CN115819565A - 新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用。本发明提供特异性结合新型冠状病毒Omicron突变株的抗体，该抗体可作为Omicron突变株抗原检测的特异性抗体，用于针对Omicron突变株设计的新型冠状病毒疫苗的鉴定，并对疫苗表达的Spike RBD蛋白含量进行定量检测，或用于新型冠状病毒疫苗的质控和临床及临床前研究的免疫原性检测，或作为接种疫苗后血清中保护性抗体检测的质控抗体。

Description

新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用
技术领域
本发明是申请日为2022年6月6日，申请号为2022106272663、发明名称为“新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用”的专利申请的分案申请。本发明涉及抗体技术领域，具体涉及新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒Omicron突变株是一种具有高传播力和传播隐蔽性极强的新型冠状病毒突变株，能够突破现有疫苗的保护引起感染，被世界卫生组织定义为第五种“关切变异株”。多价疫苗被认为是目前抵御不断突变的病毒最有效的手段，疫苗的开发对于其免疫原性和有效性有着严格的要求，因此抗原含量的检测是疫苗开发过程中不可或缺的关键步骤。而针对多价疫苗的开发，还需要建立针对各种突变毒株抗原的定量检测方法。
目前，辉瑞(Pfizer),莫德纳(Moderna)和阿斯利康(AstraZeneca)等多家疫苗公司均针对新型冠状病毒突变株开展了大量研究以推进新一代疫苗开发，针对Omicron变异株的新一代疫苗也在研发中。
简化新型冠状病毒疫苗的开发流程有利于推进疫苗的研发进展。然而，由于缺乏对新型冠状病毒进化历史和人群免疫水平的长期监测，世界卫生组织尚未建立起一套可以类比流感疫苗的严格流程以应对新型冠状病毒毒株的更新换代。为推进更有效的疫苗以更快的速度问世，便捷高效的疫苗开发工具将发挥重要作用。然而，目前对于新型冠状病毒疫苗检测的抗体均为通用性的抗体，不能针对新型冠状病毒Omicron突变株设计的疫苗进行特异性的检测与鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用。
本发明通过以新型冠状病毒Omicron突变株Spike RBD蛋白作为免疫原进行小鼠免疫，经细胞融合与筛选、杂交瘤细胞亚克隆，获得表达抗体的杂交瘤细胞株。通过实验验证发现，该抗体能够特异性识别新型冠状病毒Omicron突变株抗原识别位点。进一步地，本发明通过杂交瘤测序获得了该抗体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选地，以上所述的抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施例方式中提供克隆号为3A7C12的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在上述抗体或其抗原结合片段的基础上，本发明提供一种核酸分子，其编码所述抗体或其抗原结合片段。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
进一步地，本发明提供一种生物材料，其含有所述核酸分子；所述生物材料为载体或宿主细胞。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
本发明还提供一种抗体偶联物，其为将所述抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物的如下任一种应用：
(1)在新型冠状病毒疫苗的鉴定或免疫原性检测中的应用；
(2)在新型冠状病毒疫苗的质控中的应用；
(3)在制备用于新型冠状病毒检测的试剂中的应用；
(4)在制备用于检测新型冠状病毒或其疫苗表达的Spike RBD蛋白的含量的试剂中的应用；
(5)在作为新型冠状病毒疫苗免疫后血清中保护性抗体检测的质控抗体中的应用。
上述应用中，新型冠状病毒疫苗的鉴定具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段鉴定新型冠状病毒疫苗是否含有新型冠状病毒的抗原(尤其是新型冠状病Omicron突变株的Spike蛋白)及其含量水平，或者鉴定新型冠状病毒疫苗的真伪，即疫苗是否为针对新型冠状病毒(尤其是新型冠状病毒Omicron突变株)的疫苗。
鉴定的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
上述应用中，免疫原性检测具体为检测新型冠状病毒疫苗引起动物机体免疫应答的性能，包括免疫动物体液免疫功能(例如：中和抗体及其水平、抗体的亲和力)的评价等，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为标准对照抗体用于疫苗的免疫原性检测。
上述应用中，新型冠状病毒疫苗的质量控制具体为检测新型冠状病毒疫苗中抗原质量、含量、稳定性等是否合格，本发明提供的抗体或抗原结合片段可作为抗原检测方法(酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法)的结合抗体，用于疫苗中抗原质量、含量、稳定性的检测。
