BR112019013468A2 - anticorpos anti-hiv-1 amplamente neutralizante e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

esta invenção refere-se anticorpos anti-hiv-1 amplamente neutralizante e potente, kits e métodos de uso dos mesmos.

Description

ANTICORPOS ANTI-HIV-1 AMPLAMENTE NEUTRALIZANTE E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS
DECLARAÇÃO RELATIVA AO FINANCIAMENTO FEDERAL
[001] Esta invenção como feita com o apoio do governo sob os números de concessão AI100148 concedido pelo National
Institute of Health (NIH) . 0 governo dos EUA tem certos
direitos nesta invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] 0 campo da invenção é para anticorpos anti-HIV-1
(broadly Neutralizing antibodies bNabs) amplamente
neutraliz ante e métodos de suas utilizações.
ANTECEDENTES
[003] Vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um lentivírus (família retroviridae) que infecta humanos. Se não for tratado, ao longo do tempo a infecção pelo HIV resultará em síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome - AIDS), uma condição em que a falha progressiva do sistema imunológico permite infecções oportunistas com risco de vida (por exemplo toxiplasmose) e cânceres (por exemplo sarcoma de Kaposi) prosperem, em última análise, resultando em morte do indivíduo infectado. Sem tratamento, o tempo médio de sobrevivência após a infecção inicial é entre 9 a 11 anos no total. O HIV/AIDS representa uma crise global de saúde, considerada uma pandemia pelo CDC, com cerca de 37 milhões de pessoas infectadas com HIV a partir de 2014, resultando em cerca de 1,2 milhões de mortes neste ano.
[004] O HIV tem vários subtipos caracterizados, incluindo HIV-1 e HIV-2. O HIV-1 é mais virulento, mais infeccioso,
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2/152 e prevalente globalmente, enquanto o HIV-2 é menos virulento, menos infeccioso, e atualmente é predominante apenas na África Ocidental. 0 HIV-1 representa a causa da maioria de infecções de HIV e, portanto, representa um alvo clinicamente mais significativo. Existem vários subgrupos dentro do HIV1, incluindo o grupo Μ, o grupo Ν, o grupo 0 e o grupo P. 0 Grupo M, que significa maior, representa aproximadamente 90% das Infecções de HIV, e é subdividido ainda em outros subtipos, A-K, ocasionalmente dividido em sub subtipos (Al, A2, etc.). A notável diversidade de HIV-1, causada por uma alta taxa de mutação, contribui para a dificuldade de tratar efetivamente o HIV. Para combater esta questão, os pesquisadores tentaram desenvolver o que são conhecidos como anticorpos amplamente neutralizantes(bNAbs), que são designados como tal pela sua capacidade de neutralizar múltiplas estirpes virais de HIV, por exemplo múltiplas estirpes virais de HIV-1, tais como estas divulgadas na US 2014/0328862, incorporada inteiramente por referência neste documento. Uma fração de indivíduo infectados pelo HIV-1 desenvolve bNAbs que tipicamente desenvolve durante um período de 1-3 anos durante os quais há a Coevolução de estirpes e anticorpos virais circulantes. No entanto, estes bNabs tipicamente não conseguem neutralizar os vírus autólogos coexistentes devido à seleção mediada por anticorpo contra estirpes virais sensíveis. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de novos, anticorpos anti-HIV amplamente neutralizante que exibem um alto nível de potência contra infecção por HIV-1.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
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[005] A presente invenção refere-se a um número de anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes, potente e os métodos para uso daqueles. Consequentemente, em algumas concretizações, a presente invenção compreende um anticorpo anti-HIV-1. Em algumas concretizações, o anticorpo antiHIV-1 é um anticorpo anti-HIV-1 amplamente neutralizante (bNab) ou uma porção de ligação de antigeno daquele. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 compreende NC37 e porção de ligação de antigenos daquele. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 compreende BG1 e porção de ligação de antigenos daquele. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 compreende BG18 e porção de ligação de seus antigenos. Em algumas concretizações, a invenção compreende uma variante de BG18 e porção de ligação de seus antigenos. Em algumas concretizações, a variante de BG18 compreende um de 354BG8, 354BG18, 354BG42, 354BG33, 354BG129, 354BG188, 354BG411, e 354BG426, ou porções de ligação de seus antigenos. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende um anticorpo monoclonal (monoclonal AntiBody -mAb) . Em algumas concretizações, o anticorpo antiHIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende um anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende um anticorpo produzido de forma recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende um anticorpo humano. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de
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4/152 ligação de seu antígeno compreende um anticorpo biespecífico.
[006] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seus antígenos compreende a região variável de cadeia pesada. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende uma das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com uma das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89. Em algumas concretizações, uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89 tem substituições conservativas.
[007] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou sua porção de ligação de antígenos compreende a região variável de cadeia leve. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia leve compreende uma das SEQ ID Nos: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia leve tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com uma das SEQ ID Nos: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93. Em algumas concretizações, uma ou mais das SEQ ID Nos: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93 tem substituições conservativas.
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[008] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende pelo menos uma região determinante de complementariedade (Complementarity Determining Regions - CDRs) dentro da região variável de cadeia pesada. Em algumas concretizações, pelo menos uma CDR compreende uma das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92. Em algumas concretizações, a pelo menos uma CDR tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com uma das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92. Em algumas concretizações, uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92 tem substituições conservativas.
[009] Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antigeno compreende pelo menos uma região determinante de complementariedade (CDRs) dentro da região variável de cadeia leve. Em algumas concretizações, pelo menos uma CDR compreende uma das SEQ ID Nos: 6-8, 1416, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88, e 94-96. Em algumas concretizações, a pelo menos uma CDR tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com uma das SEQ ID Nos: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88, e 94-96. Em algumas concretizações, uma ou mais das SEQ ID NOS: 6-8, 14-16, 22Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 11/159
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24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88, e 94-96 têm substituições conservativas.
[0010] Em algumas concretizações, a presente invenção é direcionada para kits que compreendem um primeiro anticorpo. Em algumas concretizações, o primeiro anticorpo é um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo anti-HIV1 amplamente neutralizante (bNab). Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 amplamente neutralizante é qualquer anticorpo anti-HIV-1 de acordo com a presente invenção. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 especificamente liga para HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 neutraliza o HIV-1 ao ligar. Em algumas concretizações, os kits contêm um segundo anticorpo. Em algumas concretizações, o segundo anticorpo compreende um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno que especificamente liga com o HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico. Em outras concretizações, o segundo anticorpo especificamente liga ao primeiro anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o primeiro anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno é ligado a um substrato. Em algumas concretizações, o segundo anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno é ligado a um substrato. Em algumas concretizações, o primeiro anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno é etiquetado de forma detectável. Em algumas concretizações, o segundo anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno é etiquetado de forma
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7/152 detectável. Em algumas concretizações, pelo menos um dos primeiros anticorpos ou porção de ligação de seu antígeno e o segundo anticorpo ou porção de ligação de seu antígeno é etiquetado de forma detectável. Em algumas concretizações, a etiqueta detectável compreende a molécula repórter. Em algumas concretizações, a molécula repórter compreende a molécula fluorescente. Em algumas concretizações, o repórter compreende o radiomarcador. Em outras concretizações, a etiqueta detectável compreende uma enzima. Em algumas concretizações, os kits incluem um substrato para a enzima. Em algumas concretizações, a adição de um substrato para a enzima conduz para a produção de um sinal detectável. Em algumas concretizações, o sinal detectável compreende um produto solúvel colorido. Em algumas concretizações, o radiomarcador compreende 1-125. Em algumas concretizações, a enzima compreende peroxidase de rábano. Em algumas concretizações, o substrato para a enzima compreende TMB. Em algumas concretizações, os kits são capazes de detectar HIV1 ou fragmentos antigênicos do mesmo em uma amostra. Em algumas concretizações, os kits são capazes de quantificar a quantidade de HIV-1 ou fragmento antigênicos do mesmo presente em uma amostra.
[0011] Em algumas concretizações, os kits adicionalmente compreendem um agente de HIV. Em algumas concretizações, o agente de HIV é selecionado do grupo que consiste de inibidores de transcriptase reversa não nucleosídeos (NonNucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NNRTIs), inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NRTIs), inibidores de
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8/152 protease (Protease Inhibitors - Pls), inibidores de fusão, antagonistas de CCR5/inibidores de entrada, inibidores de transferência de cadeia integral (Integrase Strand Transfer Inhibitors - INSTIs), e combinações dos mesmos. Em algumas concretizações, o agente de HIV está em uma forma de dosagem unitária. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno está em uma forma de dosagem unitária. Em algumas concretizações, a forma de dosagem unitária é a forma de dosagem unitária injetável. Em algumas concretizações, o agente de HIV está armazenado no mesmo recipiente como o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o agente de HIV é armazenado em um recipiente separado. Em algumas concretizações, os kits adicionalmente compreendem um ou mais anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de seus antígenos. Em algumas concretizações, o um ou mais anticorpos anti-HIV-1 adicionais ou suas porções de ligação de antígenos compreendem quaisquer anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção. Em algumas concretizações, o um ou mais adicionais anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de antígenos do mesmo são selecionados do grupo, consistindo em NC37, NC133, NC102, AC40, AC41, AC72, e suas combinações. Em algumas concretizações, os kits compreendem instruções de uso. Em algumas concretizações, os kits compreendem um ou mais transportadores ou conservantes aceitáveis farmaceuticamente.
[0012] Em algumas concretizações, a presente invenção é direcionada para um método de detecção de HIV-1 ou um fragmento antigênico do mesmo presente em uma amostra. Em
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9/152 algumas concretizações, o método compreende obter uma amostra, contendo HIV-1 ou um de seus fragmento antigênico. Em algumas concretizações, o método compreende contactar a amostra com um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o método compreende detectar a presença de ligação específica do anticorpo antiHIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno para HIV ou o fragmento de seu antigênico. Em algumas concretizações, o método inclui quantificar a quantidade de HIV-1 ou fragmento antigênico do mesmo presente na amostra. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra biológica. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno de acordo com qualquer aspecto desta presente invenção. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é produzido recombinantemente. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo humano. Em algumas concretizações, a detecção da presença de ligação específica é realizada por imunoensaio. Em algumas concretizações, a detecção da presença de ligação específica é realizada por um imunoensaio competitivo.
[0013] Em outra concretização, a presente invenção é direcionada para um método de diagnosticar um indivíduo como
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10/152 tendo uma Infecção por HIV-1. Em algumas concretizações, o método compreende identificar um indivíduo, tendo ou suspeito de ter, uma infecção por HIV-1. Em algumas concretizações, o método compreende obter do indivíduo uma amostra, contendo HIV-1 ou um fragmento antigênico do mesmo. Em algumas concretizações, o método compreende contactar a amostra com um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o anticorpo antiHIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno de acordo com qualquer aspecto da presente invenção. Em algumas concretizações, o método compreende detectar a presença de ligação específica do anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno para o HIV ou o fragmento de seu antigênico. Em algumas concretizações, o método compreende diagnosticar o indivíduo como tendo uma infecção por HIV-1. Em algumas concretizações, o indivíduo é diagnosticado como tendo AIDS. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra biológica. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é produzido recombinantemente. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo humano. Em algumas concretizações, a detecção da presença de ligação específica é realizada por um imunoensaio. Em algumas concretizações,
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11/152 detecção da presença de ligação especifica é realizada por um imunoensaio competitivo.
[0014] Em algumas concretizações, a presente invenção é direcionada para um método de tratamento de uma infecção por HIV-1 em um indivíduo com sua necessidade. Em algumas concretizações, o método de tratamento de uma infecção por HIV-1 inclui administrar para um indivíduo, tendo ou suspeito de ter, uma infecção por HIV-1 pelo menos um anticorpo antiHIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende a anticorpo anti-HIV-1 amplamente neutralizante (bNab) ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende qualquer anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno de acordo com a presente invenção. Em algumas concretizações, o método compreende o passo de identificar um indivíduo como tendo uma infecção por HIV-1 antes do passo de administrar. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 compreende um anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é produzido recombinantemente. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo humano. Em algumas concretizações, o método adicionalmente inclui a administração de pelo menos um adicional anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de
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12/152 seu antígeno. Em algumas concretizações, o pelo menos um adicional anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo anti-HIV-1 (bNab) amplamente neutralizante ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende qualquer anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno de acordo com a presente invenção. Em algumas concretizações, o adicional anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o adicional anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende a anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o adicional anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é produzido recombinantemente. Em algumas concretizações, o método adicionalmente inclui a administração de um agente de HIV. Em algumas concretizações, o agente de HIV é selecionado do grupo que consiste de inibidores de transcriptase reversa não nucleosídeos (NNRTIs), inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos (NRTIs), inibidores de protease (Pis), inibidores de fusão, antagonistas de CCR5/inibidores de entrada, inibidores de transferência de cadeia integrase (INSTIs), e combinações do mesmo. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno pode ser coadministrado com o adicional anticorpo anti-HIV1 ou anticorpos ou porção de ligação de antígeno(s) do mesmo e/ou agente de HIV ou agente de HIVs. Em outras concretizações, o anticorpo anti-HIV ou porção de ligação de
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13/152 seu antígeno é administrado antes do adicional anticorpo anti-HIV-1 ou anticorpos ou porção de ligação de antígeno(s) do mesmo e/ou agente de HIV ou agente de HIVs. Ainda em outras concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é administrado depois do adicional anticorpo anti-HIV-1 ou anticorpos ou porção de ligação de antígeno(s) do mesmo e/ou agente de HIV ou agente de HIVs. E ainda em outras concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno pode ser administrado entre o adicional anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de antígeno(s) do mesmo e/ou agente de HIV ou agente de HIVs.
[0015] Em outra concretização, a presente invenção está direcionada para uma vacina passiva. Em algumas concretizações, a vacina compreende pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo anti-HIV-1 (bNab) amplamente neutralizante ou porção de ligação de seu antígeno. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende qualquer anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno de acordo com a presente invenção. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno compreende um anticorpo recombinante. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno é produzido recombinantemente. Em algumas concretizações, a vacina passiva adicionalmente
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14/152 compreende um adjuvante. Em algumas concretizações, a vacina passiva adicionalmente compreende um excipiente, preservativo e/ou transportador aceitável farmaceuticamente. Em outra concretização, a presente invenção é direcionada para um método de prevenir uma infecção por HIV-1 em um indivíduo com esta necessidade. Em algumas concretizações, o método inclui administrar a um indivíduo uma composição de vacina passiva de acordo com qualquer concretização da presente invenção.
[0016] Em algumas concretizações, a presente invenção está direcionada para um ácido nucleico. Em algumas concretizações, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma ou mais cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção. Em algumas concretizações, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo, codificando uma ou mais das SEQ ID
Nos : 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53,
57, 61, 65, 99, 73, 77, 81, 85, 89, e 93. Em algumas
concretizações, o ácido nucleico tem substituições
conservativas. Em algumas concretizações, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo, codificando uma ou mais CDRs dos anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção. Em algumas concretizações, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo, codificando uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30-32, 3436, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92, e 94-96. Em algumas concretizações, o ácido nucleico tem substituições conservativas.
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[0017] Em algumas concretizações, a presente invenção é direcionada para um vetor ou sistema de vetores, contendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, codificando as cadeias pesadas e/ou leves e/ou CDRs de uma ou mais dos anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de antigenos do mesmo da presente invenção. Em algumas concretizações, o vetor ou sistema de vetores compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma região variável de cadeia pesada e uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia leve. Em algumas concretizações, uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma cadeia pesada está no mesmo vetor que uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma cadeia leve. Em algumas concretizações, uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia pesada está em um vetor diferente que uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia leve. Em algumas concretizações, o vetor ou sistema de vetores é um plasmídeo ou plasmideos. Em algumas concretizações, o vetor ou um sistema de vetores é um vetor ou vetores fago. Em algumas concretizações, o vetor fago é um fago γ. Em algumas concretizações, o vetor ou vetores é um cosmideo ou cosmideos. Em algumas concretizações, o vetor ou sistema de vetores é um cromossomo recombinante ou cromossomo recombinantes. Em algumas concretizações, o sistema de vetores é uma combinação de vetores diferentes. Em algumas concretizações, a expressão das diferentes sequências de ácido nucleico pode ser concomitante. Em outras concretizações, a expressão das diferentes sequências de
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16/152 ácidos nucleicos pode ser separada de forma indutiva. Em outra concretização, a presente invenção é direcionada para um vetor ou sistema de vetores, contendo uma ou mais sequências de ácido nucleico, codificando uma ou mais regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de uma ou mais cadeias pesadas e/ou leves de um ou mais dos anticorpos antiHIV-1 da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0018] As Figuras ΙΑ, 1B, IC, ID, IE, 1F representam o repertório de anticorpo HIV-1 no doador EB354. Figura 1 A: Valores de carga viral conforme medido nos anos 2002-2015. Os pontos no tempo em que os anticorpos neutralizantes foram isolados estão indicados no gráfico. O ponto no tempo em que o plasma foi coletado são marcados com setas apontadas para baixo. Figura 1B: Mapa de calor, mostrando os valores IC50 no ensaio TZM-bl de Igc sérico purificado de 4 pontos de tempo (indicado pelas setas em (IA) ) testado contra um painel de estirpes de HIV-1. Todos os ensaios de neutralização foram realizados em duplicatas. Figura IC: Painéis superiores: As células B de memória IgG+ pré-enriquecidas CD 19 foram coloradas com CD19 e com três iscas não nativas de HIV-1: Núcleo 2CC, gpl40Yu2 trimero dobrável e gpl40g2UG37.8 + gpl40cza79012 (gpl40 A+C) trimero dobrável, e uma isca nativa BG505.SOSIP-AviB. As populações inseridas no quadrado representam células que foram separadas de unicelular e os números indicam a percentagem de células que foram CD19+/isca+ fora do total de células IgG+. Os painéis inferiores: Os gráficos de setores representam as sequências de Ig totais que foram amplificadas das unicelulares
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17/152 separadas do gráfico de FACS correspondentes mostrado na parte superior. 0 número no meio dos círculos representa o número total de anticorpos. Os setores vazios representam sequências que aparecem apenas uma vez e não possuem quaisquer parentes clonais. Os setores representam clones de anticorpo e são proporcionais ao número de sequências em cada clone. Os clones marcados com um asterisco são clones que exibem neutralização de nivel 2 e estes são representados pelas variantes NC37, BG18 e BG1. Figura 1D: Painel superior: Um mapa de calor mostrando a potência de neutralização, com base nos valores IC50 no ensaio TZM-bl, dos anticorpos monoclonais NC37, BG1 e BG18. Painel inferior: Potência de neutralização baseada nos valores de IC50 no ensaio TZM-bl, do IgG policlonal doador de 2014, bem como NC37, BG1 e BG18 contra YU2WT, YU2N28oy, YU2NN332k e YU2Nni6ok. Todos os ensaios TZM-bl foram realizados em duplicata. Figura 1E: Um mapa de calor de potência de neutralização baseado em IC50 no ensaio TZM-bl, de anticorpos NC37, BG1, BG18 e uma combinação 1:1:1 (comb.) testados contra um painel de pseudovirus de HIV-1 120 Tier 2. A média geométrica de todos os virus neutralizados e a largura percentual são indicados no painel inferior. Ensaios de neutralização foram realizados em duplicatas. Figura 1F: Curva de cobertura baseada nos valores em (1E).
[0019] As Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G representam sequência e análise estrutural do BG18 bNab. Figura 2A: Alinhamento de sequências de aminoácidos de cadeia pesada de 10-1074, PGT121 e BG18. Os asteriscos indicam lacunas no alinhamento. As setas representam posições de estrutura em
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18/152 que todos os três anticorpos são mutados em comparação com seus respectivos genes da linha germinativa. CDR Hl, H2 e H3 são indicados. Figura 2B: Alinhamentos sequência de cadeia leve como em (A) para 10-1074, PGT121 e BG18. Figura 2C: Painel esquerdo: Diagramas de fita dos domínios do Vh (cinza escuro) e Vl (cinza claro) de Fab BG18 como resolvido em resolução de 1,3 Â. Painel Central: Representação da superfície do domínio variável BG18. Painel direito: A conformação CDRH3 é estabilizada por ligação de nitrogênio (mostrado como linhas tracejadas) dentro do círculo. Resíduos de interação são mostrados como bastão, o restante de CDRH3 e o vizinho CDRH1 são mostrados como diagramas de fita. Figura 2D: Painel esquerdo: Diagramas de fita que mostram uma sobreposição dos domínios variáveis de BG18 (roxo), PGT121 (verde) e 10-1074 (azul). O CDRH3 do BG18 é destacado em vermelho, os círculos CDRH3 círculos de PGT121 e 10-1074 são castanhos. Painel direito: Vl de BG18 (rosa claro) e PGT121 (verde claro) são mostrados após a superposição de VH. CDRL2Bgi8 foi desordenado no cristal e é indicado por uma linha tracejada. 10-1074 está intimamente relacionado com PGT121 e foi omitido para maior clareza. Figura 2E: Representações de superfície de BG18 e PGT121. Figura 2F: Estrutura EM de partícula simples (densidade cinza transparente) de BG505 SOSIP.664 ligada para BG18 e 179NC75 Fabs. As coordenadas para BG505 SOSIP.664, BG18 Fab, e um modelo para 179NC75 Fab (CH103 Fab: PDB 4JAM) , foram ajustados na densidade EM como descrito no Exemplo 1 infra. As médias da classe 2D são dadas. Figura 2G: Comparações de ângulos de ligação de BG505 adotado pelo BG18 Fab versus o
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Fabs de 10-1074, PGT122 (PDB 5FYJ) , PGT135 (PDB 4JM2), e PGT128 (PDB 5ACO). As densidades para os 179NC75 Fabs foram subtraídos no mapa BG18-179NC75-BG505 para facilitar comparações .
[0020] As Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E representam vírus de plasma autólogo no doador EB354. Figura 3A: Árvore filogenética de máxima verossimilhança das sequências do gene env derivado de único genoma do doador EB354 amostradas em 2006, 2010, 2013 e 2014. O asterisco vermelho indica ciados com suporte de bootstrap >90%. Três grupos de sequências principais são arbitrariamente denominadas Grupos A, B e C. Os três triângulos indicam sequências env em que o local de glicosilação ligado a N está ausente. As caixas tracejadas indicam culturas de VOC; o número entre parênteses representa o número de sequências viral env VOC. Figura 3B: Gráficos de dispersão representam a diversidade de sequências de nucleotídeo emparelhadas de sequências env de plasma a partir de 2010, 2013 e 2014. Cada ponto representa a diferença genética entre duas sequências emparelhadas em um determinado ponto no tempo. Os valores P foram determinados, usando um teste Z baseado em estatística U de duas amostras e indica ***p<0,0005. Figura 3C: Mapas de calor mostrando valores de IC50 no ensaio TZM-bl de BG18, BG1, NC37 e o purificado IgG contemporâneo a partir do mesmo ponto do tempo que os genes env viral contra pseudovirus autólogo, usando sequência env EB354. As estrelas marcam pseudovirus que são resistentes para todos os três bNAbs autólogos. O anticorpo 3BNC117 (descrito no documento US 2014/0328862) serviu como um controle. Os círculos à esquerda correspondem
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20/152 aos pontos do tempo em que as sequências foram obtidas, conforme indicado em (3A) . Os ensaios de neutralização foram realizados em duplicatas e repetidos pelo menos duas vezes. Os quadrados cinzas indicam que o ensaio não foi préformatado. Figura 3D: Os gráficos de setores representam a sensibilidade dos pseudovirus autólogos, usando sequências env EB354 para cada um dos três bNAbs autólogos em diferentes pontos do tempo analisados. O número no meio dos círculos representa o número do pseudovirus env testado, e os diferentes setores são proporcionais ao número de pseudovirus. Os bNAbs são indicados à esquerda e os pontos do tempo em que as amostras foram coletadas são indicados acima do gráfico. As barras abaixo dos círculos mostram quando os transcritos de anticorpo foram detectados por PCR. Figura 3E: Os valores de IC50 no ensaio TZM-bl de BG18, BG1, NC37 e o bNAb 3de controle BNC117 contra VOCs obtidos a partir de células T CD4 EB354 de 2014 e 2015.
[0021] As Figuras 4A, 4B, 4C, 4D, 4E representam o tratamento de ratos hu infectados com HIVyu2. A Figura 4A: Os valores de carga viral em quatro (BG18) e cinco (NC37) infectados com HIVyu2 antes e depois da monoterapia com BG18 (painel superior) ou NC37 (painel inferior). A área cinza sombreada no gráfico indica o período de tempo durante o qual BG18 (superior) ou NC37 (inferior) foi administrado. As linhas em negrito indicam os valores médio geométricos em cada experiência de tratamento. Figura 4B: Alinhamento de sequência de aminoácido de sequências gpl20 de vírus clonados no dia 21 após a terapia com BG18 (superior) ou NC37 (inferior). Cada barra horizontal representa a sequência de
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21/152 um único clone gpl20 alinhado ao HIV-1yu2. As substituições de aminoácido são indicadas como ticks. 0 ID do rato a partir da qual a sequência foi obtida é indicada nas barras verticais. Uma visão expandida das áreas da caixa é mostrada à direita de cada painel. Figura 4C: Os gráficos de setores mostram as mutações recorrentes para BG18 (superior) e NC37 (inferior) em gpl20 em comparação com a sequência de HIV-1yu2 tipo selvagem. Os diferentes setores são proporcionais ao número de sequências que transportam mutações. 0 número no centro do setor indica o número total de sequências clonadas. Setores brancos no NC37 indicam a ausência de quaisquer mutações recorrentes. Figura 4D: Valores de carga viral em sete ratos hu antes e depois do tratamento com uma combinação de BG18+NC37+BG1. Os ratos TI e T2 são ratos de controle não tratados (marcas abertas) . Os ratos T3-T7 receberam a combinação de BG18+NC37+BG1 (marcas completas). A área sombreada indica o período de tempo em que a combinação de bNAbs foi dada. As médias da média geométrica são mostradas em linhas negritadas, pontilhada para o grupo não tratado e cheia para o grupo tratado. Figura 4E: Diferença do Logio na carga viral em comparação com o dia 0 (antes da administração do anticorpo) . 0 asterisco indica um valor de esboço.
