CN115960215A - 一种抗hiv的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HIV的抗体，所述抗体包含分别如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链互补决定区CDR‑H1、CDR‑H2、CDR‑H3；以及分别如SEQ ID NO.5、6、7所示氨基酸序列的轻链互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2、CDR‑L3。本发明同时公开了编码所述抗体的核酸分子、载体、宿主细胞、免疫偶联物。本发明同时公开了产生HIV抗体的方法。

Description

一种抗HIV的抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗HIV的抗体。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是引发艾滋病(Acquired Immunodefieiency Syndrome，AIDs)即获得性免疫缺陷综合征的病原体。HIV包括 HIV-1 和 HIV-2 两种类型，两者在基因水平上的差异>55%。其中 HTV-1 具有更强的毒力和传染性，世界范围内大多数艾滋病病例是由 HIV-l的感染引起的。与HIV-1相比，HIV-2 的复制能力和致病性较弱，其感染所造成的病例主要存在于非洲西部地区，并且数量较少。因此，目前全世界主要的研究目标为 HIV-1。

HIV为逆转录病毒科慢病毒属，它具有慢病毒类似的基本结构特征，由衣壳蛋白组装形成核心，在其外侧，则是由基质蛋白（p17）形成的球状结构，球状结构被一层类脂膜包裹，其上镶嵌着 HIV的包膜蛋白。HIV 的遗传物质为两条 10kb左右的RNA 链，同逆转录聚合酶（RT）存在于衣壳蛋白内部。HIV-1的基因组至少含有9条基因片段，其中病毒的结构蛋白由gag、env、pol基因编码，剩余的基因主要编码调控蛋白，其中gag基因编码P17、P24、P15等。病毒增殖所必须的蛋白酶（PR)、逆转录酶（RT)、整合酶（IN）等则由pol基因编码。env基因负责编码糖基化的包膜蛋白前体gp160，gp160裂解后形成表面膜蛋白 gp120和跨膜蛋白gp41。在各种蛋白和核酸的共同作用下，HIV得以成功组装成大小为100-120mm的球状病毒颗粒。

HIV广谱中和抗体，因为识别HIV病毒膜蛋白相对保守的位点，受到HIV病毒变异的影响较小，所以可对抗绝大多数HIV病毒株，比例甚至可以达到90%以上，因而在艾滋病治疗中具有极高的应用价值。但感染者体内这类HIV广谱中和抗体很难产生，究其原因，发现HIV广谱中和抗体（如4E10、B12、2G12、2F5），往往还是自身反应性和多反应性抗体（据报道，75%的HIV抗体具有多反应性），由于可以与人体自身抗原等多种抗原反应，所以在发育过程中，免疫系统会将分泌这类抗体的B细胞克隆清除，以免引起自身免疫反应，这可能是HIV广谱中和抗体难以产生的原因，因此本领域的很多研究正致力于寻找更敏感、更具有特异性、更简便的HIV广谱抗体的筛选及检测技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种抗HIV的广谱中和抗体。

本发明的目的之二在于提供了一种筛选抗HIV广谱中和抗体的方法。

本发明的目的之三在于提供了检测或治疗HIV感染的药物和途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种抗HIV抗体，所述抗体包含： 重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括重链互补决定区，所述重链互补决定区包含：SEQ ID NO.1的氨基酸序列所示的CDR-H1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列所示的CDR-H2以及SEQ ID NO.3的氨基酸序列所示的CDR-H3；所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含：SEQ ID NO.5的氨基酸序列所示的CDR-L1、SEQ ID NO.6的氨基酸序列所示的CDR-L2以及SEQ ID NO.7的氨基酸序列所示的CDR-L3。

进一步，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明的第一方面所述的抗体。

本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明的第二方面所述的核酸分子。

本发明的第四方面提供了一种包含本发明的第二方面所述的核酸分子或本发明的第三方面所述的载体的宿主细胞。

本发明的第五方面提供了一种产品，所述产品包含本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体或本发明的第四方面所述的宿主细胞。

