CN110343172A - 一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明以大肠杆菌表达的黄热病毒E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期患者的PBMCs中筛选到可以特异结合黄热病毒E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR及PCR扩增，获得抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。本发明获得的6株人源抗体均有很强的YFV中和活性，IC 50值达0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的YFV China的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。

Description

一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

黄热病毒(yellow fever virus，YFV)，单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种蚊媒传播的可引起人类致病的病原体，同一科病毒还包括寨卡病毒(zikavirus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、西尼罗病毒(west nile virus，WNV)等。YFV是引起黄热病的重要病原，严重时会引起出血热伴随多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴结、心、肾。

在1996年时，科学家曾估计每年在非洲和南美洲黄热病毒可引起20万人感染，30万人死亡。近两年，巴西、安哥拉和刚果民主共和国等地发生了黄热病暴发，已造成数百人死亡，死亡率达14％，中国在2016年有11例输入病例。目前，临床上已有减毒疫苗(YFV17D)，但疫苗短缺和接种率不足导致疾病频繁爆发，非免疫个体仍处于危险之中。在YFV感染后，临床上没有可用于治疗该疾病的有效的特异性药物。

迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黄病毒等。黄病毒表面的E蛋白(Envelope)识别细胞表面的受体，进而促进病毒膜与细胞膜发生膜融合，由三个不同的结构域(DI，DII和DIII)完成这些过程。因此，E蛋白是机体免疫系统产生的中和抗体作用的重要表位。

已有研究发现有一些人源抗体具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黄热病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和Central African Republic(CAR)1986、Ethiopia1961、 Senegal1990、Nigeria1987、Ghana 1927(Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA病毒在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的YFV中和抗体。

发明内容

为了解决上述问题，本发明首先以大肠杆菌表达的YFV-E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期YFV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合YFV-E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR和PCR扩增，获得6株抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。测序正确后，经哺乳动物细胞表达、纯化，进行一系列的功能检测，包括与YFV-E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测。

本发明的第一个目的是提供一种抗体，如(1)～(6)任一所示：

(1)抗体命名为YD2，其重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)抗体命名为YD25，其重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)抗体命名为YD62，其重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

(4)抗体命名为YD86，其重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

(5)抗体命名为YD97-1，其重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；

(6)抗体命名为YD97-2，其重链可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25，核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。

在本发明的一种实施方式中，所述抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26，核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

在本发明的一种实施方式中，YD2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2；YD25的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:4；YD62的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6；YD86的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:8；YD97-1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10；YD97-2的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:11且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:12。

在本发明的一种实施方式中，所述YD2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:13、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:14。

在本发明的一种实施方式中，所述YD25的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:16。

在本发明的一种实施方式中，所述YD62的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:17、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。

在本发明的一种实施方式中，所述YD86的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:19、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。

在本发明的一种实施方式中，所述YD97-1的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:21、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:22。

在本发明的一种实施方式中，所述YD97-2的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:23、轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:24。

本发明的6个抗体，来源于同一病患者，并且均靶向黄热病毒特有的囊膜蛋白E蛋白，通过抑制E蛋白介导的受体结合和/或膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。

本发明的第二个目的是提供所述抗体在制备药物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述药物是用于治疗和/或预防黄热病毒的药物。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97-1或YD97-2。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、 YD62、YD86、YD97-1、YD97-2中的至少2种。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物还含有医学上可接受的载体。

本发明的第四个目的是提供一种用于免疫诊断或检测的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97-1、YD97-2中任一抗体的抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。

本发明的第五个目的是提供编码所述人源单克隆抗体YD2、YD25、YD62、YD86、YD97-1 和YD97-2的基因序列。

在本发明的一种实施方式中，所述抗体的重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。

在本发明的一种实施方式中，所述抗体的轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述抗体的重链的序列，依次包括CMV启动子序列、 EcoR I酶切位点序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、XhoI 酶切位点序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述抗体的轻链的序列，依次包括CMV启动子序列、 Sac I酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、酶切位点序列Xho I。

在本发明的一种实施方式中，所述第一酶切位点序列或第二酶切位点序列包括但不限于 EcoR I、Xho I、Sac I或Xho I的酶切位点序列。

在本发明的一种实施方式中，所述前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，编码该前导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

本发明的第六个目的是提供含有所述抗体基因序列的载体或者表达所述抗体的细胞。

本发明的有益效果：

本发明获得了6株人源高中和活性的YFV抗体：YD2、YD25、YD62、YD86、YD97-1 和YD97-2。这6株抗体与已经报道的YFV抗体序列完全不同，是6株新发现的抗体。6株人源抗体均有很强的YFV中和活性IC 50值达0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的YFV China的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。