[0022] As Figuras 5A, 5B representam os resultados da competição ELISA. Cada um dos anticorpos neutralizantes (quantidades iguais) foi ensaiado por ligação em ELISA a BG505 SOSIP.664 na presença de quantidades crescentes de vários anticorpos competidores. A linha preta indica ligação
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22/152 do anticorpo biotinilado na ausência de competição. Figura 5A: BG18, Figura 5B: BG1.
[0023] As Figuras 6A, 6B, 6C, 6D representam comparação de sequências entre BG18, PGT121 e 10-1074. Figura 6A: Dendrograma das sequências das cadeias pesadas de PGT121, 10-1074 e nove variantes clonais de BG18, bem como as suas linhas de germes previstas. Figura 6B: Alinhamento das CDRs de cadeia pesada. A posição comum para as variantes PGT121/10-1074 e BG18 estão em destaque. Figura 6C: O mesmo que (6A), mas para as cadeias leves. Figura 6D: Alinhamento das CDRs de cadeia leve. A posição comum para as variantes de PGT121/10-1074 e BG18 estão em destaque.
[0024] A Figura 7 representa o potencial eletrostático de BG18. Os potenciais de superfície eletrostática de Fabs foram calculados com APBS e representações de superfície foram exibidas em quimera UCSF e sombreada. As interfaces de ligações previstas estão delineadas com uma linha preta pontilhada. As pegadas aproximadas nas superfícies PGT121 e 10-1074 Fab dos glicanos gpl20 ligados a Asnl37gpi2o, Asnl56gPi2o e Asn332gpi2o são indicados com triângulos pretos.
[0025] As Figuras 8A, 8B, 8C representam a estrutura do complexo NC37 Fab-gpl20. Figura 8A: A estrutura cristalina de 2,7 Â de um complexo de NC37 Fab-gpl20 sobreposto a uma estrutura do complexo de 8ANC134 Fab-gpl20 (PDB 4RX4) revela uma orientação de ligação de gpl20 semelhante para os dois anticorpos. Figura 8B: Close-up da interface Fab-gpl20 mostra a CDRH3 estendida do NC37 comparado com o 8ANC134 CDRH3. Figura 8C: Vista lateral de uma estrutura de trímero BG505 na representação de superfície (PDB 4TVP) com epítopos
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23/152 previsto para NC37, 8ANC134 e NIH45-46 mostrado em um protômero do trimero. 0 CDRH3 mais longo do NC37 sugere uma área de contato maior em um protômero adjacente (cinza claro) do trimero.
[0026] As Figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F representam a ligação do anticorpo BG18 para glicopeptideos V3 de HIV-1 sintético. Os glicopeptideos V3 marcados com biotina foram imobilizados em um chip de neotravidina e utilizou-se BG8 IgG como o analito. Figura 9A: A interação entre BG18 e um glicopeptideo JR-FL mini-V3 portador de um glicano MangGlcNAcz em N301. Ligação fraca foi observada. Figura 9B: Interação entre BG18 e um glicopeptideo JR-FL mini-V3 portador de um glicano MangGlcNAcz glicano em N332. Ligação fraca foi observada. Figura 9C: Interação entre BG18 IgG e um glicopeptideo JR-FL mini-V3 portador de um complexo biantenário do tipo N-glicano em N301. Nenhuma ligação foi observada. A Figura 9D: Interação entre BG18 IgG e um glicopeptideo JR-FL mini-V3 portador de um complexo biantenário tipo N-glicano em N332. Nenhuma ligação foi observada. Figura 9E: Interação entre BG18 IgG e um glicopeptideo A244 mini-V3 portador de um glicano MangGlcNAcz em N334. Ligação fraca foi observada. A Figura 9F: Interação entre BG18 IgG e um glicopeptideo CAP45 mini-V3 portador de um glicano MangGlcNAcz em N334. Ligação fraca foi observada.
[0027] As Figuras. 10A, 10B, 10C representam sequenciação env genoma único do virus do plasma do doador EB354. Figura 10A: Os gráficos de setores representam as sequências env totais amplificadas pelo PCR do genoma único PCR para cada ponto do tempo de coleta. O número total de sequências
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24/152 obtidas de cada ponto do tempo é denotado no meio do circulo, e os diferentes setores são proporcionais ao número de sequências. Figura 10B: Árvore filogenética de máxima probabilidade de sequências de gene env derivada de genoma único do doador EB354 amostradas em 2006, 2010, 2013 e 2014. Um asterisco indica ciados com suporte de bootstrap >90%. A tabela do lado direito mostra os valores de TCID50 e os valores de IC50 no ensaio TZM-bl de BG18, BG1, NC37 e o anticorpo de controle 3BNC117 contra pseudovirus autólogo, usando sequências env de EB354. Figura 10C: Comparando os valores de pseudovirus TCID50, usando env EB354 que foram resistentes a todos os três bNAbs em oposição a pseudovirus, usando sequências env EB354 que foram sensíveis para pelo menos um bNAb. Valor de P (teste t)=0,0016.
[0028] As Figuras 11A, 11B, 11C representam o tratamento com BG8 de rato hu infectado com HIVyu2. Figura 11A: Valores de carga viral em quatro ratos hu antes e depois da administração de BG8. A área cinza sombreada no gráfico indica o período de tempo durante o qual o anticorpo foi administrado. As linhas em negrito indicam os valores médios geométricos do riment. Figura 11B: Alinhamento da sequência de aminoácido sequências gpl20 de vírus clonados no dia 21 após a terapia. Cada barra cinza horizontal representa a sequência de um único clone gpl2 0 alinhado ao HIV-1yu2. As substituições de aminoácido são indicadas como black ticks. O ID dos ratos a partir do qual a sequência foi obtida é indicado nas barras pretas verticais. Uma visão expandida das áreas da caixa é mostrada à direita em cada painel. Figura 11C: Gráficos de setores, mostrando as mutações
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25/152 recorrentes no gpl20 em comparação com a sequência do HIV1yu2 do tipo selvagem após a terapia com BG8. 0 número no centro do círculo denota o número total de sequências clonadas; os setores representam as áreas mais consistentemente mutadas no gpl20 e são proporcionais ao número de sequências que transportam mutações.
[0029] As Figuras 12A, 12B representam cargas virais nos ratos humanizados tratados com anticorpo e infectados por HIV yu2 · Os valores de carga virais em ratos humanizados infectados com HIVYU2 antes e depois da monoterapia com BG18 (Figura 12A) e NC37 (Figura 12B) . A área sombreada no gráfico indica o período de tempo durante o qual o anticorpo foi dado. Cada gráfico mostra duas experiências independentes indicadas por círculos (primeira experiência) e por quadrados (segunda experiência) . Formas cheias e abertas indicam ratos tratados e de controle, respectivamente. As linhas grossas tracejadas e cheias indicam os valores médio para rato de controle e tratados, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições
[0030] Um anticorpo anti-HIV-1 pode tomar uma das numerosas formas na matéria, como divulgado neste documento. Anticorpos são em parte definidos pelos antígenos aos quais está ligado, portanto, um anticorpo anti-HIV-1 é qualquer anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epítopo encontrado no envelope viral do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), por exemplo dentro de gpl20 e/ou gpl40, como descrito neste documento. Entende-se na matéria que
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26/152 um anticorpo é uma glicoproteína, compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H - Heavy) e duas cadeias leves (L light) interligadas por ligação de dissulfeto, ou uma porção de ligação de seu antígeno. Uma cadeia pesada é constituída de uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). A cadeia leve é constituída de uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões variáveis de ambas as cadeias pesada e leve compreendem regiões estruturais (Framework Regions - FWR) e regiões determinantes de complementariedade (Complementarity Determining Regions - CDR) . As quatro regiões FWR são relativamente conservadas, enquanto as Regiões CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) representam região hiper variáveis e são arranjadas do terminal NH2 para o terminal COOH como segue: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, FWR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno, enquanto na dependência do isótipo da(s) região (s) constante (s) podem mediar a ligação da imunoglobulina para tecidos ou fatores hospedeiros. É conhecido na matéria que é possível manipular anticorpos monoclonais e outros anticorpos e utilizar técnicas da tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retenham a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem evoluir introduzindo DNA, codificando a região variável de imunoglobulina, ou CDRs, de um anticorpo para as regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente.
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[0031] O termo anticorpo (Antibody - Ab) como usado neste documento é usado no sentido amplo e especificamente pode incluir qualquer imunoglobulina, seja natural ou parcialmente ou totalmente sinteticamente produzida, incluindo, mas não limitado para anticorpo monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos e anticorpos polireativos), e fragmentos de anticorpos. Assim, o termo anticorpo como utilizado em qualquer contexto dentro desta especificação, pretende incluir, mas não está limitado para, qualquer membro de ligação específica, classe de imunoglobulina e/ou isótipo (por exemplo, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, e IgE) e fragmentos biologicamente relevantes ou membro de ligação específica do mesmo, incluindo, mas não limitado para Fab, F(ab')2, scFv (cadeia única ou entidade relacionada) e (scFvh.
[0032] O termo fragmentos de anticorpo como usado neste documento pode incluir aqueles fragmentos de anticorpo obtidos, utilizando técnicas prontamente conhecidas e disponíveis para os especialistas na matéria, como previsto neste documento. Por tanto, em adição à definição de anticorpo apresentado supra, o termo anticorpo pode adicionalmente englobar qualquer polipeptídeo ou proteína, compreendendo uma porção de um anticorpo intacto, tais como o antígeno ligação ou região variável do anticorpo intacto. Este pode ser derivado de fontes naturais, ou podem ser parcialmente ou totalmente sinteticamente produzidos. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados para fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos,
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28/152 e anticorpos lineares. Os termos porção de ligação de antígeno, fragmento de ligação de antígeno ou Fab como usado neste documento podem se referir a uma região em um anticorpo que se liga a antígenos. Um experiente na matéria entenderá que os Fabs são constituídos de uma constante de um domínio variável de cada uma das cadeias pesada e leve de um anticorpo.
[0033] O termo anticorpo monoclonal ou mAb como usado neste documento pode referir-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais, compreendendo a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais podem incluir, mas não limitados para anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos recombinantes e anticorpo humanos. Os métodos de produção de anticorpo monoclonais são bem conhecidos na matéria, com alguns exemplos específicos discutidos infra, incluindo tecnologia de hibridoma, produção de anticorpo recombinante, por exemplo por exibição de fago ou tecnologia de exibição de levedura, produção por ratos transgênicos, e cultura de célula B simples. Os métodos que envolvem a amplificação de cadeias pesadas e/ou leves de genes de anticorpo (por exemplo um plasmídeo ou cosmídeo) por PCR (ou tecnologia similar) in vitro ou em sistema bacterianos e/ou mamíferos e/ou levedura são considerados dentro do escopo da presente invenção.
[0034] Os termos modificações de sequência conservativa ou substituições conservativas como usado neste documento
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29/152 podem referir-se a modificações de aminoácido para um epitopo alvo da invenção que não afeta ou altera significativamente as características da ligação dos anticorpos anti-HIV-1 para o(s) epitopo(s). Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácido. As substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido, tendo cadeias laterais similares foram definidas na matéria. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alamina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalamina, metionina), cadeias laterais ramificada beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalamina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro do epitopo alvo para o qual os anticorpos anti-HIV-1 da invenção se ligam especificamente, por exemplo epítopos no envelope viral de HIV-1, por exemplo epítopos no gpl20 e/ou gpl40, podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e os anticorpos da presente invenção podem ser testados contra epitopo alvo que pode ser testado, por exemplo utilizando
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30/152 ensaios funcionais descrito neste documento ou de outra maneira conhecido na matéria.
[0035] O termo amostra biológica refere-se a uma amostra obtida de um organismo (por exemplo, paciente) ou de componentes (por exemplo, células) de um organismo. A amostra pode ser de qualquer tecido biológico, célula (s) ou fluido. A amostra pode ser uma amostra clínica que é uma amostra derivada de um sujeito, tal como um paciente humano. Tais amostras incluem, mas não são limitados para, saliva, escarro, sangue, células de sangue (por exemplo, glóbulos brancos), fluidos corporais, lavagens, sucos pancreáticos, sucos gástricos, descargas, CSF, líquido amniótico linfático, plasma, sêmen, medula óssea, e amostras de biopsia de tecido ou agulha fina, urina, fezes, fluido peritoneal e fluido pleural, ou células destes, e quaisquer combinações dos mesmos. As amostras biológicas também podem incluir seções de tecidos, tais como seções congeladas tiradas para propósitos histológicos. Uma amostra biológica também pode ser referida como uma amostra do paciente. Uma amostra biológica também pode incluir uma proteína isolada substancialmente purificada, preparação de membrana ou cultura de célula.
[0036] O termo anticorpo biespecífico refere-se a construtores de imunoglobulina artificial que são constituídos de fragmentos de dois anticorpos monoclonais diferentes, que estão ligados a dois antígenos diferentes. Existem vários tipos distintos de anticorpos biespecíficos, incluindo, mas não limitado para anticorpos trifuncionais e Fabs ligados quimicamente. Os anticorpos anti-HIV-1 da
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31/152 presente invenção podem compreender anticorpos biespecíficos e incluem fragmentos de um ou mais anticorpos anti-HIV-1 diferentes, incluindo um ou mais anticorpos anti-HIV-1 diferentes da presente invenção, por exemplo BG18 e BG1, ou um ou mais anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção e anticorpos anti-HIV-1 conhecidos, por exemplo BG18 e 3BNC117 (descrito no documento US 2014/0328862), ou BG18 e VRC01, descrito no documento US 8,637,036. O bNabs anti-HIV biespecífico e métodos de produção e seus usos estão descritos em PCT/US16/64713, incorporada neste documento por referência.
[0037] Os termos quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz como usado neste documento podem referir-se a uma quantidade do composto ou agente que é capaz de produzir um resultado medicamente desejado em um indivíduo em tratamento. O método de tratamento pode ser realizado ín vivo ou ex vivo, sozinho ou em conjunto com outros fármacos ou terapia. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada para uma formulação ou via de administração particular.
[0038] Os termos ligação específica, ligação seletiva, liga-se seletivamente, e liga-se especificamente, podem se referir à ligação de anticorpo para um epítopo em um antígeno predeterminado, mas não a outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma constante de dissociação de equilíbrio (KB) de aproximadamente menos que 10~6 M, tal como aproximadamente menos que 10 ~7 M, 10 ~8 M, 10~9 M ou 10~10 M ou ainda inferior quando determinada por,
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32/152 por exemplo, diálise de equilíbrio ou tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (Surface Plasmon Resonance - SPR) em um instrumento de ressonância de plasmon de superfície BIACORE® 2000, utilizando o antígeno predeterminado, por exemplo, um epítopo em um envelope viral de HIV-1, por exemplo (i) gpl20, como o analito e o anticorpo como o ligante, ou análise de Scatchard da ligação do anticorpo para células positivas do antígeno, e (ii) se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que sua afinidade para ligação para um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno estreitamente relacionado.
[0039] O termo homologia como usado neste documento pode referir-se à existência de estrutura compartilhada entre duas composições. O termo homologia no contexto de proteínas pode referir-se à quantidade (por exemplo, expressa em uma percentagem) de sobreposição entre duas ou mais sequências de aminoácido e/ou peptídeo. No contexto de ácido nucleicos, o termo pode referir-se a uma quantidade (por exemplo, expressa em uma percentagem) de sobreposição entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos. Como usado neste documento, a percentagem de homologia (%) entre duas sequências é equivalente à percentagem de identidade entre as duas sequências. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia =# de posições idênticas/total # de posições x 100), levando em consideração o número de intervalos, e o comprimento de cada
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33/152 intervalo, que precisam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas, usando um algoritmo matemático. Tal homologia é bem representada na matéria através de ferramentas de alinhamento local e/ou algoritmos, por exemplo BLAST e/ou BLAST 2,0, e podem incluir alinhamento em pares, métodos de alinhamento de múltiplas sequências, métodos de alinhamento estrutural, e/ou métodos de análise filogenética.
[0040] Os termos coadministração, coadministrado, e em combinação com como usado neste documento podem referir-se à administração de pelo menos dois agentes ou terapias para um indivíduo. Em algumas concretizações, a coadministração de dois ou mais agentes/terapias é concorrente. Em outras concretizações, um primeiro agente/terapia é administrado antes de um segundo agente/terapia. Os experientes na matéria compreenderam que as formulações e/ou vias de administração dos vários agentes/terapias utilizados podem variar. Por exemplo, os anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção podem ser coadministrados um com os outros, ou podem ser coadministrados ao lado de outros anticorpos, por exemplo outros anticorpos amplamente neutralizante, tais como, por exemplo, os anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes divulgados na US 2014/0328862, por exemplo 3BNC117, ou VRC01, descrito na US 8,637,036, incorporados inteiramente neste documento por referência, ou opcionalmente, coadministrados com outros agentes de HIV. A coadministração pode ou não ocorrer simultaneamente, por exemplo um ou mais anticorpos
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34/152 anti-HIV-1 da presente invenção podem ser administrados antes ou depois de outro anticorpo anti-HIV-1 da presente invenção (ou outro anticorpo anti-HIV ou outros agentes de HIV) , ou podem ser administrados ao mesmo tempo ou substancialmente em tempo similar. Um experiente na matéria apreciará gue a coadministração não pretende ser limitativa no tempo como pretende descrever a administração ao lado de outros compostos e/ou terapias como parte de um regime do paciente.
[0041] O termo agente de HIV como usado neste documento pode referir-se a uma terapia para o tratamento de HIV que, por si só, não compreende um anticorpo anti-HIV-1. Por exemplo, inibidores de transcriptase reversa não nucleosídeos (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NNRTIs), inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors NRTIs), inibidores de protease (Protease Inhibitors - Pls), inibidores de fusão, antagonistas de CCR5/inibidores de entrada, inibidores de transferência de cadeia integrase (Integrase Strand Transfer Inhibitors - INSTIs), e combinações dos mesmos, seriam todos considerados agente de HIVs, uma vez que são tratamentos terapêuticos não baseados em anticorpos que podem ser coadministrados com um ou mais anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção, e/ou anticorpos anti-HIV-1 adicional. Um experiente na matéria apreciará que esta lista não deve ser considerada exaustiva e como o estado da técnica avança e tratamentos adicionais ficam disponíveis, eles são considerados dentro do escopo desta definição.
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[0042] O termo transportadores como usado neste documento pode incluir transportadores, excipíentes, ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem, mas não limitados para tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo, mas não limitado para, ácido ascórbico; polipeptídeo baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como, incluindo, mas não limitado para, albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como, incluindo, mas não limitado para, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como, incluindo, mas não limitado para, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacarídeos, disacarídeos, e outro carboidratos incluindo, mas não limitado para, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como, incluindo, mas não limitado para, EDTA; álcoois de açúcar tais como, incluindo, mas não limitado para, manitol ou sorbitol; contraíons de formação de sal, tais como, incluindo, mas não limitado para, sódio; e/ou surfactantes não iônico, tais como, incluindo, mas não limitado para, TWEEN.; polietileno glicol (PolyEthylene Glycol - PEG), e PLURONICS.
[0043] O termo tratar ou tratamento de uma doença referese à execução de um protocolo, que pode incluir administrar um ou mais fármacos para um paciente (humano ou diverso), em
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36/152 um esforço para aliviar sinais ou sintomas da doença. 0 alívio pode ocorrer antes dos sinais ou sintomas da doença aparecer, assim como depois de sua aparição. Assim, tratar ou tratamento inclui prevenir ou prevenção da doença. Os termos prevenir ou prevenção referem-se a medidas profiláticas e/ou preventivas, no qual o objetivo é para prevenir ou retardar a condição ou distúrbio patológico alvo. Por exemplo, no caso da infecção pelo vírus da imunodeficiência 1 (HIV-1), prevenir ou prevenção pode surgir em uma situação em que o curso do tratamento é avançado, de modo a prevenir ou retardar a infecção pelo HIV-1, tais como através da vacinação passiva. Tal prevenir ou prevenção também surgem no caso de infecção latente pelo HIV-1, por exemplo naqueles indivíduos que são soropositivos, mas não apresentam quaisquer sintomas (isto é, não prosseguir para os sintomas de AIDS), no qual o objeto seria prevenir infecção ativa e/ou limpar um paciente da referida Infecção por HIV-1. Além disso, tratar ou tratamento não requer alívio completo de sinais ou sintomas, não requer uma cura e inclui especificamente protocolos que têm apenas um efeito marginal, ainda que positivo, para o paciente.
[0044] O termo epítopo como usado neste documento pode referir-se à região de um antígeno ao qual um anticorpo ou célula T se liga, por exemplo uma região do envelope viral de HIV-1, incluindo, mas não limitado para uma glicoproteína, por exemplo gpl20, ou uma região em uma glicoproteína. Um antígeno refere-se a uma substância que provoca uma reação imunológica ou se liga aos produtos dessa reação.
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[0045] Os termos anticorpo, peptídeo, polipeptídeo ou proteína purificados ou isolados refere-se a um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína, como usado neste documento, podem referir-se a um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína que foi separada de outras proteínas, lipideos, e ácido nucleicos, com os quais está naturalmente associado. O polipeptídeo/proteína pode constituir pelo menos 10% (isto é, qualquer percentagem entre 10% e 100%, por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, e 99%) em peso seco da preparação purificada. A pureza pode ser medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida gel, ou análise HPLC. Um polipeptídeo/proteína isolado (por exemplo, anticorpos antiHIV-1) descrito na invenção pode ser produzido por técnicas de DNA recombinante.
Anticorpos anti-HIV-1 Amplamente Neutralizante
[0046] A presente invenção relata a anticorpos anti-HIV1 amplamente neutralizante (bNabs) e suas porções de ligação a antígenos. Em particular, a presente invenção relata a vários anticorpos monoclonais distintos, BG18, NC37, e BG1, às suas porções de ligação de antígenos, incluindo, mas não limitado para suas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), e seus derivados e variantes, que exibem neutralização ampla e potente de HIV-1 ín vivo (ver Exemplo 1 infra) . Assim, os anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção possuem uma forte utilidade terapêutica, isolado ou em combinação uns com os outros, ou com outros bNabs, ou com outros tratamentos de HIV, como discutido neste documento.
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[0047] Cada um dos BG18, NC37 e BG1 tem epítopos distintos, não sobreposto. O NC37 reconhece os CD4bs. O NC37 e suas variantes clonais exibem características dos bNAbs derivados de ambos VhI -2 e Vh1-46; entretanto, análises estruturais sugerem que NC37 reconhece Env de uma maneira tipo Vh1-46. Sem querer estar limitado pela teoria, prevêse que a CDRH3 longa da NC37 estabeleça contato com o protômero adjacente no trímero, reconhecendo assim um epítopo trímero quaternário, cujo núcleo se sobrepõe com os CD4bs.
[0048] O BG1 liga-se à região V1V2 de Env, outro alvo frequente de bNAbs, que surgem durante infecção natural. O BG1 representa o primeiro anticorpo desta classe (bNabs) a ser isolado de um doador infectado pelo Clade Β. A sua potência é semelhante aos membros da família do anticorpo VRC26, tais como estes descritos em N. A. Doria-Rose et al., Developmental pathway for potent VlV2-directed HIVneutralizing antibodies. Nature 509, 55-62 (2014), mas é menos potente que os bNAbs PG9/16 e PGDM1400. Como outros bNAbs V1V2 isolados até hoje, o BG1 tem uma longa CDRH3 rica em tirosina.
[0049] BG18, o mais potente de cada um dos BG18, NC37 e BG1, é direcionado contra o patch glicano centrado Asn332gpi2o na base do círculo V#. Esta é uma região fortemente glicosilada, que inclui carboidratos nas posições Asn332gpi2o, Asn3Olgpi2o, Asn386gpi2o, Asn392gpi2o, Asnl37gpi2o, Asnl56gpi2o. Um número de bNAbs monoclonais que se ligam para ambos os componentes de proteína e carboidrato neste local foram isolados, incluindo PGT121-124, como descrito no L. M. Walker et al. , Broad
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39/152 neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature 477, 466-470 (2011) e 10-1074, como descrito em H. Mouquet et al., Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unidadeed States of America 109, E3268-3277 (2012) . Todos estes bNAbs foram isolados de um doador de Clade A e podem ser subclassifiçados naqueles que dependem exclusivamente do glicano Asn332gpi2o (10-1074 e PGT124), e aqueles que também fazem contatos com glicanos circundantes no patch de glicano V3 (PGT121-123). O BG18 e as suas variantes clonais assemelham-se a 10-1074, na medida em que se baseiam em Asn332gpi2o, mas o BG18 é mais potente do que os bNAbs antiV3 publicados e o primeiro a ser isolado de um doador Clade B.