本发明的第六方面提供了一种用于生成抗HIV广谱中和抗体的方法，所述方法包括：培养本发明的第四方面所述的宿主细胞。

本发明的第七方面提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物包含本发明的第一方面所述的抗体。

本发明的第八方面提供了一种检测样品中HIV病毒的方法，所述方法包括使样品与本发明的第一方面所述的抗体接触，从而检测所述样品中的HIV病毒。

本发明的第九方面提供了如下任一项所述的应用：

(a)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的产品、本发明的第六方面所述的方法或本发明的第七方面所述的免疫偶联物在制备治疗HIV 感染或HIV相关疾病的药物中的应用；

(b)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的产品或本发明的第七方面所述的免疫偶联物在制备检测HIV感染或HIV相关疾病诊断、预后或治疗监测的产品中的应用；

(c)本发明的第一方面所述的抗体在HIV免疫组织化学测定中的应用。

附图说明

图1是pcDNA3.1(+)-Fc表达载体图；

图2是人源化BLT小鼠外周血成熟B细胞分选图；

图3是BN4抗体自身反应性检测（Hep-2 Elisa）图；

图4是BN4抗体与HIV表面抗原gp140-trimer结合活性检测图。

具体实施方式

本发明基于人源化BLT小鼠的研究。人源化BLT小鼠，是将人胎儿脐带血中CD34⁺的造血干细胞、胎儿肝和胸腺组织移植到NOD/SCID小鼠体内，使人的造血细胞、淋巴细胞在BLT小鼠体内发育。由于人B细胞处在小鼠体内的发育环境中，对于人体来讲的这类自身反应/多反应性B细胞克隆可能被清除的比例降低，从而可以更多地保留下来。我们建立了人源化BLT小鼠模型，研究BLT小鼠体内人B细胞的发育情况，发现75%的成熟B细胞具有自身/多反应性，比例相当高。在对这些自身/多反应性抗体进行研究过程中，发现了具备HIV广谱中和抗体特征的抗体，这相当于从含高比例自身/多反应性抗体库中进行HIV抗体的筛选，获得HIV广谱中和抗体的几率大大提高。基于上述发现，本发明公开了一种获得HIV广谱中和抗体的方法：在人源化BLT小鼠外周血中获得成熟B细胞，筛选具有自身反应性/多反应性的抗体，进一步发现具有抗HIV活性的广谱中和抗体。

发明的第一方面提供了一种抗HIV抗体，所述抗体包含： 重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括重链互补决定区，所述重链互补决定区包含：SEQ ID NO.1的氨基酸序列所示的CDR-H1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列所示的CDR-H2以及SEQ ID NO.3的氨基酸序列所示的CDR-H3；所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含：SEQ ID NO.5的氨基酸序列所示的CDR-L1、SEQ ID NO.6的氨基酸序列所示的CDR-L2以及SEQ ID NO.7的氨基酸序列所示的CDR-L3。

进一步，所述抗体包含：

(a)与SEQ ID NO .4的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VH序列；

(b)与SEQ ID NO .8的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的VL序列；或者

(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。

进一步，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

在本发明中，术语“抗体”可包括整个抗体分子、全长免疫球蛋白分子，特 别是天然存在的全长免疫球蛋白分子，或者由免疫球蛋白基因片段重组处理形成的全长免疫球蛋白分子，以及抗体片段。抗体片段可以是包含至少一个抗体-抗原结合位点的抗体片段。

进一步，所述的抗体可包括融合蛋白。抗体-抗原结合位点可以是包含至少一个CDR序列的抗体的抗原结合位点。

进一步，在本发明中，所述的抗体可包括例如单克隆、多克隆、多特异性(例如双特异性)、重组、人、嵌合和人源化抗体，也可包括微型抗体和双抗体，还可包括体内或体外产生的免疫球蛋白，也可包括抗体混合物。

术语“单克隆抗体”是指高度特异性识别和结合抗原决定簇或抗原表位中的基本同质抗体群。这与多克隆抗体形成对比，所述多克隆抗体一般包括识别和结合不同抗原决定簇的不同抗体。

进一步，所述的单克隆抗体包括完整的全长单克隆抗体和抗体片段(例如Fab、Fab'、F (ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子。