上述应用中，新型冠状病毒检测具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段检测新型冠状病毒(尤其是新型冠状病毒Omicron突变株)或其Spike蛋白或Spike蛋白的RBD在样品中是否存在或其含量水平。检测包括诊断目的(所述样品来自受试者，包括受试者的排泄物、口鼻分泌物等)或非诊断目的(所述样品是体外培养的细胞样品)。检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
用于新型冠状病毒检测的试剂包括本发明的抗体或其抗原结合片段，优选该抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
上述应用中，检测新型冠状病毒或其疫苗表达的Spike蛋白的含量具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段检测样品中Spike蛋白或Spike蛋白的RBD的含量水平，检测包括诊断目的(所述样品来自受试者，包括受试者的排泄物、口鼻分泌物等)或非诊断目的(所述样品是体外培养的细胞样品)。检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
上述应用中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段还可作为新型冠状病毒疫苗免疫后血清中保护性抗体检测的质控抗体使用，具体为在利用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法检测中保护性抗体的过程中，作为标准对照抗体使用。
优选地，上述应用中，所述新型冠状病毒为新型冠状病毒Omicron突变株。
本发明提供一种新型冠状病毒或其疫苗的检测试剂盒，其包含所述抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物。
本发明提供一种药物组合物，其包含所述抗体或其抗原结合片段。
上述药物组合物用于预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病。本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为药物组合物的唯一活性成分，或者与其它药物活性成分联合使用。药物组合物还可包含药学领域允许的辅料。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供特异性结合新型冠状病毒Omicron突变株的抗体，该抗体结合特殊的空间表位，只与新型冠状病毒Omicron突变株的Spike RBD发生特异性结合，且具有较高的亲和力，而不结合野生型及其他突变抗原(Alpha、Beta、Gamma、Delta)，是理想的Omicron突变株抗原检测抗体，可用于Omicron突变毒株或针对Omicron突变毒株而设计的新型冠状病毒疫苗或多价疫苗的检测和鉴定，并对该疫苗表达的Spike RBD蛋白的含量进行定量检测，或用于新型冠状病毒疫苗或多价疫苗的质控和临床及临床前研究中的免疫原性检测，还可作为接种疫苗后血清中保护性抗体检测的质控抗体，该抗体可作为便捷高效的疫苗开发工具，有利于加速新一代疫苗的研发进程。
附图说明
图1为本发明实施例3中特异性新型冠状病毒Omicron突变株抗体的SDS-PAGE鉴定结果，其中，蛋白质分子量marker条带从上到下依次为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa。
图2为本发明实施例3中特异性新型冠状病毒Omicron突变株抗体的SEC-MALS鉴定结果。
图3为本发明实施例3中特异性新型冠状病毒Omicron突变株抗体的ELISA特异性结合分析结果。
图4为本发明实施例3中特异性新型冠状病毒Omicron突变株抗体的BLI分析结果。
图5为本发明实施例3中特异性新型冠状病毒Omicron突变株抗体进行疫苗SpikeRBD蛋白定量分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1特异性新型冠状病毒Omicron抗体的制备
本实施例中，按照以下方法制备新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体：
1、小鼠免疫：以新型冠状病毒Omicron突变株Spike RBD蛋白(购自Acrobiosystems)作为免疫原，用新型冠状病毒Omicron突变株Spike RBD蛋白免疫小鼠。免疫结束后，用ELISA方法检测免疫动物血清。常规免疫结束后，如果免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平，进行细胞融合。
2、筛选：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对新型冠状病毒Omicron突变株Spike RBD蛋白特异性结合呈阳性且与野生型,Alpha,Beta,Gamma,Delta Spike RBD蛋白均无结合的细胞。
3、克隆扩大培养：将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集上清，用ELISA方法进行检测。
4、亚克隆：采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，用ELISA方法进行亚克隆筛选。
5、杂交瘤细胞抗体基因测序：提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。
