CN108299559A - Zaire型埃博拉病毒检测抗体及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Zaire型埃博拉病毒检测抗体及其制备方法及应用。所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，为人源单克隆抗体；其轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、DKT，和SEQ ID No.5，重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7，和SEQ ID No.8。本发明所述抗体能够很好的检测Zaire型埃博拉病毒囊膜蛋白GP，具有重要的经济和社会意义。

Description

Zaire型埃博拉病毒检测抗体及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Zaire型埃博拉病毒检测抗体、其制备方法及应用。
背景技术
埃博拉病毒(Ebola virus)1976年分别在苏丹和刚果民主共和国发现。目前，已经发5种亚型：扎伊尔型(Zaire)，苏丹型(Sudan)，本迪布焦型(Bundibugyo)，科特迪瓦型(Cote d’Ivoire)，以及莱斯顿型(Reston)，其中前4个亚型对人类具有致病性。最近一次埃博拉病毒感染事件暴发始于2014年2月，死亡率可高达90％，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量性休克或器官衰竭。
埃博拉病毒在自然界的起源及宿主尚未确定，有证据表明该病毒是动物源性病毒，蝙蝠可能是其潜在的自然宿主。埃博拉病毒具有很强的传染性，感染病人的血液、精液、汗液，唾液及分泌物均具有感染性，可通过皮肤、结膜或呼吸道等途径感染密切接触者。埃博拉病毒感染细胞由囊膜蛋白GP介导，GP经过furin或furin-like蛋白酶加工，形成GP1和GP2两个亚单位，GP1和GP2由一对二硫键连接形成异源二聚体，形成成熟的三聚体形式。GP1亚基负责将病毒锚定于靶细胞，GP2亚基负责病毒包膜与细胞膜的融合，进而将病毒基因组释放进入宿主细胞，此过程需要内源性半胱氨酸蛋白酶参与完成。
GP在埃博拉病毒的致病性方面发挥重要作用，可选择性地降低细胞表面与细胞粘附和免疫功能相关的大分子的表达，从而导致细胞的脱落死亡。此外，sGP通过CD16b结合至中性粒细胞，与宿主免疫系统相互作用，改变FcγRIIIB和CR3之间物理性和功能性的相互作用，进而抑制早期中性粒细胞对病毒的清除，从而引起免疫逃逸。
目前，市场上仅有台北Abnova和北京义翘神州两家公司生产、销售相关鼠源及兔源单(多)抗。常用的抗体筛选方法有噬菌体展示抗体文库筛选、单个B细胞测序技术、B细胞永生化和人源化小鼠杂交瘤细胞筛选等等，我们利用噬菌体展示抗体文库筛选方法获得了一种Zaire型埃博拉病毒检测抗体。本发明利用正常人的PBMC所构建的噬菌体展示抗体文库，采用亲和筛选的方式获得具有亲和力的单克隆抗体基因序列，简化了抗体的筛选流程，也为抗体药物的研发提供了一个捷径。
发明内容
针对现有市场供应量的不足及实际需求，本发明的目的是提供Zaire型埃博拉病毒检测抗体、其制备方法及应用。本发明提供的Zaire型埃博拉病毒检测抗体，为埃博拉病毒感染诊断以及埃博拉病毒抗原GP的检测提供了新的选择，具有重要的经济和社会意义。
为了达到上述目的，本发明提供了一种Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，为人源单克隆抗体；其轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、DKT(E-1C8 CDR-L2，AspLysThr)或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，和SEQ ID No.5或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.6或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.7或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，和SEQ ID No.8或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
优选地，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQID No.1或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
优选地，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的轻链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.9或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.10或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、和SEQ ID No.11或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；重链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.12或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.13或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、和SEQ ID No.14或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
优选地，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID No.15或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列、和SEQ ID No.16或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含SEQ ID No.15或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列、以及SEQ ID No.16或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列中的至少一个。
本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含上述表达载体。
本发明还提供了上述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID No.15-SEQ ID No.20及上述序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列中的至少一个与表达载体连接，扩增，转染293T细胞，收取293T细胞上清，挂proA柱，洗脱，得到Zaire型埃博拉病毒检测抗体。
优选地，所述的表达载体为哺乳动物表达载体。
更优选地，所述的哺乳动物表达载体为pFuse-Fc和pCAGGS哺乳动物表达载体。
本发明还提供了上述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体在制备对埃博拉病毒GP抗原具有亲和力、对埃博拉病毒的检测中的应用。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种Zaire型埃博拉病毒检测抗体，所述抗体为人源单克隆抗体。根据本发明的实施例，抗体的轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.3、DKT(E-1C8CDR-L2，AspLysThr)、SEQ ID No.5所示；其重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。
所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
