CN113817031B - 一种分离的抗原表位多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的抗原表位多肽，所述抗原表位多肽包含SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列或其变体，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或变体，或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明的抗原表位多肽可特异性结合西尼罗河病毒抗体，利用该性质，可开发检测西尼罗河病毒抗体的试剂盒以及预防西尼罗河病毒感染的疫苗。

Description

一种分离的抗原表位多肽
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种分离的抗原表位多肽。
背景技术
西尼罗河病毒(West Nile Virus，WNV)感染可引起西尼罗河热、西尼罗河病毒性脑炎和脑膜炎，是一种人畜共患、自然疫源性、急性传染病。自1999年WNV在美国纽约爆发以来，该病毒已经迅速传播到世界多个国家和地区，成为严重威胁人类健康的病毒性疾病，引起了全球公共卫生界的关注。WNV可以感染多种蚊虫和鸟类，并通过蚊虫和鸟类的交替感染将病毒沿着鸟类迁徙的路径进行传播；蚊虫还可以通过叮咬被WNV感染的鸟类将WNV传染给多种哺乳动物，如人类、马、狗、猫和家禽如鸡、鹅等；该病毒还可以通过输血、器官移植、哺乳及胎盘垂直传播。截至目前全球已有两万多人感染WNV，发病率在20％以上，与以前的WNV感染相比，重症病例明显增加，死亡率上升为5-15％。
表位是存在于抗原表面的，决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团，又称为抗原决定簇。抗原是通过表位与相应淋巴细胞表面的受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答。单个抗原分子可具有一种或多种不同的表位，每种表位只有一种抗原特异性。因此，表位是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的基础，一般包含5～7个氨基酸和单糖残基的大小，至多不超过20个氨基酸残基。
开发抗原表位多肽有利于制备检测西尼罗河病毒抗体的产品，例如将鉴定的表位合成多肽，单独或混合包被ELISA板，可用于病毒抗体的检测。这些抗原表位可以用于设计基因工程疫苗，或用于西尼罗河病毒及西尼罗河病毒抗体的检测。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离的抗原表位多肽，所述抗原表位多肽包含西尼罗河病毒E蛋白的多肽片段或其变体。
进一步，所述抗原表位多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其变体，SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列或变体，或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID NO.1的变体包括以下任一项：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第1位被替换；
2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第3位被替换；
3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第5位被替换。
优选地，SEQ ID NO.1的变体包括以下任一项：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第1位被替换A；
2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第3位被替换A；
3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第5位被替换A。
优选地，SEQ ID NO.3的变体包括以下任一项：
1)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第1位被替换；
2)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第2位被替换；
3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第6位被替换；
优选地，SEQ ID NO.3的变体包括以下任一项：
1)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第1位被替换A；
2)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第2位被替换A；
3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第6位被替换A。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种抗原多肽，所述抗原多肽包括前面所述的抗原表位多肽的变体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种复合物，所述复合物包括前面所述的抗原表位多肽或前面所述的抗原多肽。
进一步，所述复合物还包括载体，所述载体通过偶联、缀合或融合的方式与所述抗原表位多肽形成复合物。
优选地，所述偶联包括MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法、亚胺酸脂法。
优选地，所述载体包括蛋白、毒素或脂类。
优选地，所述蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白。
优选地，所述复合物为融合蛋白。
在本发明的具体实施方案中，所述复合物是前面所述的抗原表位多肽或前面所述的抗原多肽与Fc的N端连接形成的融合蛋白。
具体地，前面所述的抗原表位多肽或前面所述的抗原多肽与Fc的N端之间由GGGGS连接。
用于本发明的Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒展示前面所述的抗原表位多肽、抗原多肽或前面所述的复合物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了分离的核酸分子或包含其的核酸载体，其包含编码前面所述的抗原表位多肽、抗原多肽或前面所述的复合物的核酸序列。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含前面所述的核酸分子或包含其的核酸载体。
本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
可用于本发明的宿主细胞为原核细胞。更优选地，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。在一个相关实施方案中，宿主细胞为真核细胞。优选地，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞)、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS；或为真菌细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；或为昆虫细胞如Sf9。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性结合前面所述的抗原表位多肽、前面所述的复合物。
可以通过本领域常规的方法将所述载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。
可以使用本领域常用的方法从宿主细胞中分离和纯化本发明的抗原表位肽。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化表位肽。对于分离纯化所得的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。
