EA042959B1 - Нейтрализирующие анти-вич-1 антитела широкого спектра действия и способы их применения - Google Patents

Нейтрализирующие анти-вич-1 антитела широкого спектра действия и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA042959B1
EA042959B1 EA201991591 EA042959B1 EA 042959 B1 EA042959 B1 EA 042959B1 EA 201991591 EA201991591 EA 201991591 EA 042959 B1 EA042959 B1 EA 042959B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hiv
antibody
antigen
antibodies
binding portion
Prior art date
Application number
EA201991591
Other languages
English (en)
Inventor
Мишель Нуссенцвейг
Наталия Т. Фройнд
Памела Дж. Бьеркман
Луиз Шарф
Original Assignee
Дзе Рокфеллер Юниверсити
Кэлифорниа Инститьют Оф Текнолоджи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Рокфеллер Юниверсити, Кэлифорниа Инститьют Оф Текнолоджи filed Critical Дзе Рокфеллер Юниверсити
Publication of EA042959B1 publication Critical patent/EA042959B1/ru

Links

Description

I. Заявление о федеральном финансировании
Настоящее изобретение создано при государственной поддержке в рамках гранта AI100148, выделенного Национальным институтом здравоохранения (NIH). Государство США обладает определенными правами на настоящее изобретение.
II. Область техники, к которой относится изобретение
Областью изобретения является нейтрализующие анти-ВИЧ-1 антитела (bNab) широкого спектра действия и способы их применения.
III. Уровень техники
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - это лентивирус (семейство Retroviridae), который заражает людей. Если не лечить ВИЧ-инфекцию, то со временем она приведет к развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), состояния, при котором прогрессирующая недостаточность иммунной системы позволяет процветать опасным для жизни оппортунистическим инфекциям (например, токсоплазмоз) и раковым заболеваниям (например, саркома Капоши), что в конечном итоге приводит к смерти зараженного человека. Без лечения среднее время выживания после первичной инфекции составляет всего от 9 до 11 лет. ВИЧ/СПИД представляет собой серьезный глобальный кризис в области здравоохранения, который CDC считает пандемией: по состоянию на 2014 год около 37 миллионов человек инфицированы ВИЧ, в результате которого в том же году умерло около 1,2 миллиона человек.
ВИЧ имеет несколько подтипов, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-2. ВИЧ-1 является более вирулентным, более инфекционным и преобладающей формой во всем мире, тогда как ВИЧ-2 является менее вирулентным, менее инфекционным и в настоящее время распространен только в Западной Африке. ВИЧ-1 является причиной большинства случаев ВИЧ-инфекций и, следовательно, представляет собой более клинически значимую мишень. ВИЧ-1 включает несколько подгрупп, в том числе группу М, группу N, группу О и группу Р. Группа М, означающая основная, включает примерно 90% случаев ВИЧ-инфекции и подразделяется еще на другие подтипы, А-К, которые иногда подразделяются еще на дополнительные подтипы (A1, A2 и т.д.). Исключительное разнообразие ВИЧ-1, вызванное высокой частотой мутаций, затрудняет эффективное лечение ВИЧ. Для борьбы с этой проблемой исследователи пытались разработать так называемые нейтрализующие антитела (bNAb) широкого спектра действия, обозначенные таким образом, благодаря своей способности нейтрализовать несколько вирусных штаммов ВИЧ, например, несколько вирусных штаммов ВИЧ-1, например, раскрытых в US 2014/0328862, включенной в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки. У части людей, инфицированных ВИЧ-1, генерируются bNAb, которые обычно развиваются в течение 1-3 лет, в течение которых происходит коэволюция циркулирующих вирусных штаммов и антител. Однако эти bNab обычно не способны нейтрализовать сосуществующие аутологичные вирусы из-за опосредованного антителами отбора против чувствительных вирусных штаммов. Соответственно, существует острая необходимость в новых, нейтрализующих анти-ВИЧ антителах широкого спектра действия, которые проявляют высокий уровень активности против инфекции ВИЧ-1.
IV. Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к ряду нейтрализующих эффективных анти-ВИЧ-1 антител широкого спектра действия и к способам их применения. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает анти-ВИЧ-1 антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело представляет собой нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело (bNab) широкого спектра действия или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело включает NC37 и его антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления антиВИЧ-1 антитело включает BG1 и его антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело включает BG18 и его антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления изобретение включает вариант BG18 и его антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления вариант BG18 включает одно из: 354BG8, 354BG18, 354BG42, 354BG33, 354BG129, 354BG188, 354BG411 и 354BG426 или их антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело (mAb). В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1-антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантно продуцируемое антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает биспецифическое антитело.
В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части содержат вариабельную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит одну из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи имеет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с одной из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89. В некоторых вариантах осуществления одна или более из
- 1 042959
SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89 имеют консервативные замены.
В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части содержат вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи содержит одну из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с одной из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93. В некоторых вариантах осуществления одна или более из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93 имеют консервативные замены.
В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть содержит по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR) в вариабельной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна CDR содержит одну из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68. 74-76, 82-84 и 90-92. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна CDR имеет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с одной из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74- 76, 82-84 и 90-92. В некоторых вариантах осуществления одна или более из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 6668, 74- 76, 82-84 и 90-92 имеют консервативные замены.
В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть содержит, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область (CDR) в вариабельной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна CDR содержит одну из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88 и 94-96. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна CDR имеет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с одной из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88 и 94-96. В некоторых вариантах осуществления одна или более из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78- 80, 86-88 и 94-96 имеют консервативные замены.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам, содержащим первое антитело. В некоторых вариантах осуществления первое антитело представляет собой анти-ВИЧ1 антитело или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело (bNab) широкого спектра действия. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело широкого спектра действия представляет собой любое анти-ВИЧ-1 антитело по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело специфически связывается с ВИЧ-1 или его антигенным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело нейтрализует ВИЧ-1 при связывании. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат второе антитело. В некоторых вариантах осуществления второе антитело включает анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с ВИЧ-1 или его антигенным фрагментом. В других вариантах осуществления второе антитело специфически связывается с первым антителом или его антигенсвязывающей частью. В некоторых вариантах осуществления первое антитело или его антигенсвязывающая часть связана с субстратом. В некоторых вариантах осуществления второе антитело или его антигенсвязывающая часть связана с субстратом. В некоторых вариантах осуществления первое антитело или его антигенсвязывающая часть является детектируемо меченой. В некоторых вариантах осуществления второе антитело или его антигенсвязывающая часть является детектируемо меченой. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из первого антитела или его антигенсвязывающей части и второго антитела или его антигенсвязывающей части является детектируемо меченым. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка содержит репортерную молекулу. В некоторых вариантах осуществления репортерная молекула содержит флуоресцентную молекулу. В некоторых вариантах осуществления репортер содержит радиоактивную метку. В других вариантах осуществления детектируемая метка содержит фермент. В некоторых вариантах осуществления наборы включают субстрат для фермента. В некоторых вариантах осуществления добавление субстрата к ферменту приводит к генерации детектируемого сигнала. В некоторых вариантах осуществления детектируемый сигнал включает окрашенный растворимый продукт. В некоторых вариантах осуществления радиоактивная метка включает I-125. В некоторых вариантах осуществления фермент включает пероксидазу хрена. В некоторых вариантах осуществления субстрат для фермента включает ТМВ. В некоторых вариантах осуществления наборы способны детектировать ВИЧ-1 или его антигенные фрагменты в образце. В некоторых вариантах осуществления наборы обеспечивают количественное определение ВИЧ-1 или его антигенных фрагментов, присутствующих в образце.
В некоторых вариантах осуществления наборы дополнительно содержат анти-ВИЧ агент. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ агент выбирают из группы, состоящей из ненуклеозидных ин
- 2 042959 гибиторов обратной транскриптазы (NNRTI), нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NRTI), ингибиторов протеазы (PI), ингибиторов слияния, антагонистов CCRS/ингибиторов проникновения, ингибиторов переноса цепи интегразой (INSTI) и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ агент находится в стандартной лекарственной форме. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть находятся в стандартной лекарственной форме. В некоторых вариантах осуществления стандартная лекарственная форма представляет собой инъецируемую стандартную лекарственную форму. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ агент находится в том же контейнере, что и анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ агент находится в отдельном контейнере. В некоторых вариантах осуществления наборы дополнительно содержат одно или более дополнительных анти-ВИЧ-1 антител или их антигенсвязывающих частей. В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных анти-ВИЧ-1 антител или их антигенсвязывающих частей включают любые анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных анти-ВИЧ-1 антител или их антигенсвязывающих частей выбирают из группы, состоящей из NC37, NC133, NC102, АС40, АС41, АС72 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей или консервантов.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу детектирования ВИЧ-1 или его антигенного фрагмента, присутствующего в образце. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение образца, содержащего ВИЧ-1 или его антигенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование образца с анти-ВИЧ-1 антителом или его антигенсвязывающей частью. В некоторых вариантах осуществления способ включает детектирование наличия специфического связывания анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части с ВИЧ или его антигенным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления способ включает количественное определение ВИЧ-1 или его антигенных фрагментов, присутствующих в образце. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биологический образец. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть является рекомбинантно продуцируемой. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления детектирование наличия специфического связывания выполняют методом иммуноанализа. В некоторых вариантах осуществления детектирование наличия специфического связывания выполняют методом конкурентного иммуноанализа.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики индивидуума, как имеющего ВМЧ-1 инфекцию. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию индивидуума, имеющего или подозреваемого на наличие ВИЧ-1 инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ содержит получение от индивидуума образца, содержащего ВИЧ-1 или его антигенного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование образца с анти-ВИЧ-1 антителом или его антигенсвязывающей частью. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления способ включает детектирование наличия специфического связывания анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части с ВИЧ или его антигенным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления способ включает диагностику индивидуума, как ВИЧ-1 инфицированного. В некоторых вариантах осуществления индивидуума диагностируют, как имеющего СПИД. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биологический образец. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть является рекомбинантно продуцируемой. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления детектирование наличия специфического связывания выполняют методом иммуноанализа. В некоторых вариантах осуществления детектирование наличия специфического связывания выполняют методом конкурентного иммуноанализа.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения ВИЧ-1 инфекции у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ лечения ВИЧ-1 инфекции включает введение индивидууму, имеющему или подозреваемому на наличие инфекции ВИЧ-1, по меньшей мере одного анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязываю
- 3 042959 щая часть содержит нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело широкого спектра действия (bNab) или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает любое анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления способ включает до стадии введения стадию идентификации индивидуума как ВИЧ-1 инфицированного. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть является рекомбинантно продуцируемой. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одно дополнительное анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело широкого спектра действия (bNab) или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает любое анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть является рекомбинантно продуцируемым. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение анти-ВИЧ агента. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ агента выбирают из группы, состоящей из ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NNRTI), нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NRTI), ингибиторов протеазы (PI), ингибиторов слияния, антагонистов CCRS/ингибиторов проникновения, ингибиторы переноса цепи интегразой (INSTI) и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть могут вводиться совместно с дополнительным анти-ВИЧ-1 антителом или антителами или их антигенсвязывающей частью(частями) и/или анти-ВИЧ агентом или анти-ВИЧ агентами. В других вариантах осуществления анти-ВИЧ антитело или его антигенсвязывающую часть вводят до введения дополнительного анти-ВИЧ-1 антитела или антител или их антигенсвязывающей части(частей) и/или анти-ВИЧ агента или анти-ВИЧ агентов. В других вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть вводят после введения дополнительного анти-ВИЧ-1 антитела или антител или их антигенсвязывающей части(ей) и/или анти-ВИЧ агента или анти-ВИЧ агентов. В других вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть можно вводить между дополнительными анти-ВИЧ-1 антителами или их антигенсвязывающей частью(частями) и/или анти-ВИЧ агентом или анти-ВИЧ агентами.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к пассивной вакцине. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает нейтрализующее анти-ВИЧ-1 антитело широкого спектра действия (bNab) или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает нейтрализующее анти-ВИЧ-1-антитело широкого спектра действия или его антигенсвязывающую часть в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть включает рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть является рекомбинантно продуцируемой. В некоторых вариантах осуществления пассивная вакцина дополнительно содержит адъювант. В некоторых вариантах осуществления пассивная вакцина дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, консервант и/или носитель. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики ВИЧ-1 инфекции у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение индивидууму композиции пассивной вакцины в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или более тяжелых и/или легких цепей анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или более из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 99, 73, 77, 81, 85, 89 и 93. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота имеет консервативные замены. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую одну или более CDR анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последова- 4 042959 тельность, кодирующую одну или более из SEQ ID NO: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30-32,
34-36, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92 и 9496. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота имеет консервативные замены.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вектору или системе векторов, содержащих одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и/или легкие цепи и/или CDR одного или более анти-ВИЧ-1 антител или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вектор или система векторов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь, находится в том же векторе, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, находится в другом векторе, отличном от вектора, в котором находится последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления вектор или система векторов представляет собой плазмиду или плазмиды. В некоторых вариантах осуществления вектор или система векторов представляет собой фаговый вектор или векторы. В некоторых вариантах осуществления фаговый вектор представляет собой γ-флаг. В некоторых вариантах осуществления вектор или векторы представляют собой космиду или космиды. В некоторых вариантах осуществления вектор или система векторов представляет собой рекомбинантную хромосому или рекомбинантные хромосомы. В некоторых вариантах осуществления система векторов представляет собой комбинацию разных векторов. В некоторых вариантах осуществления экспрессия различных последовательностей нуклеиновых кислот может осуществляться совместно. В других вариантах осуществления экспрессия различных последовательностей нуклеиновых кислот может индуцироваться независимо. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору или системе векторов, содержащих одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более определяющих комплементарность областей (CDR) одной или более тяжелых и/или легких цепей одного или более анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению.
V. Краткое описание чертежей
На фиг. 1А, 1В, 1С, 1D, 1E, 1F представлен репертуар анти-ВИЧ-1 антител, полученных от донора ЕВ354. Фиг. 1А: значения вирусной нагрузки, измеренные в 2002-2015 годах. На графике указаны моменты времени, когда были выделены нейтрализующие антитела. Момент времени сбора плазмы отмечен стрелками, направленными вниз. Фиг. 1В: тепловая карта, показывающая значения IC50, полученные в TZM-bl анализе, для очищенного сывороточного IgG в 4 временных точках (обозначенных стрелками на (1А)), протестированного относительно панели штаммов ВИЧ-1. Все анализы нейтрализации выполняли в двух экземплярах. Фиг. 1С: верхние панели: IgG+ В-клетки памяти, предварительно обогащенные CD19, окрашивали CD19 и тремя ненативными приманками ВИЧ-1: 2СС кор, складчатый тример gp140YU2 и gp14092uG37.8+gp140CZA79012 (gp140 А+С) тримеры, и одна нативная приманка BG505.SOSIPAviB. Популяции в квадратных вставках представляют собой клетки, полученные в результате сортировки единичных клеток, а числа указывают процент CD19+/затравка+ клеток относительно общего количества IgG+ клеток. Нижние панели: круговые диаграммы представляют общее количество последовательностей Ig, амплифицированных из клеток, полученных в результате сортировки единичных клеток, из соответствующего графика FACS, показанного сверху. Число в середине диаграмм указывает общее количество антител. Пустые срезы представляют собой последовательности, представленные в единичном экземпляре, не имеющие клонально родственных видов. Срезы представляют клоны антител и пропорциональны количеству последовательностей в каждом клоне. Клоны, отмеченные звездочкой, являются клонами, которые продемонстрировали нейтрализацию уровня (tier) 2, и представлены вариантами NC37, BG18 и BG1. Фиг. 1D: верхняя панель: тепловая карта, показывающая эффективность нейтрализации, основанная на на значениях IC50, полученных в TZM-bl анализе, моноклональных антител NC37, BG1 и BG18. Нижняя панель: эффективность нейтрализации, основанная на значениях IC50, полученных в TZMbl анализе, поликлонального IgG донора из образца 2014 года, а также NC37, BG1 и BG18 к YU2WT, YU2N280Y, YU2NN332K и YU2NN160K. Все TZM-bl анализы выполняли в двух экземплярах. Фиг. 1E: тепловая карта эффективности нейтрализации, на значениях IC50, полученных в анализе TZM-bl, антител NC37, BG1, BG18 и 1:1:1 комбинации (комб.), протестированных относительно панели из 120 псевдовирусов ВИЧ-1 уровня 2. Среднее геометрическое значение всех нейтрализованных вирусов и процент широты действия указаны на нижней панели. Анализы нейтрализации выполняли в двух экземплярах. Фиг. 1F: кривая покрытия, основанная на значениях из (1E).
На фиг. 2А, 2В, 2С, 2D, 2Е, 2F, 2G представлены последовательность и структурный анализ bNab BG18. Фиг. 2А: выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелых цепей 10-1074, PGT121 и BG18. Звездочки обозначают зазоры (гэпы), возникающие в процессе выравнивания. Стрелки указывают положения в каркасе, в которых все три антитела мутированы относительно их соответствующих генов зародышевой линии. Указаны CDR H1, H2 и Н3. Фиг. 2В: выравнивание последовательностей легких цепей, как и в (А) для 10-1074, PGT121 и BG18. Фиг. 2С: левая панель: ленточная диаграмма доменов VH
- 5 042959 (темно-серый) и VL (светло-серый) Fab BG18, показанная с разрешением 1,3 А. Средняя панель: представление поверхности вариабельной области BG18. Правая панель: конформация CDRH3 стабилизируется водородными связями (показаны пунктирными линиями) внутри петли. Взаимодействующие остатки показаны в виде палочек, остаток CDRH3 и соседний CDRH1 показаны в виде ленточных диаграмм. Фиг. 2D: левая панель: ленточные диаграммы, показывающие наложение вариабельных доменов BG18 (фиолетовый), PGT121 (зеленый) и 10-1074 (синий). CDRH3 BG18 выделен красным, петли CDRH3 PGT121 и 10-1074 выделены темно-бордовым. Правая панель: VL BG18 (светло-розовый) и PGT121 (светло-зеленый) показаны после наложения VH. CDRL2BG18 не имеет упорядоченной структуры в кристалле и обозначен пунктирной линией. 10-1074 тесно связан с PGT121 и не показан для ясности. Фиг. 2Е: представление поверхностей BG18 и PGT121. Фиг. 2F: ЭМ структура единичной частицы (прозрачная серая плотность) BG505 SOSIP.664, связанная с Fab BG18 и Fab 179NC75. Координаты для BG505 SOSIP.664, Fab BG18 и модель для Fab 179NC75 (Fab CH103: PDB 4JAM) вписывали в ЭМ плотность, как описано в примере 1 ниже. Приведены средние значения 2D-классов. Фиг. 2G: сравнение угла связывания BG505, характерного для Fab BG18, относительно Fab 10-1074, PGT122 (PDB 5FYJ), PGT135 (PDB 4JM2) и PGT128 (PDB 5АСО). Плотности для Fabs 179NC75 вычитали из карты BG18-179NC75-BG505 для облегчения сравнений.
На фиг. 3А, 3В, 3С, 3D, 3Е представлены аутологичные вирусы, присутствующие в плазме у донора ЕВ354. Фиг. 3А: Полученное методом максимального правдоподобия филогенетическое древо последовательностей генов env, полученных из одного генома из образцов донора ЕВ354, взятых в 2006, 2010, 2013 и 2014 годах. Красная звездочка означает филогенетические ветви с бутстрэп-оценкой >90%. Три основные группы последовательностей произвольно названы кластерами А, В и С. Три треугольника указывают последовательности env, в которых отсутствует N-связанный сайт гликозилирования. Квадраты, выделенные пунктирными линиями, указывают VOC культуры; число в скобках представляет количество вирусных последовательностей env в VOC. Фиг. 3В: диаграммы разброса данных, изображающие парное разнообразие нуклеотидных последовательностей для последовательностей env плазмы, полученной в 2010, 2013 и 2014 гг. Каждая точка представляет генетическое различие в попарном сравнении двух последовательностей в заданный момент времени. Значения Р определяли с помощью Z-критерия, основанного на U-статистике для двух выборок, и указывают ***р<0,0005. Фиг. 3С: тепловые карты, показывающие значения IC50, полученные в TZM-bl анализе, для BG18, BG1, NC37, а также IgG, очищенного в тот же момент времени, что и вирусные гены env, к аутологичным псевдовирусам, используя последовательности env донора ЕВ354. Звезды обозначают псевдовирусы, которые устойчивы ко всем трем аутологичным bNAb. Антитело 3BNC117 (описанное в US 2014/0328862) служило контролем. Круги слева соответствуют моментам времени, в которые была получена последовательность, указанная в (3А). Анализы нейтрализации проводили в двух экземплярах и повторяли, по меньшей мере, дважды. Серые квадраты указывают на то, что анализ не был проведен. Фиг. 3D: круговые диаграммы представляют чувствительность аутологичных псевдовирусов, полученную с использованием последовательностей env донора ЕВ354, к каждому из трех аутологичных bNAb в разные проанализированные моменты времени. Число в середине круга означает количество протестированных env псевдовирусов, а различные срезы пропорциональны количеству псевдовирусов. bNAb указаны слева, а моменты времени, когда были получены образцы, указаны над графиками. Столбцы под кругами показывают, когда были обнаружены транскрипты антител с помощью ПЦР. Фиг. 3Е: значения IC50, полученные в TZM-bl анализе, для BG18, BG1, NC37 и контрольного bNAb 3BNC117 к VOC, полученным из CD35 Т-клеток донора ЕВ354 в 2014 и 2015 г.
На фиг. 4А, 4В, 4С, 4D, 4Е показано лечение ВИЧYU2-инфицированных мышей. Фиг. 4А: значения вирусной нагрузки у четырех (BG18) и пяти (NC37) ВИЧYU2-инфицированных hu-мышей до и после монотерапии антителом BG18 (верхняя панель) или NC37 (нижняя панель). Заштрихованная серым цветом область на графике указывает период времени, в течение которого вводили BG18 (вверху) или NC37 (внизу). Жирные линии указывают средние геометрические значения в каждом эксперименте по лечению. Фиг. 4В: выравнивание аминокислотных последовательностей gp120 из вирусов, клонированных на 21 день после терапии BG18 (вверху) или NC37 (внизу). Каждая горизонтальная полоса представляет собой последовательность одного клона gp120, выровненную относительно BИЧ-1YU2. Аминокислотные замены указаны в виде галочек. Идентификатор (ID) мыши, из которой была получена последовательность, указан на вертикальных столбцах. Увеличенный вид областей, показанный в отдельных квадратах, приведен справа на каждой панели. Фиг. 4С: круговые диаграммы, показывающие рекуррентные мутации для BG18 (вверху) и NC37 (внизу) в gp120 относительно последовательности HIV-1YU2 дикого типа. Различные срезы пропорциональны количеству последовательностей, которые несут мутации. Число в центре круга обозначает общее количество клонированных последовательностей. Белый срез в NC37 указывает на отсутствие каких-либо повторяющихся мутаций. Фиг. 4D: значения вирусной нагрузки у семи hu-мышей до и после лечения комбинацией BG18+NC37+BG1. Мыши Т1 и Т2 являются необработанными контрольными мышами (незакрашенные значки). Мыши Т3-Т7 получали комбинацию BG18+NC37+BG1 (закрашенные значки). Заштрихованная область указывает период времени, в течение которого вводили комбинацию bNAb. Средние геометрические значения показаны жирными линиями,
- 6 042959 пунктирная линия относится к необработанной группе, а сплошные линии - к обработанной группе. Фиг.
4Е: разница Log10 в вирусной нагрузке по сравнению с днем 0 (до введения антител). Звездочкой обозначено выпадающее значение.
На фиг. 5А, 5В представлены результаты конкурентного ИФА. Каждое из нейтрализующих антител (равные количества) анализировали методом ИФА в отношении связывания с BG505 SOSIP.664 в присутствии возрастающих количеств различных конкурирующих антител. Черная линия указывает на связывание биотинилированного антитела в отсутствие конкуренции. Фиг. 5А: BG18, фиг. 5В: BG1.
