CN116948018A - 广谱中和抗hiv-1抗体及其使用方法 - Google Patents

广谱中和抗hiv-1抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有效的广谱中和抗HIV‑1抗体、试剂盒及其使用方法。

Description

广谱中和抗HIV-1抗体及其使用方法
本申请是申请日为2017年12月22日、申请号为2017800874962、发明名称为“广谱中和抗HIV-1抗体及其使用方法”的申请的分案申请。
I.关于联邦资助的声明
本发明在国家卫生研究院(NIH)的AI100148号资助下利用政府支持完成。美国政府享有本发明的一定权利。
II.发明领域
本发明领域涉及广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)及其使用方法。
III.背景技术
人免疫缺陷病毒(“HIV”)是一种感染人的慢病毒(逆转录病毒科)。如果不治疗，HIV感染将随着时间的推移导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，这是一种免疫系统渐进性衰竭的病症，它产生危及生命的机会性感染(例如弓形体病)和癌症(例如卡波西氏肉瘤)的盛行，并最终导致受感染个体死亡。如果不治疗，初次感染后的平均存活时间总共介于9至11年。HIV/AIDS是重大的全球健康威胁，被CDC视为是全球性流行病，在2014年约3700万人感染HIV，当年导致约120万人死亡。
HIV具有许多特征亚型，包括HIV-1和HIV-2。HIV-1致命性更强、感染性更强且在全球流行，而HIV-2则致命性较弱、感染性较弱且目前仅在西非流行。HIV-1是大多数HIV感染的原因，并且因此其是更具临床意义的目标。HIV-1有一些亚组，包括组M、组N、组O和组P。代表“主要的”组M占HIV感染的约90％，并分为进一步的亚型A-K，其又有时被分成亚-亚型(A1、A2等)。HIV-1的显著多样性由高突变率引起，使得HIV难以被有效治疗。为了解决这个问题，研究人员试图开发出所谓的广谱中和抗体(“bNAb”)，这类抗体由于其能够中和多种HIV病毒株而得名，例如多种HIV-1病毒株，例如在US 2014/0328862中公开的那些，该文献通过引用整体并入本文。一部分HIV-1感染的个体形成了bNAb，这通常在1-3年的时间内形成，而在此期间存在循环病毒株和抗体的共同进化。然而，由于抗体介导的针对敏感病毒株的选择性，这些bNab通常不能中和共存的自体病毒。因此，迫切需要对HIV-1感染具有高水平效力的新的广谱中和抗HIV抗体。
IV.发明概述
本发明涉及许多有效的广谱中和抗HIV-1抗体及其使用方法。因此，在一些实施方案中，本发明包含抗HIV-1抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体是广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体包含NC37及其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体包含BG1及其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体包含BG18及其抗原结合部分。在一些实施方案中，本发明包含BG18的变体及其抗原结合部分。在一些实施方案中，BG18的变体包含354BG8、354BG18、354BG42、354BG33、354BG129、354BG188、354BG411和354BG426中的一个，或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体(mAb)。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组产生的抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含人抗体。在一些实施方案中，抗-HIV-1抗体或其抗原结合部分包含双特异性抗体。
在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89中的一个。在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89中一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89中的一个或多个具有保守取代。
在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85和93中的一个。在一些实施方案中，轻链可变区与SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85和93中的一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85和93中的一个或多个具有保守取代。
在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区内的至少一个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，至少一个CDR包含SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92中的一个。在一些实施方案中，至少一个CDR与SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92的一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92的一个或多个具有保守取代。
在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区内的至少一个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，至少一个CDR包含SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96中的一个。在一些实施方案中，至少一个CDR与SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96中的一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同源性。在一些实施方案中，SEQ IDNO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96中的一个或多个具有保守取代。
在一些实施方案中，本发明涉及包含第一抗体的试剂盒。在一些实施方案中，第一抗体是抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)。在一些实施方案中，广谱中和抗HIV-1抗体是本发明的任何抗HIV-1抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体特异性结合HIV-1或其抗原性片段。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体在结合后中和HIV-1。在一些实施方案中，试剂盒含有第二抗体。在一些实施方案中，第二抗体包含抗HIV-1抗体或其抗原结合部分，其特异性结合HIV-1或其抗原性片段。在其他实施方案中，第二抗体特异性结合第一抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合部分与底物结合。在一些实施方案中，第二抗体或其抗原结合部分与底物结合。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合部分具有可检测的标记。在一些实施方案中，第二抗体或其抗原结合部分具有可检测的标记。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合部分和第二抗体或其抗原结合部分中的至少一个具有可检测的标记。在一些实施方案中，可检测的标记包含报告分子。在一些实施方案中，报告分子包含荧光分子。在一些实施方案中，报告分子包含放射性标记。在其他实施方案中，可检测的标记包含酶。在一些实施方案中，试剂盒包括酶的底物。在一些实施方案中，向酶添加底物导致产生可检测的信号。在一些实施方案中，可检测的信号包含有色可溶性产物。在一些实施方案中，放射性标记包含I-125。在一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，酶的底物包含TMB。在一些实施方案中，试剂盒能够检测样品中的HIV-1或其抗原性片段。在一些实施方案中，试剂盒能够定量样品中存在的HIV-1或其抗原性片段的量。
在一些实施方案中，试剂盒还包含HIV试剂。在一些实施方案中，HIV试剂选自由非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、CCR5拮抗剂/进入抑制剂、整合酶链转移抑制剂(INSTI)及其组合组成的组。在一些实施方案中，HIV试剂是单位剂型。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是单位剂型。在一些实施方案中，单位剂型是可注射的单位剂型。在一些实施方案中，HIV试剂与抗HIV-1抗体或其抗原结合部分储存在同一容器中。在一些实施方案中，HIV试剂单独储存。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一个或多个额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，一个或多个额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含本发明的任一抗HIV-1抗体。在一些实施方案中，一个或多个额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分选自由NC37、NC133、NC102、AC40、AC41、AC72及其组合组成的组。在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种药学上可接受的载体或防腐剂。
在一些实施方案中，本发明涉及检测样品中存在的HIV-1或其抗原片段的方法。在一些实施方案中，该方法包含获得包含HIV-1或其抗原性片段的样品。在一些实施方案中，该方法包括使样品与抗HIV-1抗体或其抗原结合部分接触。在一些实施方案中，所述方法包括检测抗HIV-1抗体或其抗原结合部分与HIV或其抗原性片段的特异性结合的存在。在一些实施方案中，该方法包括定量样品中存在的HIV-1或其抗原性片段的量。在一些实施方案中，样品是生物样品。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是本发明任一方面的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是重组产生的。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含人抗体。在一些实施方案中，通过免疫测定来完成特异性结合存在的检测。在一些实施方案中，通过竞争性免疫测定来完成特异性结合存在的检测。
在另一个实施方案中，本发明涉及将个体诊断为具有HIV-1感染的方法。在一些实施方案中，该方法包括鉴定具有或怀疑具有HIV-1感染的个体。在一些实施方案中，该方法包括从个体获得含有HIV-1或其抗原性片段的样品。在一些实施方案中，该方法包括使样品与抗HIV-1抗体或其抗原结合部分接触。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是本发明任一方面的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括检测抗HIV-1抗体或其抗原结合部分与HIV或其抗原性片段的特异性结合的存在。在一些实施方案中，该方法包括将所述个体诊断为具有HIV-1感染。在一些实施方案中，个体被诊断为患有AIDS。在一些实施方案中，样品是生物样品。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是重组产生的。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含人抗体。在一些实施方案中，通过免疫测定来完成特异性结合存在的检测。在一些实施方案中，通过竞争性免疫测定来完成特异性结合存在的检测。
在一些实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗HIV-1感染的方法。在一些实施方案中，治疗HIV-1感染的方法包括将至少一个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分施用于具有或怀疑具有HIV-1感染的个体。在一些实施方案中，至少一个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，至少一个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含本发明的任一抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括在施用步骤之前将个体鉴定为具有HIV-1感染的步骤。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体包含重组抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是重组产生的。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含人抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用至少一个额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述至少一个额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，至少一个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含本发明任一抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体。在一些实施方案中，额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组抗体。在一些实施方案中，额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是重组产生的。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用HIV试剂。在一些实施方案中，HIV试剂选自由非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、CCR5拮抗剂/进入抑制剂、整合酶链转移抑制剂(INSTI)及其组合组成的组。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可与额外的一种或多种抗HIV-1抗体或抗体或其抗原结合部分和/或一种或多种HIV试剂共同施用。在其他实施方案中，抗HIV抗体或其抗原结合部分在额外的一种或多种抗HIV-1抗体或抗体或其抗原或其抗原结合部分和/或一种或多种HIV试剂之前施用。在其他实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分在额外的一种或多种抗HIV-1抗体或抗体或其抗原结合部分和/或一种或多种HIV试剂后施用。并且甚至在其他实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可以在另外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分和/或一种或多种HIV试剂中间施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及被动疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含至少一个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含本发明的任一抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含单克隆抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分包含重组抗体。在一些实施方案中，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分是重组产生的。在一些实施方案中，被动疫苗还包含佐剂。在一些实施方案中，被动疫苗还包含药学上可接受的赋形剂、防腐剂和/或载体。在另一个实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中防止HIV-1感染的方法。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用本发明任一方面的被动疫苗组合物。
