CN100401064C - 绘制并消除t细胞表位的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于确定蛋白质分子上可引起免疫反应的决定簇和表位的筛选方法。具体而言，本发明涉及在治疗性蛋白质中鉴定T细胞表位。最后，本发明涉及这样的组合方法，所述组合方法将使用表位绘制与由所述表位绘制法确定MHC II类配体并分别设计具有此类配体和表位的数量减少的序列类似物相一致。

Description

绘制并消除T细胞表位的方法
发明领域
本发明涉及免疫学领域。本发明提供了筛选蛋白质分子上可引起免疫反应的决定簇和表位的方法。具体而言，本发明涉及在治疗性蛋白质中鉴定T细胞表位。最后，本发明涉及这样的组合方法，所述组合方法将使用表位绘制与由所述表位绘制法确定MHC II类配体并分别设计具有此类配体和表位的数量减少的序列类似物相一致。
发明背景
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已开发了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)。在这些人蛋白具有免疫原性的情况下，可能发生了对这些蛋白的免疫耐受的破坏，否则对这些蛋白的免疫耐受将在这些受试者体内运行。
当人蛋白被作为替代治疗，例如在蛋白的组成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和许多其他疾病的遗传性疾病中，情况就不同了。在这些情况下，治疗学替代蛋白可能一开始就作为外来分子而产生免疫应答，并且当个体能够产生针对该治疗剂的免疫应答时，该治疗的功效将大打折扣。
不管该蛋白治疗剂被宿主免疫系统视作外来分子还是本来存在的对该分子的耐受被克服了，对该蛋白的免疫反应的机理是相同的。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。此类T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸残基序列。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。
MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用。人群中的每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。
针对治疗性蛋白的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。
T细胞表位鉴定是消除表位的第一步，然而，本领域中少有将表位鉴定和表位去除整合为一个方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置换除去预测的T细胞表位。然而，在该方案和其他基于计算的表位鉴定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)161：850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)17：555-561]中，预测的能够结合MHC II类分子的肽可能不会在所有情况下(尤其是在体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的作用。此外，对T细胞表位预测的计算方法通常不能预测DP或DQ限制性表位。
同样，例如用明确定义的MHC同种异型的B细胞系作为MHC II类结合表面的来源以测量合成肽结合MHC II类分子的能力的体外方法可以应用于MHC II类配体的鉴定[Marshall K.W.等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.)152：4946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫学杂志(J.Immunol.)145：1799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol)159：3238-3246]。然而，这些技术不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位，也不能确定结合肽能够起T细胞表位的作用。
最近利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合体的技术已经得到应用[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]。这些试剂和方法用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。
T细胞活化的生物学测定提供了一个解读受试肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的例子包括Petra等人用对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖进行测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图[Petra，A.M.等人(2002)免疫学杂志(J.Immunol.)168：155-161]。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行T细胞增殖测定导致明确了该毒素免疫显性的表位区[Reece J.C.等人(1993)免疫学杂志(J.Immunol.)151：6175-6184]。WO99/53038公开了一种方法，该方法利用分离的人免疫细胞亚型，促进它们的体外分化，在合成的目的肽存在时培养细胞，并测定培养的T细胞中任何诱导的增殖来确定受试蛋白的T细胞表位。同样的技术也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治疗杂志(J.Immunotherapy)23：654-660]描述过，在这两个例子中，该方法都用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶的T细胞表位。这种技术需要小心应用细胞分离技术和补充多种细胞因子的细胞培养基以得到所需的免疫细胞亚型(树突状细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)，并且无助于使用多种供体样品的快通量筛选。
在这些方法的一种改变形式中，Hiemstra等[Hiemstra，H.S.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：10313-10318]描述了鉴定可刺激已知T细胞的肽表位的方法，此方法对于在(自身)抗原未知的情况下检测其自身反应性T细胞克隆是极有价值的。
有许多上述例子和其他涉及测定体外T细胞活化事件(通常通过测定诱导的增殖反应进行)的改变形式的生物学试验。但是，这些方法无一提供了用于检测人源蛋白质中生物学相关表位的统一方案，也不易用于检测大量MHC同种异型中重要的表位。本发明用于提供此种方案，并提供了用于对特定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性肽、多肽或蛋白质进行鉴定和去除T细胞表位的基础。
总之，本发明涉及下述内容：
●在幼稚T细胞试验中使用一组合成肽绘制治疗蛋白质的免疫原性区，特别是治疗蛋白质为人蛋白质；
●在回忆试验中使用一组合成肽精细绘制治疗蛋白质的免疫原性区；
●在幼稚T细胞试验中使用一组完整蛋白质的变体以选择体外显示最小免疫原性的变体；
●在幼稚T细胞试验中使用一组合成肽变体以选择体外显示最小免疫原性的肽序列；
●使用T细胞刺激的生物学试验以选择在幼稚T细胞试验中刺激指数小于2.0、优选小于1.8的肽序列；
●使用T细胞刺激的生物学试验以选择在幼稚T细胞试验中刺激指数小于2.0、优选小于1.8的蛋白质变体；
●一种策略，其中T细胞系由事先接受治疗性蛋白质的个体发育而得，并且使用这些细胞系绘制所述治疗分子的免疫原性区；
●如上所述的策略，其中还与由事先接受治疗性蛋白质的个体发育得到T细胞系平行地发育B细胞系，并且组合应用这些细胞系绘制所述治疗分子的免疫原性区；
●与由事先接受治疗性蛋白质的同一个体发育得到T细胞系而平行地发育的B细胞系的用途，其在下一轮的T细胞刺激中用作自身APC的来源，或任选地用作合成肽结合试验的结合表面；
●使用分离自健康供体的PBMC，构建受试蛋白质的T细胞表位图谱，并且筛选方法涉及的步骤包括：i)抗原接触，通过体外使用合成肽或完整蛋白质免疫原培养，培养期间不超过7天；ii)添加IL-2，并且培养不超过3天；iii)将已接触过抗原的T细胞加入至自体已接受辐射的PBMC并用抗原再攻击，进一步培养4天；以及iv)测定T细胞活化，如用任一合适的方法测定增殖指数；
