CN106432484B - 人类免疫缺陷病毒中和抗体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人类免疫缺陷病毒中和抗体及其使用方法。具体而言，本发明提供针对人类免疫缺陷病毒或HIV的表位的广谱中和抗体。本发明进一步提供了包含用于预防的HIV抗体的组合物和用于诊断和治疗HIV感染的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2011年5月17日提交的美国临时申请No.61/486,960的优先权。该临时申请的公开内容以其整体并入本文。
联邦基金资助研究的声明
导致本发明的研究部分地受到美国国立卫生研究院基金No.P01AI08677-01的支持。因此，美国政府对本发明有一定的权利。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，其全文通过引用并入本文。所述制作于2016年1月21日的ASCII拷贝命名为1603418US01-序列表.txt，大小为935961字节。
技术领域
本发明涉及针对人免疫缺陷病毒(“HIV”)的表位的抗体。本发明还涉及用于预防和治疗HIV感染的针对HIV的gp120包膜蛋白的广谱中和抗体的制备及应用。
背景技术
HIV导致获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)。长期非进展者中对HIV感染的免疫反应表明，特异性病毒免疫可限制疾病的感染和症状。一些HIV感染个体在其血清中显示有广谱中和IgG抗体；虽然它们对于设计有效的疫苗有潜在的重要性，但对于这些抗体的特异性和活性知之甚少，并且还没有单个的特征与保护性免疫相对应。在动物模型中，中和抗体的被动转移可以有助于防止病毒攻击。中和抗体反应也可以在HIV感染的个体中发展，但血清反应的详细组成仍未完全揭示。
已经揭示了AIDS的许多免疫异常。这些包括但不限于，B细胞功能异常、异常抗体反应、单核细胞功能缺陷、细胞因子生产受损、自然杀伤细胞和细胞毒细胞功能抑制、淋巴细胞对可溶抗原的识别和反应能力缺陷，以及T4辅助/诱导淋巴细胞群的耗竭。
来自大量HIV病毒株的编码HIV env的氨基酸和RNA序列是已知的(Modrow,S.等人.,J.Virology 61(2):570(1987))。HIV病毒体覆盖着源自宿主细胞外膜的膜或包被。该膜包含在其羧基末端区域锚定于膜双层的一群包膜糖蛋白(gp 160)。每个糖蛋白包含两个片段：N-末端片段和C-末端片段。N-末端片段，由于其相对分子量为约120kD，而称为gp120，突出到包围病毒体的水环境中。C-末端片段，命名为gp 41，横跨膜。N-末端gp 120和C-末端gp 41通过对溶蛋白性裂解特别敏感的肽键共价连接。参见McCune等人的欧洲专利申请公开号No.0 335 635以及其所引用的参考文献，每一个以全文引用的方式并入本文。
已经提出几种构建AIDS疫苗的方法，包括但不限于，灭活和减毒病毒疫苗、来自病毒感染细胞的亚单位疫苗、重组生产的病毒抗原、基于合成肽的疫苗、抗独特型疫苗和基于病毒载体的疫苗。另外一种用于HIV治疗性和预防性治疗的方法包括制造强效的广谱中和单克隆抗体。多个研究已经报道了通过各种技术来克隆和制造靶向CD4结合位点和病毒体刺突的其他部分并中和HIV的单克隆抗体。一般来说，这些技术包括自我融合或噬菌体展示技术。通常，在使用噬菌体展示技术制备HIV中和抗体时，重链和轻链的随机组合被组合且选择随机的一对。研究已经报道了有限数目的单克隆抗体，例如，噬菌体展示抗体b12，其是广谱强效的，并广谱中和(即抗体可以中和血清中的多种HIV)HIV。单克隆抗体b12是已报道的预防猕猴中HIV感染的广谱中和抗体。另一个广谱中和抗体包括2G12，其非典型地具有在其它任何具有三个组合位点的抗体中发现的结构。
VRC01是最近发现的靶向HIV刺突上的CD4结合位点(CD4bs)的广谱中和抗体。通过纯化结合可溶的、生物素标记的、稳定化的以及重现表面化的(re-surfaced)的HIV gp120的核心片段的单个B细胞而分离出VRC01(X.Wu等人.,Science 329,856(Aug 13,2010))。虽然是成功的，但分离效率低，从一个个体的2500万个外周血单核细胞仅产生3个密切相关的结合HIV的抗体。和其它通过单个细胞抗原捕获方法所获得的抗-HIV抗体一样，VRC01-3显示了非常高水平的体细胞突变，其对于效力和广度是基本的。这种高频率突变对于抗体克隆是潜在的障碍，因为突变序列可能不再与用于克隆的引物互补。
一些研究报道，某些患者产生广谱中和的HIV抗体。研究报道了，在非人灵长类的被动转移实验中，抗体可以防御初始的HIV感染，并且可以在感染过程中调节病毒装载。参见，例如，Mascola,2000；Shibata,1999；Veazey,2003；Parren,2001；Mascola,1999；Trkola,2005；Wei,2003；Frost,2005；Burton,2004；Mascola,2007；Karlsson Hedestam,2008；McMichael,2006；Zolla-Pazner,2004。
发明内容
本发明在一个实施方式中提供了HIV广谱中和抗体。在一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含重链，该重链包含共有的氨基酸序列：
QXXLXQSGGXVKKPGXSVXVSCXASGYXXFXXYXIHWXRQAPGXGXXWVGXIXPRXGXXXXAXXFQGRLSLTRDXXXXXXTXXXFMDLXGLRXDDTAVYFCARXXXXXXXXXXXXXXXXXXDX(SEQ ID NO:1)，其中X表示任意氨基酸或无氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含轻链，该轻链包含共有的氨基酸序列：
EIXLTQSPXSLSXSXGEXXTISCXXXQXXXXXXXLXWYQQRXGXAPRLLIXXXSXXXXGVPXRFSGXXXGXXYXLXISXLXXDDXAXYFCXXYEXXXXXXX(SEQ ID NO:2)，其中X表示任意氨基酸或无氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含重链和轻链，其中重链包括高度保守的共有序列，轻链包括高度保守的共有序列。本发明进一步提供了生产分离的HIV抗体的方法，该抗体包含重链和轻链，其中重链包含高度保守的共有序列，轻链包含高度保守的共有序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链共有序列以及SEQ ID NO：2的轻链序列。在进一步的实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链共有序列以及SEQ ID NO：2的轻链序列的一种或两种，或与其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，且所述抗体不具有VRC01的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链共有序列以及SEQ ID NO：2的轻链共有序列的一种或两种，并且其中所述抗体在小于1.0μg/ml的IC50浓度时中和HIV病毒ZM53M.PB12，或在小于1.0μg/ml的IC50浓度时中和HIV病毒R1166.c1，或在小于30μg/ml的IC50浓度时中和DU172.17。在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链共有序列以及SEQ ID NO：2的轻链共有序列的一种或两种，其中所述抗体在小于30μg/ml的IC50浓度时中和VRC01抗性的HIV病毒。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其选自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、8ANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含重链CDR1、CDR2和CDR3区域和轻链CDR1、CDR2和CDR3区域，这些区域包括HIV抗体相应区域的氨基酸序列，所述HIV抗体选自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含选自SEQ ID NO：5-438的氨基酸序列的重链。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含选自SEQ ID NO：439-583的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含重链和轻链，所述重链和轻链包括表A或表B中所列的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包括含有氨基酸序列：ASWDFDF(SEQ ID NO：3)的插入序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包括含有氨基酸序列：TARDY(SEQ ID NO：4)的插入序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含插入序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
在另一个实施方式中，本发明提供了用以提高分离的HIV抗体的HIV中和效力和广度的方法，所述方法包括插入至少一个插入序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
根据另一个实施方式，本发明提供了包含本发明的分离的HIV抗体的组合物。
根据另一个实施方式，本发明提供了包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
根据另一个实施方式，本发明提供了编码本发明的分离的HIV抗体的核酸分子。
根据其他的实施方式，本发明提供了包含编码本发明的分离的HIV抗体的核酸分子的载体，以及包含所述载体的细胞。
根据另一个实施方式，本发明提供了预防或治疗HIV感染或HIV相关疾病的方法，其包括步骤：鉴定需要这种预防或治疗的哺乳动物受试者，以及施与所述受试者至少一种治疗有效量的本发明的HIV抗体。
根据另一个实施方式，方法进一步包括施用第二治疗剂。根据另一个实施方式，第二治疗剂是抗病毒剂。
本发明的另一个实施方式提供了减少病毒复制或感染传播到其他宿主细胞或组织中的方法，其包括用至少一种本发明的抗体接触哺乳动物细胞。根据另一个方面，本发明提供了用于治疗感染了HIV的哺乳动物受试者的方法，该方法包括施与所述受试者包含至少一种本发明的抗体的药物组合物。
根据另一个实施方式，本发明提供用于制备和施用HIV抗体制剂的方法，其中HIV抗体制剂适合以一定量或根据足以诱导对HIV的保护性免疫反应或降低哺乳动物受试者中HIV病毒的计划表施用于患有HIV感染或具有感染HIV风险的哺乳动物受试者。在另一个实施方式，本发明提供了用于检测生物样品中包含含有高度保守共有序列的重链和含有高度保守共有序列的轻链的HIV抗体的方法，。
在另一个实施方式中，本发明提供了本发明的分离的抗体，其用于治疗HIV。
在另一个实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含本发明的药学有效量的分离的HIV抗体的药学上可接受的剂量单位，以及药学有效量的HIV试剂的药学上可接受的剂量单位，所述HIV试剂选自非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、进入或融合抑制剂以及整合酶抑制剂，其中这两种药学上可接受的剂量单位都可以任选地采取单个药学上可接受的剂量单位的形式。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于诊断、预后或监测受试者的HIV治疗的试剂盒，其包括一种或多种检测试剂，该检测试剂特异性结合来源于受试者的生物样品中的抗-HIV中和抗体。在本发明的另一个方面中，所述试剂盒还提供了用于进行PCR或质谱的试剂。
附图说明
图1A-D显示了HIV抗体中和活性IC50。(A)限制面板。最上面一行表示供体数，然后是克隆或抗体(表4)；病毒显示在左侧。颜色表示IC50浓度：红色≤0.1μg/ml；橙色0.1-1μg/ml；黄色1-10μg/ml；绿色≥10μg/ml；白色表示在测试的任何浓度下未被中和。(B)扩展面板。(C)比较VRC01、NIH45-46、3BNC117的中和总结图。线段长度和圆的尺寸与IC50成反比。颜色表示病毒进化枝：红色A、蓝色B、绿色C、紫红色D、黑色AE、金色AG。(D)3BNC60(SEQ ID NO：893)、1B2530和8ANC134重链的序列，浅灰覆盖的为在质谱图中发现的肽。红点表示了各种种系序列之间的差异。
图2A-C显示HIV抗体的结合性质。(A)12A12、12A21和12A-种系(GL)还原(reverted)的抗体结合到YU2-gp140和2CC-核心的代表性SPR传感图。(B)图显示了代表性抗体的KA。(C)图显示了与所示抗体孵育后，结合到表达Bal.26的293T细胞的抗-CD4i抗体的平均荧光强度。表显示了抗体是否诱导了CD4i位点可达性。
图3A和B显示了HIV抗体的共有序列，以及HIV抗体的氨基酸序列。(A)种系基因、10个选择的抗体和8ANC195(分别为SEQ ID NO：1和890-902，按出现顺序编号)关于框架区(FR)和CDR区的氨基酸一致性的比对。残基根据3BNC60的结构来编号。(B)同A类似，显示了轻链(分别为SEQ ID NO：2和903-916，按出现顺序编号)的比对。(C、D和E)3BNC60Fab的晶体结构。
图4A和B显示了将高度突变的免疫球蛋白重链用特异引物恢复。(A)新旧引物组的并列比较。红色框表示IgVH基因的成功扩增。图4A分别公开了SEQ ID NO：917-979，按出现顺序编号)(B)结合来源于Pt 8的2CC-核心的HIV抗体。克隆家族表示为不同扩展的片形。二个不能用旧引物组扩增的高突变克隆显示为条纹扇形。
图5显示了新的VRC01克隆成员的Ig V重链(A)(分别为SEQ ID NO：980-984，按出现顺序编号)和轻链(B)(分别为SEQ ID NO：985-989，按出现顺序编号)的序列。
图6显示了患者血清中和活性。(A)表总结了在Tzm-bl检测中抗一组Tier 2病毒的纯化的血清IgG的中和活性。暗红色框表示IC50值低于10μg/ml，橙色表示为IC50值在10-100μg/ml之间且黄色表示为IC50值高于100μg/ml。(B)点图总结了4个更广泛测试的患者的A中所示的IC50值。
图7证明了通过质谱对抗体的检测。碰撞活化的解离(collision activateddissociation)MS/MS谱记录了带两个电荷的来自3BNC153HC的肽HSDYCDFDVWGSGSQVIVSSASTK(SEQ ID NO：888)(A)和来自8ANC134HC的DGLGEVAPAYLYGIDAWGQGTTVIVTSA STK(SEQ ID NO：889)。(B.将观察到的b型片段离子(含N-末端)和y-型片段离子(含C-末端)标记于谱中。来自片段离子的水的损失表示为*。对应于来自母离子的水的损失的离子标记于谱中。观察到的骨架裂解在序列中用
表示b型离子并且用
表示y型离子。
图8A和B证实了HIV抗体的亲和力。(A)通过表面等离子体共振(SPR)测定的结合于gp140和2CC-核的抗体。所选的3BNC-抗体克隆的抗体结合的SPR传感图随时间显示。(B)柱状图显示了A中所示的所选IgG抗体与gp140和2CC-核心抗原的结合亲和力(KA)。RU，反应单位。
图9A-C显示了所选HIV抗体对于(A)免疫球蛋白重链基因、(B)轻链κ和(C)轻链λ基因序列的体细胞超突变分析。用其各自的种系核苷酸序列进行序列比对。体细胞突变显示为红色的字母，另外灰色框是指替代突变。具有指示共有残基的*的种系氨基酸序列显示于核苷酸比对之上。图9A公开了SEQ ID NO：991、990和992-997；图9A续公开了SEQ ID NO：999、998和1000-1003；图9B公开了SEQ ID NO：1005、1004和1006-1009；图9B续公开了SEQID NO：1011、1010和1012-1015；且图9C公开了SEQ ID NO：1017、1016和1018-1019，全部都是分别以出现顺序编号的。
图10A-C显示了来自每个(A)病人(Pt)1、(B)Pt3和(C)Pt8的一个扩展的中和克隆的抗体序列。通过质谱鉴定的肽以颜色表示。通过一个或多个质谱所观察到的肽(由浅灰色表示)唯一地定义标有星号的变体。其余的质谱所观察到肽不唯一地对应多个变体，表示为深灰色。带有下划线的氨基酸表示显示的变体中的非胰蛋白酶裂解位点。推测裂解通过胰凝乳蛋白酶裂解或其他突变(在克隆的变体中未观察到)产生，所述突变在这些位点加入了赖氨酸或精氨酸残基。图10A公开了SEQ ID NO：1020-1061；图10B公开了SEQ ID NO：1062-1113；且图10C公开了SEQ ID NO：1114-1138，全部都是分别以出现顺序编号。
具体实施方式
发明的详细说明
I.HIV中和抗体
本发明的一个实施方式中提供了抗HIV广谱中和抗体。在一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有共有氨基酸序列：
QXXLXQSGGXVKKPGXSVXVSCXASGYXXFXXYXIHWXRQAPGXGXXWVGXIXPRXGXXXXAXXFQGRLSLTRDXXXXXXTXXXFMDLXGLRXDDTAVYFCARXXXXXXXXXXXXXXXXXXDX(SEQ ID NO：1)的重链，其中X表示任意氨基酸或无氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有共有氨基酸序列：
