CN115894674A - 一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于新冠病毒检测的技术领域，公开了一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用。其中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区同时包括如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区1～3，轻链可变区同时包括如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区1～3。相较于其他的新冠N蛋白抗体而言，本发明提供的抗体或其抗原结合片段中，重链可变区与轻链可变区折叠所形成具有三维空间结构的抗原结合位点与新冠N蛋白具有强结合能力，能够不受其他病毒及药物的干扰，特异性识别SARS‑CoV‑2中的Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株以及Omicron变异株等主流变异株，使用其作为SARS‑CoV‑2的检测物质，可实现对于SARS‑CoV‑2高准确度且高效的检测。

Description

一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明属于新冠病毒检测的技术领域，尤其涉及一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在持续传播中不断发生进化和变异，目前已出现多种变异株，其中Alpha(B.1.1.7)变异株、Beta(B.1.351)变异株、Gamma(P.1)变异株、Delta(B.1.617.2)变异株和Omicron(B.1.1.529)变异株传染性更强，且对疫苗和治疗的抵抗力更高，为COVID-19防治带来新难点和新挑战，而对感染者进行快速诊断是COVID-19防治的第一步。

目前，实时荧光RT-PCR因具有快速简便、成本低、特异性高等特点，成为使用最多最广泛的核酸检测方法，采集口咽拭子样本、鼻咽拭子或肛拭子样本，进行实时逆转录酶聚合酶链式反应检测是否存在SARS-CoV-2的遗传物质RNA，若检测结果为阳性，可直接确诊为感染病例。

但是，由于实时荧光RT-PCR的检测结果容易受到诸多因素影响，可能造成核酸检测结果“假阴性”而出现漏诊；且检测耗时较长、对场地设备和技术人员要求较高，限制了对于SARS-CoV-2进行检测的精度和效率。

发明内容

为了提高对于SARS-CoV-2进行检测的精度和效率，本发明提供了一种用于检测冠状病毒的抗体及制备方法和应用。

本发明的目的之一是提供一种抗体或其抗原结合片段。

本发明的目的之二是提供一种抗体或其抗原结合片段的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种检测试剂盒。

本发明的目的之四是提供上述抗体或其抗原结合片段在非诊断目的的SARS-CoV-2检测中的应用。

具体地，本发明提供的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区同时包括如SEQID NO:1～3所示的重链互补决定区1～3，所述轻链可变区同时包括如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区1～3。

在一些具体的实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为包括氨基酸序列如SEQID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区以及如SEQ ID NO:19的轻链恒定区的单克隆抗体。

在一些具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为Fv、Fab或F(ab′)₂。

在一些具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体中的一种。

在另一方面，本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段的制备方法中，具体步骤为：

S1、通过重组DNA技术制备得到氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重组新冠N蛋白；

S2、使用所述重组新冠N蛋白免疫小鼠制备得到免疫脾细胞，并利用杂交细胞技术制备得到杂交瘤细胞；

S3、同时以核苷酸序列如SEQ ID NO:10-17所示的核苷酸片段作为引物，从所述杂交瘤细胞中提取编码合成所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，转化受体细胞，分泌表达所述抗体或其抗原结合片段。

在一些具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为包括氨基酸序列如SEQID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区以及如SEQ ID NO:19的轻链恒定区的单克隆抗体。

在一个方面，本发明提供的检测试剂盒，其中，包含有上述抗体或其抗原结合片段，和/或通过上述制备方法制备得到的抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本发明提供的上述抗体或其抗原和/或核酸分子在非诊断目的的SARS-CoV-2检测中的应用。

在某些优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段用于对样品中的SARS-CoV-2和/或新冠N蛋白进行定性和/或定量检测。

有益效果：

本发明提供的抗体与SARS-CoV-2的核衣壳蛋白(N蛋白)具有高亲合力；同时，与其他的新冠N蛋白抗体相比，本发明提供的抗体对于SARS-CoV-2中的Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株以及Omicron变异株等主流变异株也具有良好的识别能力，不受其他病毒及药物的干扰，能够定性、定量地对待测样品中SARS-CoV-2或N蛋白进行检测，实现提高SARS-CoV-2检测精度和效率的效果。

附图说明

图1为本发明实施例制备得到的纯化产物SDS-PAGE测试的实验结果图；

图2为本发明实施例制备得到的纯化产物的高效液相色谱峰图。

具体实施方式

本发明涉及的氨基酸序列及核苷酸序列如表1所示：

表1

核衣壳(N)蛋白是SARS-CoV-2病毒感染过程中表达量最丰富的病毒结构蛋白，在病毒进入人体细胞后便会大量表达，因此可作为早期诊断SARS-CoV-2病毒感染的标记物之一。