●使用分离自其中针对受试蛋白质或其衍生物已建立免疫反应的患者的PBMC，构建受试蛋白质的T细胞表位图谱，并且应用的筛选方法涉及的步骤包括：i)抗原接触，通过体外使用合成肽或完整蛋白质免疫原培养，培养期间不超过7天；ii)添加IL-2，并且培养不超过3天；iii)将已接触过抗原的T细胞加入至自体已接受辐射的PBMC并用抗原再攻击，进一步培养不超过4天；以及iv)测定T细胞活化，如用任一合适的方法测定增殖指数；
●使用多克隆或单克隆细胞系构建T细胞表位图谱，其中所述多克隆或单克隆细胞系来自健康供体的PBMC样本或来自对目标蛋白质已建立免疫反应的患者的PBMC样本。所述细胞系发育为免疫学上已接触抗原的状态是通过一轮或多轮的接触抗原步骤进行，为在IL-2+/-植物血凝素(PHA)或其他丝裂原刺激剂存在下培养扩增的细胞数。所述已接触抗原的细胞与单个的合成肽或包含多个合成肽的肽库接触，并使用任一合适的方法检测刺激并增殖的细胞系。如果由合并的肽免疫原检测到了刺激，则需要用单个的肽或较小的肽库并且进一步接触细胞进行下轮筛选以揭示刺激肽的身份；
●使用幼稚T细胞活化试验在蛋白质序列中绘制T细胞表位位置的相关方法，以及模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案；
●用于在蛋白质序列中定位T细胞表位的方法，其包括以下步骤：i)使用幼稚T细胞活化试验和合起来包含目标蛋白质序列的合成肽来鉴定可活化T细胞的表位区；ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案分析步骤(i)中鉴定的表位区，并由此在表位区中鉴定MHC II类配体；iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案鉴定表位区中包含的MHC配体的如下序列类似物，所述序列类似物不再结合MHCII类或者以较低的亲和性结合较少数量的MHC同种异型；iv)使用幼稚T细胞活化试验和完全包含在目标蛋白质中鉴定的表位区的合成肽或合起来包含在目标蛋白质中鉴定的表位区的合成肽，并在幼稚T细胞活化试验中与野生型(亲本)序列平行地测试序列类似物；
●根据上述方案的方法，其中步骤(ii)和(iii)使用WO 02/069232所教导的计算方法实施；
●根据上述方案的方法，其中幼稚T细胞活化试验使用来自约20个或更多不相关供体的PBMC细胞进行；
●根据上述方案的方法，其中当在两个或多个独立供体样本中观察到刺激指数分值约2.0时，则发现了T细胞表位的位置；
●根据上述方案的方法，其中当在两个或多个独立供体样本中观察到刺激指数分值约2.0时则发现了T细胞表位的位置，且其中可使用计算体系在同一序列位置中确定一个或多个MHC II类配体；
●根据上述方案的方法，其中计算体系是根据WO 02/069232所教导的方法；
●对促进免疫反应的能力降低的蛋白质序列的鉴定可使用前述方案中免疫学上已接触抗原的细胞和筛选方法实施，通过平行参照只包含野生型序列的肽库或完整蛋白抗原测试多个变体肽或完整蛋白抗原。选择相对于参照肽库或野生型蛋白质具有较小刺激指数的肽或蛋白质变体用于进一步分析；
●对促进免疫反应的能力增强的蛋白质序列或蛋白质制品的鉴定可使用前述方案中免疫学上已接触抗原的细胞和筛选方法实施，通过平行参照产生已知的体外免疫反应的肽库或完整蛋白抗原测试一个或多个肽或完整蛋白抗原。选择相对于参照制品显示出引起不同刺激指数特征的肽或蛋白质制品用于进一步分析，或可从产生过程中去除；
●在幼稚T细胞试验中能够引起刺激指数大于1.8、优选大于2.0的肽序列，并且选自任一治疗蛋白质；
●选自任一治疗蛋白质的在幼稚T细胞试验中能够引起刺激指数大于1.8、优选大于2.0的肽序列，其中对肽进行最小程度的修饰并在幼稚T细胞试验中进行测试，并且发现其刺激指数小于2.0；
●肽序列，其与野生型蛋白序列具有100％氨基酸同一性，并且能够在T细胞试验中引起刺激指数为1.8或者更大、优选大于2.0；
●蛋白质分子，其中已使用T细胞试验绘制了免疫原性区，然后进行修饰使得在T细胞试验中重新测试时，该经修饰的蛋白质引起的刺激指数小于亲本(未修饰的)分子，并且最优选地小于2.0。
发明祥述
根据本发明的第一个实施方案，提供了这样的方法，如果蛋白质以其未经修饰形式导入人类受试者，则由该方法可筛选所述蛋白质抗原中在其序列内存在的可引起T细胞活化免疫反应的决定簇。该方法因此提供了在对人具有治疗潜力的蛋白质中鉴定T细胞表位的预测手段，其中所述蛋白质为欲提供的用于治疗获得性疾病且可为人蛋白质。
尤其希望提供目标蛋白质的如下表位图谱，所述图谱与大范围可能的MHC同种异型相关。希望所述图谱有足够的代表性，使得可以设计或选择对大多数可能施用该蛋白质的患者引起T细胞免疫反应的能力消失或至少减小的经修饰蛋白质。因此在本发明的实践中，筛选方法所使用的来自原初供体PBMC的T细胞收集自具有足够免疫多样性的供体库，以提供在人群中至少大于90％并且优选地大于95％的MHC II类库(HLA-DR)的样本。在理想的情况下，代表等于大于99％是优选的，虽然认识到对达到该理想状况存在实际的限制。因此，如果欲对给定的合成肽检测幼稚T细胞反应，该肽实际上与来自多个分别供体的PBMC制品接触。供体的数量或文中较优选地描述为″供体库″实际上不可能小于20个不相关个体(根据他们的MHC II类单倍型进行预选择)。
术语″原初供体″在本发明上下文中是指获自个体的T细胞以前没有暴露于目标蛋白质或肽抗原，并且当蛋白质抗原是人蛋白质时，所述个体没有接受任何治疗性或外部来源性的该蛋白质。
因此，根据本发明的第一个实施方案，提供了研究免疫原性幼稚T细胞的T细胞表位绘制的方法。所述T细胞获自多个不同健康供体的外周血样本，对所述健康供体而言目标蛋白质可能为内源分子，但所述健康供体并未接受外部来源如治疗性施用的目标蛋白质。本试验使用体外培养的PBMC，通过本领域的常规方法并涉及将PBMC与目标蛋白质代表性的合成肽接触，经合适的孵育时间后，测定肽诱导的T细胞活化如细胞增殖。测定可以任何合适的方法进行，并且可使用3H-胸苷掺入法，由此易于通过仪器测定细胞内3H的量。将PBMC样本与合成肽接触而产生的细胞增殖程度与未用肽处理的PBMC样本相比较。也可参照一种或多种具有预期增殖作用的肽处理后的增殖反应。关于此，认为尤其有利的是使用具有已知MHC限制性的肽，尤其是对DP或DQ同种型具有MHC限制性的肽表位。
为了有利于对给定的目标蛋白质组成表位图谱，产生了一组代表蛋白质序列的合成肽。在本发明方案下的典型分析涉及使用含15个氨基酸残基的肽，这基于认识到含有不少于9个氨基酸残基的肽原则上是合适的肽。也可使用明显超过15个氨基酸残基的肽，但是可能的二级结构效应或细胞内加工的复杂性可影响肽诱导增殖反应的能力。为了对给定蛋白质的全长扫描，特别简便的方案是对每15个氨基酸残基制备合成肽，所述合成肽与下一个肽在序列上有12个氨基酸残基的重叠，即每一连续肽依次渐增地添加3个氨基酸用于分析。这样肽的任一特定相邻对将绘制目标蛋白质中连续的18个氨基酸序列。对于包含n个氨基酸残基的目标蛋白质，对于所述蛋白质完整扫描所需的15聚体合成肽数量为1+(n-12)/3。可考虑其它方案并同样有效。
使用如上概述并在文中的实施例中详细示出的方案，本发明人发现了可对来自不同健康供体个体的幼稚PBMC引起增殖反应的蛋白质序列区。所讨论的蛋白质序列为来自人完整蛋白质的序列串，对于该序列串预期具有免疫耐受，但在体外仍可证明引起替代免疫反应的能力。如果所讨论的蛋白质之一例如作为治疗剂施用时，该能力也可延伸应用至体内。具体地这些蛋白质为干扰素α2和干扰素β。这两种蛋白质均用于治疗，并且已报道了它们对患者所引起的令人注目的免疫原性反应[Russo，D.等(1996)，见上文；Stein，R.等(1988)，见上文；Myhr，K.M.等(2000)，Neurology 55：1569-1572；Bertolotto，A.等(2000)，Immunopharmacology 48：95-100]。本发明因此提供了用于阐明正常人蛋白质中表位区的概括性方案，并阐明了来自这些蛋白质的肽引起健康供体的幼稚PBMC体外增殖反应的能力。
在第一个实施方案中使用幼稚T细胞试验确定T细胞图谱的一个尤其有用方法在实施例1和2中提供，由此揭示了干扰素β(IFNβ)和干扰素α2(IFNα2)的免疫原性区。用于鉴定在体内为弱免疫原性的蛋白质中T细胞表位的尤其优选的方法在实施例3中描述。
在第二个实施方案中，本发明提供了对T细胞表位图谱的说明，此图谱可指导设计经修饰的蛋白质，由此所述分子的表位区被适当修饰，以至于它们不再能引起本发明方案的增殖反应，并且目的蛋白质因此对人产生较小的免疫原性。