在一些实施方案中，本发明涉及核酸。在一些实施方案中，核酸包含编码本发明的抗HIV-1抗体的一条或多条重链和/或轻链的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、99、73、77、81、85、89和93中的一个或多个的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有保守取代。在一些实施方案中，核酸包含编码本发明的抗HIV-1抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ ID NO:2-4、6-8、10-12、14-16、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、38-40、42-44、46-48、50-52、54-56、58-60、62-64、66-68、70-72、74-76、78-80、82-84、86-88、90-92和94-96中的一个或多个的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有保守取代。
在一些实施方案中，本发明涉及包含一个或多个核苷酸序列的载体或载体系统，所述核苷酸序列编码本发明的一个或多个抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链和/或CDR。在一些实施方案中，载体或载体系统包含编码重链可变区的核酸序列和编码轻链可变区的核酸序列。在一些实施方案中，编码重链的核酸序列与编码轻链的核酸序列在同一载体上。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列与编码轻链可变区的核酸序列位于不同的载体上。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种质粒。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种噬菌体载体。在一些实施方案中，噬菌体载体是γ噬菌体。在一些实施方案中，所述一种或多种载体是一种或多种黏粒。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种重组染色体。在一些实施方案中，载体系统是不同载体的组合。在一些实施方案中，不同核酸序列的表达可以是同时发生的。在其他实施方案中，不同核酸序列的表达可以是单独诱导的。在另一个实施方案中，本发明涉及载体或含有一个或多个核酸序列的载体或载体系统，所述核酸序列编码本发明的一个或多个抗HIV-1抗体的一条或多条重链和/或一条或多条轻链的一个或多个互补决定区(CDR)。
V.附图简要说明
图1A、1B、1C、1D、1E、1F表示供体EB354中的抗体库。图1A：2002-2015年测量的病毒载量值。图中显示分离中和抗体的时间点。用向下箭头标记收集血浆的时间点。图1B：显示来自针对一组HIV-1菌株测试的来自4个时间点((lA)中的箭头所示)的纯化血清IgG的TZM-bl测定中的IC50值的热图。所有中和测定一式两份进行。图1C：上图：CD19预富集IgG+记忆B细胞用CD19以及用三种非天然HIV-1诱饵(bait)(2CC核心、gp140YU2折叠三聚体和gp14092UG37.8+gp140CZA79012(gp140 A+C)折叠三聚体)和一个天然诱饵BG505.SOSIP-AviB染色。方形插图中的群体表示单细胞分选的细胞，数字表示总IgG+细胞中CD19+/诱饵+细胞的百分比。下图：饼图表示从顶部显示的相应FACS图中的单分选细胞扩增的总Ig序列。饼图中间的数字表示抗体的总数。空白块表示仅出现一次并且没有任何克隆亲属的序列。所述块代表抗体克隆，并且与每个克隆中的序列数成正比。标有星号的克隆是显示tier 2中和的克隆，这些克隆由变体NC37、BG18和BG1表示。图1D：上图：单克隆抗体NC37、BG1和BG18的显示基于TZM-bl测定中的IC50值的中和效力的热图。下图：针对YU2WT、YU2N280Y、YU2NN332K和YU2NN160K，2014年的供体多克隆IgG以及NC37、BG1和BG18的基于TZM-bl测定中的IC50值的中和效力。所有TZM-bl测定一式两份进行。图1E：针对一组120Tier 2HIV-1假病毒检测的，抗体NC37、BG1、BG18和1：1：1组合(“comb.”)的基于TZM-bl测定中的IC50的中和效力的热图。所有中和病毒的几何平均值和百分比宽度(percent breadth)在下图中显示。中和测定一式两份进行。图1F：基于(1E)中的值的覆盖曲线。
图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G表示BG18 bNab的序列和结构分析。图2A：10-1074、PGT121和BG18的重链氨基酸序列的比对。星号表示比对中的间隙。箭头代表所有三种抗体与其各自的种系基因相比发生突变的框架位置。显示CDR H1、H2和H3。图2B：(A)中10-1074、PGT121和BG18的轻链序列比对。图2C：左图：以的分辨率解析BG18Fab的VH结构域(深灰色)和VL结构域(浅灰色)的带图。中图：BG18可变结构域的表面展示。右图：CDRH3构象通过环内的氢键(显示为虚线)稳定。相互作用的残基以棍表示，CDRH3的其余部分和相邻的CDRH1以带图显示。图2D：左图：显示BG18(紫色)、GT121(绿色)和10-1074(蓝色)可变结构域重叠的带图。BG18的CDRH3用红色突出显示，PGT121和10-1074的CDRH3环为褐红色。右图：显示VH叠加后BG18(浅粉红色)和PGT121(浅绿色)的VL。CDRL2BG18在晶体中是无序的，并用虚线表示。10-1074与PGT121密切相关，为清楚起见而省略。图2E：BG18和PGT121的表面展示。图2F：与BG18和179NC75的Fab结合的BG505 SOSIP.664的单粒子EM结构(灰色透明密度)。如下文实施例1中所述，将BG505 SOSIP.664、BG18 Fab和179NC75 Fab模型(CH103Fab：PDB4JAM)的坐标拟合至EM密度。给出了2D类平均值。图2G：BG18Fab采用的BG505结合角与10-1074、PGT122(PDB 5FYJ)、PGT135(PDB 4JM2)和PGT128(PDB 5ACO)的Fab的比较。从BG18-179NC75-BG505图去掉179NC75 Fab的密度以便于比较。
图3A、3B、3C、3D、3E表示供体EB354中的自体血浆病毒。图3A：来自在2006、2010、2013和2014取样的供体EB354的单基因组衍生的env基因序列的最大似然系统发育树。红色星号自引支持度≥90％的分支。三个主要序列组任意命名为簇A、B和C。三个三角形表示不存在N-连接糖基化位点的env序列。虚线显示的方框表示VOC培养；括号中的数字表示病毒env VOC序列的数量。图3B：描绘来自2010、2013和2014的血浆env序列的成对核苷酸序列多样性的散点图。每个点表示在给定时间点两个序列之间的成对基因差异。使用基于双样本U统计的Z检验确定P值，显示***p<0.0005。图3C：显示使用EB354 env序列针对自体假病毒在与病毒env基因相同的时间点纯化的BG18、BG1、NC37和同时期IgG的TZM-bl测定中的IC50值的热图。星标假病毒对所有三种自体bNAb都有抗性。抗体3BNC117(描述于US 2014/0328862中)用作对照。左侧的圆圈对应于获得序列的时间点，如(3A)中所示。中和测定一式两份进行并重复至少两次。灰色方块表示未进行测定。图3D：饼图表示在不同时间点分析的使用EB354 env序列的自体假病毒对三种自体bNAb中的每一种的敏感性。饼图中间的数字表示测试的env假病毒的数量，并且不同的块与假病毒的数量成正比。bNAb显示在左侧，采集样品的时间点表示在图上方。饼图下方的横条显示通过PCR检测的抗体转录本。图3E：BG18、BG1、NC37和对照bNAb 3BNC117针对2014和2015从EB354 CD4 T细胞获得的VOC在TZM-bl测定中的IC50值。
图4A、4B、4C、4D、4E表示HIVYU2感染的hu-小鼠的治疗。图4A：在BG18(上图)或NC37(下图)单一疗法之前和之后，四只(BG18)和五只(NC37)HIVYU2感染的hu-小鼠的病毒载量值。图上的灰色阴影区域表示施用BG18(上图)或NC37(下图)的时间段。粗线表示每个治疗实验的几何平均值。图4B：用BG18(上图)或NC37(下图)治疗后第21天克隆的病毒的gp120序列的氨基酸序列比对。每个水平条表示与HIV-1YU2比对的单个gp120克隆的序列。氨基酸取代用记号标出。获得序列的小鼠ID显示在垂直条上。框出区域的展开视图显示在每个图的右侧。图4C：饼图显示与野生型HIV-1YU2序列相比，gp120中BG18(上图)和NC37(下图)的复发突变。不同的块与携带突变的序列的数量成正比。饼图中心的数字表示克隆序列的总数。NC37中的白色块表明没有任何复发突变。图4D：用BG18+NC37+BG1组合治疗前后7只hu小鼠的病毒载量值。小鼠T1和T2是未处理的对照小鼠(空心标记)。小鼠T3-T7接受BG18+NC37+BG1组合(实心标记)处理。阴影区域表示给予bNAb组合的时间段。用粗线显示几何平均值，点线表示未处理组和实线表示处理组。图4E：与第0天(抗体施用前)相比，病毒载量的Log10差异。星号表示轮廓值(outline value)。
图5A、5B表示竞争ELISA结果。在增加量的各种竞争抗体的存在下，在ELISA中测定每种中和抗体(等量)与BG505 SOSIP.664的结合。黑线表示在没有竞争的情况下生物素化的抗体结合。图5A：BG18，图5B：BG1。
图6A、6B、6C、6D表示BG18、PGT121和10-1074之间的序列比较。图6A：PGT121、10-1074和9个BG18克隆变体以及它们的预期种系的重链序列的树状图。图6B：重链CDR的比对。突出显示PGT121/10-1074和BG18变体共有的位置。图6C：与(6A)相同但是轻链。图6D：轻链CDR的比对。突出显示PGT121/10-1074和BG18变体共有的位置。
图7表示BG18的静电位。用APBS计算Fab的表面静电位，并且表面表示(surfacerepresentation)显示在在UCSF嵌合体中并阴影化。预期的结合界面用黑色虚线勾勒出轮廓。用黑色三角形表示与Asn137gp120、Asn156gp120和Asn332gp120连接的gp120聚糖的PGT121和10-1074Fab表面上的近似足迹。
图8A、8B、8C表示NC37 Fab-gp120复合物结构。图8A：叠加在8ANC134Fab-gp120复合物结构(PDB 4RX4)上的NC37Fab-gp120复合物的晶体结构揭示了两种抗体相似的gp120结合方向。图8B：Fab-gp120界面的特写显示了与8ANC134 CDRH3相比，NC37的延伸的CDRH3。图8C：表面表示中BG505三聚体结构的侧视图(PDB 4TVP)，其中NC37、8ANC134和NIH45-46的预期表位显示在三聚体的一个原聚体上。NC37的较长CDRH3表明三聚体的相邻原聚体(浅灰色)上的较大接触面积。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F表示BG18抗体与合成的HIV-1V3糖肽的结合。将生物素标记的V3糖肽固定在中性亲和素(neortravidin)芯片上，并使用BG8 IgG作为分析物。图9A：BG18与在N301携带Man9GlcNAc2聚糖的JR-FL mini-V3糖肽之间的相互作用。观察到弱的结合。图9B：BG18与在N332携带Man9GlcNAc2聚糖的JR-FL mini-V3糖肽之间的相互作用。观察到弱的结合。图9C：BG18 IgG与在N301携带双触角复合型N-聚糖的JR-FL mini-V3糖肽之间的相互作用。没有观察到结合。图9D：BG18 IgG与在N332携带双触角复合型N-聚糖的JR-FLmini-V3糖肽之间的相互作用。没有观察到结合。图9E：BG18 IgG与在N334携带Man9GlcNAc2聚糖的A244 mini-V3糖肽之间的相互作用。观察到弱的结合。图9F：BG18 IgG与在N334携带Man9GlcNAc2聚糖的CAP45 mini-V3糖肽之间的相互作用。观察到弱的结合。
图10A和10B表示来自供体EB354的血浆病毒的单基因组env测序。图10A：饼图表示对于每个收集时间点通过单基因组PCR扩增的总env序列。饼图的中间表示从每个时间点获得的序列总数，并且不同的块与序列的数量成正比。图10B：在2006、2010、2013和2014取样的供体EB354的单基因组衍生的env基因序列的最大似然系统发育树。星号表示自引支持率≥90％的分支。右侧的表显示使用EB354 env序列针对自体假病毒的BG18、BG1、NC37和对照抗体3BNC117在TZM-bl测定中的TCID50值和IC50值。
图11A、11B、11C表示用BG8治疗的HIVYU2感染的hu小鼠。图11A：施用BG8之前和之后四只hu小鼠中的病毒载量值。图中的灰色阴影区域表示抗体施用的时间段。粗线表示几何平均值riment。图11B：在治疗后第21天克隆的病毒的gp120序列的氨基酸序列比对。每个水平灰色条表示与HIV-1YU2比对的单个gp120克隆的序列。氨基酸取代以黑色记号示出。获得序列的小鼠ID显示在垂直黑条上。框出区域的扩展视图显示在每个图的右侧。图11C：饼图显示BG8治疗后与野生型HIV-1YU2序列相比，gp120中的复发突变。饼图中心的数字表示克隆序列的总数；块表示gp120中最一致的突变区域，并且与携带突变的序列的数量成正比。
图12A、12B表示HIVYU2感染的抗体治疗的人源化小鼠中的病毒载量。BG18(图12A)和NC37(图12B)单一疗法之前和之后HIVYU2感染的人源化小鼠中的病毒载量值。图中的阴影区域表示给予抗体的时间段。每个图显示由圆圈(一个实验)和正方形(第二个实验)表示的两个独立实验。实心和空心的形状分别表示治疗小鼠和对照小鼠。虚线和粗线分别表示对照和治疗小鼠的平均值。
VI.具体实施方案
A.定义
如本文所公开的，抗HIV-1抗体可以采用本领域中的多种形式中的一种。抗体部分地由它们所结合的抗原限定，因此，如本文所述，“抗HIV-1抗体”是特异性结合至少一个在人免疫缺陷病毒1(“HIV-1”)病毒包膜(例如在gp120和/或gp140内)发现的表位的任何此类抗体。在本领域中应理解，抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区都包含框架区(FWR)和互补决定区(CDR)。四个FWR区是相对保守的，而CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)代表高变区并且从NH2末端到COOH末端按如下顺序排列：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域，然而，根据同种型，恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。本领域已知可以操作单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术的技术来产生保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这些技术可以发展成将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。
本文使用的术语“抗体”(Ab)以最广泛的意义使用，具体地可包括任何免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或完全合成产生的，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。因此，如在本说明书内任何上下文中所使用的术语“抗体”意指包括但不限于任何特异性结合成员、免疫球蛋白类型和/或同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)和生物学相关的片段或其特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab')2、scFv(单链或相关实体)和(scFv)2。
如本文所述，本文所用的术语“抗体片段”可包括使用那些本领域普通技术人员容易已知且可获得的技术获得的那些抗体片段。因此，除了上文所述的“抗体”的定义之外，术语“抗体”可进一步包括任何包含完整抗体的一部分的多肽或蛋白，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。这些可以源自天然来源，或者它们可以部分或完全合成产生。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体和线性抗体。如本文所用的术语“抗原结合部分”、“抗原结合片段”或“Fab”可以指抗体上与抗原结合的区域。本领域普通技术人员将理解，Fab包含抗体每条重链和轻链的一个恒定结构域一个可变结构域。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”可以指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即包含所述群的单独抗体在除了可能以少量存在的可天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体可包括但不限嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和人抗体。产生单克隆抗体的方法是本领域熟知的，下面讨论的一些具体实例包括杂交瘤技术、重组抗体产生(例如，通过噬菌体展示或酵母展示技术)、通过转基因小鼠产生和单B细胞培养。涉及通过PCR(或类似技术)在体外或在细菌和/或哺乳动物和/或酵母系统中扩增抗体基因(例如质粒或黏粒)的重链和/或轻链的方法被认为是在本发明的范围内。