本申请中提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段靶向新冠N蛋白，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(V_H)、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(V_L)、如SEQ ID NO:18所示的重链可变区(C_H)以及如SEQ ID NO:19所示的重链可变区(C_L)；其中，在V_H中含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区1～3(CDR1～3)，在V_L中含有氨基酸序列如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区1～3(CDR1～3)。

本发明中提供的抗体或其抗原结合片段中，V_H和V_L上的互补决定区使得该抗体或其抗原结合片段具有特异性结合新冠N蛋白的特异性，同时V_H和V_L特定的氨基酸序列折叠形成一个特定三维空间结构的抗原结合位点，其中V_H和V_L上与互补决定区临近的几个氨基酸处于β折叠结构中，本发明提供的抗体中互补决定区所具有的三维空间结构相较于其他的抗新冠N蛋白抗体而言，与新冠N蛋白的抗原决定簇具有更高的结合能力。

因此，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以准确地检测冠状病毒，并且不受其他疾病病毒株及药物的交叉干扰，能够有效地识别Alpha(B.1.1.7)变异株、Beta(B.1.351)变异株、Gamma(P.1)变异株、Delta(B.1.617.2)变异株和Omicron(B.1.1.529)变异株等主流变异株。使用该抗体或其抗原结合片段作为检测抗体，可建立一种快速、可靠且可用于SARS-CoV-2早期感染判断的检测方法。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以是包含全长抗体片段的多肽；或者是保留有与新冠N蛋白具有强特异性结合能力片段的多肽，具体可根据需要选择相应类型的多肽。在一些具体的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为包含全长抗体片段的多肽，具体地可以是但不限定于多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体中的一种，保留有与新冠N蛋白具有强特异性结合能力片段的多肽具体地可以是但不限定于Fv、Fab或F(ab′)₂中的一种。

其中，Fv指的是小分子的基因工程抗体，通过短肽将氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区连接而成；Fab指的是抗体分子经过木瓜蛋白酶水解之后得到的具有抗原结合能力的片段，具体为氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区通过S-S键联得到的片段；F(ab′)₂指的是抗体分子经过胃蛋白酶水解得到的大分子片段，具体为两个Fab通过氨基酸序列如SEQID NO:7所示的重链可变区之间的S-S键联得到的片段，具有双价抗体活性，能够与两个相应的新冠N蛋白的抗原决定簇结合。

在本发明中，可使用放射性同为素、酶、荧光染料、生物素以及胶体金等标记物以共价结合或物理吸附的方式标记于抗体或其抗原结合片段上，以形成抗体-标记物复合体，应用免疫分析的方法对样本中的新冠N蛋白及与其具有相同抗原决定簇的物质进行定性和定量的分析。

在一些具体的实施方式中，用于标记抗体或其抗原结合片段的酶可以是但不限定于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶借助酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或者是具有一定电子密度的颗粒，在实际的新冠检测中，可使用肉眼、显微镜、分光光度计进行观察或测定。

在一些具体的实施方式中，用于标记抗体或其抗原结合片段的荧光染料可以是但不限定于荧光素类荧光染料、罗丹明类荧光染料、花菁素类荧光染料或香豆素类荧光染料。

本申请中还提供了抗原或抗原结合片段的制备方法，具体的步骤为：

S1、通过重组DNA技术制备得到氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重组新冠N蛋白；

S2、使用所述重组新冠N蛋白免疫小鼠制备得到免疫脾细胞，并利用杂交细胞技术制备得到杂交瘤细胞；

S3、同时以核苷酸序列如SEQ ID NO:10～17所示的核苷酸片段作为引物，从所述杂交瘤细胞中提取编码合成抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，转化受体细胞，分泌表达所述抗体或其抗原结合片段。

在一些具体的实施方式中，重组新冠N蛋白可以是通过基因工程技术制备得到的，首先通过逆转录合成得到编码重组新冠N蛋白的DNA片段，再将该片段与pEM5.1载体重组构建得到重组质粒，将该重组质粒转化HEK293细胞中，通过HEK293细胞的生物合成制备得到重组新冠N蛋白。

本发明中，以重组新冠N蛋白与生理盐水配置得到0.5～2.0mg/mL的抗原溶液，抗原溶液与福氏完全佐剂混合处于油包水的状态时，通过注射的方式给予小鼠刺激，使其发生免疫反应，进而产生能够分泌抗原或抗原结合片段的免疫脾细胞，与提前复苏的SP2/0细胞在融合剂PEG的作用下融合，得到杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选得到高表达的细胞株进行后续的处理。