[0050] O BG18 difere dos membros caracterizados anteriormente desta classe por uma orientação surpreendentemente distinta do CDRH3 e do domínio da cadeia leve. Em adição, o BG18 difere dos outros membros deste grupo de anticorpos em que tenha uma CDRH3 mais curta e não tenha inserções ou deleções, embora sem desejar estar limitado pela teoria, sugere que os anticorpos como BG18 podem ser fáceis de serem induzidos. Na ausência de uma estrutura de alta resolução de um complexo BG18-Env, é difícil prever como o CDRH3 mais curto de BG18 interage com o Env. Estudos estruturais de complexos Env com PGT122 e Fabs 10-1074 demonstram que eles adotam um ângulo de aproximação similar, que é aproximadamente perpendicular aos protômeros gpl20 dentro de um trímero Env. A estrutura EM do BG18-Env, embora
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40/152 não tenha resolução suficiente para resolver interações detalhadas, mesmo assim demonstra que BG18 se aproxima de Env de um ângulo diferente, que é deslocado em até 40° na direção ao promotor gpl20 em relação aos ângulos de aproximação de 10-1074 e PGT122. As variantes clonais BG18 e derivados, incluindo 354BG8, 354BG18, 354BG42, 354BG33, 354BG129, 354BG188, 354BG411, e 354BG426 juntamente com as suas sequências de comprimento total, regiões determinantes de complementariedade de cadeias pesadas e leve (CDRs), são apresentadas abaixo na Tabela 1. Um dendrograma de variantes de BG18 é apresentado na Figura 6 e discutido no Exemplo 1 infra. As variantes clonais de BG1 e derivados, incluindo BG1, BG22, e BG47, juntamente com as suas sequências de comprimento total, regiões determinantes de complementariedade das cadeias pesadas e leves (CDRs), são apresentadas abaixo na Tabela 2.
Nome SEQ ID III!· Sequência
354BG8IgH 1 EVQLRESGPRLVKPSETLSLSCDVFGDSRPSDHSWTWV RQPPGKALEWIGDVHYNGDNTYNPSLRGRVKIDVDRST HRFSLTLKSL TAADT GIY FCARNVIRVFGVISLGEWFH YGMDVWGPGTAVIVSS
CDR1 2 GDSRPSDHS
CDR2 3 VHYNGDN
CDR3 4 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
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Nome SEQ ID Sequência
354BG8 IgL 5 SSELTQAPSVSVSPGQTATIACSGPPLASRYTYWYRQK PGQAPVLIIFRDRQFPSGVSGRFSASKSGTTATLTIRD VQVEDEGDYYCQSSDTSDSYKMFGGGTTLTVL
CDR1 6 PLASRY
CDR2 7 RDR
CDR3 8 QSSDTSDSYKM
354BG18 IgH 9 QVQLRESGPGLVKPSETLSLSCTVSNDSRPSDHSWTWV RQSPGKALEWIGDIHYNGATTYNPSLRSRVRIELDQSI PRFS LKMT SMTAADTGMYYCARNAIRIYGWALGEWFH YGMDVWGQGTAVTVSS
CDR1 10 NDSRPSDHS
CDR2 11 IHYNGAT
CDR3 12 NAIRIYGVVALGEWFHYGMDV
354BG18 IgL 13 SSELTQPPSVSVSPGQTARITCSGAPLTSRFTYWYRQK PGQAPVLIISRSSQRSSGWSGRFSASWSGTTVTLTIRG VQADDEADYYCQSSDTSDSYKMFGGGTKLTVL
CDR1 14 PLTSRF
CDR2 15 RSS
CDR3 16 QSSDTSDSYKM
354BG42 IgH 17 EVQLRESGPGLVKPSETLSLSCDVFGDSRPSDHSWTWV RQPPGKALEWIGDVHYNGDTTYNPSLRGRVKIDVDRST
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Nome SEQ ID Sequência
HRFSLTLNSL T AAD T GIY FCARNVIRVFGVISLGEWFH YGMDVWGQGTAVTVSS
CDR1 18 GDSRPSDHS
CDR2 19 VHYNGDT
CDR3 20 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
354BG42 IgL 21 SSELTQAPSVSVSPGQTATIACSGPPLASRYTYWYRQK PGQAPVLIIFRpRQFPSGVSGRFSASKSGTTATLTIRD VQVEDEGDYYCQSSDTSDSYKMFGGGTTLTVL
CDR1 22 PLASRY
CDR2 23 RDR
CDR3 24 QSSDTSDSYKM
354BG33 IgH 25 QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSNDSRPSDHSWTWV RQSPGKALEWIGDIHYNGATTYNPSLRSRVRIELDQSI PRES LKMT SMTAADTGMYYCARNAIRIYGWALGEWFH YGMDVWGQGTAVTVSS
CDR1 26 NDSRPSDHS
CDR2 27 IHYNGAT
CDR3 28 NAIRIYGWALGEWFHYGMDV
354BG33 IgL 29 SSELTQPPSVSVSPGQTAKITCSGAALTSRFTYWYRQK PGQAPVLIISRTSQRSSGWSGRFSASWSGTTVTLTIRG VQADDEGDYYCQSSDTSDSYKMFGGGTKLTVL
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Nome SEQ ID Sequência
CDR1 30 ALTSRF
CDR2 31 RTS
CDR3 32 QSSDTSDSYKM
354BG129 IgH 33 EVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWV RQSPGKALEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVKLEVDTST NRFFLKMTSL TVAD T GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFH YGMDVWGQGTAITVS P
CDR1 34 GDSRPSDHS
CDR2 35 IHYGGDI
CDR3 36 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG129 IgL 37 SSELTQTPSVTVSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQK PGQAPVLIIFRpRQFSSGMSGRFASSHSGTTVTLTIRD VRVEDEADYYCQSSDINDSYKMFGGGTKVTVL
CDR1 38 PLASRY
CDR2 39 RPR
CDR3 40 QSSDINDSYKM
354BG188 IgH 41 EVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWV RQSPGKTLEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVKLEVDTSS
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Nome SEQ ID Sequência
NR F FLKMT S L TVAD T GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFH YGMDVWGQGTAITVS P
CDR1 42 GDSRPSDHS
CDR2 43 IHYGGDI
CDR3 44 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG188 IgL 45 SSELTQTASVTVSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQK PGQAPVLIIFRpRQFSSGISGRFSSSQSGTTVTLTIRD VRVEDEADYYCQSSDTSDSFKMFGGGTKLTVL
CDR1 46 PLASRY
CDR2 47 RDR
CDR3 48 QSSDTSDSFKM
354BG411 IgH 49 QVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWV RQSPGKALEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVELEVDRST NRFFLKMTSLSVADTGMYFCARNVIRVFGVIALGEWFH YGMDVWGQGTAITVS P
CDR1 50 GDSRPSDHS
CDR2 51 IHYGGDI
CDR3 52 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG411 IgL 53 SSELTQAPSVTVSPGDTARIACSGPPLATRYCYWYRQK SGQAPVLIIFRDRQFSSGVSGRFSSSQSGSTVTLTIRD VRVEDEADYYCQSSDTSDSYKMFGGGTKLTVL
CDR1 54 PLATRY
CDR2 55 RDR
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Nome SEQ ID Sequência
CDR3 56 QSSDTSDSYKM
354BG419 IgH 57 QVQLRESGPGLVKPSETLSLSCDVFGDSRPSDHSWTWV RQPPGKALEWIGDIHYNGDKTYNPSLRGRVKIDVDRST HRFSLTLNSL TAADT GMY FCARNVIRVFGVISLGEWFH YGMDVWGPGTAVTVS S
CDR1 58 GDSRPSDHS
CDR2 59 IHYNGDK
CDR3 60 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
354BG419 IgL 61 SSELTQAPSVSVSPGQTARIACSGPPLASRYTYWYRQK PGQAPVLIIFRpRQFPSGVSGRFSASKSGTTGTLTIRD VQAEDEGDYYCQSSDTSDSYKMFGGGTTLTVL
CDR1 62 PLASRY
CDR2 63 RDR
CDR3 64 QSSDTSDSYKM
354BG426 IgH 65 QVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWV RQSPGKALEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVKLEVDTSS NRFFLKMTSL TVAD T GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFH YGMDVWGQGTAITVS P
CDR1 66 GDSRPSDHS
CDR2 67 IHYGGDI
CDR3 68 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG426 IgL 69 SSELTQAPSVTLSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQK PGQAPVLIIFRpRQFSSGISGRFSSSQSGTTVTLTIRD VRVEDEADYYCQSSDNSDSFKMFGGGTKLTVL
CDR1 70 PLASRY
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Nome SEQ ID Sequência
CDR2 71 RDR
CDR3 72 QSSDNSDSFKM
Tabela 1. Sequências das Variantes de BG18
SEQ ID ΙΗΒΙΙΙΪΙΪΙΪ Sequência
BGlIgH 73 AEQLVESGGGLVPPGRSLRLSCSASGFYFPDYAMA.WVR QAPGQGLQWVGFMRGWAYGGSAQFAAFAVGKFAISRDD GRNWYLDVKNPTFEDTGVYFCAREQRNKDYRYGQEGF GYSYGMDVWGRGTTVWS T
CDR1 74 GFYFPDYA
CDR2 75 MRGWAYGGSA
CDR3 76 EQRNKDYRYGQEGFGYSYGMDV
BG1 IgL 77 DIHMTQSPVSLSASVGDRVTITCRASHFIANYVNWYQQ KPGKAPTLLIFESSTLQRGVPSRFSAYGDGTEFTLSIN T L Q PE D FAS YICQQSHSPPVTFGAGTRVDQK
CDR1 78 HEIANY
CDR2 79 ESS
CDR3 80 QQSHSPPVT
BG22 IgH 81 EERLVESGGGLVPPGRSLRLSCSAFDFYFPpYAMAWVR QAPGKGLEWIGFIRGWAYGQAAQYGKSASGRMTISRDD S RRWYLDIKSPIEEDT GAY FCAREQRGGDGRYSGDGF GYPYGMDVWGRGTMVTVSA
CDR1 82 DFYFPDYA
CDR2 83 IRGWAYGQAA
CDR3 84 EQRGGDGRYSGDGFGYPYGMDV
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Nome SEQ ID Sequência
BG22 IgL 85 DILMTQSPVSLSASIGERITITCRASHFIANYVNWYQQ RPGKAPKLLIFQSWTLNRGIPSRFSGYGDGTEFTLSIS ALQSEDFGTYICQQSHSPPLSFGGGTRVDQT
CDR1 86 HFIANY
CDR2 87 QSW
CDR3 88 QQSHSPPLS
BG47 IgH 89 EERLVESGGGLVPPGRSLRLSCSAFDFYFPDYAMAWVR QAPGRALEWIGFIRGWAYGQSAQYGKSASGRMTISRDD S RRWYLDIKSPTHEDT GVY ECAREQRGANGRYGGDGF GYSYGMDVWGRGTMVSVSA
CDR1 90 DFYFPDYA
CDR2 91 IRGWAYGQSA
CDR3 92 EQRGANGRYGGDGFGYSYGMDV
BG47 IgL 93 DIQMTQSPFTLSASVGERVTITCRASHFIANYVNWYQQ RPGRAPKLLIFESSTLNRGVPSRFSGSGDGTEFTLSIS ALQSEDFATYICQQSHSPPVSFGGGTRVDQT
CDR1 94 HFIANY
CDR2 95 ESS
CDR3 96 QQSHSPPVS
Tabela 2. Sequências das Variantes de BG1
[0051] Um experiente na matéria apreciará que as regiões determinantes de complementariedade (CDRs) da maioria dos anticorpos, por exemplo, NC37, BG1, incluem todas as variantes de BG1, e BG18, incluindo todas as variantes de BG18, determinam em grande escala a atividade biológica dos anticorpos, formando o parátopo no anticorpo, com o CDRH3
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48/152 possuindo o caráter mais distintivo. Consequentemente, os anticorpos da presente invenção podem compreender NC37, suas CDRs, BG1, suas CDRs e BG18, e suas CDRs, incluindo todas as variantes de NC37, BG1, e BG18 e suas respectivas CDRs. Um experiente na matéria também perceberá que os anticorpos da presente invenção podem conter substituições conservativas, incluídas nas CDRs, e ainda estarem dentro do escopo da invenção. Consequentemente, algumas concretizações da presente invenção são direcionadas para anticorpos e porções de ligação de seus antígenos, expressando as CDRs listadas das Tabelas 1 e 2.
[0052] Por exemplo, algumas concretizações da presente invenção são direcionadas para anticorpos ou porções de ligação de seus antígenos, tendo uma cadeia pesada que compreende uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89, ou um certo grau de homologia com uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e quaisquer intervalos intervenientes destes. Uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89 podem ter substituições conservativas. Algumas concretizações da presente invenção são direcionadas para anticorpos ou porções de ligação de seus antígenos, tendo uma cadeia leve que compreende uma ou mais das SEQ ID Nos: 5, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93, ou um certo grau de homologia com uma ou mais das SEQ ID Nos: 55, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93, por exemplo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e qualquer intervalo interveniente destes.
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Uma ou mais das SEQ ID Nos: 5, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93 podem ter substituições conservativas.
[0053] As cadeias pesadas de IgG têm tipicamente cerca de 400 a cerca 600 aminoácidos de tamanho, mais tipicamente 450 a cerca de 550 aminoácidos. A região variável de cada cadeia pesada, independentemente da classe de anticorpo, é tipicamente cerca de 100-140 aminoácidos de comprimento, mais tipicamente cerca de 110-130 aminoácidos. As cadeias leves são tipicamente cerca de 210-220 aminoácidos de comprimento, mais tipicamente 211-217. A região variável das cadeias leves tem tipicamente cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento.
[0054] Algumas concretizações da presente invenção são direcionadas para anticorpos ou porções de ligação de seus antígenos, tendo uma ou mais CDRs dentro da cadeia pesada que compreende uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 1820, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92 ou um certo grau de homologia com uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92, por exemplo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e quaisquer intervalo interveniente destes. Uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84, e 90-92 pode ter substituições conservativas.
[0055] Algumas concretizações da presente invenção são direcionadas para anticorpos ou porções de ligação de seus antígenos, tendo uma ou mais CDRs dentro da cadeia leve que compreende uma ou mais das SEQ ID Nos: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88, e
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94-96 ou um certo grau de homologia com uma ou mais das SEQ ID Nos: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 6264, 70-72, 78-80, 86-88, e 94-96, por exemplo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e qualquer intervalo interveniente destes. Uma ou mais das SEQ ID Nos: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88, e 94-96 podem ter substituições conservativas. [0056] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser constituídos de porções de ligação de antígeno, por exemplo CDRs, de diferentes bNabs individuais, incluindo, mas não limitado para estes bNabs da presente invenção. Puramente a título de exemplo, derivado manipulado pode compreender uma cadeia leve de um dos NC37, BG1, ou BG18, incluindo guaisquer variantes, e uma cadeia pesada de um bNab diferente, incluindo um de NC37, BG1, ou BG18, incluindo quaisquer variantes. Ou um derivado modificado pode compreender uma cadeia leve de uma variante de BG18 e uma cadeia pesada de outro variante de BG18. Um experiente na matéria reconhecerá que os métodos de produção de anticorpo recombinante permitem um número significativo de anticorpos recombinantes, cada um dos quais é expressamente considerado como estando dentro do escopo da presente divulgação. Consequentemente, os bNabs da presente invenção podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como estes descritos na Patente U.S. No. 4,816,567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser prontamente isolado e sequenciado, usando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídeos, que são capazes de ligação especificamente para genes que codificam
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51/152 as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murinos). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transíectados em células hospedeiras, tais como células COS simian, células de ovário de hamster Chinês (Chinese Hamster Ovary - CHO), ou células de mieloma que não produzem de outra forma proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpo monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. 0 DNA também pode ser modificado, por exemplo, por ligação covalente para a sequência que codifica imunoglobulina da totalidade ou parte da sequência que codifica para um polipeptídeo de não imunoglobulina. Um tal polipeptídeo de não imunoglobulina pode ser substituído por domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode ser substituído por domínios variáveis de um local de combinação de antígeno de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.
[0057] Uma vez produzidos, recombinantemente ou de outro modo, os anticorpos anti-HIV-1 podem ser purificados ou isolados, de modo que os anticorpos sejam substancialmente isentos de, por exemplo, qualquer soro, sobrenadante, ou outras culturas celulares ou materiais relacionados. Os métodos de purificação de anticorpos são conhecidos na matéria, e podem incluir enriquecimento seletivo ou métodos de isolação específica. Por exemplo, purificação por afinidade pode ser usada, tal como afinidade específica de classe. Os métodos de fracionamento podem também ser empregados no início para ajudar a isolar o subconjunto de proteínas de amostra que incluem imunoglobulinas. Tipicamente, a afinidade específica do antígeno é aplicada
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52/152 para isolar os anticorpos que estão ligados ao antígeno. Os anticorpos podem então ser combinados com um transportador, tampão, diluente, solvente e/ou conservantes etc., que servem para criar composições de anticorpo anti-HIV-1 aceitável farmaceuticamente.
[0058] Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Os métodos para preparar anticorpos monovalentes são bem conhecidos na matéria. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é geralmente truncada em qualquer ponto da região Fc, de modo a impedir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácido, ou são eliminados de modo a impedir a reticulação. Os métodos in vitro são também adequados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente, fragmentos Fab, pode ser realizada, utilizando técnicas de rotina conhecidas na matéria.
[0059] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos, utilizando várias técnicas conhecido na matéria, incluindo biblioteca de apresentação de fago [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) ] . As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpo humano monoclonais (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, anticorpo humanos podem ser produzidos pela introdução de
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53/152 loci da imunoglobulina humana em animais transgênicos por exemplo, ratos nos quais os genes da imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativadas. Após o desafio, observa-se a produção de anticorpo humano, que se assemelha ao que é visto em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo genético, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e nas seguintes publicações cientificas: Marks et al. , Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al. , Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
[0060] Algumas concretizações da invenção são direcionadas para vetores e sistema de vetores, contendo sequência de nucleotídeos que codificam para as regiões variáveis, incluindo, mas não limitado para CDRs dos anticorpos antiHIV-1 da presente invenção, por exemplo NC37, BG1, e BG18, incluindo guaisquer variantes, e porções de ligação de seus antígenos. O vetor pode ser, por exemplo, mas não necessariamente, um plasmídeo; outros vetores recombinantes são conhecidos na matéria e podem incluir, por exemplo vetores de fago, tais como um vetor de fago λ, outros vetores virais, tais como vetor adenoviral não replicante, cosmídeos, e/ou cromossomas artificiais. Um sistema de vetores pode ou não ser indutível separadamente, isto é, ter diferentes elementos promotores e/ou repressores. Comum para
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54/152 a maioria de vetores construídos, que são a origem de replicações, locais de multiclonagem, e marcadores selecionáveis, de modo que um vetor (incluindo sistemas de vetores, por exemplo múltiplos plasmídeos) contenha um tal sistema, serão considerados abrangidos pelo escopo desta invenção. Está dentro do âmbito de um experiente na matéria derivar seguência de ácido nucleicos de uma dada sequência de peptídeo e cloná-las em um sistema de escolha. Por conseguinte, algumas concretizações da presente invenção
está direcionada para um vetor ou sistema de vetores,
contendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos,
codificando uma ou mais das SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 13, 17, 21,
25, 29, 33, 37, 41 , 45, 49, 53, 57, 61, 65, 73, 77, 81, 85,
89, e 93. Em algumas concretizações, a presente invenção é direcionada para um vetor ou sistema de vetores, contendo uma ou mais sequência de ácidos nucleicos, codificando um ou mais CDRs de uma ou mais cadeias pesadas e/ou leves de um ou mais dos anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção, por exemplo, sequência de nucleotídeo ou sequências que codificam para uma ou mais das SEQ ID Nos: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 42-44, 4648, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92, e 94-96 e combinações das mesmas. Estes nucleotídeos que codificam as cadeias pesadas/leves e/ou CDRs podem ter substituições conservativas e para aquelas que codificam as CDRs, independentemente dessas substituições conservativas, podem partilhar um certo grau de homologia (por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) com as sequências de
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55/152 nucleotídeos. 0 vetor ou sistema de vetores da presente invenção pode ser introduzido em uma um ou mais células (isto é, as células são transformadas com o vetor), e tais meios são conhecidos na da matéria.
Formulações Farmacêuticas e Distribuição
[0061] Uma concretização da presente invenção é direcionada para composições farmacêuticas, compreendendo pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou sua porção de ligação de antígeno da presente invenção, bem como os seus métodos de utilização no tratamento de um paciente na sua necessidade. O paciente pode ter uma infecção latente ou ativa por HIV-1. Os anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de antígenos do mesmo utilizadas nestas composições e métodos podem ser qualquer anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno da presente invenção, mas de particular utilidade são os anticorpos anti-HIV ou porção de ligação de seus antígenos, que compreendem BG18 ou variantes, incluindo variantes produzidas recombinantemente, e/ou derivados modificados dos mesmos.
[0062] Um anticorpo anti-HIV-1 aceitável farmaceuticamente ou porções de ligação de antígenos desta composição adequadas para administração do paciente conterá uma quantidade eficaz do anticorpo anti-HIV-1 ou anticorpos ou porções de ligação de antígenos desta formulação que retenha a atividade biológica ao mesmo tempo que promove a máxima estabilidade durante a armazenagem dentro de um intervalo de temperatura aceitável. As composições farmacêuticas podem também incluir, dependendo da formulação desejada, diluentes farmaceuticamente aceitáveis, veículos farmaceuticamente
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56/152 aceitáveis e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, ou quaisquer veículos comumente usados para formulação de composições farmacêuticas para administração animal ou humana. 0 diluente é selecionado, de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, solução soro fisiológico tamponada com fosfato, soluções do Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. A quantidade de um excipiente que é útil na composição ou formulação farmacêutica desta invenção é uma quantidade que serve para distribuir uniformemente o anticorpo através da composição, de modo a poder ser uniformemente disperso, quando é administrado para um indivíduo na sua necessidade. Pode servir para diluir o anticorpo para uma concentração que forneça os desejados resultados paliativos ou curativos benéficos, ao mesmo tempo minimiza quaisquer efeitos colaterais adversos que possam ocorrer a partir de uma concentração muito elevada. Pode também ter um efeito preservativo. Assim, para anticorpos que tenha uma atividade fisiológica elevada, mais do excipiente será empregado. Por outro lado, para qualquer ingrediente(s) ativo(s) que exiba uma atividade fisiológica menor, uma quantidade menor do excipiente será aceitável
[0063] A composição aceitável farmaceuticamente pode estar na forma líquida ou na forma sólida. Uma formulação sólida é geralmente, mas não necessariamente, liofilizada e colocada em solução antes da administração para dosagem única ou múltiplas. As formulações não devem ser expostas para temperatura extrema ou pH, de modo a evitar desnaturação termal. Assim, é essencial formular uma composição de
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57/152 anticorpo da presente invenção dentro de um intervalo de pH biologicamente relevante. Uma solução tamponada para manter um intervalo de pH adequado durante armazenagem é muitas vezes necessário, especialmente para formulações líquidas armazenadas por períodos mais longo de tempo entre a formulação e a administração. Tipicamente, ambas as formulações líquida e sólida requerem armazenagem a temperaturas mais baixas (usualmente 2-8°C.), de modo a manter a estabilidade por períodos longos. As composições de anticorpo, especialmente formulações líquidas, podem conter um bacteriostato para prevenir ou minimizar proteólise durante a armazenagem, incluindo, mas não limitado para concentrações eficaz (usualmente <1% p/v) de álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutanol, metilparabeno e/ou propilparabeno. Um bacteriostático pode ser contraindicado para alguns pacientes. Portanto, uma formulação liofilizada pode ser reconstituída em uma solução, contendo ou não contendo tal componente. Componentes adicionais podem ser acrescentados a uma formulação de anticorpo líquida ou sólida tamponada, incluindo, mas não limitado para açúcares como um crioprotetor (incluindo, mas não necessariamente limitado para hidrocarbonetos polihidroxi, tais como sorbitol, manitol, glicerol e dulcitol e/ou dissacarídeos, tais como sacarose, lactose, maltose ou trealose) e, em alguns casos, um sal relevante (incluindo, mas não limitado para NaCI, KC1 ou LiCl). Tais formulações de anticorpo, especialmente formulações líquidas classificadas para armazenagem de longo período, irá basear-se em um intervalo útil de osmolaridade
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58/152 total para promover estabilidade a longo prazo à temperatura de 2-8°C., ou superior, ao mesmo tempo que torna a formulação útil para injeção parenteral. Por exemplo, mas não necessariamente, um intervalo eficaz de osmolaridade total (o número total de moléculas em solução) pode ser de cerca de 200 mOs/1 a cerca de 800 mos/1. Será evidente que a quantidade de um crioprotetor, tais como sacarose ou sorbitol, dependerá da quantidade de sal na formulação para que a osmolaridade total da solução permaneça dentro de um intervalo apropriado. Por tanto, uma formulação isenta de sal pode conter, mas não necessariamente, de cerca de 5% a cerca de 25% de sacarose.
[0064] Alternativamente, uma formulação a base de sorbitol isenta de sal pode conter, mas não necessariamente, sorbitol dentro de um intervalo de cerca de 3% a cerca de 12%. As formulações isentas de sal podem justificar o aumento dos níveis dos respectivos crioprotetores, a fim de manter os níveis efetivos de osmolaridade. Estas formulações também podem conter um cátion divalente (incluindo, mas não necessariamente limitado para MgCÍ2, CaCÍ2 e MnCÍ2) ; e um surfactante iônico não 32 (incluindo mas não necessariamente limitado para Polisorbato-80 (Tween 80®), Polisorbato-60 (Tween 60®), Polisorbato-40 (Tween 40®) e Polisorbato-20 (Tween 20®), éteres alquino de polioxietileno, incluindo, mas não limitado para Brij 58®, Brij 35®, assim como outros tais como Triton X-100®, Triton X 114®, NP40®, Span 85 e a série Pluronica de surfactantrs não iônico (por exemplo, Pluronic 121)) . Qualquer combinação de tais componentes, incluindo provável inclusão de um bacteriostático, pode ser
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59/152 útil para preencher as formulações, contendo anticorpo da presente invenção. Os anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos da presente invenção pode também ser um derivado químico, que descreve anticorpos que contenham porções químicas adicionais que não são normalmente uma parte da molécula de imunoglobulina (por exemplo, peguilação). Tais porções podem melhorar a solubilidade, meia vida, absorção etc. da molécula de base. Alternativamente, as porções podem atenuar efeitos colaterais indesejáveis da molécula de base ou diminuir a toxicidade da molécula de base.