序列可以包含某些生物学功能等同的氨基酸或“保守性替代”，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其经基因工程改造以改进CDR或含CDR抗体的特性。
前面所述的氨基酸序列如下：
SEQ ID No.1(E-1C8 L)：
QAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGSYSNIGPGYAVQWYQQRPGTAPKLLIYDKTNRPSGVPDRFSGSRSGTSASLAISGLQAEDEAVYYCHSYDNSLSGWVFGGGTQLTVLC。
SEQ ID No.2(E-1C8 H)：
MAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERWDWGEIVVVPAAITPYYYYGMDAWGQGTTVTVSS。
SEQ ID No.3(E-1C8 CDR-L1)：YSNIGPGYA。
SEQ ID No.5(E-1C8 CDR-L3)：HSYDNSLSGWV。
SEQ ID No.6(E-1C8 CDR-H1)：GGTFSSYA。
SEQ ID No.7(E-1C8 CDR-H2)：IIPIFGTA。
SEQ ID No.8(E-1C8CDR-H3)：ARERWDWGEIVVVPAAITPYYYYGMDA。
所述抗体的轻链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11所示；其重链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列如SEQ D No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.14所示。
根据本发明的实施例，前面所述的氨基酸序列如下：
SEQ ID No.9(E-1C8FR-L1)：QAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGS。
SEQ ID No.10(E-1C8 FR-L2)：VQWYQQRPGTAPKLLIY。
SEQ ID No.11(E-1C8FR-L3)：NRPSGVPDRFSGSRSGTSASLAISGLQAEDEAVYYC。
SEQ ID No.12(E-1C8 FR-H1)：MAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS。
SEQ ID No.13(E-1C8 FR-H2)：ISWVRQAPGQGLEWMGG。
SEQ ID No.14(E-1C8FR-H3)：NYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC。
所述抗体为人源单克隆抗体。
所述抗体为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体或其衍生物。
本发明的抗体或其抗原结合片段，能够很好的结合埃博拉病毒表面唯一抗原-囊膜蛋白GP。
在本发明的第二方面，本发明提供了两种DNA片段。根据本发明的实施例，这些DNA片段编码如第一方面所述的抗体。
根据本发明的实施例，前面所描述的DNA片段，包含重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列；编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16所示。
根据本发明的实施例，前面所述的核苷酸序列如下：
SEQ ID No.15(E-1C8L chain)：
CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCTACTCTAACATCGGGCCAGGCTACGCTGTACAGTGGTACCAGCAGCGTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAAGACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCACCTCCGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCCGTTTATTACTGCCACTCCTATGACAACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGTGGGACCCAGCTCACCGTTTTATGT。
SEQ ID No.16(E-1C8 H chain)：
ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAACGTTGGGATTGGGGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATAACCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA。
通过采用本发明的多核苷酸，能够有效地合成Zaire型埃博拉病毒检测抗体或抗原结合片段。
在本发明的第三方面，本发明还提供了两种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。
通过采用根据本发明的方法，能够利用前面所述的多核苷酸有效地合成根据本发明实施例的Zaire型埃博拉病毒检测抗体或抗原结合片段。关于Zaire型埃博拉病毒检测抗体或抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该多核苷酸，在此不再赘述。
在本发明的第五方面，本发明提供了如第一方面所述埃博拉病毒检测抗体抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)使用亲和筛选方法从噬菌体展示抗体文库中筛选能够特异结合Zaire型埃博拉病毒囊膜蛋白GP的单克隆，对其进行测序获得其重链和轻链的高度可变区序列核苷酸序列信息；
(2)通过PCR扩增、酶切、连接方法构建抗体表达载体。
根据本发明的实施例，所述抗体的制备方法可以采用本领域技术人员熟知的技术进行，在此不做特殊限制。
根据本发明的实施例，步骤(2)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为pFuse-Fc和pCAGGS哺乳动物表达载体。
考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
进一步地，本发明将前面所述抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，可获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够识别Zaire型埃博拉病毒抗原GP。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。可将上述编码抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化或转染宿主细胞，获得所述抗体以及单链抗体。
此外，可将前面所述抗体的轻链可变区编码基因和重链可变区基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达检测埃博拉病毒的全抗免疫球蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述抗体来源于人体，能够更好的体现病毒与人体免疫系统的相互作用，抗体(ScFv-Fc形式)与GP蛋白的亲和力KD为1.26nM。本发明所述抗体能够很好的检测Zaire型埃博拉病毒囊膜蛋白GP，具有重要的经济和社会意义。
附图说明
图1是本发明制备的E-1C8的ScFv-Fc和IgG两种抗体形式与埃博拉GP蛋白结合的ELISA结果；
图2为本发明抗体E-1C8的ScFv-Fc抗体与表达在293T细胞表面的GP蛋白结合的IFC结果。
图3为本发明抗体E-1C8的IgG抗体Western Blot方法检测埃博拉GP蛋白的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中采用的噬菌体展示抗体文库由Richard Lerner提供，GAO’s Lib，按照记载在Zhang H，Wilson IA，Lerner RA：Selection of antibodies that regulatephenotype from intracellular combinatorial antibody libraries.Proc Natl AcadSci USA 2012，109(39)：15728-15733.中记载的方法构建。