本文所用的术语“保守序列修饰”或“保守取代”可以指对本发明的靶表位的氨基酸修饰，其不显著影响或改变抗HIV-1抗体与表位的结合特征。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗HIV-1抗体特异性结合的靶表位(例如HIV-1病毒包膜上的表位，例如gp120和/或gp140上的表位)内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以针对可测试的靶表位测试本发明的抗体，例如使用本文所述的功能测定或在本领域中其他已知的测定。
术语“生物样品”是指从生物体(例如患者)或生物体的组分(例如细胞)获得的样品。样品可以是任何生物组织、细胞或液体。样品可以是“临床样品”，其是源自受试者(例如人患者)的样品。此类样品包括但不限于唾液、痰液、血液、血细胞(如白细胞)、体液、灌洗液、胰液、胃液、排出物、CSF、淋巴羊水、血浆、精液、骨髓和组织或细针活检样品、尿液、粪便、腹膜液和胸膜液、或其细胞及其任何组合。生物样品还可包括组织切片，例如用于组织学目的的冷冻切片。生物样品也可称为“患者样品”。生物样品还可包括基本上纯化或分离的蛋白质、膜制剂或细胞培养物。
术语“双特异性抗体”是指人工免疫球蛋白构建物，其包含与两种不同的抗原结合的两种不同的单克隆抗体的片段。存在几种独特类型的双特异性抗体，包括但不限于三功能抗体和化学连接的Fab。本发明的抗HIV-1抗体可以包含双特异性抗体，并且包括一个或多个不同抗HIV-1抗体的片段，所述不同抗HIV-1抗体包括本发明的一个或多个不同的抗HIV-1抗体，例如BG18和BG1，或本发明的一个或多个抗HIV-1抗体和已知的抗HIV-1抗体，例如BG18和3BNC117(在US 2014/0328862中描述)，或BG18和VRC01(在US8,637,036中描述)。在PCT/US16/64713中描述了双特异性抗HIV bNab及其制备和使用的方法，在此通过引用并入。
如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”可以指能够在治疗的受试者中产生医学上期望的结果的化合物或药剂的量。治疗方法可以在体内或离体进行、单独进行或与其他药物或疗法结合进行。治疗有效量可以一次或多次给药、应用或剂量施用，并不意图限于特定的制剂或施用途径。
术语“特异性结合”、“选择性结合”可以指抗体与预定抗原上的表位结合但不与其他抗原上的表位结合。通常，当通过例如平衡透析或者在2000表面等离子体共振仪器中的表面等离子体共振(SPR)技术来测定(使用预定抗原，例如HIV-1的病毒包膜上的表位(例如gp120)作为分析物并使用抗体作为配体)，或抗体与抗原阳性细胞的结合的Scatchard分析测定，抗体以约小于10-6M，例如约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，和(ii)结合预定抗原的亲和力比其结合除预定抗原外的非特异性抗原或紧密相关抗原(例如BSA，酪蛋白)的亲和力至少大两倍。
如本文所用的术语“同源性”可以指两种组合物之间共有结构的存在。在蛋白质背景下，术语“同源性”可以指两个或多个氨基酸序列和/或肽序列之间重叠的量(例如以百分比表示)。在核酸背景下，该术语可以指两个或更多个核酸序列之间重叠的量(例如以百分比表示)。如本文所用，两个序列之间的百分比(％)同源性等于两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数量的函数(即％同源性＝相同位置的#/位置总数#×100)，考虑到间隙的数量和每个间隙的长度，需要引入其以得到两个序列的最佳比对。可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比的测定。这种同源性的广泛代表是局部比对工具和/或算法(例如，BLAST和/或BLAST 2.0)，并且可包括成对比对、多序列比对方法、结构比对方法和/或系统发育分析方法。
如本文所用，术语“共同施用”、“共同给药”和“与……组合”可以指向受试者施用至少两种药剂或疗法。在一些实施方案中，两种或多种药剂/疗法的共同施用是并存的。在其他实施方案中，在第二药剂/疗法之前施用第一药剂/疗法。本领域技术人员理解，所使用的各种药剂/疗法的制剂和/或施用途径可以变化。例如，本发明的抗HIV-1抗体可以彼此共同施用，或者可以与其它抗体共同施用，例如，其它广谱中和抗体，举例来说，如在US 2014/0328862中公开的那些广谱中和抗-HIV抗体例如，3BNC117或在US 8,637,036中描述的VRC01，通过引用其整体并入本文，或任选地，与其它HIV药剂共同施用。共同施用可同时发生，也可不同时发生，例如，本发明的一个或多个抗HIV-1抗体可以在本发明的另一个抗HIV-1抗体(或其它抗HIV抗体或其它HIV试剂)之前或之后施用，或者可以在相同或基本相似的时间施用。本领域普通技术人员将理解，共同施用并不意指时间上受到限制，因为其意在描述与作为患者方案的一部分的其它化合物和/或疗法一起施用。
如本文所用，术语“HIV试剂”可以指用于治疗HIV的疗法，其本身不包含抗HIV-1抗体。例如，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、CCR5拮抗剂/进入抑制剂、整合酶链转移抑制剂(INSTI)及其组合，都被认为是“HIV试剂”，因为它们是基于非抗体的治疗性治疗，其可以与一个或多个本发明的抗HIV-1抗体和/或额外的抗HIV-1抗体共同施用。本领域普通技术人员将理解，该列表不应被认为是穷尽性的，并且随着技术的进步和额外的治疗的出现，它们被认为在该定义的范围内。
如本文所用，术语“载体”可包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所用剂量和浓度对与之接触的细胞或哺乳动物无毒。通常生理学上可接受的载体是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如但不限于EDTA；糖醇，例如但不限于甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，例如但不限于钠；和/或非离子表面活性剂，例如但不限于TWEEN.；聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
术语疾病的“治疗”是指执行方案，其可包括向患者(人或其它)施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的病征或症状。缓解可以在出现疾病的病征或症状之前发生以及在出现之后。因此，“治疗”包括“预防”或“防止”疾病。术语“预防”或“防止”是指预防性的和/或防止性的措施，其目的是防止或减缓目标病理状况或病症。例如，在感染免疫缺陷病毒1(HIV-1)的情况下，在以下情况下可以产生“预防”或“防止”：先行治疗疗程从而防止或阻止HIV-1感染，例如通过被动接种。在HIV-1潜伏感染的情况下也会出现这种“预防”或“防止”，例如那些血清阳性但没有表现出任何症状(即没有发展为AIDS症状)的个体，其目的可以预防活性感染和/或清除患者的所述HIV-1感染。另外，“治疗”不需要完全缓解病征或症状，不需要治愈，并且具体包括对患者仅具有些微的积极效果的方案。
如本文所用，术语“表位”可指抗体或T细胞结合的抗原的区域，例如，HIV-1的病毒包膜的区域，包括但不限于糖蛋白，例如gp120，或糖蛋白上的区域。“抗原”指引起免疫反应或结合该反应的产物的物质。
术语“纯化的”或“分离的”抗体、肽、多肽或蛋白质指如本文所用的肽、多肽或蛋白质，可指已经从与其天然相关的其他蛋白质、脂类和核酸中分离的肽、多肽或蛋白质。多肽/蛋白质可占纯化制剂的干重的至少10％(即10％和100％的任何百分比，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和99％)。纯度可通过任何合适的标准方法来测量，例如，通过柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。通过重组DNA技术来生产本发明所述的分离的多肽/蛋白质(例如，抗HIV-1抗体)。
B.广谱中和抗HIV-1抗体
本发明涉及广谱中和抗HIV-1抗体(bNab)及其抗原结合部分。特别地，本发明涉及许多不同的单克隆抗体(BG18、NC37和BG1)，其抗原结合部分(包括但不限于其互补决定区(CDR))及其衍生物和变体，其在体外显示对HIV-1有效的广谱中和作用(参见下文实施例1)。因此，如本文所讨论，本发明的抗HIV-1抗体具有强的治疗效用，单独或彼此组合，或与其它bNab或与其它HIV治疗组合。
BG18、NC37和BG1每个均有不同的非重叠表位。NC37识别CD4b。NC37及其克隆变体显示VH1-2和VH1-46衍生的bNAb的特征；然而，结构分析表明NC37以VH1-46型方式识别Env。不希望受理论束缚，预期NC37的长CDRH3与三聚体上的相邻原聚体接触，从而识别核心与CD4b重叠的四元三聚体表位。
BG1与Env的V1V2区域结合，其是天然感染期间出现的bNAb的另一个常见靶标。BG1表示从感染分支B的供体中分离的该类型(bNab)中的第一抗体。其效力类似于VRC26抗体家族的成员，例如在N.A.Doria-Rose等人.,Developmental pathway for potent VlV2-directed HIV-neutralizing antibodies.Nature 509,55-62(2014)中公开的那些，但不如PG9/16和PGDM1400 bNAb有效。与迄今为止分离的其它V1V2 bNAb一样，BG1具有长的富含酪氨酸的CDRH3。
BG18是BG18、NC37和BG1每个中最有效的，其针对V3环底部以Asn332gp120为中心的聚糖片(glycan patch)。这是一个高度糖基化的区域，包括在位置Asn332gp120、Asn301gp120、Asn386gp120、Asn392gp120、Asn137gp120、Asn156gp120的碳水化合物。已经分离了许多在该位点与蛋白质和碳水化合物组分均结合的单克隆bNAb，包括PGT121-124(如L.M.Walker等人.,Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potentantibodies.Nature477,466-470(2011)中所述)和10-1074(如H.Mouquet等人.,Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIVantibodies.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 109,E3268-3277(2012)中所述)。所有这些bNAb都是从分支A供体中分离出来的，可以亚分类为仅依赖Asn332gp120聚糖的那些(10-1074和PGT124)，以及也与V3聚糖片中的周围聚糖接触的那些(PGT121-123)。BG18及其克隆变体在依赖Asn332gp120方面类似于10-1074，但BG18比公开的抗-V3 bNAb更有效，并且首先从分支B供体中分离出来。
BG18与这种类别中先前表征的成员的区别在于，CDRH3和轻链结构域的令人惊讶的独特定向。此外，BG18与该组抗体的其他成员的不同之处在于，它具有较短的CDRH3且没有插入或缺失，不希望受理论束缚，这表明BG18样抗体可能更容易引发。在缺乏BG18-Env复合物的高分辨率结构的情况下，难以预测BG18的较短的CDRH3如何与Env相互作用。对PGT122和10-1074Fab的Env复合物的结构研究表明，它们采用类似的接近角，其近似垂直于Env三聚体内的gp120原聚体。然而，BG18-Env EM结构尽管没有足够的分辨率来解析详细的相互作用，但它表明BG18从不同的角度接近Env，相对于10-1074和PG122的接近角，其朝gp120原聚体移动高达40°。BG18克隆变体和衍生物，包括354BG8、354BG18、354BG42、354BG33、354BG129、354BG188、354BG411和354BG426，以及它们的全长序列、重链和轻链互补决定区(CDR)，列于下表1中。BG18变体的树状图在图6中列出并在下文的实施例1中讨论。BG1克隆变体和衍生物，包括BG1、BG22和BG47，以及它们的全长序列、重链和轻链互补决定区(CDR)，列于下表2中。
表1.BG18变体序列
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表2.BG1变体的序列
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本领域普通技术人员将理解，大多数抗体(例如NC37、BG1(包括BG1的所有变体)和BG18(包括BG18的所有变体))的互补决定区(“CDR”)通过在抗体上形成互补位而很大程度上决定了抗体的生物活性，其中CDRH3具有最独特的特征。因此，本发明的抗体可包含NC37、其CDR，BG1、其CDR和BG18及其CDR，包括NC37、BG1和BG18的所有变体及其各自的CDR。本领域普通技术人员还将认识到，本发明的抗体可以含有保守取代，包括在CDR中，并且仍然在本发明的范围内。因此，本发明的一些实施方案涉及表达表1和2中列出的CDR的抗体及其抗原结合部分。
例如，本发明的一些实施方案涉及具有包含以下一个或多个序列的重链的抗体或其抗原结合部分：SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89，或与EQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89中的一个或多个具有一定程度的同源性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及其中的任何介于中间的范围。SEQID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89中的一个或多个可具有保守取代。本发明的一些实施方案涉及具有包含以下一个或多个序列的轻链的抗体或其抗原结合部分：SEQ IDNO:5、13、21、20、37、45、53、61、69、77、85和93，或与SEQ ID NO:55、13、21、20、37、45、53、61、69、77、85和93中的一个或多个具有一定程度的同源性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及其中的任何介于中间的范围。SEQ ID NO：5、13、21、20、37、45、53、61、69、77、85和93中的一个或多个可具有保守取代。
IgG重链的大小通常为约400至约600个氨基酸，更通常为450至约550个氨基酸。不管抗体种类如何，每条重链的可变区通常长约100-140个氨基酸，最通常约110-130个氨基酸。轻链通常长约210-220个氨基酸，更通常211-217个氨基酸。轻链的可变区通常长约100-120个氨基酸。
本发明的一些实施方案涉及在重链内具有一个或多个包含以下一个或多个序列的CDR的抗体或其抗原结合部分：SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92，或与SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92中的一个或多个具有一定程度的同源性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及其中的任何介于中间的范围。SEQ ID NO:2-4、10-12、18-20、26-28、34-36、42-44、50-52、58-60、66-68、74-76、82-84和90-92中的一个或多个可以具有保守取代。
本发明的一些实施方案涉及在轻链内具有一个或多个包含以下一个或多个序列的CDR的抗体或其抗原结合部分：SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96，或与SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96中的一个或多个具有一定程度的同源性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以及其中的任何介于中间的范围。SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40、46-48、54-56、62-64、70-72、78-80、86-88和94-96中的一个或多个可具有保守取代。
此外，本发明的抗体可以包含来自不同bNab个体(包括但不限于本发明的那些bNab)的抗原结合部分，例如CDR。纯粹作为实例，工程化衍生物可包含来自NC37、BG1或BG18(包括任何变体)之一的轻链，和来自不同的bNab(包括NC37、BG1或BG18之一，包括任何变体)的重链。或者，工程化衍生物可包含来自BG18的一个变体的轻链和来自另一个BG18变体的重链。本领域技术人员将知晓，重组抗体产生方法允许产生显著数量的重组抗体，其中的每一个都明确地认为在本公开的范围内。因此，本发明的bNab可以通过重组DNA方法产生，例如在U.S.Pat.No.4,816,567中所述的那些。编码本发明单克隆抗体的DNA可以使用常规步骤容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中(例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，从而在重组宿主细胞中以获得单克隆抗体的合成。DNA也可以被修饰，例如，通过共价连接至免疫球蛋白编码序列、全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明抗体的恒定结构域，或者可以取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