在一些具体的实施方式中，选择6～8周龄、体重为16～18g的雌性小鼠BALB/C小鼠作为免疫对象，有利于获得更多的免疫脾细胞。

在一些具体的实施方式中，在进行细胞融合前4天，提前复苏一只或两只SP/02细胞，经过多次扩皿培养，使得进行细胞融合时培养基中的SP/02细胞密度为80％，此时SP/02细胞的状态较为理想，有利于与小鼠免疫脾细胞的融合，提高融合的成功率。

本发明中，收集高表达的杂交瘤细胞株，并提取RNA，通过逆转录合成得到编码包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区(V_H)、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(V_L)、如SEQ ID NO:18所示的重链可变区(C_H)以及如SEQ ID NO:19所示的重链可变区(C_L)的抗体或其抗原结合片段的核苷酸片段。

本申请中还提供了一种检测试剂盒，以上述的抗体或其抗原结合片段作为检测物质，用于检测样品中是否存在新冠N蛋白。

在一些具体的实施方式中，检测试剂盒中还包括由可与本申请提供的抗体或其抗原结合片段特异性结合的第二抗体。

本申请还提供了上述抗体或其抗原结合片段在非诊断目的的SARS-CoV-2检测中的应用。

在一些具体的实施方式中，采用该抗体或其抗原结合片段作为检测物质，可以使用但不限制于使用酶联免疫吸附、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法和竞争法中一种或多种检测方法，对样品中的SARS-CoV-2和/或新冠N蛋白进行定性和/或定量检测。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

其中，涉及的抗体及其来源如下所示：

COV19-PS-Mab15和COV19-PS-Mab117抗体对(菲鹏生物股份有限公司)；

SARS-CoV-2NP-mAb抗体对(隆基生物，货号为MI04514和MI04515)。

制备例.重组新冠N蛋白

本制备例提供了一种重组新冠N蛋白的制备方法，通过逆转录的方法合成含有编码SARS-CoV-2的核衣壳蛋白(N蛋白)核苷酸的DNA分子，且该DNA分子的3′端含有编码6个组氨酸标签的核苷酸序列以及终止密码子；使用NdeI酶和XhoI酶将该核苷酸序列连接到pEM5.1载体上构建得到重组质粒，将该重组质粒转染到HEK293细胞中；使用CD05培养基、于温度为37℃，转速为100rpm的二氧化碳摇床下培养7d后，收获上清，并使用Ni柱进行纯化，并且在纯化的过程中检测OD₂₈₀，收集相应级份的产物，制备得到分子量大小为46.5kDa的重组冠状N蛋白，且该重组冠状N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

实施例.新冠N蛋白抗体

本实施例提供的新冠N蛋白抗体为单克隆抗体，具体的制备包括以下的步骤：

S1、免疫小鼠：

(1)使用生理盐水将制备例1制备得到的重组新冠N蛋白溶解配置得到浓度为1mg/mL的抗原溶液，并与等体积的福氏完全佐剂混合，制备得到呈油包水状态的抗原溶液；

(2)选择6～8周龄、体重为16～18g的雌性BALB/C小鼠作为免疫对象，以100μg/0.5mL的剂量给每只小鼠腹部皮下注射；

(3)间隔3周进行第二次注射，第二次免疫起使用由福氏不完全佐剂配置得到的抗原溶液进行注射，以50μg/0.5mL的剂量给每只小鼠腹部皮下注射；间隔2周后进行第三次注射，第三次注射后，继续饲养10d准备细胞融合；

S2、细胞融合：

(1)提前复苏一只或两只SP2/0细胞，待培养皿中细胞密度达到50％时进行扩皿，使得进行融合时培养基中SP2/0细胞的密度在80％左右；

(2)取经过S1处理后小鼠的免疫脾细胞与SP2/0细胞按照1:8的比例混合，经离心、重悬、离心以及去上清后，加入融合剂PEG并静置90s后，离心弃上清；

(3)将融合后的细胞按照100μL/孔铺入96细胞培养板中，培养10d左右，并使用ELISA检测方法进行阳性孔筛选：铺重组新冠N蛋白过夜，洗板、加脱脂奶粉于37℃下孵育1h，加入100μL的细胞培养液上清于37℃下孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗于37℃下孵育30min；洗板，加入显色液进行显色10min，后加入终止液，读取每孔培养液的OD450，筛选高表达量的细胞株进行亚克隆；

S3、收集经过S2处理获得的细胞，提取RNA，进行逆转录，于37℃下进行逆转录15min，且所使用到的引物如表2所示，并构建含有逆转录产物的重组表达载体，使用PEI转染HEK293细胞，收集培养液上清；

表2.