[0065] Para o tratamento ín vivo, ao paciente é administrado ou fornecido uma formulação farmacêutica, incluindo pelo menos um anticorpo anti-HIV ou porção de ligação de seu antígeno da presente invenção. Quando utilizado para terapia ín vivo, os anticorpos anti-HIV ou porção de ligação de seus antígenos da invenção são administrados para o paciente em quantidades terapeuticamente eficazes (isto é, quantidades que eliminam ou reduzem a carga viral total, como descrito no Exemplo 1 infra) . Os anticorpos são administrados para um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, com um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. Os anticorpos ou porção de ligação de seus antígenos pode ser administrado de forma parenteral, quando possível, no local da célula alvo, ou intravenosamente. Em algumas concretizações, o anticorpo é
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60/152 administrado por administração intravenosa ou subcutânea. As composições terapêuticas da invenção podem ser administradas para um paciente ou sujeito sistemicamente, de forma parenteral, ou localmente. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e a melhora da doença são prontamente mensuráveis por procedimentos de rotina familiar para um médico.
[0066] Para a administração de forma parenteral, os anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antigenos podem ser formulados em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão) em associação com um transportador parenteral aceitável farmaceuticamente. Exemplos de tais transportadores incluem, mas não são limitados, água, soro fisiológico, solução do Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano 5%. Os transportadores não aquoso incluem, mas não são limitados para óleos fixos e oleato de etilo. Os lipossomas podem ser utilizados como transportadores. O transportador pode conter pequenas quantidades de aditivos, tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e estabilidade química, tais como, por exemplo, tampões e conservantes.
[0067] Os anticorpos anti-HIV-1 ou porção de ligação de seus antigenos da presente invenção podem ser administrados para o hospedeiro de qualquer modo, estratégia e/ou combinação disponível na matéria em quantidades suficientes para oferecer um tratamento terapêutico contra HIV-1. Estas composições podem ser fornecidas para o indivíduo através de uma variedade de vias conhecidas na matéria, especialmente vias parenterais, incluindo mas de modo nenhum limitadas
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61/152 para vias parenteral, tais como intravenosa (IV), intramuscular (IM); ou administração subcutânea (SC), com IV administração sendo o normal dentro da matéria de administração de anticorpo terapêutico. Estas composições podem ser administradas como doses separadas ou múltiplas (isto é, administração do anticorpo em tempos alternados, mantendo a condição estéril da formulação através do regime de tratamento).
[0068] A dose e o regime de dosagem dependem de uma variedade de fatores facilmente determinados por um médico, tais como
a natureza da infecção, por exemplo, o seu índice
terapêutico, o paciente, e a história do paciente.
Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um
anticorpo é administrada a um paciente. Em algumas
concretizações, a quantidade de anticorpo administrado está no intervalo de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal paciente, e qualquer intervalo entre eles. Dependendo do tipo e severidade da infecção, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg do peso corporal (por exemplo, cerca de 0,1-15 mg/kg/dose) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração para o paciente seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Os anticorpos anti-HIV-1 podem ser administrados com taxas de volume relativamente baixas, por exemplo, mas não necessariamente de cerca de 0,001 ml/dia a 10 ml/dia, de modo a minimizar distúrbio ou trauma do tecido perto do local em que a formulação é liberada. A formulação pode ser liberada a uma taxa de, dependendo do(s) agente(s) biológico(s) específico(s), em uma dose baixa, por exemplo,
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62/152 de cerca de 0,01 pg/hora ou 0,1 pg/hora, 0,25 pg/hora, 1 pg/hora, geralmente até cerca de 200 pg/hora, ou a formulação é administrada a uma taxa de volume baixa por exemplo, uma taxa de volume de cerca de 0,001 ml/dia a cerca de 1 ml/dia, por exemplo, 0,01 microgramas por dia até cerca de 20 miligramas por dia. A dosagem depende de vários fatores, tais como potência, biodisponibilidade, e toxicidade do ingrediente ativo utilizado (por exemplo, os anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de antígenos do mesmo) e os requisitos do sujeito. O progresso desta terapia é prontamente monitorado por métodos e ensaios convencionais e baseado em critérios conhecidos do médico ou outras pessoas competentes na matéria. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e melhora da doença são prontamente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares para um médico.
[0069] Concretizações específicas para transportadores de administração para anticorpos anti-HIV-1 da presente invenção incluem microesferas de PLGA, como discutido neste documento e como os adicionalmente conhecidos na matéria, bem como transportadores não degradáveis à base de polímeros, compreendendo poli (etileno-co-acetato de vinil; PEVAc) . Adicionalmente, a liberação controlada e a distribuição localizada de produto terapêutica baseado em anticorpo são revistas em Grainger, et al. , 2004, Expert Opln. Blol. Ther. 4(7) : 1029-1044) . Microcápsulas adequadas capazes de encapsular o anticorpo pode também incluir microcápsulas de hidroximetil celulose ou gelatina e microcápsulas de polimetil metacrilato preparadas por técnicas de
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63/152 coacervação, ou por polimerização interfacial. Ver publicação PCT WO 99/24061 intitulada Method for Producing IGF-1 Sustained-Release Formulations, em que uma proteína é encapsulada em microesferas de PLGA, esta referência que é incorporada inteiramente neste documento por referência. Em adição, pode também ser utilizada micros emulsões ou sistemas de distribuição de fármaco coloidal, tais como lipossomas e microesferas de albumina. Outras composições de liberação prolongada preferidas empregam um bioadesivo para reter o anticorpo no local de administração. Como notado acima, a formulação de liberação prolongada pode compreender um polímero biodegradável no qual o anticorpo está disposto, o que pode proporcionar uma liberação não imediata. Dispositivos não injetáveis podem ser descritos neste documento como um implante, implante de depósito farmacêutico, implante de depósito, depósito não injetável ou algum termo similar. Os implantes de depósito comuns podem incluir, mas não são limitados para dispositivos de polímero sólida biodegradável e não biodegradável (tais como um polímero estendido ou dispositivo em forma de haste coaxial), bem como numerosos sistemas de bomba também conhecidos na matéria. Os dispositivos injetáveis são divididos em injeções em bolus (liberação e dissipação do fármaco subsequente à injeção), e injeções de depósito ou repositório, que fornecem um reservatório de armazenagem no local de injeção, permitindo a liberação prolongada do agente biológico ao longo do tempo. Um implante de depósito pode ser ligado cirurgicamente para o ponto de distribuição, de modo a proporcional um reservatório adequado para a liberação
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64/152 prolongada do anticorpo ao longo do tempo. Tal dispositivo será capaz de transportar a formulação do fármaco em quantidades tais como terapeuticamente ou profilaticamente requerida para o tratamento durante o período préselecionado. 0 implante de depósito pode também fornecer proteção para a formulação contra a degradação por processos corporais (tais como proteases) durante o tempo de tratamento. Como é conhecido na matéria, o termo liberação prolongada refere-se à liberação gradual (contínua ou descontínua) de tal agente da matriz de polímero em bloco durante um período de tempo prolongado. Independentemente do dispositivo específico, a liberação prolongada da composição resultará em concentrações locais biologicamente eficazes do anticorpo. Uma liberação prolongada do(s) agente(s) biológico(s) será por um período de um único dia, vários dias, uma semana ou mais; mas provavelmente por um mês ou mais, ou até cerca de seis meses, dependendo da formulação. Os polímeros naturais ou sintéticos conhecidos na matéria serão úteis como um implante de depósito, devido às suas características, tais como cinética, degradação versátil, segurança e biocompatibilidade. Estes copolímeros podem ser manipulados para modificar a farmacocinética do ingrediente ativo, proteger o agente do ataque enzimático, bem como degradar ao longo do tempo no local de fixação ou injeção. 0 artesão compreenderá que existem amplos ensinamentos na matéria para manipular as propriedades destes copolímeros, incluindo o respectivo processo de produção, catalisadores utilizados e peso molecular final do implante de depósito ou injeção de depósito de liberação
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65/152 prolongada. Os polímeros naturais incluem, mas não são limitados para proteínas (por exemplo, colágeno, albumina ou gelatina); polissacarídeos (celulose, amido, alginatos, quitina, quiitosana, ciclodextrina, dextrana, ácido hialurônico) e lipídeos. Os polímeros sintéticos biodegradáveis podem incluir, mas não são limitados para vários poliésteres, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al. , 1983, Biopolymers 22:547556), poliláticos ( [PolyLActides - PLA] ; Patente U.S. No. 3,773,919 e EP 058,481), poliglicolate polilactato (PolyLactate polyGlycolate - PLGA) tais como polilactide-coglicolide (ver, por exemplo, Patente U.S. Nos. 4,767,628 e 5, 654,008), poliglicólido (PolyGlycolide PG) , polietileno glicol (PolyEthylene Glycol - PEG) conjugados de poli(αácidos hidroxi), poliortoésteres, poliaspirinas, polifosfagones, vinilpirrolidona, polivinil álcool (PVA), PVA-g-PLGA, PEGT-PBT copolímero (poliativo), metacrilatos, poli(N-isopropilacrilamida), PEO-PPO-PEO (plurônicos), PEOPPO-PAA copolímeros, PLGA-PEO-PLGA, poliortoésteres (POE), ou quaisquer combinações dos mesmos, como descrito acima (ver, por exemplo, Patente U.S. No.6,991,654 e Patente U.S.
No.20050187631, cada uma das quais está incorporada inteiramente neste documento por referência, hidrogéis (ver, por exemplo, Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105, acetato de etileno-vinil não degradável (por exemplo discos de etileno vinil acetato e poli(etileno-co-acetato de vinil)), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradável tais como o Lupron Depot™, ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP
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133,988), gel de ácido hialurônico (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 4,636,524), suspensões de ácido algínico, poliortoésteres (POE), e semelhantes. Polilactídeo (PLA) e seus copolímeros com glicolídeo (PLGA) são bem conhecidos na matéria desde a comercialização do Lupron Depot™, aprovado em 1989 como a primeira formulação parenteral de liberação prolongada, utilizando polímeros de PLA. Exemplos adicionais de produtos que utilizam PLA e PLGA como excipientes para alcançar liberação prolongada do ingrediente ativo incluem Amidox (PLA; doença periodontal), Nutropin Depot (PLGA; com hGH), e o câncer de Trelstar Depot (PLGA; próstata). Outros polímeros sintéticos incluem mas não são limitados para poli (c-caprolactona), poli3-hidroxibutirato, poli(3-ácido málico) e poli(dioxanona)]; polianidridos, poliuretano (ver WO 2005/013936), poliamidas, ciclodestrans, poliortoésteres, álcoo n-vinil 1, polietileno óxido/polietileno tereftalato, polifosfato, polifosfonato, poliortoéster, policianoacrilato, polietilenoglicol, polidihidropiran, e poliacital. Os dispositivo não biodegradáveis incluem mas não são limitados para vários derivados de celulose (carboximetil celulose, acetato de celulose, acetato de propionato de celulose, etil celulose, hidroxipropil metil celulose) implantes à base de silicone (polidimetilsiloxano) , polímeros acrílicos, (polimetacrilato, polimetilmetacrilato, polihidroxi(etilmetilacrilato), bem como polietileno-co(vinil acetato), poloxâmero, polivinilpirrolidona, poloxamina, polipropileno, poliamide, poliacetal, poliéster, poli etileno-clorotrifluoretileno, politetrafluoretileno
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67/152 (PTFE ou Teflon™), borracha de butadiene estireno, polietileno, polipropileno, polifenileno óxidopoliestirene, poli-a-cloro-p-xileno, polimetilpenteno, polisulfona e outros polímeros bioestável relacionados. Transportadores adequados para formulações de depósito de liberação prolongada incluem, mas não são limitados para microesferas, filmes, cápsulas, partículas, géis, revestimentos, matrizes, bolachas, pílulas ou outras composições de distribuição farmacêutica. Exemplos de tais formulações de liberação prolongada são descritos acima. Ver também patentes U.S. Nos. 6,953,593; 6,946,146; 6,656,508; 6,541,033; e 6,451,346, os conteúdos das quais são incorporados neste documento por referência. A forma de dosagem deve ser capaz de transportar a formulação de fármaco em quantidades e concentração, tais como requerida para o tratamento terapeuticamente durante o período préselecionado, e deve fornecer proteção suficiente para a forma de formulação da degradação pelos processos corporais durante o tratamento. Por exemplo, a forma de dosagem pode ser rodeada por um exterior feito de um material que tenha propriedades para proteger contra a degradação de processos metabólicos e o risco de, por exemplo, vazamento, rachadura, quebra ou distorção. Isto pode prevenir a expulsão do conteúdo da forma de dosagem de maneira descontrolada sob esforços a que seria submetido durante o uso, por exemplo, devido a forças físicas exercidas sobre o dispositivo de liberação do fármaco como resultado de articulação normal da junção e outros movimentos pelo sujeito ou por exemplo, em dispositivo convectivos de administração de fármaco, forças
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68/152 físicas associadas à pressão gerada dentro do reservatório. 0 reservatório de fármaco ou outro meio para armazenar ou conter o fármaco deve também ser de um material que evite reações não intencionais com a formulação de agente ativo, e é preferencialmente biocompatível (por exemplo, quando a forma de dosagem é implantada, é substancialmente não reativa com relação ao corpo do sujeito ou fluidos corporais). Geralmente, os anticorpos anti-HIV-1 são administrados para um indivíduo por pelo menos 12 horas até pelo menos uma semana, e mais provavelmente através de um implante projetado administrar um fármaco por pelo menos 10, 20, 30, 100 dias ou pelo menos 4 meses, ou pelo menos 6 meses, 12 meses, 24 meses ou mais, como requerido.
[0070] Em algumas concretizações, o anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de antígenos do mesmo da presente invenção podem ser coadministrado com um ou mais tratamentos adicionais para HIV-1, por exemplo coadministrado com um ou mais agente de HIVs (por exemplo, inibidores de transcriptase reversa não nucleosídeos (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NNRTIs), inibidores de transcriptase reversa nucleosídeos (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NRTIs), inibidores de protease (Protease Inhibitors - Pls), inibidores de fusão, antagonistas de CCR5/inibidores de entrada, inibidores de transferência de cadeia integrase (Integrase Strand Transfer Inhibitors - INSTIs), e combinações dos mesmos) e/ou adicional anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos, incluindo, mas não limitado para adicionais anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos
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69/152 da presente invenção. Com mostrado no Exemplo 1 infra, uma administração 1:1:1 de NC17, BG1, e BG18 foi eficaz para reduzir a carga viral in vivo. Apesar de não quererem estar limitado pela teoria, os dados indicam que os bNAbs monoclonais e níveis muito baixos de vírus sensíveis à neutralização coexistem em EB354, sugerindo que os anticorpos contribuem para o controle de elite neste indivíduo. De acordo com outra concretização, a presente invenção fornece uma vacina passiva ou composições farmacêuticas contendo pelo menos um anticorpo anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos da invenção e um transportador aceitável farmaceuticamente. De acordo com uma concretização, a vacina ou composições farmacêuticas é uma composição, contendo pelo menos um anticorpo descrito neste documento e um excipiente aceitável farmaceuticamente. A vacina pode incluir uma pluralidade de anticorpos tendo as características descritas neste documento em qualquer combinação e pode adicionalmente incluir outros anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos. A vacina passiva pode compreender um ou mais conservantes, transportadores, e/ou excipientes aceitáveis farmaceuticamente, que são conhecidos na matéria. Em outras concretizações, a presente invenção fornece uma vacina ativa ou composições farmacêuticas contendo o HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico. Se HIV-1 for usado, pode ser atenuado. Pode ser morto pelo calor. Se forem utilizados fragmentos antigênicos, pode ser preferível, embora não necessário, utilizar glicoproteína gpl20, embora os fragmentos de glicoproteína gp!20 possam ser aceitáveis.
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[0071] As presentes composições podem ser utilizadas em uma composição imunogênica para imunizar um animal. Tais composições imunogênicas de acordo com a invenção podem ser utilizadas para a preparação de uma vacina. Preferencialmente, é produzida uma vacina profilática e/ou terapêutica. Assim, dentro do escopo desta invenção está uma composição imunogênica ou de vacina que contém um transportador aceitável farmaceuticamente e uma quantidade eficaz de um antigeno como está supra descrito. Os transportadores utilizados na composição podem ser selecionados com base no modo e via de administração, e na prática farmacêutica padrão. A composição pode também conter um adjuvante. Exemplos de um adjuvante incluem uma toxina da cólera, Escherichia coii enterotoxina termolábil, lipossoma, DNA não metilado (CpG) ou qualquer outro complexo imuno estimulante inato. Vários adjuvantes que podem ser utilizados para adicionalmente aumentar ainda mais a resposta imunológica dependem da espécie hospedeira e incluem adjuvante de Freund (completos e incompletos), géis minerais, tais como alumínio, hidróxido, substâncias tensoativas, tais como lisolecitian, polióis plurônicos, polianiões, peptideos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa do buraco da fechadura (keyhole limpet hemocyanin), e dinitrofenol.
[0072] Uma formulação de vacina pode ser administrada a um indivíduo per se ou na forma de uma composição farmacêutica ou terapêutica. As composições da invenção e um adjuvante podem ser fabricados por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drágeas,
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71/152 levigação, emulsificação, encapsulação, envolvidos ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional, usando um ou mais transportadores aceitáveis fisiologicamente, diluentes, excipientes ou auxiliareis que facilitam o processamento dos antígenos da invenção em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada dependente da via de administração escolhida.
[0073] Para injeção, as preparações de vacina podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatível, tais como solução de Hanks, solução do Ringer, solução salina tamponada com fosfato, ou qualquer outro tampão de solução salina fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como agente de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, a composição pode estar na forma de pó para constituição com um transportador adequado, por exemplo, água isenta de pirogênicos estéreis, antes da utilização.
[0074] A quantidade de uma composição administrada depende, por exemplo, do antígeno particular na composição, se um adjuvante é coadministrado com o antígeno, o tipo de adjuvante coadministrado, o modo e frequência de administração, e o efeito desejado (por exemplo, proteção ou tratamento), como pode ser determinado por um experiente na matéria. A determinação de uma quantidade eficaz da formulação de vacina para administração está bem dentro das capacidades dos experientes na matéria, especialmente à luz da descrição detalhada fornecida neste documento. Uma dose
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72/152 eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir uma indução de uma resposta imune, utilizando técnicas que são bem conhecidas na matéria. Um especialista na matéria pode prontamente otimizar a administração a todas as espécies animais com base nos resultados descritos neste documento. A quantidade da dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente. Por exemplo, quando utilizado como uma vacina, as formulações de vacina da invenção podem ser administradas em cerca de 1 a 3 doses por um período de 1-36 semanas. A vacinação pode continuar indefinidamente, dependendo das circunstâncias, particularmente com vacinação passiva. Preferencialmente, 1 ou 2 doses são administradas, em intervalos de cerca de 3 semanas a cerca de 4 meses, e as vacinações de reforço podem ser administradas periodicamente a partir de então. Protocolos alternativos podem ser apropriados para animais individuais. Uma dose adequada é uma quantidade da formulação de vacina que, quando administrada como descrito acima, é capaz de aumenta uma resposta imune em um animal imunizado suficiente para proteger o animal de uma infecção por pelo menos 4 a 12 meses. Em geral, a quantidade do antígeno presente em uma dose varia entre cerca de 1 pg a cerca de 100 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg a cerca de 1 mg, e preferencialmente de cerca de 100 pg a cerca de 1 pg. O intervalo de dose adequado variará com a via de injeção e com o tamanho do indivíduo, mas variará tipicamente no intervalo de cerca de 0,1 ml a cerca de 5 ml. Reforços adicionais podem ser dados conforme necessário.
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Kits e Métodos de Diagnóstico
[0075] Uma concretização da presente invenção é direcionada para kits para detecção de HIV-1 presente em uma amostra. Estes kits podem compreender um anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seu antígeno da presente invenção e vários reagentes, por exemplo, reagentes que auxiliam na detecção de ligação entre o anticorpo anti-HIV-1 e um epítopo presente em HIV-1, por exemplo gpl20 e/ou gpl40, ou um fragmento de seu antigênico.
[0076] Os kits podem ser ensaios in vitro, tais como imunoensaios, por exemplo ensaios imunoenzimáticos (Enzyme Immune Ensaios - EIA), ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (Enzyme Linked Immunosorbent Ensaio - ELISA), ELISPOT (ensaio imunoenzimático - enzima-linked immunospot), radioimunoensaios (RadioImmunoEnsaios - RIAs), imunofluorescência, e outros ensaios conhecidos na matéria, incluindo, mas não limitado para Análise de Western Blot e/ou métodos de imunoprecipitação. Os ensaios in vitro podem ser competitivos, ou indiretos, tais como em um ensaio sanduíche, ou pode ser um método de captura anticorpo. Por exemplo, em um ELISA direto, uma solução tamponada de um antígeno, por exemplo uma amostra, contendo HIV-1 ou um fragmento antigênico do mesmo ou uma amostra biológica, contendo ou suspeita de conter HIV-1, é adicionada para um poço de uma placa de microtitulação, por exemplo uma placa de 96 poços. Uma solução de proteína que não reage, por exemplo, albumina sérica bovina ou caseína é então acrescentada ao poço. O anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seus antígenos conjugados com uma enzima de
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74/152 molécula repórter é adicionada, por exemplo conjugada com peroxidase de rábano, embora não seja necessariamente a enzima, como outras enzimas comuns incluem fosfatase alcalina, ou β-D-galactosidase, embora outras enzimas sejam concebíveis e consideradas incorporadas pela presente invenção. Um substrato para a enzima é então adicionado, o que leva para um sinal detectável. Por exemplo, a adição de TMB para peroxidase de rábano resulta em um produto colorido, caso em que o ELISA é um ensaio colorimétrico. Os ELISAs podem ser executados em um formato qualitativo ou quantitativo. Os resultados qualitativos fornecem um resultado positivo ou negativo simples (sim ou não) para uma amostra. 0 ponto de corte entre positivo e negativo é determinado pelo analista e pode ser estatístico. Os ELISAs sanduíche geralmente seguem o seguinte protocolo. A captura do anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de seus antígenos está ligado para (isto é imobilizado) um substrato, por exemplo uma placa de microtiter. A amostra, contendo o antígeno (isto é, amostra contendo HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico, é então acrescentada ao substrato no ponto em que é capturado pelos anticorpos antiHIV-1. 0 substrato é então lavado para remover antígeno não ligado. Um segundo anticorpo anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos são acrescentados, que se ligam a um epítopo diferente no HIV-1, tal como epítopos diferentes do gpl20, ou em antígenos diferentes, tal como gpl40. 0 segundo anticorpo anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos é ligado a uma molécula repórter, por exemplo, uma enzima, embora a molécula repórter possa ser qualquer
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75/152 molécula que conduza para um sinal detectável. A placa pode ser lavada uma segunda vez, e nos casos em que a molécula repórter é uma enzima, um substrato pode ser acrescentado, por exemplo TMB, que resulta em um sinal detectável (também um ensaio colorimétrico). Um terceiro tipo comum de ELISA é o ELISA competitivo. Nestas concretizações, anticorpo antiHIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos não marcado é incubado na presença de uma amostra, contendo antígeno que são então acrescentados a um poço revestido com antígeno. A placa é lavada, de modo a remover anticorpos não ligados. Um anticorpo secundário que é específico para o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo secundário específico para os anticorpos anti-HIV-1. 0 anticorpo secundário está ligado a uma molécula repórter, como descrito neste documento, tais como uma enzima (ou qualquer outra molécula que possa conduzir a um sinal detectável). Alguns ELISAs competitivos utilizam antígenos marcador em vez de anticorpos marcados; quanto menos antígeno na amostra, mais o antígeno marcado é retido e resulta um sinal detectável mais forte.
[0077] Outras formas de ensaios in vitro comuns incluem radioimunoensaios (RIAs). Tipicamente uma quantidade conhecida de um antígeno está ligada a um marcador radioativo, por exemplo 1-125 embora outros sejam adequados para uso, tais como Tc, que é então misturado com uma quantidade conhecida de anticorpo específico para o antígeno, por exemplo anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos. Então, uma amostra, contendo quantidade desconhecida de um antígeno é acrescentada, (por
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76/152 exemplo, uma amostra biológica que contém ou é suspeita de conter HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico) é acrescentada. Este é um competitivo direto para ligação específica; à medida que a concentração de antígeno não marcado é aumentada, a ligação entre os anticorpos anti-HIV1 e o padrão marcado é diminuída o que é diretamente mensurável, medindo a radioatividade. Outros ensaios são conhecidos e uma pessoa com conhecimentos normais na matéria reconheceram prontamente sua aplicabilidade.
[0078] Em algumas concretizações, a invenção é direcionada para um método de detecção HIV-1 ou um fragmento antigênico do mesmo em uma amostra. Tais métodos podem utilizar qualquer dos ensaios descritos neste documento, ou outros que são conhecidos na matéria. Vários dos ensaios descritos neste documento são capazes de quantificar a quantidade de antígeno presente na amostra, e assim, de acordo com algumas concretizações, a presente invenção está direcionada para métodos de quantificação da quantidade de HIV-1 ou fragmento de seus antigênicos presentes em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica.