以下实施例中采用的Zaire型埃博拉病毒囊膜蛋白GP(NCBI GenBank：AHX24658.2，构建至昆虫表达质粒表达获得)按照记载在Wang H，Shi Y，Song J，Qi J，LuG，Yan J，Gao GF：Ebola Viral Glycoprotein Bound to Its Endosomal ReceptorNiemann-Pick C1.Cell 2016，164(1-2)：258-268中的方法制备。
sGP(NCBI GenBank：U23187.1，构建至昆虫表达质粒表达获得)按照记载在MohanGS，Li W，Ye L，Compans RW，Yang C：Antigenic Subversion：A Novel Mechanism of HostImmune Evasion by Ebola Virus.PLoS Pathogens 2012，8(12)：e1003065中的方法制备。
ssGP(NCBI GenBank：NP_066248，构建至昆虫表达质粒表达获得)按照记载在Radoshitzky SR，Warfield KL，Chi X，Dong L，Kota K，Bradfute SB，Gearhart JD，Retterer C，Kranzusch PJ，Misasi JN et al：Ebolavirus delta-peptideimmunoadhesins inhibit marburgvirus and ebolavirus cell entry.Journal ofvirology 2011，85(17)：8502-8513中的方法制备。
实施例1抗体的制备
Zaire型埃博拉病毒GP蛋白检测抗体的制备方法，包括如下步骤：
1.1使用亲和筛选方法从噬菌体展示抗体文库中筛选能够特异结合Zaire型埃博拉病毒囊膜蛋白GP(NCBI GenBank：AHX24658.2，构建至昆虫表达质粒表达获得)的单克隆：
1.1.1使用NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher，21955)对抗原(GP)分子中含有伯氨基的氨基酸进行生物素化，得到生物素化后的抗原Bio-GP：
1.1.1.1根据抗原GP摩尔量计算所需使用NHS-PEG4-Biotin的摩尔量，使NHS-PEG4-Biotin的摩尔量50倍于GP摩尔量，计算方法如下：
mL protein*(mg protein/mL protein)*(mmol protein/mg protein)*(50mmolBiotin/mmol protein)＝mmol Biotin；
50＝推荐的NHS-PEG4-Biotin与抗原分子的摩尔比；
1.1.1.2.根据1.1.1.1计算所需浓度为20mM NHS-PEG4-Biotin的体积，计算方法如下：
mmol Biotin*(589mg/mmol Biotin)*170μL/2.0mg)＝μL Biotin Solution
589＝NHS-PEG4-Biotin分子量；
170＝溶解2.0mg NHS-PEG4-Biotin为摩尔浓度20mM所需的溶剂体积；
1.1.1.3溶解200μg GP至700μL PBS中；
1.1.1.4使用170μL试剂盒中的溶剂将NHS-PEG4-Biotin溶解为20mM；
1.1.1.5在GP中加入4μL的NHS-PEG4-Biotin，混匀，冰上孵育2h；
1.1.1.6将孵育好的蛋白样品加至脱盐柱(Thermo Fisher，89882)介质中央，使蛋白浸润至脱盐柱；
1.1.1.7 1000g，2min离心，所获得的流川液即为生物素化后的Bio-GP；
1.1.2使用磁珠法进行筛选：
1.1.2.1第一天：
使用5％BSA(AMRESCO，0332)-PBST封闭1.5ml离心管，室温孵育1h；
使用PBS洗磁珠(200μL每样，Thermo Fisher，11206D)4次；
5％BSA-PBST封闭文库(200μL)，室温孵育30min；
将上述文库加至PBS洗过的磁珠中(1/4体积磁珠)，室温孵育30min；
向上步上清加入5μg生物素化后的抗原Bio-GP，室温孵育2h；
稍离心，将上步所得加至前一步剩余的3/4体积磁珠中，室温孵育20min；
回收磁珠，PBST洗涤4次，PBS洗涤2次；
回收磁珠，加入300μL pH 2.2 Glycine-HCl，室温反应10min；
上步上清至新离心管，立即加入pH 8.0的Tris 115μL进行中和；
将所得上清加至9mL OD600为0.5-0.7的XL1-Blue(Agilent，200228)，混匀，37℃，30min；
滴定：
产出OutPut：取上步1μL至200μL LB中，然后使用LB进行100倍浓度梯度稀释，涂氨苄平板；
投入Input：取文库1μL至1mL LB中，使用LB进行1000倍梯度稀释，加至200μL XL1-Blue中，涂氨苄平板；
将上上步所得，3000RPM，4℃，15min，弃上清，加200μL LB，混匀，涂Amp大板；
滴定板置于37℃过夜，大板置于30℃过夜；
1.1.2.2第二天
使用涂布棒刮大板，25mL LB刮，5mL LB洗；
测OD值；
用LB(LB含10％Glucose，100μg/mL Amp，5μg/mL Tet)稀释合适体积的刮板液至100mL，OD600为0.1左右，37℃ 2h，至OD600 0.5左右；
加1.5mL Helper phage(Thermo Fisher，18311019)，37℃，0.5h，每10min晃动一次；
37℃，200RPM，1.5h，测OD600，稀释至OD600 0.8；
4℃，3000RPM，15min，50mL LB重悬，再离心一次；
50mLLB重悬，取40mL于新瓶中(LB含100μg/mL Amp，5μg/mL Tet，35μg/mL Kan)；
30℃，过夜；
1.1.2.3第三天
取昨日所摇菌，4℃，5000RPM，15min；
上清至新离心桶中，加入PEG-NaCl(1∶4)，冰上1h；
4℃，14000g，30min，弃上清；
4℃，14000g，5min，弃上清；
2mL 1％BSA-PBS重悬，14000g，5min，2次，取200μL用于下一轮筛选，此为一轮完整筛选；
重复上一轮筛选步骤；
1.1.2.4第四天
重复进行新一轮筛选；
1.1.2.5第五天
重复进行新一轮筛选；
1.1.2.6第六天
重复进行新一轮筛选，六天完成四轮筛选。
对产出投入率进行计算，结果如下表所示：
表1.产出投入比例
对所得的克隆噬菌粒得进行测序获得其重链和轻链的可变区序列核苷酸序列信息，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16，E-1C8的测序结果如下所示：
C04_S148806_S625861a_EGP-1-1-C8_PGMF，(SEQ ID No.18)：
GGAGGGCTTTAAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAACGTTGGGATTGGGGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATAACCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCTACTCTAACATCGGGCCAGGCTACGCTGTACAGTGGTACCAGCAGCGTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAAGACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCACCTCCGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCCGTTTATTACTGCCACTCCTATGACAACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGTGGGACCCAGCTCACCGTTTTATGTGGCCTCGGGGGCCTGGTCGACTACAAAGATGACGATGACAAATAGACTAGTGGCCAGGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGTGGCGGCTCTGAGGAGCGGTTCCGGTGTGGCTCTGGTTCCGTGATTTG