进一步，所述的单克隆抗体是指以任意方式制备的抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。

术语“人源化抗体”是指非人（例如鼠类）抗体形式，其为特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其包含最少非人（例如鼠类）序列的片段。一般来说，人源化抗体是互补决定区（CDR）的残基被具有所需特异性、亲和性和性能的非人种类(例如小鼠、大鼠、兔和仓鼠) 的CDR残基所取代的免疫球蛋白(Jones等人，1986，Nature(《自然》)，321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science，239:1534-1536)。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被具有所需特异性、亲和性和性能的非人种类抗体中的相应残基取代。人源化抗体可进一步通过Fv框架区和/或被取代的非人残基内的额外残基的替代进行修饰，以完善和优化抗体特异性、亲和性和/或性能。一般而言，人源化抗体包含全部的至少一种(通常是两种或三种)可变域。

术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列获自两种属或多种属的抗体。轻链和重链的可变区可获自哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子等)中具有所需特异性、亲和性和性能的抗体的可变区，而恒定区与获自另一种属（通常是人）的抗体的序列同源，以避免在这些种属中引起免疫反应。通常，嵌合抗体使用啮齿动物可变区(VH和VL)以及人恒定区，以产生主要是人区域的抗体。这种嵌合抗体的产生是本领域已知的，并可通过标准方法获得。

术语“抗体片段”可指抗体的一个片段，例如F(ab')2、Fab、F(ab)2、Fab'、Fv、dAb、scFv、重链可变区CDR-H1、重链可变区CDR-H2、重链可变区CDR-H3、轻链可变区CDR-L1、轻链可变区CDR-L2、轻链可变区CDR-L3、单链可变片段(scFv)、VH、VL等，所有均优选表现出对HIV，特别是人HIV的特异性结合。

进一步，所述的抗体片段可特异性地与被整个抗体或全长抗体识别的相同抗原结合。

进一步，所述的抗体片段可以是完整抗体的一部分。

术语“抗体混合物”是含有两种或两种以上表现出对HIV特别是人HIV的特异性结合抗体或由其构成的混合物。

在本发明中，术语“核酸分子”如本领域所知的使用，并可特别地指通过共价键连接的两个或多个核苷酸或核苷酸类似物。

进一步，所述的核酸分子包括寡核苷酸和多核苷酸，寡核苷酸通常包含不多于50个核苷酸，多核苷酸可具有任何长度。

进一步，所述的核酸分子可包括DNA（例如cDNA）、基因或RNA。包含核酸分子的核苷酸可例如选自天然存在的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和核苷酸类似物，例如非天然存在的合成核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。核苷酸类似物在本领域是已知的，并描述于例如Lin等人，1994, Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)22:5220-5234；Jellinek等人，1995,Biochem.34:11363- 11372；Pagratis等人，1997,Nature Biotechnol.(《自然生物技术》)15:68-73。

进一步，所述的核酸分子可克隆到合适的载体中用于扩增、进一步突变或修饰或表达。

在本发明中涉及一种包含编码本发明第二方面所述的核酸分子的载体，所述的载体能够有效表达本发明中所述的抗体。

进一步，所述的载体可用来在合适的宿主中按照本领域已知的方法制备本发明中所述的抗体。

进一步，所述的载体可将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、封装在脂质体、质粒中的DNA或RNA表达载体、噬菌体载体、能够在载体引入的宿主细胞中自主复制的载体，以及与阳离子浓缩剂结合的DNA或RNA表达载体。载体引入宿主细胞后可整合到宿主细胞的基因组中，使其随后能够与宿主基因组一起复制。

进一步，所述载体包括但不限于线性多核苷酸、质粒和病毒载体。

进一步，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒 载体、腺相关病毒载体。

进一步，所述的载体可特别指能够指导一个或多个基因的表达，基因与表达载体可操作连接。核苷酸序列的表达载体可经优化用于在宿主细胞中表达，可通过插入合适的调节子区域、 启动子、转录终止子或活化子，或复制原点。

术语“宿主细胞”是天然存在的细胞或转化的细胞，它包含载体并且支持载体的复制或表达。宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内细胞等。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa等。