[0079] Os ensaios contendo anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos da presente invenção podem ou não ser utilizados para fins de diagnóstico. Consequentemente, em algumas concretizações, a invenção é direcionada para métodos de utilização de diagnosticar dos anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos da presente invenção. Devido à especificidade dos anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antígenos da presente invenção, os imunoensaios, contendo anticorpos
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77/152 anti-HIV-1 ou porções de ligação de antigenos do mesmo da presente invenção podem ser suficientes para diagnose um indivíduo como tendo uma infecção ativa ou latente de HIV1. Os anticorpos ou porções de ligação de seus antigenos não necessitam ser restritos a qualquer particular epítopos, desde que os anticorpos ou porções de ligação de seus antigenos utilizados sejam específicos para HIV-1. Por exemplo, em um ensaio sanduíche, o primeiro anticorpo antiHIV-1 ou porções de ligação de seus antigenos podem ligarse a um primeiro epítopo, tal como um gpl20, e o segundo anticorpo anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antigenos (que se liga a uma molécula repórter) pode ligar-se a um segundo epítopo, que pode ou não estar presente no mesmo antígeno. Consequentemente, os kits e os métodos utilizados para detectar ou quantificar a quantidade de HIV-1 ou um fragmento de seu antigênico podem conter BG18, NC37, e BG1, incluindo porções de ligação de seus antigenos, e seriam considerados dentro do escopo desta invenção. Ou, qualquer dos BG18, NC37, e BG1, incluindo porções de ligação de seus antigenos, e qualquer outro anticorpo anti-HIV-1, desde que sejam adequados para incorporação nestes kits/métodos. Será apreciado que os anticorpos anti-HIV-1 ou porções de ligação de seus antigenos utilizados com o propósito de detectar e/ou quantificar HIV-1 presente em uma amostra ou mesmo para fins de diagnóstico não precisam necessariamente ser capazes de amplamente neutralizante HIV-1 para possuir utilidade para tal propósito.
Equivalentes
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[0080] Quando um valor de intervalos é fornecido, entende-se que cada valor interveniente, para o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto declare claramente o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente desse intervalo é englobado dentro da invenção. OS limites superior e inferior deste intervalo menor que podem ser independentemente incluídos nos intervalos estão também englobados dentro da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo declarado. Onde o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluídos ambos os limites incluídos estão também incluídos na invenção.
[0081] Amenos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como normalmente entendido por um especialista na matéria, para qual essa invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes destes descritos neste documento podem também ser utilizados na prática ou como teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas inteiramente neste documento por referência.
[0082] Como utilizado neste documento e nas reivindicações anexadas, as formas singulares um, e e o incluem referências plurais, a menos que o contexto declare claramente o contrário.
[0083] 0 termo cerca de refere-se a um intervalo de valores que não seriam considerados por um especialista na
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79/152 matéria como substancialmente diferentes dos valores da linha de base. Por exemplo, o termo cerca de pode referirse a um valor que esteja dentro de 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% de do valor declarado, assim como valores intervenientes a tais valores declarados.
[0084] As publicações descritas neste documento são fornecidas apenas para a sua divulgação antes da data de apresentação da presente invenção. Nada neste documento é para ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem direito de antedata de tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação que podem precisar ser confirmadas independentemente.
[0085] Cada um dos Pedidos e Patentes citados neste texto, bem como cada documento ou referência, Patente ou literatura não relacionado a Patentes, citadas em cada um dos Pedidos e Patentes (incluindo durante a acusação de cada Patente emitida; documentos citados pelo Pedido), e cada uma dos Pedidos e Patentes PCT e estrangeiras correspondentes e/ou reivindicando prioridade de qualquer uma destes Pedidos e Patentes, e cada um dos documentos citados ou referenciados em cada um dos Pedidos citando documentos, são expressamente incorporados inteiramente neste documento por referência. Mais geralmente, documentos ou referências são citadas neste texto, seja uma Lista de Referência antes das reivindicações; ou no próprio texto; e, cada um destes documentos ou (referências aqui citadas), bem como cada documento ou
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80/152 referência citada em cada uma das referências citadas neste documento (incluindo especificações de fabricantes, instruções etc.), é neste documento expressamente incorporada por referência.
[0086] Os seguintes exemplos não limitativos servem para ilustrar adicionalmente a presente invenção.
EXEMPLOS
Coexistência de Anticorpo HIV-1 Neutralizante Amplamente Potente e Virus Sensíveis a Anticorpos em um Controle Virêmico.
Métodos
Indivíduo infectado com HIV-1 EB354
[0087] A IgG purificada do doador EB354 classificou-se no nível 1% superior para amplitude e potência para neutralização em um coorte de 394 não progressores de longo prazo infectados pelo HIV-1. O doador EB354 foi diagnosticado com o Clade B do HIV-1 em 1986. Ele recebeu tratamento com didanosina e estavudina entre 1995 e 1998, mas não recebeu nenhuma terapia antiretroviral desde aquela época. Tem sido acompanhado clinicamente frequentemente desde 2002 (Tabela 3: HLA A*01:01, 24:02, B*27:05, 57:01, C*01:02, 06:02). A maioria dos indivíduos rapidamente desenvolve anticorpos específico para a estirpe depois de infecção. Esta resposta está associada com a seleção de variantes virais resistentes que em alguns casos provocam bNAbs. No entanto, os indivíduos estudados em detalhe diferem do EB354 e que o desenvolvimento de bNAbs é associado com rápida seleção de vírus de plasma autólogo, gue são resistentes para bNAbs coexistentes. 0 EB 354 é significativo porque estirpes virais sensíveis e
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81/152 resistentes coexistentes com bNAbse e as estirpes resistentes não produzir altos níveis de viremia, porque elas são de alguma forma parcialmente eficaz ou mantidas sob controle por células CD8+ T. Assim os vírus dos plasmas sensíveis a bNAb foram incapazes de escapar da pressão imune neste indivíduo, resultando em bNAb: equilíbrio viral, em que o vírus persiste, mas é incapaz de produzir altos níveis de viremia. 0 EB354 é incomum em ser ambos um controlador de elite e um neutralizador de elite. Os controladores de elite HIV-1 são indivíduos infectados que mantêm baixa cargas virais por muitos anos. Estes indivíduos são menos propensos a transmitir o vírus e mantêm a sobrevivência livre de AIDS a longo prazo. Os alelos HLA alelos B57*01 e/ou B27*05 são encontrados em 85% dos controladores de elite do HIV-1. Estes alelos estão associados com a atividade citotóxica de célula T CD8 melhorada. Em comparação com os progressores virêmicos (isto é, pacientes com cargas virais elevadas), os controladores de elite têm menor probabilidade de desenvolver bNAbs. Independentemente das respostas robustas das Célula T CD8+ que podem ter infecção parcialmente controlada, existiu replicação suficiente de HIV-1 em EB354 para apoiar o desenvolvimento do bNAb e a maturação da afinidade. Como discutido neste documento, os bNAbs que apresentam a atividade neutralizante sorológica no doador EB354 reconhece vários epítopos não sobrepostos.
Data do
diagnóstico 1986
HLA A101,2402 B2705,5701 Cwl02,602
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Data da visita Carga CD4abs CD8abs
24/04/2002 310 957 1406
07/08/2002 653 554
03/12/2002 2520 983 1787
11/03/2004 1035 1323 1634
18/06/2004 171 1231 1753
20/08/2004 467
07/10/2004 182 789
28/02/2005 1048 1227
25/08/2005 < 400 1080
17/11/2005 1665 1551
03/08/2006 < 400
24/10/2006 < 400 744 1132
15/11/2006 206 814
06/04/2007 < 400 564
28/11/2007 < 400 781
17/07/2008 149 815
17/03/2009 107 734
19/02/2010 170 900 1933
10/08/2010 65 1096 1706
13/07/2011 380 795 1512
28/03/2013 414 1127 1809
18/09/2013 547 674 1152
21/07/2014 454 697 1321
17/07/2015 461 605 1224
Tabela 3. Informação Clinica sobre o Doador EB354
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Separação de Célula B e Isolamento de Anticorpo
[0088] A seleção de unicelular de bait+CDl 9+IgG+ células B de PBMCs do doador EB354 foi conduzida como descrito no J. F. Scheid et al. , A method for identification of HIV gpl40 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods 343r 65-67 (2009) As células B de memória foram pré-enriquecidas com anti-CD19 grânulos magnéticos (MACS) e coloradas, usando quatro iscas diferentes: a proteína do núcleo gpl20 2CC como isca, gpl40YU2, uma mistura 1:1 de gpl40g2UG37.8 (Clade A) + gpl40cza79012 (Clades C) e BG505 SOSIP.664. Primers de resgate foram utilizados para amplificar as cadeias pesadas e os genes IgÀ e primers regulares foram utilizados pela cadeia IgK. Todos os produtos PCR foram sequenciados e analisados quanto ao uso do gene Ig, CDR3, e o número de hipermutações somáticas Vh/Vl (IgBLAST e IMGT) . Os produtos de PCR purificados, digeridos foram clonados em vetores de expressão Igyl-, IgK ou IgÀ- humanos como prevíamente descrito no T. Tiller et al. , Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of immunological methods 329, 112-124 (2008) e produzido por transfecção de transiente de expressão plasmideos de IgH, IgK e IgL em células HEK 293-6E em crescimento exponencial como descrito em F. Klein et al., Enhanced HIV-1 immunotherapy by commonly arising antibodies that target virus escape variants. The Journal of experimental medicine 211, 2361-2372 (2014).
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Estudos de Neutralização
[0089] A neutralização do HIV-1 foi avaliada, usando o ensaio de célula TZM.bl baseado em luciferase. Resumidamente, os pseudovirus do envelope foram incubados com cinco diluições em série de anticorpos únicos e aplicados para células TZM.bl, que transportam um gene repórter de luciferase. Depois de 48 horas, as células foram Usadas e a luminescência foi medida. IC50 e ICso refletem concentrações de anticorpo único que causaram uma redução nas unidades de luminescência relativas (Relative Luminescence Units - RLU) em 50% e 80%, respectivamente. Curvas de coberturas foram construídas, usando a ferramenta computacional de Data base de Anticorpo.
Cristalização, Coleta de Dados de Raios X e Determinações de Estrutura
[0090] Os cristais de Fab BG18 em que um potencial local de glicosilação ligada a N na posição 26 da cadeia pesada foi removido por mutação de Asn2 6nc a Gin mostrando tamanho e morfologia superior comparado com cristais de Fab BG18 do tipo selvagem, assim a determinação da estrutura foi realizada, utilizando Fab BG18N26q. Cristais de Fab BG18N26q (grupo espacial P2i; a = 46,12 Â, b = 71,04 Â, c = 69,54 Â; β= 98.48°; 1 molécula por unidade assimétrica); foram obtidos pela combinação de 0,2 μΐ de uma solução de proteína de 18 mg/ml com 0,2 ml acetato de sódio 0,1 M pH 4,5, 26,8% (v/v) polietileno glicol (PEG) 400 e 13,4% (p/v) PEG 8.000 a 20°C, crioprotegido em licor mãe suplementado com 20% (v/v) etileno glicol, e instantaneamente resfriado em nitrogênio líquido. Cristais de NC102 Fab (grupo espacial P2i2i2i; a = 60,2 Â,
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85/152 h=82,5 Â, c = 117,2 Â; 1 molécula por unidade assimétrica) foram produzidos por difusão de vapor pelo método de gotas com um reservatório de 0,1 M acetato de sódio pH 4,6 e 2,0 M sulfato de amônia, usando 250 nl de gotas com uma razão de proteína:reservatório de 1,5:1. Os cristais foram crioprotegidos em licor mãe suplementado com 25% (v/v) etileno glicol e resfriado instantaneamente em nitrogênio líquido. Os cristais de um complexo NC37-93TH057 (grupo espacial P2i2i2i; a = 63,6 Â, b = 67,4 Â, c = 210,4 Â; 1 complexo por unidade assimétrica) foram produzidos por difusão de vapor por método de gotas em 250 nl por incubação de proteína e reservatório (compreendendo 0,1 M HEPES pH 7,5 e 20% (p/v) PEG 10.000) a uma razão proteína:reservatório de 1,5:1. Os cristais foram crioprotegidos em licor mãe suplementado com 20% (p/v) PEG 400 e resfriado instantaneamente em nitrogênio líquido.
[0091] Os dados de difração por raios X foram coletados na linha de luz 12-2 de Stanford Synchrotron Radiation Lightsource equipado com detector de pixel Pilatus 6M (Dectris). O XDS foi utilizado para indexar, integrar e dimensionar os dados. Os cristais de Fab BG18n26q foram difratados para 1,5 Â, e a estrutura foi resolvida por substituição molecular, usando 10-1074 Fab (PDB code 4FQ2) VhVl com voltas de CDR removidos e ChICl como modelo de pesquisa. A estrutura foi refinada, usando uma abordagem iterativa de refinamento com Phenix e construção de modelo manual em Coot. O modelo final de BG18n26q Fab (Rwork = 18,0%, Rfree = 18,9%) apresentou 98,3%, 1,7% e 0% de resíduos nas regiões favorecidas, permitida, e não permitida,
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86/152 respectivamente, do gráfico de Ramachandran. 0 Fab NC102 difratou para 1,6 Â, e a estrutura foi resolvida por substituição molecular, utilizando um modelo de NIH45-46 (código PDB 3U7W) com VhVl com voltas de CDR removidos e ChICl como modelos de pesquisa. 0 modelo final de NC102 Fab (Rwork = 18,0%, Rfree = 20,0%) apresentou 98%, 2% e 0% de resíduos nas regiões favorecida, permitida, e não permitida, respetivamente, do gráfico Ramachandrant. A estrutura do complexo NC37-93TH057 gpl20 foi resolvida por substituição molecular, usando modelos de pesquisa de NC102 VHVL, ChICl, e um núcleo de gpl20 truncado (de PDB 3U7Y) como modelos de pesquisa. O modelo final do complexo NC37-93TH057 (Rwork = 21,0%, Rfree = 26,0%) apresentou 96%, 4% e 0% de resíduos nas regiões favorecida, permitida, e não permitida, respectivamente, do gráfico de Ramachandran. A coleta de dados e as estatísticas de refinamento são apresentadas na Tabela 4.
354BG18 Fab 354NC37 + 93TH057 354NC102 Fab
Intervalo de 35,44 - 1,3 (1,346 - 1,3) 38,6 - 2,7 (2,8 - 2,7) 38,91-1,60 (1, 66 - 1, 60)
Grupo espacial P2i P21212i P21212i
Dimensões da
46, 12, 71, 04, 69, 54 63,60, 67,41, 210,42 60,22, 82,50, 117,21
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354BG18 Fab 354NC37 + θ3ΤΗ057 354NC102 Fab
||||· 90, 98,48, 90 90, 90, 90 90, 90, 90
Reflexões 1111(11!^ 634239 (60770) 172153 (17052) 515918 (48175)
Reflexões 106792 (10428) 25596 (2517) 77546 (7649)
Multiplicidade 5,9 (5,7) 6,7 (6,8) 6,7 (6,3)
0, 98 (0, 98) 1, 00 (1, 00) 1, 00 (1, 00)
Média 1/sigma II· 14,48 (0, 86) 14, 80 (2,73) 11,12 (1,68)
iBBBOiiliBiiilBiiiiiii 14,92 41, 63 15, 84
Mesclagem R 0,06152 (1,772) 0,1272 (0,7028) 0, 108 (1, 031)
lllll· 0, 999 (0,318) 0,996 (0,832) 0, 997 (0, 996)
lllll· 1 (0, 694) 0,999 (0,953)
0, 180 0,21 0, 18
0, 189 0,26 0,2
Número de 3616 6161 4159
macrom-oléculas 3167 5924 3402
ligantes 235 25
solvente 449 2 732
Resíduos de 432 781 448
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354BG18 Fab 354NC37 + 93TH057 354NC102 Fab
proteína
RMS {ligações) iiiieiiiiii® 0, 009 0, 005 0, 007
RMS (ângulos) 1· 1 0, 96 1, 145
6, 17 13, 99 3,41
Fator B médio ΙΙΒίΙΙ· 22,89 36, 55 20,37
21,3 35, 77 17,77
56, 03 34,45
34,17 34,8 31,96
Tabela 4. Coleção de Dados e Estatística de Refinamento. As estatísticas para o shell de resolução mais alta são mostradas entre parênteses.
[0092] A estrutura de um complexo BG505 SOSIP.664-BG18179NC75 foi resolvido por tomografia/sub-tomograma de crioeletrônica com resolução média aproximada de 40 Â e usado como uma estrutura de referência para resolver uma estrutura EM de partículas individuais a partir de amostras coradas negativamente. Os complexos purificados BG505 SOSIP.664BG18-179NC75 foram diluídos para 10 pg/m, em TBS imediatamente antes da adição de 3 μΐ para um filme ultrafino C com descarga luminosa em filme de suporte de carbono Holey, malha 400 redes, grades Cu (Ted Pella, Inc.). As amostras nas grades foram reticuladas, utilizando vapor de glutaraldeído e depois coloradas com 3% acetato de uranilo.
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Os dados foram coletados usando um microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai T12, operando a 120 keV equipado com um Gatan Ultrascan 2k X 2k CCD. As imagens foram adquiridas, usando um tempo de exposição de 0,5 segundo com uma ampliação nominal de 42.000x a 1 pm de desfocagem, resultando em 2,5 Â por pixel. Um total de 25,639 partículas foram coletadas, usando swarm picking em EMAN2.1, e a correção de CTF foi feita, usando EMAN2.1. A média inicial da Classe 2D livre de referência foi realizado, usando RELION e todas as partículas foram classificadas em 250 classes. 9.827 partículas correspondentes às boas médias da classe foram selecionadas, e as partículas foram adicionalmente classificadas, usando classificação 3D RELION, depois do que 7.925 partículas foram selecionadas para refinamento. Para obter uma estrutura de referência para classificação 3D e refinamento, os dados foram coletados de uma amostra complexa independente BG505 SOSIP.664-BG18-179NC75 por tomografia de crioeletrônica e uma estrutura média de sub tomograma 40 Â foi obtida, usando métodos descritos no Scharf, L., et al. , Broadly Neutralizing Antibody 8ANC195 Recognizes Closed and Open States of HIV-1 Env. Cell, 2015. 162(6): p. 1379-90. A estrutura média de sub tomograma foi filtrada com baixa passagem para 80 Â para uso como a estrutura de referência para a reconstrução de partículas individuais. A resolução de reconstrução final de partícula única foi de aproximadamente 25 Â calculada, usando RELION e um FSC padrão ouro com um corte de 0,143, recomendado para estimativas de resolução de reconstrução EM de partículas únicas.
[0093] Ajuste de Mapas de Densidade EM
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[0094] As estruturas EM foram visualizadas, usando USCF Quimera. As coordenadas das estruturas de cristal foram ajustadas nas estruturas EM de partícula única de sub tomograma rateadas ou marcadas negativas, usando o ajuste no mapa utilitário dentro de UCSF Quimera com as seguintes opções: correlação em tempo real /atualização média, uso de mapa simulado a partir de átomos, resolução de 25 Â. Uma estrutura BG505 SOSIP.664 (PDB 4TVP) foi primeiro ajustada na densidade, e depois coordenadas Para Fab BG18 e Fab CH103 (PDB 4JAM; como um modelo para Fab 179NC75) na densidade correspondente individualmente. AS regiões de domínio Ch1-Cl dos Fabs exibiram densidades inferiores.
Produção de Proteina e Purificação para Estudos de Determinação Estrutural
[0095] Os Fabs BG18, BG18n26q, NC102 e NC37 marcados com 6xHis foram expressos por transfecção de transiente em células HEK293-6E e purificados a partir de sobrenadantes de células transfectadas, usando cromatografia de afinidade com Ni2+NTA (GE Healthcare) e cromatografia de exclusão de tamanho Superdex 200 16/60 (SEC) (GE Healthcare) . Truncado, o núcleo proteína 93TH057 gpl20 marcado com His foi produzido em células de inseto infectadas com bacilovirus e purificadas como descrito, utilizando cromatografia de afinidade Ni2+ (GE Healthcare) (Diskin et al. Science 2011; Diskin et al. NSMB 2010) . Antes dos experimentos de cristalização, proteínas NC37 e 93TH057 purificadas foram coincubadas (razão molar 2:1 de Fab para núcleo gpl20) e tratadas com 5 kU de endoglicosidase H por mg de proteína gpl20 durante 3 horas a 25°C. O complexo tratado com endoglicosidase H foi
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91/152 purificado por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). [0096] Os trímeros BG505 SOSIP.664 solúveis para estudos EM foram construídos como descrito no Sanders, R.W., et al., in Sanders, R.W., et al., A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gpl40, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog, 2013. 9(9) : p. el003618. As células HEK293-6E tratadas com 5 μΜ kifunensina (Sigma) foram cotransfectadas com plasmideos, codificando BG505 SOSIP.664 e furina solúvel a uma razão de 4:1. A proteína BG505 SOSIP.664 foi coletada dos sobrenadantes das células, utilizando uma coluna de imunoafinidade de 2G12 feita por acoplamento covalente de monômero 2G12 IgG para uma coluna de Sepharose ativada por NHS (GE Healthcare). A proteína foi eluída com 3M MgCÍ2 seguido por troca de tampão imediato na solução salina tamponada com Tris (TBS) pH 7,4 (50mM NaCl). Os trímeros foram adicionalmente purificados, utilizando Mono Q 5/50 GL (GE Healthcare) seguido de Superose 6 10/300 SEC (GE Healthcare).
Virus Autólogos
[0097] Sequenciação de genoma único (Single Genome Sequencing - SGS) dos genes env HIV-l-RNA do HIV-1 foi extraída do plasma do paciente, utilizando o kit Qiagen MinElute vírus Spin de acordo com instruções do fabricante. O RNA extraído RNA foi submetido à síntese de cDNA específico de Env, usando Transcriptase Reverse Superscript III e primer específico HIV-1 envB3out:
envB5out: 5'-TAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 97)
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92/152 envB3out: 5'-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3' (SEQ ID NO: 98) envB5in: 5'-TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 99) envB3in: 5'-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3' (SEQ ID NO: 100) [0098] A primeira etapa BCR foi realizada em um volume de 20 μΐ, contendo 1 x tampão de Alta Fidelidade, 2 mM MgSO4, 0,2 mM dNTPs e 0,5 unidades de Platinum Tag de Alta Fidelidade, usando 0,2 μΜ de cada um dos de primers envB5out e envB3out. A segunda etapa POR foi realizada, usando 1 μΐ de POR 1 e 0,2 μΜ dos primers de envB5in e envB3in. As condições de POR foram as mesmas que a PCR-1, exceto por 45 ciclos e uma temperatura de recozimento aumentada de 58 °C. Os produtos de PCR-2 foram verificados, usando E-Gels de 96 poços a 1% (Invitrogen). Bandas de PCRs com eficiências de amplificação menores que 30% foram submetidas à preparação de biblioteca e sequenciadas, usando o kit de Preparação de amostra de DNA Illumina Nextera (Illumina). Os cassetes de expressão de CMV-Env foram gerados de acordo com o protocolo estabelecido em J. L. Kirchherr et al. , High throughput functional analysis of HIV-1 env genes without cloning. J Virol Methods 143, 104-111 (2007) . 500 ng de CMV-env foram cotransfectados com pSG3Aenv em placas de 6 poços em células 293T e ο sobrenadante foi coletado depois de 48 horas. Todos os plasmideos tiveram as sequências validadas antes da expressão. Os sobrenadantes foram submetidos a teste de neutralização por ensaios TZM-bl.
Ensaios TZM-bl de Virus Mutante de Glicol Env
Os pseudovirus foram gerados por transfecção de células 293T (ATCC) com um plasmídeo de expressão de HIV-1 Env e ο esqueleto do plasmídeo genômico deficiente Env chamado
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93/152 pSG3AEnv como descrito no Li, M., et al. , Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies. J Virol, 2005. 79(16): p. 10108-25. Os pseudovirus foram coletados 72 horas após transfecção para utilização em ensaios de neutralização. A atividade de neutralização foi avaliada, utilizando uma única etapa de ensaio de replicação de pseudovirus e células alvo TZM-B1, como descrito no Li et al. acima. Resumidamente, as células TZM-bl foram semeadas em uma placa de plano fundo de 96 poços. Para esta placa foi adicionado pseudovirus, que foi pré-incubado com diluições em série de anticorpo durante 1 hora a 37°C. A expressão de gene repórter luciferase foi quantificada 72 horas depois da infecção por lise e adição do substrato de luciferase Bright-GloTM (Promega). Para determinar os valores ICsoas as curvas de resposta de doses foram ajustadas por regressão não linear.