1.2a使用内切酶SfiI(Thermo Fisher，FD1824，1μL/反应)酶切所筛选到的结合埃博拉病毒GP蛋白的克隆噬菌粒(酶切得到VH-VL，SEQ.ID No.17)以及目标载体质粒pFuse-Fc(InvivoGen，pfuse-hg1fc2)，37℃，30min；
1.2b分别以所筛到的噬菌粒(SEQ.ID No.18)为模板，按照常规方法对表达序列进行基因合成(GENEray)(两侧引入EcoRI，XhoI酶切位点)，得到重链可变区-重链恒定区(VH-CH，SEQ.ID No.19)，轻链可变区-轻链恒定区(VL-CL，SEQ.ID No.20)，使用内切酶EcoRI(Thermo Fisher，FD0274，1μL/反应)，XhoI(Thermo Fisher，FD0694，1μL/反应)酶切VH-CH，VL-CL以及目标质粒pCAGGS(Addgene，12445)，37℃，30min；
1.3进行DNA凝胶电泳，将目的抗体片段(ScFv形式VH-VL，SEQ.ID No.17以及IgG形式重链全长VH-CH，SEQ.ID No.19，轻链全长VL-CL，SEQ.ID No.20)以及目标载体质粒(pFuse-Fc和pCAGGS，其中，pFuse-Fc用于与VH-VL连接，pCAGGS用于与VH-CH和VL-CL连接)切胶并使用凝胶回收试剂盒(CWBIO，CW2302)将目的抗体片段与载体片段回收；
SEQ ID No.17(E-1C8ScFv，VH-VL)：
ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAACGTTGGGATTGGGGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATAACCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCTACTCTAACATCGGGCCAGGCTACGCTGTACAGTGGTACCAGCAGCGTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAAGACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCACCTCCGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCCGTTTATTACTGCCACTCCTATGACAACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGTGGGACCCAGCTCACCGTTTTATGT。
SEQ.ID No.19(E-1C8VH-CH)：
GAATTCGCCACCatggagttcggcctgagctgggtgttcctggtggccatcatcaagggcgtgcaatgccagATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAACGTTGGGATTGGGGGGAGATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATAACCCCCTACTACTACTACGGTATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggcgccgagcagcaaaagcaccagcggcggcaccgcggcgctgggctgcctggtgaaagattattttccggaaccggtgaccgtgagctggaacagcggcgcgctgaccagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcagcggcctgtatagcctgagcagcgtggtgaccgtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagcaacaccaaagtggaaaacgcgtgGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGACTCGAG。
SEQ.ID No.20(E-1C8 VL-CL)：
GAATTCGCCACCatggcctgggctctgctattcctcaccctcctcactcagggcacagggtcctgggccCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCTACTCTAACATCGGGCCAGGCTACGCTGTACAGTGGTACCAGCAGCGTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAAGACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCACCTCCGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCCGTTTATTACTGCCACTCCTATGACAACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGTGGGACCCAGCTCACCGTTTTATGTGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCAcaccaccaccaccaccacTAACTCGAG。
1.4使用连接试剂盒(Thermo Fisher，15224041)将目的抗体片段与载体片段进行连接，22℃，60min；
1.5将所得连接产物转化DH5α感受态(CWBIO，CW0808，100μL)，冰上放置30min；
1.6 42℃热激1min；
1.7冰上放置1min；
1.8补加LB培养基至1mL后，37℃，200RPM，摇菌60min；
1.9取200μL涂LB平板(氨苄抗性)，37℃，过夜；
1.10挑取昨日平板单克隆加入甘油进行单克隆保菌(甘油终浓度10％)及测序，并对单克隆序列进行比对，获得序列正确的单克隆(SEQ.ID NO.17，SEQ.ID NO.19及SEQ.IDNO.20)；
1.11使用正确克隆的甘油菌按照1∶1000体积比接种到LB培养基中摇菌，37℃，过夜；
1.12使用大提质粒试剂盒(TIANGEN，DP117)提取质粒；
1.13使用PEI(Sigma-Aldrich，P3143，质量比PEI∶质粒，3∶1)转染293T细胞(购自CRL-3216)；
1.14四天后收取293T细胞上清，0.22μm滤膜过滤后，挂proA柱(GEHealthcare，17-0403-01)，2mL/min；
1.15使用AKTA pure(GE Healthcare，17-0403-01)洗脱抗体，然后用1M Tris(pH8.0)进行中和；
1.16将所得蛋白浓缩，换液为PBS溶剂；
1.17 SDS-PAGE电泳检测所获得蛋白(IgG形式以及ScFv-Fc形式)是否为抗体蛋白。
此株单克隆抗体命名为E-1C8(SEQ.ID NO.17，SEQ.ID NO.19及SEQ.ID NO.20)，为人源单克隆抗体；其轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、DKT(E-1C8 CDR-L2，AspLysThr)，和SEQ ID No.5，重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7，和SEQ ID No.8；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.1，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2；轻链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、和SEQ ID No.11；重链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、和SEQ ID No.14。
1.18 ELISA
包被200ng/孔的抗原蛋白于96孔ELISA板，100μL/孔，4℃过夜；200μL/孔PBS洗3遍；200μL/孔5％脱脂奶粉-PBST室温封闭1h；加入10倍浓度梯度稀释的E-1C8(ScFv-Fc形式以及IgG形式)，100μL/孔(起始浓度100μg/ml)，室温孵育1h；200μL/孔PBST洗3遍；加入与HRP-羊抗人二抗(ZSGB-BIO，ZB-2304)100μL/孔，室温孵育1h；200μL/孔PBST洗3遍；加入TMB显色液(Beyotime，P0209)50μL/孔，2min；加入2M H2SO4 50uL/孔终止反应；读取OD450数值；使用Graphpad Prism 5进行数据分析，计算出EC50。