На фиг. 6А, 6В, 6С, 6D представлено сравнение последовательностей между BG18, PGT121 и 101074. Фиг. 6А: дендрограмма последовательностей тяжелых цепей PGT121, 10-1074 и девяти клональных вариантов BG18, а также их предсказанных зародышевых линий. Фиг. 6В: выравнивание CDR тяжелой цепи. Выделены позиции, общие для PGT121/10-1074 и вариантов BG18. Фиг. 6С: то же, что в (6А), но для легких цепей. Фиг. 6D: выравнивание CDR легкой цепи. Выделены позиции, общие для PGT121/101074 и вариантов BG18.
На фиг. 7 показан электростатический потенциал BG18. Электростатические поверхностные потенциалы Fab рассчитывали с помощью программы APBS, а представление поверхности получено с помощью UCSF Chimerac затенениями. Предсказанные интерфейсы связывания выделены пунктирной черной линией. Примерные области узнавания на поверхностях Fab PGT121 и 10-1074 гликанов gp120, прикрепленных к Asn137gp120, Asn156gp120 и Asn332gp120, обозначены черными треугольниками.
На фиг. 8А, 8В, 8С представлена структура комплекса NC37 Fab-gp120. Фиг. 8А: кристаллическая структура (с разрешением 2,7 А) комплекса NC37 Fab-gp120, наложенная на структуру комплекса 8ab134 Fab-gp120 (PDB 4RX4), обнаруживает сходную ориентацию связывания gp120 у двух антител. Фиг. 8В: крупный план интерфейса Fab-gp120 показывает увеличенный CDRH3 NC37 по сравнению с 8ANC134 CDRH3. Фиг. 8С: вид сбоку структуры тримера BG505 в виде поверхности (PDB 4TVP) с предсказанными эпитопами для NC37, 8ANC134 и NIH45-46, показанными на одном протомере тримера. Более длинный CDRH3 NC37 предполагает большую площадь контакта на соседнем протомере (светло-серый) тримера.
На фиг. 9А, 9В, 9С, 9D, 9Е, 9F представлено связывание антитела BG18 с синтетическими гликопептидами V3 ВИЧ-1. Биотин-меченные гликопептиды V3 иммобилизовали на чипе с нейтравидином, и в качестве аналита использовали IgG BG8. Фиг. 9А: взаимодействие между BG18 и гликопептидом JR-FL mini-V3, несущим гликан Man9GlcNAc2 в N301. Наблюдается слабое связывание. Фиг. 9В: взаимодействие между BG18 и гликопептидом JR-FL mini-V3, несущим гликан Man9GlcNAc2 в N332. Наблюдается слабое связывание. Фиг. 9С: взаимодействие между BG18 IgG и гликопептидом JR-FL mini-V3, несущий 2-антенарный комплексный тип N-гликан в N301. Связывания не наблюдается. Фиг. 9D: взаимодействие между BG18 IgG и гликопептидом JR-FL mini-V3, несущим 2-антенарный комплексный тип N-гликан в N332. Связывания не наблюдается. Фиг. 9Е: взаимодействие между IgG BG18 и гликопептидом mini-V3 A244, несущим гликан Man9lGcNAc2 в N334. Наблюдается слабое связывание. Фиг. 9F: взаимодействие между BG18 IgG и гликопептидом САР45 mini-V3, несущим гликан Man9GlcNAc2 в N334. Наблюдается слабое связывание.
На фиг. 10А, 10В, 10С представлено секвенирование единичного генома вируса, полученного из плазмы донора ЕВ354. Фиг. 10А: круговые диаграммы обозначают общее количество последовательностей env, амплифицированных методом ПЦР из одного генома, для каждого момента времени сбора образца. Общее количество последовательностей, полученных в каждой временной точке, приведены в центре круговой диаграммы, а различные срезы пропорциональны количеству последовательностей. Фиг. 10В: полученное методом максимального правдоподобия филогенетическое дерево последовательностей генов env, выделенных из одного генома из образцов донора ЕВ354, собранных в 2006, 2010, 2013 и 2014 годах. Звездочка означает филогенетические ветви с бутстрэп-оценкой >90%. В таблице справа показаны значения ТСШ50 и IC50, полученные в TZM-bl анализе, для BG18, BG1, NC37 и контрольного антитела 3BNC117 к аутологичным псевдовирусам с использованием последовательностей env донора ЕВ354. Фиг. 10С: сравнение значений ТСШ50 для псевдовирусов с использованием env донора ЕВ354, которые оказались устойчивыми ко всем трем bNAb, в отличие от псевдовирусов с использованием последовательностей env донора ЕВ354, которые оказались чувствительными по меньшей мере к одному bNAb. Р-значение (т-тест)=0,0016.
На фиг. 11А, 11В, 11С показаны результаты лечения антителом BG8 ВИЧYU2-инфицированных huмышей. Фиг. 11А: значения вирусной нагрузки у четырех hu-мышей до и после введения BG8. Заштрихованная серым цветом область на графике указывает период времени, в течение которого вводили антитело. Жирные линии обозначают средние геометрические значения. Фиг. 11В: выравнивание аминокислотных последовательностей gp120 из вирусов, клонированных на 21 день после терапии. Каждая горизонтальная серая полоса представляет последовательность одного клона gp120, выровненного относительно ВИЧ-1YU2. Аминокислотные замены обозначены черными галочками. Идентификатор (ID) мыши, из которой была получена последовательность, указан на вертикальных черных полосах. Увеличенный вид областей, показанных в отдельных квадратах, приведен справа на каждой панели. Фиг. 11С: круговые диаграммы, показывающие рецидивирующие мутации в gp120 относительно последовательности
- 7 042959
ВИЧ-1YU2 дикого типа после терапии BG8. Число в центре круга обозначает общее количество клонированных последовательностей; срезы представляют наиболее стабильно мутированные области в gp120 и пропорциональны количеству последовательностей, которые несут мутации.
На фиг. 12А, 12В представлены вирусные нагрузки у ВИЧYU2-инфицированных, гуманизированных мышей, получавших антитела. Значения вирусной нагрузки у ВИЧYU2-инфицированных гуманизированных мышей до и после монотерапии BG18 (фиг. 12А) и NC37 (фиг. 12В). Заштрихованная область на графике указывает период времени, в течение которого вводилось антитело. На каждом графике показаны результаты двух независимых экспериментов, обозначенных кружками (один эксперимент) и квадратами (второй эксперимент). Закрашенные и незакрашенные формы обозначают обработанных и контрольных мышей, соответственно. Пунктирные и сплошные жирные линии показывают средние значения для контрольных и обработанных мышей, соответственно.
VI. Подробное описание изобретения
А. Определения.
В данной области известно, что анти-ВИЧ-1 антитело может принимать одну из многочисленных форм, как описано в настоящей заявке. Антитела частично определяются антигенами, с которыми они связываются, таким образом, анти-ВИЧ-1 антитело представляет собой любое антитело, которое специфически связывается с по меньшей мере одним эпитопом, обнаруженным в вирусной оболочке вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), например в gp120 и/или gp140, описанных в настоящей заявке. В данной области техники известно, что антитело представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающую часть. Тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН3). Легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей включают каркасные области (FWR) и определяющие комплементарность области (CDR). Четыре области FWR являются относительно консервативными, в то время как области CDR (CDR1, CDR2 и CDR3) представляют собой гипервариабельные области и расположены в направлении от NH2-конца к СООН-концу следующим образом: FWR1, CDR1, FWR2, CdR2, FWR3, CDr3, FWR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном, в то время как константная область(области) в зависимости от изотипа может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина. В данной области техники известно, что можно манипулировать моноклональными и другими антителами и использовать методы технологии рекомбинантных ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые сохраняют специфичность исходного антитела. Такие способы могут включать введение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина, или CDR антитела в константные области или константные области плюс каркасные области другого иммуноглобулина.
Используемый в настоящем описании термин антитело (Ab) применяется в самом широком смысле и, в частности, может включать любой иммуноглобулин, будь то природный или частично или полностью синтезированный, включая, без ограничения, моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела и полиреактивные антитела) и фрагменты антител. Таким образом, термин антитело, используемый в настоящем описании в любом контексте, включает, без ограничения, любой специфический связывающий элемент, класс и/или изотип иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE) и биологически релевантный фрагмент или его специфически связывающий элемент, включая, без ограничения, Fab, F(ab')2, scFv (одноцепочечный или родственный объект) и (scFv)2.
Используемый в настоящей заявке термин фрагменты антитела может включать фрагменты антитела, которые получены методами, хорошо известными и доступными специалистам в данной области, описанными в настоящей заявке. Следовательно, в дополнение к приведенному выше определению антитела термин антитело может дополнительно охватывать любой полипептид или белок, содержащий часть интактного антитела, такую как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Они могут быть получены из природных источников или могут быть синтезированы полностью или частично. Примеры фрагментов антител включают, без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела и линейные антитела. Используемые в настоящей заявке термины антигенсвязывающая часть, антигенсвязывающий фрагмент или Fab могут относиться к области антитела, которая связывается с антигенами. Специалист в данной области поймет, что Fab состоит из одного константного и одного вариабельного домена каждой из тяжелой и легкой цепи антитела.
Используемый в настоящем описании термин моноклональное антитело или mAb может относиться к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах.
Моноклональные антитела могут включать химерные антитела, гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела и человеческие антитела. Способы получения моноклональных антител хорошо известны в данной области, включая некоторые конкретные примерами, обсуждаемыми ниже, в том чис- 8 042959 ле технология гибридомы, получение рекомбинантных антител, например, с помощью технологии фагового дисплея или дрожжевого дисплея, продуцирование трансгенными мышами и культурами единичных В-клеток. Методы, которые включают амплификацию тяжелых и/или легких цепей генов антител (например, плазмиды или космиды) с помощью ПЦР (или аналогичным методом) либо in vitro, либо в бактериальных системах и/или системах млекопитающих и/или дрожжевых системах, входят в объем настоящего изобретения.
Используемые в настоящем описании термины консервативные модификации последовательностей или консервативные замены могут относиться к аминокислотным модификациям целевого эпитопа по изобретению, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания анти-ВИЧ-1 антител с эпитопом(ами). Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в целевом эпитопе, с которым специфически связываются анти-ВИЧ-1 антитела по изобретению, например эпитопы на оболочке вируса ВИЧ-1, например эпитопы на gp120 и/или gp140, могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и антитела по настоящему изобретению могут быть протестированы относительно целевого эпитопа, например, с использованием функциональных анализов, описанных в настоящей заявке или известных иным образом в данной области техники.
Термин биологический образец относится к образцу, полученному из организма (например, пациента) или из компонентов (например, клеток) организма. Образец может представлять собой любую биологическую ткань, клетку(и) или жидкость. Образец может представлять собой клинический образец, который является образцом, полученным от субъекта, такого как пациент-человек. Такие образцы включают, без ограничения, слюну, мокроту, кровь, клетки крови (например, белые кровяные клетки), телесные жидкости, лаваж, соки поджелудочной железы, желудочный сок, выделения, ЦСЖ, лимфатическую амниотическую жидкость, плазму, сперму, костный мозг и образцы биопсии ткани или образцы пункционной биопсии, мочу, стул, перитонеальную жидкость и плевральную жидкость или их клетки и любые их комбинации. Биологические образцы также могут включать срезы тканей, такие как замороженные срезы, взятые для гистологических целей. Биологический образец также может упоминаться как образец пациента. Биологический образец также может включать по существу очищенный или выделенный белок, мембранный препарат или клеточную культуру.
Термин биспецифическое антитело относится к искусственным конструкциям иммуноглобулина, состоящие из фрагментов двух разных моноклональных антител, которые связываются с двумя разными антигенами. Существует несколько различных типов биспецифических антител, включая, без ограничения, трифункциональные антитела и химически связанные Fab. Анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению могут включать биспецифические антитела и фрагменты одного или более разных антиВИЧ-1 антител, включая одно или более разных анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению, например, BG18 и BG1 или одно или более анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению и известных анти-ВИЧ-1 антител, например, BG18 и 3BNC117 (описанного в US 2014/0328862) или BG18 и VRC01, описанного в US 8,637,036. Биспецифические bNab к ВИЧ и способы их получения и применения описаны в PCT/US16/64713, включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Используемые в настоящем описании термины эффективное количество или терапевтически эффективное количество могут относиться к количеству соединения или агента, которое способно обеспечить нужный с медицинской точки зрения результат у субъекта, подвергаемого лечению. Способ лечения может быть выполнен in vivo или ex vivo, отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами или терапией. Терапевтически эффективное количество может быть введено за одно или более введений, применений или дозирований и не предназначено для ограничения конкретным препаратом или способом введения.
Термины специфическое связывание, селективное связывание, селективно связывается и специфически связывается могут относиться к связыванию антитела с эпитопом на предварительно определенном антигене, но не с другими антигенами. Как правило, антитело связывается с равновесной константой диссоциации (KD), равной примерно менее 10-6 М, например, примерно менее 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже, определенной, например, методом равновесного диализа или поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в приборе поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® 2000 с использованием заранее заданного антигена, например эпитопа на оболочке вируса ВИЧ-1, на- 9 042959 пример gp120, в качестве аналита, и антитела в качестве лиганда, или с помощью анализа Скэтчарда связывания антитела с антиген-положительными клетками, и (ii) связывается с предварительно определенным антигеном со сродством, которое по меньшей мере в два раза превышает его сродство связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), отличным от заранее заданного антигена или близкородственного антигена.
Используемый в настоящем описании термин гомология может относиться к существованию общей структуры между двумя композициями. Термин гомология в контексте белков может относиться к величине (например, выраженной в процентах) перекрытия между двумя или более аминокислотными и/или пептидными последовательностями. В контексте нуклеиновых кислот этот термин может относиться к величине (например, выраженной в процентах) перекрытия между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот. Используемый в настоящем описании процент (%) гомологии между двумя последовательностями эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций, совместно используемых последовательностями (т.е. % гомологии=количество идентичных позиций/общее количество позиций х100), с учетом количества зазоров и длины каждого зазора, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с помощью математического алгоритма. Такая гомология хорошо представлена в данной области техники посредством инструментов и/или алгоритмов локального выравнивания, например, BLAST и/или BLAST 2.0 и может включать методы парного выравнивания, методы выравнивания множества последовательностей, методы структурного выравнивания и/или методы филогенетического анализа.
Используемые в настоящем описании термины совместное введение, совместно введенный и в комбинации с могут относиться к введению субъекту по меньшей мере двух агентов или видов терапии. В некоторых вариантах одновременное введение двух или более агентов/видов терапии является одновременным. В других вариантах осуществления первый агент/терапия вводится перед вторым агентом/терапией. Специалистам в данной области понятно, что составы и/или пути введения различных используемых агентов/видов терапии могут меняться. Например, анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению могут вводиться совместно друг с другом или могут вводиться совместно с другими антителами, например, другими нейтрализующими антителами широкого спектра действия, такими как, например, нейтрализующие анти-ВИЧ антитела широкого спектра действия, раскрытые в US 2014/0328862, например 3BNC117 или VRC01, описанные в патенте США 8637036, который включен в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки, или необязательно совместно с другими анти-ВИЧ агентами. Совместное введение может происходить или не происходить одновременно, например, одно или более анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению можно вводить до или после другого анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению (или другого анти-ВИЧ антитела или других анти-ВИЧ агентов) или можно вводить в то же или по существу такое же время. Специалист в данной области поймет, что совместное введение не подразумевает ограничения по времени, поскольку оно предназначено для описания введения вместе с другими соединениями и/или видами терапии в качестве части схемы лечения пациента.
Используемый в настоящем описании термин анти-ВИЧ агент может относиться к терапии для лечения ВИЧ, который сам по себе не включают анти-ВИЧ-1 антитела. Например, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI), нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), ингибиторы протеаз (PI), ингибиторы слияния, антагонисты CCRS/ингибиторы проникновения, ингибиторы переноса интегразой (INSTI) и их комбинации, все являются анти-ВИЧ агентами, поскольку они являются не основанными на антителах терапевтическими методами лечения, которые можно вводить совместно с одним или более анти-ВИЧ-1 антителами по настоящему изобретению и/или дополнительными анти-ВИЧ-1 антителами. Специалист в данной области техники поймет, что этот список не следует считать исчерпывающим, и, поскольку современные достижения и дополнительные способы обработки становятся доступными, они также входят в объем этого определения.
Используемый в настоящем описании термин носители может включать фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые нетоксичны для клетки или млекопитающего, подвергающегося воздействию этих веществ, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный рН-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают, без ограничения, буферы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая, без ограничения, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярный (из менее чем примерно 10 остатков) полипептид; белки, такие как, без ограничения, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как, без ограничения, поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как, без ограничения, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая, без ограничения, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как, без ограничения, ЭДТА; сахарные спирты, такие как, без ограничения, маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как, без
- 10 042959 ограничения, натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как, без ограничения,
Твин; полиэтиленгликоль (ПЭГ) и ПЛЮРОНИКи.
Термин лечение заболевания относится к выполнению протокола, который может включать введение одного или более лекарственных веществ пациенту (человеку или кому-либо еще) для купирования признаков или симптомов заболевания. Купирование может произойти до проявления признаков или симптомов заболевания, а также после их появления. Таким образом, лечение включает профилактику заболевания. Термин профилактика относится к профилактическим и/или превентивным мерам, целью которых является предотвращение или замедление развития целевого патологического состояния или расстройства. Например, в случае заражения вирусом иммунодефицита 1 (ВИЧ-1), профилактика может происходить в ситуации предварительного прохождения курса лечения для предотвращения или блокирования заражения ВИЧ-1, например, пассивной вакцинацией. Такая профилактика также происходит в случае скрытой инфекции ВИЧ-1, например, у тех людей, которые являются сероположительными без проявления каких-либо симптомов (т.е. без прогрессирования до проявления симптомов СПИДа), при этом возможна профилактика развития активной инфекции и/или очистка пациента от указанной инфекции ВИЧ-1. Кроме того, лечение не обязательно приводит к полному купированию признаков или симптомов, излечению и, в частности, оно включает протоколы, которые оказывают лишь минимальное, но положительное воздействие на пациента.
Используемый в настоящем описании термин эпитоп может относиться к области антигена, с которой связывается антитело или Т-клетка, например к области оболочки вируса ВИЧ-1, включая гликопротеин, без ограничения, например gp120 или область на гликопротеине. Антиген относится к веществу, которое вызывает иммунологическую реакцию или связывается с продуктами этой реакции.
Термины очищенное или выделенное антитело, пептид, полипептид или белок относятся к пептиду, полипептиду или белку, как используется в настоящем описании, и могут относиться к пептиду, полипептиду или белку, который был отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он связан в естественных условиях. Полипептид/белок может составлять, по меньшей мере, 10% (т.е. любой процент от 10 до 100%, например, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 95 и 99%) в расчете на сухую массу очищенного препарата. Чистота может быть измерена любым подходящим стандартным методом, например, колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или анализом ВЭЖХ. Выделенный полипептид/белок (например, анти-ВИЧ-1 антитела), описанный в изобретении, может быть получен методами рекомбинантной ДНК.
В. Нейтрализующие анти-ВИЧ-1 антитела широкого спектра действия.
Настоящее изобретение относится к нейтрализующим анти-ВИЧ-1 антителам широкого спектра действия (bNab) и их антигенсвязывающим частям. В частности, настоящее изобретение относится к нескольким различным моноклональным антителам, BG18, NC37 и BG1, их антигенсвязывающим частям, включая, без ограничения, их определяющие комплементарность области (CDR), а также их производным и вариантам, которые демонстрируют широкую и мощную нейтрализацию ВИЧ-1 in vivo (см. пример 1 ниже). Таким образом, анти-ВИЧ-1 антитела по настоящему изобретению обладают сильной терапевтической эффективностью в случае их применения либо по отдельности, либо в комбинации друг с другом, либо с другими bNab, либо с другими видами лечения ВИЧ, как обсуждалось в настоящем описании выше.
Каждое из BG18, NC37 и BG1 имеет различные неперекрывающиеся эпитопы. NC37 распознает CD4bs. NC37 и его клональные варианты демонстрируют характеристики bNAb, полученных как из VH1-2, так и из VH1-46; однако согласно результатам структурного анализа предполагается, что NC37 распознает Env по типу VH1-46. He желая быть связанными какой-либо теорией, предполагается, что длинный CDRH3 NC37 вступает в контакт с соседним протомером на тримере, распознавая тем самым четвертичный эпитоп тримера, ядро которого перекрывается с CD4bs.
BG1 связывается с областью V1V2 Env, другой часто встречающейся мишенью bNAb, возникающей во время естественной инфекции. BG1 представляет собой первое антитело в этом классе (bNab), выделенное из донора, инфицированного типом (филогенетической ветвью) В. Его активность сходна с членами семейства антител VRC26, такими как описано у N.A. Doria-Rose et al., Developmental pathway for potent V1V2-directed HIV-neutralizing antibodies. Nature 509, 55-62 (2014), но оно является менее эффективным, чем bNAb PG9/16 и PGDM1400. Как и другие bNAb V1V2, выделенные до настоящего времени, BG1 имеет длинный, богатый тирозином CDRH3.
BG18, наиболее эффективное из BG18, NC37 и BG1, и направлено на Asn332gp120-центрированный гликановый участок у основания петли V3. Это - сильно гликозилированная область, которая включает углеводы в положениях Asn332gp120, Asn301gp120, Asn386gp120, Asn392gp120, Asn137gp120, Asn156gp120. Был выделен ряд моноклональных bNAb, которые связываются как с белковыми, так и с углеводными компонентами в этом участке, включая PGT121-124, описанного у L.M. Walker et al., Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature 477, 466-470 (2011), и 10-1074, описанного у H. Mouquet et al., Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E3268-3277 (2012). Все эти bNAb были выделены из донора, инфицированного типом А, и могут быть подразделены на антитела, которые
- 11 042959 связываются исключительно с гликаном Asn332gp12o (10-1074 и PGT124), и те, которые также связываются с окружающими гликанами в гликановом участке V3 (PGT121-123). BG18 и его клональные варианты похожи на 10-1074 в том смысле, что они задействуют Asn332gp120, но BG18 является более эффективным, чем опубликованные bNAb к V3, и впервые был выделен из донора, инфицированного типом В.
BG18 отличается от ранее охарактеризованных представителей этого класса удивительно характерной для него ориентацией CDRH3 и домена легкой цепи. Кроме того, BG18 отличается от других членов этой группы антител тем, что он имеет более короткий CDRH3 и не содержит вставок или делеций, хотя, не желая быть связанными какой-либо теорией, можно предположить, что BG18-подобные антитела легче генерируются. В отсутствие структуры высокого разрешения комплекса BG18-Env трудно предсказать, как более короткий CDRH3 BG18 взаимодействует с Env. Структурные исследования комплексов Env с Fab PGT122 и 10-1074 показывают, что они приближаются к протомерам gp120 в тримере Env примерно под одинаковыми углами, приблизительно перпендикулярными. ЭМ-структура BG18-Env, хотя и не имеет достаточного разрешения для более точного определения типа взаимодействий, тем не менее демонстрирует, что BG18 приближается к Env под другим углом, который смещен на 40° к промотору gp120 относительно углов сближения 10-1074 и PGT122. Клональные варианты и производные BG18, включая 354BG8, 354BG18, 354BG42, 354BG33, 354BG129, 354BG188, 354BG411 и 354BG426, а также их полноразмерные последовательности, определяющие комплементарность области тяжелой и легкой цепей (CDR), приведены ниже в табл. 1. Дендрограмма вариантов BG18 представлена на фиг. 6 и обсуждается в приведенном ниже примере 1. Клональные варианты и производные BG1, включая BG1, BG22 и BG47, вместе с их полноразмерными последовательностями, определяющими комплементарность областями тяжелых и легких цепей (CDR), приведены ниже в табл. 2.