本发明还提供了一种产品，所述产品包括抗体、组合物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性结合前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽、前面所述的复合物；优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括以下任一项：
1)药物组合物，其包含前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽、前面所述的复合物、前面所述的类病毒颗粒、前面所述的核酸分子或包含其的核酸载体、前面所述的抗体。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物是疫苗。
2)检测组合物，其包含前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽、前面所述的复合物、前面所述的抗体；优选地，所述检测组合物还包含可检测部分。
可检测部分包括例如标记或标记物。一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。成像剂包括放射性同位素，造影剂包括碘、钆或氧化铁。酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。一些实施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。一些实施方案中，标记包含Alexa
Figure BDA0003296074730000053
标记，诸如Alex
Figure BDA0003296074730000052
680或Alexa
Figure BDA0003296074730000051
750。一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或一种或多种半抗原。
如本文所用，术语“标记”是指并入可检测标记物，例如，通过并入放射性标记的氨基酸或与可通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分的多肽连接。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的且可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂连接以减少潜在的空间位阻。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种非诊断目的的检测抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体的方法，所述方法包括使用前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)获取含有抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体的样本；
2)将前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物与步骤1)的样本接触；
3)检测抗原抗体反应；
优选地，所述抗体包括如下序列：重链可变区的CDR序列分别如SEQ ID NO.19-21所示；轻链可变区的CDR序列分别如SEQ ID NO.22-24所示。
优选地，所述抗体包括如下序列：重链可变区序列如SEQ ID NO.25所示；轻链可变区序列如SEQ ID NO.26所示。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种应用，所述应用包括以下任一项：
1)前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物在作为免疫抗原中的应用；
2)前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物在制备抗体中的应用；
3)前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面述的复合物在制备预防西尼罗河病毒感染的疫苗中的应用；
4)前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物在制备检测抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体中的应用；
5)前面所述的抗原表位多肽、前面所述的抗原多肽或前面所述的复合物在制备治疗西尼罗河病毒感染的药物中的应用；
6)前面所述的类病毒颗粒、前面所述的核酸分子或包含其的核酸载体在制备预防西尼罗河病毒感染的疫苗中的应用；
7)前面所述的类病毒颗粒、前面所述的核酸分子或包含其的核酸载体在制备治疗西尼罗河病毒感染的药物中的应用。
在本申请中，术语“抗原表位多肽”指任何能够被特异性的抗体所识别的多肽片段。在具体的实施方式中，所述“抗原表位多肽”的长度可以是4-25个氨基酸，例如9-25个氨基酸、9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。
在本申请中“特异性结合”指的是，两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到的或者即使可以检测到，也是很弱的。
在本发明中，可用于西尼罗河病毒感染检测的方法包括但不限于，例如酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法、免疫组织化学检测法及类似的检测方法。
合适的药学上可接受的载体包括，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。药学上可接受的载体可进一步包括能提高多肽、抗体或核酸分子的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。
本发明的复合物或药物组合物的施用方式包括但不限于传统的施用途径，例如静脉滴注、肌肉注射、阴道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径等。特别地，所述施用形式是注射或输液形式。
本发明的复合物或药物组合物可以各种形式存在，包括但不限于例如，固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。优选的形式根据具体的施用方式及其预防、治疗或诊断应用而定。
适合肠胃外途径注射的本发明的药物组合物可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，或者可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸，如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性，如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。
本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如对羟苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇、苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。
本发明的抗原表位肽而成的疫苗可使用本领域公知的方法制备。例如，作为该疫苗，有含有本发明的抗原表位肽作为有效成分的注射剂或固体剂等。抗原表位肽可以中性或盐的形态配方，例如作为药学上可容许的盐，可列举盐酸、磷酸等无机盐、或乙酸、酒石酸等有机酸。此外，视需要也可以添加白蛋白、湿润剂、乳化剂等辅助剂。
本发明的疫苗是以治疗上有效的量进行投予。投予量取决于治疗对象、免疫系统，必要的投予量依临床医师的判断决定。另外，投予间隔可依对象、目的来设定。
本发明所述的抗原表位多肽、抗体或药物组合物可以与其它抗病毒试剂相结合而用于预防和/或治疗西尼罗河病毒感染及与之相关的疾病。本发明所述的抗原表位多肽、抗体或药物组合物可以和其它抗病毒试剂同时、分开或连续施用。其它抗病毒试剂包括但不限于，例如利巴韦林、金刚烷、羧基脲、IL-2、IL-12和五羧链胞酸。
附图说明
图1显示抗原表位肽-Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图2显示抗原表位肽-Fc融合蛋白与抗体结合特异性检测结果图，其中，A：抗原表位肽1-Fc；B：抗原表位肽2-Fc；C：抗原表位肽3-Fc；