一旦以重组或其它方式产生，抗HIV-1抗体可以进行纯化的或分离，使得抗体基本上不含有例如任何血清、上清液或其它细胞培养物或相关材料。抗体纯化的方法是本领域已知的，并且可以包括选择性富集或特异性分离方法。例如，可以使用亲和纯化，例如类型特异性亲和力。也可以在一开始采用分级化方法来帮助分离包括免疫球蛋白的样品蛋白质的亚群。通常，应用抗原特异性亲和力来分离与所述抗原结合的抗体。然后可以将抗体与载体、缓冲液、稀释剂、溶剂和/或防腐剂等组合，用于产生药学上可接受的抗HIV-1抗体组合物。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达的方法。通常在Fc区中的任何位置截短重链以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。体外方法也适于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来完成抗体消化，以产生其片段，特别是Fab片段。
人单克隆抗体可以使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。也可使用Cole等人和Boerner等人的技术制备人单克隆抗体(Cole等人.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner等人.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人抗体，例如，内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的小鼠。在应激后，观察到人抗体产生，其在所有方面与人中观察到的非常相似，包括基因重排、装配(assembly)和抗体库。例如，在U.S.Pat.No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中以及以下科学出版物中描述了这种方法：Marks等人.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild等人.,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
本发明的一些实施方案涉及含有编码可变区的核苷酸序列的载体和载体系统，包括但不限于本发明的抗HIV-1抗体(例如，NC37、BG1和BG18，包括任何变体)及其抗原结合部分的CDR。例如，载体可以但不一定是质粒；其他重组载体是本领域已知的，可包括例如，噬菌体载体如λ噬菌体载体、其它病毒载体如非复制型腺病毒载体、黏粒和/或人工染色体。载体系统可以是或可以不是可单独诱导的，即具有不同的启动子和/或阻遏元件。大多数工程化载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标记，这样只要载体(包括载体系统，例如多个质粒)含有这样的系统，它们就被认为是本发明范围所涵盖。从给定的肽序列获得核酸序列并将它们克隆到所选择的系统中，在本领域普通技术人员的能力范围内。因此，本发明的一些实施方案涉及含有一个或多个核酸序列的载体或载体系统，所述核酸序列编码SEQID NO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、73、77、81、85、89和93中一个或多个。在一些实施方案中，本发明涉及含有一个或多个核酸序列的载体或载体系统，所述核酸序列编码本发明一个或多个抗HIV-1抗体的一条或多条重链和/或轻链的一个或多个CDR，例如，编码SEQ ID NOL:2-4、6-8、10-12、14-16、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、38-40、42-44、46-48、50-52、54-56、58-60、62-64、66-68、70-72、74-76、78-80、82-84、86-88、90-92和94-96及其组合中的一个或多个的一个或多个核苷酸序列。编码重链/轻链和/或CDR的这些核苷酸可以具有保守取代，并且对于那些编码CDR的核苷酸(与这些保守取代无关)，可以与所述核酸序列具有一定程度的同源性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。可以将本发明的载体或载体系统引入一个或多个细胞中(即用载体“转化”细胞)，并且这类方法是本领域已知的。
C.药物制剂和递送
本发明的一个实施方案涉及包含至少一个本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的药物组合物，以及它们用于治疗有此需要的患者中的方法。患者可能有潜伏或活跃的HIV-1感染。在这些组合物和方法中使用的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可以是本发明的任何抗HIV-1抗体或其抗原结合部分，但特别有用的是那些包含BG18或变体的抗HIV抗体或其抗原结合部分，包括重组产生的变体和/或其工程化衍生物。
适于患者施用的药学上可接受的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分组合物将在制剂中含有有效量的抗HIV-1抗体或抗体或其抗原结合部分，其均保留生物活性，还可在储存期间在可接受的温度范围内促进最大稳定性。根据所需的制剂，药物组合物还可包括药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂或通常用于配制动物或人类施用的药物组合物的任何此类媒介物。挑选稀释剂以便不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank氏溶液。本发明的药物组合物或制剂中的有用的赋形剂的量是用于使抗体在整个组合物中均匀分布的量，以使将其递送至有需要的受试者时均匀分散。它可用于将抗体稀释至提供所需有益的缓解或治愈结果的浓度，同时将可能由于浓度过高而可能发生的任何不良副作用降至最低。它也可能具有防腐作用。因此，对于具有高生理活性的抗体，将使用更多的赋形剂。另一方面，对于任何表现出较低生理活性的有效成分，将使用较少量的赋形剂。
药学上可接受的组合物可以是液体形式或固体形式。固体制剂通常但不不一定冻干并在进行单次或多次给药施用前加入溶液中。制剂不应暴露于极端温度或pH值以避免热变性。因此，必须在生物学相关的pH范围内配制本发明的抗体组合物。通常需要对溶液进行缓冲以在储存期间保持适当的pH范围，特别是对于在配制和施用之间储存较长时间的液体制剂。通常，液体和固体制剂都需要在较低温度(通常为2-8℃)下储存，以保持较长时间的稳定性。配制的抗体组合物，尤其是液体制剂，可含有抑菌剂以防止储存期间的蛋白质水解或使其最小化，包括但不限于有效浓度(通常<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。对于一些患者，抑菌剂可能是禁忌的。因此，冻干制剂可以在含有或不含有这种成分的溶液中重构。可以将额外的组分添加到缓冲液体或固体抗体制剂中，包括但不限于作为冷冻保护剂的糖(包括但不必限于多羟基烃，例如山梨糖醇、甘露醇、甘油和半乳糖醇和/或二糖，例如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，并且在某些情况下，还有相关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。这种抗体制剂，特别是将要长期储存的液体制剂，将依赖于有用的总渗透压范围，以促进2-8℃或更高温度下的长期稳定性，同时还可使制剂用于肠胃外注射。例如但不是必须的，总渗透压的有效范围(溶液中的分子总数)可以是约200mOs/L至约800mOs/L。很明显，诸如蔗糖或山梨糖醇的细胞保护剂的量将取决于制剂中盐的量，以使溶液的总渗透压保持在合适的范围内。因此，无盐制剂可以但不一定含有约5％至约25％的蔗糖。
或者，无盐山梨糖醇基制剂可以但不必定含有约3％至约12％范围内的山梨糖醇。无盐制剂可以保证各个冷冻保护剂范围的增加，以保持有效的渗透压水平。这些制剂还可含有二价阳离子(包括但不一定限于MgCl2、CaCl2和MnCl2)；和非-32离子表面活性剂(non-32ionic surfactant)(包括但不一定限于聚山梨酯-80(吐温)、聚山梨酯-60(吐温)、聚山梨酯-40(吐温/>)和聚山梨醇酯-20(吐温/>)、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于/> 以及其他如Triton X-/>Triton X/>Span85和Pluronic系列非离子表面活性剂(例如Pluronic 121)。这些组分的任何组合，包括可能包含的抑菌剂，可用于填充本发明的含抗体制剂。本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分也可以是“化学衍生物”，其描述含有额外化学部分的抗体，所述化学部分通常不是免疫球蛋白分子的一部分(例如聚乙二醇化)。这些部分可以改善基础分子的溶解度、半衰期，吸收等。或者，所述部分可以减弱基础分子的不良副作用或降低基础分子的毒性。
对于体内治疗，对患者施用或提供包含至少一种本发明的抗HIV抗体或其抗原结合部分的药物制剂。当用于体内治疗时，将本发明的抗HIV抗体或其抗原结合部分以治疗有效量(即消除或减少总病毒载量的量，如下文实施例1中所述)施用于患者。将抗体施用于人患者，根据已知方法，例如静脉内给药，例如大剂量(bolus)或者一段时间内的连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、外用(topical)或吸入途径。可能时，抗体或其抗原结合部分可以在靶细胞部位肠胃外给药，或静脉内给药。在一些实施方案中，通过静脉内或皮下给药来施用抗体。本发明的治疗组合物可以全身、胃肠外或局部施用于患者或受试者。上述用于评估成功治疗和改善疾病的参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测定。
对于肠胃外给药，抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可以与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。此类媒介物的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清蛋白。非水性媒介物包括但不限于固定油和油酸乙酯。脂质体可用作载体。媒介物可含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，举例来说，如缓冲剂和防腐剂。
本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可以以足以提供针对HIV-1的治疗性治疗的量以本领域可用的任何方式、策略和/或组合施用于宿主。这些组合物可通过本领域已知的各种途径提供给个体，尤其是肠胃外途径，包括但不限于肠胃外途径，例如静脉内(IV)、肌肉内(IM)；或者皮下(SC)给药，IV施用是治疗性抗体施用领域内的标准。这些组合物可以分开或多剂量施用(即，通过在治疗方案期间维持制剂的无菌条件，在错开的时间施用抗体)。
剂量和剂量方案取决于医生容易确定的各种因素，例如感染的性质，例如其治疗指数，患者和患者的病史。通常，将治疗有效量的抗体施用于患者。在一些实施方案中，施用的抗体的量在约0.001mg/kg患者体重至约100mg/kg患者体重的范围，以及其间的任何范围。根据感染的类型和严重程度，约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂量)抗体是用于施用于患者的初始候选剂量，而不论是否例如通过一个或多个单独施用，还是通过连续输注。抗HIV-1抗体可以以相对低的体积速率递送，例如但不一定约0.001ml/天至10ml/天，以使组合物释放的部位附近的组织干扰或创伤最小化。根据具体的生物制剂，制剂可以以低剂量的速率释放，例如，通常从约0.01μg/hr或0.1μg/hr、0.25μg/hr、1μg/hr，高至约200μg/hr，或以低体积速率递送制剂，例如，体积速率为从约0.001mL/天至约1mL/天，例如，0.01微克/天高至约20毫克/天。剂量取决于许多因素，例如所用活性成分(例如抗HIV-1抗体或其抗原结合部分)的效力、生物利用度和毒性以及受试者的要求。通过常规方法和测定并基于医师或本领域其他技术人员已知的标准，可以容易地监测该疗法的进展。上述用于评估疾病成功治疗和改善的参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测定。
如本文所讨论和本领域进一步已知，本发明的抗HIV-1抗体的递送载体的具体实施方案包括PLGA微球以及包含聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯；PEVAc)的基于聚合物的不可降解载体。此外，在Grainger等人.,2004,Expert Opin.Biol.Ther.4(7):1029-1044中综述了基于抗体的治疗产品的控释和局部递送。能够包封抗体的合适的微胶囊还可包括通过凝聚技术或通过界面聚合制备的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。参见题为“Method for Producing IGF-1Sustained-Release Formulations”的PCT公开WO 99/24061，其中蛋白质被包封在PLGA微球体中，该参考文献通过引用整体并入本文。此外，还可以使用微乳液或胶体药物递送系统，例如脂质体和白蛋白微球。其他优选的持续释放组合物使用生物粘附剂将抗体保留在施用部位。如上所述，持续释放制剂可包含将抗体置于其中的可生物降解的聚合物，其可提供非立即释放。非可注射装置在本文中可描述为“植入物”、“药物贮库植入物”、“贮库植入物”、“非可注射的贮库”或一些这样类似的术语。常见的贮库植入物可包括但不限于固体可生物降解和不可生物降解的聚合物装置(例如延伸的聚合物或同轴棒形装置)，以及本领域中已知的许多泵系统。
将可注射装置分成大剂量注射(注射后药物的释放和消散)，以及贮存库或贮库注射，其在注射部位提供贮库，允许生物制剂随时间持续释放。可以通过外科手术将贮库植入物束缚至递送点，以便为抗体随时间延长释放提供足够的贮库。这种装置能够携带具有预定时期内治疗所需的治疗性或预防性的量的药物制剂。贮库植入物还可以在治疗期间保护制剂免受身体过程(例如蛋白酶)的降解。如本领域所知，术语“持续释放”是指这种药剂在延长的时间内从嵌段聚合物基质中逐渐(连续或不连续)释放。无论具体装置如何，组合物的持续释放将导致抗体的局部生物有效浓度。生物制剂的持续释放可以是一天、几天、一周或更长的时期；但最有可能是一个月或更长时期，或最多至约六个月，这取决于制剂。由于诸如通用的降解动力学、安全性和生物相容性的特征，本领域已知的天然或合成聚合物将可用作贮库植入物。可以操纵这些共聚物以改变活性成分的药代动力学，保护药剂免受酶攻击和在附着或注射部位随时间而降解。技术人员将理解，本领域有充分的教导来操控这些共聚物的性质，包括各自的制备方法、所用的催化剂和持续释放的贮库植入物或贮库注射的最终分子量。天然聚合物包括但不限于蛋白质(例如胶原蛋白、白蛋白或明胶)；多糖(纤维素、淀粉、藻酸盐、甲壳质、壳聚糖、环糊精、葡聚糖、透明质酸)和脂质。可生物降解的合成聚合物可包括但不限于各种聚酯、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人.,1983，Biopolymers 22：547-556)、聚乳酸([PLA]；U.S.Pat.No.3,773,919和EP 058,481)、聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)如聚丙交酯-共-乙交酯(参见，例如，U.S.Pat.No.4,767,628和5,654,008)、聚乙交酯(PG)，聚(α-羟基酸)的聚乙二醇(PEG)缀合物、聚原酸酯、聚阿司匹林、聚磷酸酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA-g-PLGA、PEGT-PBT共聚物(聚活性)、甲基丙烯酸酯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PEO-PPO-PEO(pluronics)、PEO-PPO-PAA共聚物、PLGA-PEO-PLGA、聚原酸酯(POE)或其任意组合，如上所述(例如，参见U.S.Pat.No.6,991,654和U.S.Pat.Appl.No.20050187631，其每一个通过引用整体并入本文，水凝胶(参见，例如，Langer等人.,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105,不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(例如乙烯乙酸乙烯酯盘和聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯))、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如Lupron DepotTM、聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、透明质酸凝胶(参见，例如，U.S.Pat.No.4,636,524)、藻酸悬浮液、聚原酸酯(POE)等。