根据该第二个实施方案，对蛋白质的合适修饰可包括特定残基的氨基酸替代或残基的组合。为了除去T细胞表位，优选在所预测的肽序列中合适的位点进行氨基酸替代以实现T细胞表位活性的减小或者消除。实践中，合适的位点优选等同于在MHC II类结合沟所提供的口袋之一中结合的氨基酸残基。最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代是替代为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替代为更亲水的残基。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内，所述位置为与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这可能对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的″口袋残基″的位置，而是在所述肽序列内的任意位点上进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的硅片上(insilico)技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。例如可考虑恢复变体分子结构或生物学活性的改变。此类补偿性改变也包括对多肽中特定氨基酸残基的删除或添加。
从蛋白质分子中去除表位的一个尤其有用的方法涉及使用文中示出的幼稚T细胞活化试验方案与硅片上技术的结合，其中所述硅片上技术根据在WO 02/069232(此处引用作为参考)中描述的方案而开发。
该软件在肽MHC II类结合的相互作用水平上模拟抗原呈递过程，以提供对任一特定肽序列的结合分值。对人群中存在的许多主要MHC II类同种异型测定此分值。由于该方案可测试任意肽序列，可在肽与MHC II类结合沟相互作用的能力方面预测氨基酸替换、添加或删除的结果。由此可设计含有与MHC II类相互作用并作为免疫原性T细胞表位发挥作用的肽的数量减少的新序列组合物。如果使用任一供体样本进行生物学测试可评估与最多4种DR同种异型的结合，那么硅片上的方法可使用大于40种同种异型同时测试相同的肽序列。实践中，该方法可指导新序列变体的设计，其中所述新序列变体在与多种MHC同种异型相互作用的能力方面有所降低。
通过举例说明应用表位鉴定和去除的结合方法，本申请提供了涉及设计人干扰素α(IFNα)的程序所得结果。全长人IFNα序列产生了一组51个15聚体肽(在实施例2的表2中列出)。T细胞试验可确定该分子内的三个免疫原性区(称为R1，R2和R3)，且根据WO02/069232方案的软件系统可在每一表位R1-R3中鉴定预测的MHC II类配体。而且，该系统可进一步鉴定在表位中导致所述肽序列和在该系统中代表的基本上所有MHC II类同种异型之间结合亲和性明显丧失的氨基酸替代。构建了一组合成肽，所述合成肽包含野生型表位区和其中MHC II类的结合通过氨基酸替代而去除的变体序列。所述肽用于幼稚T细胞活化试验，并对每一肽和供体PBMC样本的组合测定刺激指数。在所有情况下，如果供体样本对野生型肽产生反应，则变体肽不活化T细胞(图3)。
本发明的一个优选实施方案是使用经改进的T细胞活化试验，其中对T细胞反应的测定是在加入受试蛋白质或肽后的不同时间进行。该新型测试方法尤其用于检测完整蛋白质或弱免疫原性多肽的T细胞反应。所述新型试验方法抵消了T细胞试验混合物中组分的复杂性，其中所述混合物包含白细胞和不同分子(包括细胞因子)的混合。对任一受试蛋白质或肽，在所述试验中T细胞反应的动力学取决于多个因素，包括在T细胞试验混合物中T细胞的状态(例如，T细胞是幼稚T细胞还是记忆T细胞)、细胞因子在多个时间点时的浓度、以及由于一些因素(如特定的肽-MHC II类复合体浓度)产生明显T细胞增殖的速率。对于任一给定蛋白质或肽，在所述试验体系中T细胞增殖的峰位于加入蛋白质或肽至所述试验混合物的第7天前或后，这样在第7天时(标准试验时间点)T细胞增殖不明显。通过在一个时程期间例如在第4、5、6、7、8和9天测试T细胞增殖，则可检测T细胞反应，而不必在第7天检测。T细胞试验时程在实施例3中显示。对于完整蛋白质，T细胞试验时程提供了对T细胞免疫原性的灵敏分析，并因此提供了对蛋白质进行灵敏的免疫原性筛选。此外，如在实施例3中所述，该试验法也可用于检测氨基酸替代对免疫原性的效果。
将使用硅片上工具确定MHC II类配体并设计缺乏MHC II类配体的序列类似物与使用基于生物学的T细胞活化试验进行表位绘制和再检测相一致的组合方法是尤其有效的方法，并且是本发明最优选的实施方案。根据该最优选实施方案的概括性方法包括以下步骤：
i)使用幼稚T细胞活化试验和合成肽确定可活化T细胞的表位区，其中所述的合成肽合起来包含蛋白质的目标序列；
ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合而分析在步骤(i)中确定的表位区并因此确定表位区中MHC II类配体的计算方案；
iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合而确定在表位区中所包含的MHC配体的序列类似物的计算方案，其中所述序列类似物不再结合MHC II类或以降低的亲和力结合至较少数目的MHC同种异型；
iv)使用幼稚T细胞活化试验和合成肽，其中所述的合成肽包含全部或合起来包含在目标蛋白质中确定的表位区，并在幼稚T细胞活化试验中与野生型(亲本)序列相平行地测试所述序列类似物；
已知在WO 02/069232中所述的软件方案也可用于以高度确切定义对任一人蛋白质如干扰素而言所有包含可容许MHC类配体的肽的数据集合。对于如需要蛋白水解酶加工免疫原性肽和导致其体内呈递的其他生理步骤，下面这一点是清楚的，即整个肽库的相对小的子集具有最终的生物学相关。在此类情况下，本发明人建立的体外人T细胞活化试验可用于确定此类生物学相关肽。因此，对合成肽进行了测试，测试其引起体外培养的人T细胞产生增殖反应的能力。如果此类方法使用健康供体的幼稚人T细胞进行，本发明人已建立了在操作此试验时，刺激指数等于或大于2.0为一个有用的测定诱导增殖的参数。该刺激指数(SI)一般如下获得：所测定的针对受试肽的增殖分值(如使用3H-胸苷掺入时每分钟放射性的计数)除以未与受试肽接触的细胞增殖分值。不引起反应的肽产生的SI＝1.0，而在实践中SI值在0.8-1.2的范围内是常见的。为了确保所记录分值的可信性，可将许多技术方法结合入此类试验的操作中。一般所有的测定均至少一式三份进行，并计算平均分值。如果所计算的SI＝＞2.0，则可对一式三份中分别的分值检查存在偏离数据的证据。类似地，在每一试验板中可包括对照肽，其中所述对照肽预期对大多数PBMC供体样本为反应性的。流感血细胞凝集素307-319(序列：PKYVKQNTLKLAT)和衣原体HSP60肽(序列：KVVDQIKKISKPVQH)是尤其合适的对照肽，但也可使用许多其他的例子。所述试验应优选地也使用强的完整蛋白质抗原如匙孔血蓝蛋白，所有的PBMC样本对该抗原预期会显示SI明显大于2.0。
根据本发明的方案，实践中需要测试基本上具有相同肽序列的多种形式，以建立这样的修饰(单个氨基酸替代或一些其他变化或变化的组合)，所述修饰导致所述肽诱导T细胞活化效应的能力丧失或至少该能力较小。该需求通过使用许多不同的实践方法而满足，所述实践方法之一涉及最初筛选大量的变体并实施选择方案确定其中相对于其亲本(如野生型)肽序列而言诱导增殖的能力降低或缺乏诱导增殖能力的变体肽。此方法可完全使用幼稚PBMC样本进行，并同时(即平行地)进行表位绘制。应理解的是该方法不限于筛选合成肽，该方法也可开发用来筛选例如可能包含多种变体的完整蛋白质分子，其中所述的多种变体作为变体“文库”产生，从变体″文库″中选择目标成员。此类文库例如可通过本领域公知的重组方法产生，或可包含用合成方式例如应用组合化学的原理产生的文库。在任一情况下，本文中选自文库成员的目标特性为不能诱导PBMC制备物的增殖反应。
备选地，可用来自完全不同供体库的样本的幼稚PBMC筛选变体肽，即当希望很少或不诱导增殖时，可使用经修饰肽重复进行表位绘制。
进一步且尤其有利的方案涉及到在免疫回忆试验中测试经修饰肽诱导增殖效应的能力。这例如可如下实施：使用来自在最初的幼稚PBMC试验期间鉴定的已知反应性供体的PBMC，并使用合成肽(如在一个库中)或完整蛋白质刺激，然后在存在细胞因子如IL-2时孵育合适的时间。孵育后，使用合成的(经修饰)肽或经修饰的完整目标蛋白质再次刺激所述培养物，并且使用合适的方法测定增殖效应。本发明人将这种试验法归于″回忆″试验，之所以这样称呼是因为参与增殖反应的T细胞群体是在再次刺激期间活化。
回忆试验尤其用于对体内显示弱免疫原性的蛋白质或肽抗原确定T细胞表位，并且当特定氨基酸序列中的T细胞表位最初是通过其他方法如计算技术或生物学试验确定的时，所述回忆试验可提供所述表位存在的确切证据。在操作此类回忆试验时，从健康供体或对特定治疗已建立免疫反应的患者分离PBMC。有必要冻存多份自体PBMC，这样它们可在接下来的步骤中用作抗原呈递细胞(APC)。该试验的开始步骤是抗原接触步骤。典型且优选的方法需要向24孔板的每一孔中加入2-4×106个PBMC。向细胞中加入完整蛋白质或肽抗原或肽库，典型的浓度分别为1-10μg/ml和1-10μM(肽在肽库中的总浓度可为1μM)。最后的培养体积为2ml。将细胞孵育7天，在第7天加入10U/ml IL-2，并将细胞再孵育3天，接下来将细胞用于抗原的再攻击。