6、抗体生产与纯化：将步骤5获得的抗体基因序列克隆至表达载体并转染到HEK293细胞中，进行扩大培养，采用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
实施例2新型冠状病毒Omicron突变株抗体特异性分析
本实施例中，按照上述实施例1中的方法获得9个不同序列的单克隆抗体，并采用酶联免疫吸附试验对上述新型冠状病毒Omicron突变株抗体进行特异性分析，分析方法如下：
1、用CBS(0.015mol/L Na2CO3，0.035mol/L NaHCO3,0.0077mol/L NaN3,pH 9.59)将新型冠状病毒野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron的SPIKE RBD蛋白稀释至2μg/mL，加入酶标板孔中，每孔100μL。用封板膜封板，放置4℃过夜。
2、弃去孔中液体，拍干酶标板，用PBST洗液洗板，300μL/孔浸泡，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板3次。
3、每孔加入100μL封闭剂(含有1.5％BSA的PBST洗液),用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
4、将上述新型冠状病毒Omicron突变株抗体用样品稀释液(含有0.5％BSA的PBST洗液)稀释至1μg/mL。加入酶标板中，每孔100μL。用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
5、用样品稀释液将HRP-Anti-Human IgG稀释至0.05μg/mL，每孔加入100μL，用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
6、每孔加入100μL显色液.用封板膜封板，放置37℃避光孵育。
7、每孔加入50μL终止液，轻轻震荡酶标板至显色均匀。
8、用酶标仪读取450nm和630nm的吸光度值，用OD450扣减OD630值得到吸光度值(OD值)。
各单克隆抗体的吸光度值(OD值)检测结果如表1所示。
表1不同抗体的ELISA检测OD值
Figure SMS_1
以上实验结果显示，上述9个新型冠状病毒抗体中，克隆号：1B12G6、3A7C12、3C6E1、9A5C5对于新型冠状病毒Omicron突变株显示了高特异性，且与其他突变株没有交叉反应。
实施例3新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体的分析鉴定和功能分析
本实施例中，采用本领域已知的方法对实施例2中筛选的新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体(克隆号3A7C12)进行分析鉴定和功能分析，具体如下：
1、SDS-PAGE鉴定结果(图1)显示，3A7C12克隆号抗体还原电泳两条带分子量大小分别为25kDa和50kDa左右，纯度大于99％。
2、SEC-MALS鉴定结果(图2)显示，3A7C12克隆号抗体纯度大于99％，分子量大小150kDa。
3、ELISA结合实验结果(图3)表明，3A7C12克隆号的抗体能够特异地识别新型冠状病毒Omicron突变抗原(新型冠状病毒Omicron突变株的Spike RBD蛋白)，但与新型冠状病毒野生型以及Alpha,Beta,Gamma,Delta突变株的Spike RBD蛋白无结合。
4、BLI分析数据(图4)显示，从上至下7条拟合线分别代表Omicron突变抗原在100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、0nM浓度下与3A7C12克隆号抗体之间亲和和解离随时间的变化规律，结果表明，3A7C12克隆号的抗体结合新型冠状病毒Omicron突变抗原的亲和力高达9.07nM。
5、新型冠状病毒Omicron突变抗原定量检测实验结果(图5)表明，3A7C12克隆号的抗体可以采用双抗体夹心法对新型冠状病毒Omicron突变抗原进行定量检测，从而获得疫苗Spike RBD蛋白的含量。
6、3A7C12克隆号抗体的亚型鉴定结果显示，该抗体经Ig Isotyping MouseInstant ELISA Kit(货号：88-50660，Invitrogen)检测亚型为IgG1 kappa。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
4.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为载体或宿主细胞。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物的如下任一种应用：
(1)在新型冠状病毒疫苗的鉴定或免疫原性检测中的应用；
(2)在新型冠状病毒疫苗的质控中的应用；
(3)在制备用于新型冠状病毒检测的试剂中的应用；
(4)在制备用于检测新型冠状病毒或其疫苗表达的Spike RBD蛋白的含量的试剂中的应用；
(5)在作为新型冠状病毒疫苗免疫后血清中保护性抗体检测的质控抗体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒为新型冠状病毒Omicron突变株。
9.一种新型冠状病毒或其疫苗的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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