因为Lupron DepotTM的商业化，聚乳酸(PLA)及其与乙交酯的共聚物(PLGA)在本领域中是众所周知的，其在1989年被批准为使用PLA聚合物的第一个肠胃外缓释制剂。使用PLA和PLGA作为赋形剂以实现活性成分持续释放的产品的其他实例包括Amidox(PLA；牙周病)、Nutropin Depot(PLGA；具有hGH)和Trelstar Depot(PLGA；前列腺癌)。其他合成聚合物包括但不限于聚(c-己内酯)、聚3-羟基丁酸酯、聚(β-苹果酸)和聚(二氧环己酮)]；聚酸酐、聚氨酯(参见WO 2005/013936)、聚酰胺、cyclodestrans、聚原酸酯、n-乙烯醇、聚环氧乙烷/聚对苯二甲酸乙二醇酯、多磷酸酯、聚膦酸酯，聚原酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚乙二醇、聚二氢吡喃和聚缩醛。不可生物降解的装置包括但不限于各种纤维素衍生物(羧甲基纤维素、乙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)硅基植入物(聚二甲基硅氧烷)、丙烯酸聚合物、(聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、多羟基(乙基甲基丙烯酸酯)以及聚乙烯-共-(乙酸乙烯酯)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚乙烯吡咯烷酮、poloxamine、聚丙烯、聚酰胺、聚缩醛、聚酯、聚乙烯-三氟氯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE或“TeflonTM”)、丁苯橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯醚-聚苯乙烯、聚-a-氯对二甲苯、聚甲基戊烯、聚砜和其他相关的生物稳定聚合物。适合于缓释贮库制剂的载体包括但不限于微球体、膜、胶囊、颗粒、凝胶、包衣、基质、薄片(wafer)、丸剂或其他药物递送组合物。上文描述了这种缓释制剂的实例。也可参见U.S.Pat.No.6,953,593；6,946,146；6,656,508；6,541,033和6,451,346，每个专利内容均通过引用并入本文。剂型必须能够携带具有预定时期内治疗所需的治疗性的量和浓度的药物制剂，并且必须为制剂提供足够的保护，使其免于在治疗期间通过身体过程降解。例如，剂型可以由外部材料包围，所述外部材料具有防止代谢过程降解和例如泄漏、开裂、破裂或变形的风险的特性。这可以防止剂型内容物在使用期间受到的应力下以不受控制的方式排出，例如，由于受试者的正常关节接合和其他运动而施加在药物释放装置上的物理力，或者例如，在传递性药物输送装置中与贮库内产生的压力相关的物理力。药物贮库或用于容纳或含有药物的其他装置也必须是这样的材料，以避免与活性剂制剂的非预期反应，并且优选是生物相容的(例如，在植入剂型的情况下，它对于受试者的身体或体液基本上是非反应性的)。通常，以至少12小时至至少一周来将抗HIV-1抗体施用于个体，并且最有可能通过设计的植入物以至少10、20、30、100天或至少4个月、或至少6个月、12个月、24个月或更长时间来递送需要的药物。
在一些实施方案中，本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可以与HIV-1的一种或多种额外的治疗共同施用，例如，与一种或多种HIV药剂共同施用(例如非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、CCR5拮抗剂/进入抑制剂、整合酶链转移抑制剂(INSTI)及其组合)和/或额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分，包括但不限于本发明的额外的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。如下文实施例1所示，NC17、BG1和BG18的1：1：1施用有效的降低体内病毒载量。虽然不希望受理论束缚，但数据表明单克隆bNAb和非常低水平的中和敏感病毒在EB354中共存，这表明抗体有助于该个体中的精英控制(elite control)。根据另一个实施方案，本发明提供了含有至少一个本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的被动疫苗或药物组合物。根据一个实施方案，疫苗或药物组合物是含有至少一个本文所述抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物。疫苗可包括多种具有本文所述特征的任何组合的抗体，并且还可以包括其他抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。被动疫苗可包含一种或多种本领域已知的药学上可接受的防腐剂、载体和/或赋形剂。在其他实施方案中，本发明提供含有HIV-1或其抗原性片段的活性疫苗或药物组合物。如果使用HIV-1，可使其减弱。其可能会被热灭活。如果使用抗原性片段，尽管不是必需的，但优选使用糖蛋白gp120，尽管糖蛋白gp120的片段也可接受。
本发明的组合物可用于免疫原性组合物中以免疫动物。本发明的这种免疫原性组合物可用于制备疫苗。优选生产预防性和/或治疗性疫苗。因此，在本发明范围内的是免疫原性或疫苗组合物，其含有如上所述的药学上可接受的载体和有效量的抗原。组合物中使用的载体可以根据施用方式和途径以及标准药学实践来选择。组合物还可含有佐剂。佐剂的实例包括霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素、脂质体、未甲基化DNA(CpG)或任何其他先天免疫刺激复合物。可用于进一步增加免疫应答的各种佐剂取决于宿主物种，并且包括弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。
疫苗制剂可以本身或以药物或治疗组合物的形式施用于受试者。本发明的组合物和佐剂可以通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干处理的方法来生产。药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，其有助于将本发明的抗原加工成可以药学上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，疫苗制剂可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液中，例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液、磷酸盐缓冲盐水或任何其他生理盐水缓冲液。溶液可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，组合物可以是粉末形式，用于在使用前与合适的媒介物(例如无菌无热原水)进行构建。
例如，施用的组合物的量取决于组合物中的特定抗原、佐剂是否与抗原共同施用、共同施用的佐剂的类型、施用的模式和频率以及期望的效果(例如，保护或治疗)，其可以由本领域技术人员确定。施用的疫苗制剂的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。最初可以从体外测定来估计有效剂量。例如，可以使用本领域熟知的技术来在动物模型中配制剂量，实现免疫应答的诱导。基于本文所述的结果，本领域普通技术人员可以容易地优化对所有动物物种的施用。剂量的量和间隔可以单独调整。例如，当用作疫苗时，本发明的疫苗制剂可以约1-3个剂量施用1-36周。接种疫苗可能会根据情况无限期地持续，特别是被动接种疫苗。优选地，以约3周至约4个月的间隔施用1或2个剂量，并且此后可以定期给予加强免疫接种。替代方案可能适合个体动物。当按如上所述施用时，合适的剂量是疫苗制剂的量，其能够在免疫动物中产生足以保护动物至少4至12个月免于感染的免疫应答。通常，剂量中存在的抗原的量为每kg宿主约1pg至约100mg，通常为约10pg至约1mg，优选为约100pg至约1pg。合适的剂量范围随注射途径和受试者的大小而变化，但通常为约0.1mL至约5mL。可根据需要提供额外的加强剂量。
D.试剂盒和诊断方法
本发明的一个实施方案涉及用于检测样品中存在的HIV-1的试剂盒。这些试剂盒可包含本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分和各种试剂，例如，有助于检测抗HIV-1抗体与HIV上存在的表位(例如gp120和/或gp140，或其抗原性片段)之间结合的试剂。
试剂盒可以是体外测定，例如免疫测定、例如酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT(酶联免疫斑点)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光和本领域已知的其他测定，包括但不限于蛋白质印迹分析和/或免疫沉淀方法。体外测定可以是竞争性的，或间接的，例如在夹心测定中，或可以是抗体捕获方法。例如，在直接ELISA中，将抗原的缓冲溶液(例如，含有HIV-1或其抗原性片段的样品或含有或疑似含有HIV-1的生物样品)加入到微量滴定板的孔中，例如，96孔板。然后将非反应蛋白质的溶液，例如，牛血清白蛋白或酪蛋白加入到孔中。加入与报告分子酶缀合的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分，例如，与辣根过氧化物酶缀合，尽管其不是必须的酶，因为还可以缀合其他常见的酶包括碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶，尽管其他酶是可想到的并且被认为是本发明的实施方案。然后加入酶的底物，这导致可检测的信号。例如，将TMB加到辣根过氧化物酶中导致有色产物产生，在这种情况下，ELISA是比色测定。ELISA可以以定性或定量的形式进行。定性结果为样本提供了简单的阳性或阴性结果(是或否)。阳性和阴性之间的截断值由分析者确定，并且可能是统计学上的。夹心ELISA通常遵循以下方案。将捕获抗HIV-1抗体或其抗原结合部分与基板结合(即“固定”在基板上)，例如微量滴定板。然后将含有抗原的样品(即含有HIV-1或其抗原性片段的样品)加入到基板中，在此点它被抗HIV-1抗体所捕获。然后洗涤基板以除去未结合的抗原。加入第二抗HIV-1抗体或其抗原结合部分，其结合HIV-1上的不同的表位，例如gp120上的不同表位，或结合不同抗原上的不同的表位，例如gp140。第二抗HIV-1抗体或其抗原结合部分与报告分子结合，例如酶，尽管报告分子可以是任何导致可检测信号的分子。可以第二次洗涤板，并且在报告分子是酶的情况下，可以加入底物，例如TMB，这可产生可检测的信号(也是比色测定)。常见的ELISA的第三种类型是竞争性ELISA。在这些实施方案中，未标记的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分在含有抗原的样品的存在下孵育，然后将其加入到抗原包被的孔中。洗涤板以除去未结合的抗体。第二抗体对一抗具有特异性，例如对抗HIV-1抗体具有特异性的第二抗体。如本文所述，第二抗体与报告分子结合，例如酶(或可导致可检测信号的任何其他分子)。一些竞争性ELISA使用标记的抗原而不是标记的抗体；样品中的抗原越少，保留的标记的抗原就越多，产生的可检测信号越强。
其他形式的常见体外测定包括放射免疫测定(RIA)。通常，将已知量的抗原与放射性示踪剂连接，例如I-125，尽管其他的也适合使用，例如99Tc，然后将其与已知量的抗原特异性抗体混合，例如抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。然后，加入含有未知量抗原的样品(例如加入含有或疑似含有HIV-1或其抗原性片段的生物样品)。这是特异性结合的直接竞争；随着未标记的抗原浓度的增加，抗HIV-1抗体与标记的标准品之间的结合降低，这可通过测量放射性直接测量。其他测定是已知的，并且本领域普通技术人员将容易地知晓它们的适用性。
在一些实施方案中，本发明涉及检测样品中HIV-1或其抗原性片段的方法。此类方法可以利用本文所述的任何测定或本领域已知的其他测定。本文描述的几种测定够定量样品中存在的抗原的量，因此，在一些实施方案中，本发明涉及定量样品(例如生物样本)中存在的HIV-1或其抗原性片段的量的方法。含有本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的测定可以用于或不用于诊断目的。因此，在一些实施方案中，本发明涉及本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的诊断用途的方法。由于本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的特异性，含有本发明的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的免疫测定可足以将个体诊断为具有活跃或潜伏的HIV-1感染。抗体或其抗原结合部分不必限于任何特定的表位，只要所用的抗体或其抗原结合部分对HIV-1具有特异性即可。例如，在夹心测定中，第一抗HIV-1抗体或其抗原结合部分可结合第一表位，例如gp120上，第二抗HIV-1抗体或其抗原结合部分(与报告分子结合)可与第二表位结合，其可以存在或不存在于同一抗原上。因此，用于检测或定量HIV-1或其抗原性片段的量的试剂盒和方法可含有BG18、NC37和BG1，包括其抗原结合部分，并且认为在本发明的范围内。或者，BG18、NC37和BG1中的任何一个(包括其抗原结合部分)和任何其他抗HIV-1抗体，只要它们适合并入这样的试剂盒/方法中即可。可以理解，用于检测和/或定量样品中存在的HIV-1或甚至用于诊断目的的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分不一定需要能够广谱中和HIV-1以具有此目的的效用。
E.等同物
在提供范围的值的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的任何中间值至下限单位的十分之一，以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在本发明内。可以独立地包括在较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包括在本发明内，受所述范围中任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中两个中的一个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用其整体并入本文。
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
术语“约”是指本领域普通技术人员不认为与基线值显著不同的一系列值。例如，术语“约”可以指在所述值的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％范围内的值，以及介于所述值之间的值。
本文公开的出版物仅仅是为了它们在本发明的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。
本文中引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利中引用的每个文件或参考文献、专利或非专利文献(包括在每个授权专利的诉讼期间；“申请引用文件”)以及与这些申请和专利中的任何一个相对应和/或要求的优先权的每个PCT和外国申请或专利，以及每一个引用的文献或在每个申请引用的文献中引用的参考文献，在此通过引用其整体明确地并入本文。更一般地，在本文中引用了文献或参考文献，不论是在权利要求之前的参考列表中或者在正文当中；并且，这些文献或参考文献中的每一个(“本文引用的参考文献”)，以及在每个本文引用的参考文献中引用的每个文献或参考文献(包括任何制造商的说明书、说明等)在此明确地并入本文。
以下非限制性实施例用于进一步说明本发明。
VII.项
1.分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含至少一个互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:2-4、6-8、10-12、14-16、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、38-40、42-44、46-48、50-52、54-56、58-60、62-64、66-68、70-72、74-76、78-80、82-84、86-88、90-92和94-96。
2.根据项1所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含含有CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的重链可变区，其中CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3包含选自由以下组成的组的CDRH组的各序列：SEQ ID NO:2-4、SEQ ID NO:10-12、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:26-28、SEQ ID NO:34-36、SEQ ID NO:42-44、SEQ ID NO:50-52、SEQ ID NO:58-60、SEQ ID NO:66-68、SEQ ID NO:74-76、SEQ ID NO:82-84和SEQ ID NO:90-92。
