JP2005529170A - T細胞エピトープをマッピングおよび除去する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は免疫学の分野に関する。本発明は免疫反応を生起し得るタンパク質分子上の決定基(determinant)およびエピトープを識別するためのスクリーニング方法を提供する。本発明は、特に、治療タンパク質中のT細胞に対するエピトープの識別に関する。最後に、本発明は、前記エピトープマッピング方法に由来するMHCクラスIIリガンドの識別およびそうしたリガンドおよびエピトープの数をそれぞれ減少させた配列アナログの設計と連携してエピトープマッピングを使用する組合せ法に関する。
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff,R.W. et al(1985)Cancer Res. 45:879-885;Shawler,D.L. et al(1985)J.Immunol.135:1530-1535]。モノクローナル抗体については、HAMA反応を低減させようと多数の技術が開発されている[WO 89/09622;EP 0239400;EP 0438310;WO 91/06667]。これらの組換えDNA手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2:449,456;Rebello,P.R. et al(1999)Transplantation 68:1417-1420]。
・ナイーブT細胞アッセイにおいて、タンパク質、特に治療タンパク質の免疫原領域(複数を含む)をマッピングするために合成ペプチドのパネルを使用すること(ここでタンパク質はヒトタンパク質である);
・治療タンパク質の免疫原領域(複数を含む)の微細マッピングするために、リコールアッセイにおいて合成ペプチドのパネルを使用すること;
・in vitroにおいて最小の免疫原性を表示する変異体を選択するために全タンパク質変異体のパネルを使用すること;
・in vitroにおいて最小の免疫原性を表示するペプチド配列を選択するために合成ペプチド全変異体のパネルを使用すること;
・ナイーブT細胞アッセイにおいて、2.0未満の、好ましくは1.8未満の刺激指数を示すペプチド配列を選択するためにT細胞刺激の生物学的分析を使用すること;
・ナイーブT細胞アッセイにおいて、2.0未満の、好ましくは1.8未満の刺激指数を示すタンパク質変異体を選択するためにT細胞刺激の生物学的分析を使用すること;。
・治療分子の免疫原領域(複数を含む)をマッピングするために、さらに、予め治療タンパク質を受けた個体から発生させたT細胞系と平行にB細胞系を発生させる上記による方法;
・同じ個体に由来するT細胞系の発生と平行して予め治療タンパク質を受けた個体から発生させたB細胞系の、T細胞刺激のさらなる繰り返しにおける自己由来APC源としての、また場合によっては合成ペプチド結合アッセイのための結合表面としての使用;
・健常なドナーから単離されたPBMCを使用する被験タンパク質T細胞エピトープマップの構築および以下のステップを含むスクリーニング方法:
i)7日以内の培養期間の間、合成ペプチドまたは全タンパク質免疫源を使用する、in vitroでの抗原プライミング;
ii)IL−2の添加および3日間以内の培養;
iii)プライミングT細胞の照射された自己由来PBMCへの添加およびさらに4日間の培養期間中に行う抗原による再チャレンジ、ならびに
iv)T細胞活性化、例えば、任意の適当な方法による増殖指数の測定;。
i)7日以内の培養期間の間、合成ペプチドまたは全タンパク質免疫源を使用する、in vitroでの抗原プライミング、ii)
ii)IL−2の添加および3日間以内の培養、iii)
iii)プライミングT細胞の照射された自己由来PBMCへの添加およびさらに4日間の培養期間中に行う抗原による再チャレンジ、ならびに
iv)T細胞活性化、例えば、任意の適当な方法による増殖指数の測定;
・対象タンパク質に対して確立した免疫反応を有する、健常なドナーまたは患者から得たPBMC試料に由来するポリクローナルもしくはモノクローナルな細胞系を有効に利用するT細胞エピトープマップの構築。IL−2+/-フィトヘムアグルチニン(PHA)または他の細胞分裂促進性の刺激の存在下、1回または複数回のプライミングステップによって免疫学的にプライミングされた状態に前記細胞系を増殖させ、拡大された細胞数において完結させること。前記プライミングさせた細胞を個別の合成ペプチドまたは多数の合成ペプチドを含むペプチドプールのいずれかと接触させ、刺激を受けて増殖した細胞系を何らかの適当な手段を使用して検出する。プールされたペプチド免疫原から刺激が検出された場合は、刺激ペプチドの同一性を、個別のペプチドまたはより小さなペプチドプールおよびさらにプライミングした細胞によるスクリーニングの繰り返しをさらに使用して明らかにする;