结果如由图1所示，该抗体的两种形式都能够很好的结合GP蛋白，同时该抗体的IgG形式也能结合分泌型GP蛋白(sGP，NCBI GenBank：U23187.1，及ssGP，NCBI GenBank：NP_066248，构建至昆虫表达质粒表达获得)，表2示出了E-1C8的ScFv-Fc及IgG形式与埃博拉病毒GP的半数效应浓度EC50。
表2
实施例2抗原抗体亲和力测试
利用OCTET技术，将实施例1中得到的E-1C8的ScFv-Fc(4.125μg/mL)形式通过亲和作用固定到Protein A探针(PALL ForteBio，18-5010)上，固定500s，使响应值达到1-2nm，液相抗原蛋白埃博拉病毒GP按2倍比稀释(浓度范围3.125nM-200nM)。进行动力学参数测定，结合时间500s，解离时间500s。而后，利用Software计算亲和力，表3示出了E-1C8的ScFv-Fc形式与埃博拉病毒GP的亲和力测定结果，亲和力为1.26nM。
表3
实施例3抗体与细胞表面GP蛋白的IFC实验
在293T细胞(CRL-3216)中瞬时转染GP蛋白表达载体pEGFP-N1-GP(pEGFP-N1，BD Biosciences，#6085-1)(GENEray公司合成GP序列，NCBI GenBank：AHX24658.2两端引入XhoI，BamHI酶切位点，酶切插入pEGFP-N1，SEQ.ID NO.4)，24小时后使用实施例1中得到的E-1C1的ScFv-Fc形式作为一抗(10μg/mL，200μL)，与转染表达GP蛋白的293T细胞共孵育，然后使用Goat anti Human-PE荧光抗体(eBioscienceTM，12-4998-82，1：200，200μL)进一步染色，使用荧光显微镜进行观察拍摄，确定所筛选到的抗体与GP的原位结合活性，结果如图1所示，E-1C8与细胞表面表达的GP蛋白具有结合活性。
SEQ.ID NO.4(EGFP-N1-GP)：
ctcgagaccaccATGGGCGTTACAGGAATATTGCAGTTACCTCGTGATCGATTCAAGAGGACATCATTCTTTCTTTGGGTAATTATCCTTTTCCAAAGAACATTTTCCATCCCACTTGGAGTCATCCACAATAGCACATTACAGGTTAGTGATGTCGACAAACTAGTTTGTCGTGACAAACTGTCATCCACAAATCAATTGAGATCAGTTGGACTGAATCTCGAAGGGAATGGAGTGGCAACTGACGTGCCATCTGCAACTAAAAGATGGGGCTTCAGGTCCGGTGTCCCACCAAAGGTGGTCAATTATGAAGCTGGTGAATGGGCTGAAAACTGCTACAATCTTGAAATCAAAAAACCTGACGGGAGTGAGTGTCTACCAGCAGCGCCAGACGGGATTCGGGGCTTCCCCCGGTGCCGGTATGTGCACAAAGTATCAGGAACGGGACCGTGTGCCGGAGACTTTGCCTTCCATAAAGAGGGTGCTTTCTTCCTGTATGArCGACTTGCTTCCACAGTTATCTACCGAGGAACGACTTTCGCTGAAGGTGTCGTTGCATTTCTGATACTGCCCCAAGCTAAGAAGGACTTCTTCAGCTCACACCCCTTGAGAGAGCCGGTCAATGCAACGGAGGACCCGTCTAGTGGCTACTATTCTACCACAATTAGATATCAGGCTACCGGTTTTGGAACCAATGAGACAGAGTACTTGTTCGAGGTTGACAATTTGACCTACGTCCAACTTGAATCAAGATTCACACCACAGTTTCTGCTCCAGCTGAATGAGACAATATATACAAGTGGGAAAAGGAGCAATACCACGGGAAAACTAATTTGGAAGGTCAACCCCGAAATTGATACAACAATCGGGGAGTGGGCCTTCTGGGAAACTAAAAAAAACCTCACTAGAAAAATTCGCAGTGAAGAGTTGTCTTTCACAGTTGTATCAAACGGAGCCAAAAACATCAGTGGTCAGAGTCCGGCGCGAACTTCTTCCGACCCAGGGACCAACACAACAACTGAAGACCACAAAATCATGGCTTCAGAAAATTCCTCTGCAATGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGGAAGCTGCAGTGTCGCATCTAACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCTGAGGCAACTCAAGTTGAACAACATCACCGCAGAACAGACAACGACAGCACAGCCTCCGACACTCCCTCTGCCACGACCGCAGCCGGACCCCCAAAAGCAGAGAACACCAACACGAGCAAGAGCACTGACTTCCTGGACCCCGCCACCACAACAAGTCCCCAAAACCACAGCGAGACCGCTGGCAACAACAACACTCATCACCAAGATACCGGAGAAGAGAGTGCCAGCAGCGGGAAGCTAGGCTTAATTACCAATACTATTGCTGGAGTCGCAGGACTGATCACAGGCGGGAGAAGAACTCGAAGAGAAGCAATTGTCAATGCTCAACCCAAATGCAACCCTAATTTACATTACTGGACTACTCAGGATGAAGGTGCTGCAATCGGACTGGCCTGGATACCATATTTCGGGCCAGCAGCCGAGGGAATTTACATAGAGGGGCTAATGCACAATCAAGATGGTTTAATCTGTGGGTTGAGACAGCTGGCCAACGAGACGACTCAAGCTCTTCAACTGTTCCTGAGAGCCACAACTGAGCTACGCACCTTTTCAATCCTCAACCGTAAGGCAATTGATTTCTTGCTGCAGCGATGGGGCGGCACATGCCACATTCTGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGGCGTTATAATTGCAGTTATCGCTTTATTCTGTATATGCAAATTTGTCTTTggggatccACCGGTCGCCACCATGGTG。
实施例4抗体检测GP蛋白的Western Blot实验
GP蛋白制样(体积比4∶1与5*Loading buffer(Beyotime，P0015)混匀，沸水浴10min)，跑SDS-PAGE胶(5μg/mL，10μL)，转膜(硝酸纤维素膜，Thermo Fisher，IB301001)后，使用实施例1得到的E-1C8的IgG形式(10μg/mL，1mL)作为一抗孵育，室温1h，然后使用Goatanti Human-HRP(ZSGB-BIO，ZDR-5301，1∶2000，1mL)作为二抗孵育，室温1h，最后使用CN/DAB Substrate Kit进行显色(Thermo Fisher，34000，2mL)，结果如图3所示，所使用的E-1C8能够在Western Blot水平上检测GP蛋白。
通过上述实施例可以看出，本发明所述抗体来源于正常人PBMC，并且在ELISA、OCTET、IFC以及Western Blot试验中都能够很好的结合埃博拉病毒囊膜蛋白GP，因此具有一定的经济和社会意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 上海科技大学
<120> Zaire型埃博拉病毒检测抗体及其制备方法及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Pro Gly
20 25 30
Tyr Ala Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Lys Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Cys
100 105 110
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Trp Asp Trp Gly Glu Ile Val Val Val Pro