附图说明

图1：YFV China-E蛋白纯化分子筛与SDS-PAGE结果；

图2：Protein A纯化后，抗体SDS-PAGE结果；

图3：抗体与YFV China-E的动力学曲线结果；

图4：抗体对YFV China的中和曲线结果；

图5：抗体对感染YFV China-E小鼠的保护效果；A为存活小鼠体重变化，B为小鼠存活率。

具体实施方式

实施例1：黄热病毒E蛋白的表达与纯化

YFV CNYF01/2016(YFV-China)病毒株膜蛋白E蛋白-(氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示)胞外区DNA片段通过NdeI和XhoI酶切后，连接到pET21a载体上。其中YFV E蛋白编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子。再将连接产物转化到BL21大肠杆菌感受态细胞。单克隆接种到40mLLB培养基中，培养6-8小时。接种到4L的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入 IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4-6小时。收获包涵体，通过稀释法复性包涵体。复性液浓缩后换成20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0缓冲液,10％甘油。将浓缩后的蛋白溶液进一步以分子排阻层析纯化，使用AKTA-purifier(GE)和superdex200Hiload 16/60柱(GE)，使用缓冲液A(20mM Tris，150mMNaCl，pH8.0，10％甘油)，同时监测280nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。经鉴定，可获得高纯度E单体蛋白，大小为43kDa。结果如图1。

实施例2：与YFV China-E蛋白结合的特异性记忆B细胞的分离

在病人的知情同意下，采集20mL的血液，分离PBMCs。将分离的PBMCs以10⁷/mL 的密度与终浓度400nM的YFV-E蛋白冰上孵育结合半小时，然后用PBS洗2次，再与下列抗体孵育：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-human CD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。抗体冰上孵育半小时后，用PBS洗2次。经FACSAria III分选收集PE-Cy5^-APC^-APC-Cy7⁺Pacific Blue⁺FITC⁺PE⁺的细胞，直接收集到96孔板内，1细胞/ 孔。

实施例3：单一B细胞PCR、序列分析及人源抗体设计

将实施例2获得的B细胞通过Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)逆转录，逆转录引物如表1(序列如SED ID NO.33至SED ID NO.40所示)，55℃反应60min。

表1.逆转录反应引物

将此逆转录产物作为模板，用HotStar Tap Plus酶(QIAgen)进行PCR，扩增抗体可变区序列(PCRa)。设计相应的引物，反应条件如下：95℃，5min；95℃30s，55℃(重链/κ链)/50℃(λ链)30s，72℃90s，35个循环；72℃，7min。将此作为模板再进行第二轮PCR (PCRb)，条件如下：95℃，5min；95℃30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)30s， 72℃90s，35个循环；72℃，7min。

1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。条带大小在400-500bp的切胶回收后送测序公司测序。测序结果用NCBI在线软件进行分析。

分析正确的可变区序列与相应的重链/κ链/λ链的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体pCAGGS中。其中重链与λ链以EcoRI和XhoI连接，κ链以SacI与XhoI连接。B细胞测序及真核细胞表达质粒构建策略如下：

人源抗体设计策略如下：

重链：CMVpromoter-EcoR I-Leader sequences-重链可变区-C_H-Xho I；

轻链(κ)：CMVpromoter-Sac I-Leader sequences-轻链可变区-C_L(κ)-Xho I；

其中，Leader sequences的氨基酸序列如SEQ ID NO:29(核苷酸序列如SEQ IDNO:30)。

实施例4：抗体的表达及纯化

用含10％FBS的DMEM培养293T细胞。用实施例3中构建的，含有特定抗体轻、重链编码基因的质粒共转染293T。转染4-6小时后换液成无血清的DMEM继续培养7天，收集上清。

收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0)的缓冲液等体积混合，经过0.22μm滤膜过滤后，与proteinA预装柱结合(5mL，GE Healthcare)。以0.1M 甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如图2，说明目标蛋白得到正常表达。

最终，得到了6个能与YFV China-E蛋白结合且中和活性较强的抗体YD2、YD25、YD62、 YD86、YD97-1和YD97-2。具体基因重排方式如下表2