抗原的再攻击需要自体PBMC作为APC。将APC与完整蛋白质或合成肽抗原(例如浓度为1-10μg/ml)在37℃孵育1小时。APC的增殖能力最优选地用γ辐射破坏，例如在圆底96孔板(1×105个PBMC/孔)中使用4000拉德γ辐射。将1-10×104个已接触抗原的T细胞加至每一含有APC的孔中。建立未处理的对照反应是重要的，所述对照反应包含在不存在再攻击抗原时将已接触抗原的T细胞与经γ辐射的APC培养。孵育这些细胞4天，然后进行脉冲增殖评估，例如3H-胸苷掺入试验。应理解的是此方法同样可用富集的细胞群或纯化的细胞群进行。
在第三个实施方案中，提供了这样的方法，可由此方法筛选蛋白质抗原序列中存在的可在个体中引起T细胞免疫反应的决定簇，对所述个体而言，该待施用的目标蛋白质用于治疗遗传(组成型)疾病，但实际上，由于个体中的遗传缺陷，所述蛋白质已成为外来蛋白。从这种意义上说，该蛋白很可能代表体内的强抗原，并且本发明人已经建立了现在可从这些个体的PBMC体外建立多克隆或单克隆T细胞系，并且这些细胞系可以用作蛋白中T细胞表位作图的有效细胞系。这基本上可以前面所述的回忆试验相同的方式完成，不同之处在于将T细胞进行几轮抗原体外刺激后立即在IL-2存在下增殖而完成。为了建立多克隆T细胞系，2-3轮抗原刺激通常足够产生大量抗原特异性细胞。这些细胞被用于筛选大量的合成肽(例如以肽库的形式)，并且它们可以低温保藏以备用。在包括将抗原和PBMC共同孵育7天后的最初一轮完成后，随后在最优选的作为抗原呈递细胞的自体经照射PBMC存在下，进行抗原的再次攻击。这些轮的抗原选择进行3-4天，并且引入包括用IL-2刺激的增殖阶段，可以每3天加入IL-2，总的时间约9天。最后的再次攻击用已经“静息”的T细胞(即没有被IL-2刺激已经约4天了)进行。如前所述使用最优选的自体抗原呈递细胞，用抗原(例如合成肽或完整蛋白)刺激这些细胞约4天，随后测量增殖应答(如果有的话)。
所以，第三个实施方案的方法包括产生来自患有目标疾病个体的PBMC样品的T细胞系或者寡克隆培养物、用合成肽或者完整蛋白制品体外刺激所述细胞系或培养物、体外测定单独的合成肽或蛋白的增殖效果(如果存在)、产生单个合成肽或完整蛋白的修饰变体、重新检验所述修饰肽或蛋白的促进T细胞系或培养物产生显著增殖性应答的后续能力。
尤其有用的是建立个体的寡克隆培养物的T细胞系，在这些个体中已经开始了先前的治疗性替代治疗并且该替代治疗已经导致对该治疗性蛋白的免疫应答的诱导。关于此主题的一个明显例子是接受血友病A治疗的个体，其对治疗性的因子VIII具有明显可测定的抑制性抗体滴度。在本发明的方案中，尤其希望利用来自这类所谓的“抑制剂病人(inhibitor patient)”的PBMC样品，因为预期有许多这些个体的T细胞库所定义的因子VIII蛋白的表位图将代表能够进行体内呈递的大多数优势肽表位。在这种意义上说，来自在先前显示出免疫应答的病人的PBMC构成了体内接触治疗性蛋白的产物，并且在本发明的方案中尤其有用。文中的实施例4详细描述了对人FVIII进行表位绘制的方法，其中使用了来自健康人供体的幼稚T细胞和来自血友病A患者的PBMC。
如果使用来自以前接受免疫原性外源蛋白的个体的PBMC细胞系一般而言构成了回忆试验法，所述回忆试验还提供了实际的益处，在于对任一特定的刺激肽或蛋白质具有较大地提高增殖反应幅度的能力。所述回忆试验减小了进行增殖测定时会遇到的技术挑战，并且在此情况下，如果对目标蛋白质确定了多个表位，该回忆试验可能能定义免疫优势表位的可能等级。虽然如文中所示的对于特别大的蛋白质如因子VIII情况确实如此，但预计小的人蛋白质分子(如小于200个氨基酸残基)可具有多个或复合的(即重叠的)T细胞表位。
在本发明的第四个实施方案中，提供了将前述的试验法应用于筛选成批的治疗性生物蛋白质的方案。该筛选方法的目的在于证实所述受试生物蛋白质的免疫原性谱与例如下列尤其有用的情形的一致性，所述情形为所述生物蛋白质的产生方法被一些参数改变且虽然所测定的所述蛋白质的物理特性可能在被接受的范围内，也考虑到所述蛋白质的潜在免疫原性特性可能已经改变。因此为了预测对目标分子的任一新制备物产生的免疫原性反应，文中所示的方法可尤其有效地提供此类筛选方法。
因此根据第四个实施方案，作为对目标蛋白质进行表位绘制方法的一部分而获得的T细胞系(寡克隆或单克隆)或任选地或此外一组幼稚PBMC制备物可用于测试受试蛋白质的体外免疫原性，其中针对所述幼稚PBMC制备物已建立了一群已知的反应性制备物，并且将针对受试蛋白质的反应分值与所述蛋白质的参照物或″金标准″制备物比较。在此方面，如果使用T细胞系，尤其优选地使用来自以前显示对参照蛋白质产生免疫反应的受试者的T细胞系。此类T细胞系预期在体外对抗原刺激产生高的刺激指数分值，并可能代表所述蛋白质中最生物相关的和免疫优势表位。根据第四个实施方案，这些细胞系提供了用于表位丧失/改变的指示。相反，根据第四个实施方案，包含已知的一组对目标蛋白质产生反应性同种异型的多组幼稚PBMC提供了从头表位产生的指标，并且在预测不需要的临床免疫原性反应中同样有用，其中所述表位存在于受试产物蛋白质中。
术语“T细胞表位”根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHC II类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
此处及所附权利要求书中引用的术语″肽″为包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(定义在下文中)连接。有20种不同的天然存在氨基酸参与肽的生物产生，它们可以以任何数目及任意顺序连接形成肽链或环。用于肽生物产生中的天然存在氨基酸均具有L-构型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或两种不同构型的氨基酸的各种组合通过常规的合成法制备合成肽。某些肽仅包含为数不多的氨基酸单元。短肽，如具有少于10个氨基酸单元的短肽，有时称为“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸残基，例如高达100个或更多个残基，被称为“多肽”。按照惯例，认为“多肽”可为包含三个或多个氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常为特定类型的“短”多肽。因此，如此处所用，谈及“多肽”时也包括寡肽。而且任何谈及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一种不同排列都将形成不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数及因此形成的不同蛋白质的数目实际上是不受限的。
本发明现在通过下列实施例阐述。所述实施例和以上部分谈及了下列图：
图1显示了IFNβ中的免疫原性区，并详细描述了这些区域中可刺激人幼稚T细胞的肽序列。
图2提供了显示可促进人幼稚T细胞体外增殖的IFNβ肽的列表。对于供体中的两个供体，反应记录为来自区域R1或R2的多个重叠肽。对表位区R1或R2中绘制的单个合成肽产生的反应分值来自6个供体。
图3提供了来自时程T细胞活化试验的示例性数据。对来自IFNαR1、R2和R3表位区的合成肽和含有氨基酸替代的肽序列类似物，图中绘制了平行测试的刺激指数(SI)与时间(天)之间的关系。
实施例1
MHC、肽和T细胞受体(TCR)的相互作用提供了T细胞识别的抗原特异性的结构基础。T细胞增殖测定检验肽与MHC的结合和TCR对MHC/肽复合体的识别。本实施例的体外T细胞增殖测定包括刺激含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞的外周血单核细胞(PBMC)。用合成肽抗原进行体外刺激，在某些实验中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)测量刺激的T细胞增殖并对洗涤的固定细胞进行闪烁计数估计掺入的3H-Thy的存在。
从国家血液部门(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存时间小于12小时的人血血沉棕黄层。从Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培养初级人淋巴细胞的无血清AIM V培养基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷兰)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