3.根据项1或2所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含含有CDRL1、CDRL 2和CDRL 3的轻链可变区，其中CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含选自由以下组成的组的CDRL组的各序列：SEQ ID NO:6-8、SEQ ID NO:14-16、SEQ ID NO:22-24、SEQ ID NO:30-32、SEQ ID NO:38-40、SEQ ID NO:46-48、SEQ ID NO:54-56、SEQ ID NO:62-64、SEQ ID NO:70-72、SEQ ID NO:78-80、SEQ ID NO:86-88和SEQ ID NO:94-96。
4.根据项3所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含选自由以下组成的组的CDR组的各序列：SEQ ID NO:2-4和6-8；SEQ ID NO:10-12和14-16；SEQ ID NO:18-20和22-24；SEQ ID NO:26-28和30-32和SEQ ID NO:34-36和38-40；SEQ ID NO:42-44和46-48；SEQ ID NO:50-52和54-56；SEQ IDNO:58-60和62-64；SEQ ID NO:66-68和70-72；SEQ ID NO:74-76和78-80；SEQ ID NO:82-84和86-88和SEQ ID NO:90-92和94-96。
5.根据项1至4任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含以下一者或两者：(i)重链，其包含选自由SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89组成的组的重链序列和(ii)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:5、l3、21、29、37、45、53、61、69、77、85和93组成的组的轻链序列。
6.根据项5所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中所述重链和轻链包含以下各序列：SEQ ID NO:1和5；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:17和21；SEQ ID NO:25和29；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:65和69；SEQ ID NO:73和77；SEQ ID NO:81和85和SEQ ID NO:89和93。
7.根据项1至6任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
8.根据项1至7任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中抗体抗原或其结合部分是重组产生的。
9.分离的核酸，其包括编码项1至7任何一项所述的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的CDR、重链可变区或轻链可变区的序列。
10.载体，其包含项9所述的核酸。
11.培养的细胞，其包含项10所述的载体。
12.药物组合物，其包含(i)项1-8任何一项所述的第一抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，和(ii)药学上可接受的载体。
13.根据项12所述的药物组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含含有CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的重链可变区，其中CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3包含SEQ ID NO:10-12的各序列。
14.根据项12至13任何一项所述的药物组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含含有CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的轻链可变区，其中CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含SEQ ID NO:14-16的各序列。
15.根据项14所述的药物组合物，其中CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含SEQ ID NO:10-12和14-16的各序列。
16.根据项15所述的药物组合物，其中重链和轻链包含SEQ ID NO:9和13的各序列。
17.根据项16所述的药物组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含BG18。
18.根据项12所述的药物组合物，进一步包含第二抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。
19.根据根据项18所述的药物组合物，其中第二抗HIV-1抗体选自由NC37、NC133、NC102、AC40、AC41和AC72组成的组。
20.治疗HIV-1感染的方法，其包括：鉴定有此需要的受试者，并且对所述受试者施用第一治疗试剂，其包含治疗有效量的项1-8任何一项所述的第一抗HIV-1抗体或其抗原结合部分或项12-19任一项所述的药物组合物。
21.根据项20所述的方法，进一步包括施用第二治疗试剂。
22.根据项21所述的方法，其中第二治疗试剂选自由以下组成的组：非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、进入或融合抑制剂、整合酶抑制剂和第二抗HIV-1抗体或其抗原结合部分。
23.根据项22所述的方法，其中第二抗HIV-1抗体选自由NC37、NC133、NC102、AC40、AC41和AC72组成的组。
24.疫苗组合物，其包含项1至8任何一项所述的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分。
25.根据项24所述的疫苗组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含含有CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的重链可变区，其中CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3包含SEQ ID NO:10-12的各序列。
26.根据项24-25任何一项所述的疫苗组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含含有CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的轻链可变区，其中CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含SEQ ID NO:14-16的各序列。
27.根据项16所述的药物组合物，其中CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含SEQ ID NO:10-12和14-16的各序列。
28.根据项17所述的药物组合物，其中重链和轻链包含SEQ ID NO:9和13的各序列。
29.根据项28所述的药物组合物，其中第一抗HIV-1抗体包含BG18或BG1。
30.在有此需要的受试者中防止HIV-1感染的方法，其包括将项24-29任何一项所述的疫苗组合物施用于所述受试者。
VIII.实施例
1.有效的HIV-1广谱中和抗体和抗体敏感病毒共存于病毒血症控制物(viremiccontroller)
A.方法
HIV-1感染的受试者EB354
在394名HIV-1感染的长期非进展者的群组中，来自供体EB354的纯化IgG的中和广度和效力排名前1％。供体EB354于1986年被诊断为HIV-1分支B。他在1995年至1998年间接受了去羟肌苷和司他夫定的治疗，但从那以后就没有接受过抗逆转录病毒治疗。自2002年以来，他经常被临床随访(表3:HLA A*01:01,24:02,B*27:05,57:01,C*01:02,06:02)。大多数个体在感染后不久会迅速产生株特异性抗体。该反应与在一些情况下引发bNAb的抗性病毒变体的选择相关。然而，详细研究的个体与EB354的不同之处在于，bNAb的形成与对共存的bNAb具有抗性的自体血浆病毒的快速选择有关。EB354是显著的，因为敏感和抗性病毒菌株与bNAb共存，并且抗性菌株没有产生高水平的病毒血症，要么是因为它们在某种程度上部分有效，要么是被CD8+T细胞一直关注。因此，bNAb敏感血浆病毒不能逃脱该个体的免疫压力，导致bNAb:病毒平衡，病毒持续存在但不能产生高水平的病毒血症。EB354在精英控制者(elite controller)和精英中和者(elite neutralizer)方面都不同寻常。HIV-1精英控制者是多年来维持低病毒载量的感染个体。这些个体不太可能传播病毒，他们维持长期的无艾滋病生存。在85％的HIV-1精英控制者中发现HLA等位基因B57*01和/或B27*05。这些等位基因与增强的CD8T细胞细胞毒性活性有关。与病毒血症进展者(即具有高病毒载量的患者)相比，精英控制者不太可能形成bNAb。不考虑具有部分受控感染的强大的CD8+T细胞应答，EB354中有足够的HIV-1复制以支持bNAb形成和亲和力成熟。如本文所讨论，导致供体EB354中的血清学中和活性的bNAb识别几个非重叠表位。
表3.供体EB354的临床信息
B细胞分选和抗体分离
如J.F.Scheid等人.,A method for identification of HIV gp 140bindingmemory B cells in human blood.Journal of immunological methods 343,65-67(2009)所述，进行来自供体EB354 PBMC的诱饵+CD19+IgG+B细胞的单细胞分选。记忆B细胞用抗CD19磁珠(MACS)预富集并用四种不同的诱饵染色：gp120 2CC核心蛋白作为诱饵、gp140YU2、gp14092UG37.8(分支A)+gp140CZA79012(分支C)的1：1混合物和BG505 SOSIP.664。使用救援引物(rescue prime)扩增重链和Igλ基因两者，并将常规引物用于IgK链。对所有PCR产物进行测序并分析Ig基因使用、CDR3和VH/VL体细胞高突变(IgBLAST和IMGT)的数量。如先前在T.Tiller等人.,Efficient generation of monoclonal antibodies from singlehuman B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.Journal ofimmunological methods 329,112-124(2008)中所述，将纯化的经消化PCR产物克隆到人Igγ1-、Igκ或Igλ-表达载体中，并且如F.Klein等人.,Enhanced HIV-l immunotherapy bycommonly arising antibodies that target virus escape variants.The Journal ofexperimental medicine 211,2361-2372(2014)所述，通过将IgH、IgK和IgL表达质粒瞬时转染到指数生长的HEK 293-6E细胞中来使其产生。
中和研究
使用基于荧光素酶的TZM.b1细胞测定来评估HIV-1中和。简言之，将包膜假病毒与单个抗体的5倍连续稀释液一起孵育，并应用于携带荧光素酶报告基因的TZM.b1细胞。48小时后，裂解细胞并测量发光。IC50和IC80分别反映引起相对发光单位(RLU)减少50％和80％的单个抗体浓度。使用抗体数据库计算工具构建覆盖曲线。
结晶、X射线数据收集和结构测定
与野生型BG18 Fab的晶体相比，其中的重链第26位的潜在N-连接糖基化位点通过将Asn26HC突变为Gln而去除的BG18Fab的晶体显示出优越的大小和形态，因此使用BG18N26QFab进行结构测定。通过将0.2μL的18mg/mL蛋白质溶液与0.2mL的0.1M乙酸钠(pH 4.5)、26.8％(v/v)聚乙二醇(PEG)400和13.4％(w/v)PEG 8,000在20℃下组合获得BG18N26Q Fab的晶体(空间群P21；每个不对称单位1个分子)，在补充有20％(v/v)乙二醇的母液中冷冻保护，并在液氮中快速冷却。利用0.1M乙酸钠三水合物(pH 4.6)和2.0M硫酸铵的贮库，使用蛋白质:贮库比率为1.5:1的250nL滴，通过在座滴中蒸气扩散产生NC102 Fab的晶体(空间群P212121；/>每个不对称单位1个分子)。将晶体在补充有25％(v/v)乙二醇的母液中冷冻保护，并在液氮中快速冷却。通过以1.5：1的蛋白质：贮库比率孵育蛋白质和储库(包含0.1MHEPES pH 7.5和20％(w/v)PEG 10,000)，利用在250nL座滴中蒸发扩散来生产NC37-93TH057复合物的晶体(空间群P212121；/> 每个不对称单位1个复合物)。将晶体在补充有20％(w/v)PEG 400的母液中冷冻保护，并在液氮中快速冷却。
在配备Pilatus 6M像素探测器(Dectris)的斯坦福同步辐射(StanfordSynchrotron Radiation)光源光束线12-2上收集X射线衍射数据。XDS用于索引、整合和量度数据。BG18N26Q Fab的晶体衍射至并且使用10-1074Fab(PDB代码4FQ2)VHVL(其中去除CDR环)和CH1CL作为检索模型，通过分子置换来解析结构。使用Phenix和Coot中手动模建，通过精修迭代法来精修结构。BG18N26Q Fab的最终模型(R工作＝18.0％，R自由＝18.9％)在Ramachandran图的有利区域、允许区域和非允许区域中分别具有98.3％、1.7％和0％的残基。NC102 Fab衍射至/>并且使用NIH45-46(PDB代码3U7W)的模型(其中去除CDR环的VHVL和CH1CL作为检索模型)，通过分子置换来解析结构。NC102 Fab的最终模型(R工作＝18.0％，R自由＝20.0％)在Ramachandran图的有利区域、允许区域和非允许区域中分别具有98％、2％和0％的残基。使用检索模型NC102 VHVL、CH1CL和截短的gp120核心(来自PDB3U7Y)，通过分子置换解析NC37-93TH057 gp120复合物结构。NC37-93TH057复合物(R工作＝21.0％，R自由＝26.0％)的最终模型在Ramachandran图的有利区域、允许区域和非允许区域中分别具有96％、4％和0％的残基。表4列出了数据收集和细化统计数据。
表4.数据收集和精修统计信息。最高分辨率shell的统计信息显示在括号中。
BG505 SOSIP.664-BG18-179NC75复合物的结构通过平均至约分辨率的冷冻电子断层扫描/亚层断层扫描来解析，并用作参考结构以解析来自负染色样品中单粒子EM结构。在TBS中将纯化的BG505SOSIP.664-BG18-179NC75复合物稀释至10μg/mL，然后立即加入3μL至多孔碳支撑膜(400目，Cu网格(Ted Pella，Inc.))上的辉光放电超薄C膜(glow-discharged ultrathin C film)。使用戊二醛蒸气使网格上的样品交联，然后用3％乙酸铀酰染色。使用在120keV下操作的配备有Gatan Ultrascan 2k X2k CCD的FEI Tecnai T12透射电子显微镜收集数据。使用0.5秒曝光时间、42,000x的标称放大率、1μm散焦获得图像，/像素。在EMAN2.1中使用群体拣选挑选总共25,639个颗粒，并且使用EMAN2.1进行CTF校正。使用RELION进行初始无参考2D类平均化，并将所有粒子分为250个类。选择对应良好分类平均值的9,827个颗粒，并且在RELION中使用3D分类进一步分类颗粒，之后选择7,925个颗粒用于精修。为了获得3D分类和精修的参考结构，通过冷冻电子断层扫描从独立的BG505SOSIP.664-BG18-179NC75复合物样品中收集数据，并且使用Scharf，L.,等人.,Broadly Neutralizing Antibody 8ANC195 Recognizes Closed and Open States ofHIV-1Env.Cell,2015.162(6):p.l379-90中描述的方法获得/>亚断层扫描平均结构。将亚断层扫描平均结构低通滤波至/>用作单粒子重建的参考结构。使用RELION和具有0.143截断值的金标准FSC计算的最终单粒子重建的分辨率为约/>推荐用于单粒子EM重建的分辨率估计。
EM密度图的拟合
使用USCF Chimera使EM结构可视化。使用UCSF Chimera内的图内拟合应用，将晶体结构的坐标拟合到亚断层扫描平均化的或负染色单粒子EM结构中，选项有以下：实时相关性/平均更新、从原子模拟的使用图、分辨率首先将BG505SOSIP.664结构(PDB4TVP)拟合至密度中，然后使BG18 Fab和CH103 Fab(PDB 4JAM；作为179NC75 Fab的模型)坐标分别单独拟合至相应的密度。Fab的CH1-CL结构域区域表现出差的密度。