EIXLTQSPXSLSXSXGEXXTISCXXXQXXXXXXXLXWYQQRXGXAPRLLIXXXSXXXXGVPXRFSGXXXGXXYXLXISXLXXDDXAXYFCXXYEXXXXXXX(SEQ ID NO：2)的轻链，其中X表示任意氨基酸或无氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链序列和SEQ ID NO：2的轻链序列。在进一步的实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO：1的重链序列和SEQ ID NO：2的轻链序列的一种或两种，或与其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，且抗体不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比如下文所公开的进行测定。
在其它实施方式中，本发明提供分离的HIV抗体，其包含含有高度保守的重链氨基酸序列的重链和含有高度保守的轻链氨基酸序列的轻链。高度保守的重链氨基酸序列在本文中定义为与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。高度保守的轻链氨基酸序列在本文中定义为与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。同一性百分比如下文所公开的进行测定。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有高度保守的重链氨基酸序列的重链和含有高度保守的轻链氨基酸序列的轻链，且抗体不具有VRC01的序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO：2的轻链序列的一个或两个，并且其中抗体在小于1.0μg/ml的IC50浓度下中和HIV病毒ZM53M.PB12，或在小于1.0μg/ml的IC50浓度下中和HIV病毒R1166.c1，或在小于30μg/ml的IC50浓度下中和DU172.17。在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含SEQ ID NO:1的重链序列和SEQ ID NO:2的轻链序列的一个或两个，其中抗体在小于30μg/ml的IC50浓度下中和抗VRC01的HIV病毒。抗VRC01的HIV病毒在本文中定义为在50μg/ml的IC50值时能耐受VRC01的中和的HIV病毒。抗VRC01的HIV病毒包括，例如，HO86.8、DU172.17、250-4、278-50以及620345.c1。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其选自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含重链CDR1、CDR2和CDR3区和轻链CDR1、CDR2和CDR3区，这些区域包括选自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196的HIV抗体的相应区域的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有选自SEQ ID NO：5-438的氨基酸序列的重链。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有选自SEQ ID NO：439-583的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有列于表A或表B中的氨基酸序列的重链和轻链。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有氨基酸序列：
ASWDFDF(SEQ ID NO：3)的插入序列。在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其中插入序列SEQ ID NO：3对应于起始于如图5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重链的FR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：3替换了本发明的HIV抗体的相应区域。例如，SEQ ID NO：3可以插入在重链FR3的第七个氨基酸之后。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其包含含有氨基酸序列：
TARDY(SEQ ID NO：4)的插入序列。在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其中插入序列SEQ ID No：4对应于起始于如图5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重链的CDR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：4替换了本发明的HIV抗体的相应区域。例如，SEQ ID NO：4可以插入在重链CDR3的第四个氨基酸之后。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的HIV抗体，其中插入序列SEQ ID No：3对应于起始于如图5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重链的FR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：3替换了本发明的HIV抗体的相应区域，并且插入序列SEQID No：4对应于起始于如图5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重链的CDR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：4替换了本发明的HIV抗体的相应区域。例如，SEQ IDNO：3可以插入在重链的FR3的第七个氨基酸之后并且SEQ ID NO：4可以插入在重链的CDR3的第四个氨基酸之后。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于提高分离的HIV抗体的HIV中和效力和广度的方法，其包含制备分离的HIV抗体，其中插入序列SEQ ID No：3对应于起始于如图5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重链的FR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：3替换了本发明的HIV抗体的相应区域，和/或插入序列SEQ ID No：4对应于起始于如图5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重链的CDR3区域，如通过序列比对所确定的，插入序列SEQ ID NO：4替换了本发明的HIV抗体的相应区域。例如，SEQ ID NO：3可以插入在重链的FR3的第七个氨基酸之后和/或SEQ ID NO：4可以插入在重链的CDR3的第四个氨基酸之后。本领域技术人员可以利用用于多肽或抗体生产的重组方法和/或合成化学技术修饰抗体的氨基酸序列。此外，本领域技术人员能够通过使用如下所述的HIV中和分析鉴定具有更强HIV中和效力和广度的改良的HIV抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了改良的分离的HIV抗体，其包括插入序列SEQID NO：3和SEQ ID NO：4中的至少一个，其中所述改良的分离的HIV抗体与所述没有插入序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的分离的HIV抗体相比，具有更强的HIV中和效力和广度。本领域技术人员能够通过使用如下所述的HIV中和分析鉴定具有更强的HIV中和效力和广度的改良的HIV抗体。
本领域技术人员可以利用用于多肽或抗体生产的重组方法和/或合成化学技术修饰抗体的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了制备分离的HIV抗体的方法，其包含SEQ IDNO：1的重链共有序列和SEQ ID NO：2的轻链序列。在另一个实施方式中，本发明提供了生产分离的HIV抗体的方法，其包括SEQ ID NO：1的重链共有序列和SEQ ID NO：2的轻链序列中的一个或两个，或者与其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，并且该抗体不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比按如下所述进行测定。
在另一个实施方式中，本发明提供了检测分离的HIV抗体的方法，其包括从哺乳动物受试者获得含免疫球蛋白的生物样品，从所述样品分离HIV抗体，测定HIV抗体的氨基酸序列，并鉴定是否存在SEQ ID NO：1的重链序列和SEQ ID NO：2的轻链序列。在另一个实施方式中，本发明提供了选择分离的HIV抗体的方法，其包括测定是否存在SEQ ID NO：1的重链共有序列和SEQ ID NO：2的轻链序列中的一个或两个，或者与其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，并且该抗体不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比按下文所述进行测定。生物样品可以是血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检。氨基酸序列可以通过本领域已知的方法包括如PCR和质谱进行测定。
本文所用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异抗体和多反应性抗体)以及抗体片段。因此，在本说明书任意语境使用的术语“抗体”是指包括，但不限于，任意的特异性结合成员、免疫球蛋白类型和/或同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)；和其生物相关片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv和scFv(单链或相关物)。本领域知晓，抗体是包含通过二硫键内部相连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)组成。轻链是由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链和轻链两者的可变区都包括框架区(FWR)和互补决定区(CDR)。四个FWR区相对保守，而CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)代表超变区并且从NH2末端到COOH末端排列如下：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域，而依据同种型，恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
同时，本文所定义的“抗体”也包括嵌合抗体、人源化抗体和重组抗体、产生于转基因非人类动物的人抗体以及选自利用本领域技术人员可使用的富集技术产生的库的抗体。
术语“可变”是指抗体间可变(V)区的某些片段在序列上存在广泛差异。所述V结构域介导抗原结合并且定义了特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均匀分布在跨越110个氨基酸的可变区域中。相反，V区域由每个均长9-12个氨基酸的被称为“超变区”的具有极度可变性的较短区域所分割的具有15-30个氨基酸的相对不变的被称为框架区(FR)的片段(stretch)组成。天然的重链和轻链的可变区每一个都包括四个FR，大多采取β-片层构型，通过3个超变区相连，其形成连接部分β-片层结构，并且在某些情况中形成部分β-片层结构的环。每条链中的超变区通过FR紧密相连，并与来自其它链的超变区一起促进抗体的抗原结合位点形成(参见，如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
本文的术语“超变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”(“CDR”)的氨基酸残基。
本文所用术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。术语“多克隆抗体”是指包括抗不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。
本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的，只要它们展现出期望的生物学活性(参见，例如，美国专利No.4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本发明提供了来自人抗体的可变区抗原结合序列。因此，本文主要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(如CDR)并含有一个或多个来自非人抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文所述的嵌合抗体是包含一种抗体类别或亚类的人可变区域抗原结合序列以及来自另一个抗体类别或亚类的另一个序列如FR或C区序列的抗体。
“人源化抗体”通常认为是具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基的人抗体。这些非人氨基酸残基经常称为“引入”(import)残基，其通常取自“引入”可变区。人源化可以通过以下Winter及其同事提出的方法通过用引入超变区序列替代相应的人抗体序列进行(参见，例如Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(参见，例如，美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于一个完整的人可变区域被非人类物种来源的相应序列所替换。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，如完整抗体的抗原结合或可变区域。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见，例如，美国专利No.5,641,870；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段包含由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密的非共价结合的方式形成的二聚体。从这两个结构域的折叠产生出6个超变环(从H和L链各形成3个环)，其提供氨基酸残基用于抗原结合，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区域(或Fv的一半，其仅包含3个抗原特异的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，虽然与完整结合位点相比，其亲和力较低。
“单链Fv”(“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽可以进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽连接臂，其使得sFv形成抗原结合所需的结构。对于sFv的综述，参见，例如，Pluckthun在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995,以下。
术语“双价抗体”是通过构建在VH和VL结构域之间具有短连接臂(约5-10个残基)的sFv片段制备的小抗体片段，使得获得V结构域的链间而不是链内的配对，形成二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异双价抗体是两个“交叉”的sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双价抗体更充分地描述于，例如EP404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
结构域抗体(dAb)，其可以由完全人的形式进行生产，是抗体的最小已知的抗原结合片段，其范围为约11kDa至约15kDa。dAb是免疫球蛋白的重链和轻链的高(robust)可变区(分别是VH和VL)。其高表达于微生物细胞培养物中，显示出良好的生物物理特性，包括例如但不限于，溶解度和温度稳定性，并且非常适合于在体外筛选系统如噬菌体展示中进行筛选和亲和力成熟。dAb作为单体具有生物活性，并且由于它们的小尺寸和固有的稳定性，可以形成(formatted)较大的分子以产生具有延长的血清半衰期或其它药理活性的药物。这种技术的实例公开在，例如，WO9425591描述了来源于骆驼科动物(Camelidae)重链Ig的抗体，以及US20030130496描述了从噬菌体文库中分离单结构域的完全人抗体。
Fv和sFv是唯一的具有完整结合位点而缺少恒定区的种类。因此，它们在体内使用中适合于减少非特异结合。构建sFv融合蛋白以产生在sFv的氨基末端或羧基末端任意一端的效应蛋白的融合。参见，例如Antibody Engineering,ed.Borrebaeck,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利No.5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以是单特异的或双特异的。
在某些实施方式中，本发明的抗体是双特异或多特异的。双特异抗体是对于至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异抗体可结合到单个抗原的两个不同表位上。其它此类抗体可结合具有对于第二抗原的结合位点的第一抗原结合位点。或者，抗HIV臂可以与结合白细胞的触发分子上的臂相组合，触发分子如T细胞受体分子(如CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FCγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以便将细胞防御机制集中并定位于受感染的细胞。双特异抗体也可用于将细胞毒性试剂定位于受感染的细胞。双特异抗体可以以全长抗体或抗体片段进行制备(例如，F(ab')2双特异抗体)。例如，WO96/16673描述了双特异anti-ErbB2/anti-FcγRIII抗体并且美国专利No.5,837,234公开了双特异anti-ErbB2/anti-FcγRI抗体。例如，WO98/02463公开了双特异anti-ErbB2/Fcα抗体；美国专利No.5,821,337公开了双特异anti-ErbB2/anti-CD3抗体。也可参见，如Mouquet等，Polyreactivity Increases The Apparent Affinity Of Anti-HIVAntibodies By Heteroligation.NATURE.467,591-5(2010)。