对血沉棕黄层轻微离心从血浆和血小板中分离出红血球和白血球。除去并扔掉顶层部分(含有血浆和血小板)。在磷酸盐缓冲液(PBS)中1∶1稀释红血球和白血球并铺在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根据生产商推荐的条件进行离心并从血清+PBS/菲可帕克界面收获PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通过离心收集。除去并扔掉上清液，将PBMC沉淀重新悬浮在50ml PBS中。通过离心再次沉淀细胞并抛弃PBS上清液。用50ml AIM V培养基重新悬浮细胞并在此时计数并用锥虫蓝染料排除估计存活率。再次离心收集细胞并抛弃上清液。细胞重新悬浮以低温保藏，密度为3×107/ml。保藏培养基为90％(v/v)热失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。将细胞转移到受调节的冰冻容器(Sigma)并且在转移到液氮以长期保存前将其置于-70℃过夜。当需要使用时，在37℃水浴中快速解冻然后转移到10ml预热的AIMV培养基。
在96孔平底板(PBMC密度为2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下将PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脉冲。对于本研究，产生并使用以3个氨基酸递增的重叠并覆盖IFNβ全序列的合成肽(15聚体)。肽标识编号(ID#)和序列在表1中给出。
表1：IFNβ肽
Figure C0381345100231
Figure C0381345100241
每种肽都单独地针对从20个未接触抗原供体中分离的PBMC进行筛选。在每个供体测定中使用先前已经显示具有免疫原性的两种对照肽和一种强的非记忆抗原KLH。在本研究中使用的对照抗原为流感血细胞凝集素307-319(序列：PKYVKQNTLKLAT)；衣原体HSP60肽(序列：KVVDQIKKISKPVQH)和匙孔血蓝蛋白。
将肽溶解于DMSO中使其终浓度为10mM，然后将这些贮存液在AIM V培养基中稀释到原来的1/500(终浓度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其终浓度为2和20μM(体积为100μl)。通过锥虫蓝染料排除估计解冻的PBMC的存活率。然后将细胞重新悬浮(密度为2×106个细胞/ml)，向每个含有肽的孔中移入100μl(2×105个PBMC/孔)。在每个肽浓度下测定一式三份的孔培养物。在5％CO2、37℃的潮湿空气中孵育平板7天。用1μCi 3H-Thy/孔的脉冲细胞18-21小时后收获到过滤垫上。用Wallac微量培养板β顶层平板计数器(Perkin Elmer)或类似仪器测定CPM值。结果表达为刺激指数，其中刺激指数(SI)为用受试肽的增殖值(如放射性的每分钟计数)除以未接触受试肽的细胞所测定的值进行确定。
使用T细胞增殖试验对IFNβ序列中的T细胞表位进行绘制，结果确定了2个免疫原性区，为R1和R2，每一免疫原性区通过4种重叠肽的反应确定(图1)。
实施例2
使用实施例1的方法对获得人蛋白干扰素α2(IFNα)的表位图谱。在所用方法中，除了合成肽为如表2(下文)所示和与PBMC制备物的孵育浓度为10μM不同外，其他方面为如实施例1的方法。
在IFNα序列中对T细胞表位的绘制，结果确定了3个免疫原性区，为R1、R2和R3。它们是分别对如图2所示的7个、4个和5个重叠肽产生T细胞增殖而确定的。认为区域3包含潜在的免疫优势T细胞表位，因为在对IFNα起反应的供体中，有三分之二记录到对该区域起增殖反应。
表2：IFNα肽
  肽ID编号   IFNα2b；15聚体序列   肽ID编号  IFNα2b；15聚体序列
  1   CDLPQTHSLGSRRTL   28  DKFYTELYQQLNDLE
  2   PQTHSLGSRRTLMLL   29  YTELYQQLNDLEACV
  3   HSLGSRRTLMLLAQM   30  LYQQLNDLEACVIQG
  4   GSRRTLMLLAQMRRI   31  QLNDLEACVIQGVGV
  5   RTLMLLAQMRRISLF   32  DLEACVIQGVGVTET
  6   MLLAQMRRISLFSCL   33  ACVIQGVGVTETPLM
  7   AQMRRISLFSCLKDR   34  IQGVGVTETPLMKED
  8   RRISLFSCLKDRHDF   35  VGVTETPLMKEDSIL
  9   SLF SCLKDRHDFGFP   36  TETPLMKEDSILAVR
  10   SCLKDRHDFGFPQEE   37  PLMKEDSILAVRKYF
  11   KDRHDFGFPQEEFGN   38  KEDSILAVRKYFQRI
  12   HDFGFPQEEFGNQFQ   39  SILAVRKYFQRITLY
  13   GFPQEEFGNQFQKAE   40  AVRKYFQRITLYLKE
  14   QEEFGNQFQKAETIP   41  KYFQRITLYLKEKKY
  15   FGNQFQKAETIPVLH   42  QRITLYLKEKKYSPC
  16   QFQKAETIPVLHEMI   43  TLYLKEKKYSPCAWE
  17   KAETIPVLHEMIQQI   44  LKEKKYSPCAWEVVR
  18   TIPVLHEMIQQIFNL   45  KKYSPCAWEVVRAEI
  19   VLHEMIQQIFNLFST   46  SPCAWEVVRAEIMRS
  20   EMIQQIFNLFSTKDS   47  AWEVVRAEIMRSFSL
  21   QQIFNLFSTKDSSAA   48  VVRAEIMRSFSLSTN
  22   FNLFSTKDSSAAWDE   49   AEIMRSFSLSTNLQE
  23   FSTKDSSAAWDETLL   50   MRSFSLSTNLQESLR
  24   KDSSAAWDETLLDKF   51   FSLSTNLQESLRSKE
  25   SAAWDETLLDKFYTE
  26   WDETLLDKFYTELYQ
  27   TLLDKFYTELYQQLN
实施例3
进行时程T细胞活化试验的方法
进行时程T细胞活化试验的一般性方法包括以下步骤：
1.每一供体融化1管PBMC。
2.将细胞重悬为2-4×106个细胞/ml(在AIM V中)。
3.分别将1ml转移至24孔板中的3个孔(给出的终浓度为2-4×106个细胞/孔)，因为通常用于测试抗原的2个不同浓度并与无抗原处理对照比较(如10-50μg/ml蛋白质或1-5μM肽)。
4.制备抗原母液，对蛋白质通常为100μg/ml，对肽通常为2-10μM。将1ml抗原加至每一孔中，产生终浓度为10-50μg/ml蛋白质或1-5μM肽。
5.孵育5天。
6.通过吸打将细胞温和重悬于2ml培养物中，并且对每一培养条件取出100μl细胞并置于96孔板(圆底)的一个孔中，对每一培养条件重复该过程3次(在每个时间点，对每一培养条件总共取出了300μl)。
7.对96孔板的每一细胞孔加入在100μlAIM V中的1μCi/孔3H[Thy]。
8.过夜孵育并收获细胞。
9.重复第6、7和8天(根据需要可包括第9天)的步骤6-8。
10.对每一抗原进行SI确定并绘制SI对时间的点阵图。
图3示出了对跨过干扰素α2免疫原性区域(参见实施例2)的长肽进行免疫原性时程试验的代表性结果。该新的时程方法尤其用于分析完整蛋白以筛选T细胞免疫原性(SI＞1.8)并分析在该蛋白质内进行的氨基酸修饰对免疫原性的影响。
实施例4
建立T细胞系和克隆的方法
外周血单核细胞(PBMC)分离自血友病患者，并在液氮中低温贮存。血液样本的提供获得患者的知情同意并取得了Addenbrooke′s HealthCare Trust当局道义上的批准。
在大体积培养物中先用FVIII刺激抗原特异性T细胞，然后用几轮IL-2诱导的扩增而建立T细胞系。最初于24孔板中将在2ml含有4μg/mlFVIII(RefactoTM)的AIM V培养基中的2×106个PBMC进行孵育(在37℃的湿润环境，含5％CO2)。孵育7天后，加入100U/ml IL-2并继续培养3天。在10天的抗原/IL-2刺激结束后收集并计数T淋巴母细胞。为了保有抗原特异性，将T淋巴母细胞进行第二轮的抗原刺激，使用经γ射线照射的自体PBMC作为抗原呈递细胞。通过将24孔板中的1×106个自体PBMC/孔与4μg/ml FVIII在0.75ml AIM V(含5％热灭活的人AB血清)孵育1小时，然后进行4000拉德的γ-照射实施。将在0.25ml AIM V中的4×105个细胞/ml自体T淋巴母细胞加至经γ-照射的抗原呈递细胞(已用FVIII预孵育过)，并培养3天。T淋巴母细胞用100U/ml IL-2刺激3天而扩增；然后每3天向培养物提供新鲜的IL-2(终浓度为100U/ml)，共进行9天。为了确保所有扩增的T淋巴母细胞为抗原特异的，进行了第3轮抗原刺激，其中收集T淋巴母细胞并以4×105个细胞/ml重悬于AIM V培养基中。如所述的那样，事先将24孔板中的1×106个经γ-照射的自体PBMC与4μg/mlFVIII在0.75ml AIM V(含5％热灭活的人AB血清)孵育1小时从而产生抗原呈递细胞，将在0.25ml AIM V中的4×105个细胞/ml自体T淋巴母细胞加至经γ-照射的抗原呈递细胞并孵育3天。在T淋巴母细胞收获并用于筛选肽库前3天进行最后的10U/ml IL-2扩增。