・ナイーブT細胞活性化アッセイと1または複数のMHCアロタイプへのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームとを使用するタンパク質配列中にT細胞エピトープの位置をマッピングする協同的方法;。
i)T細胞を活性化し得るエピトープ領域を識別するための、ナイーブT細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドの使用;
ii)ステップ(i)において識別されたエピトープ領域を分析し、それによりエピトープ領域内のMHCクラスIIリガンドを識別するための、1または複数のMHCアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用;
iii)もはやMHCクラスIIを結合しないか、より少数のMHCアロタイプにより低い親和性で結合する、エピトープ領域(複数も含む)内に包含されるMHCリガンドの配列アナログを識別する1または複数のMHCアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用;
iv)ナイーブT細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質内に識別されるエピトープ領域を完全にまたは集合的に包含する合成ペプチドの使用ならびに野生型の(親)配列と平行してナイーブT細胞活性化アッセイにおいて配列アナログを試験すること;
・ステップ(ii)および(iii)がWO 02/069232によって教示される計算上のアプローチを使用して実行される上記スキームによる方法;
・約20人以上の無関係なドナーに由来するPBMC細胞を使用して、ナイーブT細胞活性化アッセイを行う上記のスキームによる方法;
・2以上の独立したドナー試料中で約2.0の刺激指数スコアが観察される場合に、T細胞エピトープの位置が見出される上記スキームによる方法;
・2以上の独立したドナー試料中で約2.0の刺激指数スコアが観察されるときであって、計算システムを使用して同じ配列場所内に1または複数のMHCクラスIIリガンドを識別することができる場合に、T細胞エピトープの位置が見出される上記スキームによる方法;。
・免疫反応を促進する能力が低減したタンパク質配列の識別は、上記スキームの免疫学的にプライミングされた細胞および多数の変異体ペプチドまたは全タンパク質抗原が野生型の配列のみを含む参照ペプチドプールまたは全タンパク質抗原と平行して試験されるスクリーニングプロセスを使用して達成され得る。参照プールまたは野生型タンパク質に対してより低い刺激指数を有するペプチドまたはタンパク質変異体を、さらなる分析のために選択する;
・免疫反応を促進する能力が増加したタンパク質配列またはタンパク質調製物の識別は、上記スキームの免疫学的にプライミングされた細胞および1または複数のペプチドまたは全タンパク質抗原が既知のin vitro免疫反応を与える参照ペプチドプールまたは全タンパク質抗原と平行して試験されるスクリーニングプロセスを使用して達成され得る。参照調製物に対して異なる刺激指数プロフィールを生起することが示されたペプチドまたはタンパク質調製物を、さらなる分析のために選択するか、または生産工程から除去してもよい;。
・ナイーブT細胞活性化アッセイにおいて1.8を超え、好ましくは、2.0を超える刺激指数を生起することができ、任意の治療タンパク質から選択されるペプチド配列(ここで、ペプチドは最小限修正され、ナイーブT細胞活性化アッセイにおいて試験され、2.0未満の刺激指数を有することが見出されている);
・野生型のタンパク質配列と100%のアミノ酸同一性を共有し、T細胞アッセイにおいて1.8以上、好ましくは2.0を超える刺激指数を生起し得るペプチド配列;
・免疫原領域がT細胞アッセイを用いてマッピングされ、次いで、T細胞アッセイにおける再試験時に、修正されたタンパク質分子が、親(未修正)分子より小さく最も好ましくは2.0未満である刺激指数を生起するタンパク質分子。
本発明の第1の実施形態によれば、万一そのタンパク質がヒト被験者に未修飾状態で導入された場合、T細胞駆動された免疫反応を生起し得る決定基がその配列内に存在するかによりタンパク質抗原がスクリーニングされ得る方法が提供される。これにより、この方法は、タンパク質が、獲得した疾病状態の治療のために供給されることになっている場合、かつ、そのタンパク質がヒトタンパク質であり得る場合、ヒトにおいて治療可能性のあるタンパク質においてT細胞エピトープを識別するための予測ツールを提供する。
i)T細胞を活性化し得るエピトープ領域を識別するための、ナイーブT細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドの使用;
ii)ステップ(i)において識別されたエピトープ領域を分析し、それによりエピトープ領域内のMHCクラスIIリガンドを識別するための、1または複数のMHCアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用;