[0099] Síntese de Glicopeptideos V3 do HIV-1
[00100] A síntese dos glicopeptideos V3 derivados de várias estirpes de HIV-1 foi conseguida, utilizando um método quimo enzimático que consiste da síntese automatizada de peptídeo em fase sólida do precursor de peptídeo GlcNAc e subsequente transglicosilação enzimática do peptídeo GlcNAc para proporcionar glicopeptideos alvos, seguindo os procedimentos estabelecidos em Amin, M.N., et al. , Synthetic glycopeptides reveal the glycan specificity of HIVneutralizing antibodies. Nat Chem Biol, 2013. 9(8): p. 5216. As interações entre os glicopeptideos sintéticos
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94/152 biotinilado e os anticorpos BG18 e BG8 IgG foram avaliados por SPR, usando um sistema BIAcore T200 (GE Healthcare) a 25°C. Os glicopeptídeos biotinilado foram imobilizados em chips sensor CM5 revestido com neutravidina em tampão HBS-P (10 mM HEPES, NaC1150 mM, surfactante P20 0,05% v/v, pH 7,4) até ser atingida a unidade de resposta 200 (RU). O BG18 (ou BG8) foi injetado em diluições em série de duas vezes com a concentração, iniciando em 4 μΜ em tampão BS-P com uma razão de fluxo de 40 μΐ/minuto por 180 segundos. O tampão BS-P com uma razão de fluxo de 40 μΐ/minuto foi então injetado por 1210 segundos para permitir a dissociação. A regeneração foi realizada por injeção de 3M MgCÍ2 com uma razão de fluxo de 50 μΐ/minuto por 3 minutos seguido por injeção de tampão HBS-P com a razão de fluxo de 50 μΐ/minuto por 5 minutos.
Modelo de Rato In vivo
[00101] Ratos humanizados NOD Ragl~/~I12rgnu11 (NOD.CgRagltmlMom I12rgtmlwN/SzJ) (The Jackson Laboratory) foram tratados com 1 mg de cada anticorpo de forma subcutânea (s.c.) duas vezes por semana por um período de 3 semanas, obtendo um total de seis injeções de anticorpo. Os ratos hu de controle foram reconstituídos com células humanas do mesmo doador e infectados com HIV-1yu2, mas não tratados com anticorpos. As cargas virais no plasma foram medidas semanalmente. As sequências de gpl20 dos ratos com rebote viral foram obtidas como descrito no F. Klein et al. , HIV therapy by a combination of broadly neutralizing antibodies in humanized mice. Nature 492, 118-122 (2012) .
ELISAs
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[00102] As placas ELISA de 96 poços de ligação elevada (Costar) foram revestidas durante a noite com 5 pg/ml de núcleo 2CC purificado, gpl20.YU2 (tipo selvagem ou mutantes) ou trímero dobrado de gpl40.YU2 em PBS. Depois da lavar 6 vezes com PBS + Tween 20 a 0,05%, as placas foram bloqueadas por 2 horas com BSA 2%, EDTA 1 μΜ e Tween-PBS 0,05% (tampão de bloqueio), e então incubada por 1 hora com IgGs que foram acrescentados como sete diluições 1:4 consecutivas em PBS a partir da concentração inicial de 4 pg/ml. Após lavagem adicional, as placas foram desenvolvidas por incubação com anticorpos de cabra anti IgG humano conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch) (a 0,8 pg/ml em tampão de bloqueio) por 1 hora seguido por substrato cromogênio de peroxidase de rábano (HorseRadish Peroxidase - HRP) (solução ABTS; Invitrogen). Para competição ELISAs, as placas foram revestidas com 0,5 pg/ml de BG505.SOSIP.664, lavadas, bloqueadas por 2 horas com tampão de bloqueio e então incubadas por 1 hora com IgGs acrescentada como sete diluições consecutivas de 1:4 em PBS a partir da concentração inicial de 32 pg/ml, e na presença de anticorpo biotinilado a uma concentração constante de 4 pg/ml. As placas foram depois desenvolvidas, utilizando estreptavidina conjugada com HRP (Jackson ImmunoReseach) (a 1 pg/ml em tampão de bloqueio).
[00103] Por ELISAs, usando trimero BG505 SOSIP.664 com um marcador de epitopo D7324 (BG505 SOSIP.664-D7324) as placas foram revestidas durante a noite com 5 pg/ml de anticorpo D7324 como descrito no Sanders, R.W., et al. , A nextgeneration cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505
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SOSIP.664 gpl40, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog, 2013. 9(9): p. el003618, e então lavadas e incubadas com 500 ng/ml do trimero. Depois de uma lavagem adicional, as IgGs foram acrescentadas por 1 h com sete diluições consecutivas de 1:4 em PBS a partir das concentrações iniciais de 4 pg/ml. O ponto final foi gerado por incubação com anticorpos de cabra anti IgG humano conjugado com HRP, como descrito acima. Todos os experimentos foram realizados pelo menos 3 vezes.
Geração de Vírus CMV-Env
[00104] Os cassetetes de expressão de CMV-env foram gerados de acordo com um protocolo estabelecido (52) . Resumidamente, o promotor CMV foi amplificado a partir do vetor de expressão pcDNA3.1D/V5-HÍS-TOPO utilizando os seguintes primers:
CMVenv: 5'-AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCAT-3' (SEQ ID NO:
101) e
CMVenvlA 5'-CATAGGAGATGCCTAAGCCGGTGGAGCTCTGCTTATATAGACCTC3' (SEQ ID NO: 102).
[00105] 0 produto de POR foi purificado, usando o POR
Macherey-Nagel POR e o Kit de Purificação de Gel. 1 ui do produto de POR da primeira etapa foi amplificado, utilizando os seguintes primers:
envlATOPO 5'-CACCGGCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAA-3' (SEQ ID NO: 103) e
Revl9 5'-ACTTTTTGACCACTTGCCACCCAT-3' (SEQ ID NO: 104) em um volume 20 μΐ, contendo Ix Tampão de Alta Fidelidade, 2 mM MgSO4, 0,2 mM dNTPs, 0,5 unidades de Alta Fidelidade PlêAinum
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Taq e 0,2 μΜ de cada primer. As condições cíclicas foram 94°C, 2 minutos; (94°C, 15 segundos; 55°C 30 segundos; 68°C, 4 minutos) x 35; 68°C, 10 minutos. A presença de env foi validada por análise em um gel de Agarose 0,7% e o produto foi purificado, utilizando o Gel Macherey-Nagel e Kit de Purificação de PCR. 10 ng de envelope e 0,5 ng de CMV foram então submetidos a PCR sobreposto com primers CMVenv e Revl9 em triplicados. O volume total reação 6 foi 50 μΐ, contendo Ix Tampão de Alta Fidelidade, 0,2 μΜ MgSCd, 0,2 mM dNTPs, 1 unidade de Platina de alta fidelidade (High Fidelity Platinum Taq) e 0,4 μΜ de cada primer. A PCR foi realizada a 94°C, 2minutos; (94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 68°C, 4 minutos) x 25; 68°C, 10 minutos. 500 ng de CMV-env foram cotransfectados com pSG3Aenv em placas de 6 poços em células 293T e o sobrenadante foi coletado depois de 48 horas. Os sobrenadantes foram submetidos a teste de neutralização por TZM-bl como descrito supra.
Virus da Cultura (VOA)
[00106] 0 virus do doador EB354 foi obtido por cocultura de células mononuclear o sangue periférico do paciente (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) com PBMCs de doador saudáveis como descrito em Van't Wout et al., Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nat Protoc, 2008. 3(3) : p. 363-70. Os PBMCs de doador saudáveis foram obtidos de pacientes por leucaferese sob protocolo de estudo MNU-0628 da Universidade de Rockefeller. Os PBMCs de doador saudáveis foram préestimulados a uma densidade de 5 x 106 células por ml em IMDM, contendo FBS10%, Penicilina Estreptomicina 1% e PHA a
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98/152 pg/ml por 2-3 dias a 37°C e 5% C02. 6 x 106 das PBMCs doadoras estimuladas foram então transferidas para IMDM, contendo 10% FBS, 1% Penicilina-Estreptomicina, 10 lU/ml IL- e 5 pg/ml polibreno e cocultivados com 5-10 x ΙΟ6 EB354 PBMCs a 37 °C e 5% CO2. O meio foi substituído semanalmente e a presença de p24 no sobrenadante da cultura foi quantificada por Lenti-X p24 Rapid Titer Kit (Clontech). As culturas, excedendo 1 ng de p24 por ml de sobrenadante, foram congeladas e armazenadas a -80°C. A determinação da dose infecciosa de cultura de tecido 50 (TCID50) e testes subsequentes para sensibilidade de vírus autólogo para diferentes anticorpos amplamente neutralizantes e IgG sérica autóloga foram conduzidos, utilizando um ensaio de neutralização TZM-bl, de acordo com protocolos supra descritos. Todos os ensaios de neutralização foram executados em duplicata.
Mutantes do Envelope HIV-1YU2
[00107] Mutações simples, duplas e triplas foram introduzidas no envelope HIV-1yu2 tipo selvagem, usando o kit de mutagênese direcionado ao local QuikChange (multi-), de acordo com as especificações do fabricante (Agilent Technologies).
Análise de Evolução Viral
[00108] Alinhamentos de sequência de nucleotídeos env foram gerados, usando ClustalW (versão 2.11) ou via alinhamento manual, usando o software de análise de sequência Generous (versão 8.1.6). As regiões que não puderam ser alinhadas inequivocamente foram removidas por análise filogenética e cálculos de diversidade. As classes de modelos
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99/152 evolutivos para análise filogenética de máxima probabilidade foram selecionadas, usando jModelTest. As árvores de probabilidade filogenética foram geradas, usando PhyML (versão 3) com estimação conjunta dos valores dos parâmetros do modelo e filogenias. As diversidades genéticas em pares foram comparadas entre amostras, usando um teste estatístico U de duas amostras na ferramenta Web DIVEIN.
Processamento Bioinformática de Sequências de MiSeq Env
[00109] Adaptadores de sequência foram removidos, usando Cutadapt vl.8.3. A montagem de leitura de cada vírus foi realizada em três etapas. Primeiro, a montagem de novo foi realizada, usando o Spades v3.6.1 para produzir arquivos contíguos longos. Os contíguos maiores que 255 bp foram subsequentemente alinhados para uma sequência de referência de envelope de HIV e uma sequência de consenso foi gerada, usando Generous 8. Finalmente, as leituras foram realinhadas para a sequência de consenso para fechar lacunas e um consenso final foi gerado. As sequências com picos duplos (identidade de consenso de corte para qualquer resíduo < 75%) foram omitidas da análise a jusante.
Análise Estatística
[00110] As diferenças estatísticas foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney. O software GraphPad Prism foi utilizado para análise, e os dados foram considerados significativos em *p < 0,05, **p < 0,01, e ***p < 0,001.
Resultados
Múltiplos bNAbs
[00111] A IgG purificada do doador EB354 classificou-se no nível 1% superior para amplitude de neutralização e potência
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100/152 em um coorte de 394 infectados pelo HIV-1 não progressores a longo prazo. Este doador foi diagnosticado com o Clade B do HIV-1 em 1986. Ο EB354 recebeu tratamento com didanosina e estavudina entre 1995 e 1998, mas não teve terapia antiretroviral desde aquela época. Em 2002, a carga viral do EB354 foi <400 cópias/ml e as contagens CD4 e CD8 foram 954 e 1046 células/mm3, respectivamente, EB354 teve três picos documentados em viremia entre 2002 e 2006 (Figura IA) . A potência neutralizante sorológica e amplitude foram avaliadas pela primeira vez em 2006, quando a carga viral foi <400 cópias/ml (Figuras IA e 1B e Tabela 3). A atividade neutralizante aumentou até 2010, e permaneceu ampla e potente desde este tempo (Figura IB). A tipificação de HLA revelou HLAA*01:01, 24:02, B*27:05, 57:01, C*01:02, 06:02 (Tabela
3) .
[00112] Para isolar os anticorpos responsáveis pela atividade sorológica do indivíduo, as células únicas foram classificadas, usando quatro diferentes HIV-1 baits; núcleo 2CC, gpl40Yu2, uma mistura 1:1 de gpl40g2UG37.s (Clade A) + gpl4OCzA7goi2 (Clades C) e BG505 SOSIP.664 (Figura 1C) . Um total de 241 cadeias leves e pesadas emparelhadas foram isoladas, das quais 152 anticorpos formaram 22 clones diferentes. Os anticorpos de 3 clones mostraram atividade neutralizante de nível 2 (Figura 1C e Tabela 13) . Quando comparados com o IgG do soro dos anos 2010-2015, os anticorpos pertencentes ao clone como exemplificado pelo anticorpo BG18 (Figura 1C) , recapitularam a maior parte da atividade serológica (Figura 1D). Os anticorpos pertencentes aos outros 2 clones neutralizantes, exemplificados pelo
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101/152 anticorpo NC37 e anticorpo BG1 (Figura 1C) , foram menos potentes, mas complementavam a atividade do BG18 (Figura 1D) [00113] Para mapear locais de ligação dos anticorpos nos 3 clones neutralizantes, foram realizados ensaios TZM-bl, utilizando variantes HIV-1yu2 portadoras de mutações pontuais específicas de epítopo em Env. Enquanto a Igc poli clonal não apresentou alteração mensurável na sensibilidade para os mutantes, o anticorpo BG18 foi sensíveis para YU2N332k (glicano-V3) , o anticorpo BG1 para YU2ni6ok (V1V2), e anticorpo NC37 para YU2N28oy (CD4bs) (Figura 1D) . Consistente com os resultados de neutralização, a ligação BG18 por ELISA foi competitivamente inibida por PGT121 e 10-1074; e a ligação de BG1 foi reduzida por PGT145 (Figura 5).
[00114] 0 BG18 neutralizou 64% dos vírus em um painel de 118 vírus (Figura 1E, Tabela 5) com uma média geométrica de IC50 de 0,03 pg/ml e foi comparável em largura, mas mais potente do que PGT121 ou 10-1074 (Figura 1F, Tabelas 5 a 10). Os anticorpos NC37 e BG1 apresentaram média geométrica de IC50S de 0,3 pg/ml e 0,67 pg/ml, e 33% e 37% amplitude, respectivamente. (Figura IE e 1F, Tabelas 6 e 7). A mistura 1:1:1 dos três bNAbs neutralizou 81% dos vírus no painel de vírus 118 com uma média geométrica de IC50 de 0,130 pg/ml, indicando um efeito aditivo (Figura 1E, Tabela 11).
Vírus ID BG18
Clade IC5O IC80
6535.3 B 0, 001 0, 005
QH0692.42 B 0, 013 0, 042
SC422661.8 B 0, 005 0, 021
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BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
PVO. 4 B 0, 003 0, 013
TRO.11 B 0, 001 0, 002
AGIO .0.29 B 0, 001 0, 003
RHPA4259.7 B 1,437 >30
THRO4156.18 B >30 >30
REJO4541.67 B >30 >30
TRJO4551.58 B 3,341 26, 938
WITO4160.33 B 0, 018 0,250
CAAN5342.A2 B 0, 008 0, 040
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 003 0, 012
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 001 0, 004
1054_07_TC4_1499 B (T/F) 0, 005 0, 022
1056_10_TAl1_1826 B (T/F) 0, 007 0, 045
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 003 0, 012
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 0, 003 0, 010
6244_13_B5_4576 B (T/F) 0, 011 0, 049
62357_14_D3_4589 B (T/F) 3, 008 >30
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0, 003 0, 016
Dul56.12 C 0, 003 0, 010
Dul72.17 C >30 >30
Du422.1 C 0, 009 0, 057
ZM197M.PB7 C >30 >30
ZM214M.PL15 C >30 >30
ZM233M.PB6 C 2,866 29,805
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BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
ZM249M.PLl C >30 >30
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PLIOa C 0, 029 0, 161
CAP45.2.00.G3 C >30 >30
CAP210.2.00.E8 C 3,469 10,748
HIV-001428-2.42 C 0, 004 0, 021
HIV-0013095-2.11 C 10,516 29,966
HIV-16055-2.3 C >30 >30
HIV-16845-2.22 C 0, 019 0, 090
CelO86_B2 C (T/F) >30 >30
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) 0, 004 0, 012
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) 0, 002 0, 007
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F C1G C (T/F) 0, 034 0,257
249M B10 C (T/F) >30 >30
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 1,454 8,725
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 002 0, 008
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 029 0,350
Ce704809221_1B3 C (T/F) 4,394 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 109/159
104/152
BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
CNE19 BC >30 >30
CNE2 0 BC 0.002 0, 006
CNE21 BC 0, 002 0, 007
CNE17 BC 0, 020 0, 109
CNE3 0 BC 0, 019 0, 059
CNE52 BC 0, 012 0, 045
CNE53 BC 0, 003 0, 011
CNE58 BC 0, 024 0, 073
MS208.Al A >30 >30
Q23.17 A 0, 006 0, 020
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A >30 >30
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 13,986 >30
3415.vl.cl A 0, 023 0, 087
33 65.v2.c2 A 0, 013 0, 037
191955_A11 A (T/F) >30 >30
191084 B7-19 A (T/F) 0, 011 0, 043
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 005 0, 056
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG 0,761 3, 934
263-8 CRF02_AG 1,380 7,548
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 110/159
105/152
BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
T250-4 CRF02_AG 0, 001 0, 006
T251-18 CRF02_AG 0, 086 0,328
T278-50 CRF02_AG 2,947 12,875
T255-34 CRF02_AG >30 >30
211-9 CRF02_AG 1,299 5, 529
235-47 CRF02_AG 0, 005 0, 017
620345.c01 CRF01_AE >30 >30
ONE 8 CRF01_AE >30 >30
C1080.c03 CRF01_AE 5,369 >30
R2184.c04 CRF01_AE >30 >30
R1166.cOl CRF01_AE >30 >30
R32 65.cO 6 CRF01_AE >30 >30
C2101.cOl CRF01_AE >30 >30
C3347.cll CRF01_AE >30 >30
C4118.c09 CRF01_AE >30 >30
ONE 5 CRF01_AE >30 >30
BJGX009000.02.4 CRF01_AE 24,376 >30
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJGX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJGX028000.10.3 CRF01_AE 0,474 14,851
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 111/159
106/152
BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
(T/F)
X1193_cl G 0, 005 0, 022
P0402_c2_ll G 0, 005 0, 029
X1254_c3 G 0, 004 0, 012
X2088_c9 G 0, 004 0, 009
X2131_C1_B5 G 0, 002 0, 008
P1981_C5_3 G 0, 006 0, 019
X1632_S2_B10 G >30 >30
3016.v5.c45 D >30 >30
AO 7412M1.vrcl2 D 0, 081 1,715
231965.cOl D >30 >30
231966.c02 D >30 >30
191821_E6_1 D (T/F) 14,076 >30
3817.v2.c59 CD 0,219 1, 059
6480.v4.c25 CD 0, 016 0, 116
6952.vl.c20 CD 0, 005 0, 011
6811.v7.cl8 CD 0, 001 0, 006
89-Fl_2_25 CD >30 >30
3301.vl.c24 AC 0, 025 0, 082
6041.v3.c23 AC >30 >30
654 0.v4.cl AC 28,197 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 112/159
107/152
BC1 8 Vírus ID Clade IC50 IC80
6545.v4. cl AC >30 >30
0815.v3.c3 AC D 0, 160 5, 964
3103.v3.cl0 AC D 0, 002 0, 005
BG505/T332N A <0,0001 0, 002
YU2_WT B 0, 033 0, 198
YU2_N276D B 0, 012 0, 036
YU2_N332K B >30 >30
YU2_N160K B 0, 028 0, 150
YU2_N280Y B 0, 005 0, 016
Tabela 5. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl para
BG18 .
NC37
Vírus ID Clade IC50 IC80
6535.3 B >30 >30
QH0692.42 B 0,582 2,054
SC422661.8 B 0, 071 0,321
PVO. 4 B 0,412 2,825
TRO.11 B 0,337 1,761
AC10.0.29 B >30 >30
RHPA4259.7 B 0,345 2,289
THRO4156.18 B >30 >30
REJO4541.67 B 0, 104 0,304
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 113/159
108/152
NC37 Vírus ID Clade IC50 IC80
TRJO4551.58 B 0, 143 1, 615
WITO4160.33 B 0,733 17,779
CAAN5342.A2 B 0, 911 3, 694
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 037 0, 133
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 054 0,207
1054_07_TC4_1499 B (T/F) >30 >30
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 1, 048 5, 510
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 099 0, 638
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 1,236 6, 388
6244_13_B5_4576 B (T/F) 5, 574 >30
62357_14_D3_4589 B (T/F) 1,860 29,422
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0,202 0,714
Dul56.12 C >30 >30
Dul72.17 C >30 >30
Du422.1 C >30 >30
ZM197M.PB7 C 3, 098 17,368
ZM214M.PL15 C >30 >30
ZM233M.PB6 C >30 >30
ZM249M.PL1 C >30 >30
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PLIOa C >30 >30
CAP45.2.00.G3 C >30 >30
CAP210.2.00.E8 C >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 114/159
109/152
NC37
Vírus ID Clade IC50 IC80
HIV-001428-2.42 C 0, 124 2,275
HIV-0013095-2.11 C >30 >30
HIV-16055-2.3 c >30 >30
HIV-16845-2.22 c >30 >30
CelO86_B2 C (T/F) 2,322 20,996
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) >30 >30
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) >30 >30
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F CIG C (T/F) >30 >30
249M BIO C (T/F) >30 >30
ZM247vl(Rev-) C (T/F) >30 >30
7030102001E5(Rev-) C (T/F) >30 >30
1394C9G1(Rev-) C (T/F) >30 >30
Ce704809221_1B3 C (T/F) >30 >30
CNE19 BC >30 >30
CNE2 0 BC >30 >30
CNE21 BC >30 >30
CNE17 BC >30 >30
CNE3 0 BC 0, 915 11,813
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 115/159
110/152
NC37 Vírus ID Clade IC50 IC80
CNE52 BC >30 >30
CNE53 BC >30 >30
CNE58 BC >30 >30
MS208.Al A >30 >30
Q23.17 A >30 >30
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A 0,242 1,574
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 0,255 1, 821
3415.vl.cl A 0, 183 0, 654
33 65.v2.c2 A >30 >30
191955_A11 A (T/F) >30 >30
191084 B7-19 A (T/F) 0, 064 0,208
9004SS_A3_4 A (T/F) >30 >30
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG >30 >30
263-8 CRF02_AG 0,269 1,523
T250-4 CRF02_AG >30 >30
T251-18 CRF02_AG 1, 835 7, 857
T278-50 CRF02_AG >30 >30
T255-34 CRF02_AG >30 >30
211-9 CRF02_AG >30 >30
235-47 CRF02_AG 14,369 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 116/159
111/152
NC37 Vírus ID Clade IC50 IC80
620345.c01 CRF01_AE >30 >30
CNE8 CRF01_AE >30 >30
C1080.c03 CRF01_AE >30 >30
R2184.c04 CRF01_AE 0, 025 0, 082
R1166.cOl CRF01_AE >30 >30
R32 65.cO 6 CRF01_AE >30 >30
C2101.cOl CRF01_AE >30 >30
C3347.cll CRF01_AE >30 >30
C4118.c09 CRF01_AE >30 >30
CNE5 CRF01_AE >30 >30
BJGX009000.02.4 CRF01_AE >30 >30
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >30 >30
X1193_cl G >30 >30
P0402_c2_ll G >30 >30
X1254_c3 G >30 >30
X2088_c9 G >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 117/159
112/152
NC37 Vírus ID Clade IC50 IC80
X2131_C1_B5 G >30 >30
P1981_C5_3 G >30 >30
X1632_S2_B10 G >30 >30
3016.v5.c45 D 23,592 >30
AO 7412M1.vrcl2 D >30 >30
231965.cOl D >30 >30
231966.c02 D >30 >30
191821_E6_1 D (T/F) 9, 963 >30
3817.v2.c59 CD >30 >30
6480.v4.c25 CD 3, 060 >30
6952.vl.c20 CD 0, 104 0,477
6811.v7.cl8 CD >30 >30
89-Fl_2_25 CD 17,963 >30
3301.vl.c24 AC >30 >30
6041.v3.c23 AC 0, 018 0, 054
654 0.v4.cl AC >30 >30
6545.v4.cl AC >30 >30
0815.v3.c3 AC D 0, 022 0, 082
3103.v3.cl0 AC D >30 >30
BG505/T332N A
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 118/159
113/152
NC37
Vírus ID Clade IC50 IC80
YU2_WT B 0, 12
YU2_N276D B NT
YU2_N332K B 0, 05
YU2_N160K B 0, 05
YU2_N280Y B >30
Tabela 6. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl para
NC37 .