100 105 110
Ala Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
Tyr Ser Asn Ile Gly Pro Gly Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgagacca ccatgggcgt tacaggaata ttgcagttac ctcgtgatcg attcaagagg 60
acatcattct ttctttgggt aattatcctt ttccaaagaa cattttccat cccacttgga 120
gtcatccaca atagcacatt acaggttagt gatgtcgaca aactagtttg tcgtgacaaa 180
ctgtcatcca caaatcaatt gagatcagtt ggactgaatc tcgaagggaa tggagtggca 240
actgacgtgc catctgcaac taaaagatgg ggcttcaggt ccggtgtccc accaaaggtg 300
gtcaattatg aagctggtga atgggctgaa aactgctaca atcttgaaat caaaaaacct 360
gacgggagtg agtgtctacc agcagcgcca gacgggattc ggggcttccc ccggtgccgg 420
tatgtgcaca aagtatcagg aacgggaccg tgtgccggag actttgcctt ccataaagag 480
ggtgctttct tcctgtatga tcgacttgct tccacagtta tctaccgagg aacgactttc 540
gctgaaggtg tcgttgcatt tctgatactg ccccaagcta agaaggactt cttcagctca 600
caccccttga gagagccggt caatgcaacg gaggacccgt ctagtggcta ctattctacc 660
acaattagat atcaggctac cggttttgga accaatgaga cagagtactt gttcgaggtt 720
gacaatttga cctacgtcca acttgaatca agattcacac cacagtttct gctccagctg 780
aatgagacaa tatatacaag tgggaaaagg agcaatacca cgggaaaact aatttggaag 840
gtcaaccccg aaattgatac aacaatcggg gagtgggcct tctgggaaac taaaaaaaac 900
ctcactagaa aaattcgcag tgaagagttg tctttcacag ttgtatcaaa cggagccaaa 960
aacatcagtg gtcagagtcc ggcgcgaact tcttccgacc cagggaccaa cacaacaact 1020
gaagaccaca aaatcatggc ttcagaaaat tcctctgcaa tggttcaagt gcacagtcaa 1080
ggaagggaag ctgcagtgtc gcatctaaca acccttgcca caatctccac gagtccccaa 1140
tccctcacaa ccaaaccagg tccggacaac agcacccata atacacccgt gtataaactt 1200
gacatctctg aggcaactca agttgaacaa catcaccgca gaacagacaa cgacagcaca 1260
gcctccgaca ctccctctgc cacgaccgca gccggacccc caaaagcaga gaacaccaac 1320
acgagcaaga gcactgactt cctggacccc gccaccacaa caagtcccca aaaccacagc 1380
gagaccgctg gcaacaacaa cactcatcac caagataccg gagaagagag tgccagcagc 1440
gggaagctag gcttaattac caatactatt gctggagtcg caggactgat cacaggcggg 1500
agaagaactc gaagagaagc aattgtcaat gctcaaccca aatgcaaccc taatttacat 1560
tactggacta ctcaggatga aggtgctgca atcggactgg cctggatacc atatttcggg 1620
ccagcagccg agggaattta catagagggg ctaatgcaca atcaagatgg tttaatctgt 1680
gggttgagac agctggccaa cgagacgact caagctcttc aactgttcct gagagccaca 1740
actgagctac gcaccttttc aatcctcaac cgtaaggcaa ttgatttctt gctgcagcga 1800
tggggcggca catgccacat tctgggaccg gactgctgta tcgaaccaca tgattggacc 1860
aagaacataa cagacaaaat tgatcagatt attcatgatt ttgttgataa aacccttccg 1920
gaccaggggg acaatgacaa ttggtggaca ggatggagac aatggatacc ggcaggtatt 1980
ggagttacag gcgttataat tgcagttatc gctttattct gtatatgcaa atttgtcttt 2040
ggggatccac cggtcgccac catggtg 2067
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
His Ser Tyr Asp Asn Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
Ala Arg Glu Arg Trp Asp Trp Gly Glu Ile Val Val Val Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ile Thr Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Ala
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 10
Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 12
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 14
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 15
caggctgtgc tcactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagctactc taacatcggg ccaggctacg ctgtacagtg gtaccagcag 120
cgtccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataaga ccaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caggtctggc acctccgcct ccctggccat cagtgggctc 240
caggctgagg atgaggccgt ttattactgc cactcctatg acaacagcct gagtggttgg 300
gtgttcggcg gtgggaccca gctcaccgtt ttatgt 336
<210> 16
<211> 408
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 16
atggcacagg tgcagctggt gcaatctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg 60
aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgcga 120
caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtacagca 180
aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca 240
gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300
gaacgttggg attgggggga gattgtagta gtaccagctg ctataacccc ctactactac 360
tacggtatgg acgcctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 408
<210> 17
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggcacagg tgcagctggt gcaatctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg 60
aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgcga 120
caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtacagca 180
aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca 240
gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300
gaacgttggg attgggggga gattgtagta gtaccagctg ctataacccc ctactactac 360
tacggtatgg acgcctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggcggcggc 420
tctggcggag gtggcagcgg cggtggcgga tcccaggctg tgctcactca gccgtcctca 480
gtgtctgggg ccccagggca gagggtcacc atctcctgca ctgggagcta ctctaacatc 540
gggccaggct acgctgtaca gtggtaccag cagcgtccag gaacagcccc caaactcctc 600
atctatgata agaccaatcg gccctcaggg gtccctgacc gattctctgg ctccaggtct 660
ggcacctccg cctccctggc catcagtggg ctccaggctg aggatgaggc cgtttattac 720
tgccactcct atgacaacag cctgagtggt tgggtgttcg gcggtgggac ccagctcacc 780
gttttatgt 789
<210> 18
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagggcttt aaatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgcg 60
gcccagccgg ccatggcaca ggtgcagctg gtgcaatctg gggctgaggt gaagaagcct 120
gggtcctcgg tgaaggtctc ctgcaaggct tctggaggca ccttcagcag ctatgctatc 180
agctgggtgc gacaggcccc tggacaaggg cttgagtgga tgggagggat catccctatc 240
tttggtacag caaactacgc acagaagttc cagggcagag tcacgattac cgcggacgaa 300
tccacgagca cagcctacat ggagctgagc agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat 360
tactgtgcga gagaacgttg ggattggggg gagattgtag tagtaccagc tgctataacc 420
ccctactact actacggtat ggacgcctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 480
ggcggcggcg gctctggcgg aggtggcagc ggcggtggcg gatcccaggc tgtgctcact 540
cagccgtcct cagtgtctgg ggccccaggg cagagggtca ccatctcctg cactgggagc 600
tactctaaca tcgggccagg ctacgctgta cagtggtacc agcagcgtcc aggaacagcc 660
cccaaactcc tcatctatga taagaccaat cggccctcag gggtccctga ccgattctct 720
ggctccaggt ctggcacctc cgcctccctg gccatcagtg ggctccaggc tgaggatgag 780
gccgtttatt actgccactc ctatgacaac agcctgagtg gttgggtgtt cggcggtggg 840
acccagctca ccgttttatg tggcctcggg ggcctggtcg actacaaaga tgacgatgac 900
aaatagacta gtggccagga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga ggtggcggct 960
ctgaggagcg gttccggtgt ggctctggtt ccgtgatttg 1000
<210> 19
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaattcgcca ccatggagtt cggcctgagc tgggtgttcc tggtggccat catcaagggc 60
gtgcaatgcc agatggcaca ggtgcagctg gtgcaatctg gggctgaggt gaagaagcct 120
gggtcctcgg tgaaggtctc ctgcaaggct tctggaggca ccttcagcag ctatgctatc 180
agctgggtgc gacaggcccc tggacaaggg cttgagtgga tgggagggat catccctatc 240
tttggtacag caaactacgc acagaagttc cagggcagag tcacgattac cgcggacgaa 300
tccacgagca cagcctacat ggagctgagc agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat 360
tactgtgcga gagaacgttg ggattggggg gagattgtag tagtaccagc tgctataacc 420
ccctactact actacggtat ggacgcctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 480
gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc 540
ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 600
tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 660
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 720
tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggagccc 780
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 840
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 900