自大体积培养物克隆
用FVIII抗原第3次刺激后，收获并重悬T淋巴母细胞，系列稀释至细胞密度为4×102-1×104个细胞/ml(2×最终培养物密度)。融化自体PBMC并在聚丙烯管中重悬至2×106个细胞/ml(2×最终培养物密度)。然后将PBMC暴露于4000拉德γ-射线照射，并用作抗原呈递细胞，通过有限稀释选择抗原反应性T细胞克隆。经γ-射线照射的抗原呈递细胞(终细胞密度为1×106个细胞/ml)与T淋巴母细胞(终细胞密度为2×102-5×103个细胞/ml)、1-l0μg/ml FVIII抗原和100U/ml IL-2混合。通过在Terasaki板的每一孔中加入APC、T淋巴母细胞、FVIII和IL-2的20μl混合物建立T细胞克隆。用Terasaki板中2-50个T淋巴母细胞/孔进行有限稀释克隆。
选择和维持T细胞克隆
T淋巴母细胞与FVIII抗原、IL-2和经γ-照射的自体抗原呈递细胞孵育约14天。在鉴定了含有确切显示细胞生长的孔后，将T淋巴母细胞圆底96孔板的含有1×105个经γ-照射的同种异体PBMC、100U/ml IL-2和1μg/ml植物血凝素(PHA)、终体积为200μl AIM V(含有1％热灭活的人AB血清)的单独孔中。当细胞汇片时将T细胞克隆分开，并最终转移至24孔板的含有1×106个经γ-照射的同种异体PBMC(饲养细胞)、100U/ml IL-2和1μg/ml植物血凝素(PHA)、终体积为2ml AIM V(含有1％热灭活的人AB血清)的单独孔中。T细胞克隆的常规维持涉及每2-3周(根据细胞生长确定)用新鲜的PHA和同种异体饲养细胞刺激和一周两次用100U/ml IL-2刺激。只有证实为FVIII特异的T细胞克隆扩增，并将所述T细胞克隆用于筛选FVIII肽。
自体B细胞的EBV转化
通过将3ml经过滤(0.45μl)B95.8上清加入4×106个PBMC并于37℃孵育1小时，使PBMC制备物中的B细胞永生化，以产生B淋巴母细胞样细胞系(BLCL)。沉淀PBMC并重悬于含有5％热灭活胎牛血清(FCS)和1μg/ml环孢菌素A的2ml RPMI中。孵育7天后，将1ml的培养基替换为含有5％FCS和2μg/ml环孢菌素A的新鲜RPMI(给出的终浓度为1μg/ml环孢菌素A)。在第14天和第21天重复该替换方案，之后根据需要使用含有5％FCS的RPMI将细胞分开，并在组织培养瓶中扩大培养。
用T细胞系/克隆筛选FVIII肽
合成长度为15个残基并且通过以12个氨基酸与前一个肽重叠而递增的肽(Pepscan，Netherlands)。肽最初以10mM溶解于100％二甲基亚砜(DMSO)中贮存。产生肽库用于同时筛选针对FVIII特异的T细胞系的大量肽。将肽库组织为每一库包含有下一个库的重叠肽，通过这种途径，2个重叠肽的T细胞表位导致诱导2个分别库的增殖。每一库一般由8个肽组成，对每一肽测试1或5μM。
通过将1×105个PBMC或BLCL重悬于50μl AIM V培养基并接下来加至圆底96孔板的每一孔中，从而自体PBMC(对于T细胞系)或EBV转化的BLCL(对于T细胞克隆)被用作抗原呈递细胞。每一肽库以两种浓度(1或5μM)加入孔中，一式三份。将抗原呈递细胞与肽库在37℃孵育1小时，然后暴露于4000拉德γ-射线照射。当BLCL(而不是经γ-照射的自体PBMC)用作T细胞克隆的抗原呈递细胞时，将BLCL用1μg/ml丝裂霉素C 37℃预处理1小时，然后用AIM V洗4次。然后将抗原特异性T细胞系或T细胞克隆以5×104个细胞/孔加入并孵育3天。在第3天，每一孔用1μCi[3H]-胸苷脉冲最少8小时。将板收获至滤垫上后，用Wallac微孔板β计数仪测定cpm/孔。
用来自健康供体的PBMC进行幼稚T细胞表位绘制
来自40个HLA-DR健康供体的血液用于分离PBMC，所得PBMC用于筛选2种浓度(1和5μM)的单独FVIII肽。由于来自每一供体的PBMC数不足以筛选所有的FVIII肽，将供体分成2组，其中第1组的20个供体用于筛选分子中前一半的肽，而第2组供体用于筛选剩余的肽。根据所表达的MHC II类同种异型选择供体，以在世界人口中覆盖大量的同种异型。使用合适的方法检测MHC同种异型。
使用市售试剂体系(Dynal，Wirral，UK)试验所有PBMC样本的组织型别。试验根据供应商推荐的方法和标准的补充试剂以及琼脂糖电泳体系进行。
PBMC含有生理量的幼稚T细胞和抗原呈递细胞。这些细胞的使用密度为2×105个细胞/孔(96孔平底板)，用于对一式三份的在200μl培养物中的1和5μM肽进行筛选。细胞与肽在37℃孵育6天，然后每一孔用1μCi[3H]-胸苷脉冲最少8小时。将板收获至滤垫上并用Wallac微孔板β计数仪测定cpm/孔。
表3显示了使用来自血友病患者的T细胞系和来自健康个体的幼稚T细胞制备物产生的人B结构域缺失的FVIII表位图谱。如果将T淋巴母细胞和来自T细胞的幼稚PBMC用于鉴定含有T细胞表位的肽库，那么接下来对这些肽库进行解码，以确定含有T细胞表位的单独肽。
表3
  残基#<sup>*</sup> 肽序列
  196   ILLFAVFDEGKSWSH
  406   SYKSQYLNNGPQRIG
  415   GPQRIGRKYKKVRFM
  511   YKWTVTVRDGPTKSD
  610   ASNIMHSINGYVFDS
  634   VAYWYILSIGAQTDF
  817   MSSSPHVLRNRAQSG
  1009   CNIQMEDPTFKENYR
  1117   STLFLVYSNKCQTPL
  1204   ISQFIIMYSLDGKKW
  1251   IARYIRLHPTHYSIRSTLRM
序列编号是根据B结构域缺失的序列进行的
实施例5：
计算方案
有多种因素对决定蛋白或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一个化合物。
连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：
Figure C0381345100311
由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是每一酰胺平面绕共有Cα键的转角。此后术语″转角″和″扭转角″是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地规定了多肽链的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和Ψ角的惯例，即在给定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是Ψ角的定义。参见Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。
本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHCII类分子结合沟的主要口袋1锚定位点对特定氨基酸侧链具有设计好的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.J.Immunol.152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位相关的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。
将本发明具体化的计算机方法描绘出肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选约两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予大约处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3中的描述计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。在这一方面本发明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-细胞表位的肽区域。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变MHC II类的结合特性。