iii)もはやMHCクラスIIを結合しないか、より少数のMHCアロタイプにより低い親和性で結合する、エピトープ領域(複数も含む)内に包含されるMHCリガンドの配列アナログを識別する1または複数のMHCアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用;
iv)ナイーブT細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質内に識別されるエピトープ領域を完全にまたは集合的に包含する合成ペプチドの使用ならびに野生型の(親)配列と平行してナイーブT細胞活性化アッセイにおいて配列アナログを試験すること;
高い程度の確実性をもって、IFNなどの任意のヒトタンパク質について、許容可能なMHCクラスリガンドの母集団を含むすべてのペプチドのデータセットを定義するためにWO 02/069232に概説されたソフトウェアスキームを使用し得ると理解される。in vivoでの免疫原性ペプチドの提示に結びつく、タンパク質分解を生ずる処理および他の生理学的ステップに対する要求などの理由のために、ペプチドの全レパートリーの比較的小さなサブセットが、最終的に生物学関連性を有するであろうことは明らかであろう。そのような状況において、本発明者らは、生物学的に関連のあるペプチドを識別するために、ex vivoでのヒトT細胞活性化アッセイを使用し得ることを確証した。したがって、in vitroで培養されるヒトT細胞中での増殖応答を生起するその能力に関して合成ペプチドを試験する。健常なドナーから得られたナイーブなヒトT細胞を使用して、この種のアプローチを行う場合、本発明者らはそのようなアッセイの操作において、2.0以上の刺激指数が誘導された増殖の有用な手段であることを確立した。刺激指数(SI)は、慣用的に、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア(例えば3H−チミジン組み込みを使用する場合、放射能の1分当たりカウント)を試験ペプチドと接触させていない細胞において測定されたスコアで割ることにより得られる。応答を生起しないペプチドはSI=1.0を与えるが、実際的には0.8〜1.2の範囲内のSI値は際立ったものではない。記録されたスコアに対する確信を保証するために、多数の技術的な手順がそのようなアッセイの操作に組み込まれ得る。典型的には、すべての測定は少なくとも3重になされ、平均スコアを計算することができる。計算されたSI=>2.0である場合、3重の個別スコアは異常値の証拠があるかどうか検討することができる。同様に、大多数のPBMCドナー試料が応答するであろうと予想される対照ペプチドの包含は、各アッセイプレートに含まれ得る。インフルエンザウイルス血球凝集素ペプチド307-309、配列PKYVKQNTLKLA);およびクラミジアHSP 60ペプチド配列KVVDQIKKISKPVQHは特に適当な対照ペプチドであるが、他の多くの例も利用できるであろう。また、好ましくは、アッセイは、キーホールリンペット由来のヘモシニアン(これに対しては、すべてのPBMC試料が2.0を超えて顕著なSIを示すと予想される)などの有力な全タンパク質抗原を使用するべきである。
図1は、IFNβ内の免疫原性領域を示し、ナイーブなヒトT細胞を刺激することができるこれらの領域から得たペプチド配列を詳しく示す。
MHC、ペプチドおよびT細胞レセプター(TCR)の間の相互作用は、T細胞認識の抗原特異性に構造的な基礎を与える。T細胞増殖アッセイによりペプチドのMHCへの結合およびMHC/ペプチド複合体のTCRによる認識を試験する。この実施例のin vitroでのT細胞増殖アッセイは、末梢血単核細胞(PBMC)の刺激と関係しており、抗原提示細胞(APC)およびT細胞を含んでいる。刺激はin vitroで、合成ペプチド抗原、実験によってはタンパク質抗原全体を使用して行った。刺激されたT細胞増殖を、3H−チミジン(3H−Thy)を用いて測定し、取り込まれた3H−Thyの存在を洗浄した固定細胞のシンチレーションカウントを使用して評価した。
実施例1の方法を用いて、ヒトタンパク質インターフェロンa2(IFNα)についてのエピトープマップを導いた。方法は、合成ペプチドを表2(下記)に示すものとし、PBMC調製物とのインキュベーションを10μMの濃度とした以外はすべての点で実施例1に準じた。
経時的T細胞活性化アッセイを行う方法
経時的T細胞活性化アッセイを行うための一般的なプロトコルは以下のステップを含む:
1.ドナー当たりPBMC 1バイアルを解凍する。
2.細胞を2〜4×106細胞/ml(AIM V中)を再懸濁する。
3.2つの異なる濃度で抗原を試験し、非抗原で処理した対照に対して比較するのが通常であるため(例えば、10〜50μg/mlタンパク質または1〜5μMペプチド)、24ウェルプレートの3ウェルに1mlを移す(最終濃度2〜4×106PBMC/ウェル)。
4.典型的にタンパク質については100μg/ml、ペプチドについては2〜10μM抗原ストック溶液を作成する。最終濃度10〜50μg/mlタンパク質または1〜5μMペプチドを与えるように各ウェルに抗原1mlを加える。
5.5日間インキュベートする。