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 960
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1020
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1080
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1140
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1200
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1260
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1320
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1380
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1440
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgactcgag 1479
<210> 20
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaattcgcca ccatggcctg ggctctgcta ttcctcaccc tcctcactca gggcacaggg 60
tcctgggccc aggctgtgct cactcagccg tcctcagtgt ctggggcccc agggcagagg 120
gtcaccatct cctgcactgg gagctactct aacatcgggc caggctacgc tgtacagtgg 180
taccagcagc gtccaggaac agcccccaaa ctcctcatct atgataagac caatcggccc 240
tcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc aggtctggca cctccgcctc cctggccatc 300
agtgggctcc aggctgagga tgaggccgtt tattactgcc actcctatga caacagcctg 360
agtggttggg tgttcggcgg tgggacccag ctcaccgttt tatgtggtca gcccaaggct 420
gccccctcgg tcactctgtt cccgccctcc tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca 480
ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat 540
agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc accacaccct ccaaacaaag caacaacaag 600
tacgcggcca gcagctacct gagcctgacg cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac 660
agctgccagg tcacgcatga agggagcacc gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt 720
tcacaccacc accaccacca ctaactcgag 750

Claims (10)

1.一种Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，为人源单克隆抗体；其轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、DKT或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，和SEQ ID No.5或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.7或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，和SEQ ID No.8或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.2或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的轻链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.9或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.10或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、和SEQID No.11或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；重链框架区FR1、FR2和FR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.12或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、SEQ ID No.13或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列、和SEQ ID No.14或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体，其特征在于，所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID No.15或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列、和SEQ IDNo.16或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含SEQ ID No.15或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列、以及SEQ ID No.16或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列中的至少一个。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的上述表达载体。
7.权利要求1-4所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID No.15-SEQ ID No.20及上述序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列中的至少一个与表达载体连接，扩增，转染293T细胞，收取293T细胞上清，挂proA柱，洗脱，得到Zaire型埃博拉病毒检测抗体。
8.如权利要求7所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为哺乳动物表达载体。
9.如权利要求8所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物表达载体为pFuse-Fc和pCAGGS哺乳动物表达载体。
10.权利要求1-4所述的Zaire型埃博拉病毒检测抗体在制备对埃博拉病毒GP抗原具有亲和力、对埃博拉病毒的检测中的应用。
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CN105112375A (zh) * 2015-08-21 2015-12-02 浙江大学医学院附属第一医院 杂交瘤细胞株zjed0-02、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用
WO2016054598A2 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof

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