图3显示WNV EDIII突变体-Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中A：多点突变；B：单点突变1/2/3/4/6/8/9；C：单点突变5/7/10；
图4显示WNV EDIII突变体-Fc融合蛋白与抗体结合特异性检测结果图，其中，A：多点突变；B：单点突变；
图5显示表位竞争实验的结果图，其中A：多点突变；B：单点突变；
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1抗原表位肽融合蛋白制备与功能检测
一、抗原表位肽融合蛋白制备
1、方法
1.1制备融合蛋白表达载体
抗原表位肽1：QYTGTD(SEQ ID NO.1)
抗原表位肽1-Fc
抗原表位肽2：HGTVVLELQYTGTDGPCKVP(SEQ ID NO.2)
抗原表位肽2-Fc
抗原表位肽3：TYGVCSKAF(SEQ ID NO.3)
抗原表位肽3-Fc
WNV EDIII：(SEQ ID NO.4)
WNV EDIII-Fc
方法：利用PCR方法overlap扩增抗原表位肽和Fc融合序列，抗原表位肽或WNVEDIII和Fc序列(Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)之间引入GGGGS，利用分子克隆的方法将融合片段的编码序列克隆入表达载体中。
1.2将表达载体转染进哺乳动物细胞中，进行表达。
1.3收集表达上清，利用GE公司的Protein A FF蛋白柱进行纯化。
1.4用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1mol/L pH 8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01mol/L的PBS透析72h，0.22μm滤膜过滤除菌。
2、结果
融合蛋白表达纯化结果图1所示，抗原表位肽1-Fc、抗原表位肽2-Fc、抗原表位肽3-Fc均表达成功。
二、抗原抗体结合特异性检测
2.1方法
通过ELISA实验检测WNV-XH1抗体(WNV-XH1抗体序列见申请号为202011075191X的专利文献)。与抗原表位肽的结合情况。具体实验步骤如下：
1)在ELISA板中包被10μg/ml的抗原表位肽1-Fc，抗原表位肽2-Fc以及抗原表位肽3-Fc融合蛋白，4℃过夜；
2)用脱脂奶粉封闭未结合的位点，然后用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；
3)配置不同浓度的抗体WNV-XH1，加入步骤2中的ELISA板条中，37℃孵育1h，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；
4)加入HRP-标记的羊抗人IgG(Fab’)2抗体，37℃孵育30min，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。
2.2结果
结果见图2，表明抗原表位肽1-Fc、抗原表位肽2-Fc、抗原表位肽3-Fc可与WNV-XH1抗体特异性结合。
实施例2抗原表位肽突变对结合能力的影响
一、WNV EDIII突变体融合蛋白制备
1、方法
1.1突变设计
对WNV EDIII上的抗原表位肽1:QYTGTD进行单点和多点突变，突变后的多肽如下所示：
WNV EDIII MUT2：(SEQ ID NO.7)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELAAAGAAGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANAKVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT6：(SEQ ID NO.8)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELAY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT7：(SEQ ID NO.9)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQA TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT8：(SEQ ID NO.10)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY AGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT9：(SEQ ID NO.11)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGADGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT10：(SEQ ID NO.12)
EKLQLKG TTYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTAGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
对抗原表位肽3:TYGVCSKAF进行单点和多点突变，突变后的多肽如下所示：
WNV EDIII MUT1：AAGVCAAAA(SEQ ID NO.13)
EKLQLKG TAAGVCAAAA KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT1：AYGVCSKAF(SEQ ID NO.14)
EKLQLKG TAYGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT2：TAGVCSKAF(SEQ ID NO.15)
EKLQLKG TTAGVCSKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT3：TYGVCAKAF(SEQ ID NO.16)
EKLQLKG TTYGVCAKAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT4：TYGVCSAAF(SEQ ID NO.17)
EKLQLKG TTYGVCSAAF KFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANA KVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
WNV EDIII SMUT5：TYGVCSKAA(SEQ ID NO.18)
EKLQLKG TTYGVCSKAAKFLGTPADTG HGTVVLELQY TGTDGPCKVP ISSVASLNDLTPVGRLVTVN PFVSVATANAKVLIELEPPF GDSYIVVGRG EQQINHHWHK SGSSIG
1.2方法
1)将WNV EDIII突变序列基因全合成。
2)利用PCR方法overlap扩增各WNV EDIII突变体和Fc融合序列，WNV EDIII突变体和Fc序列之间引入GGGGS，利用分子克隆的方法将融合片段克隆入表达载体中。
3)将表达载体转染进哺乳动物细胞中，进行表达。
4)收集表达上清，利用GE公司的Protein A FF蛋白柱进行纯化。
5)用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1mol/L pH 8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01mol/L的PBS透析72h，0.22μm滤膜过滤除菌。
1.3结果
使用SDS-PAGE进行蛋白表达纯化，结果如图3所示，WNV EDIII-Fc及以上WNVEDIII突变体-Fc均表达成功，注：图中的1-10分别代表WNV EDIII SMUT1-Fc-WNV EDIIISMUT10-Fc，MUT1代表WNV EDIII MUT1-Fc、MUT2代表WNV EDIII MUT2-Fc、EDIII代表WNVEDIII-Fc。
二、抗原抗体结合特异性检测
2.1方法
通过ELISA实验检测WNV-XH1抗体与WNV EDIII-Fc及以上WNV EDIII突变体-Fc的结合情况。WNV-XH1抗体序列见申请号为202011075191X的专利文献。