Название SEQ ID NO: Последовательность
354BG8IgH 1 EVOLRESGPRLVKPSETLSLSCDVFGDSRPSDHSWTWVROPPG KALEWIGDVHYNGDNTYNPSLRGRVKIDVDRSTHRFSLTLKSL TAADT GIY FCARNVIRVFGVISLGEWFHYGMDVWGPGTAVIVS S
CDR1 2 GDSRPSDHS
CDR2 3 VHYNGDN
CDR3 4 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
354BG8 IgL 5 SSELTOAPSVSVSPGOTATIACSGPPLASRYTYWYRQKPGOAP VLIIFRPRQFPSGVSGRFSASKSGTTATLTIRDVQVEDEGDYY CQSSDTSDSYKMFGGGTTL TVL
CDR1 6 PLASRY
CDR2 7 RPR
CDR3 8 QSSDTSDSYKM
354BG18 IgH 9 OVOLRESGPGLVKPSETLSLSCTVSNDSRPSDHSWTWVRQSPG KALEWIGDIHYNGATTYNPSLRSRVRIELDQSIPRFSLKMTSM TAADTGMYYCARNAIRIYGWALGEWFHYGMDVWGQGTAVTVS S
CDR1 10 NDSRPSDHS
CDR2 11 IHYNGAT
CDR3 12 NAIRIYGVVALGEWFHYGMDV
354BG18 IgL 13 SSELTQPPSVSVSPGQTARITCSGAPLTSRFTYWYRQKPGQAP VLIISRSSQRSSGWSGRFSASWSGTTVTLTIRGVQADDEADYY CQSSDTSDSYKMFGGGTKLTVL
CDR1 14 PLTSRF
CDR2 15 RSS
CDR3 16 QSSDTSDSYKM
- 12 042959
354BG42 IgH 17 EVOLRESGPGLVKPSETLSLSCDVFGDSRPSDHSWTWVROPPG KALEWIGDVHYNGDTTYNPSLRGRVKIDVDRSTHRFSLTLNSL TAADT GIY FCARNVIRVFGVISLGEWFHYGMDVWGOGTAVTVS S
CDR1 18 GDSRPSDHS
CDR2 19 VHYNGDT
CDR3 20 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
354BG42 IgL 21 SSELTOAPSVSVSPGOTATIACSGPPLASRYTYWYROKPGOAP VLIIFRORQFPSGVSGRFSASKSGTTATLTIRDVQVEDEGDYY CQSSDTSDSYKMFGGGTTL TVL
CDR1 22 PLASRY
CDR2 23 RPR
CDR3 24 QSSDTSDSYKM
354BG33 IgH 25 OVOLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSNDSRPSDHSWTWVRQSPG KALEWIGDIHYNGATTYNPSLRSRVRIELDQSIPRFSLKMTSM TAADTGMYYCARNAIRIYGVVALGEWFHYGMDVWGOGTAVTVS S
CDR1 26 NDSRPSDHS
CDR2 27 IHYNGAT
CDR3 28 NAIRIYGVVALGEWFHYGMDV
354BG33 IgL 29 SSELTQPPSVSVSPGOTAKITCSGAALTSRFTYWYRQKPGOAP VLIISRTSQRSSGWSGRFSASWSGTTVTLTIRGVQADDEGDYY CQSSDTSDSYKMFGGGTKLTVL
CDR1 30 ALTSRF
CDR2 31 RTS
CDR3 32 QSSDTSDSYKM
354BG129 IgH 33 EVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWVRQSPG KALEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVKLEVDTSTNRFFLKMTSL TVADT GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFHYGMDVWGQGTAITVS P
CDR1 34 GDSRPSDHS
CDR2 35 IHYGGDI
CDR3 36 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG129 IgL 37 SSELTQTPSVTVSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQKPGQAP VL11FRDRQFSS GMS GRFAS SHSGTTVTLTIRDVRVE DEADYY
- 13 042959
COSSPINPSYKMFGGGTKVTVL
CDRl 38 PLAS RY
CDR2 39 RPR
CDR3 40 QSSPINPSYKM
354BG188 IgH 41 EVQLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGPSRPSPHSWTWVRQSPG KTLEWIGPIHYGGPITYNPSLRSRVKLEVPTSSNRFFLKMTSL TVADT GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFHYGMPVWGOGTAITVS P
CDRl 42 GDSRPSDHS
CDR2 43 IHYGGDI
CDR3 44 NVIRVFGVIALGEWFHYGMPV
354BG188 IgL 45 SSELTOTASVTVSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQKPGOAP VLIIFRpRQFSSGISGRFSSSQSGTTVTLTIRDVRVEDEADYY CQSSPTSPSFKMFGGGTKLTVL
CDRl 46 PLASRY
CDR2 47 RPR
CDR3 48 QSSPTSPSFKM
354BG411 IgH 49 OVOLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGPSRPSPHSWTWVROSPG KALEWIGPIHYGGPITYNPSLRSRVELEVPRSTNRFFLKMTSL SVAPTGMYFCARNVIRVFGVIALGEWFHYGMPVWGOGTAITVS P
CDRl 50 GPSRPSPHS
CDR2 51 IHYGGPI
CDR3 52 NVIRVFGVIALGEWFHYGMPV
354BG411 IgL 53 SSELTOAPSVTVSPGPTARIACSGPPLATRYCYWYRQKSGOAP VL11FRPRQFSSGVSGRFSSSQSGSTVTLTIRPVRVE PEAPYY CQSSPTSPSYKMFGGGTKLTVL
CDRl 54 PLATRY
CDR2 55 RPR
CDR3 56 QSSPTSPSYKM
354BG419 IgH 57 OVOLRESGPGLVKPSETLSLSCPVFGPSRPSPHSWTWVROPPG KALEWIGPIHYNGPKTYNPSLRGRVKIPVPRSTHRFSLTLNSL TААР T GMY FCARNVIRVFGVISLGEWFHYGMPVWGPGTAVTVS S
CDRl 58 GPSRPSPHS
- 14 042959
CDR2 59 IHYNGDK
CDR3 60 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV
354BG419 IgL 61 SSELTOAPSVSVSPGOTARIACSGPPLASRYTYWYROKPGOAP VLIIFRDRQFPSGVSGRFSASKSGTTGTLTIRDVQAEDEGDYY COSSDTSDSYKMFGGGTTL TVL
CDR1 62 PLASRY
CDR2 63 RPR
CDR3 64 QSSDTSDSYKM
354BG426 IgH 65 OVOLRESGPGLVKPSGNMALTCTISGDSRPSDHSWTWVRQSPG KALEWIGDIHYGGDITYNPSLRSRVKLEVDTSSNRFFLKMTSL TVADT GIY FCARNVIRVFGVIALGEWFHYGMDVWGOGTAITVS P
CDR1 66 GDSRPSDHS
CDR2 67 IHYGGDI
CDR3 68 NVIRVFGVIALGEWFHYGMDV
354BG426 IgL 69 SSELTOAPSVTLSPGETARIACSGPPLASRYCYWYRQKPGOAP VLIIFRDRQFSSGISGRFSSSQSGTTVTLTIRDVRVEDEADYY CQSSDNSDSFKMFGGGTKLTVL
CDR1 70 PLASRY
CDR2 71 RPR
CDR3 72 QSSPNSPSFKM
Таблица 1. Последовательности вариантов BG18.
Название SEQ ID NO: Последовательность
BGlIgH 73 AEOLVESGGGLVPPGRSLRLSCSASGFYFPDYAMAWVROAPGO GLOWVGFMRGWAYGGSAQFAAFAVGKFAISRDDGRNWYLDVK NP T FE D T GVY FCAREQRNKDYRYGQEGFGYSYGMDVWGRGTTV WST
CPR1 74 GFYFPDYA
CPR2 75 MRGWAYGGSA
CPR3 76 EQRNKDYRYGQEGFGYSYGMDV
BG1 IgL 77 DIHMTQSPVSLSASVGDRVTITCRASHFIANYVNWYQQKPGKA PTLLIFESSTLORGVPSRFSAYGDGTEFTLSINTLQPEDFASY ICOQSHSPPVTFGAGTRVDQK
CPR1 78 HFIANY
- 15 042959
CDR2 79 ESS
CDR3 80 QQSHSPPVT
BG22 1дН 81 EERLVESGGGLVPPGRSLRLSCSAFDFYFPDYAMAWVRQAPGK GLE WIG FIRGWAYGQAAQ YGKS AS GRMTIS RDDS RRWYL DIК S PIEE DT GAY FCAREQRGGDGRYSGDGFGYPYGMDVWGRGTMV TVSA
CDR1 82 DFYFPDYA
CDR2 83 IRGWAYGQAA
CDR3 84 EQRGGDGRYSGDGFGYPYGMDV
BG22 IgL 85 DILMTQSPVSLSASIGERITITCRASHFIANYVNWYQQRPGKA PKLLIFQSWTLNRGIPSRFSGYGDGTEFTLSISALQSEDFGTY ICQQSHSPPLSFGGGTRVDQT
CDR1 86 HFIANY
CDR2 87 QSW
CDR3 88 QQSHSPPLS
BG47 IgH 89 EERLVESGGGLVPPGRSLRLSCSAFDFYFPDYAMAWVRQAPGR ALE WIG FIRGWAYGQSAQ YGKS AS GRMT IS RDDS RRWYL DIК S P T HE D T GVY FCAREQRGANGRYGGDGFGYSYGMDVWGRGTMV SVSA
CDR1 90 DFYFPDYA
CDR2 91 IRGWAYGQSA
CDR3 92 EQRGANGRYGGDGFGYSYGMDV
BG47 IgL 93 DIQMTQSPFTLSASVGERVTITCRASHFIANYVNWYQQRPGRA PKLLIFESSTLNRGVPSRFSGSGDGTEFTLSISALQSEDFATY ICQQSHSPPVSFGGGTRVDQT
CDR1 94 HFIANY
CDR2 95 ESS
CDR3 96 QQSHSPPVS
Таблица 2. Последовательности вариантов BG1.
Специалист в данной области поймет, что определяющие комплементарность области (CDR) большинства антител, например NC37, BG1, включая все варианты BG1, и BG18, в том числе все варианты BG18, в значительной степени определяют биологическую активность антитела, образуя паратоп на антителе, причем CDRH3 обладает наиболее специфическим характером. Соответственно, антитела по настоящему изобретению могут содержать NC37, его CDR, BG1, его CDR и BG18 и его CDR, включая все варианты NC37, BG1 и BG18 и их соответствующих CDR. Специалист в данной области также поймет, что антитела по настоящему изобретению могут содержать консервативные замены, в том числе в CDR, и при этом оставаться в рамках изобретения. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам и их антигенсвязывающим частям, экспрессирующим CDR, перечисленным в табл. 1 и 2.
Например, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам или их антигенсвязывающим частям, имеющим тяжелую цепь, содержащую одну или более из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89 или имеющую определенную степень гомологии с одной или более из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89, например по меньшей мере, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% и любые их промежуточные диапазоны. Одна или более из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81 и 89 могут иметь консервативные замены. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам или их антигенсвязывающим частям, имеющим легкую цепь, содержащую одну или более из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93 или имеющую определенную степень гомологии с одной или более из SEQ ID NO: 55, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93, например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% и любые их промежуточные диапазоны. Одна или более из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 20, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 и 93 могут иметь консервативные замены.
Тяжелые цепи IgG обычно имеют размер от примерно 400 до примерно 600 аминокислот, более типично от 450 до примерно 550 аминокислот. Вариабельная область каждой тяжелой цепи, независимо от класса антител, обычно имеет длину примерно 100-140 аминокислот, наиболее типично примерно 110- 16 042959
130 аминокислот. Легкие цепи обычно имеют длину примерно 210-220 аминокислот, более типично 211217. Вариабельная область легких цепей обычно имеет длину примерно 10 0-120 аминокислот.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам или их антигенсвязывающим частям, имеющим одну или более CDR в тяжелой цепи, содержащие одну или более из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84 и 90-92 или имеющие определенную степень гомологии с одной или более из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 42-44, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82-84 и 90-92, например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% и любые их промежуточные диапазоны. Одна или более из SEQ ID NO: 2-4, 10-12, 18-20, 26-28, 34-36, 4244, 50-52, 58-60, 66-68, 74-76, 82- 84 и 90-92 могут иметь консервативные замены.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам или их антигенсвязывающим частям, имеющим одну или более CDR в легкой цепи, содержащие одну или более из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88 и 94-96 или имеющие определенную степень гомологии с одной или более из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 46-48, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88 и 94-96, например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% и любые их промежуточные диапазоны. Одна или более из SEQ ID NO: 6-8, 14-16, 22-24, 30-32, 38-40, 4648, 54-56, 62-64, 70-72, 78-80, 86-88 и 94-96 могут иметь консервативные замены.
Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут состоять из антигенсвязывающих частей, например CDR, из разных отдельных bNab, включая, без ограничения, bNab по настоящему изобретению. Исключительно в качестве примера, сконструированное производное может содержать легкую цепь одного из NC37, BG1 или BG18, включая любые варианты, и тяжелую цепь другого bNab, включая одно из NC37, BG1 или BG18, в том числе любые варианты. Альтернативно, сконструированное производное может содержать легкую цепь одного варианта BG18 и тяжелую цепь другого варианта BG18. Специалист в данной области поймет, что способы получения рекомбинантных антител допускают значительное количество рекомбинантных антител, каждое из которых однозначно находится в пределах объема настоящего изобретения. Соответственно, bNab по настоящему изобретению могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, такими как описано в патенте США № 4,816,567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть легко выделена и секвенирована с помощью традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иным образом не продуцируют белок иммуноглобулина, для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности не относящегося к иммуноглобулину полипептида. Такой не относящийся к иммуноглобулину полипептид может быть заменен константными доменами антитела по изобретению или может быть заменен вариабельными доменами одного антигенсвязывающего сайта антитела по изобретению для создания химерного бивалентного антитела.
После получения, рекомбинантным или иным образом, анти-ВИЧ-1 антитела могут быть очищены или выделены, так чтобы антитела по существу не содержали, например, никакой сыворотки, супернатанта или других клеточных культур или родственных материалов. Методы очистки антител известны в данной области и могут включать методы селективного обогащения или специфического выделения. Например, может быть использована аффинная очистка, такая как очистка, основанная на классспецифическом сродстве. Сначала также можно использовать методы фракционирования, облегчающие выделение подмножества образцов белков, которые включают иммуноглобулины. Как правило, антигенспецифическое сродство применяется для выделения антител, которые связываются с антигеном. Затем антитела могут быть объединены с носителем, буфером, разбавителем, растворителем и/или консервантами и т.д., которые служат для создания фармацевтически приемлемых композиций анти-ВИЧ-1 антител.
Антитела могут представлять собой моновалентные антитела. Способы получения моновалентных антител хорошо известны в данной области. Например, один из способов включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи иммуноглобулина и модифицированной тяжелой цепи. Тяжелая цепь обычно обрезается в любой точке Fc-области для предотвращения сшивки тяжелой цепи. Альтернативно, соответствующие цистеиновые остатки замещают другим аминокислотным остатком или удаляют, чтобы предотвратить сшивку. Для получения моновалентных антител также подходят способы in vitro. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности фрагментов Fab, может быть выполнено обычными методами, известными в данной области техники.
Человеческие моноклональные антитела могут быть получены различными методами, известными в данной области, включая библиотеки фагового дисплея [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Для получения человеческих моноклональных антител также доступны доступны способы, описанные Cole et al. и Boerner et al. (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Анало- 17 042959 гично, человеческие антитела могут быть получены путем введения локусов человеческого иммуноглобулина в организм трансгенных животных, например мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. При заражении наблюдается продуцирование человеческих антител, которые во всех отношениях сильно похожи на антитела, образующиеся у людей, включая перегруппировку генов, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к векторам и системам векторов, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют вариабельные области, включая, без ограничения, CDR анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению, например NC37, BG1 и BG18, в том числе любые варианты, и их антигенсвязывающих частей. Вектор может быть, например, но не обязательно, плазмидой; в данной области известны и другие рекомбинантные векторы и могут включать, например, фаговые векторы, такие как А-фаговый вектор, другие вирусные векторы, такие как нереплицирующийся аденовирусный вектор, космиды и/или искусственные хромосомы. Векторная система может быть или может не быть отдельно индуцируемой, т.е. может иметь разные промоторные и/или репрессорные элементы. Общим для большинства сконструированных векторов являются источники репликации, сайты мультиклонирования и селектируемые маркеры, при условии, что вектор (включая системы векторов, например, множественные плазмиды) содержит такую систему, и считается, что он входит в объем настоящего изобретения. Специалисту в данной области понятно, что можно получить последовательности нуклеиновых кислот из заданной пептидной последовательности и клонировать их в систему выбора. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к вектору или системе векторов, содержащих одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 73, 77, 81, 85, 89 и 93. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вектору или системе векторов, содержащих одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более CDR одной или более тяжелых и/или легких цепей одного или более анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению, например нуклеотидной последовательности или последовательностям, кодирующим одну или более из SEQ ID NO: 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 3840, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86- 88, 90-92 и 94-96 и их комбинации. Эти нуклеотиды, кодирующие тяжелые/легкие цепи и/или CDR, могут иметь консервативные замены, а нуклеотиды, кодирующие CDR, независимо от таких консервативных замен, могут обладать определенной степенью гомологии (например, по меньшей мере, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%) с этими нуклеотидными последовательностями. Вектор или система векторов по настоящему изобретению может быть введена в одну или более клеток (т.е. клетки являются трансформироваными вектором), и такие способы известны в данной области техники.
С. Фармацевтические составы и доставка.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению, а также к способам их применения для лечения нуждающегося в этом пациента. Пациент может иметь скрытую или активную инфекцию ВИЧ-1. Анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части, используемые в этих композициях и способах, могут быть любыми антиВИЧ-1 антителами или их антигенсвязывающими частями по настоящему изобретению, но особенно полезными являются такие анти-ВИЧ антитела или их антигенсвязывающие части, которые содержат BG18 или его варианты, включая варианты, полученные рекомбинантным способом, и/или его сконструированные производные.
Фармацевтически приемлемая композиция анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части, подходящая для введения пациенту, может содержать эффективное количество анти-ВИЧ-1 антитела или антител или их антигенсвязывающих частей в составе, который сохраняет биологическую активность, при этом обеспечивая максимальную стабильность при хранении в приемлемом температурном диапазоне. Фармацевтические композиции могут также включать, в зависимости от целевого состава, фармацевтически приемлемые разбавители, фармацевтически приемлемые носители и/или фармацевтически приемлемые наполнители, или любую такую несущую среду, обычно используемую для приготовления фармацевтических композиций для введения животным или людям. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка. Количество наполнителя, которое используется в фармацевтической композиции или составе по настоящему изобретению, представляет собой количество, которое служит для равномерного распределения антитела по всей композиции, чтобы его можно было равномерно диспергировать при доставке нуждающемуся в этом субъекту. Он может служить для разбавления антитела до концентрации, которая обеспечивает целевые полезные паллиативные или лечебные результаты, при
- 18 042959 этом сводя к минимуму любые побочные эффекты, которые могут возникнуть при слишком высокой концентрации. Он также может иметь эффект консерванта. Таким образом, для антител, имеющих высокую физиологическую активность, можно использовать наполнитель в более высоких количествах. С другой стороны, для любого активного ингредиента(ов), который проявляет более низкую физиологическую активность, будет использоваться меньшее количество наполнителя.
Фармацевтически приемлемая композиция может быть в жидкой или твердой форме. Твердый состав обычно, но не обязательно, лиофилизируют и превращают в раствор перед введением для однократного или многократного дозирования. Составы не должны подвергаться воздействию экстремальных температур или рН во избежание термической денатурации. Таким образом, важно приготовить композицию антител по настоящему изобретению в биологически значимом диапазоне рН. Часто необходим забуференный раствор для поддержания надлежащего диапазона рН во время хранения, особенно для жидких составов, хранящихся в течение более длительных периодов времени, начиная с момента их приготовления до введения. Как правило, жидкие и твердые составы требуют хранения при более низких температурах (обычно 2-8°С) для сохранения стабильности в течение более длительных периодов времени. Приготовленные композиции антител, особенно жидкие составы, могут содержать бактериостат для предотвращения или минимизации протеолиза во время хранения, включая, без ограничения, эффективные концентрации (обычно <1% мас./об.) бензилового спирта, фенола, м-крезола, хлорбутанола, метилпарабена и/или пропилпарабена. Бактериостат может быть противопоказан некоторым пациентам. Следовательно, лиофилизированный состав может быть восстановлен в растворе, содержащем или не содержащем такой компонент. К забуференной жидкой или твердой композиции антител могут быть добавлены дополнительные компоненты, включая, без ограничения, сахара в качестве криопротектора (включая, без ограничения, полигидроксилированные углеводороды, такие как сорбит, маннит, глицерин и дульцит, и/или дисахариды, такие как сахароза, лактоза, мальтоза или трегалоза) и, в некоторых случаях, соответствующую соль (включая, без ограничения, NaCl, KCl или LiCl). Такие составы антител, особенно жидкие составы, предназначенные для длительного хранения, готовят с учетом полезного диапазона общей осмолярности как для обеспечения стабильности при температуре 2-8°С или выше в течение длительного периода времени, так и для получения состава, пригодного для парентеральной инъекции. Например, но не обязательно, эффективный диапазон общей осмолярности (общее количество молекул в растворе) может составлять от примерно 200 мОс/л до примерно 800 мОс/л. Очевидно, что количество циропротектора, такого как сахароза или сорбит, будет зависеть от количества соли в композиции из расчета, чтобы общая осмолярность раствора оставалась в соответствующем диапазоне. Следовательно, не содержащий соль состав может, но не обязательно, содержать от примерно 5% до примерно 25% сахарозы.
Альтернативно, бессолевой состав на основе сорбита может, но не обязательно, содержать сорбит в диапазоне от примерно 3% до примерно 12%. Для бессолевых составов может потребоваться увеличенный диапазон соответствующего криопротектора для поддержания эффективных уровней осмолярности. Эти составы могут также содержать двухвалентный катион (включая, но не обязательно, MgCl2, CaCl2 и MnCl2); и поверхностно-активное вещество, не являющееся ионным ПАВ 32 (включая, без ограничения, полисорбат-80 (Твин 80®), полисорбат-60 (Твин 60®), полисорбат-40 (Твин 4 0®) и полисорбат-20 (Твин 20®), полиоксиэтиленалкиловые простые эфиры, включая, без ограничения, Brij 58®, Brij 35®, а также другие, такие как Triton X-100®, Triton X 114®, NP40®, Span 85 и ряд неионных поверхностно-активных веществ серии Плюроник (например, Плюроник 121)). Любая комбинация таких компонентов, включая необязательное включение бактериостата, может быть полезна для заполнения антителосодержащих составов по настоящему изобретению. Анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению также могут представлять собой химическое производное, которое представляет антитела, содержащие дополнительные химические фрагменты, в нормальных условиях не являющиеся частью молекулы иммуноглоблюлина (например, пегилирование). Такие фрагменты могут улучшать растворимость, увеличивать период полураспада, улучшать абсорбцию и т.д. основной молекулы. Альтернативно, такие фрагменты могут ослаблять нежелательные побочные эффекты основной молекулы или уменьшать токсичность основной молекулы.
Для лечения in vivo пациенту вводят или предоставляют фармацевтическую композицию, включающую, по меньшей мере, одно анти-ВИЧ антитело или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению. Анти-ВИЧ антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению, когда используется для терапии in vivo, вводят пациенту в терапевтически эффективных количествах (т.е. в количествах, которые устраняют или уменьшают общую вирусную нагрузку, как описано ниже в примере 1). Антитела вводят пациенту-человеку известными способами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение определенного периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацероброспинальным, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным, интратекальным, пероральным, местным способами введения или путем ингаляции. Антитела или их антигенсвязывающие части могут быть введены парентерально, если возможно, в целевой участок клеток или внутривенно. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят внутривенно или под- 19 042959 кожно. Терапевтические композиции по изобретению можно вводить пациенту или субъекту системно, парентерально или местно. Вышеуказанные параметры для оценки успешного лечения и улучшения заболевания легко поддаются измерению с помощью обычных процедур, знакомых врачу.