进一步，所述的宿主细胞可特别指已用核酸序列转化或能够用核酸序列转化的细胞。在转化后，宿主细胞可表达选定的目标基因。

进一步，所述的宿主细胞不仅包括转化后获得的宿主细胞，也包括转化后获得的宿主细胞的后代，无论该后代在形态上或在遗传组成上是否与原亲代细胞相同。因为可能发生某些修饰，例如由突变和/或环境影响造成的修饰，这样的后代可能与亲代细胞不相同，所述后代产生能够结合HIV特别是人HIV的抗体或抗体片段。

本发明的第五方面提供了一种产品，所述的产品包含本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体或本发明的第四方面所述的宿主细胞。

进一步，所述的产品包括但不限于诊断HIV的产品、检测HIV的产品、治疗HIV感染的药物或药物组合物。

进一步，检测、诊断产品包括试剂盒、芯片或高通量测序平台。

进一步，所述试剂盒包括化学发光液。

进一步，所述化学发光液包括酶促反应发光剂、直接化学发光剂、电化学发

光剂。

进一步，酶促反应发光剂包括酶促反应酶和酶促反应酶的发光底物。

进一步，酶促反应酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β- 半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。

进一步，酶促反应酶的发光底物包括辣根过氧化物酶的发光底物、碱性磷酸

酶的发光底物、葡萄糖氧化酶的发光底物、β-半乳糖苷酶的发光底物、溶菌酶的发光底物、苹果酸脱氢酶的发光底物。

进一步，所述辣根过氧化物酶的发光底物包括鲁米诺或其衍生物、对-羟基

苯乙酸。

进一步，所述碱性磷酸酶的发光底物包括 AMPPD、4-甲基伞形酮磷酸盐。

进一步，所述直接化学发光剂包括不需要酶的催化作用，只需要改变溶液的pH 条件就能发光的试剂。

进一步，所述电化学发光剂包括在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。

进一步，所述的药物组合物包含治疗有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段。

进一步，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。

进一步，所述的药学上可接受的载体包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、软膏剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。

进一步，所述药物组合物还包括第二治疗剂。

进一步，所述第二治疗剂是抗病毒剂。

进一步，所述抗病毒剂包括：非核苷逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂、整合酶抑制剂。

进一步，所述的非核苷逆转录酶抑制剂包括奈韦拉平、地拉韦啶、依非韦伦，依曲韦林和利匹韦林。

进一步，所述的蛋白酶抑制剂中的蛋白酶可以是从放线菌发酵液中分离到亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素等，能分别抑制胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、金属蛋白酶等各种蛋白酶。

进一步，所述的蛋白酶抑制剂包括茚地那韦、沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、安普那韦。

进一步，所述的融合抑制剂包括多肽类HIV-1融合抑制剂。

进一步，所述的多肽类HIV-1融合抑制剂包括C肽类融合抑制剂、N肽类融合抑制剂、以gp41融合肽(FP)为靶标的融合抑制剂、非天然氨基酸修饰的HIV-1融合抑制多肽。

进一步，所述的C肽类融合抑制剂包括T-20。

进一步，所述的N肽类融合抑制剂包括DP-107。

进一步，所述的以gp41融合肽(FP)为靶标的融合抑制剂包括VIRIP。

进一步，所述的非天然氨基酸修饰的HIV-1融合抑制多肽包括D型环18肽。

进一步，所述的整合酶抑制剂包括拉替拉韦(RAL)、艾维雷韦(EVG)、 多替拉韦(DTG)以及Bictegravir(BIC)。

本发明还提供了包含所述抗HIV抗体的免疫偶联物。

术语“免疫偶联物”是与一种或多种异源分子偶联的抗体。例如，免疫偶联物可以包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、蛋白质结构域、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素偶联的抗HIV抗体。

进一步，免疫偶联物可以包含抗HIV抗体或其片段(例如，scFv)。

在一些实施方案中，免疫偶联物为抗体-药物偶联物，其中抗体与一种或多种药物偶联。

在一些实施方案中，免疫偶联物包含与酶促活性毒素或其片段偶联的如本发明所述的抗体。

在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与放射性原子偶联以形成放射偶联物的如本发明所述的抗体。

进一步，可用于产生放射偶联物的示例性放射性同位素包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。放射性偶联物可以包含用于闪烁照相检测的放射性原子(例如，tc99m或1123，或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁)。