用于制备双特异抗体的方法是本领域已知的。传统的生产全长双特异抗体的方法基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两种链具有不同的特异性(参见，如Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。相似的方法公开在如WO93/08829、Traunecker等人，EMBO J.,10:3655-3659(1991)以及Mouquet等人，PolyreactivityIncreases The Apparent Affinity Of Anti-HIV Antibodies ByHeteroligation.NATURE.467,591-5(2010)中。
或者，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区融合到免疫球蛋白恒定结构域序列上。与Ig重链恒定结构域的融合包含至少部分的铰链、CH2和CH3区。根据一些实施方式，含有轻链结合的必要位点的第一重链恒定区域(CH1)至少存在于其中一种融合之中。编码免疫球蛋白重链融合以及，如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA，插入到分别的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。当用于构建的三种多肽链的不等比例可以提供所需的双特异抗体的最佳产量时，这种方式可为调整实施方式中的三种多肽片段的相互比例提供更大的灵活性。但是，当以相同比例表达至少两种多肽链可导致高产量或当比例对期望的链结合的产量无明显影响时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
用于从抗体片段产生双特异抗体的技术也已在文献中公开。例如，可使用化学连接来制备双特异抗体。例如，Brennan等人，Science，229：81(1985)中公开了一种方法，其中完整抗体被蛋白水解切开进而产生F(ab')2片段。这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的条件下被还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后，产生的Fab'片段被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，Fab'-TNB衍生物中的一个通过用巯基乙胺还原进而重新转换为Fab'-硫醇，并与其它Fab'-TNB衍生物等摩尔量混合，以形成双特异抗体。产生的双特异抗体可作为酶的选择性固定的试剂。
抗体的其它修饰在本文中也有涉及。例如，抗体可被连接到多种非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体还可以通过如凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)包埋在制备的微胶囊中并用于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或用于大珠滴乳液。这样的技术公开于，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)。
通常，本发明的抗体是重组产生的，使用的载体和方法是本领域已有的。人抗体还可以通过体外活化的B细胞来产生(参见，例如，美国专利No.5,567,610和5,229,275)。本发明在分子遗传学和基因工程方面所使用的常规方法公开在现行版的Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)；GeneExpression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,D.Goeddel编,1991.AcademicPress,San Diego,CA)；"Guide to Protein Purification"in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Innis等人，1990.Academic Press,San Diego,CA)；Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY)以及Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.。试剂、克隆载体和用于遗传操做的试剂盒购自商业供应商如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Clontech和Sigma-AldrichCo。
人抗体也可以在转基因动物(如小鼠)中产生，其能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生全组成成分的人抗体。例如，已经公开了在嵌合和种系突变的小鼠中纯合缺失抗体重链连接区域(JH)基因导致完全抑制内源抗体的产生。将人种系的免疫球蛋白基因转到这样的种系突变的小鼠中通过抗原攻击产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.,7:33(1993)；美国专利No.5,545,806、5,569,825、5,591,669(均是GenPharm的)；美国专利No.5,545,807以及WO 97/17852。这样的动物可以被遗传工程改造以产生包括本发明的多肽的人抗体。
已经开发了各种用于产生抗体片段的技术。通常，这些片段通过蛋白水解消化衍生自完整抗体(参见，例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods24:107-117(1992)以及Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，现在这些片段可直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可表达在E.coli中并由E.coli分泌，从而可容易地生成大量的这样的片段。Fab'-SH片段可从E.coli中直接回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(参见，例如，Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(AB')2片段可以从重组宿主细胞培养物中直接分离。美国专利No.5,869,046中公开了具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段，其包含补救(salvage)受体结合表位残基。其它用于生产抗体片段的技术对于技术人员是明显的。
用于从库中使用富集技术筛选抗体片段的其它的技术在本领域里是已知的，包括但不限于：噬菌体展示；核糖体展示(Hanes和Pluckthun，1997,Proc.Nat.Acad.Sci.94:4937-4942)；细菌展示(Georgiou等人，1997,Nature Biotechnology 15:29-34)和/或酵母菌展示(Kieke等人，1997,Protein Engineering 10:1303-1310)，这些都可代替先前所描述的技术来筛选单链抗体。从直接利用丝状噬菌体技术产生的单链抗体库中筛选单链抗体。噬菌体展示技术是本领域已知的(例如，参见来源于Cambridge Antibody Technology(CAT)的技术)，其公开于美国专利No.5,565,332；5,733,743；5,871,907；5,872,215；5,885,793；5,962,255；6,140,471；6,225,447；6,291650；6,492,160；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081以及其他美国专利家族成员中，或依赖于在1992年5月24日提交的优先权申请GB 9206318的申请，也可参见Vaughn等人1996,NatureBiotechnology 14:309-314。单链抗体还可以用已知的重组DNA技术，如DNA扩增方法(如PCR)或可以通过使用相应的杂交瘤cDNA作为模板进行设计并构建。
变体抗体也包括在本发明范围之内。因此，申请中所列举的序列的变体也包括在本发明范围之内。可以通过使用本领域已知的方法获得具有改良的亲和性的抗体序列的其他变体并且这些变体也包括在本发明范围之内。例如，氨基酸替换可用于获得具有进一步改良的亲和性的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善抗体生产中的表达系统的翻译效率。
这样的变体抗体序列与申请中列举的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同一性。这样的序列同一性是相对于参考序列(即，申请中列举的序列)的全长计算获得的。本文所述的百分比同一性是通过使用BLAST版本2.1.3并使用由NCBI(美国国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)给定的默认参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚分＝11并且空位延伸罚分＝1]来确定的。例如，本发明提供的肽序列包含至少约5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本发明公开的一个或多个序列的连续肽以及其之间所有的中间长度的肽。本文所用的术语“中间长度”是指在所引用值中间的任意长度，如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等。
本发明提供单独的抗体，或与其它抗体联合的抗体，例如但不限于VRC01和PG9，其在血清中具有广谱中和活性。
根据另一个实施方式，本发明提供了用于制备和施用HIV抗体组合物的方法，其适合对患有HIV感染或处在HIV感染风险下的人类或非人类灵长类动物患者以一定量且根据方案施用抗体组合物，所述方案足以诱导人类中的对抗HIV的保护性免疫应答或减少HIV病毒。
根据另一个实施方式，本发明提供了包含至少一种本发明的抗体和药学上可接受的载体的疫苗。根据一个实施方式，所述疫苗是包含至少一种本文所述的抗体和药学上可接受的载体的疫苗。该疫苗可包括具有本文所述特征的、任意组合的多种抗体并且可以进一步包括本领域已知的中和HIV的抗体。
应当理解，组合物可以是单一的本文所述的抗体或本文所述抗体的组合，其可以是相同或不同的，用以预防性或治疗性处理疫苗接种后各种亚型的HIV感染的进展。这样的组合可以根据所期望的免疫力来进行筛选。当抗体施于给动物或人时，其可以与一种或多种本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂组合。组合物还可以包括本领域已知的广谱中和抗体，包括但不限于VRC01、PG9和b12。
此外，对于确定患者中HIV治疗的有效水平，特别地，合适的动物模型是可以获得的并且已广泛用于评估各种基因治疗方案在体内对抗HIV的功效(Sarver等人，(1993b),见上文)。这些模型包括小鼠、猴和猫。即使这些动物HIV疾病天然不敏感，用人外周血单核细胞(PBMC)、淋巴结、胎儿肝脏/胸腺或其它组织重组的嵌合小鼠模型(例如SCID、bg/nu/xid、NOD/SCID、SCID-hu、免疫活性的SCID-hu、骨髓消融的BALB/c)也可以用慢病毒载体或HIV感染，并作为HIV发病机理的模型。相似地，可使用猴免疫缺陷病毒(SIV)/猴模型以及猫免疫缺陷病毒(FIV)/猫模型。根据本发明，当用于治疗性治疗AIDS时，药物组合物可以包括其它药物与载体。这些其它药物可以以其传统方式来使用(即，作为抗病毒剂治疗HIV感染)。HIV药剂的实例包括但不限于非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、进入或融合抑制剂和整合酶抑制剂。
根据另一个实施方式，本发明提供了基于抗体的药物组合物，其包含有效量的分离的HIV抗体或亲和力成熟版本，其为减少HIV病毒的感染提供了预防性或治疗性治疗的选择。本发明的基于抗体的药物组合物可以通过任意数目的本领域已知的策略进行配制(例如，参见McGoff和Scher,2000,Solution Formulation of Proteins/Peptides:InMcNally,E.J.,ed.Protein Formulation and Delivery.New York,NY:Marcel Dekker；pp.139-158；Akers和Defilippis,2000,Peptides and Proteins as ParenteralSolutions.In:Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins.Philadelphia,PA:Talyor and Francis；pp.145-177；Akers等人，2002,Pharm.Biotechnol.14:47-127)。适合于患者施用的药学上可接受的组合物包含有效量的制剂中的抗体，其在可接受温度范围内的贮存过程中既保留了生物活性也可促进最大稳定性。药物组合物还可以包括，依赖于所需要的制剂，药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂或常规用于配制施用于动物或人的药物组合物的这类载体。所选择的稀释剂不应影响组合物的生物活性。这类稀释剂的实例是蒸馏水、磷酸盐生理缓冲盐水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。本发明的药物组合物或制剂中有用的赋形剂的量是为了将抗体均匀分散在整个组合物中，使得当其传递给有需求的受试者时，其可以是均匀分散的量。它可以用于稀释抗体到这样一个浓度，该浓度提供了所需的有益缓和效果或治疗效果，并同时将可能由过高浓度引起的任何不良副作用最小化。其还具有防腐效果。因此，对于具有高生理活性的抗体而言，将使用较多的赋形剂。另一方面，对于任何表现出较低生理活性的活性成分而言，将使用较少量的赋形剂。
包含至少一种本文所述的抗体或本文所述的抗体的组合的上述抗体和抗体组合物或疫苗组合物可以用于预防性和治疗性治疗HIV病毒感染。
本发明还涉及分离的多肽，其包含列于表A、B和图10A-C的轻链和重链的氨基酸序列；SEQ ID NO:1和2的重链和轻链的共有序列；以及插入序列SEQ ID NO：3和4。
在其它相关实施方式中，本发明提供了多肽变体，其编码列于表A、B和图10A-C的HIV抗体的氨基酸序列；SEQ ID NO:1和2的重链和轻链的共有序列；以及插入序列SEQ IDNO：3和4。这些多肽变体与本发明的多肽序列相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更高的序列同一性，如通过使用本文所述方法所测定的(例如，使用标准参数的BLAST分析)。本领域技术人员将认识到，通过考虑氨基酸相似性等因素，这些值可以适当地调整从而确定编码的的蛋白的相应同一性。
术语“多肽”取其常规含义，即氨基酸的序列。多肽不限于一个特定长度的产物。肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义之内，并且除非另有说明，这些术语可以互换地使用。此术语也包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。多肽可以是完整的蛋白质或其亚序列。本发明语境中感兴趣的特定多肽是含有CDR、VH和VL的氨基酸亚序列，并能够结合抗原或HIV感染的细胞。
本文所用的术语多肽“变体”是多肽，其通常不同于本文所具体公开的多肽，其具有一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。这样的变体可以是天然存在或合成产生的，例如，通过对本发明的一个或多个上述多肽序列进行修饰，且对本文所述的多肽的一个或多个生物活性进行评估和/或使用任何数量的本领域公知的技术。
例如，某些氨基酸可以替换在蛋白质结构中的其它氨基酸而没有明显损失与其它多肽(如抗原)或细胞结合的能力。由于结合能力和蛋白性质决定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上进行某些氨基酸序列的替换并且，因此，其基础的DNA编码序列，从而获得具有类似性质的蛋白质。因此，考虑到的是，在所公开的组合物的肽序列或相应的编码所述肽的DNA序列中制备各种变化，而未明显损失它们的生物效用或活性。
在许多情况中，多肽变体含有一个或多个保守替换。“保守替换”是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水(hydropathic)性质基本上不发生变化。
氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
“同源性”或“序列同一性”是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％的多核苷酸或多肽同源性。
这样的变体多肽序列与申请所列举的序列具有70％或以上(即80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在其他实施方式中，本发明提供了多肽片段，其包括本文所公开的氨基酸序列的各种长度的连续延伸段(stretch)。例如，本发明提供的肽序列包含至少约5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本发明公开的一个或多个序列的连续肽以及其之间所有的中间长度的肽。