6.ピペットで移すことにより細胞を穏やかに2ml培養液中に再懸濁し、各条件から細胞100μlを取り、96ウェルプレート(丸底)に入れ、この到達培養条件(時間ポイント当たり各培養条件から合計300μlを取る)を3回繰り返す。
7.96ウェルプレートの各細胞ウェルに100μl AIM V中1μCi/ウェル3H[Thy]を加える。
8.一夜インキュベートし収穫する。
9.段階6〜8を6、7および8日(必要な場合、9日目を含むことができる)繰り返す。
10.SI測定を行い、各抗原のSI対時間をプロットする。
T細胞系およびクローンの樹立方法
血友病患者から得た末梢血から単核細胞(PBMC)を単離し、液体窒素下で低温保存した。血液試料は、十分なインフォームドコンセントおよびアッデンブルック(Addenbrooke)ヘルスケアトラストのローカルな倫理的承認の下で提供された。
FVIII抗原よる3回目の刺激後に、Tブラストを回収し、4×102〜1×104細胞/mlの密度に連続希釈によって再懸濁した(2×最終培養密度)。自己由来PBMCを解凍し、ポリプロピレンチューブ中で2×106細胞/ml(2×最終培養密度)に溶解し再懸濁した。次いで、PBMCを4000 radのγ放射に暴露し、希釈を制限することにより抗原反応性T細胞クローンを選択するために抗原提示細胞として使用した。γ照射した抗原提示細胞(最終密度1×106)をTブラスト(最終密度2×102〜5×103細胞/ml)、1〜10μg/ml FVIII抗原および100U/mlIL−2と混合した。20μlのAPC、Tブラスト、FVIIIおよびIL−2混合物を各ウェルに加えることにより、Terasakiプレート中T細胞クローンを確立した。希釈クローニングの制限はTerasakiプレートの2〜50Tブラスト/ウェルを使用して行った。
TブラストをFVIII抗原、IL−2およびγ照射した自己由来抗原提示細胞とともにおよそ14日間インキュベートした。明白な成長を示す細胞を含むウェルを識別した後、Tブラストを、丸底96ウェルプレートの、1×105のγ照射した異質遺伝子型(allogenic)のPBMC(最終体積200μlAIM V(1%の熱不活性化したヒトAB血清を含む)中100U/ml IL−2および1μg/ml フィトヘマトグルチニン(PHA)を含む単一ウェルに移した。細胞がコンフルエントになった時点で、T細胞クローンを分割し、最終的には最終体積2mlAIM V(1%の熱不活性化したヒトAB血清を含む)中1×105のγ照射した異質遺伝子型PBMC(支持細胞)、100U/ml IL−2および1μg/mlフィトヘマトグルチニン(PHA)を含む24ウェルの単一ウェルに移した。T細胞クローンの日常的メンテナンスは、(細胞成長に依存して)2〜3週ごとに新鮮なPHAおよび異質遺伝子型支持細胞での刺激、および2週ごとに100U/ml IL−2に刺激を含んでいた。FVIII特異的であると判明したT細胞クローンのみを展開しFVIIIペプチドをスクリーニングするのに用いた。
3mlのろ過した(0.45μ)B95.8上澄液を4×106PBMCに添加し37℃で1時間インキュベートすることによって、PBMC調製物から得たB細胞を不死化し、B リンパ芽細胞系(BLCL)を生成した。PBMCをペレット化し、熱不活性化したウシ胎仔血清(FCS)5%および1μg/mlシクロスポリンAを含む2ml RPMI中に再懸濁した。7日間インキュベートした後、1mlの培地を5%FCSおよび2μg/mlシクロスポリンAを含む新鮮なRPMIに取り替えた(シクロスポリンAの最終濃度1μg/ml)。この供給法(feeding regime)を細胞が分割後14日目および21日目に繰り返し、必要なときにはウシ胎仔血清(FCS)5%を含むRPMIを用いて組織培養フラスコ内に展開した。
15残基長で、かつ、12アミノ酸の増分によって前のペプチドと重複するペプチドを合成した(Pepscan(オランダ))。ペプチドは、最初、保存用に100%ジメチルスルホキシド(DMSO)10mM中に溶解した。同時にFVIII特異的T細胞系から多くのペプチドをスクリーニングするためペプチドプールを生成した。プールは、含有される各プールが後のプールと重複するペプチドを含むように構成し、このアプローチを用いて2個のペプチドの重複したT細胞エピトープは2つの別個のプールの増殖を引き起こす結果をもたらす。各プールは、典型的には各ペプチド1または5μMのいずれかで試験した8ペプチドからなるものであった。
40名の健常なHLA−DRタイプドナーからの血液を用いてPBMCを単離し、これを用いて2種の濃度(1または5μl)で個々のFVIIIペプチドをスクリーニングした。各ドナーから得たPBMCの数はFVIIIペプチドをすべてスクリーニングするには不十分であったので、ドナーを2群に分け、最初の20名のドナーは分子の前半のペプチドをスクリーニングするために使用し、第2のドナー集合は残るペプチドをスクリーニングするために使用した。ドナーは、世界人口の中に多数存在するアロタイプをカバーするように発現されたMHCクラスII アロタイプに従って選択した。MHCアロタイプは用いて検出した。