在一些实施方案中，本发明提供了诊断HIV感染的方法。诊断方法通常涉及来自患者的生物样品(诸如例如，血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检物)与HIV抗体接触，以及确定与对照样品或预定截止值相比，抗体是否优先与样品结合，从而表明HIV病毒的存在。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1抗HIV抗体的制备

1、成熟B细胞的分选

Buffer1: 500 ml 1×PBS + 2 ml 0.5 M EDTA + 25 ml 10% BSA (含2 mMEDTA, 0.5%BSA)

（1）收集人源化BLT小鼠外周血200 μl，加入200μl Buffer1；

（2）加入10倍体积的ACK lysing buffer (Fisher/BioWhittaker)，室温孵育10min，1500 rpm离心10 min；

（3）弃上清，加入10 ml Buffer 1洗细胞，1500 rpm离心10 min；

（4）弃上清，加入10 μl Buffer 1重悬细胞；加入流式抗体，标记成熟B细胞：

anti-CD5/FITC (UCHT2, eBioscience)

anti-CD19/PE (SJ25-C1, BD Pharmingen)

anti-CD10/APC (BC96, eBioscience)

anti-CD27/PE-Cy7 (O323, eBioscience)

anti-IgM/PE-Cy5 (G20-127, BD Pharmingen)

（5）流式细胞仪(FACS Sorter)分选成熟B细胞（CD5-CD19+CD10-CD27- IgM+），将单个细胞收集到96 孔 PCR板中，内置4μl细胞裂解液；

（6）将分选到的细胞至于干冰上，并尽快保存于-70℃冰箱。

（7）结果：如图2所示，分选获得成熟B细胞。

2、抗体的鉴定

（1）反转录合成cDNA，用Invitrogen公司的SuperScript® III First-StrandSynthesis System合成体系；

（2）第一轮PCR，扩增抗体重链VH基因、轻链VL基因，用Qiagen 公司的Hotstar 试剂盒；

（3）第二轮巢式PCR，扩增抗体VH基因、VL基因，用Qiagen 公司的Hotstar 试剂盒；

（4）将第二轮PCR产物VH片段、VL片段分别连入T载体，转化JM109感受态细菌；

（5）用PCR法鉴定含VH片段、VL片段的阳性克隆；

（6）选择来自同一细胞的，经PCR鉴定为阳性的VH和VL产物，将其组装成单链抗体scFv。

（7）通过SfiI、Not I酶切位点，将scFv连入含IgG1-Fc的 pcDNA3.1(+)-Fc表达载体（含IgG1-Fc标签，图1），转化JM109感受态细菌。

（8）用PCR法鉴定含scFv片段的阳性克隆并测序，获得序列正确的scFv /pcDNA3.1(+)-Fc克隆。

（9）抗体序列如表1所示

表1抗体序列

3、抗体的真核表达和亲和纯化

 将测序正确的scFv /pcDNA3.1(+)-Fc质粒，用lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染HEK 293T细胞。293T细胞接种于15 cm的培养板中，含20 ml培养基，细胞铺板至90%时，用40μg质粒DNA，100μl lipofectamine2000，按操作指南进行转染。转染8-10h后换液，换液后48h收集细胞上清，用Protein A亲和层析法（Protein A sepharoseCL-4B，GE Healthcare）纯化抗体（表达的抗体含Fc标签），经超滤浓缩后获得scFv-Fc抗体蛋白。

实施例2抗体特性的检测

1、自身反应性检测

抗体的自身反应性采用临床上标准的抗核抗体检测试剂盒（QUANTA Lite™ ANAELISA，INOVA Diagnostics, Inc.）进行检测，检测试剂盒中提供了阴性反应样品、低阳性反应样品、高阳性反应样品。4E10是一个HIV广谱中和抗体，也是一个自身/多反应性抗体，实验中我们制备了4E10 scFv-Fc，用作阳性对照抗体。检测步骤如下：

（1）包被：ANA 试剂盒中的Elisa板已经进行了抗原包被；

（2）一抗：加入 50 μg/ml scFv-Fc蛋白50μl，室温反应2h；

（3）二抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗人IgG-Fc抗体，室温反应1h；

（4）显色：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入TMB底物溶液，每孔100μl，室温避光显色3分钟；