本发明还包括编码本发明的抗体的重链和轻链的部分或全部的核酸序列及其片段。由于遗传密码的冗余性，将存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。
本发明还包括分离的核苷酸序列，其编码列于表A、B和图10A-C中的HIV抗体重链和轻链的多肽；SEQ ID NO:1和2的重链和轻链的共有序列；以及插入序列SEQ ID NO：3和4。
在其它相关实施方式中，本发明提供了多核苷酸变体，其编码列于表A、B和图10A-C的HIV抗体的重链和轻链的肽序列；SEQ ID NO:1和2的重链和轻链的共有序列；以及插入序列SEQ ID NO：3和4。这些多核苷酸变体与本发明的多核苷酸序列相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更多的序列同一性，如通过使用本文所述方法测定的(例如，使用标准参数的BLAST分析)。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等因素，这些值可以适当地调整以确定相应的由2条核苷酸序列编码的蛋白的同一性。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用，是指单链或双链RNA、DNA或混合聚合物。多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外和质粒序列以及表达或被改造来表达多肽的较小的工程化的基因片段。
术语“分离的核酸”是核酸，其基本上与天然伴随天然序列的其它基因组DNA序列以及蛋白或复合物如核糖体和聚合酶相隔离。该术语包括从其天然存在环境移动的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离的形式。因此，它指最初(originally)分离的核酸并且不排除后来人工添加到分离的核酸上的基因或序列。
本文所用术语多核苷酸“变体”，是一种多核苷酸，其通常因一个或多个替换、缺失、添加和/或插入而不同于本文具体公开的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的或通过合成产生，例如通过对本发明的一个或多个多核苷酸序列进行修饰，并对编码的多肽的一个或多个生物活性进行评估和/或使用任何数量的本领域公知的技术。
修饰可以在本发明的多核苷酸结构中制备且仍然能获得有功能的分子，该分子编码具有所需特征的变体或衍生多肽。当希望改变多肽的氨基酸序列以创建本发明多肽的等价或甚至改良的变体或部分时，本领域技术人员通常会改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
通常，多核苷酸变体包含一个或多个替换、添加、缺失和/或插入，使得相对于由本文具体列出的多核苷酸序列编码的多肽，由变体多核苷酸编码的多肽的免疫原性结合性质基本没有降低。
在另一个实施方式中，发明提供了多核苷酸片段，其包含各种长度的与本文公开的一个或多个序列相同或互补的连续延伸段的序列。例如，本发明提供的多核苷酸包含本文公开的一个或多个序列的至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多的连续核苷酸以及在其中间的所有中间长度并包含所引用数值间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；并包括200-500、500-1000间的所有整数。
本发明的另一个实施方式中，提供了能够在中度至高度严格条件下与本发明提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列相杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次。本领域技术人员理解，可容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方式中，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
在一些实施方式中，由多核苷酸变体或片段编码的多肽与天然多核苷酸编码的多肽具有相同的结合特异性(即特异地或优先地结合到相同的表位或HIV病毒株)。在一些实施方式中，所述多核苷酸、多核苷酸变体、片段和杂交序列编码的多肽与本文具体列出的多肽序列具有至少约50％、至少约70％、以及至少约90％的结合活性水平。
本发明的多核苷酸或其片段，无论其自身编码序列的长度是多少，都可以与其它DNA序列如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制性内切酶位点、多克隆位点、其它编码片段等结合，使得其总长度可以变化很大。可使用几乎任何长度的核酸片段。例如，说明性的多核苷酸段具有约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对等的总长度，这些长度(也包括所有的中间长度)，这些都包括在本发明的许多实施方式中。
在一些实施方式中，本文提供的多核苷酸序列可作为探针或引物用于核酸杂交，如作为PCR引物。这样的核酸探针具有与目标序列特异性杂交的能力，使它们能够检测给定样品中是否存在互补序列。然而，本发明也包括其它用途，例如使用序列信息制备突变体的引物，或用于制备其它遗传构建体的引物。因此，本发明的核酸片段特别有用，该核酸片段包括至少约15个核苷酸长的连续序列的序列区域，该连续序列具有与本文公开的15个碱基长的连续序列相同或互补的序列。更长的连续的相同或互补序列，如约20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有的中间长度)长的那些(包括全长序列)以及这些数值间的所有长度也都用于一些实施方式中。
多核苷酸分子所具有的序列区域由10-14、15-20、30、50或甚至100-200个核苷酸左右(也包括中间长度)的连续核苷酸延伸段组成，其与本文公开的多核苷酸序列相同或互补，特别考虑到将它们作为杂交探针，用于如Southern和Northern印迹法，和/或作为用于如PCR的引物。片段总长度以及互补延伸段(strech)的大小最终取决于具体核酸片段的预期用途或应用。较小的片段通常用于杂交实施方案，其中连续互补区域的长度可以变化，如约15至约100个核苷酸之间，但根据希望检测的互补序列的长度，可以使用较大的连续互补延伸段。
使用约15-25个核苷酸长的杂交探针可形成既稳定又具有选择性的双链分子。不过，为了增加杂交体的稳定性和选择性，从而提高所得到的特异的杂交分子的质量和程度，可以利用具有多于12个碱基长度的连续互补序列的分子。可以利用具有15至25个连续核苷酸或者需要时甚至更长的基因互补的延伸段的核酸分子。
杂交探针在本文公开的任何序列的任何部分中进行选择。需要的全部仅是回顾本文所列出的序列或序列的任何连续部分，从约15-25个核苷酸长直至并包括全长序列的长度，希望利用它们作为探针或引物。探针和引物序列的选择受各种因素的制约。例如，可能希望从全部序列的末端选取引物。
本发明范围内还包括如表达载体的载体，其包含本发明的核酸序列。转化有这些载体的细胞也包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了包含本发明核酸的载体和宿主细胞，以及用于生产本发明多肽的重组技术。本发明的载体包括可以在任何类型的细胞或生物体中进行复制的载体，包括如质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体。在一些实施方式中，包括本发明多核苷酸的载体是适合于多核苷酸繁殖或复制的载体，或者是适合于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知并可以购买的。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒复制和选择的复制起点(如复制的ColE1起点)和选择标记(如氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指包含用于在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体包括抗体片段所需要的控制序列或调控元件的载体。
本文所用术语“细胞”可以是任何细胞，包括但不限于真核、多细胞物种(如与单细胞的酵母细胞相反)，例如但不限于，哺乳动物细胞或人细胞。细胞可作为单一实体或者是较大的细胞群的一部分而存在。这样的“较大的细胞群”可以包括如细胞培养物(混合的或纯的)、组织(如内皮组织、上皮组织、粘膜组织或其它组织)、器官(如肺、肝、肌肉和其它器官)、器官系统(如循环系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统或其他器官系统)或生物体(如鸟、哺乳动物等)。
本发明的多核苷酸可以全部或部分合成，其然后再使用常规的分子生物学和细胞生物学技术结合起来，并插入到载体中，常规的分子生物学和细胞生物学技术包括，如使用适当的限制性位点和限制性内切酶将多核苷酸亚克隆到线性化的载体中。本发明的多核苷酸是使用与多核苷酸每条链互补的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应进行扩增获得的。这些引物还包括限制性内切酶酶切位点以促使亚克隆到载体中。可复制的载体构件通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记或选择基因。
为了表达本发明的多肽，编码多肽或其功能等同物的核苷酸序列可以插入到合适的表达载体中，即含有对插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。本领域技术人员公知的方法可用于构建含有编码目标多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这样的技术描述于如Sambrook,J.等人，(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,Plainview,N.Y.以及Ausubel,F.M.等人，(1989)Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.。
本发明还提供了用于通过使用本发明的抗体、多肽和核酸进行诊断和预后分析的试剂盒。本发明的试剂盒包括含有标记或未标记形式的本发明的HIV抗体、多肽或核酸的合适容器。此外，当抗体、多肽或核酸以适合用于进行间接分析的标记形式用于间接结合分析时，试剂盒还包括用于进行该适合的间接分析的试剂。例如，依赖于标签的性质，试剂盒可以包括含有酶底物或衍生试剂的一个或多个合适的容器。也可包括对照样品和/或使用说明。本发明还提供用于通过PCR或质谱检测生物样品中是否存在本发明的HIV抗体或HIV抗体的核酸序列的试剂盒。
本文使用的“标签”(label)是指直接或间接连接到抗体上以便产生“标记的”抗体的可检测的化合物或组合物。标签也可以连接到本文公开的多肽和/或核酸序列上。标签可以是自身可被检测到的(如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标签的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。也可以修饰本发明的抗体和多肽，以包括表位标记(tag)或标签，例如，用于纯化或诊断应用。合适的检测手段包括标签的使用，例如但不限于放射性核苷酸、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等。
根据另一个实施方式，本发明提供了诊断方法。诊断方法通常包括将HIV抗体与从患者获得的生物样品相接触，如血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检，并测定与对照样品或预定临界值相比，抗体是否优先结合于样品上，从而证明HIV病毒是否存在。
根据另一个实施方式，本发明提供了检测来自于患者的生物样品中是否存在本发明的HIV抗体的方法。检测方法一般包括从患者获得生物样品，如血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检并分离HIV抗体或其片段，或编码HIV抗体的核酸，并分析生物样品中是否存在HIV抗体。而且，本发明提供了检测细胞中的HIV抗体的核苷酸序列的方法。也可以通过使用本文公开的引物检测HIV抗体的核苷酸序列。也可利用已知的重组技术和/或使用质谱来判断来自于患者的生物样品中是否存在HIV抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于检测生物样品中HIV抗体的方法，其中HIV抗体包含含有高度保守共有序列的重链和含有高度保守共有序列的轻链，所述方法包括从哺乳动物受试者获得含免疫球蛋白的生物样品，从所述样品分离HIV抗体，并鉴定重链和轻链的高度保守共有序列。生物样品可以是血液、血清、唾液、尿、痰、细胞拭子样品或组织活检。氨基酸序列可以通过本领域已知的方法包括如PCR和质谱来确定。
术语“评估”包括任何形式的测量，且包括确定元件(elements)是否存在。术语“测定”、“测量”、“评价”、“评估”和“分析”可互换使用并包括定量和定性测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估是否存在”包括测定某物存在的量，和/或测定存在或不存在。本文所用的术语“测定”、“测量”和“评估”和“分析”可互换使用，并包括定量和定性测定。
II.减少病毒复制的方法
进一步提供了用于减少受试者中HIV病毒滴度、病毒复制、病毒增殖或HIV病毒蛋白量增加的方法。根据另一个方面，方法包括向受试者施用有效减少受试者中一种或多种HIV毒株或分离物的HIV滴度、病毒复制或者HIV蛋白量增加的量的HIV抗体。
根据另一个实施方式，本发明提供了减少病毒复制或减少传播HIV感染到其他宿主细胞或组织的方法，其包括用结合于gp120的抗原表位的抗体或其部分与哺乳动物细胞相接触。
III.治疗方法
根据另一个实施方式，本发明提供了用于治疗患有病毒感染如HIV的哺乳动物的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用含有本文公开的HIV抗体的药物组合物。根据一个实施方式，用于治疗感染HIV的哺乳动物的方法包括对所述哺乳动物施用含有本发明抗体或其片段的药物组合物。本发明的组合物可包括多于一种的具有公开的特征的抗体(如多种抗体或一群抗体)。其也可以包括其它本领域已知的HIV中和抗体，例如但不限于VRC01、PG9和b12。
被动免疫已证明是一种有效和安全的用于预防和治疗病毒性疾病的策略。(参见，例如Keller等人，Clin.Microbiol.Rev.13:602-14(2000)；Casadevall,Nat.Biotechnol.20:114(2002)；Shibata等人，Nat.Med.5:204-10(1999)；以及Igarashi等人，Nat.Med.5:211-16(1999)，其每一个都通过引用并入本文)。使用人单克隆抗体的被动免疫提供了用于紧急预防和治疗HIV的即时治疗策略。
有感染HIV相关疾病或病症风险的受试者包括与受感染人相接触的患者或通过某种其他途径暴露于HIV的患者。可以在HIV相关疾病或病症的特有症状发生之前施用预防性药剂，以防止疾病或病症，或者延迟其进程。
为了体内治疗人类和非人类患者，给患者施用或提供包括本发明HIV抗体的药物制剂。当用于体内治疗时，给患者施用治疗有效量(即消除或减轻患者病毒负荷的剂量)的本发明的抗体。以已知的方法将抗体施用给人类患者，例如静脉内给药如推注或一段时间的连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或吸入途径。抗体可以通过肠胃外或静脉内给药，如果可能的话，在目标细胞位点给药。在一些实施方式中，抗体通过静脉内或皮下给药施用。本发明的治疗性组合物可全身、胃肠外或局部施用于患者或受试者。以上用于评估成功的疾病治疗和改善的参数可容易地通过医生熟悉的常规程序进行测量。
用于肠胃外给药时，抗体可以以单位剂量的可注射的形式(溶液、悬浮液、乳浊液)与药学上可接受的肠胃外介质一起进行配制。这样的介质的实例包括但不限于水、盐水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。非水介质包括但不限于固定油和油酸乙酯。脂质体可被用作载体(carrier)。介质可含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质，如缓冲剂和防腐剂。抗体可以约1mg/ml至10mg/ml的浓度配制在这样的介质中。
剂量和剂量方案依赖于可以由医生容易地进行决定的多种因素，如感染的性质、其治疗指数、病人和病人病史。通常，将治疗有效量的抗体施用给患者。在一些实施方式中，抗体的给药量按患者体重计在约0.1mg/kg至约50mg/kg的范围内。依照感染的类型和严重程度，无论是例如通过一次或多次分开给药或是通过连续输注，按患者体重计给患者施用约0.1mg/kg至约50mg/kg(例如约0.1-15mg/kg/剂量)的抗体是初始的候选剂量。这种疗法的进展可容易地通过常规方法和分析并基于医生或其他本领域技术人员已知的标准进行监测。以上用于评估疾病的成功治疗和改善的参数可容易地通过医生熟悉的常规程序进行测量。
其它治疗方案可与本发明的HIV抗体的给药相结合。联合给药包括共给药、使用分隔的制剂或单个药物制剂，以及按任意顺序进行的连续施用，其中优选在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性的同时存在一段时间。这样的联合治疗可导致协同治疗的效果。以上用于评估疾病的成功治疗和改善的参数可容易地通过医生熟悉的常规程序进行测量。