用于结构测定研究的蛋白质生产和纯化
通过在HEK293-6E细胞中瞬时转染来表达6x-His-标记的BG18、BG18N26Q、NC102和NC37 Fab，并使用Ni2+-NTA亲和层析(GE Healthcare)和Superdex 200 16/60尺寸排阻层析(SEC)(GE Healthcare)从转染的细胞上清液中进行纯化。在杆状病毒感染的昆虫细胞中产生截短的、His标记的93TH057 gp120核心蛋白质，并如(Diskin等人.Science 2011；Diskin等人.NSMB 2010)所述使用Ni2+亲和层析(GE Healthcare)进行纯化。在结晶试验之前，将纯化的NC37和93TH057蛋白质共培养(Fab与gp120核心的摩尔比为2：1)，并在25℃下用每毫克gp120蛋白质5kU的内切糖苷酶H处理3小时。使用Superdex 200 10/300GL柱(GEHealthcare)通过尺寸排阻色谱层析纯化内切糖苷酶H处理的复合物。
如Sanders,R.W.,等人.,A next-generation cleaved,soluble HIV-1Envtrimer,BG505 SOSIP.664gp 140,expresses multiple epitopes for broadlyneutralizing but not non-neutralizing antibodies.PLoS Pathog,2013.9(9):p.e1003618中所述，构建用于EM研究的可溶性BG505 SOSIP.664三聚体。将将用5μMKifunensine(Sigma)处理的HEK293-6E细胞用编码BG505SOSIP.664的质粒和可溶性弗林蛋白酶以4:1的比例共转染。使用2G12免疫亲和柱从细胞上清液中获得BG505 SOSIP.664蛋白质，所述2G12免疫亲和柱通过将2G12 IgG单体共价偶联至NHS活化的Sepharose柱(GEHealthcare)而制得。用3M MgCl2洗脱蛋白质，然后立即将缓冲液交换为pH 7.4的Tris缓冲盐水(TBS)(50mM NaCl)。使用Mono Q 5/50GL(GE Healthcare)，然后使用Superose 6 10/300SEC(GE Healthcare)进一步纯化三聚体。
自体病毒
根据制造商的说明，使用Qiagen MinElute Virus Spin Kit从患者血浆中提取HIV-1env基因HIV-1-RNA，对其进行单基因组测序(SGS)。使用SuperScript III逆转录酶和HIV-l特异性引物envB3out对提取的RNA进行Env特异性cDNA合成：
envB5out：5'-TAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG-3'(SEQ ID NO:97)
envB3out：5'-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3'(SEQ ID NO:98)
envB5in：5'-TT AGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3'(SEQ ID NO:99)
envB3in：5'-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3'(SEQ ID NO:100)
第一轮PCR在含有1x高保真缓冲液、2mM MgSO4、0.2mM dNTP和0.5单位高保真度铂Taq并且使用envB5out和envB3out每个引物各0.2μM的20μL体积中进行。使用1μL的PCR1和0.2μM的envB5in和envB3in引物进行第二轮PCR。除了45个循环和退火温度升高为58℃，PCR条件与PCR-1的条件相同。使用1％96孔E-Gels(Invitrogen)检查PCR-2产物。将扩增效率低于30％的PCR的条带进行文库制备，并使用Illumina Nextera DNA样品制备试剂盒(Illumina)进行测序。根据J.L.Kirchherr等人.,High throughput functional analysisof HIV-l env genes without cloning.J Virol Methods 143,104-111(2007)所述的方案，产生CMV-Env表达盒。在6孔板中将500ng CMV-env与pSG3△env共转染到293T细胞中，并且在48小时后收集上清液。在表达之前对所有质粒进行序列验证。通过TZM-bl测定对上清液进行中和测试。
Env乙二醇突变病毒的TZM-bl测定
如Li,M.,等人.,Human immunodeficiency virus type 1env clones fromacute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies.J Virol,2005.79(16):p.10108-25中所述，通过用表达HIV-1Env的质粒和称为pSG3△Env的Env缺陷基因组骨架质粒转染293T细胞(ATCC)，产生假病毒。转染后72小时获得假病毒用于中和测定。如Li等人如上所述，使用单轮复制假病毒测定法和TZM-B1靶细胞评估中和活性。简而言之，将TZM-bl细胞接种于96孔平底板中。将在37℃下与抗体连续稀释液预孵育1小时的假病毒加入该平板中。在裂解并添加Bright-GloTM荧光素酶底物(Promega)后，对感染后72小时的荧光素酶报告基因表达进行定量。为了确定IC50值，通过非线性回归拟合剂量-反应曲线。
HIV-1V3糖肽的合成
根据Amin,M.N.,等人.,Synthetic glycopeptides reveal the glycanspecificity of HIV-neutralizing antibodies.Nat Cherm Biol,2013.9(8):p.521-6中所示的过程，通过使用由GlcNAc-肽前体的自动固相肽合成和随后的GlcNAc-肽的酶促转糖基化组成的化学酶法，实现源自几种HIV-1菌株的V3糖肽的合成，以提供靶糖肽。在25℃下使用BIAcore T200系统(GE Healthcare)通过SPR，评估生物素化的合成糖肽与BG18和BG8IgG抗体之间的相互作用。在HBS-P缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、P20表面活性剂0.05％v/v、pH7.4)中将生物素化的糖肽固定在中性抗生物素蛋白包被的CM5传感器芯片上，直至响应单位(RU)达到200。以4μM在BS-P缓冲液中的开始浓度将BG18(或BG8)以2倍系列稀释液注射，流速为40μL/min，注射180秒。然后以流速40μL/min注射BS-P缓冲液1210s，以允许解离。通过以流速50μL/min注射3M MgCl2 3分钟，然后以流速50μL/min注射HBS-P缓冲液5分钟，进行再生。
体内小鼠模型
通过每种抗体1mg皮下(s.c.)注射，每周两次，持续3周总共六次抗体注射，处理人源化NOD Rag1-/-Il2rgnull(NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(杰克逊实验室)。用来自相同供体的人细胞重建对照hu-小鼠并用HIV-1YU2感染但不用抗体处理。每周测量血浆病毒载量。如F.Klein等人.,HIV therapy by a combination of broadly neutralizingantibodies in humanized mice.Nature 492,118-122(2012)中所述，获得来自具有反弹病毒小鼠的gp120序列。
ELISA
将高结合96孔ELISA板(Costar)用在PBS中的5μg/mL纯化的2CC核心、gp120.YU2(野生型或突变体)或gp140.YU2折叠三聚体包被过夜。用PBS+0.05％ Tween 20洗涤6次后，用2％BSA、1μM EDTA和0.05％Tween-PBS(“封闭缓冲液”)封闭平板2小时，然后利用作为在PBS中从初始浓度4μg/mL的7个连续1：4稀释液添加的IgG孵育1小时。再次洗涤后，通过与山羊HRP缀合的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)(在封闭缓冲液中，0.8μg/mL)一起孵育1小时，接着用辣根过氧化物酶(HRP)显色底物(ABTS溶液；Invitrogen)，使平板显色。对于竞争性ELISA，用0.5μg/mL BG505.SOSIP.664包被板，洗涤，用封闭缓冲液封闭2小时，然后与IgG孵育1小时(作为在PBS中从初始浓度32μg/mL的7个连续1：4稀释液添加的IgG)，并且在浓度恒定为4μg/mL的生物素化抗体存在下。然后使用HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(Jackson ImmunoReseach)(在封闭缓冲液中，1μg/mL)，使平板显色。
对于使用带有D7324表位标签(BG505 SOSIP.664-D7324)的BG505 SOSIP.664三聚体的ELISA来说，如Sanders,R.W.,等人.,A next-generation cleaved,soluble HIV-1Envtrimer,BG505 SOSIP.664gp140,expresses multiple epitopes for broadlyneutralizing but not nonneutralizing antibodies.PLoS Pathog,2013.9(9):p.e1003618中所述，将板用5μg/mL D7324抗体包被过夜，然后洗涤并与500ng/mL三聚体一起孵育。进一步洗涤后，将IgG作为在PBS中从初始浓度4μg/mL的7个连续1：4稀释液，添加持续1小时。如上所述，通过与HRP缀合的山羊抗人IgG抗体一起孵育产生终点。所有实验至少进行3次。
CMV-Env病毒产生
根据建立的方案(52)产生CMV-env表达盒。简而言之，使用以下引物从pcDNA3.1D/V5-His-TOPO扩增CMV启动子：
CMVenv：5'-AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCAT-3'(SEQ ID NO:101)和
CMVenv1A5'-CATAGGAGATGCCTAAGCCGGTGGAGCTCTGCTTATAT AGACCTC-3'(SEQ IDNO:102)。
使用Macherey-Nagel PCR和凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。使用以下引物扩增1ul第一轮PCR产物：
envl ATOPO5'-CACCGGCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAA-3'(SEQ ID NO:103)和
Rev19 5'-ACTTTTTGACCACTTGCCACCCAT-3'(SEQ ID NO:104)，在含有1x高保真缓冲液、2mM MgSO4、0.2mM dNTP、0.5单位高保真铂Taq和0.2μM各引物的20μl体积中进行。循环条件为94℃，2分钟；(94℃，15秒；55℃，30秒；68℃，4分钟)×35；68℃，10分钟。通过在0.7％琼脂糖凝胶上分析验证了env的存在，并使用Macherey-Nagel凝胶和PCR纯化试剂盒纯化产物。然后以CMVenv和Rev 19作为引物对10ng包膜和0.5ng CMV进行重叠PCR，一式三份。总反应体积6为50μL，包含1x高保真缓冲液、0.2μM MgSO4、0.2mM dNTP，1单位高保真铂Taq和0.4μM各引物。PCR在94℃，2分钟；(94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，4分钟)×25；68℃，10分钟下进行。在6孔板中将500ng CMV-env与pSG3△env共转染到293T细胞中，48小时后收集上清液。如上所述，通过TZM-bl对上清液进行中和测试。
培养病毒(VOA)
如van't Wout等人.,Isolation and propagation of HIV-l on peripheralblood mononuclear cells.Nat Protoc,2008.3(3):p.363-70中所述，通过将患者外周血单核细胞(PBMC)与健康供体PBMC共培养，获得来自供体EB354的病毒。根据洛克菲勒大学的研究方案MNU-0628，通过白细胞分离术从患者获得健康供体PBMC。健康供体PBMC在37℃和5％CO2下，在含有10％ FBS、1％青霉素-链霉素和1μg/mL PHA的IMDM中以5×106个细胞/毫升的密度预刺激2-3天。然后将6×106个经刺激的供体PBMC转移到含有10％ FBS、1％青霉素-链霉素、10IU/mL IL-2和5μg/mL聚凝胺的IMDM中，并在37℃和5％CO2下与5-10×106个EB354 PBMC共培养。每周更换培养基，并通过Lenti-X p24 Rapid Titer Kit(Clontech)定量培养上清液中存在的p24。将每mL上清液的p24超过1ng的培养物冷冻并在-80℃下储存。根据上述方案，使用TZM-bl中和测定，进行组织培养感染剂量50(TCID50)的确定和随后的自体病毒对不同广谱中和抗体和自体血清IgG的敏感性测试。所有中和测定一式两份进行。
HIV-1YU2包膜突变体
根据制造商的说明书(Agilent Technologies)，使用QuikChange(多)定点诱变试剂盒，将单突变、双突变和三突变引入野生型HIV-1YU2包膜中。
病毒进化分析
使用ClustalW(版本2.11)生成env核苷酸序列的比对，或使用Geneious(版本8.1.6)序列分析软件通过手动比对。去除了无法明确比对的区域，用于系统发育分析和多样性计算。使用jModelTest选择用于最大似然系统发育分析的进化模型类型。使用PhyML(版本3)，利用模型参数值和系统发育的联合估计，生成最大似然系统发生树。在DIVEIN站点工具中使用双样本U统计检验，比较样本之间的成对遗传多样性。
MiSeq env序列的生物信息学处理
使用Cutadapt v1.8.3除去序列衔接子。在三个步骤中进行每个病毒的读段组装。首先，使用Spades v3.6.1进行从头组装以产生长的重叠群文件。随后将长度大于255bp的重叠群与HIV包膜参考序列比对，并使用Geneious 8产生共有序列。最后，将读段与共有序列重新比对以消除间隙并产生最终共有序列。从下游分析中省略具有双峰的序列(任何残基的截断共有序列同一性<75％)。
统计分析
通过Mann-Whitney检验分析统计学差异。GraphPad Prism软件用于分析，数据在*p≤0.05、**p≤0.01和***p≤0.001时被认为是显著的。
B结果
多个bNAb
在394名感染HIV-1的长期非进展者的组群中，来自供体EB354的纯化的IgG中和宽度和效力排名前1％。这名捐赠者于1986年被诊断出患有HIV-1分支B。EB354在1995年至1998年期间接受了去羟肌苷和司他夫定的治疗，但从那时起就没有接受抗逆转录病毒治疗。在2002年，EB354的病毒载量<400拷贝/mL，CD4和CD8计数分别为954和1046细胞/mm3。EB354在2002年至2006年间具有三个记录的病毒血症峰值(图1A)。在2006年，当病毒载量<400拷贝/ml时，首先评估血清中和效力和宽度(图1A和1B和表3)。中和活性增加至2010年，并且从那时起一直保持广谱和有效(图1B)。HLA分型显示HLA A*01：01，24：02、B*27：05，57：01、C*01：02，06：02(表3)。
为了分离导致该受试者血清学活性的抗体，使用四种不同的HIV-1诱饵对单细胞进行分选；2CC核心、gp140YU2、gp14092UG37.8(进分支A)+gp140CZA79012(分支C)的1：1混合物和BG505 SOSIP.664(图1C)。共分离出241对重链和轻链，其中152个抗体形成22个不同的克隆。来自3个克隆的抗体显示出tier 2中和活性(图1C和表13)。当与2010-2015年的血清IgG相比时，如抗体BG18所示例(图1C)，属于所述克隆的抗体概括了大部分血清学活性(图1D)。如抗体NC37和抗体BG1所示例(图1C)，属于其他2个中和克隆的抗体效力较低，但补充了BG18的活性(图1D)。
为了在3个中和克隆中绘制抗体的结合位点，使用携带Env中表位特异性点突变的HIV-1YU2变体进行TZM-bl测定。尽管多克隆IgG对突变体的敏感性没有显示出可测量的变化，但抗体BG18对YU2N332K(聚糖-V3)、抗体BG1对YU2N160K(V1V2)和抗体NC37对YU2N280Y(CD4b)敏感(图1D)。与中和结果一致，通过ELISABG18的结合受到了PGT121和10-1074竞争性抑制；PGT145降低了BG1结合(图5)。
在118个病毒的组中，BG18中和了64％的病毒(图1E、表5)，几何平均IC50为0.03μg/ml，并且与PGT121或10-1074在宽度上相当且比其更有效(图1F、表5至10)。抗体NC37和BG1显示几何平均IC50分别为0.3μg/mL和0.67μg/mL，以及33％和37％宽度(图1E和1F、表6和7)。在118个病毒的组中，三种bNAb的1：1：1混合物中和了81％的病毒，几何平均IC50为0.130μg/mL，这显示了加成效应(图1E、表11)。
表5.BG18的TZM-bl测定中的IC50和IC80的值。