（5）检测：加入2N H₂SO₄100μl终止反应，酶标仪450nm处进行检测。

（6）结果：如图3所示，一个scFv-Fc抗体（命名为BN4）抗核反应显示出强阳性，几乎与4E10 scFv-Fc相当。表明BN4与人类核抗原反应，是一种自身反应性抗体。

2、多反应性检测

抗体的多反应性是检测抗体和自然界多种公认常见抗原的反应，包括人单链DNA（ssDNA）、人双链DNA（dsDNA）、重组人胰岛素（insulin）、人心磷脂（cardiolipin）、牛血清白蛋白（BSA）、细菌脂多糖（LPS）等。源于人源化BLT小鼠的抗体多反应性通过基于电化学发光法的MSD(Gaithersburg, MD, USA)平台进行评价。实验中，4E10 scFv-Fc用作阳性对照抗体。

（1）包被：用ssDNA、dsDNA、insulin、cardiolipin、BSA、LPS各10 μg/ml为多反应性抗原，包被384孔MSD板，4℃孵育过夜；

（2）封闭：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入 10% FBS 100ul封闭Elisa板，室温孵育1h；

（3）一抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入 5 μg/ml scFv-Fc蛋白15μl，室温孵育反应2h；

（4）二抗：弃去孔中液体，PBST洗涤3次，加入1 μg/ml带SULFO标签的羊抗人IgG-Fc抗体15μl，室温反应2h；

（5）弃去孔中液体，PBST洗涤3次，根据操作指南，反应板在MSD Sector Imager2400进行读取。

（6）结果：BN4与ssDNA、dsDNA、insulin、cardiolipin、BSA、LPS抗原反应均显示出强阳性，几乎与4E10 scFv-Fc相当，表明BN4与这些抗原都反应，是一种多反应性抗体。

3、HIV抗原结合反应检测

基于MSD平台技术，设置了BN4与HIV表面抗原gp140-trimer结合实验，用5 μg/mlgp140-trimer（来自HIV-YU2病毒株）包被384孔MSD板，方法同上。实验中，仍以4E10 scFv-Fc为阳性对照抗体，在自身反应性检测结果中显示阴性和低阳性反应的抗体，这个实验中被用作阴性对照和低阳性反应对照。

结果如图4所示，BN4与gp140-trimer显示出较强的结合活性，大约为4E10 scFv-Fc 结合活性的12%，是阴性对照的32倍，低阳性对照的5.3倍，这表明BN4具有HIV抗原结合活性，具备进一步开发的价值。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗HIV广谱中和抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括重链互补决定区，所述重链互补决定区包含：SEQ ID NO.1的氨基酸序列所示的CDR-H1、SEQ ID NO.2的氨基酸序列所示的CDR-H2以及SEQ ID NO.3的氨基酸序列所示的CDR-H3；所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区包含： SEQID NO.5的氨基酸序列所示的CDR-L1、SEQ ID NO.6的氨基酸序列所示的CDR-L2以及SEQ IDNO.7的氨基酸序列所示的CDR-L3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗体。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的核酸分子。

5.一种包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体的宿主细胞。

6.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1和2任一项所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞。

7.一种用于生成权利要求1或2所述的抗HIV广谱中和抗体的方法，其特征在于，所述方法包括： 培养权利要求5所述的宿主细胞。

8.一种免疫偶联物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的抗体。

9.一种检测样品中HIV病毒的方法，其特征在于，所述方法包括使样品与权利要求1或2所述的抗体接触，从而检测所述样品中的HIV病毒。

10.如下任一项所述的应用：

(a)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的产品、权利要求7所述的方法或权利要求8所述的免疫偶联物在制备治疗HIV 感染或HIV相关疾病的药物中的应用；

(b)权利要求1或2所述的抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的产品或权利要求8所述的免疫偶联物在制备检测HIV感染或HIV相关疾病诊断、预后或治疗监测的产品中的应用；

(c)权利要求1或2所述的抗体在HIV免疫组织化学测定中的应用。

Images