术语“治疗”(treating)或“治疗”(treatment)或“减轻”可互换使用并且是指治疗性治疗和预防性或防范性措施二者，其中目的是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或病症。那些需要治疗的对象包括已经患有病症以及倾向于患上病症或那些病症需要被阻止的对象。如果在接受了根据本发明方法的治疗量的抗体后，该患者显示了可观察到的和/或可测量的一种或多种以下情况的减少或消失：受感染细胞减少或受感染细胞消失；受感染细胞占总细胞的百分比减少；和/或一种或多种与具体感染相关的症状缓解至某种程度；发病率和死亡率降低，并其生活质量问题改善，则受试者或哺乳动物的感染被成功“治疗”了。以上用于评估疾病的成功治疗和改善的参数可容易地通过医生熟悉的常规程序进行测量。
术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者或哺乳动物疾病或病症的抗体或药物的量。
与一个或多个其它治疗剂“联合”给药包括任意顺序的同时(并行)和连续施用。
本文所用的“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度对于暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如但不限于EDTA；糖醇，例如但不限于甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，例如但不限于钠；和/或非离子表面活性剂，例如但不限于TWEEN.；聚乙二醇(PEG)和普朗尼克(PLURONICS)。
在提供了范围的值时，应该理解，除非文中另有明确说明，否则每个插入值、到下限的单位的十分之一、该范围的上限和下限之间和任何其它在所述范围内的所述值或插入值都包含于本发明范围之内。可独立地包括于较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，只要去除被特地排除在外的极限所述范围内被特定排除在外的任何界限。当所述范围包括界限的一个或两个时，排除被包括的界限的一个或两个的范围也包括于本发明中。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所述的方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在公开了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用而全部并入本文。
本文和权利要求中使用的单数形式“一”、“和”以及“该”，除非上下文另有明确规定，包括复数对象。
提供本文公开的出版物只是由于其公开早于本申请的提交日期。本文的任何内容均不能被理解为承认了本发明由于在先发明而无权先于这些出版物。另外，出版物中提供的日期可能与实际出版日期不同，其可能需要独立地确认。
本文中所引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利所引用的每个文件或参考文献、患者或非患者的文献(包括每个授权专利审查过程中的；“申请引用的文件”)和每个对应于这些申请和专利任意一个的PCT和外国申请或专利和/或要求任何这些申请和专利的优先权的每个PCT和外国申请或专利，以及每个申请引用的文件中所引用或参考的每个文件，在此明确地通过引用而全部并入。更一般地，本文所引的文件或参考文献，要么出现在权利要求前的参考文献列表中，要么出现在本文自身中；并且，每个这样的文件或参考文献(“本文引用的参考文献”)，以及每个在本文引用的参考文献中所引用的每个文件或参考文献(包括任何制造商的规范、使用说明等)，在此明确地通过引用并入本文。
以下非限制性实施例用于进一步说明本发明。
实施例1
材料、方法和仪器
样品。人样品由所有参与机构按照伦理审查委员会(Institutional ReviewBoard,IRB)评估的协议签署知情同意书后进行收集。患者1选自纽约艾伦戴蒙艾滋病研究中心(Aaron Diamod Aids Research Center)的一组长期无进展者。患者3和8选自波士顿拉根研究所(Ragon Institute)的一组精英控制者。患者1、3和8基于其对标准组HIV分离物的广谱中和血清活性进行选择。患者12基于广谱血清中和活性从“国际艾滋病疫苗倡议组织”(International Aids Vaccine Initiative)的协议G队列(Protocol G Cohort)进行选择。
染色、单细胞分选和抗体克隆。进行2CC核和gp 140特异性Ig+记忆B细胞的染色和单细胞分选(J.F.Scheid等人，Nature 458,636(Apr 2,2009))。简言之，将CD19+B细胞用抗人CD19磁性MACS珠(Miltenyi Biotec)从外周血单核细胞进行富集，并随后用抗人CD20和抗人IgG抗体(Becton Dickinson)以及生物素化的2CC核(B.Dey等人，PLoS Pathog 5,e1000445(May,2009))或YU2-gp140三聚体(R.Diskin,P.M.Marcovecchio,P.J.Bjorkman,Nat Struct Mol Biol17,608(May,2010))进行染色，再用偶联链霉亲和素的藻红蛋白(PE,Beckton Dickinson)进行检测。单个细胞在FACSAria III细胞分选仪(Becton Dickinson)上分选到96孔PCR板(Denville)中，排除细胞双联体，该96孔PCR板中包含4μl/孔的冰冷0.5×磷酸盐缓冲盐水(PBS)，该PBS中含有10mM DTT、
(Promega)、0.4U 5′-3′Prime RNAse InhibitorTM(Eppendorf)。板用
′F`膜(BioRad)密封，立即在干冰中冷冻并贮藏于-80℃。
cDNA合成和Ig扩增均以具有下述改进的方法进行(H.Wardemann等人，Science301,1374(Sep 5,2003))：
不是使用原始引物组，第一和第二免疫球蛋白特异性PCR在半巢式方法中使用表1中所述的引物进行。将重链和轻链PCR产物克隆到其各自的表达载体中，并在HEK 293细胞中表达抗体之前，通过测序确定带有原始PCR产物的克隆表达质粒具有100％同一性。
ELISA。高结合的96孔ELISA板(Costar)用PBS中的100ng/孔的纯化抗原(gp140、gp120、gp41、gp120核和2CC-核)(B.Dey等人，PLoS Pathog 5,e1000445(2009年5月))和突变蛋白(gp120D368R、gp120I420R)包被过夜。洗涤后，将板用2％BSA、1μM EDTA、0.05％Tween-PBS(封闭缓冲液)封闭2小时，再用稀释到4μg/ml的IgG抗体和若干连续的1:4PBS稀释抗体孵育2小时。洗涤后，将板用山羊HRP-连接的抗小鼠IgG(Jackson ImmunoReseach)(封闭缓冲液中0.8μg/ml)并加入100μl的HRP显色底物(ABTS溶液，Invitrogen)孵育1h来显色。光密度使用ELISA酶标仪(Molecular Devices)在405nm(OD405nm)进行测量。减去包被的孔中单独进行PBS孵育所获得的背景值。测试IgG抗体的多反应性(H.Mouquet等人，Nature 467,591(Sep 30,2010))并且当它们识别四个测试的结构不同的抗原：ssDNA、dsDNA、胰岛素和LPS中的至少两个时，认为其是多反应性的。用于反应性的阈值通过使用对照抗体mGO53(阴性)、eiJB40(弱阳性)和ED38(高阳性)来确定。
中和分析：进行中和筛选(D.C.Montefiori,Curr Protoc Immunol Chapter 12,Unit 12 11(Jan,2005))。简言之，中和检测为单轮感染Tzm-bl细胞之后荧光素酶报告基因表达的减少。为了排除抗体样品中的非特异抗病毒活性，用MuLV(鼠白血病病毒)作为阴性对照。
骨髓浆细胞的克隆特异性识别。用Ficoll-Paque(GE Healthcare)从骨髓吸出物Ficoll纯化单核细胞后，将骨髓浆细胞用抗人CD 138和抗CD 19抗体(Becton Dickinson)进行染色。CD138+CD 19+人浆细胞在FACSAria III细胞分选仪(Becton Dickinson)进行大量分选，并参照厂商说明书用Trizol LS试剂(Invitrogen)在100.000个细胞上进行RNA分离。参照厂商说明书使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将RNA逆转录。将cDNA进行免疫球蛋白特异PCR，该PCR具有以下改进：用2轮巢式免疫球蛋白重链克隆特异PCR并使用表1中列出的第一轮正向前导序列(forward leader)和恒定区域反向引物，以及随后的基于单细胞分析获得的测序结果设计的克隆特异性正向和反向引物来扩增1μl的cDNA。依照厂商说明书将PCR产物凝胶纯化并克隆到TOPO TA载体(Invitrogen)中。用克隆特异性引物通过PCR筛选菌落并测序。
表面等离子体共振。如先前公开的方法(Mouquet 2010)，所有实验在25℃使用Biacore T100(Biacore，Inc)在HBS-EP+电泳缓冲液(Biacore，Inc)中进行。12.5μg/mL的YU-2gp140和2CC核蛋白通过pH 4.5的氨基偶联固定于CM5芯片(Biacore，Inc)上，产生100RU的固定化水平。为了对gp140-和2CC核-衍生的芯片进行动力学测量，IgG以700nM浓度通过流通池(flow cell)以及4个连续的在HBS-EP+电泳缓冲液(Biacore，Inc)中的1:2稀释以40μL/min的流速以3min的关联和5min的解离进行注射。每个实验间用pH 2.5的10mM甘氨酸-HCl以50μL/min的流速的30秒注射将传感器表面再生。解离速率(kd(s-1))、结合速率(ka(M-1 s-1)和结合常数(KD(M)或KA(M-1)在减去背景(对照流通池的结合和HBS-EP+电泳缓冲液的信号)后，通过使用Biacore T100评估软件利用动力学分析和1:1结合模型进行计算。图2和图8所示的传感图通过用Scrubber 2软件(Center for Biomolecular InteractionAnalysis,University of Utah)处理Biacore数据获得。
CD4i位点诱导。用FugeneTM6(Roche)以1:2的质粒:Fugene的比例用pMX-IRES-GFP的构建体中的gp160BAL.26Δc或gp160YU.2Δc转染293T细胞中。48小时后，用PBS洗涤293T细胞并用无胰蛋白酶的细胞解离缓冲液(Gibco)分离，并以107细胞/ml的浓度重悬在FACS缓冲液(1×PBS、2％FBS、2mM EDTA)中。sCD4(Progenics Pharmaceuticals，Inc)和mAb加入到以40μg/ml的最终浓度起始的1:4稀释系列，中的表达gp160的293T细胞中。mGO是阴性对照抗体，其不结合gp160Δc(H.Mouquet等人，Nature 467,591(2010年9月30日))。冰上孵育15min后，细胞被分开并在冰上用Alexa647-标记的CD4诱导的位点mAb(3-67；(J.F.Scheid等人，Nature 458,636(2009年4月2日))或Alexa647-标记的对照mAb(即PG16；L.M.Walker等人，Science 326,285(2009年10月9日))或针对gp160YU.2的2G12以及针对gp160BAL.26的2G12)染色25分钟。通过使用Alexa
647微量蛋白标记试剂盒(Invitrogen)进行抗体标记。在LSRFortessa细胞分析仪(BD Bioscience)上对细胞进行分析。
结晶。在HEK 293-6E细胞中瞬时表达3BNC60IgG并通过木瓜蛋白酶裂解制备制备的Fab片段(R.Diskin,P.M.Marcovecchio,P.J.Bjorkman,Nat Struct Mol Biol 17,608(2010年5月)。结晶筛选在20℃通过蒸汽扩散用nL坐滴(sitting drops)法并使用MosquitoTM(TTP LabTech)结晶机器人于MRC结晶板(Jena Bioscience)上进行。将9.5mg/ml浓度的3BNC60 Fab与贮液(reservoir solution)以1:1比例混合以产生400nL的液滴。用PEGRx HTTM(Hampton Research)结晶筛选获得初始结晶点(Initial crystallizationhits)并进一步手动优化。适用于数据收集的晶体在11.7％的聚乙二醇20000、0.1M pH 5.0的乙酸钠、100mM的酒石酸钾/酒石酸钠、20mM的硫酸锂、10mM的pH 9.5的N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)中，以具有不对称单位的2个Fab的单斜晶系空间群P21的方式，生长数周。晶体浸泡于补充了15％甘油的贮液中2小时，之后再浸泡于补充了30％甘油的贮液中并在液氮中闪冷(flash cooling)。衍射数据利用Pilatus 6M检测器在100K下的斯坦福同步加速器辐射光源(Stanford Synchrotron Radiation Lightsource,SSRL)束线12-2进行收集。数据利用XDS W.Kabsch,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,125(Feb,2010)进行索引、整合并测量(表8)。分子置换通过使用移相器，以来自于抗肿瘤抗体CTM01(PDB代码为1AD9)的VH和CH1结构域和来自于抗gp120b13抗体(PDB代码为3IDX)的VL和CL结构域作为搜索模型来进行。反复使用Phenix P.Emsley,B.Lohkamp,W.G.Scott,K.Cowtan,ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 66,486(2010年4月)和Coot(P.Emsley,B.Lohkamp,W.G.Scott,K.Cowtan,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,486(2010年4月))进行模型构建并完善到
的分辨率。使用最大似然目标函数(maximum-likelihood targetfunction)和非晶体学对称约束(non-crystallogaphic symmetry restraints)改进结构。最终模型(R工作＝20.7％；R自由＝25.7％)包括6478个蛋白原子、146个水分子和28个糖原子(表8)。残基(residue)的91.9％、7.6％和0.5％分别位于拉氏图(Ramachandran plot)的青睐、允许和禁止区域。结构分析和可视化采用PyMol(The PyMOL Molecular GraphicsSystem,版本1.3,
LLC)完成。3BNC60结构由对于轻链的残基3-205(包括连接到Asn72的N-连接的碳水化合物中的第一个N-乙酰氨基葡糖)和对于重链的2-217组成。在末端残基的残基和CH1结构域的残基133-140是无序的。
质谱。使用ProteinG Sepharose(GE Healthcare)，按厂商说明书从血清纯化IgG。然后，IgG经固定化的木瓜蛋白酶(Pierce)消化并且消化的Fab-Fc片段混合物与饱和量的生物素化2CC-核蛋白孵育。室温孵育15分钟后，加入链亲和素偶联的磁珠(Dynabeads)(Invitrogen)并用磷酸盐缓冲盐水(Gibco)进行10轮洗涤。结合的Fab片段在95C下用十二烷基硫酸锂缓冲液(Invitrogen)进行洗脱，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定样品纯度，在质谱分析之前进行银染或考马斯染色。
分离的Fab片段用二硫苏糖醇还原、用碘乙酰胺烷基化，在4-12％的NuPAGE NovexBis-Tris凝胶(Invitrogen)上的1D凝胶电泳进行解析，并用考马斯蓝(Thermo Fisher)进行染色。从凝胶中切出Fab片段，并用200ng的胰蛋白酶(Promega)消化。用反相树脂(PORS20R2,Applied Biosystem)将所得到的肽分离，并用等份的0.5％乙酸中的40％乙腈和第二等份的在0.5％乙酸中的80％乙腈进行洗脱。用真空离心机(speedvac,Thermo FisherScientific)除去乙腈并将等份的剩余溶液加压装载于带有整合的发射器枪头(tip)(360μm O.D.,50μm I.D.,10μm枪头)的自装填
柱(New Objective,Woburn,MA)上，装入6cm的反相C 18材料(ReproSil-Pur C18-AQ,3μm珠，来自Dr.Maisch GmbH)，并连接到使用自制微型电喷射源的具有LTQ OrbitrapTM XL质谱仪或LTQ Orbitrap VelosTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)的Agilent 1200系列HPLC系统(Agilent)。通过下列梯度将肽洗脱到质谱仪：5min的0-5％B，125min的40％B，150min的60％B，165min的100％B(A＝0.1M乙酸，B＝在0.1M乙酸中的70％乙腈，流速为90nL/min)。两种仪器都在数据依赖模式下运行，并且对于两种质谱仪，目标值均设定为5e5离子且分辨率为60000(在400m/z)。为了在LTQ OrbitrapTM XL上进行分析，在全面扫描之后，对这次全面扫描中8种最丰富的离子进行8MS/MS扫描。肽(仅电荷态>1)由2Da窗口、1e4离子的目标窗口进行分离，通过CAD(归一化碰撞能量＝35，激活Q＝0.25，活化时间30msec)和LTQ中的质量分析进行解离。为了在LTQOrbitrapTM Velos上进行分析，在全面扫描之后，对该全面扫描中10种最丰富的离子在7500分辨率下进行10MS/MS扫描。肽(仅电荷态>2)由3Da窗口、2e5离子的目标窗口进行分离，通过HCD(归一化碰撞能量＝40，激活时间0.100msec)和Orbitrap中的质量分析进行解离。对于任何仪器，选择用于MS/MS的离子都设置在排除清单上30秒。所产生的MS/MS谱图用Xtandem！检索人类IPI和内部(in house)患者特异性IgG数据库中，肽与在人类IPI和内部患者特异性数据库中的胰蛋白酶肽进行自动比较。对应于患者特异性IgG的肽击中(hit)进行人工确认。