依照本发明的另一方面，可利用考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用的更复杂计算方法来更精确地预测T-细胞表位。根据这一方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHCII类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸选项中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(″PDB″)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.&Blundell TL.1993.J.Mol Biol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.San Diego，Ca.)来制备。也可以应用其他的建模方法。
本发明的方法与下述的其他计算方法有着显著的不同，这些方法在于：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样利用相对小的MHC II类分子亚组)然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变体造成仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，故其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。
利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中存在的主链构象，从而导致对肽结合的预测不准确。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，但为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C″-α位点的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C″-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。
肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8
Figure C0381345100361
在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4
Figure C0381345100371
的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1到2处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用
Figure C0381345100374
评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(
Figure C0381345100375
，H.J.J.Comput Aided Mol.Des.8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(
Figure C0381345100376
，H.J.J.Comput Aided Mol.Des.12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的
Figure C0381345100377
评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(″PDB″)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述
Figure C0381345100378
函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的
Figure C0381345100379
评分函数评估结合能。在经修饰的评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(EVdW)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR＜＝TOL        则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR＜＝0.4+TOL    则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR＞0.4+TOL      则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα＜30°        则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα＜＝80°      则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα＞80°        则f2(Δα)＝0
Figure C0381345100392
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当时           fpcs＝β或
当
Figure C0381345100395
时           fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的
Figure C0381345100396
评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑1Lf(r1L)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(r1L)：
当r1L＜＝R1时            f(r1L)＝1
当R2＜r1L＞R1时          f(r1L)＝(r1L-R1)/(R2-R1)
当r1L＞＝R2时            f(r1L)＝0
其中：R1＝r1 vdw+rL vdw+0.5
R2＝R1+3.0
r1 vdw是原子l的范德华半径
rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00
Figure C0381345100401
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.161：269-288(1982))，LUDI(
Figure C0381345100411
H.J.J.Comput Aided Mol.Des.8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.等.J.Comput.Chem.4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-3064313-9。

Claims (18)

1.使用外周血单核细胞，即PBMCs，对野生型蛋白质或其片段构建T细胞表位图谱的方法，其包括下列步骤：(i)扫描野生型蛋白质或其片段的全长相邻序列，产生预定统一的氨基酸残基数的连续合成肽片段，其中每一合成肽片段以这样的方式与下一合成肽片段重叠，每一连续肽片段依次渐增地添加至少3个氨基酸残基用于分析；(ii)通过将步骤(i)中产生的合成肽片段与来自PBMCs的T细胞孵育并培养进行体外抗原接触；(iii)用细胞因子处理并培养已接触抗原的T细胞；(iv)将已接触抗原的T细胞加至自体的经照射PBMCs，并进行与所述合成肽片段的新一轮接触和培养；(v)通过事先选择的时程法在T细胞增殖试验中测定T细胞反应；以及(vi)通过选择并集中引起根据步骤(v)测定的T细胞反应的那些样本肽片段，产生野生型蛋白质的T细胞表位图谱。
2.权利要求1的方法，其中包含T细胞的PBMCs分离自之前没暴露于所述野生型蛋白质、其片段或肽抗原的多个不同健康个体。
3.权利要求2的方法，其中PBMCs来自代表多于90％MHC II类库的具有足够免疫学多样性的供体个体库。
4.根据权利要求1的方法，其中包含T细胞的PBMCs分离自其体内已对野生型蛋白质或其片段建立了免疫反应的个体。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中个体为人，且野生型蛋白质为人蛋白质。
6.根据权利要求1的方法，其中所述重叠的合成肽片段包含9-15个氨基酸残基。
7.权利要求6的方法，其中所述合成肽片段包含15个氨基酸残基。
8.权利要求7的方法，其中2个连续的肽片段重叠3个氨基酸残基。
9.根据权利要求1的方法，其中细胞因子为IL-2。
10.根据权利要求1的方法，其中时程法为在多个不同的时间点对每一合成肽片段测定免疫原性刺激指数并绘制免疫原性刺激指数对时间的点阵图。
11.根据权利要求1的方法，其中特定合成肽片段的T细胞反应是通过其免疫原性刺激指数确定的，所述免疫原性刺激指数是通过用对受试肽片段测定的增殖分值除以对未与受试肽片段接触的细胞测定的分值获得的。
12.权利要求11的方法，其中所述刺激指数大于2。