Для парентерального введения анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части могут быть приготовлены в виде дозированной лекарственной формы для инъекций (раствора, суспензии, эмульсии) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения. Примеры таких носителей включают, без ограничения, воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Неводные носители включают, без ограничения, нелетучие масла и этилолеат. В качестве носителей могут быть использованы липосомы. Носитель может содержать незначительные количества добавок, таких как вещества, которые повышают изотоничность и химическую стабильность, такие как, например, буферы и консерванты.
Анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно вводить хозяину любым способом, с помощью любой стратегии и/или комбинации, которые доступны в данной области, в количествах, достаточных для обеспечения терапевтического лечения ВИЧ-1. Эти композиции могут быть доставлены индивидууму различными путями введения, известными в данной области, в частности путем парентерального введения, а также, без ограничения, не парентеральными способами введения, такими как внутривенное (IV), внутримышечное (IM) или подкожное (SC) введение, причем внутривенное введение является нормой в области терапевтического введения антител. Эти композиции можно вводить в виде отдельных или многократных доз (т.е. введение антитела дозами, разнесенных по времени, охраняя стерильность композиции в течение режима лечения).
Доза и режим дозирования зависят от множества факторов, легко определяемых врачом, таких как природа инфекции, например, ее терапевтический индекс, состояние пациента и его история болезни. Обычно пациенту вводят терапевтически эффективное количество антитела. В некоторых вариантах осуществления количество вводимого антитела находится в диапазоне от примерно 0,001 мг/кг до примерно 100 мг/кг массы тела пациента и в любом интервале между ними. В зависимости от типа и тяжести инфекции, от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг массы тела (например, примерно 0,1-15 мг/кг/доза) антитела представляет собой начальную возможную дозу, вводимую пациенту либо, например, в виде одного или более отдельных введений, либо в виде непрерывной инфузии. Анти-ВИЧ-1 антитела могут доставляться с относительно низкими объемными скоростями, например, но необязательно, от примерно 0,001 мл/сутки до 10 мл/сутки, для минимизации повреждения или травмирования ткани вблизи места высвобождения состава. В случае малой дозы состав может высвобождаться со скоростью, в зависимости от конкретного биологического агента(ов), например, от примерно 0,01 мкг/ч или 0,1 мкг/час, 0,25 мкг/ч, 1 мкг/ч до, как правило, примерно 200 мкг/ч, или препарат может доставляется с низкой объемной скоростью, например, объемной скоростью от примерно 0,001 мл/сутки до примерно 1 мл/сутки, например, от 0,01 микрограмма в сутки до примерно 20 миллиграммов в сутки. Доза зависит от ряда факторов, таких как активность, биодоступность и токсичность используемого активного ингредиента (например, анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающих частей) и требований субъекта. Прогресс этой терапии легко отслеживается с помощью обычных методов и анализов и основан на критериях, известных врачу или другим специалистам в данной области. Вышеуказанные параметры для оценки успешного лечения и улучшения состояния при заболевании легко поддаются измерению с помощью обычных процедур, знакомых врачу.
Конкретные варианты осуществления для среды доставки анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению включают микросферы PLGA, как обсуждается в настоящем описании и как известно в данной области техники, а также неразлагаемые носители на полимерной основе, содержащие поли(этиленвинилацетат); PEVAc). Кроме того, обзор контролируемого высвобождения и локализованной доставки терапевтических продуктов на основе антител можно найти у Grainger, et al., 2004, Expert Opin. Biol. Ther. 4(7): 1029-1044). Подходящие микрокапсулы, позволяющие инкапсулировать антитело, могут также включать гидроксиметилцеллюлозу или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, полученные методами коацервации или межфазной полимеризации. См. публикацию РСТ WO 99/24061, озаглавленную Способ получения составов с пролонгированным высвобождением IGF-1, согласно которой белок инкапсулирован в микросферах PLGA, этот документ включен в настоящее описание во всей полноте в виде ссылки. Кроме того, также могут быть использованы микроэмульсии или коллоидные системы доставки лекарственных веществ, такие как липосомы и микросферы альбумина. В других предпочтительных композициях с замедленным высвобождением используется биоадгезив для удержания антитела в месте введения. Как отмечалось выше, состав с замедленным высвобождением может содержать биоразлагаемый полимер, в который помещено антитело и который может обеспечить задержанное высвобождение. Неинъецируемые устройства могут упоминаться в настоящей заявке как имплантат, фармацевтический депо-имплантат, депо-имплантат, неинъецируемое депо или может быть обозначено аналогичным термином. Обычные депо-имплантаты могут включать, без ограничения, твердые биоразлагаемые и небиоразлагаемые полимерные устройства (такие как удлиненные полимерные или коаксиальные стержнеобразные устройства), а также многочисленные насосные системы, также известные в данной области техники. Инъецируемые устройства подразделяются на бо- 20 042959 люсные инъекции (высвобождение и рассеяние лекарственного вещества после инъекции) и инъекции хранилища или депо, которые обеспечивают резервуар для хранения в месте инъекции, обеспечивая постепенное высвобождение биологического агента с течением времени. Депо-имплантат может быть хирургически установлен в точке доставки для обеспечения адекватного резервуара для длительного высвобождения антитела с течением времени. Такое устройство способно нести лекарственный состав в таких количествах, которые терапевтически или профилактически необходимы для лечения в течение предварительно выбранного периода времени. Депо-имплантат также может обеспечивать защиту препарата от разрушения под воздействием процессов организма (таких как протеазы) на время лечения. Как известно в данной области техники, термин замедленное высвобождение относится к постепенному (непрерывному или прерывистому) высвобождению такого агента из блок-полимерной матрицы в течение продолжительного периода времени. Независимо от конкретного устройства, замедленное высвобождение композиции обеспечивает локальные биологически эффективные концентрации антитела. Длительное высвобождение биологического агента(ов) может происходить в течение одного дня, нескольких дней, недели или более; но, вероятнее всего, в течение месяца или более, или примерно до шести месяцев, в зависимости от состава. Природные или синтетические полимеры, известные в данной области техники, могут быть полезны в качестве депо-имплантата благодаря таким характеристикам, как универсальная кинетика деградации, безопасность и биосовместимость. Этими сополимерами можно манипулировать, чтобы модифицировать фармакокинетику активного ингредиента, защитить агент от ферментативного воздействия, а также обеспечения их деградации со временем в месте прикрепления или инъекции. Специалист в данной области поймет, что в данной области техники имеется множество идей по манипуляции свойствами этих сополимеров, включая соответствующий процесс производства, используемые катализаторы и конечную молекулярную массу депо-имплантата с замедленным высвобождением или депо-инъекции. Природные полимеры включают, без ограничения, белки (например, коллаген, альбумин или желатин); полисахариды (целлюлозу, крахмал, альгинаты, хитин, хитозан, циклодекстрин, декстран, гиалуроновую кислоту) и липиды. Биоразлагаемые синтетические полимеры могут включать, без ограничения, различные сложные полиэфиры, сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), полилактиды ([PLA]; патент США US 3773919 и ЕР 058481), полигликолят полилактата (PLGA), такой как полилактид-со-гликолид (см., например, патенты США № 4767628 и 5654008), полигликолид (ПГ), конъюгаты полиэтиленгликоля (ПЭГ) и поли(а-гидроксикислот), полиортоэфиры, полиаспирины, полифосфагены, винилпирролидон, поливиниловый спирт (PVA), PVA-g-PLGA, сополимер PEGT-PBT (полиактив), метакрилаты, поли(Nизопропилакриламид), РЕО-РРО-РЕО (плюроники), сополимеры РЕО-РРО-РАА, PLGA-PEO-PLGA, полиортоэфиры (РОЕ) или любые их комбинации, как описано выше (см., например, патент США № 6991454 и патент США № 20050187631, каждый из которых включен в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки), гидрогели (см., например, Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105, неразлагаемый этиленвинилацетат (например, этиленвинилацетатные диски и поли(этилен-винилацетат)), разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как Lupron Depot™, поли-D-(-)-3-гидрокси-масляная кислота (ЕР 133988), гели с гиалуроновой кислотой (см., например, патент США № 4636524), суспензии альгиновой кислоты, полиортоэфиры (РОЕ) и т.п. Полилактид (PLA) и его сополимеры с гликолидом (PLGA) хорошо известны в данной области с момента коммерциализации Lupron Depot™, одобренного в 1989 году в качестве первой парентеральной композиции с замедленным высвобождением, в которой используются полимеры PLA. Дополнительные примеры продуктов, в которых используются PLA и PLGA в качестве наполнителей для достижения замедленного высвобождения активного ингредиента, включают амидокс (PLA; заболевание пародонта), депо Nutropin (PLGA; с hGH) и депо Trelstar (PLGA; рак предстательной железы). Другие синтетические полимеры включают, без ограничения, поли(с-капролактон), поли-3-гидроксибутират, поли(в-яблочную кислоту) и поли(диоксанон)]; полиангидриды, полиуретан (см. WO2005/013936), полиамиды, циклодекстраны, полиортоэфиры, н-виниловый спирт, полиэтиленоксид/полиэтилентерефталат, полифосфат, полифосфонат, полиортоэфир, полицианоакрилат, полиэтиленгликоль, полидигидропиран и полиацеталь.
Небиоразлагаемые устройства включают, без ограничения, различные производные целлюлозы (карбоксиметилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, ацетат пропионат целлюлозы, этилцеллюлозу, гидроксипропилметил целлюлозу), имплантаты на основе кремния (полидиметилсилоксан), акриловые полимеры, (полиметакрилат, полиметилметакрилат, полигидрокси(этилметакрилат)), а также полиэтилен-со(винилацетат), полоксамер, поливинилпирролидон, полоксамин, полипропилен, полиамид, полиацеталь, полиэфир, поли(этилен-хлортрифторэтилен), политетрафторэтилен (ПТФЭ или Тефлон™), бутадиенстирольный каучук, полиэтилен, полипропилен, полифениленоксид-полистирол, поли-а-хлор-п-ксилол, полиметилпентен, полисульфон и другие родственные биостабильные полимеры. Носители, подходящие для составов депо с замедленным высвобождением, включают, без ограничения, микросферы, пленки, капсулы, частицы, гели, покрытия, матрицы, вафли, пилюли или другие фармацевтические композиции для доставки. Примеры таких составов с замедленным высвобождением описаны выше. См. также па
- 21 042959 тент США № 6,953,593; 6946146; 6656508; 6541033; и 6,451,346, содержание каждого из которых включено в настоящее описание в виде ссылки. Лекарственная форма должна быть способной нести лекарственную композицию в таких количествах и концентрациях, которые терапевтически необходимы для лечения в течение заранее выбранного периода времени, и должна обеспечивать достаточную защиту состава от разрушения под воздействием происходящих в организме процессов в течение всего периода лечения. Например, лекарственная форма может быть окружена внешней оболочкой, изготовленной из материала, который обладает защитными свойствами от разложения в результате метаболических процессов и риска, например, утечки, растрескивания, разрушения или деформации. Это может предотвратить высвобождение содержимого лекарственной формы неконтролируемым образом под воздействием стрессов, которым она может подвергаться во время использования, например, под воздействием физических сил, действующих на устройство высвобождения лекарственного вещества в результате нормального суставного сочленения и других движений субъекта или, например, в конвективных устройствах доставки лекарственных веществ, физических сил, связанных с давлением, создаваемым в резервуаре. Резервуар для лекарственного вещества или другое средство для хранения или удержания лекарственного вещества также должно быть изготовлено из такого материала, которое позволяет избегать непреднамеренных реакций с составом активного агента, и предпочтительно должно быть биосовместимым (например, когда имплантируется лекарственная форма, состав по существу не должен быть реакцинноспособным по отношению к телу субъекта или жидкостям организма). Обычно анти-ВИЧ-1 антитела вводят индивидууму в течение по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере недели, и, наиболее вероятно, через имплантат, предназначенный для доставки лекарственного вещества в течение по меньшей мере 10, 20, 30, 100 дней или по меньшей мере 4 месяцев, или по меньшей мере 6 месяцев, или по меньшей мере 12 месяцев, или по меньшей мере 24 месяцев, при необходимости.
В некоторых вариантах осуществления анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с одним или более дополнительными способами лечения ВИЧ-1, например, в комбинации с одним или более анти-ВИЧ агентами (например, ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (NNRTI), нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (NRTI), ингибиторами протеаз (PI), ингибиторами слияния, антагонистами CCR5/ингибиторами проникновения, ингибиторами переноса цепи интегразы (INSTI) и их комбинации) и/или дополнительными анти-ВИЧ-1 антителами или их антигенсвязывающими частями, включая, без ограничения, дополнительные анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению. Как показано ниже в примере 1, введение NC17, BG1 и BG18 в соотношении 1:1:1 было эффективным для уменьшения вирусной нагрузки in vivo. He желая быть связанными теорией, данные указывают на то, что у донора ЕВ354 сосуществуют моноклональные bNAb и очень низкие уровни чувствительных к нейтрализации вирусов, что наводит на предположение о том, что антитела способствуют инициации контроля у этого индивидуума. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к пассивной вакцине или фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно одному из вариантов осуществления вакцина или фармацевтические композиции представляют собой композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело, описанное в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Вакцина может включать множество антител, имеющих описанные в настоящей заявке характеристики, в любой комбинации и может дополнительно включать другие анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части. Пассивная вакцина может содержать один или более фармацевтически приемлемых консервантов, носителей и/или наполнителей, которые известны в данной области. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к активной вакцине или фармацевтическим композициям, содержащим ВИЧ-1 или его антигенный фрагмент. Если используется ВИЧ-1, он может быть ослаблен. Он может быть убит нагреванием. Если используются антигенные фрагменты, может быть предпочтительным, хотя и не обязательно, использовать гликопротеин gp120, хотя также можно использовать фрагменты гликопротеина gp120.
Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы в иммуногенной композиции для иммунизации животного. Такая иммуногенная композиция по изобретению может быть использована для приготовления вакцины. Предпочтительно изготавливают профилактическую и/или терапевтическую вакцину. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит иммуногенная или вакцинная композиция, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество антигена, как описано выше. Носители, используемые в композиции, могут быть выбраны на основе способа и пути введения и стандартной фармацевтической практики. Композиция также может содержать адъювант. Примеры адъюванта включают токсин холеры, термолабильный энтеротоксин Escherichia coli, липосому, неметилированную ДНК (CpG) или любой другой врожденный иммуностимулирующий комплекс. Различные адъюванты, которые можно использовать для дальнейшего усиления иммунологического ответа, зависят от вида хозяина и включают адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы полиуретана, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки и динитро
- 22 042959 фенол.
Вакцинная композиция может быть введена субъекту per se или в виде фармацевтической или терапевтической композиции. Композиции по изобретению и адъювант могут быть изготовлены с помощью обычных процессов смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсуляции, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены обычным способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или вспомогательных веществ, которые облегчают обработку антигенов по изобретению для использования их в фармацевтически пригодных препаратах. Подходящий препарат зависит от выбранного пути введения.
Для инъекции вакцинные препараты могут быть приготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера, забуференный фосфатом физиологический раствор или любой другой физиологический солевой буфер. Раствор может содержать агенты, подходящие для приготовления составов, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, композиция может быть в форме порошка, который разводят перед применением подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой.
Количество вводимой композиции зависит, например, от конкретного антигена в композиции, от того, вводится ли адъювант вместе с антигеном, типа совместного введения адъюванта, способа и частоты введения и нужного эффекта (например, защиты или лечения), что может определить специалист в данной области. Определение эффективного количества вакцинной композиции для введения находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания, представленного в настоящей заявке. Эффективная доза может быть первоначально оценена по результатам анализов in vitro. Например, доза может быть приготовлена с использованием животных моделей для достижения индукции иммунного ответа методами, хорошо известными в данной области. Специалист в данной области может легко оптимизировать введение для всех видов животных на основании результатов, описанных в настоящей заявке. Количество и интервал дозирования могут быть скорректированы индивидуально. Например, при использовании в качестве вакцины вакцинные составы по изобретению могут вводиться в количестве от 1 до 3 доз в течение 1-36 недель. Вакцинация может продолжаться бесконечно в зависимости от обстоятельств, особенно при пассивной вакцинации. Предпочтительно вводить 1 или 2 дозы с интервалами от примерно 3 недель до примерно 4 месяцев, и после этого можно периодически проводить повторные прививки. Для отдельных животных подходящими могут оказаться альтернативные протоколы. Подходящая доза представляет собой количество вакцинной композиции, которое при введении, как описано выше, способно вызывать иммунный ответ у иммунизированного животного, достаточный для защиты животного от инфекции в течение по меньшей мере 4-12 месяцев. Как правило, количество антигена, присутствующего в дозе, варьирует от примерно 1 мкг до примерно 100 мг на кг веса хозяина, обычно от примерно 10 мкг до примерно 1 мг и предпочтительно от примерно 100 мкг до примерно 1 мкг. Подходящий диапазон доз будет варьировать в зависимости от пути введения и размера субъекта, но обычно составляет от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл. При необходимости могут быть введены дополнительные бустерные инъекции.
D. Наборы и методы диагностики.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к наборам для обнаружения ВИЧ-1, присутствующего в образце. Эти наборы могут содержать анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению и различные реагенты, например, реагенты, которые помогают обнаружить связывание анти-ВИЧ-1 антитела с эпитопом, присутствующим на ВИЧ-1, например gp120 и/или gp140 или их антигенном фрагменте.
Наборы могут представлять собой анализы in vitro, такие как иммуноанализы, например иммуноферментные анализы (EIA), ферментный иммуносорбентный анализ (ИФА), ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ), радиоиммуноанализы (RIA), иммунофлуоресценция и другие анализы, известные в данной области, включая, без ограничения, вестерн-блот анализ и/или методы иммунопреципитации. Анализы in vitro могут быть конкурентными или непрямыми, такими как сэндвич-анализ, или могут представлять собой метод захвата антител. Например, в прямом ИФА забуференный раствор антигена, например образец, содержащий ВИЧ-1 или его антигенный фрагмент, или биологический образец, содержащий или подозреваемый на наличие ВИЧ-1, добавляют в лунку планшета для микротитрования, например в 96-луночный планшет. Затем в лунку добавляют раствор не вступающего в реакцию белка, например, бычьего сывороточного альбумина или казеина. Добавляют анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части, конъюгированные с ферментом, репортерной молекулой, например, конъюгированные с пероксидазой хрена, хотя не обязательно именно с этим ферментом, поскольку имеются другие широко используемые ферменты, включающие щелочную фосфатазу или β-D-галактозидазу, также возможны и другие ферменты, которые включены в объем изобретения. Затем добавляют субстрат для фермента, что приводит к появлению обнаруживаемого сигнала. Например, добавление ТМВ к пероксидазе хрена приводит к появлению окрашенного продукта, и в этом случае ИФА представляет собой колориметрический анализ. Методы ИФА могут проводиться в формате качественного или количественного анализа. Качественные результаты дают в отношении образца простой положительный или отрица
- 23 042959 тельный результат (да или нет). Разрыв между положительным и отрицательным результатом определяется аналитиком и может быть статистическим. Сэндвич-ИФА обычно выполняют согласно следующему протоколу. Анти-ВИЧ-1 антитело захвата или его антигенсвязывающие части связывают (т.е. иммобилизуют) на субстрате, например микротитровальной пластине. Затем к субстрату добавляют антигенсодержащий образец (т.е. образец, содержащий ВИЧ-1 или его антигенный фрагмент), после чего этот образец захватывается анти-ВИЧ-1 антителами. Затем субстрат промывают для удаления несвязанного антигена. Добавляют второе анти-ВИЧ-1 антитело или его антиген-связывающие части, которые связываются с другим эпитопом на ВИЧ-1, например, с другими эпитопами на gp120 или с другими антигенами, например gp140. Второе анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части связывают с репортерной молекулой, например ферментом, хотя репортерная молекула может быть любой молекулой, которая приводит к появлению обнаруживаемого сигнала. Планшет может быть промыт второй раз, и в тех случаях, когда репортерная молекула представляет собой фермент, может быть добавлен субстрат, например ТМВ, который приводит к появлению детектируемого сигнала (также колориметрический анализ). Третий тип общего ИФА - это конкурентный ИФА. В этих вариантах осуществления немеченое анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части инкубируют в присутствии антигенсодержащего образца, который затем добавляют в покрытую антигеном лунку. Планшет промывают для удаления несвязанных антител. Добавляют вторичное антитело, которое является специфическим по отношению к первичному антителу, например, вторичное антитело, специфическое к анти-ВИЧ-1 антителам. Вторичное антитело связывают с репортерной молекулой, как описано выше, такой как фермент (или любой другой молекулой, которая может привести к появлению обнаруживаемого сигнала). В некоторых методах конкурентного ИФА используются меченые антигены, а не меченые антитела; чем меньше количество антигена в образце, тем больше меченого антигена сохраняется и тем сильнее получается обнаруживаемый сигнал.
Другие формы анализов in vitro включают радиоиммуноанализ (RIA). Обычно известное количество антигена связывают с радиоактивной меткой, например I-125, хотя также используются и другие метки, такие как 99Тс, которое затем смешивают с известным количеством антител, специфических в отношении этого антигена, например, анти-ВИЧ-1 антителом или его антигенсвязывающими частями. Затем добавляют образец, содержащий неизвестное количество антигена (например, биологический образец, который содержит или предположительно содержит ВИЧ-1 или его антигенный фрагмент). Этот метод является прямым конкурентным методом специфического связывания; по мере увеличения концентрации немеченого антигена связывание между анти-ВИЧ-1 антителами и меченым стандартом уменьшается, что можно измерить непосредственно путем измерения радиоактивности. Известны и другие анализы, и специалист в данной области способен их использовать.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу обнаружения ВИЧ-1 или его антигенного фрагмента в образце. В таких способах можно использовать любой из описанных в настоящей заявке анализов или другие анализы, известные в данной области. Некоторые из описанных в настоящей заявке анализов обеспечивают количественное определение антигена, присутствующего в образце, и, соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам количественного определения ВИЧ-1 или его антигенных фрагментов, присутствующих в образце, например биологическом образце. Анализы, содержащие анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению, могут или не могут быть использованы для диагностических целей.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам применения анти-ВИЧ-1 антител или их антигенсвязывающих частей по настоящему изобретению для диагностики. Из-за специфичности анти-ВИЧ-1 антител по настоящему изобретению или их антигенсвязывающих частей иммуноанализы, содержащие анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению, могут быть достаточными для диагностики индивидуума как имеющего активную или скрытую инфекцию ВИЧ-1. Антитела или их антигенсвязывающие части не должны ограничиваться какими-либо конкретными эпитопами, при условии, что используемые антитела или их антигенсвязывающие части являются специфическими в отношении ВИЧ-1. Например, в сэндвич-анализе первое анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части могут связываться с первым эпитопом, таким как gp120, и второе анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающие части (связанные с репортерной молекулой) могут связываться со вторым эпитопом, который может присутствовать или не присутствовать на том же антигене. Соответственно, наборы и способы, используемые для обнаружения или количественного определения ВИЧ-1 или его антигенного фрагмента, могут содержать BG18, NC37 и BG1, включая их антигенсвязывающие части, и рассматриваются в рамках настоящего изобретения, или любое из BG18, NC37 и BG1, включая их антигенсвязывающие части, и любое другое анти-ВИЧ-1 антитело, при условии, что оно пригодно для включения в такие наборы/способы. Понятно, что анти-ВИЧ-1 антитела или их антигенсвязывающие части, используемые для целей обнаружения и/или количественного определения ВИЧ-1, присутствующего в образце, или даже для диагностических целей, необязательно должны обладать нейтрализующей способностью широкого спектра действия в отношении ВИЧ1 для возможности их применения для таких целей.