多序列比对。所有多序列比对采用CLUSTAL W2使用默认参数进行(权重矩阵：GONNET用于蛋白质且UIB用于DNA，缺口开放＝10，缺口延伸0.1)。用TeXshade软件包生成对比阴影(Alignments shading)。
比对共有区。基于残基之间的同一性和相似性(>＝70％)产生多重比对的共有序列。基于相似性对氨基酸分组如下：FYW、ILVM、RK、DE、GA、ST和NQ。
种系发生树。采用邻接法(Neighbor-Joining method)生成序列之间的关系。采用从1000个重复推断出的自展共同树(bootstrap consensus tree)以代表其关系。将对应于以少于50％自展重复产生的分区对应的分支舍去。其中相关序列聚集在自展测试(1000重复)中的重复树百分比显示在旁边的分支上。树按比例进行绘制，其分支长度的单位与用于推断系统发生树的进化距离的单位相同。用多种不同的方法计算进化距离，单位为每个序列的氨基酸差异的数目。去除每一个序列对的所有模糊不清的位置。进化分析在MEGA5中进行。
R/S比的计算。DNA序列叠加在蛋白质比对上以进行取代/替换计算。从分析中移除所有缺口位置。R/S比分析使用Perl脚本进行。
实施例2
分离HIV抗体
为了确定HIV抗体克隆是否因体细胞突变被限制，设计一系列新的引物以去除该潜在的问题(表1)。新的引物组通过分选结合缺乏V1-3环并且含有一对稳定的二硫键的HIV-gp120核蛋白(2CC核)的B细胞进行测定。与用于克隆VRC01的重现诱饵(re-surfacedbait)相反，2CC核诱饵也允许捕获针对CD4诱导的共受体结合位点(CD4i)的抗体。
在一起比较中，当与初始引物组比较时，新的引物组增加了IgH链的恢复(图4(a))。用新的引物组所获得的抗体有更多的突变(平均35.6比19.8p＝<0.0001和对于IgH的最大值85比50)并且包含用原始引物组未发现的克隆(图4(a))。为了确定新的引物是否可以从已用YU2gp140进行分选的细胞中拯救(rescue)VRC01样抗体，对来自已用原始引物组全面检查而不产生任何VRC01相关克隆的个体的冰冻cDNA样品进行检查。在80个孔中，发现3个对应于通过IgH和IgL序列测定的VRC01变体的抗体(图5A和B)。得到的结论是VRC01样抗体被gp140三聚体捕获，并且特异设计来克隆高度突变的抗体的该引物捕获了更大比例的来源于具有高滴度广谱中和抗体的患者的记忆B细胞的抗-HIV抗体。
包括2个白种人、1个西班牙裔人和1个非洲人供体的显示高滴度广谱中和抗体的四个不相关HIV感染个体采用2CC核诱饵进行检查，其中2个个体的用以前克隆的抗体不能解释其血清学活性(表2和图6A和B)。代表201不同的独特的和多样化的克隆的576个抗体从1.5X105的IgG+记忆B细胞获得的起始群体获得(表3)。
实施例3
HIV抗体的结合特异性
通过2CC核诱饵捕获的抗体克隆的大小差异很大，范围跨越2-76种不同的成员(表3)。为了确定由2CC核捕获的抗体能否结合到HIV刺突上，用YU2gp120在每个扩增的克隆的代表成员上进行ELISA。所有测试抗体结合到gp120上(表3)。
利用突变蛋白定位了抗体结合于HIV刺突上的位点，所述突变蛋白干扰了CD4bs(gp120(D368R))或CD4诱导的共受体结合位点(CD4i，gp120(I420R))。如X.Wu等人，Science329,856(2010年8月13日)报道的，由于VRC01对D368R突变敏感，它被列为CD4bs抗体，但由于接近CD4i位点，它也显示了一些对I420R突变的敏感。属于VRC01变体的NIH45-46，抗体3BNC60、8ANC131和12A12的ELISA模式与VRC01类似(基于中和活性选择这些克隆成员，表3)。包括1B2530和8ANC195的其它克隆对两种突变相同敏感并且不能仅基于ELISA进行精确分类。
为了确定抗体是否具有多反应性，对纯化的ssDNA、dsDNA、胰岛素和LPS进行ELISA。检测的63％的抗-2CC核抗体为多反应性的。得出的结论是，大多数通过2CC-诱饵捕获的抗体识别gp120上的CD4bs或CD4i位点并且许多也具有多反应性。
实施例4
体细胞超突变
体细胞超突变是开发结合抗HIV抗体并且某些情况下有助于抗-HIV抗体的多反应性的高亲和力抗原所需要的。为了测试高度突变的2CC核特异性抗体是否如此，4个代表性的抗体被逆转到相应的种系中。逆转导致ELISA中测试的全部4个克隆的抗原结合的彻底丧失并丧失了多反应性。
实施例5
HIV中和
通过标准体外分析用初始组的8种病毒测量HIV中和活性，其中8种病毒包括3个层1的进化枝A、B和C，以及5个层2的进化枝B Env假病毒变种(M.S.Seaman等人，J Virol 84,1439(2010年2月))。抗体的中和活性与VRC01和来自供体的纯化血清IgG相比(图1A、表4和图6)。呈现出高水平中和活性的抗体进一步在一组15个其他层2的进化枝A、B、C、D、G、AG和AE Env假病毒变体上进行测试(图1B、表5)，其中包括5个耐受VRC01的病毒(图1B和表5)。
所有测试抗体中的90％显示出一些中和活性并且6个克隆含有显示了高水平的效力和广度的抗体变体(图1A、B和C以及表4和5)。这些克隆也是在那些在所研究的四个患者中的每一个中通过2CC-诱饵捕获的抗体中最丰富的克隆(表3)。最令人印象深刻的新抗体3BNC117属于具有76个成员的克隆，与VRC01的1.8μg/ml相比，其对14个层2的病毒的联合组显示0.5μg/ml的平均IC80(图1C、表4和5)。
测试的20个病毒中只有4个比3BNC117对VRC01更敏感，然而14个对3BNC117更敏感，包括DU172.17，其对VRC01完全耐受但对3BNC117敏感(图1B和C)。NIH45-46是VRC01的新变体，其对所测的20个病毒中的15个都比VRC01更有效，但仍比3BNC117效力弱(图1B和C以及表4和5)。
中和的广度和效力在5个最强力的中和抗体克隆成员中存在实质性的变化。例如，3BNC156是3BNC117的变体，只中和初始组病毒中的2个并需要在比3BNC117高得多的浓度(图1A和表4)，并且3BNC55是另一种变体，其抗6个病毒的活性介于2个之间，平均IC50为4μg/ml(图1和表4)。最后，活性最高的抗体是高度超突变的。前10个抗体的平均突变数对于VH是72并且对于VL是45，这与它们的广度和效力相关(表4和5)。突变的残基逆转到种系导致所有测试的抗体的中和活性完全丧失。
实施例6
诊断肽的鉴定
上述克隆策略捕获通过抗原结合记忆B细胞产生的抗体，然而循环抗体并不是由这些细胞产生的而是起源于骨髓中的浆细胞。然而，由于不表达表面Ig A，同源抗原不能用作诱饵来捕获浆细胞。(Radbruch等人，Nat Rev Immunol 6,741(Oct,2006))。此外，骨髓中的浆细胞和循环记忆B细胞之间的关系尚未精确定义。为了判断从记忆B细胞克隆的抗体是否也发现于骨髓浆细胞隔室中，将表达CD138的浆细胞从来源于4个研究的个体中的两个的配对骨髓样本中纯化出，并用PCR特异扩增从这些个体的记忆B细胞克隆的更有效抗体的IgVH基因。以下所列为用于RU01的克隆特异性引物：
CTGCAACCGGTGTACATTCTCAAGTGCAACTGGTGC(FWRD)(SEQ ID NO.584)，CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTCCATTTGTCACAG(FWRD)，(SEQ ID NO.585)TGCGAAGTCGACGCTGACGAGACAGTGACCTGC(REV)(SEQ ID NO.586)，TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACAATAATTTG(REV)(SEQ IDNO.587)，TGCGAAGTCGACGCTGACGAGACAATAACT(REV)(SEQ ID NO.588)，以及用于RU10的：CTGCAACCGGTGTACATTTTCAGGGGCACTTGGTG(FWRD)(SEQ ID NO.589)，TGCGAAGTCGACGCTGAGGTGACGATGACCGTG(REV)(SEQ ID NO.590)。在两个患者中都容易地鉴定到了选择的克隆和大量其它变体的成员。
为了验证这些抗体也可发现于血清中，从相同的2个和一个其他个体的血清纯化的IgG吸附于2CC核诱饵并对洗脱的IgG进行质谱(图1D、图7和图10A-C)。在所有情况下都发现了针对，高活性抗体变体的诊断肽(图7、图10A-C)。得出的结论是，克隆自记忆B细胞的广谱和强效抗-HIV抗体也在骨髓浆细胞隔室和具有高血清滴度的广谱中和抗体的患者的循环IgG中发现。
实施例7
HIV抗体结合特性
为了测定抗体对gp120的亲和力是否与中和活性相关，利用表面等离子体共振(SPR)比较高活性抗体、选择的克隆亲缘和种系逆转祖细胞的结合(图2A和B、图8和表6)。
顶端的中和抗体显示了在YU2gp140三聚体上的亲和力(KA)，范围为
在2CC核上为
(图2A和B以及表6)。与其降低的中和效力和广度一致，3BNC66、3BNC156和3BNC55在YU2gp140三聚体上显示了较3BNC117低的亲和力，但意外的是，对2CC核的亲和力与中和活性不相关(图1、图8、表4和表6)。通过SPR，未检测到任何针对测试的种系逆转抗体的结合(图2B、表6)。得出的结论是，通过YU2 2CC-核捕获的抗-HIV抗体倾向于显示比对2CC-核更高的针对gp140三聚体的亲和力。
当VRC01结合到HIV刺突，它产生大的构象变化，该变化类似于CD4结合并暴露CD4i位点。相比之下，b12和大多数其它已知的抗CD4bs抗体则没有。
为了确定这是否是高活性抗体的一个共享特征，HIV-BAL.26Δc或-YU2gp160Δc表达于HEK 293T细胞表面，并且在CD4或抗CD4bs抗体存在或不存在的情况下测定CD4i抗体的结合(图2C)。除了一个例外，所有测试的高活性抗体与CD4和VRC01类似，因为它们都促进了抗CD4i抗体结合到HIV-BAL.26和YU2gp160Δc之一或两者(图2C)。
唯一不具有这一特性的高活性抗体，8ANC195，不是传统的抗CD4bs抗体，因为其对D368R和I420R突变体同样敏感(表3)。此外，它与其它高活性抗体在中和模式上不同：它不能中和任何层1的病毒并表现出对H086.8的强活性，H086.8是进化枝B病毒，其耐受所有其它测试的抗体，包括3BNC117、VRC01和b12(图1A和B以及表4和5)。
实施例8
HIV抗体序列同一性
为了确定高活性抗CD4bs抗体是否具有共同的序列特性，比对了10个最好的抗体：从每类独立衍生于5个不同患者的5个抗体克隆中选取2个变体(图3)。IgVH区的比较揭示了覆盖了68个IgVH残基的高度保守的共有序列(图3A)。该IgVH共有序列包括6个VRC01-gp120接触残基，其中包括VRC01-Arg 71，其模拟Arg59CD4和Asp368gp120的关键相互作用(图3A)。此外，包括6个接触残基的共有序列在两个密切相关的种系的IgVH基因上(VH1-2和VH1-46)是完全保守的，IgVH基因产生此类中的所有抗体(图3A和B)。
编码共有序列残基的密码子在所选的10个抗体中是高度体细胞突变的，然而氨基酸序列是保守的(图9)。在共有序列残基中沉默突变的替换比例范围为0.7-1.7，而在非共有序列残基中，该范围为3.5-22，这表明共有序列的保守是强烈选择性的(表7)。与重链相反，VRC01的轻链在与gp120的总共32个接触中只有8个。与其更受限的作用一致，相同抗体轻链序列的比较发现了覆盖了53个IgVL残基的不太广泛的共有序列，其中包括3个VRC01-gp120接触残基(图3B)。最后，同重链一样，轻链起因于一组限制的种系基因：2个来源于IgK1D-33、2个来源于IgK3-11以及一个来源于IgL1-47(图3B和表3)。抗体8ANC195在数个重要方面不同于其它抗体，其并不完全与共有序列一致并且并不起因于相关重链或轻链(图3A和B)。得出的结论是，在高活性、竞争性抗CD4bs抗体(HAADs)中存在显著的序列趋同(convergence)。
实施例9
3BNC60Fab的晶体结构
为了确定不同患者中的抗体结构是否也是保守的，3BNC60Fab的晶体结构被解析到
分辨率并将其与VRC01相比较。结构揭示了标准Fab的四个结构域VH、CH1、VL和CL以及VH和VL内形成抗原结合位点的互补决定区(CDR)。在3BNC60不对称单元中的两个Fab几乎相同，但是，由于通过晶格接触形成的不同化学环境，在连接链D和E的环中的残基74-78的构象稍有变化。
在VRC01-gp120的共结晶结构中叠加来自3BNC60和VRC01的VH结构域(T.Zhou等人，Science 329,811(Aug 13,2010))提供了
的均方根差(rmsd)(计算111个Cα原子)，具有局限在CDR2残基58-65(3BNC60编号)的主要差异。叠加结构表示了与gp120的识别界面的保守。例如，Arg723BNC60采用了与Arg71VRC01类似的构象，其类似于正常形成于Arg59CD4和Asp368gp120之间的重要盐桥。此外，Trp473BNC60采用了与Trp47VRC01相同的构象，该残基接触gp120并涉及稳定CDRH3和CDRL3构象的芳香族和脂肪族残基相互作用的复杂网络。Gln653BNC60，其对应于Gln64VRC01，位于在结构上不同于VRC01的残基片段(残基58-65)中。3BNC60上这个区域的构象涉及晶体中的晶格接触，可能通过结合gp120而发生改变，因为它可能与gp120上的CD4结合环相冲突。
叠加3BNC60和VRC01的VL结构域提供了
的rmsd(计算95个Cα原子)并显示出某些gp120接触残基是结构保守的；Tyr913BNC60和Glu91a3BNC60采用了与Tyr91VRC01和Glu96VRC01类似的构象，其通过极性相互作用与gp120的环D相连。总之，这些结构比较表明，3BNC60同gp120结合时的架构与同VRC01结合时观察到的架构相同。
实施例10
HIV抗体共有序列
上述实验定义了一类竞争性抗CD4bs抗体、HAAD，其分享IgVH和IgVL共有序列，共有序列包括在VRC01和HIV刺突之间的8个接触残基(图3A和B)。在因其高水平血清抗-HIV活性而选择的五个不同供体中，这些抗体只来源于2个密切相关的IgVH和3个IgVL种系基因，其符合HAAD的共有序列：VH1-2和VH1-46仅相差7个氨基酸，相差的氨基酸中没有一个属于共有序列部分(图3A)。尽管存在广泛的体细胞突变，在它们的种系形式中都保留了共有序列残基。
唯一例外的共有序列是8ANC195，其在大量方面不同于其它的，暗示了它可能具有独特的抗原识别模式：在重链中缺少模仿关键的Arg59CD4和Asp368gp120接触位点的Arg；独特的中和模式；以及无法促进抗CD4i抗体结合。该抗体是产生于一个患者的两个不同的高活性抗体中的一个，提供了额外的证据支持这一观点，即血清中和活性是组合的。
表1
表2
表3A
表3A续
表3A续
表3b
表3b续
表3b续
表3c
表3c续
表3c续
表3d
表3d续
表3d续
表3e
表3e续
表3e续
表3f
表3f续
表3f续
表4a
患者3，克隆RU01
| 3BNC62 | 3BNC176 | 3BNC60 | 3BNC117 | 3BNC95 | 3BNC104 | |
| MW965.26 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.04 | ＜0.09 | ＜0.07 | ＞50 |
| BaL.26 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.04 | ＜0.09 | ＜0.07 | 0.025 |
| DJ263.8 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.04 | ＜0.09 | ＜0.07 | 0.054 |
| 6535.3 | 0.68 | 0.46 | 0.54 | 0.55 | 1.0 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.05 | 0.041 | ＜0.07 | 0.0252 |
| TRO.11 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.05 | 0.077 | ＜0.07 | 3.791 |
| PVO.4 | ＜0.09 | ＜0.10 | 0.09 | ＜0.09 | ＜0.07 | 0.348 |
| YU2.DG | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.05 | 0.054 | ＜0.07 | 0.034 |
患者3，克隆RU01(续)
| 3BNC91 | 3BNC55 | 3BNC89 | 3ANC3 | 3BNC53 | 3BNC72 | |
| MW965.26 | ＜0.08 | 0.04 | ＞0.05 | 0.18 | 0.09 | ＜0.06 |
| BaL.26 | ＞178 | ＞30 | ＞110 | ＞50 | ＞30 | ＞139 |
| DJ263.8 | ＞178 | ＞30 | ＞110 | ＞50 | ＞30 | ＞139 |
| 6535.3 | 1 | 2.6 | 1.7 | ＞50 | 13.6 | 8.49 |
| RHPA4259.7 | ＜0.08 | 2.2 | 12.4 | 7.66 | 100.6 | ＞139 |
| TRO.11 | 3.06 | 18.4 | 52.4 | 10.76 | ＞155 | ＞139 |
| PVO.4 | 0.44 | 3.9 | 2.7 | 36.77 | ＞155 | ＞139 |
| YU2.DG | ＜0.08 | 0.9 | 0.39 | 35.01 | ＞155 | ＞139 |
表4a续
患者3，克隆RU01续
| 3BNC156 | 3BNC158 | 3BNC153 | 3BNC108 | |
| MW965.26 | 0.08 | 0.11 | 0.15 | ND |
| BaL.26 | ＞111 | ＞109 | ＞100 | 20.6 |
| DJ263.8 | ＞111 | ＞109 | ＞100 | ＞55 |
| 6535.3 | 11.1 | 9.9 | 28.9 | ＞55 |
| RHPA4259.7 | ＞111 | ＞109 | ＞100 | 45.91 |