表2抗体基因重排

实施例5：人源抗体的性能检测

(1)表面等离子共振技术检测与YFV-E的结合能力

表面等离子共振分析利用Biacore T100(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：

首先，将anti-human IgG的抗体以氨基偶联的方式固定在CM5芯片的通道(flowcell,Fc)。固定量控制在10,000响应值(response units,RU)左右。以抗体捕获的方式结合纯化的抗体，此时，液流速度控制在10μL/min，进样1min，抗体捕获量在60RU左右。再以10mMHEPES，150mM NaCl，pH 7.4溶液倍比稀释YFV China-E蛋白，流速调至30μL/min，依次通过各通道，从低浓度开始逐一上样YFV-E蛋白。曲线组成图如图3所示的动力学曲线。结果如表3 所示。结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software T100(Biacore，Inc.)软件进行。 SPR的结果显示，6株抗体均可以与YFV-E蛋白结合。

表3抗体与YFV China-E蛋白结合的动力学常数

(2)中和试验

将纯化的抗体3倍倍比稀释，与1:60稀释的YFV(C6/36扩增)混合，37℃共孵育60分钟。然后将混合液加入到已铺满Vero细胞的24孔板中，300μL/孔。37℃孵育1小时后，每孔补充培养基(DMEM，10％FBS)0.7mL，继续培养40小时后染色。收集细胞，用含4％多聚甲醛，0.05％的soponin的PBS处理细胞，冰上避光静置30min。然后以solution溶液(PBS， 1％BSA，0.01％soponin)洗涤细胞2次，与2μg/mL的Z6-FITC抗体冰上孵育30min后，solution溶液洗涤细胞2次，用FACSCanto检测细胞阳性比例。根据不同浓度下阳性比例，计算抗体对YFV的中和能力，如图4所示，结果统计如表4。

表4抗体对YFV China中和效果

(3)动物保护试验

3周龄雌性Balb/c小鼠(维通利华公司)，以4-5只分组。每只小鼠颅内注射80PFU病毒YFV China。感染24小时后单一剂量10mg/kg的抗体或等体积的PBS通过腹腔注射给感染的小鼠。记录14天内小鼠的存活与体重变化。体重变化超过25％或是出现瘫痪症状的小鼠处死。结果如图5显示。注射YD2抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为66.7％，存活小鼠体重恢复。注射YD25抗体的小鼠在第10天开始死亡，至第16天的存活率为66.7％。注射YD86抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为66.7％。注射 YD97-2抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为80％。注射YD62与YD97-1 抗体的小鼠在第11天开始死亡，至第16天的存活率为100％。注射对照抗体的的4只小鼠在感染后第8天开始死亡，11天全部死亡(图5)这6株抗体保护率总结如表5。

表5抗体对感染YFV China小鼠的治疗效果

目前，已发现的抗黄热病毒的人源抗体已有5A、7A、R3(27)、1A、2A、R3(9)，基因重排方式为：VH4-59，VH3-11，VK1-12，VL1-19(GenBank中序列号分别为:AY661699，AY661700，AY661701，AY661702，AY661703和AY661704)：其中5A、7A、R3(27)可以中和2001年前的部分毒株和疫苗株YFV 17D，中和活性IC₅₀约1-10ug/ml。无体内动物实验验证其功能。本实验中6株人源抗体的IC₅₀为3.5～0.03μg/mL。并且，在动物保护实验中，本发明使用的抗体剂量为10mg/kg，其中YD97-1可以完全保护致死剂量攻击的小鼠。YD2、 YD25、YD86和YD97-1对小鼠的保护率为60％以上。

综上，本发明通过筛选康复病人的YFV China-E特异结合的记忆B细胞，获得6株人源高中和活性的YFV抗体：YD2、YD25、YD62、YD86、YD97-1和YD97-2。这6株抗体与已经报道的黄热抗体序列完全不同，是新发现的抗体，均有很强的中和黄热病毒活性。并且，可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的黄热病毒的攻击。这提示，6株人源抗体有着临床治疗和预防黄热病的应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile

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Ile Pro Ile Phe Gly Ser Pro His Tyr Ala His Lys Phe Gln Asp Arg

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Arg

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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Arg Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Ser Val Arg Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Thr Pro Ile Phe Asp Ile Ala Asp Tyr Ser Gln Lys Phe

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Gln Gly Arg Leu Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

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1 5 10 15

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<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Gly Ile Ser Tyr Ser

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asp Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Lys Thr Phe Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Val Lys

100 105

<210> 11

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ala Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Thr Thr Arg Thr Ala Ser

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Trp Glu Tyr Asn Tyr Arg Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp

100 105 110

Ser Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcgtc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc atcagctggg tgcgacaggc ccccggacaa 120

gggcttgagt ggatgggaag gatcatccca atttttggta gcccacacta cgcacacaaa 180

ttccaggaca gagtcacgat cacggcggac aaactcacga acacagccta catggagttg 240

agtagcctga gttctgagga cacggccatg tattactgtg cgagactgtc cgactatgat 300

aatcgtggta ataactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

ttcacctgcc gggcaagtca ggacattgga aatcgtttag gctggtatca gcagaaacca 120

ggggaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

agattcagcg gcagtggctc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gcggattttg caacttattt ttgtctacag catgatagtt acccacggac attcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 15