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表6.NC37的TZM-bl测定中的IC50和IC80的值。
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表7.BG1 TZM-bl测定中的IC50和IC80的值。
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表8.BG8的TZM-bl测定中的IC50和IC80的值。
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表9. 10-1074的TZM-bl测定中IC50和IC80的值
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表10.PGT121的TZM-bl测定中的IC50和IC80的值
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表11.针对118个病毒的组，NC37、BG1和BG18的1:1:1组合在TZM-bl测定中的IC50和IC80的值。
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/>
/>
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BG18
在氨基酸水平上，BG18分别与均来自VH4-59种系前体的10-1074和PGT121的重链具有63％和62％的同一性。BG18来自密切相关的(90.8％同一性)种系基因VH4-4(图6A)。PGT121、10-1074和BG18及其克隆变体的重链的互补决定区(CDR)比对显示了CDRH1和CDRH2之间的高度相似性。BG18的CDRH3比PGT121/10-1074短三个残基(21个残基vs.24个残基；图2A和图6B)。另外，BG18在与PGT121家族共有的框架区中具有7个突变中的6个(图2A)，但不同于PGT121/10-1074的成员，不含任何插入或缺失。
BG18使用VL基因节段VL2-25，并且在氨基酸序列水平上分别与PGT121和10-1074所使用的VL3-21基因节段仅46％和50％同一性相关(图2B、图6C和图6D)。此外，与10-1074和PGT121相比，BG18及其变体的轻链有稍微多一些突变，但对于重链而言，则不含任何插入或缺失。因此，BG18及其克隆变体显示出与先前分离的PGT121/10-1074类抗体相似的重链，但具有不同的轻链。
BG18 Fab的分辨率晶体结构显示，除CDRH3外CDR环形成了紧密的结合位点，CDRH3超出其他CDR突出约/>呈现主要由疏水残基组成的尖端(图2C)。CDRH3不是完全延伸，而是自身折回来形成由CDRH3残基Gly100aHC、Val100bHC、Val100CHC、Gly100eHC和Glu100fHC之间的氢键稳定的构象(图2C)。CDRL2的结构是无序的，表明它可以在未结合的抗体中采取多种构象。未结合的BG18、PGT121(PDB 4FQ1)和10-1074Fab(PDB 4FQ2)结构的叠加显示，它们的VH结构域除CDRH3外都紧密排列，其中CDRH3在BG18中位于VH结构域上方，但在PGT121和10-1074Fab结构中明显靠向VL(图2D)。与BG18和PGT121轻链相关的低序列同一性一致(图2B、图6C和图6D)，对齐的VL结构域(分别与BG18-PGT121和BG18-10-1074叠加的轻链比较，发现对于叠加93或92Cα原子具有/>的均方根偏差)显示了所有CDRL环的取向差异(图2D)。尽管存在这些差异，但在BG18中也观察到了在PGT121和10-1074中的CDRH2和CDRH3之间的断裂(图2E)。衬在该断裂上的残基与糖基化PGT121 Fab结构中的复合型N-聚糖相互作用，并与连接至PGT122-BG505SOSIP复合物结构(PDB 4TVP)中Asn137gp120的N-聚糖相互作用。BG18在CDRH3和CDRL1/CDRL3之间显示第二个断裂，由于CDRH3定位于PGT121及其克隆亲属的轻链之上而不能在这些抗体中形成(图2E)。除了这些结构差异外，与PGT121和10-1074的表面电位相比，BG18 VH-VL结构域的静电表面电位显示出带正电的片的的不同分布(图.7)。总之，这些结果与将Env的BG18识别与PGT 121相关bNAb识别进行比较而得出的差异一致。
为了研究BG18如何识别Env，解析了与来自BG18和CD4b bNAb179NC75的Fab复合的BG505 SOSIP.664三聚体的约分辨率负染色单粒子电子显微镜(EM)结构。将来自BG18Fab晶体结构的坐标拟合到EM图中(图2F)，这允许比较BG18与其他Asn332gp120-V3 bNAb之间的接近角和潜在的Env相互作用(图2G)。与PGT122(PGT121的变体)和10-1074类似，预测BG18的CDRH3与gp120的Asp332gp120聚糖和324GDIR327基序相互作用。然而，尽管PGT122和10-1074表现出用于结合Env的类似接近角，但BG18以不同角度接触Env三聚体，该角度相对于PGT122和PGT124移位34-41°(图2G)。
评估BG18针对一组缺失特异性N-连接糖基化位点的HIV-1假病毒的中和。结果表明，除Asn332gp120外，V3环底部的聚糖均未对中和活性产生影响(表12)。与这些数据一致，BG18优选结合在Asn332gp120位含寡聚甘露糖N-聚糖的合成V3糖肽，而不结合含有在该位置或gp120内其他潜在的N-连接糖基化位点连接的复合型N-聚糖的糖肽(图9)。这些数据表明，BG18识别特性更类似于10-1074而不是PGT121。
表12.针对所选择的V3包膜突变体，BG18、BG8 PGT121和对照mAb 12A12在TZM-bl测定中的IC50和IC80值。
/>
NC37
与gp120核心结合的NC37 Fab(图1C)的分辨率晶体结构证实，NC37识别CD4b(图8A和8B)。仅基于序列，最初难以确定NC37的VH是否来自VH1-2或VH1-46种系基因，因为NC37家族的一些成员与VH1-2对齐而其他成员与VH1-46对齐(表13)。然而，结构比较显示，NC37采用了与VH1-46衍生抗体8ANC131/134相似的方向和结合角(图8A和8B)。因此，NC37使用其轻链接触环D残基Asn280gp120，而VH1-2衍生的抗体如NIH45-46使用它们的重链接触Asn280gp120。NC37的CDRH3向gp120内部结构域延伸，在CDRH3残基Tyr10OGHC和gp120内部结构域残基Lys97gp120和Glu102gp120之间形成接触。将NC37 Fab-gp120复合物叠加到SOSIP三聚体结构上表明，NC37 CDRH3与Env三聚体内的相邻原聚体接触(图8C)。
NC37于2010年分离，而BG1和BG18分离自2014年收集的PBMC。使用对BG1和BG18特异的PCR引物，检查了来自2010年和2013年的可用PBMC。在两个时间点都检测到BG1转录本，2013年首次检测到BG18。这表明BG18在2010年和2013年间出现，而BG1和NC37则更早形成。
自体中和
为了检测3种bNAb对自体病毒的作用，通过对来自2006-2015期间的五个不同时间点(2006年、2010年、2013年、2014年和2015年)进行单基因组测序(SGS)来克隆来自循环血浆病毒的个体env基因。仅回收了37个功能性框内转录本，部分原因是所有时间点的病毒载量值均低于400拷贝/mL。此外，从2015年恢复的所有序列都是非功能性的(图10)。37个功能序列形成三个簇：簇A，包含来自2006年的一个序列，其与其余的序列有约15％的差异；簇B，最大的簇，包含来自所有四个时间点的序列；簇C，包含全部来自2014年的3个序列(图3A)。与2014年出现的新序列簇一致，可以看到2013年至2014年间病毒多样性增加(图3B)。
簇C中的所有3个序列包含改变Asn332gp120处的N-连接糖基化位点的突变，而其他34个序列在Asn332gp120处具有完整的N-连接糖基化位点(图3A)。此外，簇C中的所有3个序列都具有在其他34个序列中未发现的Asp282gp120残基。位置282gp120在洛斯阿拉莫斯数据库(Los Alamos Data Base)中所有HIV-1序列的94.4％中携带Lys，并且该位置的Asp与CD4b抗体的抗性相关。
为了确定功能性Env对3种自体bNAb的敏感性，产生假病毒并用TZM-bl测定进行测试。在成功产生的35种假病毒中，只有4种对所有3种bNAb具有抗性。这些是来自簇C的Env，发现于2014年的血浆中，一个来自2013年(图3C和图10)。剩余的31种假病毒(占所有假病毒的88.5％)对3种bNAb中的至少1种敏感。此外，测试来自2006年、2010年和2014年的假病毒对来自与病毒env基因相同时间点分离的同期血清IgG的敏感性(来自2013的血浆IgG不可用于该测定)。结果表明，所测试的22种病毒中的19种仍然被同期IgG中和(图3C和图10)。
在分析的所有时间点(包括分离BG18和NC37的时间)均发现了BG18和NC37敏感病毒以及对同期IgG敏感的病毒(图3D)。相比之下，除了2006年的一种病毒外，大多数菌株对BG1具有抗性。这表明，供体EB354中的大多数自体病毒从BG1逃逸，但未能从BG18和NC37抗体逃逸(escape)，因此表明BG18和NC37的宽度和效力。
尽管不可能从来自2015年的血浆样本中获得病毒序列，但有可能从五个EB354CD4+病毒生长培养物(VOC)中的两个培养出病毒。在两种情况下，通过p24 ELISA测量，培养物需要超过五周的时间变为对病毒呈阳性。来自2015年这两种生长培养物的SGS序列与来自簇C的序列紧密聚集，并且在Asn332gp120处缺乏N-连接糖基化位点(图3A)。此外，所有序列均显示Asp282gp120。与这些发现一致，在TZM-bl测定中来自2015年的培养物上清液对所有3种bNAb具有抗性(图3E)。
BG18、NC37和BG1的体内功效
为了确定BG18或NC37是否可以在体内对HIV-1独立施加选择性压力，用HIV-1YU2感染人源化小鼠(hu-小鼠)，并治疗确定的感染。BG1显示出针对HIV-1YU2的活性差(IC50＝15.8μg/mL)，因此仅用于随后的组合治疗实验而不用于单一疗法实验。与10-1074相似，BG18或BG8(一种效力较低但仍然有效的克隆变体)的施用与病毒载量的快速下降(平均为1.5log10)相关，随后是反弹病毒血症(图4A、图11和图12)。所有反弹病毒序列都含有改变Asn332gp120处的N-连接糖基化位点的突变(图4B和4C)。使用NC37的单一疗法也短暂地抑制病毒血症，但病毒载量降低的幅度没有使用BG18的单一疗法明显，平均为0.5log10(图4A和图12)。这表明BG18和NC37对治疗HIV有效，BG18具有最明显的效果。大多数NC37-反弹病毒Env序列显示出与CD4b抗体抗性相关的R456K突变(图4B和4C)。这另外表明BG18和NC37可以在hu-小鼠体内选择HIV-1YU2抗体抗性变体。
抗体的组合可以控制hu-小鼠的HIV-1YU2感染。为了确定BG18、NC37和BG1的组合是否可以控制病毒血症，用3种bNAb(BG18、NC37和BG1)的1：1：1组合治疗5只HIV-1YU2感染的hu-小鼠。在施用3种bNAb后不久，所有动物的病毒载量降低了平均1.74Log10，并且令人惊讶的是，4/5只小鼠在3周后显示几乎检测不到的病毒载量(图4D和4E)。病毒血症仅在一只小鼠T6中反弹，并且仅在中断治疗后3周发生。其余4只小鼠甚至在治疗结束4周后也明显继续显示抑制或不可检测的病毒血症(图4D和4E)。这表明无论是单独使用还是特别组合应用，NC37、BG1以及尤其是BG18在体内有效持久抑制和中和HIV-1。
表13.中和克隆。作为来自三个克隆(蓝色、紫红色和绿色)中的每一个的代表性变体的13个抗体的遗传特征显示了中和活性。显示了VH、VL和突变水平以及CDRH3的序列(基于IMGT定义)。
前述实例和优选实施例的描述应被视为示例性的，而不是限制由权利要求限定的本发明。容易理解，在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的情况下，可以利用上述特征所阐述的许多变化和组合。这些变化不视为脱离本发明的范围，并且所有这些变化旨在包括在下列权利要求的范围内。本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。
序列
SEQ ID NO：115
NNQ
SEQ ID NO：121
NNG

Claims (10)

1.分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含至少一个互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:2-4、6-8、10-12、14-16、18-20、22-24、26-28、30-32、34-36、38-40、42-44、46-48、50-52、54-56、58-60、62-64、66-68、70-72、74-76、78-80、82-84、86-88、90-92和94-96。
2.根据权利要求1所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含含有CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的重链可变区，其中CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3包含选自由以下组成的组的CDRH组的各序列：SEQ ID NO:2-4、SEQ ID NO:10-12、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:26-28、SEQ ID NO:34-36、SEQ ID NO:42-44、SEQ ID NO:50-52、SEQ ID NO:58-60、SEQ ID NO:66-68、SEQ ID NO:74-76、SEQ ID NO:82-84和SEQ ID NO:90-92。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含含有CDRL1、CDRL 2和CDRL 3的轻链可变区，其中CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含选自由以下组成的组的CDRL组的各序列：SEQ ID NO:6-8、SEQ ID NO:14-16、SEQ ID NO:22-24、SEQ ID NO:30-32、SEQ ID NO:38-40、SEQ ID NO:46-48、SEQ ID NO:54-56、SEQ ID NO:62-64、SEQ ID NO:70-72、SEQ ID NO:78-80、SEQ ID NO:86-88和SEQ ID NO:94-96。
4.根据权利要求3所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中CDRH 1、CDRH2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3包含选自由以下组成的组的CDR组的各序列：SEQ IDNO:2-4和6-8；SEQ ID NO:10-12和14-16；SEQ ID NO:18-20和22-24；SEQ ID NO:26-28和30-32和SEQ ID NO:34-36和38-40；SEQ ID NO:42-44和46-48；SEQ ID NO:50-52和54-56；SEQ ID NO:58-60和62-64；SEQ ID NO:66-68和70-72；SEQ ID NO:74-76和78-80；SEQ IDNO:82-84和86-88和SEQ ID NO:90-92和94-96。
5.根据权利要求1至4任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其包含以下一者或两者：(i)重链，其包含选自由SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81和89组成的组的重链序列和(ii)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:5、l3、21、29、37、45、53、61、69、77、85和93组成的组的轻链序列。
6.根据权利要求5所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中所述重链和轻链包含以下各序列：SEQ ID NO:1和5；SEQ ID NO:9和13；SEQ ID NO:17和21；SEQ ID NO:25和29；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:65和69；SEQ ID NO:73和77；SEQ ID NO:81和85和SEQ ID NO:89和93。
7.根据权利要求1至6任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
8.根据权利要求1至7任何一项所述的分离的抗HIV-1抗体，或其抗原结合部分，其中抗体抗原或其结合部分是重组产生的。
9.分离的核酸，其包括编码权利要求1至7任何一项所述的抗HIV-1抗体或其抗原结合部分的CDR、重链可变区或轻链可变区的序列。
10.载体，其包含权利要求9所述的核酸。
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