| TRO.11 | ＞111 | ＞109 | ＞100 | ＞55 |
| PVO.4 | ＞111 | ＞109 | ＞100 | ＞55 |
| YU2.DG | ＞111 | ＞109 | ＞100 | 25.5 |
患者3，克隆RU01续
患者3克隆RU02-07
| 3A67 | 3A383 | 3BNC8 | 3ANC44 | 3A576 | 3ANC38 | |
| MW965.26 | 0.1 | 0.5 | 0.74 | 25.49 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | 19.2 | 5.3 | ＞50 | 27.91 | 27 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| YU2.DG | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
B12和NIH45克隆
表4b
患者1，克隆RU08
| 1B2640 | 1B2530 | 1B2364 | 1NC2 | 1NC9 | 1B2490 | |
| MW965.26 | 41.76 | 0.762 | 1.85 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | 0.08 | ＞50 | ＞25 | 0.11 | 1.37 | 0.058 |
| DJ263.8 | ＞50 | 2.71 | 3.75 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 0.04 | 3.6 | 2.18 | 0.59 | 0.09 | 0.414 |
| TRO.11 | 0.23 | 0.516 | 0.27 | 0.17 | 0.2 | 1.06 |
| PVO.4 | 1.05 | 0.275 | 0.161 | 0.37 | 0.34 | 2.97 |
| YU2.DG | 0.2 | 0.209 | 2.46 | 0.12 | 0.13 | 0.125 |
患者1，克隆RU08续
患者1，克隆RU08续
| 1NC108 | 1B2644 | 1B2339 | 1NC123 | |
| MW965.26 | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| BaL.26 | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| TRO.11 | 19.37 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| PVO.4 | 3.13 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
| YU2.DG | ＞50 | ＞25 | ＞25 | ＞50 |
患者1，克隆RU09
| 1B218 | |
| MW965.26 | ＞119 |
| BaL.26 | 1.1 |
| DJ263.8 | ＞119 |
| 6535.3 | 3.6 |
| RHPA4259.7 | ＞100 |
| TRO.11 | ＞100 |
| PVO.4 | ＞100 |
| YU2.DG | ＞100 |
表4c
患者8，克隆RU10
| 8ANC192 | 8ANC134 | 8ANC13 | 8ANC131 | 8ANC182 | 8ANC50 | 8ANC45 | |
| MW965.26 | ＞73 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞115 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | 0.08 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.17 | 0.296 |
| DJ263.8 | ＜0.03 | 0.003 | 0.008 | 0.004 | ＜0.05 | 0.04 | 0.041 |
| 6535.3 | 0.34 | 0.06 | 0.27 | 0.2 | 0.89 | 2.27 | 0.813 |
| RHPA4259.7 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞100 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞100 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞100 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | 0.89 | 0.46 | 0.63 | 0.81 | 1.2 | 3.89 | 4.259 |
| YU2.DG | 0.09 | 0.15 | 0.21 | 0.18 | 0.22 | 0.42 | 0.499 |
患者8，克隆RU11-15
| 8ANC57 | 8ANC195 | 8ANC24 | 8ANC14 | 8ACN5 | |
| MW965.26 | 24.1 | ＞50 | 0.29 | 2.01 | ＞50 |
| BaL.26 | 4.35 | ＞50 | 47.53 | ＞50 | ＞50 |
| DJ263.8 | 30.19 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞103 | 0.2 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 1.65 | 0.34 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | 32.07 | 0.18 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | 101.15 | 0.52 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| YU2.DG | 27.52 | 0.79 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
表4d
患者12，克隆RU16
| 12A12 | 12A21 | 12A4 | 12A37 | 12A22 | 12A16 | |
| MW965.26 | 0.042 | 0.075 | 0.098 | 0.056 | 0.06 | 0.167 |
| BaL.26 | 0.017 | ＜0.001 | ＜0.001 | 0.005 | 0.04 | 0.042 |
| DJ263.8 | 0.002 | 0.035 | 0.017 | 0.013 | 0.08 | 0.012 |
| 6535.3 | 21.97 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | 15.44 |
| RHPA4259.7 | 0.086 | 0.038 | 0.041 | 0.042 | 0.04 | 0.207 |
| TRO.11 | 0288 | 0.164 | 0.257 | 0.827 | 0.56 | 0.751 |
| PVO.4 | 0.928 | 0.584 | 0.819 | 0.516 | 0.45 | 2.44 |
| YU2.DG | 0.084 | 0.015 | 0.018 | 0.019 | 0.11 | 0.234 |
患者12，克隆RU16续
| 12A20 | 12A6 | 12A23 | 12A46 | 12A55 | |
| MW965.26 | 0.192 | 0.112 | 5.1 | ＞50 | 0.58 |
| BaL.26 | 0.035 | 0.072 | 057 | 0.013 | 2.87 |
| DJ263.8 | 0.05 | 0.004 | 0.63 | 5.79 | ＞50 |
| 6535.3 | 48.73 | ＞24 | 14.73 | 48.85 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 0.109 | 0.227 | 0.496 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | 0.689 | 1.52 | 2.88 | ＞50 | 21.45 |
| PVO.4 | 3.04 | 3.32 | 2.24 | 2.18 | 0.99 |
| YU2.DG | 0.142 | 0.222 | 0.053 | 0.49 | 0.1 |
表4d续
B12和NlH45克隆
表4e
患者3，克隆RU01
| 3BNC62 | 3BNC176 | 3BNC60 | 3BNC117 | 3BNC95 | 3BNC104 | |
| MW965.26 | ＜0.09 | ＜0.10 | 0.09 | ＜0.09 | ＜0.07 | ＞50 |
| BaL.26 | ＜0.09 | ＜0.10 | ＜0.04 | ＜0.09 | ＜0.07 | 0.09 |
| DJ263.8 | 0.1 | ＜0.10 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.187 |
| 6535.3 | 2.24 | 1.7 | 1.77 | 2.44 | 4.5 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＜0.09 | ＜0.10 | 0.07 | 0.137 | ＜0.07 | 0.06 |
| TRO.11 | ＜0.09 | ＜0.10 | 0.12 | 0.077 | ＜0.07 | 30.847 |
| PVO.4 | 0.23 | 0.16 | 0.27 | 0.19 | 0.23 | 0.901 |
| YU2.DG | ＜0.09 | ＜0.10 | 0.07 | 0.054 | ＜0.07 | 0.097 |
患者3，克隆RU01续
| 3BNC91 | 3BNC55 | 3BNC89 | 3ANC3 | 3BNC53 | 3BNC72 | 3BNC156 | |
| MW965.26 | ＜0.08 | 0.15 | 0.16 | 0.64 | 0.61 | 0.37 | 0.47 |
| BaL.26 | ＞178 | ＞30 | ＞110 | ＞50 | ＞30 | ＞139 | ＞111 |
| DJ263.8 | ＞178 | ＞30 | ＞110 | ＞50 | ＞30 | ＞139 | ＞111 |
| 6535.3 | 6.7 | 5.53 | 5.92 | ＞50 | 73.38 | 133.665 | 69.66 |
| RHPA4259.7 | 0.52 | 8.03 | ＞110 | ＞50 | ＞155 | ＞139 | ＞111 |
| TRO.11 | 32.31 | 41.67 | ＞110 | ＞50 | ＞155 | ＞139 | ＞111 |
| PVO.4 | 2.65 | 6.5 | 10.18 | ＞50 | ＞155 | ＞139 | ＞111 |
| YU2.DG | ＜0.08 | 1.07 | 1.49 | ＞50 | ＞155 | ＞139 | ＞111 |
患者3，克隆RU01续
| 3BNC158 | 3BNC153 | 3BNC108 | 3BNC142 | 3BNC66 | 3BNC42 | 3BNC102 | |
| MW965.26 | 0.6 | 0.63 | ND | 0.8 | 29.98 | ND | ＞50 |
| BaL.26 | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
| 6535.3 | 97.75 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
| PVO.4 | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ND | ＞50 |
| YU2.DG | ＞109 | ＞100 | ＞55 | ＞172 | ＞189 | ＞26 | ＞50 |
表4e续
患者3，克隆RU02-07
| 3A67 | 3A383 | 3BNC8 | 3ANC44 | 3A576 | 3ANC38 | |
| MW965.26 | 16 | ＞25 | 0.74 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| YU2.DG | ＞50 | ND | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
B12和NIH45克隆
| B12 | VRC01 | 45-46 | |
| MW965.26 | ND | ＜0.08 | 0.21 |
| BaL.26 | ND | 0.1 | 0.06 |
| DJ263.8 | ND | 0.553 | 0.06 |
| 6535.3 | ND | 2.7 | 0.28 |
| RHPA4259.7 | 0.39 | 0.185 | 0.146 |
| TRO.11 | ＞50 | 0.832 | 9.56 |
| PVO.4 | ＞50 | 1.2 | 0.47 |
| YU2.DG | 7.8 | 0.372 | 0.08 |
表4f
患者1，克隆RU08
| 1B2640 | 1B2530 | 1B2364 | 1NC2 | 1NC9 | 1B2490 | 1B2351 | |
| MW965.26 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | 0.32 | ＞50 | ＞25 | 0.51 | 19.92 | 0.3 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 0.25 | ＞50 | ＞25 | 4.33 | 0.4 | 1.97 | ＞50 |
| TRO.11 | 1.62 | 2.46 | 1.77 | 0.55 | 0.65 | 3.58 | 1.13 |
| PVO.4 | 2.97 | 1.25 | 0.65 | 1.08 | 1.32 | 10.57 | 0.88 |
| YU2.DG | 0.7 | 7.74 | ＞25 | 0.39 | 0.56 | 0.59 | 0.48 |
患者1，克隆RU08续
表4f续
表4g
患者8，克隆RU10
| 8ANC192 | 8ANC134 | 8ANC13 | 8ANC131 | 8ANC182 | 8ANC50 | 8ANC45 | |
| TRO.11 | ＞73 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞115 | ＞50 | ＞50 |
| BaL.26 | 0.43 | 0.11 | 0.18 | 0.31 | 0.73 | 0.77 | 7.45 |
| DJ263.8 | 0.1 | 0.044 | 0.069 | 0.046 | 0.11 | 0.15 | 0.166 |
| 6535.3 | 1.43 | 2 | 2.3 | 1.9 | 3.93 | 13.65 | 10.473 |
| RHPA4259.7 | ＞100 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞100 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞100 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞100 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | 3.94 | 2.5 | 3.7 | 4.9 | 4.43 | 14.99 | 17.315 |
| YU2.DG | 0.51 | 0.616 | 1.07 | 0.92 | 1.46 | 1.59 | 2.942 |
患者8，克隆RU11-15
| 8AN57 | 8AN195 | 8AN24 | 8AN14 | 8AN5 | |
| TRO.11 | ＞103 | ＞50 | 0.76 | 6.64 | ＞50 |
| BaL.26 | 24.76 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| DJ263.8 | ＞103 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ＞103 | 0.91 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 14.44 | 1.56 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | ＞103 | 0.89 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | ＞103 | 1.87 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| YU2.DG | 91.49 | 2.77 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
表4h
患者12，克隆RU16
| 12A12 | 12A21 | 12A4 | 12A37 | 12A22 | 12A16 | |
| MW965.26 | 0.2 | 0.85 | 1.24 | 0.3 | 0.21 | 0.58 |
| BaL.26 | 0.08 | 0.004 | 0.007 | 0.03 | 0.14 | 0.25 |
| DJ263.8 | 0.31 | 0.42 | 1.06 | 0.57 | 1.86 | 0.12 |
| 6535.3 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞25 | ＞42 |