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
6535.3 B 0,322 1, 130
QH0692.42 B >30 >30
SC422661.8 B >30 >30
PVO. 4 B >30 >30
TRO.11 B >30 >30
AGIO .0.29 B 0, 012 0, 043
RHPA4259.7 B >30 >30
THRO4156.18 B >30 >30
REJO4541.67 B 0,342 1, 662
TRJO4551.58 B >30 >30
WITO4160.33 B 0, 002 0, 014
CAAN5342.A2 B >30 >30
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) >30 >30
1006_11_C3_1601 B (T/F) >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 119/159
114/152
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
1054_07_TC4_1499 B (T/F) >30 >30
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 5, 428 29,924
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) >30 >30
6240_08_TA5_4622 B (T/F) >30 >30
6244_13_B5_4576 B (T/F) >30 >30
62357_14_D3_4589 B (T/F) 0, 638 2,889
SC05_8Cll_2344 B (T/F) >30 >30
Dul56.12 C 1,525 6, 031
Dul72.17 C >30 >30
Du422.1 C 1, 804 13,708
ZM197M.PB7 C >30 >30
ZM214M.PL15 C >30 >30
ZM233M.PB6 C >30 >30
ZM249M.PL1 C 1,223 6,795
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PLIOa C >30 >30
CAP45.2.00.G3 C 0, 149 0,383
CAP210.2.00.E8 C >30 >30
HIV-001428-2.42 C 1, 094 3, 124
HIV-0013095-2.11 C >30 >30
HIV-16055-2.3 C 4,296 16,939
HIV-16845-2.22 C >30 >30
CelO86_B2 C (T/F) >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 120/159
115/152
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) 0, 031 0, 165
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) >30 >30
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F C1G C (T/F) >30 >30
249M B10 C (T/F) 1,473 5, 445
ZM247vl(Rev-) C (T/F) >30 >30
7030102001E5(Rev-) C (T/F) >30 >30
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 1,279 7,249
Ce704809221_1B3 C (T/F) 3,251 18,455
CNE19 BC 1,267 10,883
CNE2 0 BC 4,264 >30
CNE21 BC >30 >30
CNE17 BC >30 >30
CNE3 0 BC >30 >30
CNE52 BC 0, 975 5, 008
CNE53 BC 1,318 7,470
CNE58 BC >30 >30
MS208.Al A 1,478 6, 543
Q23.17 A 0, 008 0, 016
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 121/159
116/152
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A >30 >30
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 1,395 4,297
3415.vl.cl A 14,412 >30
33 65.v2.c2 A 1,161 4,272
191955_A11 A (T/F) 0, 008 0, 018
191084 B7-19 A (T/F) >30 >30
9004SS_A3_4 A (T/F) >30 >30
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG >30 >30
263-8 CRF02_AG >30 >30
T250-4 CRF02_AG 3, 921 >30
T251-18 CRF02_AG 3,591 17,977
T278-50 CRF02_AG 19,313 >30
T255-34 CRF02_AG 11,589 >30
211-9 CRF02_AG 2,852 12,939
235-47 CRF02_AG 1,275 4,384
620345.cOl CRF01_AE 0, 626 4,229
CNE8 CRF01_AE >30 >30
C1080.c03 CRF01_AE 0, 002 0, 005
R2184.c04 CRF01_AE >30 >30
R1166.cOl CRF01_AE >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 122/159
117/152
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
R32 65.cO 6 CRF01_AE 0, 611 3,438
C2101.cOl CRF01_AE >30 >30
C3347.cH CRF01_AE >30 >30
C4118.c09 CRF01_AE 22,788 >30
CNE5 CRF01_AE 0,351 1,277
BJCX009000.02.4 CRF01_AE >30 >30
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >30 >30
X1193_cl G 0, 138 0,463
P0402_c2_ll G >30 >30
X1254_c3 G 0, 048 0, 086
X2088_c9 G >30 >30
X2131_C1_B5 G 0, 116 0,313
P1981_C5_3 G >30 >30
X1632_S2_B10 G 0, 079 0,250
3016.v5.c45 D >30 >30
AO 7412M1.vrcl2 D >30 >30
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 123/159
118/152
BG1 Vírus ID Clade IC50 IC80
231965.c01 D >30 >30
231966.c02 D >30 >30
191821_E6_1 D (T/F) >30 >30
3817.v2.c59 CD 11,147 >30
6480.v4.c25 CD >30 >30
6952.vl.c20 CD >30 >30
6811.v7.cl8 CD >30 >30
89-Fl_2_25 CD >30 >30
3301.vl.c24 AC >30 >30
6041.v3.c23 AC 6, 745 16,641
654 0.v4.cl AC >30 >30
6545.v4.cl AC >30 >30
0815.v3.c3 AC D >30 >30
3103.v3.cl0 AC D >30 >30
BG505/T332N A 0, 034 0, 125
YU2_WT B 15,816 >30
YU2_N276D B 18,765 >30
YU2_N332K B 19,434 >30
YU2_N160K B >30 >30
YU2_N280Y B 8,998 23,023
Tabela 7. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl para
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 124/159
119/152
BG1 .
BG8 Virus ID Clade IC50 IC80
6535.3 B 0, 007 0, 022
QH0692.42 B 0, 106 0,383
SC422661.8 B 0, 058 0,368
PVO. 4 B 0, 072 0,252
TRO.11 B 0, 011 0, 039
AGIO .0.29 B 0, 015 0, 043
RHPA4259.7 B 0, 023 0, 083
THRO4156.18 B >10 >10
REJO4541.67 B >10 >10
TRJO4551.58 B 0, 057 0,218
WITO4160.33 B 0, 111 0, 828
CAAN5342.A2 B 0, 005 0, 019
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 031 0, 112
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 002 0, 006
1054_07_TC4_1499 B (T/F) 0, 048 0,222
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 0, 038 0, 168
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 011 0, 047
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 0, 038 0, 131
6244_13_B5_4576 B (T/F) 0, 091 0,380
62357_14_D3_4589 B (T/F) >10 >10
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0, 017 0, 048
Dul56.12 C 0, 010 0, 036
Dul72.17 C 0, 049 0, 194
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 125/159
120/152
BG8 Vírus ID Clade IC50 IC80
Du422.1 C 0, 047 0, 113
ZM197M.PB7 C >10 >10
ZM214M.PL15 C 0,415 2,970
ZM233M.PB6 C 0, 058 0,371
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C >10 >10
ZM109F.PB4 C >10 >10
ZM135M.PLIOa C 0, 061 0,263
CAP45.2.00.G3 C >10 >10
CAP210.2.00.E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 035 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C >10 >10
HIV-16845-2.22 C 0,727 3, 930
CelO86_B2 C (T/F) >10 >10
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 070
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 019 0, 083
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F C1G C (T/F) 0, 035 0, 119
249M B10 C (T/F) >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 126/159
121/152
BG8 Vírus ID Clade IC50 IC80
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 042 0, 146
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 009 0, 019
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 031 0, 093
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 084 0,395
CNE19 BC 0, 075 >10
CNE2 0 BC 0, 002 0, 005
CNE21 BC 0, 047 0, 124
CNE17 BC 1, 180 4, 853
CNE3 0 BC 0,261 0, 678
CNE52 BC 1,991 9,763
CNE53 BC 0, 013 0, 058
CNE58 BC 0, 165 0,476
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 015
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A >10 >10
Q842.dl2 A >10 >10
3415.vl.cl A >10 >10
33 65.v2.c2 A 0, 057 0,200
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 026 0, 108
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 012 0, 032
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 127/159
122/152
BG8 Vírus ID Clade IC50 IC80
T257-31 CRF02_AG >10 >10
928-28 CRF02_AG 0, 616 2,396
263-8 CRF02_AG 0,416 5,714
T250-4 CRF02_AG 0, 002 0, 005
T251-18 CRF02_AG 0,399 2,292
T278-50 CRF02_AG 1,713 >10
T255-34 CRF02_AG >10 >10
211-9 CRF02_AG 0, 065 0,403
235-47 CRF02_AG 0, 058 0,224
620345.c01 CRF01_AE >10 >10
CNE8 CRF01_AE >10 >10
C1080.c03 CRF01_AE >10 >10
R2184.c04 CRF01_AE >10 >10
R1166.cOl CRF01_AE >10 >10
R32 65.cO 6 CRF01_AE >10 >10
C2101.cOl CRF01_AE >10 >10
C3347.cll CRF01_AE >10 >10
C4118.c09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJGX009000.02.4 CRF01_AE >10 >10
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 128/159
123/152
BG8 Vírus ID Clade IC50 IC80
(T/F)
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
X1193_cl G 0, 070 0,207
P0402_c2_ll G 0, 008 0, 024
X1254_c3 G 0, 063 0,239
X2088_c9 G 0, 003 0, 010
X2131_C1_B5 G 0, 014 0, 056
P1981_C5_3 G 0, 004 0, 013
X1632_S2_B10 G >10 >10
3016.v5.c45 D >10 >10
AO 7412M1.vrcl2 D 0, 011 0, 037
231965.cOl D >10 >10
231966.c02 D >10 >10
191821_E6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.c59 CD 0,706 4,492
6480.v4.c25 CD 0, 006 0, 023
6952.vl.c20 CD 0, 023 0, 086
6811.v7.cl8 CD 0, 003 0, 009
89-Fl_2_25 CD >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 129/159
124/152
BG8 Vírus ID Clade IC50 IC80
3301.vl.c24 AC 0, 018 0, 049
6041.v3.c23 AC >10 >10
654 0.v4.cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 AC D 0, 043 0, 197
3103.v3.cl0 AC D 0, 024 0, 061
Tabela 8. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl para
BG8 .
Vírus ID 10-1074 Clade IC5O IC8O
6535.3 B 0, 007 0, 022
QH0692.42 B 0, 106 0,383
SC422661.8 B 0, 058 0,368
PVO. 4 B 0, 072 0,252
TRO.11 B 0, 011 0, 039
AC10.0.29 B 0, 015 0, 043
RHPA4259.7 B 0, 023 0, 083
THRO4156.18 B >10 >10
REJO4541.67 B >10 >10
TRJO4551.58 B 0, 057 0,218
WITO4160.33 B 0, 111 0, 828
CAAN5342.A2 B 0, 005 0, 019
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 130/159
125/152
Vírus ID 10—1074
Clade IC5O IC8O
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 031 0, 112
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 002 0, 006
1054_07_TC4_1499 B (T/F) 0, 048 0,222
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 0, 038 0, 168
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 011 0, 047
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 0, 038 0, 131
6244_13_B5_4576 B (T/F) 0, 091 0,380
62357_14_D3_4589 B (T/F) >10 >10
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0, 017 0, 048
Dul56.12 C 0, 010 0, 036
Dul72.17 C 0, 049 0, 194
Du422.1 C 0, 047 0, 113
ZM197M.PB7 C >10 >10
ZM214M.PL15 C 0,415 2,970
ZM233M.PB6 C 0, 058 0,371
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C >10 >10
ZM109F.PB4 C >10 >10
ZM135M.PLIOa C 0, 061 0,263
CAP45.2.00.G3 C >10 >10
CAP210.2.00.E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 035 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C >10 >10
HIV-16845-2.22 C 0,727 3, 930
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 131/159
126/152
10—1074 Vírus ID Clade IC50 IC80
CelO86_B2 C (T/F) >10 >10
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 070
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 019 0, 083
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F C1G C (T/F) 0, 035 0, 119
249M B10 C (T/F) >10 >10
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 042 0, 146
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 009 0, 019
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 031 0, 093
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 084 0,395
CNE19 BC 0, 075 >10
CNE2 0 BC 0, 002 0, 005
CNE21 BC 0, 047 0, 124
CNE17 BC 1, 180 4, 853
CNE3 0 BC 0,261 0, 678
CNE52 BC 1,991 9,763
CNE53 BC 0, 013 0, 058
CNE58 BC 0, 165 0,476
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 132/159
127/152
10—1074 Vírus ID Clade IC50 IC80
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 015
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A >10 >10
Q842.dl2 A >10 >10
3415.vl.cl A >10 >10
33 65.v2.c2 A 0, 057 0,200
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 026 0, 108
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 012 0, 032
T257-31 CRF02_AG >10 >10
928-28 CRF02_AG 0, 616 2,396
263-8 CRF02_AG 0,416 5,714
T250-4 CRF02_AG 0, 002 0, 005
T251-18 CRF02_AG 0,399 2,292
T278-50 CRF02_AG 1,713 >10
T255-34 CRF02_AG >10 >10
211-9 CRF02_AG 0, 065 0,403
235-47 CRF02_AG 0, 058 0,224
620345.cOl CRF01_AE >10 >10
CNE8 CRF01_AE >10 >10
C1080.c03 CRF01_AE >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 133/159
128/152
10—1074 Vírus ID Clade IC50 IC80
R2184.c04 CRF01_AE >10 >10
R1166.c01 CRF01_AE >10 >10
R32 65.cO 6 CRF01_AE >10 >10
C2101.cOl CRF01_AE >10 >10
C3347.cll CRF01_AE >10 >10
C4118.c09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJGX009000 .02.4 CRF01_AE >10 >10
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
X1193_cl G 0, 070 0,207
P0402_c2_ll G 0, 008 0, 024
X1254_c3 G 0, 063 0,239
X2088_c9 G 0, 003 0, 010
X2131_C1_B5 G 0, 014 0, 056
P1981_C5_3 G 0, 004 0, 013
X1632_S2_B10 G >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 134/159
129/152
10—1074 Vírus ID Clade IC50 IC80
3016.v5.c45 D >10 >10
AO 7412M1.vrcl2 D 0, 011 0, 037
231965.cOl D >10 >10
231966.c02 D >10 >10
191821_E6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.c59 CD 0,706 4,492
6480.v4.c25 CD 0, 006 0, 023
6952.vl.c20 CD 0, 023 0, 086
6811.v7.018 CD 0, 003 0, 009
89-Fl_2_25 CD >10 >10
3301.vl.c24 AC 0, 018 0, 049
6041.v3.c23 AC >10 >10
654 0.v4.cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 AC D 0, 043 0, 197
3103.v3.cl0 AC D 0, 024 0, 061
Tabela 9. Valores de IC50 e IC80 em Ensaios TZM-bl para
10-1074
Virus ID PGT121 Clade IC5O IC80
6535.3 B 0, 003 0, 010
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 135/159
130/152
PGT121 Vírus ID Clade IC50 IC80
QH0692.42 B 0,498 8,507
SC422661.8 B 0, 079 0,373
PVO. 4 B 0, 094 0,450
TRO.11 B 0, 011 0, 037
AGIO .0.29 B 0, 019 0, 060
RHPA4259.7 B 0, 013 0, 046
THRO4156.18 B >10 >10
REJO4541.67 B >10 >10
TRJO4551.58 B 0, 802 >10
WITO4160.33 B 0,301 3,200
CAAN5342.A2 B 0, 008 0, 026
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 017 0, 062
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 002 0, 008
1054_07_TC4_1499 B (T/F) 0, 041 0,299
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 0, 034 0, 148
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 008 0, 034
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 0, 068 0,231
6244_13_B5_4576 B (T/F) 0, 172 1,471
62357_14_D3_4589 B (T/F) 6,215 >10
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0, 030 0, 108
Dul56.12 C 0, 006 0, 019
Dul72.17 C 0, 062 0,531
Du422.1 C 0, 017 0, 088
ZM197M.PB7 C >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 136/159
131/152
PGT121 Vírus ID Clade IC50 IC80
ZM214M.PL15 C 0,288 2,456
ZM233M.PB6 C 2,809 >10
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C 0, 001 0, 005
ZM109F.PB4 C 8,924 >10
ZM135M.PLIOa C 0,730 5, 727
CAP45.2.00.G3 C 1,300 >10
CAP210.2.00.E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 020 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C 0,772 7,986
HIV-16845-2.22 C 8,512 >10
CelO86_B2 C (T/F) 0, 003 0, 016
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 063
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 007 0, 030
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F CIG C (T/F) 0, 082 0,363
249M BIO C (T/F) >10 >10
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 036 0, 123
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 016 0, 042
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 137/159
132/152
PGT121 Vírus ID Clade IC50 IC80
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 823 6, 227
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 043 0,285
CNE19 BC 0, 012 0, 083
CNE2 0 BC 0, 003 0, 006
CNE21 BC 0, 009 0, 031
CNE17 BC 3, 962 >10
CNE3 0 BC 0, 088 0,288
CNE52 BC 4,914 >10
CNE53 BC 0, 014 0, 062
CNE58 BC >10 >10
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 017
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A 3, 071 >10
Q842.dl2 A 0, 010 0, 037
3415.vl.cl A >10 >10
33 65.v2.c2 A 0,243 2,133
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 038 0, 118
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 006 0, 016
T257-31 CRF02_AG >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 138/159
133/152
PGT121 Vírus ID Clade IC50 IC80
928-28 CRF02_AG >10 >10
263-8 CRF02_AG 0, 647 4, 680
T250-4 CRF02_AG 0, 003 0, 009
T251-18 CRF02_AG 5, 183 >10
T278-50 CRF02_AG >10 >10
T255-34 CRF02_AG 2, 631 >10
211-9 CRF02_AG 0, 866 6, 631
235-47 CRF02_AG 0,259 1, 601
620345.c01 CRF01_AE >10 >10
CNE8 CRF01_AE >10 >10
C1080.c03 CRF01_AE >10 >10
R2184.c04 CRF01_AE >10 >10
R1166.cOl CRF01_AE >10 >10
R32 65.cO 6 CRF01_AE >10 >10
C2101.cOl CRF01_AE >10 >10
C3347.cH CRF01_AE >10 >10
C4118.c09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJCX009000.02.4 CRF01_AE 9, 001 >10
BJOX015000.il.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX025000.01.1 CRF01_AE >10 >10
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 139/159
134/152
PGT121 Virus ID Clade IC50 IC80
(T/F)
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
X1193_cl G 0, 022 0, 088
P0402_c2_ll G 0, 007 0, 022
X1254_c3 G 0, 029 0, 085
X2088_c9 G 0, 007 0, 022
X2131_C1_B5 G 0, 011 0, 037
P1981_C5_3 G 0, 002 0, 009
X1632_S2_B10 G >10 >10
3016.v5.c45 D >10 >10
A07412M1.vrcl2 D 0, 034 0,255
231965.cOl D >10 >10
231966.c02 D >10 >10
191821_E6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.c59 CD >10 >10
6480.v4.c25 CD 0, 008 0, 029
6952.vl.c20 CD 0, 049 0,348
6811.v7.cl8 CD 0, 002 0, 007
89-Fl_2_25 CD >10 >10
3301.vl.c24 AC 0, 013 0, 041
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 140/159
135/152
Vírus ID PGT121
Clade IC50 IC80
6041.v3.c23 AC >10 >10
654 0.v4.cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 AC D 0, 017 0, 085
3103.v3.cl0 AC D 0, 024 0, 073
Tabela 10. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl para
PGT121
Titer in TZM.bl células (ug/ml) IC80
Vírus ID NC37 + BG1 + BG18
Clade IC50
6535.3 B 0, 006 0, 030
QH0692.42 B 0, 033 0, 130
SC422661.8 B 0, 024 0, 089
PVO. 4 B 0, 012 0, 050
TRO.11 B 0, 004 0, 015
AGIO.0.29 B 0, 006 0, 016
RHPA4259.7 B 0,210 1, 669
THRO4156.18 B >50 >50
REJO4541.67 B 0, 199 0,696
TRJO4551.58 B 0, 938 7, 063
WITO4160.33 B 0, 021 0, 075
CAAN5342.A2 B 0, 036 0, 162
YU2.DG B 0, 052 0, 147
WEAU_dl5_410_7 8 7 B (T/F) 0, 022 0, 074
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 141/159
136/152
Titer in TZM.bl células (ug/ml) NC37 + BG1 + BG18 IC80
Virus ID Clade IC5O
1006_11_C3_1601 B (T/F) 0, 005 0, 013
1054_07_TC4_1499 B (T/F) 0, 022 0, 122
1056_1O_TA11_1826 B (T/F) 0, 031 0,266
1012_ll_TC21_3257 B (T/F) 0, 012 0, 055
6240_08_TA5_4622 B (T/F) 0, 009 0, 028
6244_13_B5_4576 B (T/F) 0, 045 0,216
62357_14_D3_4589 B (T/F) 0, 840 5, 585
SC05_8Cll_2344 B (T/F) 0, 045 0, 083
Dul56.12 C 0, 018 0, 050
Dul72.17 C >50 >50
Du422.1 C 0, 076 0,347
ZM197M.PB7 C 4, 123 >50
ZM214M.PL15 C >50 >50
ZM233M.PB6 C 7, 814 >50
ZM249M.PL1 C 2,916 17,336
ZM53M.PB12 C >50 >50
ZM109F.PB4 C >50 >50
ZM135M.PLIOa C 6, 018 31,451
CAP45.2.00.G3 C 0,251 1, 097
CAP210.2.00.E8 C 19,144 >50
HIV-001428-2.42 C 0, 029 0, 075
HIV-0013095-2.11 C 31,333 >50
HIV-16055-2.3 C 12,372 43,320
HIV-16845-2.22 C 0, 092 0,316
CelO86_B2 C (T/F) 2,088 13,998
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 142/159
137/152
Titer in TZM.bl células (ug/ml) NC37 + BG1 + BG18 Virus ID Clade IC50 IC80
CeO393_C3 C (T/F) >50 >50
Cell76_A3 C (T/F) 0, 013 0, 030
Ce2010_F5 C (T/F) >50 >50
CeO682_E4 C (T/F) >50 >50
Cell72_Hl C (T/F) 0, 017 0, 047
Ce2060_G9 C (T/F) >50 >50
Ce703010054_2A2 C (T/F) >50 >50
BF1266.431a C (T/F) 45,589 >50
246F CIG C (T/F) 0, 172 1,220
249M BIO C (T/F) 4,422 17,159
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 6,417 >50
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 011 0, 035
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 078 1,405
Ce704809221_1B3 C (T/F) 10,937 >50
CNE19 BC 1,576 17,656
CNE2 0 BC 0, 008 0, 024
CNE21 BC 0, 009 0, 022
CNE17 BC 0, 195 0,709
CNE3 0 BC 0, 067 0, 183
CNE52 BC 0, 077 0, 199
CNE53 BC 0, 015 0, 036
CNE58 BC 0, 055 0,206
MS208.Al A 2,393 17,933
Q23.17 A 0, 009 0, 024
Q461.e2 A >50 >50
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 143/159
138/152
Titer in TZM.bl células (ug/ml) NC37 + BG1 + BG18 IC8O
Virus ID Clade IC5O
Q769.d22 A 0,364 2,151
Q259.d2.17 A >50 >50
Q842.dl2 A 0,405 1,371
02 60.v5.c3 6 A 0, 018 0, 055
3415.vl.cl A 0, 039 0, 187
33 65.v2.c2 A 0, 020 0, 049
191955_A11 A (T/F) 0, 830 4,335
191084 B7-19 A (T/F) 0, 029 0, 071
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 027 0, 090
T257-31 CRF02_AG >50 >50
928-28 CRF02_AG 1,919 7,522
263-8 CRF02_AG 0,544 3,759
T250-4 CRF02_AG 0, 005 0, 029
T251-18 CRF02_AG 0, 133 0, 639
T278-50 CRF02_AG 9,069 44,006
T255-34 CRF02_AG 37,020 >50
211-9 CRF02_AG 1,976 18,953
235-47 CRF02_AG 0, 013 0, 046
620345.cOl CRF01_AE 1,325 8,233
CNE8 CRF01_AE >50 >50
C1080.c03 CRF01_AE 0, 012 0, 042
R2184.c04 CRF01_AE 0, 084 0,376
R1166.cOl CRF01_AE >50 >50
C2101.cOl CRF01_AE >50 >50
C3347.ell CRF01_AE >50 >50
Petição 870200021372, de 13/02/2020, pág. 144/159
139/152
Titer in TZM.bl células (ug/ml) NC37 + BG1 + BG18 Virus ID Clade IC50 IC80
C4118.c09 CRF01_AE >50 >50
CNE5 CRF01_AE 1,465 6, 578
BJGX009000.02.4 CRF01_AE >50 >50
BJGX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJOXOIOOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJGX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >50 >50
X1193_cl G 0, 036 0, 130
P0402_c2_ll G 0, 023 0, 088
X1254_c3 G 0, 016 0, 038
X2088_c9 G 0, 007 0, 021
X2131_C1_B5 G 0, 016 0, 036
P1981_C5_3 G 0, 022 0, 063
X1632_S2_B10 G 0,275 0, 986
3016.v5.c45 D 8,359 >50
A07412M1.vrcl2 D 0, 189 2,455
231965.cOl D >50 >50
231966.c02 D >50 >50
191821_E6_1 D (T/F) >50 >50
3817.v2.c59 CD 0,582 2,883
6480.v4.c25 CD 0, 108 0,476
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140/152
Titer in TZM.bl células NC37 + BG1 + BG18 (ug/ml) IC5O IC80
Virus ID Clade
6952.vl.c20 CD 0, 011 0, 027
6811.v7.018 CD 0, 009 0, 035
89-Fl_2_25 CD 5, 379 >50
3301.vl.c24 AC 0, 074 0,260
6041.v3.c23 AC 0, 085 0,233
654 0.v4.cl AC >50 >50
6545.v4.cl AC >50 >50
0815.v3.c3 AC D 0, 071 0,321
3103.v3.cl0 AC D 0, 009 0, 017
Tabela 11. Valores de IC50 e IC80 em Ensaio TZM-bl da
Combinação 1:1:1 de NC37, BG1, e BG18 contra o
Painel de Virus 118
BG18
[00115] Ao nivel de aminoácido BG18 é 63% e 62% idêntico às cadeias pesadas de 10-1074 e PGT121, respectivamente, ambas originárias de um precursor da linha germinal Vh4-59. O BG18 surge do gene da linha germinal intimamente relacionado (90,8% de identidade) Vh4-4 (Figura 6A) . O alinhamento das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) das cadeias pesadas de PGT121, 10-1074 e BG18 e suas variantes clonais mostram um grau de similaridade elevado entre as CDRHls e CDRH2s. O CDRH3 de BG18 são três resíduos mais curtos do que PGT121/10-1074 (21 versus 24 resíduos; Figura 2A e Figura 6B) . Em adição, BG18 patilha 6 das 7 mutações nas regiões de estrutura que são comuns para a
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141/152 família PGT121 (Figura 2A), mas ao contrário dos membros do PGT121/10-1074 não contém quaisquer inserções ou deleções.
[00116] 0 BG18 utiliza o segmento do gene VL Vl2-25, e é relacionado por apenas 46% e 50% de identidade ao nivel da sequência de aminoácido para o segmento de gene Vl3-21 utilizado por PGT121 e 10-1074, respectivamente (Figura 2B, Figura 6C e Figura 6D). Em adição, as cadeias leves de BG18 e suas variantes são ligeiramente mais mutadas em comparação com 10-1074 e PGT121, mas como as cadeias pesadas, não contêm quaisquer inserções ou deleções. Assim, BG18 e suas variantes clonais apresentam cadeias pesadas similares aos anticorpos da classe PGT121/10-1074 previamente isolados, mas diferentes cadeias leves.
[00117] A estrutura cristalina de resolução 1,3 Â do Fab BG18 Fab revelou que os círculos de CDR formam um local de combinação compacto, com exceção de CDRH3, que ressalta aproximadamente 11 Â além dos outro CDRs, apresentando uma ponta, consistindo predominantemente de resíduos hidrofóbicos (Figura 2C) . Em vez de se estender completamente, a CDRH3 se dobra sobre si mesmo em uma conformação estabilizada por ligação de nitrogênio entre os GlylOOaHc, VallOObnc, VallOOcnc, GlylOOenc e Glul00fHc resíduos de CDRH3 (Figura 2C). A CDRL2 está desordenada na estrutura, sugerindo que pode adotar múltiplas conformações no anticorpo não ligado. A superimposição de estruturas não ligado BG18, PGT121 (PDB 4FQ1) e 10-1074 Fab (PDB 4FQ2) revelou que seus domínios Vh se alinhado rigorosamente com exceção da CDRH3, que está posicionada sobre o domínio Vh em BG18, mas se inclina marcadamente sobre Vl nas estruturas
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PGT121 e 10-1074 Fab (Figura 2D). Consistente com as identidades de sequências baixas, relacionando as cadeias leves BG18 e PGT121 (Figura 2B, Figura 6C e Figura 6D), os domínios Vl alinhados (desvios quadrados médios de 3,1 Â foram encontrados para sobreposição 93 ou 92 átomos Ca em comparações de cadeia leves nas superposições de BG18-PGT121 e BG18-10-1074, respectivamente) mostraram diferenças nas orientações de todos os círculos CDRL (Figura 2D) . Apesar destas diferenças, fenda entre CDRH2 e CDRH3 em PGT121 e 101074 é também observada em BG18 (Figura 2E). Os resíduos que revestem esta fenda interagem com um N-glicano do tipo complexo em uma estrutura Fab de PGT121 glicosilatado e interagem com o N-glicano ligado a Asnl37gpi2o na estrutura complexa PGT122-BG505 SOSIP (PDB 4TVP). O BG18 apresenta uma segunda fenda entre CDRH3 e CDRL1/CDRL3, que não pode formar em PGT121 e seus parentes clonais, devido ao posicionamento de CDRH3 sobre a cadeia leve nesses anticorpos (Figura 2E) . Em adição a estas diferenças estruturais, o potencial de superfície eletrostática dos domínios BG18 VhVl mostra uma distribuição diferente de trechos carregados positivamente em comparação com os potenciais de superfície de PGT121 e 10-1074 (Figura 7). Tomados em conjunto, estes resultados estão consistentes com as diferenças no reconhecimento de Env pela BG18, em comparação com o reconhecimento pelos bNAbs relacionados com PGT121.
[00118] Para investigar como o BG18 reconhece Env, foi resolvida uma estrutura microscópica eletrônica (Electron Microscopy - EM) em partícula única com resolução negativa de aproximadamente 25 Â do trímero BG505 SOSIP.664 no
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143/152 complexo com Fabs de BG18 e o CD4bs bNAb 179NC75. A adaptação das coordenadas da estrutura de cristal de Fab de BG18 no mapa de EM (Figura 2F) permitiu a comparação entre os ângulos de abordagem e potenciais de interações de Env de BG18 e outros Asn332gpi2o-V3 bNAbs (Figura 2G) . Similar ao PGT122 (uma variante de PGT121) e 10-1074, prevê-se que o CDRH3 de BG18 interaja com o glicano Asn332gpi2o e o motif 324GDIR327 de gpl20. No entanto, enquanto PGT122 e 10-1074 exibem ângulos de abordagem semelhantes para a ligação Env, BG18 contacta o trimero Env em um ângulo diferente, que é deslocado por 34-41° em relação ao PGT122 e PGT124 (Figura 2G).
[00119] 0 BG18 foi avaliado por neutralização contra um painel de pseudovirus HIV-1 com deleções de locais de glicosilação ligados a específicos N. Os resultados indicaram que nenhum dos glicanos na base do círculo V3, com exceção do Asn332gpi2o, teve um impacto na atividade de neutralização (Tabela 12). Consistentes com estes dados, o BG18 ligou-se preferencialmente como glicopeptídeos V3 sintético contendo oligomanose N-glicanos do tipo complexo na posição Asn332gpi2o e não para glicopeptídeos contendo Ν'glicanos do tipo complexo ligados a esta posição, ou para outros potenciais locais glicosilação ligado a N dentro do gpl20 (Figura 9) . Estes dados sugerem que as propriedades de reconhecimento do BG18 são mais similares para 10-1074 do que ao PGT121.
BG8 BG18 PGT121 12A12
BG505 (T332N) 0, 007 0, 001 0, 012 0, 030
N137A 0, 003 0, 001 0, 002 0, 027
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144/152
BG8 BG18 PGT121 12A12
N15 6A 0, 008 0, 001 0, 007 0, 024
N2 95A 0, 009 0, 001 0, 014 0, 044
N3 01A 0, 004 0, 001 0, 011 0, 027
N33 9A 0, 007 0, 001 0, 016 ND
N3 8 6A 0, 004 0, 001 0, 015 0, 030
N392A 0, 005 0, 001 0, 006 0, 012
JR-CSF 0, 009 0, 001 0, 011 0,233
N2 95A 0, 006 0, 001 0, 016 0,203
N3 01A 0, 006 0, 001 0, 011 0, 010
N332A > 50 > 50 > 50 0,240
N33 9A 0, 010 0, 001 0, 007 0, 028
N362A 0, 008 0, 001 0, 018 0,267
N3 8 6A 0, 012 0, 001 0, 024 0,332
N392A 0, 014 0, 002 0, 017 0,230
G324A 0, 005 0, 001 0, 044 0,236
D325A 0, 005 0, 001 0, 079 0,203
I326A 0, 005 0, 001 0, 024 0,278
R327A 0, 005 0, 001 0, 018 0, 131
Q328A 0, 023 0, 001 0, 057 0, 038
H330A 0, 050 0, 001 0, 017 0,288
92BR020 0, 015 0, 001 0, 004 0, 050
N13 6A 0, 005 0, 001 0, 002 0, 027
N15 6A 0, 011 0, 001 0, 003 0, 035
N3 01A 0, 009 0, 001 0, 003 0, 011
N332A > 50 > 50 0, 080 0, 039
N3 8 6A 0, 012 0, 003 0, 006 0, 055
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BG8 BG18 PGT121 12A12
N392A 0, 023 0, 001 0, 007 0, 105
D325A 0, 006 0, 001 0, 006 0, 050
I326A 0, 006 0, 001 0, 002 0, 011
R327A 0, 011 0, 001 0, 001 0, 022
Q328A 0, 018 0, 001 0, 002 0, 028
H330A 0, 018 0, 001 0, 003 0, 073
N136A + N332A > 50 > 50 > 1 0, 025
N156A + N332A > 50 > 50 > 1 0, 023
N301A + N332A > 50 > 50 > 1 0, 007
N136A + N156A + N301A 0, 001 0, 001 0, 001 0, 013
Tabela 12. Valores IC50 e IC80 no Ensaios TZM-bl de BG18,
BG8 PGT121 e controle mAb 12A12 contra mutantes de envelope V3 selecionado
NC37
[00120] Uma estrutura de cristal de 2,7 Â de resolução de NC37 Fab (Figura 1C) ligada a um núcleo gpl20 verificou que o NC37 reconhece os CD4bs (Figuras 8A e 8B). Com base apenas na sequência, inicialmente foi difícil determinar se o Vh de NC37 era derivada do gene da linha germinativa VhI-2 ou VhI46, porque alguns membros da família NC37 estavam alinhados com o Vh1-2, enquanto outros estavam alinhados para Vh1-46 (Tabela 13) . No entanto, as comparações estruturais revelaram que o NC37 adota uma orientação similar e ângulo de ligação semelhantes aos dos anticorpos 8ANC131/134 derivados de Vh1-46 (Figuras 8A e 8B) . Como uma consequência, o NC37 utiliza a sua cadeia leve para contatar resíduo Asn28Ogpi2o do círculo D, enquanto anticorpos derivados de Vh1-2, tais como NIH45-46, utilizam as suas cadeias pesadas
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146/152 para contactar o Asn28Ogpi2o. A CDRH3 de NC37 estende-se para o domínio interno de gpl20, formando contatos entre TyrlOOGnc resíduo CDRH3 e Lys97gpi2o e Glul O2gpi2ogpl2 0 resíduos de domínio interno de gpl20. Sobrepondo o complexo NC37 Fabgpl20 em uma estrutura trímero SOSIP, sugere-se que o NC37 CDRH3 faça contato com os protômero adjacentes dentro do trímero Env (Figura 8C).
[00121] NC37 foi isolada em 2010, enquanto BG1 e BG18 foram isoladas a partir de PBMCs coletados em 2014. PBMCs disponíveis foram examinados a partir de 2010 e 2013 utilizando os primers PCR específicos para BG1 e BG18. Enquanto as transcrições BG1 foram detectadas em ambos os pontos de tempo, BG18 foi detectada pela primeira vez em 2013. Isso indica que BG18 surgiu entre 2010 e 2013, enquanto BG1 e NC37 desenvolveu anteriormente.
Neutralização de Autólogo
[00122] Para examinar o efeito dos 3 bNAbs em vírus autólogo, genes env individuais de vírus de plasma circulante foram clonados por sequenciação de genoma simples (SingleGenome Sequencing - SGS) de cinco pontos de tempos diferentes durante 2006-2015 (2006, 2010, 2013, 2014 e 2015). Apenas 37 transcritos funcionais no quadro foram recuperados, em parte devido a valores de carga viral abaixo de 400 copias/ml em todos os pontos de tempo. Além disso, todas as sequências recuperadas a partir de 2015 foram não funcionais (Figura 10). As 37 sequências funcionais formaram três clusters Cluster A, continha uma sequência de 2006 que era aproximadamente 15% diferente do resto das sequências, Cluster Β, o maior cluster, continha sequências de todos os
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147/152 quatros pontos do tempo e Cluster C continha 3 sequências, todas a partir de 2014 (Figura 3A) . De acordo com o novo cluster de sequências que surgiu em 2014, foi observado um aumento na diversidade viral entre 2013 e 2014 (Figura 3B). [00123] Todas as 3 sequências no Cluster C continham mutações que alteravam o local de glicosilação ligado a N em Asn332gpi2o, enquanto as outras 34 sequências tinham um local de glicosilação ligado a N intacto em Asn332gpi2o (Figura 3A) . EM adição, todas as três sequências no Cluster C tinham um resíduo Asp282gpi2o que não foi encontrado nas outras 34 sequências. A posição 282gpi2o carrega um Lys em 94,4% de todas as sequências HIV-1 na Base de Dados de Los Alamos, e Asp nesta posição está associado com a resistência aos anticorpos CD4bs.
[00124] Para determinar a sensibilidade dos Envs funcionais para os três bNAbs autólogos, os psuedovírus foram produzidos e testados em ensaio TZM-bl. Dos 35 pseudovirus que foram produzidos com sucesso, apenas 4 foram resistentes a todos os três bNAbs. Estes foram Envs do Cluster C, encontrados no plasma de 2014, e um de 2013 (Figura 3C e Figura 10). Os restantes 31 pseudovirus (88,5% de todos os pseudovirus) foram sensíveis para pelo menos um dos três bNAbs. Em adição, os pseudovirus de 2006, 2010 e 2014 foram testados quanto a sua sensibilidade para IgG de soro concomitantemente isolado do mesmo ponto do tempo que os genes env viral (IgG do plasma de 2013 não estava disponível para este ensaio) . Os resultados indicaram que 19 dos 22 vírus testados foram ainda neutralizados pela IgG contemporânea (Figura 3C e Figura 10).
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[00125] Os vírus sensíveis BG18- e NC37-, bem como os vírus sensíveis para IgG concorrente, foram encontrados em todos os pontos de tempo analisados, incluindo os tempos em que foram isolados BG18 e NC37 (Figura 3D) . Em contraste, a maioria das estirpes, com exceção de um vírus de 2006, eram resistentes ao BG1. Isso sugere que a maioria dos vírus autólogo no doador EB354 escapou do BG1, mas não conseguiu escapar dos anticorpos BG18 e NC37, indicando assim a amplitude e potência de BG18 e NC37.
[00126] Embora não tenha sido possível obter sequências virais a partir de amostra de plasma de 2015, foi possível cultivar vírus a partir de duas das cinco culturas de crescimento viral EB354 CD4+ (Viral Outgrowth Cultures VOCs). Em ambos os casos as culturas levaram mais de cinco semanas para se tornarem positivas para o vírus conforme medido por ELISA p24. As sequências SGS de ambas as culturas de crescimento de 2015 agruparam-se intimamente com sequências do Cluster C e não tinham local de glicosilação ligada a N em Asn332gpi2o (Figura 3A) . Além disso, todas as sequências mostraram Asp282gpi2o. Consistente com estes resultados, os sobrenadantes de cultura de 2015 foram resistentes para todos os três bNAbs nos ensaios TZM-bl (Figura 3E).
Eficácia In vivo de BG18, NC37 e BG1
[00127] Para determinar se BG18 ou NC37 podem exercer independentemente pressão seletiva sobre o HIV-1 ín vivo, ratos humanizados (hu-mice) foram infectados com HIV-1yu2 e a infecção estabelecida foi tratada. O BG1 mostrou atividade fraca contra HIV-lYu2 (IC50 = 15,8 pg/ml) e por isto foi
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149/152 utilizado apenas em experimentos de tratamento de combinação subsequente e não em experimentos de monoterapia. De forma semelhante à 10-1074, a administração de BG18 ou BG8, uma variante clonal menos potente, mas ainda eficaz, foi associada com um decréscimo rápido (média de 1,5 logio) na carga viral, seguido por viremia de reboque (Figura 4A, Figura 11 e Figura 12) . Todas as sequências de viremia de reboque continham uma mutação que alterou o local de glicosilação ligado a N em Asn332gpi2o (Figuras 4B e 4C) . monoterapia com NC37 também suprimiu transientemente a viremia, mas a magnitude da diminuição da carga viral foi menos profunda do que com BG18, média de 0,5 logio (Figura 4A e Figura 12). Isso indica que o BG18 e NC37 são eficazes no tratamento da HIV, com BG18 tendo os efeitos mais profundos. A maior parte das sequências Env viral de reboque NC37 mostrou uma mutação R456K que está associada com resistência aos anticorpos CD4bs (Figuras 4B e 4C) . Isso indica adicionalmente que o BG18 e NC37 podem selecionar variantes resistentes ao anticorpo do HIV-1yu2 ín vivo em ratos humanizados.
[00128] Combinações de anticorpos podem controlar infecção HIV-1yu2 em ratos hu. Para determinar se a combinação de BG18, NC37 e BG1 pode controlar a viremia em 5 ratos hu infectados com HIV-1yu2 que foram tratados com uma combinação 1:1:1 dos três bNAbs (BG18, NC37 e BG1). Pouco depois da administração dos três bNAbs, as cargas virais foram reduzidas em todos os animais com uma medida de 1,74 Logio, e, surpreendentemente, 4/5 ratos mostraram cargas virais virtualmente indetectáveis depois de 3 semanas (Figuras 4D e 4E). A viremia repercutiu
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150/152 em apenas um rato, T6, e isso ocorreu apenas três semanas depois da terapia ser descontinuada. Os restantes quatro ratos continuaram novamente apresentando viremia suprimida ou indetectável, mesmo após 4 semanas sem terapia (Figuras 4D e 4E) . Isto indica que, quer sejam aplicados individualmente, mas especialmente em combinação, NC37, BG1, e especialmente BG18 são potentes para supressão duradoura e neutralização do HIV-1 ín vivo.
Anticorpo Próximo Próximo Mutações Somáticas em V Sequência
(nt) VH % VL
NC37 1-2/1-46 K3-20 28,8 27,9 DNFGTRPVPGRGYYY GMDV (SEQ ID NO: 105)
NC133 1-46 K3-20 28 23,2 DNRGDRNVPGRGYYY GMDV (SEQ ID NO: 106)
NC102 1-2 K3-20 27,1 22,2 DNFGTRPVPGRGYYY GMDV (SEQ ID NO: 107)
AC4 0 1-46 K3-20 33,5 21,1 DNFGESHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 108)
AC41 1-46 K3-20 30, 1 21,5 DNFGESHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 109)
AC72 1-46 K3-20 29, 8 20, 8 DNFGESHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 110)
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Anticorpo Próximo Próximo Mutações Somáticas em V (nt) % Sequência
VH VL
BG8 4-4 L3-25 25, 4 20,5 NVIRVFGVISLGEWFHY GMDV (SEQ ID NO: 4)
BG18 4-4 L3-25 21,2 17,7 NAIRIYGWALGEWFHY GMDV (SEQ ID NO: 12)
BG33 4-4 L3-25 25 18,4 NVIRVFGVISLGEWFHY GMDV (SEQ ID NO: 28)
BG42 4-4 L3-25 23,7 19, 4 NVIRVFGVISLGEWFHY GMDV (SEQ ID NO: 20)
BG1 3-49 Kl-39 27,2 19, 9 EQRNKDYRYGQEGFGYSY GMDV (SEQ ID NO: 76)
BG22 3-49 Kl-39 26,8 23,4 EQRGGDGRYSGDGFGYPY GMDV (SEQ ID NO: 84)
BG47 3-49 Kl-39 27,1 22 EQRGANGRYGGDGFGYSY GMDV (SEQ ID NO: 92)
Tabela 13. Clones Neutralizante. Característica genética dos anticorpos, variantes representativas de cada um dos três clones (azul, magenta e verde) que
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152/152 mostram atividade neutralizante. São indicados os níveis de mutações Vh, Vl, bem como as sequências da CDRH3 (baseada na definição do IMGT).
[00129] Os exemplos e descrições precedentes das concretizações preferidas devem ser tomadas como ilustrativas, em vez de limitação da presente invenção como definido pelas reivindicações. Como será prontamente apreciado, numerosas variações e combinações das características apresentadas acima podem ser utilizadas sem se afastar da presente invenção como estabelecido nas reivindicações. Tais variações não são consideradas como um desvio do escopo da invenção, e todas estas variações devem ser incluídas dentro do escopo das reivindicações seguintes. Todas as referências citadas neste documento são incorporadas inteiramente por referência.

Claims (7)

1. Anticorpo anti-HIV-1 isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo pelo menos uma região determinante da complementariedade (CDR - Complementarity Determining Region) caracterizado por possuir uma sequência selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 4244, 46-48, 50- 52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 7476, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92 e 94-96.
2. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com a reivindicação 1, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH 1, CDRH 2, e CDRH 3, caracterizado por:
o CDRH 1, CDRH 2 e CDRH 3 compreenderem as respectivas sequências de um conjunto de CDRH selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 2-4, SEQ ID NOs: 10-12, SEQ ID NOs: 18-20, SEQ ID NOs: 26-28, SEQ ID NOs: 34-36, SEQ ID NOs: 42-44, SEQ ID NOs: 50-52, SEQ ID NOs: 58-60, SEQ ID NOs: 66-68, SEQ ID NOs: 74-76, SEQ ID NOs: 82-84, e SEQ ID NOs: 90-92.
3. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo a região variável de cadeia leve que compreende CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3, caracterizado por:
o CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreenderem as respectivas sequências de um conjunto de CDRL selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 6-8, SEQ ID NOs: 14-16, SEQ ID NOs: 22-24, SEQ ID NOs: 30-32, SEQ ID NOs: 38-40, SEQ ID NOs: 46-48,
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SEQ ID NOs: 54-56, SEQ ID NOs: 62-64, SEQ ID NOs: 70-72, SEQ ID NOs : 78-80, SEQ ID NOs: 86-88, e SEQ ID NOs: 94-96. 4. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com a reivindicação 3, ou porção de ligação de antigeno do mesmo, caracterizado por: o CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreenderem as respectivas sequências de um
conjunto de CDR selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 2-4 e 6-8; SEQ ID NOs: 10-12 e 14-16; SEQ ID NOs: 18-20 e 22-24; SEQ ID NOs: 2628 e 30-32, e SEQ ID NOs: 34-36 e 38-40; SEQ ID NOs: 42-44 e 46-48; SEQ ID NOs: 50-52 e 54-56; SEQ ID NOs: 58-60 e 62-64; SEQ ID NOs: 66-68 e 70-72; SEQ ID NOs: 74-76 e 78-80; SEQ ID NOs: 8284 e 86-88; e SEQ ID NOs: 90-92 e 94-96.
5. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, ou porção de ligação de antigeno do mesmo, caracterizado por compreender uma ou ambas de (1) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, e 89 e (11) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de cadeia leve selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, e 93.
6. Anticorpo anti-HIV-1 isolado da reivindicação 5, ou porção de ligação de antigeno do mesmo, caracterizado por:
a cadeia pesada e a cadeia leve compreenderem as respectivas sequências das SEQ ID NOs: 1 e 5; SEQ
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3/Ί
ID NOs: 9 e 13; SEQ ID NOs: 17 e 21; SEQ ID NOs:
25 e 29; SEQ ID NOs: 33 e 37; SEQ ID NOs: 41 e 45; SEQ ID NOs: 49 e 53; SEQ ID NOs: 57 e 61; SEQ ID NOs: 65 e 69; SEQ ID NOs: 73 e 77; SEQ ID NOs: 81 e 85; e SEQ ID NOs: 89 e 93.
7. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado por:
o anticorpo ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo químico.
8. Anticorpo anti-HIV-1 isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado por:
o anticorpo antígeno ou porção de ligação do mesmo ser feito de forma recombinante.
9. Ácido nucleico isolado caracterizado por compreender uma sequência codificando um CDR, uma região variável de cadeia pesada, ou uma região variável de cadeia leve do anticorpo anti-HIV-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, ou porção de ligação de antígeno do mesmo.
10. Vetor caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 9.
11. Cultura celular caracterizado por compreender o vector da reivindicação 10.
12. Composição farmacêutica caracterizado por compreender (i) um primeiro anticorpo anti-HIV-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, ou porção de ligação de
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4/Ί antígeno do mesmo, e (ii) um transportador aceitável farmaceuticamente.
13. Composição farmacêutica da reivindicação 12 caracterizada por:
o primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH 1, CDRH 2, e CDRH 3, em que o CDRH 1, CDRH 2 e CDRH 3 compreendem as respectivas sequências SEQ ID NOs:10-12.
14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-13 caracterizado por:
0 primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreende uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL 1, CDRL 2, e CDRL 3, em que as CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreendem as respectivas sequências SEQ ID NOs: 14-16.
15. Composição farmacêutica da reivindicação 14 caracterizado por:
a CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreenderem as respectivas sequências das SEQ ID NOs: 10-12 e 14-16.
16. Composição farmacêutica da reivindicação 15 caracterizado por:
a cadeia pesada e a cadeia leve compreenderem as respectivas sequências das SEQ ID NOs: 9 e 13.
17. Composição farmacêutica da reivindicação 16 caracterizado por:
o primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreender BG18.
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18. Composição farmacêutica da reivindicação 12, adicionalmente caracterizado por compreender um segundo anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de antígeno do mesmo.
19. Composição farmacêutica da reivindicação 18, caracterizado por:
o segundo anticorpo anti-HIV-1 ser selecionada do grupo consistindo de NC37, NC133, NC102, AC40, AC41 e AC72.
20. Método de tratamento de uma infecção por HIV-1 caracterizado por compreender: identificar um indivíduo necessitando do mesmo, e administrar para o referido indivíduo um primeiro agente terapêutico compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um primeiro anticorpo anti-HIV-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, ou porção de ligação de antígeno do mesmo ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-19.
21. Método da reivindicação 20, adicionalmente caracterizado por compreender administrar um segundo agente terapêutico.
22. Método da reivindicação 21, caracterizado por:
o segundo agente terapêutico ser selecionado do grupo consistindo de um inibidor não nucleosídeos de transcriptase reversa, um inibidor de protease, um inibidor de entrada ou fusão, um inibidor de integrase, e um segundo anticorpo anti-HIV-1 ou porção de ligação de antígeno do mesmo.
Petição 870200051276, de 24/04/2020, pág. 11/13
6/Ί
23. Método da reivindicação 22, caracterizado por:
o segundo anticorpo anti-HIV-1 ser selecionada do grupo consistindo de NC37, NC133, NC102, AC40, AC41 e AC72.
24. Composição de vacina caracterizada por compreender um anticorpo anti-HIV-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, ou porção de ligação de antígeno do mesmo.
25. Composição de vacina da reivindicação 24 caracterizada por:
o primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH 1, CDRH 2, e CDRH 3, em que as CDRH 1, CDRH 2 e CDRH 3 compreendem as respectivas sequências SEQ ID NOs:10-12.
26. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-25 caracterizada por:
o primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreender uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL 1, CDRL 2, e CDRL 3, em que as CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreendem as respectivas sequências SEQ ID NOs: 14-16.
27. Composição farmacêutica da reivindicação 16 caracterizada por:
a CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, CDRL 1, CDRL 2 e CDRL 3 compreenderem as respectivas sequências de SEQ ID NOs: 10-12 e 14-16.
28. Composição farmacêutica da reivindicação 17 caracterizada por:
Petição 870200051276, de 24/04/2020, pág. 12/13
7/7 a cadeia pesada e a cadeia leve compreenderem as respectivas sequências de SEQ ID NOs: 9 e 13.
29. Composição farmacêutica da reivindicação 28 caracterizada por:
o primeiro anticorpo anti-HIV-1 compreender BG18 ou BG1.
30. Método de prevenir infecção de HIV-1 em um indivíduo necessitando do mesmo caracterizado por compreender administrar para o referido indivíduo a composição de vacina de qualquer das reivindicações 24-29.
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