1)在ELISA板中包被2μg/ml的各WNV EDIII突变体-Fc，4℃过夜；
2)用脱脂奶粉封闭未结合的位点，然后用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；
3)配置不同浓度的抗体WNV-XH1，加入步骤2中的ELISA板条中，37℃孵育1h，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；
4)加入HRP-标记的羊抗人IgG(Fab’)2抗体，37℃孵育30min，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。
2.2结果
结果见图4，表明WNV EDIII-Fc、WNV EDIII SMUT1-Fc、WNV EDIII SMUT2-Fc、WNVEDIII SMUT3-Fc、WNV EDIII SMUT6-Fc、WNV EDIII SMUT8-Fc、WNV EDIII SMUT9-Fc与WNV-XH1抗体特异性结合。注，图中MUT1代表WNV EDIII MUT1-Fc、MUT2代表WNV EDIII MUT2-Fc、EDIII代表WNV EDIII-Fc、SMUT1-SMUT10分别代表的是WNV EDIII SMUT1-Fc-WNV EDIIISMUT10-Fc。
三、表位竞争实验
1、方法
1)在ELISA板中包被1μg/ml的WNV EDIII，4℃过夜；
2)用脱脂奶粉封闭未结合的位点，然后用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；
3)用封闭液梯度稀释的相应突变体蛋白，起始浓度为50μg/mL，按2倍比例稀释，与相应浓度的抗体WNV-XH1进行混合，放置37℃孵箱放置30min。按照100μL/孔的量加入酶联板中，37℃孵箱放置1h。
4)加入HRP-标记的羊抗人IgG(Fab’)2抗体，37℃孵育30min，用含0.1％吐温的PBS缓冲液洗涤3次；加入TMB显色，1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。
2、结果
结果见图5，表明WNV EDIII SMUT4-Fc、WNV EDIII SMUT5-Fc、WNV EDIII SMUT7-Fc、WNV EDIII SMUT10-Fc、WNV EDIII MUT1-Fc、WNV EDIII MUT2-Fc与WNV-XH1抗体不结合。注：图中WNV EDIII代表WNV EDIII-Fc、WNV EDIII MUT1代表WNV EDIII MUT1-Fc、WNVEDIII MUT2代表WNV EDIII MUT2-Fc、SMUT4、SMUT5、SMUT7、SMUT10分别代表的是WNV EDIIISMUT4-Fc、WNV EDIII SMUT5-Fc、WNV EDIII SMUT7-Fc、WNV EDIII SMUT10-Fc。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种分离的抗原表位多肽
<141> 2021-10-09
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Tyr Thr Gly Thr Asp
1               5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Val Pro
            20
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe
1               5
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Tyr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 5
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            20                  25                  30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        35                  40                  45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    50                  55                  60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                85                  90                  95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            100                 105                 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        115                 120                 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    130                 135                 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                165                 170                 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            180                 185                 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210> 6
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 60
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 120
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 180
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 240
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 300
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 360
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 420
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 480
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 540
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 600
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 660
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 690
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Ala Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Ala Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Ala Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Ala Ala Gly Val Cys Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Ala Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Ala Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala
1               5                   10                  15
Ala Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val
    50                  55                  60
Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu
65                  70                  75                  80
Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
            100                 105                 110
Gly
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Tyr Trp Ile Glu
1               5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr
1               5                   10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1               5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val His Ile Ser Cys Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly His Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105

Claims (26)

1.分离的抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列变体，或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列变体；
所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列变体是以下任一项：
1）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第1位被替换为A；
2）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第3位被替换为A；
3）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第5位被替换为A；
所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列变体是以下任一项：
1）SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第1位被替换为A；
2）SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第2位被替换为A。
2.一种抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽的序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14、或SEQ ID NO.15所示。
3.一种复合物，其特征在于，所述复合物包括权利要求1所述的抗原表位多肽。
4.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述复合物还包括载体，所述载体通过偶联或融合的方式与所述抗原表位多肽形成复合物。
5.根据权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述偶联包括MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法或亚胺酸酯法。
6.根据权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述载体包括蛋白或脂类。
7.根据权利要求6所述的复合物，其特征在于，所述蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白或其他γ球蛋白。
8.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述复合物为融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述融合蛋白是权利要求1所述的抗原表位多肽与Fc的N端连接形成的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
11.一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒展示权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物。
12.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1所述的抗原表位多肽的核酸序列、编码权利要求2所述的抗原多肽的核酸序列，或编码权利要求3-10任一项所述的复合物的核酸序列。
13.一种核酸载体，其特征在于，所述核酸载体包含权利要求12所述的核酸分子。
14.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求12所述的核酸分子或权利要求13所述的核酸载体。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽、权利要求3-10任一项所述的复合物、权利要求11所述的类病毒颗粒、权利要求12所述的核酸分子或权利要求13所述的核酸载体。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是疫苗。
18.一种检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包含权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽、或权利要求3-10任一项所述的复合物。
19.根据权利要求18所述的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物还包含可检测部分。
20.一种非诊断目的的检测抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）获取含有抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体的样本；
2）将权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物与步骤1）的样本接触；
3）检测抗原抗体反应，
所述抗体包括如下序列：重链可变区的CDR1、2、3序列分别如SEQ ID NO.19-21所示；轻链可变区的CDR1、2、3序列分别如SEQ ID NO.22-24所示。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体包括如下序列：重链可变区序列如SEQ ID NO.25所示；轻链可变区序列如SEQ ID NO.26所示。
23.权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物在制备抗体中的应用。
24.权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物在制备预防西尼罗河病毒感染的疫苗中的应用。
25.权利要求1所述的抗原表位多肽、权利要求2所述的抗原多肽或权利要求3-10任一项所述的复合物在制备检测抗西尼罗河病毒E蛋白的抗体中的应用。
26.权利要求11所述的类病毒颗粒、权利要求12所述的核酸分子或权利要求13所述的核酸载体在制备预防西尼罗河病毒感染的疫苗中的应用。
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