計算スキーム
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第1に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−CONH−基を含む有機化合物の任意の基である。
(1)予め定義した長さのペプチドセグメントの1次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(2)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約2倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値2を、芳香族側鎖に対しては値1を割り当てる)。(3)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するT細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(4)上記ステップ3に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(5)予め定義した値(例えば値1)のスコアを有する配列のすべての部分は、T細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、T細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、MHCクラスII結合特性を修飾する可能性を有する。
(ΔGbind)=(ΔGo)+(ΔGhbxNhb)+(ΔGionicxNionic)+(ΔGlipoxNlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
式中、Nは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、1つの実施形態では、ΔGo、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipoおよびΔGrotは、それぞれ5.4、−4.7、−4.7、−0.17および1.4の値を与えられる定数である。
Nhb=Σh-bondsf(ΔR,Δα)×f(Nneighb)×fpcs
によって計算される。
f(ΔR,Δ−α)=f1(ΔR)×f2(Δα)
ここで、f1(ΔR)=1(ΔR<=TOLの場合)、
または =1−(ΔR−TOL)/0.4(ΔR<=0.4+TOLの場合)、
または =0(ΔR>0.4+TOLの場合)
さらに、f2(Δα)=1(Δα<30°の場合)
または =1−(Δα−30)/50(Δα<=80°の場合)
または =0(Δα>80°の場合)。
ΔRはH−O/N水素結合長さの理想的な値(=1.9Å)からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値(=180°)からの偏差、
f(Nneighb)は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式4:
f(Nneighb)=(Nneighb/Nneighb,0)α(ここで、α=0.5)
によって計算される。
Nneighb,0=定数25である。
fpcs=β(Apolar/NHB<10Å2の場合)、
またはfpcs=1(Apolar/NHB>10Å2の場合)
Apolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
NHBは水素結合の数であり、
βは定数=1.2である。
Nlipo=ΣILf(rIL)
f(rIL)はすべての脂肪親和性リガンド原子について、1また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてLであり、以下の基準により計算される:
f(rIL)=1(rIL<=R1f(rIL)=(rIL−R1)/(R2−R1)でR2<rIL>R1の場合、
f(rIL)=0(rIL>=R2の場合)。
R2=R1+3.0であり、
r1vdwは、原子1のファンデアワールスの半径であり、
rL vdwは、原子Lのファンデアワールスの半径である。
Evdw=ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12−(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)。
r1 vdw+r2 vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
rは1対の原子間の距離である。
Claims (17)
- 以下のステップを含む、末梢血単核細胞(PBMC)により、被験タンパク質またはその断片のT細胞エピトープマップを構築する方法:
(i)被験タンパク質全体または該被験タンパク質のアミノ酸配列を代表するかそれから生成される合成ペプチド、もしくはそれらの断片を用いて、PBMC誘導T細胞とともに合成ペプチドをインキュベートおよび培養することによりin vitroで抗原をプライミングすること;