- 24 042959
Е. Эквиваленты.
В тех случаях, когда указан диапазон значений, следует понимать, что в объем изобретения входит каждое промежуточное значение, с точностью до десятой доли единицы от нижнего предела, если из контекста в явном виде не следует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов, которые независимо могут быть включены в меньшие диапазоны, также входят в объем изобретения, с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие оба предела включенных пределов, также включены в объем изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такие же значения, как их обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, также могут использоваться на практике или в испытаниях настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в него во всей их полноте в виде ссылки.
Используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.
Термин примерно относится к диапазону значений, которые не будут рассматриваться специалистом в данной области техники как существенно отличающиеся от базовых значений. Например, термин примерно может относиться к значению, которое находится в пределах 20, 15, 10, 9, 8, 7,6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% от заявленного значения, а также значению, находящемуся в пределах указанных значений.
Публикации, цитируемые в настоящей заявке, предоставлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящего изобретения. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не дает права датировать задним числом такое раскрытие на основании более раннего изобретения. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, что может потребовать независимого подтверждения.
Каждая из заявок и патентов, цитируемых в этом описании, а также каждый документ или справочная, патентная или непатентная литература, цитируемая в каждой из заявок и патентов (в том числе во время судебного разбирательства каждого выданного патента; документы, цитируемые в заявке) и каждая из заявок РСТ и других стран или патентов, соответствующих и/или притязающих на приоритет по отношению к любой из этих заявок и патентов, и каждый из документов, цитируемых или упоминаемых в каждом из документов, цитируемых в заявке, настоящим в явном виде включены в настоящее описание во всей их полноте в виде ссылки. В более общем смысле документы или ссылки цитируются в настоящем описании либо в списке ссылок перед формулой изобретения; либо в самом тексте; и каждый из этих документов или ссылок (ссылок, цитируемых в настоящем документе), а также каждый документ или ссылка, цитируемая в каждой из ссылок, цитируемых в настоящем документе (включая спецификации, инструкции и т.д. любого производителя), настоящим в явном виде включена в настоящий документ в виде ссылки.
Приведенные ниже неограничивающие примеры служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения.
VII. Примеры
1. Сосуществование эффективных нейтрализующих анти-ВИЧ-1 антител широкого спектра действия и чувствительных к антителам вирусов в контроллере виремии.
А. Методы.
ВИЧ-1-инфицированный субъект ЕВ354.
Очищенный IgG от донора ЕВ354 попал в 1% лучших по широте и эффективности нейтрализации в когорте из 394 инфицированных ВИЧ-1 долгосрочных непрогрессоров. Донору ЕВ354 был поставлен диагноз ВИЧ-1 группы В в 1986 году. Он получал лечение диданозином и ставудином в период с 1995 по 1998 год, но с тех пор не получал антиретровирусной терапии. Он находится на плановом наблюдении врача с 2002 (табл. 3: HLA А*01:01, 24:02, В*27:05, 57:01, С*01:02, 06:02). В организме большинства индивидуумов быстро вырабатываются специфические к штамму антитела вскоре после заражения. Этот ответ связан с отбором устойчивых вирусных вариантов, которые в некоторых случаях вызывают образование bNAb. Тем не менее, индивидуумы, прошедшие детальное обследование, отличаются от ЕВ354 тем, что развитие bNAb связано с быстрым отбором аутологичных вирусов в плазме, устойчивых к сосуществующим bNAb. EB354 важен, потому что чувствительные и устойчивые вирусные штаммы сосуществуют с bNAb, а резистентные штаммы не способны вызывать высокие уровни виремии либо потому, что они в некотором роде частично эффективны, либо контролируются CD8+ Т-клетками. Таким образом, в организме этого индивидуума чувствительные к bNAb вирусы плазмы оказались неспособны ускользнуть от иммунного давления, что привело к равновесию bNAb:вирус, при котором вирус сохраняется, но не способен вызывать высокие уровни виремии. ЕВ354 является необычным тем, что он является как элитным контроллером, так и элитным нейтрализатором. Элитные контролеры ВИЧ-1 - это инфици
- 25 042959 рованные индивидуумы, в организме которых поддерживается низкая вирусная нагрузка в течение многих лет. Эти индивидуумы гораздо реже передают вирус и демонстрируют долгосрочную выживаемость без СПИДа. Аллели HLA В57*01 и/или В27*05 обнаружены у 85% элитных контроллеров ВИЧ-1. Эти аллели связаны с повышенной цитотоксической активностью CD8 Т-клеток. По сравнению с виремическими профессорами (т.е. пациентами с высокой вирусной нагрузкой), у элитных контролеров вероятность развития bNAb меньше. Независимо от устойчивых ответов CD8+ Т-клеток, которые способны частично контролировать инфекцию, уровень репликации ВИЧ-1 у ЕВ354 был достаточным для генерации bNAb и созревания аффинности. Как обсуждалось в настоящем описании, bNAb, которые обеспечивают в организме донора ЕВ354 серологическую нейтрализующую активность, распознают несколько непересекающихся эпитопов.
Дата постановки диагноза 1986
HLA А101,2402 В2705,5701 Cwl02,602
Дата визита Вирусная нагрузка CD4abs CD8abs
4/24/2002 310 957 1406
8/7/2002 653 554
12/3/2002 2520 983 1787
3/11/2004 1035 1323 1634
6/18/2004 171 1231 1753
8/20/2004 467
10/7/2004 182 789
2/28/2005 1048 1227
8/25/2005 < 400 1080
11/17/2005 1665 1551
8/3/2006 < 400
10/24/2006 < 400 744 1132
11/15/2006 206 814
4/6/2007 < 400 564
11/28/2007 < 400 781
7/17/2008 149 815
3/17/2009 107 734
2/19/2010 170 900 1933
8/10/2010 65 1096 1706
7/13/2011 380 795 1512
3/28/2013 414 1127 1809
9/18/2013 547 674 1152
7/21/2014 454 697 1321
7/17/2015 461 605 1224
Таблица 3. Клинические показатели донора ЕВ354.
Сортировка В-клеток и выделение антител.
Сортировку единичных приманка+CD19+IgG+В-клеток из РВМС донора ЕВ354 выполняли, как описано у J. F. Scheid et al., А method for identification of HIV gp140 binding memory В cells in human blood. Journal of immunological methods 343, 65-67 (2009). В-клетки памяти предварительно обогащали антиCD19 магнитными частицами (MACS) и окрашивали с использованием четырех различных приманок: корового белка 2СС gp120 в качестве приманки, gp140YU2, 1:1 смесь gp14092UG37.8 (тип А) +gp140CZA79012 (тип В) и BG505 SOSIP.664. Резервные (rescue) праймеры использовали для амплификации как тяжелых цепей, так и генов IgA, а обычные праймеры использовали для цепи IgK. Все продукты ПЦР секвенировали и анализировали на предмет использования гена Ig, CDR3 и количества соматических гипермутаций VH/VL (IgBLAST и IMGT). Очищенные, расщепленные продукты ПЦР клонировали в векторы экспрессии человеческого IgY1, Igk или Igλ, как описано у Т. Tiller et al., Efficient generation of monoclonal antibodies from single human В cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of immunologi- 26 042959 cal methods 329, 112-124 (2008), и продуцировали путем временной трансфекции плазмид экспрессии
IgH, IgK и IgL в экспоненциально растущие клетки НЕК 293-6Е, как описано у F. Klein et al., Enhanced
HIV-1 immunotherapy by commonly arising antibodies that target virus escape variants. The Journal of experimental medicine 211, 2361-2372 (2014).
Изучение нейтрализации.
Нейтрализацию ВИЧ-1 оценивали, используя анализ клеток TZM.bl на основе активности люциферазы. Вкратце, псевдовирусы оболочки инкубировали с пятикратными серийными разведениями отдельных антител и наносили на клетки TZM.bl, которые несли репортерный ген люциферазы. Через 48 ч клетки лизировали и измеряли люминесценцию. Значения IC50 и IC80 отражают концентрации отдельных антител, которые вызывают снижение люминесценции в относительных единицах (RLU) на 50 и 80%, соответственно. Кривые спектра активности строили с помощью вычислительного инструмента Antibody Database.
Кристаллизация, сбор данных рентгеновского анализа и определение структуры.
Кристаллы Fab BG18 с удаленным путем мутации Asn26HC в Gln потенциальным N-связанным сайтом гликозилирования в положении 26 тяжелой цепи продемонстрировали превосходный размер и морфологию по сравнению с кристаллами Fab BG18 дикого типа, таким образом, было выполнено определение структуры с использованием Fab BG18N26q. Кристаллы Fab BG18N26q (пространственная группа Р21; а=46,12 А, b=71,04 А, с=69,54 А; β=98,48°; 1 молекула на асимметричную единицу); получали путем объединения 0,2 мкл раствора белка с концентрацией 18 мг/мл с 0,2 мл 0,1 М ацетата натрия, рН 4,5, 26,8% (об./об.) полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400 и 13,4% (об./об.) ПЭГ 8000 при 20°С, обеспечивали криозащиту в маточном растворе, дополненном 20% (об./об.) этиленгликолем, и мгновенно охлаждали в жидком азоте. Кристаллы Fab NC102 (пространственная группа Р212121; а=60,2 A, b=82,5 А, с=117,2 А; 1 молекула на асимметричную единицу) получали путем диффузии в паровой фазе в сидячих каплях с резервуаром 0,1 М тригидрата ацетата натрия, рН 4,6, и 2,0 М сульфата аммония с использованием 250 нл капель с соотношением белок:резервуар 1,5:1. Кристаллам обеспечивали криозащиту в маточном растворе, дополненном 25% (об./об.) этиленгликоля, и мгновенно охлаждали в жидком азоте. Кристаллы комплекса NC37-93TH057 (пространственная группа P212121; a=63, 6 A, b=67,4 А, с=210,4 А; 1 комплекс на асимметричную единицу) получали диффузией в паровой фазе в 250 нл сидячих каплях путем инкубации белка и резервуара (включающего 0,1 М HEPES, рН 7,5 и 20% (мас./об.) ПЭГ 10000) при соотношении белок:резервуар 1,5:1. Кристаллам обеспечивали криозащиту в маточном растворе, дополненном 20% (мас./об.) ПЭГ 400, и мгновенно охлаждали в жидком азоте.
Данные рентгеновской дифракции собирали на линии 12-2 луча источника синхротронного излучения Стэнфорда, оснащенного пиксельным детектором Pilatus 6M (Dectris). XDS использовали для индексации, интеграции и масштабирования данных. Кристаллы Fab BG18n26Q дифрагировали до 1,5 А, и определяли структуру путем молекулярной замены, используя в качестве моделей исследования VHVL 101074 Fab (PDB код 4FQ2) с удаленными петлями CDR и CH1CL. Структуру уточняли, используя итеративный подход с помощью программы Phenix и построения моделей вручную в графической программе Coot. Конечная модель Fab BG18N26q (Rwork=18,0%, Rfree=18,9%) содержала 98,3, 1,7 и 0% остатков в предпочтительном, разрешенном и запрещенном областях участка Рамачандрана, соответственно. Fab NC102 дифрагировали до 1,6 А, и структуру определяли путем молекулярной замены, используя в качестве моделей исследования модель NIH45-46 (код PDB 3U7W) с VHVL с удаленными петлями CDR и CH1CL. Окончательная модель Fab NC102 (Rwork=18,0%, Rfree=20,0%) содержала 98, 2 и 0% остатков в предпочтительных, разрешенных и запрещенных областях участка Рамачандрана, соответственно. Структуру комплекса NC37-93TH057 gp120 получали путем молекулярной замены, используя в качестве моделей исследования модели VHVL, CH1CL NC102 и усеченного кора gp120 (из PDB 3U7Y). Конечная модель комплекса NC37-93TH057 (Rwork=21,0%, Rfree=26,0%) содержала 96, 4 и 0% остатков в предпочтительном, разрешенном и запрещенном областях участка Рамачандрана, соответственно. Результаты статистики по сбору данных и уточнению представлены в табл. 4.
354BG18 Fab 354NC37+93TH05 7 354NC102 Fab
- 27 042959
Диапазон разрешения (А) 35,44-1,3 (1,346-1,3) 38,6-2,7 (2,82,7) 38,91-1,60 (1,66-1,60)
Пространственн ая группа Р21 вг^^!
Параметры элементарной ячейки
а, Ь, с (А) 46, 12, 71, 04, 69,54 63, 60, 67,41, 210,42 60,22, 82,50, 117,21
a, b, g (°) 90, 98,48, 90 90, 90, 90 90, 90, 90
Измерено отражений 634239 (60770) 172153 (17052) 515918 (48175)
Независимые отражения 106792 (10428) 25596 (2517) 77546 (7649)
Кратность 5,9 (5,7) 6,7 (6,8) 6,7 (6,3)
Полнота (%) 0, 98 (0, 98) 1,00 (1,00) 1,00 (1,00)
Значение I/сигма (I) 14,48 (0, 86) 14,80 (2,73) 11,12 (1,68)
В-фактор Вильсонв (А2) 14,92 41, 63 15, 84
R-merge 0,06152 (1,772) 0,1272 (0,7028) 0,108 (1,031)
СС1/2 0, 999 (0,318) 0, 996 (0, 832) 0, 997 (0, 996)
СС* 1 (0, 694) 0, 999 (0, 953)
R-work 0, 180 0,21 0, 18
Rfree 0, 189 0,26 0,2
Количество атомов 3616 6161 4159
макромолекул 3167 5924 3402
лигандов 235 25
растворителя 449 2 732
Остатов белка 432 781 448
RMS (связи) (А) 0, 009 0, 005 0, 007
RMS (углы) (° ) 1 0, 96 1,145
Clashscore (индекс перекрывания) 6, 17 13, 99 3,41
Среднее значение В- фактора (А2) 22,89 36, 55 20,37
макромолекул 21,3 35, 77 17,77
лигандов 56, 03 34,45
растворителя 34,17 34,8 31,96
Таблица 4. Результаты статистики по сбору данных и уточнению статистики. Статистические данные для оболочки с самым высоким разрешением приведены в скобках.
Структуру комплекса BG505 SOSIP.664-BG18-179NC75 получали с помощью криоэлектронной томографии/усреднения субтомограмм до ~40 А и использовали в качестве эталонной структуры для получения ЭМ структуры единичной частицы из негативно окрашенных образцов. Очищенные комплексы BG505 SOSIP.664-BG18-179NC75 разбавляли до концентрации 10 мкг/мл в TBS непосредственно перед
- 28 042959 добавлением 3 мкл к иммерсионной ультратонкой пленке С на перфорированной углеродной пленкеподложке, 400 меш, Cu-сетки (Ted Pella, Inc.). Образцы на сетках сшивали с использованием паров глутаральдегида и затем окрашивали 3% уранилацетатом. Данные собирали с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai Т12, работающего при 120 кэВ, снабженного камерой Gatan Ultrascan 2kx2k CCD. Изображения получали с временной выдержкой 0,5 с при номинальном увеличении 42000х при расфокусировке 1 мкм, с разрешением 2,5 А на пиксель. Методом роя частиц, используя программу EMAN2.1, в общей сложности было отобрано 25639 частиц, и коррекцию CTF выполняли с помощью программы EMAN2.1. Начальное усреднение по 2D классам, без эталона, выполняли с помощью программы RELION, и все частицы были отсортированы по 250 классам. Было отобрано 9827 частиц с хорошими средними показателями класса, и частицы были дополнительно отсортированы по 3D классификации с помощью программы RELION, после чего для уточнения было отобрано 7925 частиц. Для получения эталонной структуры для 3D классификации и уточнения собирали данные из независимого образца комплекса BG505 SOSIP.664-BG18-179NC75 с помощью криоэлектронной томографии, и структуру, полученную по усредненным 40 А субтомограммам, получали методом, описанным у Scharf, L., et al., Broadly Neutralizing Antibody 8ANC195 Recognizes Closed and Open States of HIV-1 Env. Cell, 2015. 162(6):p. 1379-90. Структуру, усредненную по субтомограммам, фильтровали с помощью фильтра нижних частот до 80 А для использования в качестве эталонной структуры для реконструкции единичных частиц. Разрешение окончательной реконструкции единичных частицы составляло ~25 А, рассчитанное с помощью программы RELION и золотого стандарта FSC с отсечкой 0,143, рекомендованных для оценки разрешения для ЭМ-реконструкций единичных частиц.
Подгонка к карте ЭМ плотности.
ЭМ структуры визуализировали с помощью программы USCF Chimera. Координаты из кристаллических структур вписывли в усредненные по субтомограмме или негативно окрашенные ЭМ-структуры единичных частиц, используя Fit in map утилиту в программе UCSF Chimera со следующими параметрами: корреляция в реальном времени/обновление среднего значения, использовать карту, смоделированную из атомов, разрешение 25 А. Сначала в плотность вписывали структуру BG505 SOSIP.664 (PDB 4TVP), а затем координаты для Fab BG18 и Fab CH103 (PDB 4JAM; в качестве модели для Fab 179NC75) отдельно в соответствующие плотности. Области доменов CH1-CL Fab имели низкую плотность.
Продуцирование и очистка белка для исследований по определению структуры.
6х-His-меченные Fab BG18, BG18n26q, NC102 и NC37 экспрессировали путем временной трансфекции в клетках НЕК293-6Е и очищали от супернатантов трансфицированных клеток с помощью Ni2+-NTA аффинной хроматографии (GE Healthcare) и эксклюзионной хроматографии на Superdex 200 размером 16/60 (SEC) (GE Healthcare). Усеченный, His-меченный, коровый белок 93ТН057 gp120 продуцировали в инфицированных бакуловирусом клетках насекомых и очищали, как описано, с помощью Ni2+ аффинной хроматографии (GE Healthcare) (Diskin et al. Science 2011; Diskin et al. NSMB 2010). Перед испытаниями на кристаллизацию очищенные белки NC37 и 93ТН057 совместно инкубировали (при 2:1 молярному отношению Fab к кору gp120 ) и обрабатывали 5 кЕ эндогликозидазы Н на мг белка gp120 в течение 3 ч при 25°С. Комплекс, обработанный эндогликозидазой Н, очищали с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру на колонке Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare).
Растворимые тримеры BG505 SOSIP.664 для ЭМ исследований конструировали, как описано у Sanders, R.W., et al., A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog, 2013. 9(9):p. el003618. Клетки НЕК293-6Е, обработанные 5 мкМ кифунензина (Sigma), ко-трансфицировали плазмидами, кодирующими BG505 SOSIP.664 и растворимый фурин в соотношении 4:1. Белок BG505 SOSIP.664 собирали из супернатантов клеток, используя иммуноаффинную колонку 2G12, приготовленную путем ковалентного связывания мономера IgG 2G12 с колонкой с NHS-активированной сефарозой (GE Healthcare). Белок элюировали 3М MgCl2 с последующей немедленной заменой буфера трисбуферным солевым раствором (TBS), рН 7,4 (50 мМ NaCl). Тримеры дополнительно очищали на колонке Mono Q 5/50 GL (GE Healthcare), а затем на колонке Superose 6 10/300 SEC (GE Healthcare).
Аутологичные вирусы.
Для одногеномного секвенирования (SGS) генов env ВИЧ-1 ВИЧ-1-РНК экстрагировали из плазмы пациента с помощью набора Qiagen MinElute Virus Spin Kit в соответствии с инструкциями производителя. Экстрагированную РНК подвергали синтезу Env-специфической кДНК с помощью обратной транскриптазы Superscript III, используя ВИЧ-1-специфический праймер envB3out:
envB5out: 5'-TAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 97);
envB3out: 5'-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3' (SEQ ID NO: 98);
envB5in: 5'-TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 99);
envB3in: 5'-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3' (SEQ ID NO: 100).
Первый цикл ПЦР проводили в объеме 20 мкл, содержащем 1х High Fidelity буфер, 2 мМ MgSO4, 0,2 мМ dNTP и 0,5 ед. High Fidelity Platinum Taq и по 0,2 мкМ каждого из праймеров envB5out и envB3out. Второй цикл ПЦР проводили, используя 1 мкл ПЦР 1 и 0,2 мкМ праймеров envB5in и envB3in.
- 29 042959
Условия ПЦР были такими же, как для ПЦР-1, за исключением 45 циклов и повышенной температуры отжига, равной 58°С. Продукты ПЦР-2 проверяли с помощью 1% 96-луночных Е-гелей (Invitrogen). Из полос, полученных в результате ПЦР с эффективностью амплификации менее 30%, получали библиотеки, которые секвенировали с помощью набора Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina). Экспрессионные кассеты CMV-Env генерировали в соответствии с протоколом, описанным у J. L. Kirchherr et al., High throughput functional analysis of HIV-1 env genes without cloning. J Virol Methods 143, 104-111 (2007). 500 нг CMV-env трансфицировали совместно с pSG3Aenv в 6-луночных планшетах в клетки 293Т, и через 48 ч собирали супернатант. Все последовательности плазмид проверяли перед экспрессией. Супернатанты тестировали на нейтрализацию с помощью TZM-bl анализа.
TZM-bl анализы гликоль-мутантных вирусов Env.
Псевдовирусы получали путем трансфекции клеток 293Т (АТСС) плазмидой, экспрессирующей Env ВИЧ-1, и плазмидой геномного остова, дефицитного по Env, названной pSG3AEnv, как описано у Li, M., et al., Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype В infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies. J Virol, 2005. 79(16):p. 10108-25. Псевдовирусы собирали через 72 ч после трансфекции для использования в анализах нейтрализации. Нейтрализующую активность оценивали в одном цикле анализа репликации псевдовируса и клеток-мишеней TZM-B1, как описано у Li et al. выше. Вкратце, клетки TZM-bl высевали в плоскодонный 96-луночный планшет. К этому планшету добавляли псевдовирус, который предварительно инкубировали с серийными разведениями антител в течение 1 ч при 37°С. Через 72 ч после заражения выполняли количественное определение экспрессии репортерного гена люциферазы после лизиса и добавления субстрата для люциферазы Bright-Glo™ (Promega). Для определения значений IC50 получали кривые доза-ответ методом нелинейной регрессии.
Синтез гликопептидов V3 ВИЧ-1.
Гликопептиды V3, полученные из нескольких штаммов ВИЧ-1, синтезировали с использованием хемоферментного метода, который состоит из автоматизированного твердофазного пептидного синтеза предшественника GlcNAc-пептид и последующего ферментативного трансгликозилирования GlcNAcпептида для получения целевых гликопептидов, следуя процедурам, описанным у Amin, M.N., et al., Synthetic glycopeptides reveal the glycan specificity of HIV-neutralizing antibodies. Nat Chem Biol, 2013. 9(8):p. 521-6. Взаимодействия между биотинилированными синтетическими гликопептидами и антителами IgG BG18 и BG8 оценивали методом SPR с помощью системы BIAcore T200 (GE Healthcare) при 25°С. Биотинилированные гликопептиды иммобилизовали на сенсорных чипах СМ5, покрытых нейтравидином, в буфере HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, поверхностно-активное вещество Р20 0,05% об./об., рН 7,4) до достижения ответа 200 единиц (RU). BG18 (или BG8) инъецировали при двукратном серийном разведении концентрации, начиная с 4 мкМ, в буфере BS-P со скоростью потока 40 мкл/мин в течение 180 с. Затем в течение 1210 с вводили буфер BS-P со скоростью потока 40 мкл/мин для обеспечения диссоциации. Регенерацию проводили путем введения 3 М MgCl2 со скоростью потока 50 мкл/мин в течение 3 минут с последующей инъекцией буфера HBS-P со скоростью потока 50 мкл/мин в течение 5 мин.
In vivo мышиная модель.