13.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的方法，其中野生型蛋白质为治疗性蛋白质。
14.用于制备来自亲本野生型蛋白质的免疫原性经修饰蛋白质的方法，其中经修饰的蛋白质具有的氨基酸序列不同于所述野生型蛋白质的氨基酸序列，且当其暴露于给定物种的免疫系统时显示免疫原性低于野生型蛋白质；所述方法包括以下步骤：(i)确定亲本野生型蛋白质或其部分的氨基酸序列；(ii)在所述野生型蛋白质的序列中鉴定一个或多个潜在的T-细胞表位；(iii)通过在最初确定的所述野生型蛋白质的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基而设计新的序列变体，所述变体通过某种方式修饰，以实质上降低或去除所述野生型蛋白质的T细胞表位序列的活性或数量和实质上降低能与来自所述野生型蛋白质的肽结合的MHC同种异型数量，其中实质上降低或去除所述野生型蛋白质的T细胞表位序列的活性或数量和实质上降低能与来自所述野生型蛋白质的肽结合的MHC同种异型数量分别通过肽与MHC分子的结合来确定，或通过肽-MHC复合物与T-细胞的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述变体以便鉴定一个或多个具有所需特性的变体，其特征在于根据步骤(ii)对野生型蛋白质中T细胞表位序列的鉴定包括根据权利要求1-13中任意一项所述的方法。
15.权利要求14的方法，其还包括步骤(v)：重复步骤(ii)-(iv)，其特征在于根据步骤(ii)对野生型蛋白质中T细胞表位序列的鉴定包括根据权利要求1-13中任意一项所述的方法。
16.权利要求14的方法，其中鉴定步骤(ii)还包括通过计算方法计算MHC II类分子与每一样本合成肽片段的结合分值，其中所述样本合成肽片段为通过扫描野生型蛋白质或其片段的全长相邻序列而产生的预定统一的氨基酸残基数的连续合成肽片段，并且其中每一合成肽片段以依次渐增地添加至少3个氨基酸残基的方式与下一合成肽片段重叠，所述结合分值是通过将存在于所述样本合成肽片段中的每一疏水氨基酸残基侧链所赋予的值相加，并选择至少一个所述合成肽片段用于修饰。
17.权利要求16的方法，其中所选择的合成肽片段具有的免疫原性刺激指数大于2.0，其中所述刺激指数通过用对所选择肽片段测定的增殖分值除以对未与所选择肽片段接触的细胞测定的分值。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的方法，其中经修饰的蛋白质具有的免疫原性刺激指数小于1.8。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05008704A (es) * 2003-02-18 2005-10-05 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de muteinas de interferon alfa con propiedades mejoradas.
NZ550339A (en) 2004-03-19 2009-11-27 Merck Patent Gmbh Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof
FR2940451B1 (fr) 2008-12-18 2014-09-12 Proteus Procede d'evaluation de l'immunogenicite des proteines

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2349463A (en) * 1996-03-21 2000-11-01 Circassia Ltd Method for identification of cryptic peptides
CN1294596A (zh) * 1998-12-08 2001-05-09 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
WO2002040997A2 (en) * 2000-10-02 2002-05-23 Genencor International, Inc. Production and use of proteins producing an altered immunogenic response

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001349A (en) * 1995-02-22 1999-12-14 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof
US5945401A (en) * 1995-06-23 1999-08-31 Conlon; Paul J. Peptide analogues of the 65KD isoform of human glutamic acid decarboxylase and uses thereof
US6165460A (en) * 1995-07-10 2000-12-26 Therion Biologics Corporation Generation of immune responses to prostate-specific antigen (PSA)
US5750356A (en) * 1996-05-31 1998-05-12 Anergen, Inc. Method for monitoring T cell reactivity
ES2258817T3 (es) * 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2349463A (en) * 1996-03-21 2000-11-01 Circassia Ltd Method for identification of cryptic peptides
CN1294596A (zh) * 1998-12-08 2001-05-09 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
WO2002040997A2 (en) * 2000-10-02 2002-05-23 Genencor International, Inc. Production and use of proteins producing an altered immunogenic response

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mapping the major human T helper epitopes of tetanus toxin.The emerging picture. Reece, Jeanette C., Geysen, H. Mario, Rodda, Stuart J.Journal of Immunology,Vol.151 No.11. 1993 *
Staphylokinase-specific cell-mediated immunity in humans. Warmerdam PAM, Vanderlick K, Vandervoort P, De Smedt H,Plaisance S, De Maeyer M, Collen D.JOURNAL OF IMMUNOLOGY,Vol.168 No.1. 2002 *
T-CELL-EPITOPE MAPPING OF THE MAJOR SECRETEDMYCOBACTERIAL ANTIGEN AG85A IN TUBERCULOSISAND LEPROSY. LAUNOIS P, DELEYS R, NIANG MN, DROWART A,ANDRIEN M, DIERCKX P, CARTEL JL, SARTHOU JL,VANVOOREN JP, HUYGEN K.INFECTION AND IMMUNITY,Vol.62 No.9. 1994 *
The identification of CD4+ T cell epitopes with dedicatedsynthetic peptide libraries. Hiemstra HS, Duinkerken G, Benckhuijsen WE, Amons R,deVries RRP, Roep BO, Drijfhout JW.PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA,Vol.94 No.19. 1997 *

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Publication number Publication date
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