(ii)プライミングされたT細胞をサイトカインによって処理し培養すること;
(iii)自己由来の照射されたPBMCにプライミングされたT細胞を添加し、前記合成ペプチドによって新たにプライミングおよび培養すること;ならびに
(iv)T細胞増殖アッセイにおけるT細胞応答を予め選択された経時的プロトコルによって測定すること。 - T細胞を含むPBMCは、事前に被験タンパク質に暴露されていない多数の異なる健常な個体から単離されるか、その断片またはペプチド抗原である請求項1に記載の方法。
- PBMCは、MHCクラスIIのレパートリーの90%以上に相当する十分な免疫学的多様性のドナー個体プールに由来する請求項2に記載の方法。
- T細胞を含むPBMCは、被験タンパク質またはその断片に対する確立した免疫反応が存在する個々の患者から単離される請求項1に記載の方法。
- 個体がヒトであり、かつ、被験タンパク質がヒトタンパク質である請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 被験タンパク質の全長を、前もって定義した均一のサイズであり選択された領域から少なくとも3個のアミノ酸残基によって構成される合成重複ペプチドについて走査する請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記合成重複ペプチドが9〜15アミノ酸残基を含む請求項6に記載の方法。
- 前記合成ペプチドが15アミノ酸残基を含む請求項7に記載の方法。
- サイトカインがIL−2である請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 経時的プロトコルを実施例3に従って行う請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 被験タンパク質が治療タンパク質である請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から11に記載のいずれかの方法を含むT細胞活性化アッセイ。
- 免疫原性の弱いタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの検出のための請求項12に記載のT細胞活性化アッセイの使用。
- 同一の生物学的活性を有する親分子から得た免疫原性が修飾された生体被験タンパク質であって、修飾された分子は前記親分子のそれと異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に露出されたときに親分子と比べて縮小された免疫性を示すものを調製する以下のステップ:
(i)親タンパク質またはその部分のアミノ酸配列を決定すること;
(ii)1または複数の潜在的なT細胞エピトープを識別すること;
(iii)本来識別されたT細胞エピトープ配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基の変更によって新しい配列変異体を設計し、前記変異体は、ペプチドのMHCへの結合およびペプチド−MHC複合体のT細胞への結合により決定される、T細胞エピトープ配列の活性もしくは数および/または前記生体分子から誘導されるペプチドに結合し得るMHCアロタイプの数をそれぞれ実質的に縮小するか除去すること;
(iv)組み換えDNA技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた1または複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること、および
(v)場合によってステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと;
を含む方法であって、ステップ(ii)によるT細胞エピトープ配列の識別が、請求項1から11のいずれかによる方法を含むことを特徴とする方法。 - 識別ステップ(ii)は、さらに、前記サンプリングされたアミノ酸残基セグメントに存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割り当てられた値を合計することにより、前記各合成ペプチドセグメントのMHCクラスII分子結合スコアを計算することを計算方法として含み、また、修飾のために前記合成ペプチドセグメントの少なくとも1つを選択することを含む請求項14に記載の方法。
- 選択された合成ペプチドは2.0以上の免疫原性刺激指数(SI)を有し、ここでSIは、選択されたペプチドにおいて測定されたT細胞増殖スコアをペプチドで接触させていない細胞において測定されたスコアによって分ることによって得られる請求項15に記載の方法。
- 修飾された被験タンパク質は1.8未満の免疫原性刺激指数(SI)を有する請求項14から16のいずれかに記載の方法。
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