| RHPA4259.7 | 0.4 | 0.13 | 0.19 | 0.19 | 0.13 | 0.93 |
| TRO.11 | 0.98 | 0.57 | 1.12 | 3.81 | 1.94 | 2.57 |
| PVO.4 | 3.15 | 2.09 | 2.95 | 1.8 | 1.49 | 8.72 |
| YU2.DG | 0.31 | 0.06 | 0.1 | 0.07 | 0.36 | 1.13 |
患者12，克隆RU16续
| 12A20 | 12A6 | 12A23 | 12A46 | 12A55 | |
| MW965.26 | 2.2 | 0.52 | ＞50 | ＞50 | 4.49 |
| BaL.26 | 0.23 | 0.47 | 3.47 | 0.08 | ＞50 |
| DJ263.8 | ND | 0.08 | 30.81 | ＞50 | ＞50 |
| 6535.3 | ND | ＞24 | ＞50 | ＞50 | ＞50 |
| RHPA4259.7 | 0.49 | 1.02 | 1.69 | ＞50 | ＞50 |
| TRO.11 | 2.41 | 5.15 | 10.11 | ＞50 | ＞50 |
| PVO.4 | 11.2 | 17.34 | 7.81 | 797 | 4.3 |
| YU2.DG | 0.67 | 1.2 | 0.19 | 0.25 | 0.29 |
B12和NlH45克隆
表5a
体外Tzm-bl中和分析，扩展面板IC50值
体外Tzm-bl中和分析，扩展面板IC50值 续
| 1NC9 | 1B2530 | 8ANC131 | 8ANC134 | 8ANC195 | 12A12 | 12A21 | |
| Q842.d12 | 0.02 | 0.249 | 0.053 | 0.061 | ＞30 | 0.014 | 0.015 |
| 3415.v1.c1 | 0.266 | 0.065 | 0.299 | 0.323 | 2.404 | 0.121 | 0.82 |
| 3365.v2.c20 | 0.329 | 4.357 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.068 | 0.045 |
| H086.8<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | 0.095 | ＞30 | ＞30 |
| ZM53M.PB12 | 0705 | 0.912 | ＞30 | ＞30 | 9.626 | 0.593 | 0.42 |
| Du172.17<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 10.797 | 0.196 | 0.126 |
| ZM109F.PB4 | 0.023 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.148 | 2.104 |
| 3016.v5.c45 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.195 | 1.163 | 0.097 |
| 231965.c1 | 0.393 | 0.168 | 6.346 | ＞30 | 0.514 | 2.217 | ＞30 |
| X1254_c3 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 1.524 | 1.032 | 26.793 |
| 250-4<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| 251-18 | 1.234 | 9.847 | 0.968 | 1.56 | 0.284 | 2.622 | 1.713 |
| 278-50<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| 620345.c1<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| R1166.c1 | 0.651 | 0.119 | ＞30 | ＞30 | 0.986 | 0.342 | 0.292 |
表5b
体外Tzm-bl中和分析，扩展面板IC80值
| B12 | VRC01 | 45-46 | 3BNC60 | 3BNC62 | 3BNC117 | 3BNC55 | |
| Q842.d12 | ＞50 | 0.096 | 0.026 | 0.03 | 0.03 | 0.01 | 0.062 |
| 3415.v1.c1 | 14.1 | 0.15 | 0.069 | 0.37 | 0.4 | 0.47 | 0.388 |
| 3365.v2.c20 | ＞50 | 0.17 | 0.114 | 0.08 | 0.09 | 0.1 | 2.341 |
| H086.8<sup>＊</sup> | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞15 | ＞15 | ＞15 | ＞30 |
| ZM53M.PB12 | ＞50 | 4 | 0.652 | 0.76 | 1.1 | 0.85 | ＞30 |
| Du172.17<sup>＊</sup> | 2.6 | ＞50 | ＞30 | ＞15 | 12.18 | 8.9 | ＞30 |
| ZM109F.PB4 | ＞50 | 0.754 | 0.22 | 1.23 | 0.78 | 0.88 | 0.396 |
| 3016.v5.c45 | 4 | 0.42 | ＞30 | 7.38 | 2.35 | ＞15 | ＞30 |
| 231965.c1 | 0.16 | 1.2 | 0.1 | 0.25 | 0.22 | 0.22 | 2.78 |
| X1254_c3 | ＞50 | 0.19 | 0.078 | 0.29 | 0.27 | 0.27 | 0.571 |
| 250-4<sup>＊</sup> | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞15 | ＞15 | ＞15 | 1.922 |
| 251-18 | ＞50 | 11.2 | 5.255 | 0.96 | 1 | 0.82 | ＞30 |
| 278-50<sup>＊</sup> | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞15 | ＞15 | ＞15 | ＞30 |
| 620345.c1<sup>＊</sup> | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞15 | ＞15 | ＞15 | ＞30 |
| R1166.c1 | ＞50 | 4.6 | 1.679 | 0.51 | 0.89 | 0.64 | 2.351 |
体外Tzm-bl中和分析，扩展面板IC80值 续
| 1NC9 | 1B2530 | 8ANC131 | 8ANC134 | 8ANC195 | 12A12 | 12A21 | |
| Q842.d12 | 0.133 | 2.191 | 0.179 | 0.205 | ＞30 | 0.06 | 0.066 |
| 3415.v1.c1 | 1.002 | 0.35 | 1.555 | 2.643 | 17.743 | 0.418 | 0.296 |
| 3365.v2.c20 | 2.163 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.192 | 0.166 |
| H086.8<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | 5.328 | ＞30 | ＞30 |
| ZM53M.PB12 | 2.771 | 4.022 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 2.069 | 1.458 |
| Du172.17<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.992 | 0.637 |
| ZM109F.PB4 | 0.146 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.698 | 13.686 |
| 3016.v5.c45 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 0.872 | 11.864 | 0.358 |
| 231965.c1 | 2.276 | 0.963 | ＞30 | ＞30 | 2.355 | 15.102 | ＞30 |
| X1254_c3 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | ＞30 | 6.949 | 5.777 | ＞30 |
| 250-4<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| 251-18 | 6.291 | ＞30 | 5.55 | 6.281 | 1.511 | 9.39 | 6.063 |
| 278-50<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| 620345.c1<sup>＊</sup> | ＞30 | ＞30 | ＞50 | ＞50 | ＞50 | ＞30 | ＞30 |
| R1166.c1 | 2.669 | 0.684 | ＞30 | ＞30 | 4.83 | 1.85 | 2.137 |
表6
通过表面等离子共振测定lgG抗体对YU-2gp140和2CC-核配体的亲和力
| gp140 | 2CC-Core | |||||
| k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup> s<sup>-1</sup>) | kd(s<sup>-1</sup>) | K<sub>D</sub>(M) | ka(M<sup>-1</sup> s<sup>-1</sup>) | kd(s<sup>-1</sup>) | K<sub>D</sub>(M) | |
| 12A12 | 4.59E+04 | 1.44E-05 | 3.15E-10 | 6.33E+04 | 1.70E-06 | 2.69E-11 |
| 12A21 | 9.18E+04 | 3.44E-07 | 3.75E12 | 1.82E+05 | 3.30E-04 | 1.81E-09 |
| 12AGL | / | / | / | / | / | / |
| 3BNC60 | 2.73E+04 | 1.86E-04 | 6.81E-09 | 3.02E+04 | 1.64E-03 | 5.45E-08 |
| 3BNC117 | 3.04E+04 | 1.99E-04 | 6.54E-09 | 1.49E-03 | 4.05E+04 | 3.68E-08 |
| 3BNC55 | 1.31E+04 | 7.55E-04 | 5.78E-08 | 8.15E-04 | 3.16E+04 | 2.57E-08 |
| 3BNC66 | 1.60E+04 | 1.41E-03 | 8.81E-08 | 3.96E+04 | 1.33E-03 | 3.36E-08 |
| 3BNC156 | 1.13E+04 | 1.98E-03 | 1.75E-07 | 1.88E+04 | 1.53E-03 | 8.12E-08 |
| 3BNC108 | / | / | / | / | / | / |
| 3BNC60GL | / | / | / | / | / | / |
| 8ANC131 | 6.59E+04 | 1.09E-03 | 1.65E-08 | 4.88E+04 | 3.23E-03 | 6.61E-08 |
| 8ANC134 | 1.55E+04 | 1.74E-03 | 1.13E-07 | 2.08E+04 | 9.57E-04 | 4.61E-08 |
| 8AGL | / | / | / | / | / | / |
| 8ANC195 | 4.88E+04 | 1.67E-03 | 3.43E-08 | 2.41E+04 | 1.32E-03 | 5.47E-08 |
| 1NC9 | 4.83E+04 | 5.81E-04 | 1.20E-08 | 5.11E+04 | 2.36E-04 | 4.61E-09 |
| 1B2530 | 4.74E+04 | 1.62E-03 | 3.42E-08 | 6.83E+04 | 4.02E-04 | 5.90E-09 |
| 1GL | / | / | / | / | / | / |
| 4546 | 4.26E+04 | 2.87E-04 | 6.75E-09 | 1.12E+05 | 4.94E-04 | 4.40E-09 |
| VRC01 | 1.83E+04 | 8.08E-06 | 4.41E-10 | 2.84E+04 | 3.25E-05 | 1.15E-09 |
表7a
对于所选10个抗体的重链序列的取代/沉默突变率
| 所有核苷酸 | 共有核苷酸 | 非共有核苷酸 | |
| 3BNC117HC | 1.8 | 1.0 | 3.5 |
| 3BNC60HC | 2.0 | 1.1 | 4.4 |
| 12A12HC | 2.8 | 1.7 | 6.3 |
| 12A21HC | 2.6 | 1.5 | 4.8 |
| NlH4546HC | 1.7 | 0.9 | 5.5 |
| VRCO1HC | 2.2 | 1.1 | 22.0 |
| 8ANC131HC | 2.7 | 1.3 | 8.0 |
| 8ANC134HC | 2.2 | 1.5 | 3.7 |
| 1B2530HC | 2.0 | 0.9 | 11.0 |
| 1NC9HC | 1.9 | 0.7 | 12.0 |
表7b
对于所选10个抗体的轻链序列的取代/沉默突变率
| 所有核苷酸 | 共有核苷酸 | 非共有核苷酸 | |
| 3BNC117KC | 1.7 | 0.8 | 2.8 |
| 3BNC60KC | 1.7 | 0.7 | 4.0 |
| 12A12KC | 1.7 | 0.6 | 4.0 |
| 12A21KC | 2.5 | 1.4 | 4.3 |
| NIH4546KC | 1.7 | 0.9 | 3.0 |
| VRCO1KC | 1.8 | 0.8 | 4.0 |
| 8ANC131KC | 1.5 | 0.5 | 4.2 |
| 8ANC134KC | 1.5 | 0.5 | 4.2 |
| 1B2530LC | 1.9 | 2.0 | 1.8 |
| 1NC9LC | 1.2 | 0.9 | 1.8 |
表8
结晶数据收集和完善统计
Claims (15)
1.一种分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO:896的序列的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQ ID NO:910的序列的CDR1、CDR2和CDR3区域，其中SEQ ID NO:896的序列的CDR1、CDR2和CDR3区域分别是NCPIN、WLKPRGGAVNYARKFQG和GKYCTARDYYNWDFEH，并且SEQ ID NO:910的序列的CDR1、CDR2和CDR3区域分别是RTSQSGSL、SGSTRAA和QQYEF。
2.如权利要求1所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗HIV抗体或其抗原结合片段在小于1.0μg/ml的IC50浓度中和HIV病毒ZM53M.PB12，或在小于1.0μg/ml的IC50浓度中和HIV病毒R1166.c1。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段，其中抗体是嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体或人抗体。
4.如权利要求3所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段，其中抗体是人抗体。
5.如权利要求3所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段，其中抗体是重组抗体。
6.一种包括权利要求1-5任一项所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段的组合物。
7.一种编码权利要求1-5任一项所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
8.一种包含权利要求7的核酸分子的载体。
9.一种包含权利要求8的载体的细胞。
10.一种药物组合物，其包括至少一种权利要求1-5任一项所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
11.权利要求10所述的药物组合物在制备用于预防或治疗HIV感染或HIV相关疾病的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述药物还包括第二治疗剂。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述第二治疗剂是抗病毒剂。
14.如权利要求11-13任一项所述的用途，其中所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
15.一种用于制造如权利要求1-5任一项所述的分离的抗HIV抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达编码所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核酸的条件下培养权利要求9所述的细胞，并分离所述抗HIV抗体或其抗原结合片段。
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