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaccaggtgc agctggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctgggtc ctcggtgagg 60

gtctcctgcg aggcttctgg aggcaccttc agcagttatg ctattagttg gctgcgacag 120

gcccctggac aaggacttga gtggatggga aggatcaccc ctatttttga tatagcagac 180

tattcacaga agttccaggg cagactcacc tttaccgcgg acaaatccac gaacacagcg 240

tacatggaac tgagcagcct gagatctgac gacacggccg tctattactg tgcgcacctt 300

atggtttggg gagttaacgg agagtccttt gatatgtggg gccaagggac catggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaaattgtgt tgacacagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattgga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagcgcct gatctattct gcatccagtt tgcagagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatgaat accctcgaac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaagtcaa a 321

<210> 17

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttgggccagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggatt cagttttagt agctattgga tgggctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag aaggaaatga gaaatactat 180

gtggactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaccaagaa ctcaatgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagatatg 300

ggatatggga gtgatgctta tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca 360

<210> 18

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttga attggtatca gcaaagacca 120

gggagagccc ctaagctcct gatctactct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag acttacgaaa tctggacgtt cggccaaggg 300

accaaggtgg aaatcaaa 318

<210> 19

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag gctcaggatt cagtttcagt gtctatggaa tacactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacagta atatcctatg atggcagtaa taaacagtac 180

gcagactccg tgaagggtcg attcgccatc tccagagaca atgacaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtcgagca 300

gtgggtggtg attcggatga ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaaattgtgt tgacacagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120

ggaaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatgatt acccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggacatcaa a 321

<210> 21

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgtaagg cttctggcta cacctttatc gcctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctc acaacggtaa cacaaactat 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccgtg accacagaca caaccacgag aacagcctcc 240

atggaactgc ggaacctgag atctgacgac acggccgtgt actactgtgc gcgagctcct 300

tgggagtata attacaggag tagtggttat tacgactcgc cctactgggg ccagggaacc 360

ctggtcaccg tctcctca 378

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gaaattgtgt tgacacagtc tccacccctc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccggtca gggcattagc tattctttag cctggtatcg gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctgatctcct ggtctatgat tcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacaa cttaaaactt tccctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggacgtcaa a 321

<210> 23

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgtaagg cttctggcta cacctttatc gcctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctc acaacggtaa cacaaactat 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccgtg accacagaca caaccacgag aacagcctcc 240

atggaactgc ggaacctgag atctgacgac acggccgtgt actactgtgc gcgagctcct 300

tgggagtata attacaggag tagtggttat tacgactcgc cctactgggg ccagggaacc 360

ctggtcaccg tctcctca 378

<210> 24

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaaattgtgt tgacacagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc atctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctacgag gcatccagtt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaggtgggtc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctctcac tttcggccct 300

gggaccaaag tggatatcaa a 321

<210> 25

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

100 105

<210> 27

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gccagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 60

ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 180

ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 240

tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 28

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgaactgtgg ctgcaccaag cgtgtttatc ttccctccca gcgacgagca gctgaagagc 60

ggcaccgcca gcgtggtctg tctcctgaac aacttctatc ccagggaggc caaggtccag 120

tggaaagtgg acaacgccct gcaaagcggc aatagccagg agtccgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctgtccagc accctgaccc tcagcaaggc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcttg cgaggtgacc catcagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300

tccttcaaca ggggcgaatg cagc 324

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20

<210> 30

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctgt gggttccagg ttccactggt 60

gac 63

<210> 31

<211> 405

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Met Ala His Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val

1 5 10 15

His Gly Gly Thr Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val

20 25 30

Thr Val Met Ala Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Gln Thr

35 40 45

Val Ala Ile Asp Gly Pro Ala Glu Ala Arg Lys Val Cys Tyr Ser Ala

50 55 60

Val Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu

65 70 75 80

Ala His Leu Ala Glu Glu Asn Asp Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr

85 90 95

Tyr Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly

100 105 110

Ser Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu

115 120 125

Phe Glu Val Asp Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu

130 135 140

His Val Gly Ala Lys Gln Glu Asn Trp Asn Thr Asp Ile Lys Thr Leu

145 150 155 160

Lys Phe Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gln Glu Ala Glu Phe Thr Gly Tyr