引物	编号	核苷酸序列
			H1	SEQ ID NO:10	AGGTCCAACTGCTCGAGTCAGG
H2	SEQ ID NO:11	AGGTCCAACTTCTCGAGTCTGG
			H1	SEQ ID NO:12	AGGTCCAACTTCTCGAGTCAGG
H2	SEQ ID NO:13	AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT
			L1	SEQ ID NO:14	CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT
L2	SEQ ID NO:15	CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC
			L3	SEQ ID NO:16	CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA
L4	SEQ ID NO:17	CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA

S4、将收集到的培养液上清进行离心、过滤后，并过柱、层析进行纯化，对经过纯化的产物送测序，并对纯化产物进行SDS-PAGE和高效液相色谱检测，结果如图1和图2所示。

由测序结果以及图1和2可知，新冠N蛋白抗体包括SEQ ID NO:7所示的重链可变区(V_H)、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区(V_L)、如SEQ ID NO:18所示的重链可变区(C_H)以及如SEQ ID NO:19所示的重链可变区(C_L)，纯化产物中新冠N蛋白抗体的纯度大于95％，且新冠N蛋白抗体中重链的分子量为53kDa，轻链的分子量为25kDa。

测试例.

对实施例提供的新冠N蛋白抗体、SARS-CoV-2NP-mAb抗体对以及COV19-PS-Mab15和COV19-PS-Mab117抗体对进行敏感性、特异性对比评估：

(1)敏感性检测：建立双抗体夹心免疫层析的检测方法，对不同浓度的新冠灭活疫苗样本进行检测，计算敏感性，测试结果如表3所示。

表3.敏感性检测结果

由表3可知，相较于现有技术中检测灵敏度较高的COV19-PS-Mab15和COV19-PS-Mab117抗体对以及SARS-CoV-2NP-mAb抗体对而言，实施例提供的新冠N蛋白抗体的对于新冠N蛋白具有更高的灵敏度。

(2)特异性检测：建立双抗体夹心免疫层析的检测方法，对SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、Alpha(B.1.1.7)变异株灭活病毒液、Beta(B.1.351)变异株灭活病毒液、Gamma(P.1)变异株灭活病毒液、Delta(B.1.617.2)变异株灭活病毒液、Omicron(B.1.1.529)变异株灭活病毒液、重组S蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、Vero细胞裂解液、肺炎支原体抗原、H₃N₂流感病毒单价原液、新生牛血清、MEM培养基、1％BSA以及1％脱脂奶粉等17份样本进行检测，测试结果如表4所示。

表4.特异性检测结果

检测结果表明，实施例提供的新冠N蛋白抗体不仅对SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、Alpha(B.1.1.7)变异株灭活病毒液、Beta(B.1.351)变异株灭活病毒液、Gamma(P.1)变异株灭活病毒液、Delta(B.1.617.2)变异株灭活病毒液、Omicron(B.1.1.529)变异株灭活病毒液以及重组N蛋白的检测结果均呈现阳性，且对于其他物质呈现阴性，相较于COV19-PS-Mab15和COV19-PS-Mab117抗体对、SARS-CoV-2NP-mAb抗体对于MEM培养基、H₃N₂流感病毒单价原液等物质的检测中也能呈现弱阳性而言，本发明实施例提供的新冠N蛋白抗体对于SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、Alpha(B.1.1.7)变异株灭活病毒液、Beta(B.1.351)变异株灭活病毒液、Gamma(P.1)变异株灭活病毒液、Delta(B.1.617.2)变异株灭活病毒液、Omicron(B.1.1.529)变异株灭活病毒液以及重组N蛋白具有更高的检测特异性，将其应用在实际的非诊断目的SARS-CoV-2检测中时，具有更高的检测精度和效率。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区同时包括如SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区1～3，所述轻链可变区同时包括如SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区1～3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区以及如SEQ ID NO:19的轻链恒定区的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为Fv、Fab或F(ab′)₂。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体中的一种。

6.一种抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

S1、通过重组DNA技术制备得到氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重组新冠N蛋白；

S2、使用所述重组新冠N蛋白免疫小鼠制备得到免疫脾细胞，并利用杂交细胞技术制备得到杂交瘤细胞；

S3、同时以核苷酸序列如SEQ ID NO:10-17所示的核苷酸片段作为引物，从所述杂交瘤细胞中提取编码合成所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，转化受体细胞，分泌表达所述抗体或其抗原结合片段。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区、如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区以及如SEQ ID NO:19的轻链恒定区的单克隆抗体。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的抗体或其抗原结合片段，和/或通过权利要求6或7所述的制备方法制备得到的抗体或其抗原结合片段。

9.权利要求1～5任一所述的抗体或其抗原结合片段或通过权利要求6或7提供的制备方法制备得到的抗体或其抗原结合片段在非诊断目的的SARS-CoV-2检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段用于对样品中的SARS-CoV-2和/或新冠N蛋白进行定性和/或定量检测。

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