Гуманизированным мышам NOD Rag1’/’I12rgnu (NOD. Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ) (The Jackson Laboratory) вводили подкожно (s.c.) 1 мг каждого антитела два раза в неделю в течение 3 недель, общим количеством инъекций антител, равным шести. Контрольных hu-мышей создавали, используя человеческие клетки от того же донора, и инфицировали BH4-1YU2, но не вводили антитела. Нагрузку плазмы вирусами измеряли еженедельно. Последовательности gp120 от мышей с увеличенной вирусной нагрузкой получали, как описано в in F. Klein et al., HIV therapy by a combination of broadly neutralizing antibodies in humanized mice. Nature 492, 118-122 (2012).
Методы ИФА.
96-луночные планшеты для ИФА с высокой степенью связывания (Costar) покрывали в течение ночи 5 мкг/мл очищенного кора 2СС, складчатого тримера gp120.YU2 (дикого типа или мутантов) или gp140.YU2 в PBS. После 6 разовой промывки PBS+0,05% Твин 20 планшеты блокировали в течение 2 ч 2% BSA, 1 мкМ EDTA и 0,05% Твин-PBS (блокирующий буфер), а затем инкубировали в течение 1 ч с IgG, которые добавляли в виде семи последовательных разведений 1:4 в PBS с начальной концентрацией 4 мкг/мл. После дополнительной промывки планшеты окрашивали путем инкубации с козьим HRPконъюгированным антителом против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch) (при 0,8 мкг/мл в блокирующем буфере) в течение 1 ч с последующим добавлением хромогенного субстрата пероксидазы хрена (HRP) (раствор ABTS); Invitrogen). Для конкурентного ИФА планшеты покрывали 0,5 мкг/мл BG505.SOSIP.664, промывали, блокировали в течение 2 ч блокирующим буфером и затем инкубировали в течение 1 ч с добавленными IgG в виде семи последовательных разведений 1:4 в PBS с начальной концентрацией 32 мкг/мл в присутствии биотинилированного антитела с постоянной концентрацией 4 мкг/мл. Затем планшеты окрашивали, используя HRP-конъюгированный стрептавидин (Jackson ImmunoReseach) (с концентрацией 1 мкг/мл в блокирующем буфере).
Для ИФА с использованием тримеров BG505 SOSIP.664 с меткой эпитопа D7324 (BG505
- 30 042959
SOSIP.664-D7324) планшеты покрывали в течение ночи 5 мкг/мл антитела D7324, как описано у Sanders, R.W., et al., A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog, 2013. 9(9):p. e1003618, и затем промывали и инкубировали с 500 нг/мл тримера. После дополнительной промывки добавляли IgG в течение 1 ч в виде семи последовательных разведений 1:4 в PBS с исходной концентрацией 4 мкг/мл. Конечный продукт получали путем инкубации с козьими HRP-конъюгированными антителами против человеческого IgG, как описано выше. Все эксперименты выполняли не менее 3 раз.
Генерация вирусов CMV-Env.
Экспрессионные кассеты CMV-env генерировали в соответствии с установленным протоколом (52). Вкратце, промотор CMV амплифицировали из экспрессионного вектора pcDNA 3.1D/V5-His-ТОРО с помощью следующих праймеров:
CMVenv: 5'-AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCAT-3' (SEQ ID NO: 101) и
CMVenv1A 5'-CATAGGAGATGCCTAAGCCGGTGGAGCTCTGCTTATATAGACCTC-3' (SEQ ID NO: 102).
Продукт ПЦР очищали, используя набор для ПЦР Macherey-Nagel и гель-очиститель. 1 мкл продукта первого цикла ПЦР амплифицировали с использованием следующих праймеров:
env1ATOPO 5'-CACCGGCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAA-3' (SEQ ID NO: 103) и Rev19 5'ACTTTTTGACCACTTGCCACCCAT-3' (SEQ ID NO: 104) в объеме 20 мкл, содержащем 1х High Fidelity буфер, 2 мМ MgSO4, 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. High Fidelity Platinum Taq и 0,2 мкМ каждого праймера. Условия цикла были следующими: 94°С, 2 мин; (94°С, 15 с; 55°С, 30 с; 68°С, 4 мин) х35; 68°С, 10 мин. Присутствие env подтверждали анализом на 0,7% агарозном геле, и продукт очищали с помощью набора для очистки Macherey-Nagel Gel и ПЦР. Затем 10 нг оболочки и 0,5 нг CMV подвергали ПЦР с перекрыванием, используя праймеры CMVenv и Rev19, в трех экземплярах. Общий реакционный объем 6 составлял 50 мкл, содержащий 1x High Fidelity буфер, 0,2 мкМ MgSO4, 0,2 мМ dNTP, 1 ед. High Fidelity Platinum Taq и 0,4 мкМ каждого праймера. ПЦР проводили при 94°С, 2 мин; (94°С, 30 с; 60°С, 30 с; 68°С, 4 мин) x25; 68°С, 10 мин. 500 нг CMV-env трансфицировали совместно с pSG3Aenv в 6-луночных планшетах в клетки 293Т, и через 48 ч собирали супернатант. Супернатанты тестировали на нейтрализацию с помощью TZM-bl анализа, как описано выше.
Культура Вируса (VOA).
Вирус из донора ЕВ354 получали путем совместного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови пациента (РВМС) со здоровыми донорскими РВМС, как описано у van't Wout et al., Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nat Protoc, 2008. 3(3):p. 363-70. Здоровые донорские РВМС получали от пациентов с помощью лейкафереза согласно протоколу исследования MNU-0628 университете Рокфеллера. Здоровые донорские РВМС предварительно стимулировали при плотности 5x106 клеток на мл в IMDM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин и 1 мкг/мл РНА, в течение 2-3 дней при 37°С при 5% СО2. Затем 6x106 стимулированных донорских РВМС переносили в IMDM, содержащую 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин, 10 МЕ/мл IL-2 и 5 мкг/мл полибрена, и совместно культивировали с 5-10x106 РВМС ЕВ354 при 37°С и 5% СО2. Среду меняли еженедельно, и наличие р24 в культуральном супернатанте определяли количественно с помощью набора Lenti-X p24 Rapid Titer (Clontech). Культуры с содержанием р24 более 1 нг на мл супернатанта замораживали и хранили при -80°С. Определение инфекционной дозы 50 для культуры ткани (TCID50) и последующее тестирование чувствительности аутологичных вирусов к различным нейтрализующим антителам широкого спектра действия и аутологичному сывороточному IgG выполняли с помощью TZM-bl анализа нейтрализации в соответствии с протоколами, описанными выше. Все анализы нейтрализации проводили в двух экземплярах.
Мутанты оболочки ВИЧ-1YU2.
Одиночные, двойные и тройные мутации вводили в оболочку ВИЧ-1YU2 дикого типа с помощью набора для множественного сайт-направленного мутагенеза QuikChange в соответствии со спецификациями производителя (Agilent Technologies).
Анализ эволюции вируса.
Выравнивания нуклеотидных последовательностей env осуществляли с помощью программы ClustalW (версия 2.11) или путем ручного выравнивания с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей Geneious (версия 8.1.6). Для филогенетического анализа и вычисления разнообразия области, которые не могли быть однозначно выровнены, удаляли. Эволюционные модельные классы для филогенетического анализа методом максимального правдоподобия выбирали с помощью программы jModelTest. Методом максимального правдоподобия получали филогенетические деревья с помощью программы PhyML (версия 3) с совместной оценкой значений параметров модели и филогении. Выполняли попарное сравнение генетического разнообразия между выборками с помощью статистического теста U из двух выборок в веб-инструменте DIVEIN.
Биоинформатическая обработка последовательностей enV с помощью системы MiSeq.
Адаптеры последовательностей удаляли с помощью программы Cutadapt v1.8.3. Считывание сборки
- 31 042959 для каждого вируса выполняли в три этапа. Сначала, сборку de novo выполняли с помощью программы Spades v3.6.1 с получением длинных файлов contig. Затем contig длиной более 255 п.н. выравнивали относительно эталонной последовательности оболочки ВИЧ, и создавали консенсусную последовательность с помощью программы Geneious 8. Наконец, считывания повторно выравнивали относительно консенсусной последовательности, чтобы закрыть гэпы, и получали окончательный консенсус. Последовательности с двойными пиками (идентичность консенсуса с отсечкой для любого остатка <75%) исключали из последующего анализа.
Статистический анализ.
Статистические различия анализировали с помощью теста Манна-Уитни. Для анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism, и данные считались значимыми при *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001.
В. Результаты.
Несколько BNAb.
Очищенный IgG из образца донора ЕВ354 попал в 1% лучших по широте и эффективности нейтрализации в когорте из 394 инфицированных ВИЧ-1 долгосрочных непрогрессоров. Этому донору был поставлен диагноз ВИЧ-1 типа В в 1986 году. ЕВ354 получал лечение диданозином и ставудином в период с 1995 по 1998 год, но с тех пор не получал антиретровирусной терапии. В 2002 году вирусная нагрузка у ЕВ354 составляла <400 копий/мл, а количество CD4 и CD8 составляло 954 и 1046 клеток/мм3, соответственно. В период с 2002 по 2006 г. у ЕВ354 было три задокументированных пика виремии (фиг. 1А). Серологическую нейтрализующую активность и широту спектра действия впервые оценили в 2006 году, когда вирусная нагрузка составляла <400 копий/мл (фиг. 1А и 1В и табл. 3). Нейтрализующая активность увеличивалась до 2010 года и оставалась широкой и мощной с того времени (фиг. 1B). HLA-типирование выявило HLA А*01:01, 24:02, В*27:05, 57:01, С*01:02, 06:02 (табл. 3).
Для выделения антител, которые отвечают за серологическую активность у этого субъекта, выполнили отбор отдельных клеток, используя четыре разные приманки ВИЧ-1; кор 2СС, gp140YU2/ 1:1 смесь gp14092UG37.8 (тип А) +gp140CZA79012 (тип С) и BG505 SOSIP.664 (фиг. 1С). Общее количество выделенных спаренных тяжелых и легких цепей составило 241, из которых 152 антитела образовали 22 различных клона. Антитела из 3 клонов показали нейтрализующую активность уровня 2 (фиг. 1С и табл. 13). По сравнению с сывороточным IgG в период 2010-2015 гг. антитела, принадлежащие этому клону, примером которого является антитело BG18 (фиг. 1С), обеспечивали наибольшую часть серологической активности (фиг. 1D). Антитела, принадлежащие двум другим нейтрализующим клонам, примером которых являются антитело NC37 и антитело BG1 (фиг. 1С), были менее эффективными, но дополняли активность BG18 (фиг. 1D).
Для картирования сайтов связывания антител в 3 нейтрализующих клонах проводили TZM-bl анализы, используя варианты HIV-1YU2, несущие в Env эпитоп-специфические точечные мутации. Учитывая тот факт, что поликлональный IgG не показал поддающегося измерению изменения чувствительности к мутантам, антитело BG18 оказалось чувствительным к YU2N332K (гликан-V3), антитело BG1 - к YU2N160K (V1V2) и антитело NC37 - к YU2n280y (CD4b) (фиг. 1D). Согласно результатам нейтрализации, связывание BG18 в методе ИФА конкурентно ингибировалось PGT121 и 10-1074; а связывание BG1 уменьшалось в присутствии PGT145 (фиг. 5).
BG18 нейтрализовал 64% вирусов на панели из 118 вирусов (фиг. 1E, табл. 5) со средним геометрическим значением IC50 0,03 мкг/мл и по широте спектра действия был сопоставим, но более эффективным, чем PGT121 или 10-1074 (фиг. 1F, табл. 5-10). Антитела NC37 и BG1 имели средние геометрические значения IC50, равные 0,3 мкг/мл и 0,67 мкг/мл, и широту 33 и 37%, соответственно. (фиг. 1E и 1F, табл. 6 и 7). Смесь 1:1:1 трех bNAb нейтрализовала 81% вирусов на панели из 118 вирусов со средним геометрическим значением IC50, равным 0,130 мкг/мл, что указывает на аддитивный эффект (фиг. 1E, табл. 11).
- 32 042959
BG18
ID вируса Группа 1С50 !С8о
6535.3 В 0, 001 0, 005
QH0692.42 В 0, 013 0, 042
SC422661.8 В 0, 005 0, 021
PVO. 4 в 0, 003 0, 013
TRO.11 в 0, 001 0, 002
АСЮ. 0.2 9 в 0, 001 0, 003
RHPA4259.7 в 1,437 >30
THRO4156.18 в >30 >30
REJO4541.67 в >30 >30
TRJO4551.58 в 3,341 26, 938
WITO4160.33 в 0, 018 0,250
CAAN5342 .A2 в 0, 008 0, 040
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) 0, 003 0, 012
1006_ll_C3_1601 В (T/F) 0, 001 0, 004
1054_07_TC4_1499 В (T/F) 0, 005 0, 022
1056_1O_TA11_1826 В (T/F) 0, 007 0, 045
1012_ll_TC21_3257 В (T/F) 0, 003 0, 012
6240_08_TA5_4622 В (T/F) 0, 003 0, 010
6244_13_B5_4576 В (T/F) 0, 011 0, 049
62357_14_D3_4589 В (T/F) 3, 008 >30
SC05_8Cll_2344 В (T/F) 0, 003 0, 016
Dul56.12 С 0, 003 0, 010
Dul72.17 С >30 >30
Du422.1 С 0, 009 0, 057
ZM197M.PB7 С >30 >30
ZM214M.PL15 С >30 >30
ZM233M.PB6 С 2,866 29,805
ZM249M.PL1 С >30 >30
- 33 042959
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PL10a C 0, 029 0,161
CAP45.2.00.G3 C >30 >30
CAP210.2.00.E8 C 3,469 10,748
HIV-001428-2.42 C 0, 004 0, 021
HIV-0013095-2.11 C 10,516 29,966
HIV-16055-2.3 C >30 >30
HIV-16845-2.22 C 0, 019 0, 090
CelO86_B2 C (T/F) >30 >30
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) 0, 004 0, 012
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) 0, 002 0, 007
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F CIG C (T/F) 0, 034 0,257
249M BIO C (T/F) >30 >30
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 1,454 8,725
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 002 0, 008
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 029 0,350
Ce704809221_1B3 C (T/F) 4,394 >30
CNE19 BC >30 >30
CNE2 0 BC 0, 002 0, 006
CNE21 BC 0, 002 0, 007
CNE17 BC 0, 020 0, 109
CNE3 0 BC 0, 019 0, 059
CNE52 BC 0, 012 0, 045
CNE53 BC 0, 003 0, 011
CNE58 BC 0, 024 0, 073
- 34 042959
MS208.Al A >30 >30
Q23.17 A 0, 006 0, 020
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A >30 >30
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 13,986 >30
3415.vl.cl A 0, 023 0, 087
3365.v2.c2 A 0, 013 0, 037
191955_A11 A (T/F) >30 >30
191084 B7-19 A (T/F) 0, 011 0, 043
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 005 0, 056
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG 0,761 3, 934
263-8 CRF02_AG 1,380 7,548
T250-4 CRF02_AG 0, 001 0, 006
T251-18 CRF02_AG 0, 086 0,328
T278-50 CRF02_AG 2,947 12,875
T255-34 CRF02_AG >30 >30
211-9 CRF02_AG 1,299 5, 529
235-47 CRF02_AG 0, 005 0, 017
620345.cOl CRF01_AE >30 >30
CNE8 CRF01_AE >30 >30
C1080.C03 CRF01_AE 5,369 >30
R2184.C04 CRF01_AE >30 >30
R1166.C01 CRF01_AE >30 >30
R3265.C06 CRF01_AE >30 >30
C2101.cOl CRF01_AE >30 >30
C3347.C11 CRF01_AE >30 >30
C4118.c09 CRF01_AE >30 >30
CNE5 CRF01_AE >30 >30
BJOX009000.02.4 CRF01_AE 24,376 >30
- 35 042959
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) 0, 474 14,851
Х1193_с1 G 0, 005 0, 022
Р0402_с2_11 G 0, 005 0, 029
Х1254_сЗ G 0, 004 0, 012
Х2088_с9 G 0, 004 0, 009
Х2131_С1_В5 G 0, 002 0, 008
Р1981_С5_3 G 0, 006 0, 019
X1632_S2_B10 G >30 >30
3016.v5.c45 D >30 >30
А07412М1.vrcl2 D 0, 081 1,715
231965.c01 D >30 >30
231966.с02 D >30 >30
191821_Е6_1 D (T/F) 14,076 >30
3817.v2.с59 CD 0,219 1,059
6480.v4.с25 CD 0, 016 0, 116
6952. vl.с20 CD 0, 005 0, 011
6811,v7,с18 CD 0, 001 0, 006
89-Е1_2_25 CD >30 >30
3301.vl.с24 AC 0, 025 0, 082
6041. v3.с23 AC >30 >30
6540.v4. cl AC 28,197 >30
6545.v4. cl AC >30 >30
0815.v3.c3 ACD 0, 160 5, 964
3103.v3.cl0 ACD 0, 002 0, 005
BG505/T332N A <0,0001 0, 002
YU2_WT В 0, 033 0, 198
YU2_N276D В 0, 012 0, 036
YU2_N332K В >30 >30
YU2_N160K В 0, 028 0, 150
YU2_N280Y В 0, 005 0, 016
Таблица 5. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе для BG18.
- 36 042959
NC37
ID вируса Группа 1С5О 1С8О
6535.3 В >30 >30
QH0692.42 В 0,582 2,054
SC422661.8 В 0, 071 0,321
PVO. 4 в 0,412 2,825
TRO.11 в 0,337 1,761
АСЮ . 0.29 в >30 >30
RHPA4259.7 в 0,345 2,289
THRO4156.18 в >30 >30
REJO4541.67 в 0, 104 0,304
TRJO4551.58 в 0, 143 1, 615
WITO4160.33 в 0,733 17,779
CAAN5342.A2 в 0, 911 3, 694
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) 0, 037 0, 133
1006_ll_C3_1601 В (T/F) 0, 054 0,207
1054_07_TC4_1499 В (T/F) >30 >30
1056_1O_TA11_1826 В (T/F) 1,048 5, 510
1012_11_TC21_3257 В (T/F) 0, 099 0, 638
6240_08_TA5_4622 В (T/F) 1,236 6, 388
6244_13_B5_4576 В (T/F) 5, 574 >30
62357_14_D3_4589 В (T/F) 1,860 29,422
SC05_8Cll_2344 В (T/F) 0,202 0,714
Dul56.12 С >30 >30
Dul72.17 С >30 >30
Du422.1 С >30 >30
- 37 042959
ZM197M.PB7 C 3, 098 17,368
ZM214M.PL15 C >30 >30
ZM233M.PB6 C >30 >30
ZM249M.PL1 C >30 >30
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PL10a C >30 >30
CAP45.2.00.G3 C >30 >30
CAP210.2.00.E8 C >30 >30
HIV-001428-2.42 C 0, 124 2,275
HIV-0013095-2.11 C >30 >30
HIV-16055-2.3 C >30 >30
HIV-16845-2.22 C >30 >30
CelO86_B2 C (T/F) 2,322 20,996
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) >30 >30
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) >30 >30
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F CIG C (T/F) >30 >30
249M BIO C (T/F) >30 >30
ZM247vl(Rev-) C (T/F) >30 >30
7030102001E5(Rev-) C (T/F) >30 >30
1394C9G1(Rev-) C (T/F) >30 >30
Ce704809221_1B3 C (T/F) >30 >30
CNE19 BC >30 >30
CNE2 0 BC >30 >30
CNE21 BC >30 >30
CNE17 BC >30 >30
- 38 042959
CNE3 0 BC 0, 915 11,813
CNE52 BC >30 >30
CNE53 BC >30 >30
CNE58 BC >30 >30
MS208.Al A >30 >30
Q23.17 A >30 >30
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A 0,242 1,574
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 0,255 1,821
3415.vl.cl A 0, 183 0, 654
3365.v2.c2 A >30 >30
191955_A11 A (T/F) >30 >30
191084 B7-19 A (T/F) 0, 064 0,208
9004SS_A3_4 A (T/F) >30 >30
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG >30 >30
263-8 CRF02_AG 0,269 1,523
T250-4 CRF02_AG >30 >30
T251-18 CRF02_AG 1,835 7,857
T278-50 CRF02_AG >30 >30
T255-34 CRF02_AG >30 >30
211-9 CRF02_AG >30 >30
235-47 CRF02_AG 14,369 >30
620345.cOl CRF01_AE >30 >30
CNE8 CRF01_AE >30 >30
C1080.C03 CRF01_AE >30 >30
R2184.c04 CRF01_AE 0, 025 0, 082
R1166.C01 CRF01_AE >30 >30
R3265.C06 CRF01_AE >30 >30
C2101.C01 CRF01_AE >30 >30
- 39 042959
С3347.С11 CRF01_AE >30 >30
С4118.с09 CRF01_AE >30 >30
CNE5 CRF01_AE >30 >30
BJOX009000.02.4 CRF01_AE >30 >30
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >30 >30
Х1193_с1 G >30 >30
Р0402_с2_11 G >30 >30
Х1254_сЗ G >30 >30
Х2088_с9 G >30 >30
Х2131_С1_В5 G >30 >30
Р1981_С5_3 G >30 >30
X1632_S2_B10 G >30 >30
3016.v5.c45 D 23,592 >30
А07412М1.vrcl2 D >30 >30
231965.c01 D >30 >30
231966.с02 D >30 >30
191821_Е6_1 D (T/F) 9, 963 >30
3817.v2.c59 CD >30 >30
6480.v4.c25 CD 3, 060 >30
6952.vl.c20 CD 0, 104 0,477
6811.v7.cl8 CD >30 >30
89-Е1_2_25 CD 17,963 >30
3301.vl.c24 AC >30 >30
6041.v3.c23 AC 0, 018 0, 054
6540.v4. cl AC >30 >30
6545.v4.cl AC >30 >30
0815.v3.c3 ACD 0, 022 0, 082
3103.v3.cl0 ACD >30 >30
BG505/T332N A
YU2_WT В 0, 12
YU2_N276D В NT
YU2_N332K В 0, 05
YU2_N160K В 0, 05
YU2_N280Y В >30
Таблица 6. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе для NC37.
- 40 042959
BGl
ID вируса Группа 1С50 1С8о
6535.3 В 0,322 1,130
QH0692.42 в >30 >30
SC422661.8 в >30 >30
PVO. 4 в >30 >30
TRO.11 в >30 >30
AGIO.0.29 в 0, 012 0, 043
RHPA4259.7 в >30 >30
THRO4156.18 в >30 >30
REJO4541.67 в 0,342 1, 662
TRJO4551.58 в >30 >30
WITO4160.33 в 0, 002 0, 014
CAAN5342.A2 в >30 >30
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) >30 >30
1006_ll_C3_1601 В (T/F) >30 >30
1054_07_TC4_1499 В (T/F) >30 >30
1056_1O_TA11_1826 В (T/F) 5, 428 29,924
1012_ll_TC21_3257 В (T/F) >30 >30
6240_08_TA5_4622 В (T/F) >30 >30
6244_13_B5_4576 В (T/F) >30 >30
62357_14_D3_4589 В (T/F) 0, 638 2,889
- 41 042959
SC05_8Cll_2344 В (T/F) >30 >30
Dul56.12 C 1,525 6, 031
Dul72.17 C >30 >30
Du422.1 C 1, 804 13,708
ZM197M.PB7 C >30 >30
ZM214M.PL15 C >30 >30
ZM233M.PB6 C >30 >30
ZM249M.PL1 C 1,223 6,795
ZM53M.PB12 C >30 >30
ZM109F.PB4 C >30 >30
ZM135M.PL10a C >30 >30
CAP45.2.00.G3 C 0, 149 0,383
CAP210.2.00.E8 C >30 >30
HIV-001428-2.42 C 1, 094 3, 124
HIV-0013095-2.11 C >30 >30
HIV-16055-2.3 C 4,296 16, 939
HIV-16845-2.22 C >30 >30
CelO86_B2 C (T/F) >30 >30
CeO393_C3 C (T/F) >30 >30
Cell76_A3 C (T/F) 0, 031 0,165
Ce2010_F5 C (T/F) >30 >30
CeO682_E4 C (T/F) >30 >30
Cell72_Hl C (T/F) >30 >30
Ce2060_G9 C (T/F) >30 >30
Ce703010054_2A2 C (T/F) >30 >30
BF1266.431a C (T/F) >30 >30
246F CIG C (T/F) >30 >30
249M BIO C (T/F) 1, 473 5, 445
ZM247vl(Rev-) C (T/F) >30 >30
7030102001E5(Rev-) C (T/F) >30 >30
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 1,279 7,249
Ce704809221_lB3 C (T/F) 3,251 18,455
- 42 042959
CNE19 BC 1,267 10,883
CNE2 0 BC 4,264 >30
CNE21 BC >30 >30
CNE17 BC >30 >30
CNE3 0 BC >30 >30
CNE52 BC 0, 975 5, 008
CNE53 BC 1,318 7,470
CNE58 BC >30 >30
MS208.Al A 1,478 6, 543
Q23.17 A 0, 008 0, 016
Q461.e2 A >30 >30
Q769.d22 A >30 >30
Q259.d2.17 A >30 >30
Q842.dl2 A 1,395 4,297
3415.vl.cl A 14,412 >30
3365.v2.c2 A 1,161 4,272
191955_A11 A (T/F) 0, 008 0, 018
191084 B7-19 A (T/F) >30 >30
9004SS_A3_4 A (T/F) >30 >30
T257-31 CRF02_AG >30 >30
928-28 CRF02_AG >30 >30
263-8 CRF02_AG >30 >30
T250-4 CRF02_AG 3, 921 >30
T251-18 CRF02_AG 3,591 17,977
T278-50 CRF02_AG 19,313 >30
T255-34 CRF02_AG 11,589 >30
211-9 CRF02_AG 2,852 12,939
235-47 CRF02_AG 1,275 4,384
620345.cOl CRF01_AE 0, 626 4,229
CNE8 CRF01_AE >30 >30
C1080.C03 CRF01_AE 0, 002 0, 005
- 43 042959
R2184.c04 CRF01_AE >30 >30
R1166.c01 CRF01_AE >30 >30
R3265.c06 CRF01_AE 0, 611 3,438
C2101.cOl CRF01_AE >30 >30
C3347.C11 CRF01_AE >30 >30
C4118.c09 CRF01_AE 22,788 >30
CNE5 CRF01_AE 0,351 1,277
BJOX009000.02.4 CRF01_AE >30 >30
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >30 >30
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >30 >30
X1193_cl G 0, 138 0,463
P0402_c2_ll G >30 >30
X1254_c3 G 0, 048 0, 086
X2088_c9 G >30 >30
X2131_C1_B5 G 0, 116 0,313
P1981_C5_3 G >30 >30
X1632_S2_B10 G 0, 079 0,250
3016.v5.c45 D >30 >30
A07412M1.vrcl2 D >30 >30
231965.cOl D >30 >30
231966.c02 D >30 >30
191821_E6_1 D (T/F) >30 >30
3817.v2.c59 CD 11,147 >30
6480.v4.c25 CD >30 >30
6952.vl.c20 CD >30 >30
6811.v7.cl8 CD >30 >30
89-Fl_2_25 CD >30 >30
- 44 042959
3301. vl.с24 AC >30 >30
6041.v3.c23 AC 6, 745 16,641
6540.v4.cl AC >30 >30
6545.v4.cl AC >30 >30
0815.v3.c3 ACD >30 >30
3103.v3.cl0 ACD >30 >30
BG505/T332N A 0, 034 0, 125
YU2_WT В 15,816 >30
YU2_N276D В 18,765 >30
YU2_N332K В 19,434 >30
YU2_N160K В >30 >30
YU2_N280Y В 8,998 23,023
Таблица 7. Значения 1С5о и 1С§о в TZM-bl анализе для BG1.
BG8
ID вируса Группа 1С50 !С8о
6535.3 В 0, 007 0, 022
QH0692.42 В 0, 106 0,383
SC422661.8 В 0, 058 0,368
PVO. 4 в 0, 072 0,252
TRO.11 в 0, ОН 0, 039
AGIO.0.29 в 0, 015 0, 043
RHPA4259.7 в 0, 023 0, 083
THRO4156.18 в >10 >10
REJO4541.67 в >10 >10
TRJO4551.58 в 0, 057 0,218
WITO4160.33 в 0, 111 0, 828
CAAN5342.А2 в 0, 005 0, 019
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) 0, 031 0, 112
1006_11_СЗ_1601 В (T/F) 0, 002 0, 006
1054_07_ТС4_1499 В (T/F) 0, 048 0,222
1056_10_ТА11_1826 В (T/F) 0, 038 0,168
-45042959
1012_11_ТС21_3257 В (T/F) 0, 011 0, 047
6240_08_ТА5_4622 В (T/F) 0, 038 0, 131
6244_13_В5_4576 В (T/F) 0, 091 0,380
62357_14_D3_4589 В (T/F) >10 >10
SC05_8Cll_2344 В (T/F) 0, 017 0, 048
Dul56.12 C 0, 010 0, 036
Dul72.17 C 0, 049 0, 194
Du422.1 C 0, 047 0, 113
ZM197M.PB7 C >10 >10
ZM214M.PL15 C 0,415 2,970
ZM233M.PB6 C 0, 058 0,371
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C >10 >10
ZM109F.PB4 C >10 >10
ZM135M.PL10a C 0, 061 0,263
CAP45.2.00.G3 C >10 >10
CAP210.2.00.E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 035 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C >10 >10
HIV-16845-2.22 C 0,727 3, 930
CelO86_B2 C (T/F) >10 >10
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 070
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 019 0, 083
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F CIG C (T/F) 0, 035 0, 119
249M BIO C (T/F) >10 >10
- 46 042959
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 042 0, 146
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 009 0, 019
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 031 0, 093
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 084 0,395
CNE19 BC 0, 075 >10
CNE2 0 BC 0, 002 0, 005
CNE21 BC 0, 047 0, 124
CNE17 BC 1,180 4,853
CNE3 0 BC 0,261 0, 678
CNE52 BC 1,991 9,763
CNE53 BC 0, 013 0, 058
CNE58 BC 0,165 0,476
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 015
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A >10 >10
Q842.dl2 A >10 >10
3415.vl.cl A >10 >10
3365.v2.c2 A 0, 057 0,200
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 026 0, 108
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 012 0, 032
T257-31 CRF02_AG >10 >10
928-28 CRF02_AG 0, 616 2,396
263-8 CRF02_AG 0,416 5,714
T250-4 CRF02_AG 0, 002 0, 005
T251-18 CRF02_AG 0,399 2,292
T278-50 CRF02_AG 1,713 >10
T255-34 CRF02_AG >10 >10
211-9 CRF02_AG 0, 065 0,403
- 47 042959
235-47 CRF02_AG 0, 058 0,224
620345.с01 CRF01_AE >10 >10
CNE8 CRF01_AE >10 >10
С1080.с03 CRF01_AE >10 >10
R2184.с04 CRF01_AE >10 >10
R1166.C01 CRF01_AE >10 >10
R3265.C06 CRF01_AE >10 >10
С2101.с01 CRF01_AE >10 >10
С3347 .сП CRF01_AE >10 >10
С4118.с09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJOX009000.02.4 CRF01_AE >10 >10
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
Х1193_с1 G 0, 070 0,207
Р0402_с2_11 G 0, 008 0, 024
Х1254_сЗ G 0, 063 0,239
Х2088_с9 G 0, 003 0, 010
Х2131_С1_В5 G 0, 014 0, 056
Р1981_С5_3 G 0, 004 0, 013
X1632_S2_B10 G >10 >10
3016.v5.с45 D >10 >10
А07412М1.vrcl2 D 0, 011 0, 037
231965.c01 D >10 >10
231966.с02 D >10 >10
191821_Е6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.с59 CD 0,706 4,492
6480.v4.с25 CD 0, 006 0, 023
6952. vl.с20 CD 0, 023 0, 086
6811.v7.с18 CD 0, 003 0, 009
89-Fl_2_25 CD >10 >10
3301.vl.с24 AC 0, 018 0, 049
6041. v3.c23 AC >10 >10
6540.v4.cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 ACD 0, 043 0, 197
3103.v3.cl0 ACD 0, 024 0, 061
Таблица 8. Значения IC50 и IC8o в TZM-bl анализе для BG8.
- 48 042959
10-1074
ID вируса Группа 1С50 1С8о
6535.3 В 0, 007 0, 022
QH0692.42 в 0, 106 0,383
SC422661.8 в 0, 058 0,368
PVO. 4 в 0, 072 0,252
TRO.11 в 0, 011 0, 039
АСЮ. 0.2 9 в 0, 015 0, 043
RHPA4259.7 в 0, 023 0, 083
THRO4156.18 в >10 >10
REJO4541.67 в >10 >10
TRJO4551.58 в 0, 057 0,218
WITO4160.33 в 0, 111 0, 828
CAAN5342 .A2 в 0, 005 0, 019
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) 0, 031 0, 112
1006_ll_C3_1601 В (T/F) 0, 002 0, 006
1054_07_TC4_1499 В (T/F) 0, 048 0,222
1056_1O_TA11_1826 В (T/F) 0, 038 0,168
1012_ll_TC21_3257 В (T/F) 0, 011 0, 047
6240_08_TA5_4622 В (T/F) 0, 038 0, 131
6244_13_B5_4576 В (T/F) 0, 091 0,380
- 49 042959
62357_14_D3_4589 В (T/F) >10 >10
SC05_8Cll_2344 В (T/F) 0, 017 0, 048
Dul56.12 C 0, 010 0, 036
Dul72.17 C 0, 049 0, 194
Du422.1 C 0, 047 0, 113
ZM197M.PB7 C >10 >10
ZM214M.PL15 C 0,415 2,970
ZM233M.PB6 C 0, 058 0,371
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C >10 >10
ZM109F.PB4 C >10 >10
ZM135M.PL10a C 0, 061 0,263
CAP45.2.00.G3 C >10 >10
CAP210.2.00.E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 035 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C >10 >10
HIV-16845-2.22 C 0,727 3, 930
CelO86_B2 C (T/F) >10 >10
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 070
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 019 0, 083
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F CIG C (T/F) 0, 035 0, 119
249M BIO C (T/F) >10 >10
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 042 0, 146
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 009 0, 019
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 031 0, 093
- 50 042959
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 084 0,395
CNE19 BC 0, 075 >10
CNE2 0 BC 0, 002 0, 005
CNE21 BC 0, 047 0, 124
CNE17 BC 1,180 4,853
CNE3 0 BC 0,261 0, 678
CNE52 BC 1,991 9,763
CNE53 BC 0, 013 0, 058
CNE58 BC 0,165 0,476
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 015
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A >10 >10
Q842.dl2 A >10 >10
3415.vl.cl A >10 >10
3365.v2.c2 A 0, 057 0,200
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 026 0, 108
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 012 0, 032
T257-31 CRF02_AG >10 >10
928-28 CRF02_AG 0, 616 2,396
263-8 CRF02_AG 0,416 5,714
T250-4 CRF02_AG 0, 002 0, 005
T251-18 CRF02_AG 0,399 2,292
T278-50 CRF02_AG 1,713 >10
T255-34 CRF02_AG >10 >10
211-9 CRF02_AG 0, 065 0,403
235-47 CRF02_AG 0, 058 0,224
620345.cOl CRF01_AE >10 >10
- 51 042959
CNE8 CRF01_AE >10 >10
С1080.С03 CRF01_AE >10 >10
R2184.с04 CRF01_AE >10 >10
R1166.C01 CRF01_AE >10 >10
R32 65.сО 6 CRF01_AE >10 >10
С2101.сО1 CRF01_AE >10 >10
С3347.С11 CRF01_AE >10 >10
С4118.с09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJOX009000.02.4 CRF01_AE >10 >10
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJ0XO1OOOO.06.2 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
Х1193_с1 G 0, 070 0,207
Р0402_с2_11 G 0, 008 0, 024
Х1254_сЗ G 0, 063 0,239
Х2088_с9 G 0, 003 0, 010
Х2131_С1_В5 G 0, 014 0, 056
Р1981_С5_3 G 0, 004 0, 013
X1632_S2_B10 G >10 >10
3016.v5.с45 D >10 >10
А07412М1.vrcl2 D 0, 011 0, 037
231965.cOl D >10 >10
231966.с02 D >10 >10
191821_Е6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.с59 CD 0,706 4,492
6480.v4.c25 CD 0, 006 0, 023
6952.vl.с20 CD 0, 023 0, 086
6811.v7.с18 CD 0, 003 0, 009
89-Fl_2_25 CD >10 >10
3301.vl.с24 AC 0, 018 0, 049
6041.v3.c23 AC >10 >10
6540.v4 . cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 ACD 0, 043 0, 197
3103.v3.cl0 ACD 0, 024 0, 061
Таблица 9. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе для 10-1074.
- 52 042959
PGT121
ID вируса Группа 1С5О ICso
6535.3 В 0, 003 0, 010
QH0692.42 В 0,498 8,507
SC422661.8 В 0, 079 0,373
PVO. 4 в 0, 094 0,450
TRO.11 в 0, ОН 0, 037
AGIO.0.29 в 0, 019 0, 060
RHPA4259.7 в 0, 013 0, 046
THRO4156.18 в >10 >10
REJO4541.67 в >10 >10
TRJO4551.58 в 0, 802 >10
WITO4160.33 в 0,301 3,200
CAAN5342.A2 в 0, 008 0, 026
WEAU_dl5_410_787 В (T/F) 0, 017 0, 062
1006_ll_C3_1601 В (T/F) 0, 002 0, 008
1054_07_TC4_1499 В (T/F) 0, 041 0,299
1056_1O_TA11_1826 В (T/F) 0, 034 0, 148
1012_H_TC21_3257 В (T/F) 0, 008 0, 034
6240_08_TA5_4622 В (T/F) 0, 068 0,231
6244_13_B5_4576 В (T/F) 0, 172 1,471
62357_14_D3_4589 В (T/F) 6,215 >10
SC05_8CH_2344 В (T/F) 0, 030 0, 108
- 53 042959
Dul56.12 C 0, 006 0, 019
Dul72.17 C 0, 062 0,531
Du422.1 C 0, 017 0, 088
ZM197M.PB7 C >10 >10
ZM214M.PL15 C 0,288 2,456
ZM233M.PB6 C 2,809 >10
ZM249M.PL1 C >10 >10
ZM53M.PB12 C 0, 001 0, 005
ZM109F.PB4 C 8,924 >10
ZM135M.PL10a C 0,730 5, 727
CAP45.2.00.G3 C 1,300 >10
CAP210.2.00 .E8 C >10 >10
HIV-001428-2.42 C 0, 020 0, 126
HIV-0013095-2.11 C >10 >10
HIV-16055-2.3 C 0,772 7,986
HIV-16845-2.22 C 8,512 >10
CelO86_B2 C (T/F) 0, 003 0, 016
CeO393_C3 C (T/F) >10 >10
Cell76_A3 C (T/F) 0, 022 0, 063
Ce2010_F5 C (T/F) >10 >10
CeO682_E4 C (T/F) >10 >10
Cell72_Hl C (T/F) 0, 007 0, 030
Ce2060_G9 C (T/F) >10 >10
Ce703010054_2A2 C (T/F) >10 >10
BF1266.431a C (T/F) >10 >10
246F CIG C (T/F) 0, 082 0,363
249M BIO C (T/F) >10 >10
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 0, 036 0, 123
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 016 0, 042
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 823 6, 227
Ce704809221_1B3 C (T/F) 0, 043 0,285
CNE19 BC 0, 012 0, 083
- 54 042959
CNE2 0 BC 0, 003 0, 006
CNE21 BC 0, 009 0, 031
CNE17 BC 3, 962 >10
CNE3 0 BC 0, 088 0,288
CNE52 BC 4,914 >10
CNE53 BC 0, 014 0, 062
CNE58 BC >10 >10
MS208.Al A >10 >10
Q23.17 A 0, 005 0, 017
Q461.e2 A >10 >10
Q769.d22 A >10 >10
Q259.d2.17 A 3, 071 >10
Q842.dl2 A 0, 010 0, 037
3415.vl.cl A >10 >10
3365.v2.c2 A 0,243 2,133
191955_A11 A (T/F) >10 >10
191084 B7-19 A (T/F) 0, 038 0, 118
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 006 0, 016
T257-31 CRF02_AG >10 >10
928-28 CRF02_AG >10 >10
263-8 CRF02_AG 0, 647 4, 680
T250-4 CRF02_AG 0, 003 0, 009
T251-18 CRF02_AG 5, 183 >10
T278-50 CRF02_AG >10 >10
T255-34 CRF02_AG 2, 631 >10
211-9 CRF02_AG 0,866 6, 631
235-47 CRF02_AG 0,259 1, 601
620345.cOl CRF01_AE >10 >10
CNE8 CRF01_AE >10 >10
C1080.C03 CRF01_AE >10 >10
R2184.c04 CRF01_AE >10 >10
- 55 042959
R1166.C01 CRF01_AE >10 >10
R3265.C06 CRF01_AE >10 >10
С2101.с01 CRF01_AE >10 >10
С3347.С11 CRF01_AE >10 >10
С4118.с09 CRF01_AE >10 >10
CNE5 CRF01_AE >10 >10
BJOX009000.02.4 CRF01_AE 9, 001 >10
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >10 >10
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >10 >10
Х1193_с1 G 0, 022 0, 088
Р0402_с2_11 G 0, 007 0, 022
Х1254_сЗ G 0, 029 0, 085
Х2088_с9 G 0, 007 0, 022
Х2131_С1_В5 G 0, 011 0, 037
Р1981_С5_3 G 0, 002 0, 009
X1632_S2_B10 G >10 >10
3016.v5.c45 D >10 >10
А07412М1.vrcl2 D 0, 034 0,255
231965.c01 D >10 >10
231966.с02 D >10 >10
191821_Е6_1 D (T/F) >10 >10
3817.v2.с59 CD >10 >10
6480.v4.c25 CD 0, 008 0, 029
6952. vl.с20 CD 0, 049 0,348
6811.v7.с18 CD 0, 002 0, 007
89-Fl_2_25 CD >10 >10
3301.vl.c24 AC 0, 013 0, 041
6041.v3.c23 AC >10 >10
654 0.v4. cl AC >10 >10
6545.v4.cl AC >10 >10
0815.v3.c3 ACD 0, 017 0, 085
3103.v3.cl0 ACD 0, 024 0, 073
Таблица 10. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе для PGT121.
- 56 042959
Титры в клетках TZM.bl (мкг/мл)
NC37+BG1+BG18
ID вируса Группа 1С50 !С8о
6535.3 В 0, 006 0, 030
QH0692.42 В 0, 033 0, 130
SC422661.8 В 0, 024 0, 089
PVO. 4 В 0, 012 0, 050
TRO.11 в 0, 004 0, 015
АСЮ. 0.2 9 в 0, 006 0, 016
RHPA4259.7 в 0,210 1, 669
THRO4156.18 в >50 >50
REJO4541.67 в 0, 199 0, 696
TRJO4551.58 в 0, 938 7,063
WITO4160.33 в 0, 021 0, 075
CAAN5342 .А2 в 0, 036 0,162
YU2.DG в 0, 052 0, 147
WEAU_dl5_410_787 в (T/F) 0, 022 0, 074
1006_11_СЗ_1601 В (T/F) 0, 005 0, 013
1054_07_ТС4_1499 В (T/F) 0, 022 0, 122
1056_10_ТА11_1826 В (T/F) 0, 031 0,266
1012_11_ТС21_3257 В (T/F) 0, 012 0, 055
6240_08_ТА5_4622 В (T/F) 0, 009 0, 028
6244_13_В5_4576 В (T/F) 0, 045 0,216
62357_14_D3_4589 В (T/F) 0, 840 5, 585
SC05_8Cll_2344 В (T/F) 0, 045 0, 083
Dul56.12 С 0, 018 0, 050
Dul72.17 С >50 >50
- 57 042959
Du422.1 C 0, 076 0,347
ZM197M.PB7 C 4,123 >50
ZM214M.PL15 C >50 >50
ZM233M.PB6 C 7,814 >50
ZM249M.PL1 C 2,916 17,336
ZM53M.PB12 C >50 >50
ZM109F.PB4 C >50 >50
ZM135M.PL10a C 6, 018 31,451
CAP45.2.00.G3 C 0,251 1,097
CAP210.2.00.E8 C 19,144 >50
HIV-001428-2.42 C 0, 029 0, 075
HIV-0013095-2.11 C 31,333 >50
HIV-16055-2.3 C 12,372 43,320
HIV-16845-2.22 C 0, 092 0,316
CelO86_B2 C (T/F) 2,088 13,998
CeO393_C3 C (T/F) >50 >50
Cell76_A3 C (T/F) 0, 013 0, 030
Ce2010_F5 C (T/F) >50 >50
CeO682_E4 C (T/F) >50 >50
Cell72_Hl C (T/F) 0, 017 0, 047
Ce2060_G9 C (T/F) >50 >50
Ce703010054_2A2 C (T/F) >50 >50
BF1266.431a C (T/F) 45,589 >50
246F CIG C (T/F) 0, 172 1,220
249M BIO C (T/F) 4,422 17,159
ZM247vl(Rev-) C (T/F) 6,417 >50
7030102001E5(Rev-) C (T/F) 0, 011 0, 035
1394C9G1(Rev-) C (T/F) 0, 078 1,405
Ce704809221_1B3 C (T/F) 10,937 >50
CNE19 BC 1,576 17,656
CNE2 0 BC 0, 008 0, 024
CNE21 BC 0, 009 0, 022
CNE17 BC 0, 195 0,709
CNE3 0 BC 0, 067 0, 183
- 58 042959
CNE52 BC 0, 077 0, 199
CNE53 BC 0, 015 0, 036
CNE58 BC 0, 055 0,206
MS208.Al A 2,393 17,933
Q23.17 A 0, 009 0, 024
Q461.e2 A >50 >50
Q769.d22 A 0,364 2,151
Q259.d2.17 A >50 >50
Q842.dl2 A 0,405 1,371
0260.v5.c36 A 0, 018 0, 055
3415.vl. cl A 0, 039 0, 187
3365.v2.c2 A 0, 020 0, 049
191955_AH A (T/F) 0, 830 4,335
191084 B7-19 A (T/F) 0, 029 0, 071
9004SS_A3_4 A (T/F) 0, 027 0, 090
T257-31 CRF02_AG >50 >50
928-28 CRF02_AG 1,919 7,522
263-8 CRF02_AG 0,544 3,759
T250-4 CRF02_AG 0, 005 0, 029
T251-18 CRF02_AG 0, 133 0, 639
T278-50 CRF02_AG 9, 069 44,006
T255-34 CRF02_AG 37,020 >50
211-9 CRF02_AG 1,976 18,953
235-47 CRF02_AG 0, 013 0, 046
620345.cOl CRF01_AE 1,325 8,233
CNE8 CRF01_AE >50 >50
C1080.C03 CRF01_AE 0, 012 0, 042
R2184.c04 CRF01_AE 0, 084 0,376
RH66.c01 CRF01_AE >50 >50
C2101.cOl CRF01_AE >50 >50
C3347.C11 CRF01_AE >50 >50
C4118.c09 CRF01_AE >50 >50
CNE5 CRF01_AE 1,465 6, 578
BJOX009000.02.4 CRF01_AE >50 >50
- 59 042959
BJOX015000.11.5 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJOX010000.06.2 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJOX025000.01.1 CRF01_AE (T/F) >50 >50
BJOX028000.10.3 CRF01_AE (T/F) >50 >50
Х1193_с1 G 0, 036 0, 130
Р0402_с2_11 G 0, 023 0, 088
Х1254_сЗ G 0, 016 0, 038
Х2088_с9 G 0, 007 0, 021
Х2131_С1_В5 G 0, 016 0, 036
Р1981_С5_3 G 0, 022 0, 063
X1632_S2_B10 G 0,275 0, 986
3016.v5.с45 D 8,359 >50
А07412М1.vrcl2 D 0, 189 2,455
231965.c01 D >50 >50
231966.с02 D >50 >50
191821_Е6_1 D (T/F) >50 >50
3817.v2.с59 CD 0,582 2, 883
6480.v4.c25 CD 0, 108 0, 476
6952.vl.с20 CD 0, 011 0, 027
6811.v7.с18 CD 0, 009 0, 035
89-Fl_2_25 CD 5, 379 >50
3301.vl.с24 AC 0, 074 0,260
6041.v3.c23 AC 0, 085 0,233
654 0.v4. cl AC >50 >50
6545.v4.cl AC >50 >50
0815.v3.c3 ACD 0, 071 0, 321
3103.v3.cl0 ACD 0, 009 0, 017
Таблица 11. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе для комбинации 1:1:1 NC37, BG1 и BG18 к панели из 118 вирусов.
BG18.
На уровне аминокислот BG18 на 63 и 62% идентичен тяжелым цепям 10-1074 и PGT121, соответственно, оба из которых происходят из предшественника зародышевой линии VH4-59. BG18 происходит из близкородственного (90,8% идентичности) гена зародышевой линии VH4-4 (фиг. 6А). Выравнивание определяющих комплементарность областей (CDR) тяжелых цепей PGT121, 10-1074 и BG18 и их клональных вариантов, показало высокую степень идентичности между CDRH1 и CDRH2. CDRH3 BG18 на три остатка короче, чем у PGT121/10-1074 (21 против 24 остатков; фиг. 2А и фиг. 6В). Кроме того, BG18 имеет 6 из 7 мутаций в каркасных областях, которые являются общими для семейства PGT121 (фиг. 2А), но в отличие от членов PGT121/10-1074 не содержит никаких вставок или делеций.
BG18 содержит сегмент VL2-25 гена VL и на уровне аминокислотной последовательности имеет только 46 и 50% идентичности с сегментом VL3-21 гена, содержащимся в PGT121 и 10-1074, соответственно (фиг. 2В, фиг. 6С и фиг. 6D). Кроме того, легкие цепи BG18 и его вариантов имеют немного больше мутаций по сравнению с 10-1074 и PGT121, но, как и тяжелые цепи, не содержат никаких вставок или делеций. Таким образом, BG18 и его клональные варианты имеют тяжелые цепи, аналогичные таковым у ранее выделенных антител класса PGT121/10-1074, но отличающиеся легкие цепи.
Кристаллическая структура Fab BG18 с разрешением 1,3 А показала, что петли CDR образуют компактный связывающий участок, за исключением CDRH3, который выступает на ~11 А за пределы других CDR в виде вершины, состоящей преимущественно из гидрофобных остатков (фиг. 2С). Вместо того, чтобы полностью развернуться, CDRH3 снова сворачивается в конформацию, стабилизированную водородными связями между остатками Gly100aHC, Val100bHC, Val100cHC, Gly100eHC и Glu100fHC в CDRH3 (фиг. 2С). CDRL2 имеет неупорядоченную структуру, что позволяет предположить, что он может принимать множественные конформации в несвязанном антителе. Наложение несвязанных структур BG18, PGT121 (PDB 4FQ1) и 10-1074 Fab (PDB 4FQ2) показало, что согласно результатам выравнивания их домены VH являются в высокой степени идентичными, за исключением CDRH3, который расположен над доменом VH в BG18, но заметно наклоняется над VL в структурах Fab PGT121 и 10-1074 (фиг. 2D). В
- 60 042959 соответствии с низкими уровнями идентичностей последовательностей легких цепей BG18 и PGT121 (фиг. 2В, фиг. 6С и фиг. 6D), выровненные домены VL (среднеквадратичные отклонения 3,1 А были найдены при совмещении атомов 93 или 92 Са при сравнении легких цепей в суперпозициях BG18-PGT121 и BG18-10-1074, соответственно) показали различия в ориентациях всех петель CDRL (фиг. 2D). Несмотря на эти различия, щель между CDRH2 и CDRH3 в PGT121 и 10-1074 также видна в BG18 (фиг. 2Е). Остатки, выстилающие эту щель, взаимодействуют с N-гликаном комплексного типа в гликозилированной структуре Fab PGT121 и взаимодействуют с N-гликаном, присоединенным к Asn137gp12o в структуре комплекса PGT122-BG505 SOSIP (PDB 4TVP). У BG18 наблюдается вторая щель между CDRH3 и CDRL1/CDRL3, которая не может быть образована у PGT121 и его клональных родственниках из-за расположения CDRH3 в этих антителах над легкой цепью (фиг. 2Е). В дополнение к этим структурным различиям электростатический поверхностный потенциал доменов VH-VL BG18 показывает другое распределение положительно заряженных участков по сравнению с поверхностными потенциалами у PGT121 и 10-1074 (фиг. 7). В сумме, эти результаты согласуются с различиями в распознавании Env антителом BG18 по сравнению с распознаванием РGТ121-родственными bNAb.
Для изучения того, как BG18 распознает Env, была создана структура, с разрешением ~25 А, единичной частицы тримера BG505 SOSIP.664 в комплексе с Fabs из BG18 и CD4bs bNAb 179NC75 с помощью электронной микроскопии (ЭМ) после негативного окрашивания. Вписывание координат из кристаллической структуры FG BG18 в ЭМ карту (фиг. 2F) позволило сравнить углы сближения и потенциальные Env-взаимодействия BG18 и других Asn332gp120-V3 bNAb (фиг. 2G). Аналогично PGT122 (вариант PGT121) и 10-1074, CDRH3 BG18, по прогнозам, взаимодействует с гликаном Asn332gpl20 и мотивом 324GDIR327 gp120. Однако в то время как PGT122 и 10-1074 демонстрируют сходные углы сближения при связывании с Env, BG18 связывается с тримером Env под другим углом, смещенным на 34-41° относительно PGT122 и PGT124 (фиг. 2G).
BG18 оценивали на нейтрализацию относительно панели псевдовирусов ВИЧ-1 с делециями специфических N-связанных сайтов гликозилирования. Результаты показали, что ни один из гликанов у основания петли V3, за исключением Asn332gp120, не оказывает влияния на нейтрализующую активность (табл. 12). В соответствии с этими данными BG18 связывается преимущественно с синтетическими гликопептидами V3, содержащими олигоманнозные N-гликаны в положении Asn332gp120, а не с гликопептидами, содержащими N-гликаны комплексного типа, присоединенные к этому положению, или с другими потенциальными N-связанными сайтами гликозилирования в gp120 (фиг. 9). Эти данные предполагают, что свойства распознавания у BG18 более сходны с 10-1074, чем с PGT121.
- 61 042959
BG8 BG18 PGT121 12А12
BG505 (T332N) 0, 007 0, 001 0, 012 0, 030
N137A 0, 003 0, 001 0, 002 0, 027
N15 6A 0, 008 0, 001 0, 007 0, 024
N2 95A 0, 009 0, 001 0, 014 0, 044
N3 01A 0, 004 0, 001 0, он 0, 027
N33 9A 0, 007 0, 001 0, 016 ND
N3 8 6A 0, 004 0, 001 0, 015 0, 030
N392A 0, 005 0, 001 0, 006 0, 012
BG8 BG18 PGT121 12 Al 2
JR-CSF 0, 009 0, 001 0, он 0,233
N2 95A 0, 006 0, 001 0, 016 0,203
N3 01A 0, 006 0, 001 0, он 0, 010
N332A > 50 > 50 > 50 0,240
N33 9A 0, 010 0, 001 0, 007 0, 028
N362A 0, 008 0, 001 0, 018 0,267
N3 8 6A 0, 012 0, 001 0, 024 0,332
N392A 0, 014 0, 002 0, 017 0,230
G324A 0, 005 0, 001 0, 044 0,236
D325A 0, 005 0, 001 0, 079 0,203
I326A 0, 005 0, 001 0, 024 0,278
R327A 0, 005 0, 001 0, 018 0, 131
Q328A 0, 023 0, 001 0, 057 0, 038
НЗЗОА 0, 050 0, 001 0, 017 0,288
BG8 BG18 PGT121 12 Al 2
92BR020 0, 015 0, 001 0, 004 0, 050
N13 6A 0, 005 0, 001 0, 002 0, 027
N15 6A 0, ОН 0, 001 0, 003 0, 035
N3 01A 0, 009 0, 001 0, 003 0, ОН
N332A > 50 > 50 0, 080 0, 039
N3 8 6A 0, 012 0, 003 0, 006 0, 055
N392A 0, 023 0, 001 0, 007 0, 105
D325A 0, 006 0, 001 0, 006 0, 050
I326A 0, 006 0, 001 0, 002 0, ОН
R327A 0, ОН 0, 001 0, 001 0, 022
Q328A 0, 018 0, 001 0, 002 0, 028
НЗЗОА 0, 018 0, 001 0, 003 0, 073
N136A+N332A > 50 > 50 > 1 0, 025
N156A+N332A > 50 > 50 > 1 0, 023
N301A+N332A > 50 > 50 > 1 0, 007
N13 6A+N15 6A+N3 01А 0, 001 0, 001 0, 001 0, 013
Таблица 12. Значения IC50 и IC80 в TZM-bl анализе BG18, BG8 PGT121 и контрольного mAb 12A12 по отношению к выбранным мутантам оболочки V3.
NC37.
Кристаллическая структура Fab NC37 (фиг. 1С) с разрешением 2,7 А, связанного с кором gp120, подтвердила, что NC37 распознает CD4bs (фиг. 8А и 8В). Исходя только из последовательности, сначала было трудно определить, был ли VH NC37 получен из гена зародышевой линии VH1-2 или VH1-46, потому что некоторые члены семейства NC37 были выровнены относительно VH1-2, в то время как другие были выровнены относительно VH1-46 (табл. 13). Однако сравнение структур показало, что NC37 принимает ту же ориентацию и угол связывания, что и антитела 8ANC131/134, полученные из VH1-46 (фиг.
- 62 042959
8А и 8В). Как следствие, для связывания с остатком Asn280gp120 петли D у NC37 задействована легкая цепь, тогда как в антителах, полученных из VH1-2, таких как NIH45-46, для связывания с Asn280gp120 используются тяжелые цепи. CDRH3 NC37 простирается в направлении внутреннего домена gp120, образуя контакты между остатком Tyr100GHC в CDRH3 и остатками Lys97gp120 и Glu102gp120 внутреннего домена gp120. Наложение комплекса NC37 Fab-gp120 NC37 на структуру тримера SOSIP позволяет предположить, что CDRH3 NC37 связывается с соседним протомером в тримере Env (фиг. 8С).
NC37 был выделен в 2010 году, тогда как BG1 и BG18 были выделены из РВМС, собранных в 2014 году. Доступные РВМС были исследованы в 2010 и 2013 годах с использованием праймеров для ПЦР, специфичных для BG1 и BG18. В то время как транскрипты BG1 были обнаружены в оба момента времени, BG18 был впервые обнаружен в 2013 году. Это указывает на то, что BG18 возник в период между 2010 и 2013 годами, тогда как BG1 и NC37 появились ранее.
Аутологичная нейтрализация.
Для изучения влияния трех bNAb на аутологичные вирусы, отдельные гены env из циркулирующих в плазме вирусов были подвергнуты одногеномному секвенированию (SGS) из пяти разных временных периодов в течение 2006-2015 гг. (2006, 2010, 2013, 2014 и 2015 гг.). Внутри рамки считывания были восстановлены только 37 функциональных транскриптов частично из-за вирусной нагрузки, которая во всех временных точках была ниже 400 копий/мл. Более того, все последовательности, восстановленные с 2015 г, были нефункциональными (фиг. 10). 37 функциональных последовательностей сформировали три кластера - кластер А, содержащий одну последовательность 2006 года, которая отличалась на ~15% от остальных последовательностей, кластер В, самый большой кластер, содержащий последовательности всех четырех временных точек, и кластер С, содержащий 3 последовательности, все 2014 г (фиг. 3А). В период с 2013 по 2014 год наблюдалось увеличение вирусного разнообразия, что согласуется с появлением нового кластера последовательностей в 2014 г (фиг. 3В).
Все три последовательности в кластере С содержали мутации, изменяющие N-связанный сайт гликозилирования в Asn332gp120/ тогда как другие 34 последовательности имели интактный N-связанный сайт гликозилирования в Asn332gp120 (фиг. 3А). Кроме того, все три последовательности в кластере С имели остаток Asp282gp120, который не был обнаружен в других 34 последовательностях. 94,4% всех последовательностей ВИЧ-1 в базе данных Los Alamos в положении 282gp120 содержат Lys, a Asp в этом положении связан с устойчивостью к CD4bs антителам.
Для определения чувствительности функциональных Env к 3 аутологичным bNAb были получены псевдовирусы, которые были протестированы с помощью TZM-bl анализа. Из 35 успешно созданных псевдовирусов только 4 оказались устойчивыми ко всем 3 bNAb. Это были Env из кластера С, обнаруженные в плазме 2014 г, и один из 2013 г (фиг. 3С и фиг. 10). Оставшиеся 31 псевдовирус (88,5% от всех псевдовирусов) оказались чувствительными по меньшей мере к 1 из 3 bNAb. Кроме того, псевдовирусы 2006, 2010 и 2014 годов были протестированы на чувствительность к параллельному сывороточному IgG, выделенному в тот же момент времени, что и вирусные гены env (IgG из плазмы 2013 г не был доступен для этого анализа). Результаты показали, что параллельно выделенный IgG оказывал нейтрализующее действие на 19 из 22 протестированных вирусов (фиг. 2С и фиг. 10).
Вирусы, чувствительные к BG18 и NC37, а также вирусы, чувствительные к конкурентному IgG, были обнаружены во всех проанализированных временных точках, включая временные точки, в которых были выделены BG18 и NC37 (фиг. 3D). Напротив, большинство штаммов, за исключением одного вируса 2006 года, оказались устойчивыми к BG1. Это говорит о том, что большинство аутологичных вирусов у донора ЕВ354 ускользнуло от BG1, но не смогло ускользнуть от антител BG18 и NC37, что указывает на широту спектра действия и эффективность BG18 и NC37.
Хотя получение вирусных последовательностей из образцов плазмы 2015 г оказалось невозможным, оказалось возможным получить вирус из двух из пяти культур CD4+ ЕВ354 для размножения вируса (VOC). Согласно результатам р24 ИФА, в обоих случаях потребовалось более пяти недель для того, чтобы культуры стали положительными в отношении вируса. Последовательности SGS из обеих культур для размножения вируса 2015 г сгруппированы рядом с последовательностями кластера С и не содержат N-связанный сайт гликозилирования в Asn332gp120 (фиг. 3А). Кроме того, все последовательности показали наличие Asp282gp120. В соответствии с этими данными культуральные супернатанты 2015 г были устойчивы ко всем трем bNAb в анализах TZM-bl (фиг. 3Е).
In vivo эффективность BG18, NC37 и BG1.
Для определения, способны ли BG18 или NC37 независимо оказывать селективное давление на ВИЧ-1 in vivo, гуманизированных мышей (hu-мышей) инфицировали ВИЧ-1YU2, и установленную инфекцию лечили. BG1 показал низкую активность против ВИЧ-1YU2 (IC50=15,8 мкг/мл) и поэтому использовался только в последующих экспериментах по комбинированному лечению, а не в экспериментах по монотерапии. Подобно 10-1074, введение BG18 или BG8, менее мощного, но все еще эффективного клонального варианта, было связано с быстрым снижением (в среднем 1,5 log10) вирусной нагрузки с последующей рикошетной виремией (фиг. 4А, фиг. 11 и фиг. 12). Все вирусные последовательности, вызывающие рикошетную реакцию, содержали мутацию, которая изменяла N-связанный сайт гликозилирования в Asn332gp120 (фиг. 4В и 4С). Монотерапия NC37 также временно подавляла виремию, но величина
- 63 042959 снижения вирусной нагрузки была менее выраженной, чем при BG18, в среднем 0,5 log10 (фиг. 4А и фиг. 12). Это указывает на то, что BG18 и NC37 эффективны для лечения ВИЧ, причем BG18 обладает наиболее выраженными эффектами. Большинство последовательностей Env вируса с рикошетной реакцией на NC37 показали мутацию R456K, которая связана с устойчивостью к αнти-CD4bs антителам (фиг. 4В и 4С). Это дополнительно указывает на то, что BG18 и NC37 позволяют отобрать устойчивые к антителам BH4-1yu2 варианты in vivo у hu-мышей.
Комбинации антител могут контролировать инфекцию ВИЧ-1YU2 У hu-мышей. Чтобы определить, может ли комбинация BG18, NC37 и BG1 контролировать виремию, пять ВИЧ-1YU2-инфицированных huмышей обрабатывали комбинацией 1:1:1 трех bNAb (BG18, NC37 и BG1). Вскоре после введения трех bNAb вирусная нагрузка снизилась у всех животных в среднем на 1,74 Log10, и, к удивлению, 4/5 мышей продемонстрировали практически не обнаруживаемую вирусную нагрузку через 3 недели (фиг. 4D и 4Е). Виремия восстановилась только у одной мыши, Т6, и это произошло только через 3 недели после прекращения терапии. Остальные 4 мыши продолжали демонстрировать фактически недетектируемую виремию даже спустя 4 недели после окончания терапии (фиг. 4D и 4Е). Это указывает на то, что независимо от того, применяются ли NC37, BG1 и BG18 по отдельности, но особенно в комбинации, NC37, BG1 и особенно BG18 эффективны для длительного подавления и нейтрализации ВИЧ-1 in vivo.
АНТИТЕЛО БЛИЖАЙ ШИЙ VH БЛИЖАЙ ШИЙ VL СОМАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ В V (nt) % ПОСЛЕ ДОВАТЕ ЛЕНОСТЬ CDRH3
VH VL
NC37 1-2/1- 46 КЗ-20 28.8 27.9 DNFGTRPVPGRGYYYGMDV (SEQ ID NO: 105)
NC133 1-46 КЗ-20 28 23.2 DNRGDRNVPGRGYYYGMDV (SEQ ID NO: 106)
NC102 1-2 КЗ-20 27.1 22.2 DNFGTRPVPGRGYYYGMDV (SEQ ID NO: 107)
АС40 1-46 КЗ-20 33.5 21.1 DNFGE SHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 108)
АС41 1-46 КЗ-20 30.1 21.5 DNFGE SHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 109)
АС72 1-46 КЗ-20 29.8 20.8 DNFGE SHKGYTYGMDA (SEQ ID NO: 110)
BG8 4-4 L3-25 25.4 20.5 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV (SEQ ID NO: 4)
BG18 4-4 L3-25 21.2 17.7 NAIRIYGWALGEWFHYGMDV (SEQ ID NO: 12)
BG33 4-4 L3-25 25 18.4 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV (SEQ ID NO: 28)
BG42 4-4 L3-25 23.7 19.4 NVIRVFGVISLGEWFHYGMDV (SEQ ID NO: 20)
BG1 3-4 9 К1-39 27.2 19.9 EQRNKDYRYGQEGFGYSYGMDV (SEQ ID NO: 76)
BG22 3-4 9 К1-39 26.8 23.4 EQRGGDGRYSGDGFGYPYGMDV (SEQ ID NO: 84)
BG47 3-4 9 К1-39 27.1 22 EQRGANGRYGGDGFGYSYGMDV (SEQ ID NO: 92)
Таблица 13. Нейтрализующие клоны. Генетическая характеристика 13 антител, репрезентативных вариантов от каждого из трех клонов (синий, пурпурный и зеленый), которые проявили нейтрализующую активность. Указаны VH, VL и уровень мутаций, а также последовательность CDRH3 (согласно IMGT).
Приведенные выше примеры и описание предпочтительных вариантов осуществления следует рассматривать как иллюстрацию, а не как ограничение настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Следует понимать, что многочисленные варианты и комбинации изложенных выше при- 64 042959 знаков могут использоваться без отклонения от настоящего изобретения, изложенного в формуле изобретения. Такие изменения не рассматриваются как отступление от объема изобретения, и все такие варианты включены в объем приведенной ниже формулы изобретения. Все ссылки, цитируемые в настоящем описании, включены во всей их полноте в виде ссылки.

Claims (20)

1. Выделенное анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающая часть, содержащие:
i) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 10-12, и ii) вариабельную область легкой цепи, которая содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRL1, CDRL2 и CDRL3 содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 14-16.
2. Выделенное анти-ВИЧ-1 антитело по п.1 или его антигенсвязывающая часть, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 9 и 13.
3. Выделенное анти-ВИЧ-1 антитело по любому из пп.1, 2 или его антигенсвязывающая часть, где антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.
4. Выделенное анти-ВИЧ-1 антитело по любому из пп.1-3 или его антигенсвязывающая часть, где антитело или его антигенсвязывающая часть получены рекомбинантным методом.
5. Биспецифическое антитело, содержащее выделенное анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-4.
6. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую анти-ВИЧ-1 антитело по любому из пп.1-4 или его антигенсвязывающую часть.
7. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую биспецифическое антитело по п.5 или его антигенсвязывающую часть.
8. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6 или 7.
9. Культивируемая клетка, содержащая вектор по п.8.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая (i) анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-5 или биспецифическое антитело по п.5 и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, где CDRH1, CDRH2, CDRH3, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 анти-ВИЧ-1 антитела содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 10-12 и 14-16.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи анти-ВИЧ-1 антитела содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 9 и 13.
13. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая второе анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть.
14. Способ лечения инфекции ВИЧ-1, включающий идентификацию субъекта, нуждающегося в этом, и введение указанному субъекту терапевтического агента, содержащего терапевтически эффективное количество анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающего антитела по любому из пп.1-4 или биспецифического антитела по п.5 или фармацевтической композиции по любому из пп.10-13.
15. Способ по п.14, дополнительно включающий введение второго терапевтического агента.
16. Способ по п.15, в котором второй терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, ингибитора протеазы, ингибитора проникновения или слияния, ингибитора интегразы и второго анти-ВИЧ-1 антитела или его антигенсвязывающей части.
17. Вакцинная композиция, содержащая анти-ВИЧ-1 антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-4 или биспецифическое антитело по п.5.
18. Вакцинная композиция по п.17, где CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антиВИЧ-1 антитела содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 10-12 и 14-16.
19. Вакцинная композиция по п.18, в которой вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 9 и 13.
20. Способ профилактики инфекции ВИЧ-1 у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту вакцинной композиции по любому из пп.17-19.
EA201991591 2016-12-27 2017-12-22 Нейтрализирующие анти-вич-1 антитела широкого спектра действия и способы их применения EA042959B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/439,339 2016-12-27
US62/444,946 2017-01-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA042959B1 true EA042959B1 (ru) 2023-04-10

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7460091B2 (ja) 広域中和抗ｈｉｖ－１抗体およびその使用方法
US20230060304A1 (en) Neutralizing antibodies to gp120 and their use
JP7080213B2 (ja) 新規抗ｐｄ－ｌ１抗体
JP2022115946A (ja) 広域中和抗ｈｉｖ抗体
US20230348584A1 (en) Use of anti-fam19a5 antibodies for treating cancers
EP4011911A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
US20230042258A1 (en) Anti-il-27 antibodies and uses thereof
JP2020502042A (ja) Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
US20220259299A1 (en) Anti-il-27 antibodies and uses thereof
IL292757A (en) Tigit antibodies and their uses
WO2022065445A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体又はその断片
US20230272048A1 (en) Hiv-1 antibodies
US20240109956A1 (en) Rapid elicitation of broadly neutralizing bovine antibodies to hiv env
US20220372148A1 (en) A pharmaceutical composition for treating hematological cancer
WO2020143749A1 (zh) 重组抗人pd-1抗体及其应用
EA042959B1 (ru) Нейтрализирующие анти-вич-1 антитела широкого спектра действия и способы их применения
IL300355A (en) Broadly neutralizing antibodies against HIV, their methods and uses
US20220389089A1 (en) Anti-il-27 antibodies and uses thereof
CN118076635A (zh) 抗il-27抗体和其用途