165 170 175

Gly Lys Ala Thr Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly

180 185 190

Asn Ser Tyr Ile Ala Glu Met Glu Lys Asp Ser Trp Ile Val Asp Arg

195 200 205

Gln Trp Ala Gln Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly

210 215 220

Ile Trp Arg Glu Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala

225 230 235 240

Ala Thr Ile Arg Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys

245 250 255

Thr Ala Leu Thr Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Glu Asn Asp Asn

260 265 270

Asn Leu Tyr Lys Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu

275 280 285

Ser Ala Leu Thr Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Met Cys Thr Asp Lys

290 295 300

Met Ser Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val

305 310 315 320

Met Gln Val Lys Val Pro Lys Gly Ala Pro Cys Lys Ile Pro Val Ile

325 330 335

Val Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ala Val Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr

340 345 350

Val Asn Pro Ile Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val

355 360 365

Asn Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Thr Gly Asp Ser

370 375 380

Arg Leu Thr Tyr Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys His

385 390 395 400

His His His His His

405

<210> 32

<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

atggcacatt gcatcggcat taccgaccgc gatttcatcg agggtgtgca tggtggtaca 60

tgggtgagtg caaccctgga acaggataaa tgcgtgaccg tgatggcccc ggataagcct 120

agtctggata ttagcctgca gaccgtggcc attgatggtc cggcagaagc ccgtaaagtg 180

tgctacagcg ccgttctgac ccacgtgaag atcaacgaca agtgccctag cacaggcgaa 240

gcccatctgg cagaggagaa cgacggtgat aacgcctgta aacgcaccta cagcgaccgt 300

ggctggggta atggctgcgg cctgtttggc aagggtagca ttgtggcctg cgcaaaattc 360

acctgcgcca agagcatgag tctgttcgag gtggaccaga ccaagattca gtatgtgatc 420

cgcgcccagc tgcacgtggg cgcaaagcag gagaactgga acaccgacat caagaccctg 480

aagttcgatg ccctgagcgg cagccaagaa gccgagttta caggttacgg caaggcaacc 540

ctggagtgtc aagtgcagac cgcagtggat ttcggtaata gctatattgc cgagatggag 600

aaagacagct ggatcgtgga tcgccagtgg gcccaagatc tgaccctgcc gtggcagagc 660

ggtagtggtg gcatttggcg cgaaatgcat catctggtgg agtttgagcc gccgcatgcc 720

gcaaccattc gtgtgctggc cctgggcaat caggaaggca gcctgaaaac cgccctgaca 780

ggcgccatgc gcgtgaccaa agacgaaaac gataataatc tgtacaagct gcatggtggc 840

cacgtgagct gccgcgtgaa gctgagcgcc ctgaccctga aaggcaccag ctacaagatg 900

tgtacagaca aaatgagctt cgttaagaat ccgaccgata ccggccacgg caccgtggtg 960

atgcaggtta aggttccgaa aggcgcaccg tgcaaaatcc cggtgattgt tgccgatgac 1020

ctgaccgccg ccgtgaataa gggcattctg gtgaccgtga acccgatcgc aagcaccaac 1080

gatgatgagg tgctgatcga agtgaacccg ccttttggcg acagttacat catcgtgggt 1140

accggcgata gccgcctgac ctatcaatgg cacaaggaag gcagtagcat cggcaaacat 1200

catcaccacc accat 1215

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atggagtcgg gaaggaagtc 20

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tcacggacgt tgggtggta 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tcacggaggt ggcattgga 19

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

caggcgatga ccacgttcc 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

catgcgacga ccacgttcc 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aggtgtgcac gccgctggtc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gcaggcacac aacagaggca 20

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

aggccactgt cacagct 17

Claims (10)

1.一种抗体，其特征在于，如(1)～(6)任一所示：

(1)重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

(4)重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

(5)重链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；

(6)重链可变区含有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区；所述重链恒定区含有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，抗体的轻链为κ链，包括轻链可变区和轻链恒定区；轻链恒定区含有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1～3任一所述的抗体。

5.权利要求1～3任一所述的抗体在制备治疗和/或预防黄热病毒的药物方面的应用。

6.编码权利要求1～3任一所述的抗体的DNA。

7.根据权利要求7所述的DNA，其特征在于，编码抗体的重链的核苷酸序列包括CMV启动子序列、前导序列、编码重链可变区的序列和编码重链恒定区的序列；编码抗体的轻链的序列包括CMV启动子序列、前导序列、编码轻链可变区的序列和编码轻链恒定区的序列。

8.含有权利要求6或7所述DNA的载体。

9.表达权利要求1～3任一所述抗体的细胞。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～3任一所述抗体的抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌。