JPH11514847A

JPH11514847A - 糖尿病の処置および予防のための方法

Info

Publication number: JPH11514847A
Application number: JP9503998A
Authority: JP
Inventors: ロンディ，マルコ; ジー．レスリー，アール．デイビッド; ジェイ．コンロン，ポール; リン，ニコラス; ガウル，アミタブ
Original assignee: ニューロクラインバイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド; ケネディーインスティテュートオブリューマトロジー; セントバーソロミューズホスピタルセンターフォークリニカルリサーチ
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 1999-12-21
Also published as: CA2225406A1; US5945401A; WO1997000891A1; AU6478696A; EP0871657A1; MX9800239A

Abstract

(57)【要約】糖尿病の処置および予防に使用するために、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型のペプチドおよびペプチドアナログが提供される。ペプチドアナログは、一般に１〜３個のアミノ酸改変を含む。ペプチドおよびアナログは、糖尿病を診断するため、および糖尿病の素因を検出するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】糖尿病の処置および予防のための方法技術分野本発明は、一般に、自己免疫疾患に関し、そしてより詳細には、糖尿病の処置および予防におけるヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼのペプチドおよびペプチドアナログの使用に関する。発明の背景免疫系は、通常、それ自体に対する攻撃の開始を妨げられる。なぜなら、自己は免疫系が保護するように設計されている組織であるからである。このような攻撃を妨げるために、自己反応性リンパ球は強力な調節機構によってチェックし続けている。全てではないが、多くの自己反応性Ｔ細胞が胸腺内でのネガティブセレクションによって排除される。ネガティブセレクションの過程は十分には理解されていないが、MHC抗原に関連して自己ペプチドに対する親和性が高すぎるＴ細胞は排除される。逆説的に、次いで、ネガティブセレクションの試練を生き残ったＴ細胞は、「ポジティブに選択される」か、または拡大されなければならない。この拡大は、ネガティブセレクションで見られるよりもある程度(おそらく、より低い親和性)までＴ細胞がMHC複合体中の自己ペプチドを認識し得ることを必要とする。次いで、この過程は、見かけ上終わりのない多数の特異性を有する免疫系を生じる。北アメリカにおいて、成人の５％(このうち３分の２を超える者は女性である) が、自己免疫疾患(多発性硬化症、慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、全身性エリテマトーデス、および甲状腺炎を含む)に罹患している。胸腺の選択を逃れた自己反応性Ｔ細胞は、全ての健常な個体に見出される。従って、自己反応性の調節はまた、胸腺外で作用する機構を通して部分的に維持される。これらの機構は、制御下で自己反応性リンパ球を維持する他の細胞(すなわち、サプレッサーＴ細胞)による、およびクローナルな不応答(アネルギー)による、活発な抑制を含む。ここで、自己に反応性である細胞は「アネルギー化」される。アネルギーは、Ｔ細胞への抗原性ペプチドの不適切な提示に関与し、これによって不応答または寛容が導かれると考えられる。ペプチド親和性は、Ｔ細胞をオンまたはオフに切り替えるかどうかに役割を果たし得る。免疫系が自己組織に対して反応すれば、たとえ潜在的に致死的でないにしても有害な自己免疫が発達する。自己免疫についての一般に流布している理論の１つは、遺伝的に自己免疫疾患の素因を有する人々が、ウイルスまたは細菌のような感染性因子との接触を生じる、というものである。感染を制御する過程において、免疫系は、自己抗原に似ている病原体上の抗原を標的とする。次いで、これらの細胞は自己組織を攻撃し始め、自己免疫を生じる。インスリン依存性糖尿病(IDDM)は、最も深刻でそして一般的な代謝障害の１つである。IDDMは、かつては急性ウイルス感染の結果として生じ得る病気に類似して急速に進行する病気として考察されたが、実際は、病状発現前の時期が通常数年の間存在する、慢性の自己免疫過程によって生じる。実際、IDDMの古典的な発現(高血糖およびケトン症)は、ほとんどのβ細胞が破壊された後の疾患の過程の後期に生じる。長年にわたるIDDMを患う患者の膵臓の最も著しい組織学的特徴は、インスリンを分泌するβ細胞をほとんど全て欠くことである。対照的に、グルカゴン(α細胞)、ソマトスタチン(δ細胞)、または膵臓ポリペプチド(膵臓ポリペプチド細胞 )を分泌する膵島の細胞は保存される。β細胞は正常な島内の細胞の大多数(70％ )を構成するので、長年にわたる糖尿病を患う患者の島は異常に小さい。軽度の間質性線維症および外分泌萎縮を除いて、他の明らかな組織学的異常は存在しない。 IDDMの発症時またはそのすぐ後に、ほとんどの島はβ細胞において欠損し、ちようど長年にわたる疾患を患う患者における島のようである。残存する島は、大きくなった核を有する細胞、種々の数の脱顆粒したβ細胞、および一般にインスリン炎といわれる慢性炎症性浸潤を含む。この炎症性浸潤は、主にCD8細胞、ならびに種々の数のCD4細胞、Bリンパ球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞からなる。島細胞上のHLAクラスＩ分子の発現は増加し、一方クラスII分子はβ細胞、マクロファージ、または内皮上で過剰発現され得る。島の血管内皮上の細胞間接着分子１の発現もまた増加する。この特徴は内皮細胞の接着および蓄積に有利である。 IDDMであると新たに診断された患者の膵臓におけるインスリン炎を患う島の分布は、著しく不均一であり得る。１つの膵葉内の島は正常に見えるかもしれないが、一方、隣接する葉内の島は小さいかまたは根深いインスリン炎を有するかもしれない。この変化性は、膵島細胞の異なるインスリン分泌活性を反映し得、最も代謝的に活性なβ細胞は、優先的に破壊されている。組織学的研究によって、 β細胞の容量における80％の減少が、症候性IDDMを誘導するために必要とされることが示唆される。島の再生の組織学的証拠はまれであるが、いく人かのIDDMの若い患者の膵臓で見出される。糖尿病は、膵臓のインスリン産生性β細胞の自己免疫的破壊、そしてその後の代謝の混乱から生じる。インスリン療法はほとんどの患者を活発な生活に導くのを可能にするが、この置換は、正常な代謝的ホメオスタシスを復活させないので、不完全である。代謝異常は、その後の普通の合併症(これは、網膜症、白内障形成、腎症、および心臓病を含む)の発症において重要であると考えられる。 IDDM自己免疫の開始因子は知られていないが、これは、膵島内のインスリン分泌性Ｂ細胞に存在する自己抗原に対する免疫寛容の欠損を最終的に誘発する。ID DMは無徴候期から始まり、これはβ島細胞を選択的に破壊する白血球(Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、およびマクロファージを含む)によって媒介される島の慢性炎症性浸潤によって特徴づけられる。 β細胞に対する自己免疫は、２つの過程の１つによって開始され得る。β細胞タンパク質とアミノ酸配列を共有するウイルスタンパク質に対する免疫応答は、 β細胞上の自己タンパク質と反応する抗ウイルス性細胞傷害性CD8リンパ球の出現を生じ得る。あるいは、環境的傷害(向β細胞性ウイルスでの感染またはβ細胞スーパー抗原の発現)は、サイトカインおよび膵島の血管内皮中の接着分子の発現を誘導する他の炎症性メディエーターを生じ得る。内皮細胞の活性化は、循環している白血球の接着および血管外遊出の増加、ならびにリンパ球に対するマクロファージの浸潤によって損傷を受けたβ細胞からのβ細胞抗原の提示を可能にする。いずれの場合も、自己免疫過程は、損傷を受けたβ細胞から放出された抗原と反応するリンパ球が炎症部位に補充されるとすぐに増強される。IDDMに対する遺伝的感受性は、β細胞自己抗原に対する末梢寛容の確立における生来の欠損を含む。炎症性の島からの炎症性サイトカインの持続的な放出は、β細胞上のHLAクラスＩ分子の過剰発現を生じ得、さらにそれらの破壊を強化し得る。自己免疫過程が進行するにつれて、免疫学的破壊の種々のエフェクター機構がβ細胞の排除を生じる。自己免疫疾患におけるＴ細胞活性化の段階は、正常な免疫調節と決して異ならない。活性化における第１段階(シグナル１)は、３成分複合体の成分(Ｔ細胞レセプター、MHC遺伝子産物、およびわずかなペプチド抗原)間の相互作用を必要とする。第２段階(シグナル２)はまだ明らかでないが、抗原提示細胞の表面のサイトカインまたはアクセサリー分子のいずれかに関連し得る(例えば、CD28リガンド)。Ｔ細胞がシグナル１のみを受ける場合、不応答またはアネルギーが生じる。Ｔ細胞が抗原とどのように応答するかを知ることによって、応答の調節を可能にし、その結果、免疫系がペプチドに対してよりよく応答し得る。逆に、自己ペプチドの認識を変化させることは、自己免疫疾患を管理するのに有用な治療であり得る。発明の要旨本発明は、糖尿病の処置および予防において使用するための、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型のペプチドおよびペプチドアナログを提供する。より詳細には、１つの局面において、ペプチドは、ヒトGADの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される７〜15アミノ酸からなる。関連する局面において、ヒトGADの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも７つのアミノ酸を含むペプチドアナログが提供される。ここで、52 1〜535に対応する残基由来の少なくとも１つのアミノ酸は、天然のタンパク質中のその部位に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変される。特定の実施態様において、アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、ロイシン、セリン、グリシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に改変される。関連する実施態様において、Ｎ末端アミノ酸またはペプチドアナログのＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の両方は、Ｄ -アミノ酸である。別の関連する局面において、ヒトGADの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも７つのアミノ酸を含むペプチドアナログが提供される。ここで、525位のアルギニン、528位のリジン、531位のプロリン、および534位のリジンからなる群より選択される１〜３のL-アミノ酸は、天然のタンパク質中のその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変される。本発明の他の局面において、ヒトGADの65kDのイソ型の残基(a)173〜187、(b)1 77〜191、(c)193〜207、(d)201〜215、(e)213〜227、(f)493〜507、(g)505〜519 、(h)525〜539、(i)533〜547、および(J)537〜551から選択される少なくとも７つのアミノ酸を含む一連のペプチドアナログが提供される。ここで、上記で確認した部分に対応する残基に由来する少なくとも１つのアミノ酸は、天然のタンパク質中のその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変される。ペプチドアナログ内のいくつかのアミノ酸が改変され得るが、一般に１〜５のいずれかの改変が好ましいこともまた、当業者に理解される。この点に関して、 MHC接触部位に対応する残基を維持することもまた、一般に好ましい。例えば、ヒトGADの65kDのイソ型の残基521〜535から選択されるアミノ酸を含むペプチドアナログ内では、一般に、523、526、529、532、および533位に対応するアミノ酸残基を維持することが好ましい。本発明のさらなる局面では、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて、本明細書中で記載されたようなペプチドアナログを含む薬学的組成物が提供される。さらに、関連する局面において、患者に治療有効量のこのような薬学的組成物を投与する工程を包含する、糖尿病の処置方法が提供される。本発明のなお他の局面において、糖尿病の検出方法が提供される。この方法は、(a)患者由来の生物学的サンプルの一部を、本明細書中に記載のように第１のペプチドまたはペプチドアナログと接触させる工程；(b)この生物学的サンプルの別の部分を、ヒトGADの65kDのイソ型の残基161〜175から選択される７〜15のアミノ酸を含む第２のペプチドと接触させる工程；および(c)第１のペプチドおよび第２のペプチドに対する応答を検出し、それによって患者が糖尿病を有するか否かを決定する工程、を包含する。関連する局面において、糖尿病に対する素因を検出するための方法が提供される。この方法は、(a)糖尿病を発症する危険性のある個体由来の生物学的サンプルを、ヒトGADの65kDのイソ型の残基161〜175 から選択される７〜15のアミノ酸を含むペプチドと接触させる工程；(b)工程(a) 由来のペプチドに対する応答を検出する工程；(c)この個体由来の第２の生物学的サンプルを、ヒトGADの65kDのイソ型の残基161〜175から選択される７〜15のアミノ酸を含むペプチドと、免疫応答を成熟させる工程(a)を十分に行なった後の時点で接触させる工程；(d)工程(c)由来のペプチドに対する応答を検出する工程；および(e)工程(b)および(d)から得られた値を比較して、それによって糖尿病に対する素因を決定する工程、を包含する。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照にして明らかになる。さらに、種々の参考文献を以下に記載し、これはより詳細に特定の手順または組成を記載する。これらの参考文献の各々は、個々に援用について記載されたかのように、その全体が参考として本明細書中で援用される。図面の簡単な説明図1Aおよび図1Bは、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型に対するDNA配列および推定のアミノ酸配列を示す。図２は、GAD65の様々な領域に対応するペプチドに対するＴ細胞の増殖性応答を示すグラフである。5〜7人の１型糖尿病患者（黒い棒）および4〜5人の健康なコントロール（平行線の棒）におけるペプチド(5μg/ml)に対する応答を、応答者数（ｙ軸）によって表している。バックグラウンドのカウント値は通常600〜3 000cpmの間であり、一方陽性のウェルはバックグラウンドカウント値に対してそれぞれ1500および6000cpmを超えなければならなかった。図３は、IDDM患者由来のＴ細胞クローンのGAD521-535に対する増殖性応答を示すグラフである。１型糖尿病患者由来の４つのクローンはGAD65のペプチド521-5 35（10μg/ml）に応答した。すべてのクローンが２より大きい刺激指数を有する応答を示した；カウント値は1000cpmを超え、そして３連のサンプルの標準偏差は＜15％であった。条件としては、Ｔ細胞のみ（黒い棒）、抗原提示細胞を含むＴ細胞（点刻の棒）、または抗原提示細胞を含むＴ細胞およびGAD521-535を含む。図４は、IDDM患者または正常なコントロール由来のヒトＴ細胞の、GAD65の様々な領域に対する増殖性応答を示すグラフである。結果は、残基数によって規定される免疫優性領域に応答する被検体のパーセンテージとして表されている。領域473-555について患者とコントロールとの間に有意差が観察された。発明の詳細な説明本発明を説明する前に、以下で用いられる特定の用語の定義を説明することは、本発明を理解する上で役に立ち得る。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「GAD」）とは、膵臓のβ細胞および中枢神経系のニューロンにおいて発現する酵素をいう。GADには２つのイソ型、「GAD 65」および「GAD67」がある。本明細書中では「GAD65」は「ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型」とも呼ばれる。ヒトGAD65のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は図１に示されている（配列番号および）。図１には示していないが、異なるスプライシングまたは翻訳後修飾によって生成されるヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの異なる分子形態もまた本発明の範囲に含まれる。 GADの「ペプチドアナログ」は少なくとも７個のアミノ酸長を有し、そしてアナログと天然のヒトGADとの間にアミノ酸配列に少なくとも１つの相違を含む。他に記載のない限り、示されるアミノ酸はＬ型をいう。天然のペプチド由来のＬアミノ酸は、タンパク質内に通常見い出される20個のＬアミノ酸のうちの他のいずれかのアミノ酸、対応するＤアミノ酸、4-ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジンのような希なアミノ酸、またはβアラニンおよびホモセリンのような非タンパク質アミノ酸のいずれかに改変され得る。メチル化（例えば、αメチルバリン）、エチルアミン、エタノールアミン、およびエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化、ならびにアミノ酸側鎖官能基のアシル化またはメチル化（例えば、リジンのイプシロンアミノ基のアシル化）のような化学的手段によって改変されたアミノ酸もまた本発明の範囲に含まれる。「残基522」、「残基525」「残基528」、「残基531」、および「残基534」（それぞれ522位、525位、528位、531位、および534位とも呼ばれる）は、図１に示したようなヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸522、525、528、5 31、および534、または相対的な位置のアミノ酸をいう。より詳細には、これらの残基の番号付けシステムは、ペプチドの長さまたはこのペプチド内のアミノ酸の位置に関係なく、天然のヒトタンパク質内のアミノ酸の位置に関連する。自己免疫の研究の主要な焦点は、自己反応性Ｔ細胞によって認識される疾患に関連する自己抗原上の優性エピトープの同定である。１型糖尿病患者において、抗原GAD65の免疫優性領域が同定されている（Lohmannら、Lancet 343:1607-08， 1994；Atkinsonら、J．Clin．Invest．94:2125-2129，1994）。本発明では、１型糖尿病患者内の免疫優性領域の詳細なＴ細胞エピトープマッピングを行った。解読のためにGAD65の２つの領域が選択され、これらは、１型糖尿病患者（アミノ酸残基473-555および161-243）ならびにコントロール被検体（アミノ酸残基16 1-243）の両方で高い頻度のＴ細胞応答に関連する領域を表す（図２および図４）。領域473-555に応答する９人の糖尿病患者を選択して、この領域をカバーする18個の単一ペプチドに対するそれらの応答をさらに研究した。７個のペプチドに対してのみＴ細胞反応性が認められた。試験を行った患者のほぼ半数がペプチド521-535に応答したが、コントロールはいずれも応答しなかった（図２）。GAD 65のペプチド521-535に対するＴ細胞反応性は遺伝学的には決定されないようである。何故なら、このペプチドに応答する２人の１型糖尿病患者の一卵性双生児の糖尿病ではない相手(non-diabetic identical co-twins)は彼ら自身応答しなかったからである。優勢に糖尿病患者でＴ細胞反応性を示した他の領域としては、525-539、533-547、および537-551（図２）が挙げられる。ペプチドマッピングデータを、応答性の個体内の選択されたペプチド、例えばペプチド521-535および505-519に特異的なT細胞クローンを確立することによって確認した。Ｉ型糖尿病はHLA DQβ1^*0302対立遺伝子と関連する（NepomおよびErlich、Ann ．Rev．Immunol．9:493-525，1991）。ヒトDQβ1^*0302遺伝子を発現するトランスジェニックNODマウスが構築された。これらのマウス由来のＴ細胞は、ペプチド493-507および505-519によって、ならびにGAD65の天然のタンパク質によって刺激され増殖する。従って、これらのペプチドは、DQβ1^*0302の状況においてＴ細胞によって認識され、そして本発明で使用するのに適したさらなるペプチドである。目的の別の領域であるペプチド161〜243は、１型糖尿病患者およびコントロールの両方と同様の割合で免疫優性であった。領域161〜243を、この領域内の同じエピトープが糖尿病患者およびコントロールにより認識されるかどうかを明らかにするために、解読した。この領域のエピトープマッピングにより、この領域を解読するのに用いられたペプチドのどれも、患者およびコントロールの両者により認識されなかったことが示された。ペプチド173〜187、177〜191、193〜207、 201〜215、および213〜227は、１型糖尿病患者（図２）によってのみ認識された。しかし、ペプチド173〜187に対するＴ細胞応答は、単に糖尿病を患っていることに関係しただけではなかった。なぜなら、ペプチド応答者であった２人の糖尿病患者の糖尿病を患っていない一卵性双生児の相手由来のＴ細胞もまたこのペプチドに応答したからである。もし遺伝的要因がペプチド173〜187に対する反応性を排他的に決定したのなら、一卵性双生児は、糖尿病であろうとなかろうと、同様のペプチド反応性を示すはずである。研究された双生児は、ペプチド173〜187 および177〜191に対して同様の応答性を示した。このことは、厳密な遺伝的効果と一貫している。環境的要因は、エピトープ認識のプロファイルを調節し得る。例えば、免疫化の後は、他の分子に対して、および特定の分子内の両方にエピトープ認識は広がる（Lohmannら、Immunol Today、14: 203-206、1993）。さらに、トランスジェニック動物の研究により、利用可能な抗原の量により調節される二次優性(subdo minant)Ｔ細胞レパートリーの存在が証明された（Cabaniolsら、EUr．J．Immuno l．24:743-1749、1994）。これらの二次優性または隠れた（すなわち、通常は認識に利用可能ではない）エピトープは、自己免疫の発達において、重要であり得る（Sercarzら、Ann．Rev．Immunol．11:729-766）。環境的要因は、エピトープ認識のプロファイルを調節し得る。例えば、ペプチド161〜175は、２人のコントロール被験体により認識されたが、糖尿病患者の誰にも認識されなかった。糖尿病を患った一卵性双生児由来のＴ細胞もまた、このペプチドを認識できなかったが、彼らの糖尿病を患っていない双生児の相手は、このペプチドに応答した。従って、521〜535のようないくつかのペプチドに対する反応性は、疾患と特異的に関連しているが、161〜175のような他のペプチドは、１型糖尿病を患っていない被験体によってのみ認識される。従って、１型糖尿病患者とコントロールとの間の異なる反応性は、糖尿病の素因を検出する方法の中で用いられ得る。本明細書中に記載されているペプチドは、IDDM患者もしくはIDDMを発症する素因のある個体由来の病原性T細胞と特異的に相互作用し、そして機能的にそれらの細胞を不活性化するアナログを開発するのに利用され得る。通常、ペプチドは、鍵となるアンカーまたは接触残基によるMHCへの結合を介して、免疫システムにより認識されるが、このペプチド内の他のアミノ酸が、Ｔ細胞による認識には必須である（Ｔ細胞接触部位）。本明細書中に記載されているように、非常に重要な残基を選択的に変化させることによる天然のペプチドの改変（改変されたペプチドリガンドすなわち「APL」）は、抗原特異的な自己反応性Ｔ細胞の非反応性を誘導し得るか、またはその応答性を変化し得る。ペプチドリガンドを改変する方法の作用のメカニズムは、Ｔ細胞レセプター（TCR）の不完全な動員を含み得る。APLが誘導し得る、可能な機能的改変はいくつかある。これらには：（ａ）単純なアンタゴニスト−APLは、抗原提示細胞上の天然のペプチドと、M HC結合について競合し得るのみであり、そしてＴ細胞の完全な活性化を可能にするわけではない。このことは、APLによりＴ細胞レセプターを通して伝達されるシグナルはないことを暗示している。（ｂ）アネルギー−APLは、Ｔ細胞が天然のペプチドに応答しなくなるように、完全な非応答性状態をＴ細胞において誘導し得る。（ｃ）表現型の切り替え−APLは、前炎症性(proinflammatory)サイトカインの生成を減少させるように、Ｔ細胞において機能的な切り替えを誘導し得、および／または、IL-4またはIL-10のような非炎症性サイトカインの生成を増加させ得る。グルタミン酸デカルボキシラーゼのペプチドアナログ上記のように、本発明は、例えば、ヒトＧＡＤの残基５２１〜５３５から選択され、そして天然に存在するアミノ酸の他のアミノ酸への改変を含む、少なくとも７個のアミノ酸を有するペプチドアナログを提供する。ペプチドアナログは、好ましくは、７〜２０アミノ酸であり、そして通常は２５アミノ酸以下である。特に好ましいペプチドアナログは、１５アミノ酸の長さである。任意のアミノ酸の改変体が本発明の範囲内である。好ましいペプチドアナログは、Ｌ−アミノ酸の以下のアミノ酸：Ｄ−リジン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、ロイシン、またはセリンのうちの任意の１つへの改変を含む。これらのアミノ酸は、保存的アミノ酸（類似の電荷、極性、疎水性、および大きさ）および非保存的アミノ酸の両方を含む。代表的には、非保存的アミノ酸の改変体のみが治療効果を提供すると予想され得るが、意外にも保存的変化（例えば、アルギニン）でさえ、天然のペプチドと比較して、ペプチドアナログの機能に大きな影響を与える。このような置換の多様性は、上記の好ましいアミノ酸が疎水性および親水性、荷電および非荷電、ならびに極性および非極性であるという事実によりさらに示される。ペプチドおよびペプチドアナログは、自動化された手順による合成を含む、標準的な化学的技術によって合成され得る。一般に、ペプチドアナログは、固相ペプチド合成法によって調製される。この合成法には、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いた活性化によって、保護されたアミノ酸残基のそれぞれを、樹脂支持体（好ましくは、４−メチル−ベンズヒドリルアミン樹脂）にカップリングさせ、Ｃ末端アミドを有するペプチドを得る工程を包含する。あるいは、クロロメチル樹脂（メリフィールド樹脂）を用いて、Ｃ末端に遊離のカルボン酸を有するペプチドを得ることができる。側鎖官能基は、例えば、以下のように保護される：セリン、スレオニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸に対してはベンジル基；ヒスチジンおよびアルギニンに対してはトシル基；リジンに対しては２− クロロベンジルオキシカルボニル基、およびチロシンに対しては２,６−ジクロロベンジル基。カップリング後、加えたアミノ酸のαアミノ官能基におけるｔ− ブチルオキシカルボニル保護基をトリフルオロ酢酸で処理し、続いてジ−イソプロピル−エチルアミンで中和することにより除去する。次いで、次の保護残基を遊離アミノ基にカップリングさせ、ペプチド鎖を延長する。最後の残基を結合させた後、保護されたペプチド樹脂をフッ化水素で処理してペプチドを樹脂から切断し、そして側鎖官能基を脱保護する。粗生成物を、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、分配クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製し得る。本発明のペプチドアナログは、（ａ）対応する天然のＧＡＤペプチドとＭＨＣへの結合を競合し；そして（ｂ）対応する天然のペプチド特異的Ｔ細胞の増殖を引き起こさないべきである。従って、候補ペプチドアナログは、（１）ＭＨＣへの競合結合を測定するアッセイ、および（２）Ｔ細胞増殖を測定するアッセイによって糖尿病を処置するそれらの能力がスクリーニングされ得る。天然のペプチドの結合を阻害し、そしてＧＡＤ反応性Ｔ細胞の増殖を刺激しないアナログは、治療に有用である。ＭＨＣ分子へのペプチドの結合が全細胞においてアッセイされ得る。簡潔には、適切なクラス１１分子を発現するエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒトの抹消血が、アッセイに使用される。細胞へのペプチドアナログの結合は、蛍光アッセイによって測定される。このアッセイにおいて、ＥＢＶ −形質転換Ｂ細胞を異なる濃度のペプチドアナログと混合し、そしてＣＯ₂インキュベーター中３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、対応する天然のＧＡＤペプチドをビオチン標識し、そして培養ウェルに加える。細胞をさらに１時間インキュベートし、次いで培地で３回洗浄する。フィコエリトリン結合ストレプトアビジンまたはフルオレセイン結合ストレプトアビジンを添加し、そして細胞を氷上で約３０分間インキュベートする。インキュベーション後、フローサイトメトリーで分析する前に細胞を２回洗浄する。ビオチン標識したＧＡＤペプチドおよびフィコエリトリンーストレプトアビジンから得た蛍光値（実験染色）から、フィコエリトリン−ストレプトアビジンのみで染色した細胞から得た蛍光値（コントロール染色）を減算することによって、蛍光強度を計算する。アナログを用いない染色は、１００％の値を確立する。阻害パーセントを各アナログについて計算し、そしてＩＣ₅₀値として表す。１００μＭ未満のＩＣ₅₀ を有するペプチドアナログは、さらなるスクリーニングのために適切である。候補ペプチドアナログを、Ｔ細胞の増殖を刺激または阻害するそれらの特性についてさらに試験する。２つの異なるアッセイが代替法として用いられ得る。１番目に、Ｔ細胞の増殖を引き起こすアナログの能力を直接的な様式で測定する。２番目のアッセイは、天然のＧＡＤペプチドによって誘導されるＴ細胞の増殖を阻害するペプチドアナログの能力を測定する。直接的な増殖アッセイにおいて、対応する天然のＧＡＤペプチド反応性Ｔ細胞は標的細胞として用いられる。Ｔ細胞クローンを、丸底マイクロタイターウェル中で３連で３日間の増殖を３連で試験した。各クローンの１０，０００個のＴ細胞を一度洗浄し、そして２〜３×１０⁴照射（４５００rad）した自己由来のＰＢＭＣまたは照射（１６，０００rad）したエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたＢ細胞に、１０μｇ／ｍｌの適切なペプチドと共に添加した。収穫およびカウントする前の最後の６時間に、０．５μＣｉ[³H]−チミジンを添加した。刺激指数（ＳＩ）を（Ｔ細胞、ＡＰＣおよび抗原を有する全ｃｐｍ／Ｔ細胞およびＡＰＣのみを有するｃｐｍ）として計算した。２番目または別のアッセイは、Ｔ細胞増殖についての競合アッセイである。このアッセイにおいて、抗原提示細胞（例えば、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞）を最初に照射し、次いで、対応する天然のＧＡＤペプチドとともに２〜４時間インキュベートする。次いで、これらの細胞を洗浄し、そしてＧＡＤペプチドに反応性であるＴ細胞とともにさらに培養する。種々の濃度の候補ペプチドアナログをさらに３日間培養物に含ませる。このインキュベーション期間の後、各培養物に１μＣｉの[³H]−チミジンをさらに１２〜１８時間パルスする。次いで培養物をファイバーグラスフィルター上に回収し、そして上記のように計数する。平均のＣＰＭおよび平均の標準誤差を３連の培養物において決定したデータから計算する。増殖を５０μＭ以上の濃度で約２５％に阻害するペプチドアナログは、さらなるスクリーニングに適切である。ＧＡＤのＭＨＣへの結合について競合し、そしてＴ細胞の増殖を直接引き起こさず、そして／または対応する天然のＧＡＤペプチドによる増殖を阻害し得る候補ペプチドが、本明細書中に記載するように用いられ得る。糖尿病の処置上記のように、本発明は、本明細書中に記載のように、治療的に効果的な量のヒトGADのペプチドアナログを患者に投与することによって糖尿病を処置するための方法を提供する。そのような処置に適した患者は、National Diabetes Data Group(Gleichmanら、Diabetes 38:578-584、1987)によって規定されるIDDMの診断を確立する基準によって同定され得る。糖尿病の効果的な処置は、いくつかの異なる手段において試験され得る。以下の基準のいずれかを満たすことによって効果的な処置が明示される。主に使用する基準は(ａ)外因性インシュリンの要求の減少、(ｂ)内因性インシュリンの産生の増大、および(ｃ)血漿グルコースレベルの標準化である。 IDDMを発症する危険性のある個体、従って本明細書に記載の予防的処置の候補者は、その遺伝子型が糖尿病およびIDDM患者の親族と正に相関する(例えば、HLA -DR1，DR3、DR4、DQ1，DQ2、DQ6、およびDQ8)。これらの個体はまた、インスリン、島細胞抗原、およびGADのような種々の自己抗原に対する自己反応性(auto-r eactive)抗体の存在によって同定され得る。予防の状況におけるペプチドアナログの効力は、以下の基準に基づいて判断される：限界希釈（limiting dilution）によって決定されるGAD反応性Ｔ細胞の頻度、GAD反応性Ｔ細胞株およびクローンの増殖応答、患者から確立されたGADに対するＴ細胞株およびクローンのサイトカインプロフィール。効力は、反応性細胞の頻度の低下、天然のペプチドと比較した場合の改変したペプチドのチミジンの取り込みの減少、ならびにTNFおよびIFN-γの減少によって確立される。本発明のペプチドアナログは、単独で、または薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。簡潔には、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載する１つ以上のペプチドアナログを含み得る。このような組成物は、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水のような緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランのような炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、ED TAまたはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、および防腐剤を含み得る。さらに、本発明の薬学的組成物はまた、例えば免疫抑制剤のような１つ以上のさらなる有効成分を含み得る。本発明の組成物は、例えば、経口、鼻、静脈、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む記載する投与様式のために処方され得る。本発明の他の実施態様において、本明細書に記載の組成物は、持続性放出移植物の一部として投与され得る。なお別の実施態様において、本発明の組成物は、凍結乾燥剤としての安定性を提供する適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥剤として処方され、その後、水和され得る。本発明の薬学的組成物は、処置(または予防)されるべき疾患に適切な様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の症状、ならびに患者の疾患の型および重篤度のような要素によって決定される。本発明の特に好ましい実施態様においては、本明細書中に記載のペプチドアナログまたは薬学的組成物は、５〜50mg /kgの用量の範囲で投与され得るが、適切な用量は臨床試験によって決定され得る。血中グルコースレベルおよび/またはグルタミン酸デカルボキシラーゼに対する自己抗体のレベルにおける減少をモニターすることによって、治療的有効性について患者をモニターし得る。以下の実施例を、限定のためではなく例示のために提示する。実施例実施例１ GAD65 ペプチドの生成 GAD65を完全にカバーする11残基がオーバーラップしている一連の15マーを、マルチピン法（Reeceら、J．Immunol．151: 6175-6184、1993）によって合成した。ペプチドを、40%アセトニトリル(HPLC等級)／水中、0.05M HEPES pH7.5〜7. 6中にて切断し、代表的なペプチドの純度をHPLCを用いて＞80％であると評価した。実施例２ GAD ペプチドアナログの調製固相方法論により、ペプチド合成機（Beckman model 990）でペプチドを合成した。p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂（MBHA樹脂）を用いて、アミド化されたカルボキシル末端を有するペプチドを調製した。遊離のカルボキシル末端を有するペプチドについては、適切に保護されたアミノ酸と結合したMerrifield樹脂を用いた。両樹脂は、Bachem Fine Chemicals（Torrance、CA）から入手した。合成に用いた誘導体化アミノ酸（Bachem Fine Chemicals）は、他に特定しない限りＬ-配置を有しており、そしてN-α-アミノ官能基はt-ブチルオキシカルボニル基によってのみ保護されていた。側鎖官能基は保護されていた。例えば：セリン、スレオニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸についてはベンジル；ヒスチジンおよびアルギニンについてはトシル；リジンについては2-クロロベンジルオキシカルボニル、およびチロシンについては2,6-ジクロロベンジルであった。Lingら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA81: 4302、1984）に従い、カルボキシル末端アミノ酸のMBHA樹脂に対する結合を、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて行い、その後のアミノ酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミドと結合した。最後のアミノ酸を組み込んだ後、t-ブチルオキシカルボニル保護基を除去し、そしてペプチド−樹脂結合体を、樹脂結合体１グラムあたりの混合物14mlのフッ化水素酸（HF）1.4mlのアニソール、および0.28mlのメチルエチルスルフィドで、 −20℃にて0.5時間、そして０℃にて0.5時間処理した。HFを０℃にて真空で除去し、そして得られたペプチドおよび樹脂混合物を、ジエチルエーテルで２回、そしてクロロホルムおよびジエチルエーテルで交互に２回洗浄した。ペプチドを２ M酢酸で５回抽出し、抽出物を凍結乾燥した。凍結乾燥した産物をまず、30％酢酸中で発展させたSephadex G-25 fineカラム（Pharmacia-LKB、Piscataway、NJ ）で精製して、短縮されたフラグメントおよび無機塩を除去した（Lingら、1984 ）。次に、CM-32カルボシキメチルセルロースカチオン交換クロマトグラフィー（Lingら、1984）によってペプチドをさらに精製した。Sephadex G-25 fine上におけるパーティションクロマトグラフィー（Lingら、1984）によって、最終精製を達成した。合成産物をアミノ酸分析、質量分光分析、および逆相HPLCによって特徴付けた。実施例３長期ヒトＴ細胞株 GADペプチド特異的Ｔ細胞クローンの樹立。１人の健常者PS（表１中のコントロールA1）、および２人の1型糖尿病患者SKおよびST（表１中の１型患者B1およびB6）から、ペプチド特異的クローンを生成した。ペプチドを用いて、４〜５日間PBMC（５×10⁶）を刺激した。PMBCをさらに、インターロイキン２（IL-2、20n g/ml）の存在下で５日間（RPMI 1640/10％ヒト血清）培養した。次いで、細胞を 0.3細胞／ウェルで96ウェルプレート（Nunc）に入れ、照射された（4500 rad＝4 5 Gy）、異種抹消血単核細胞（PBMC、１×10⁶細胞／ml）、35ng/ml抗CD3モノクローナル抗体（OKT3、ATCC，Maryland）および20ng/ml IL-2（Hoffmann-La Roch e、Nutley、NJ）によって刺激した。OKT3、IL-2および、照射された異種PBMCを用いて１〜２週間毎に再刺激することにより、全てのクローンのさらなる拡張および維持を達成した。サイクルの最後、かつIL2への最後の曝露の最低５日後に、アッセイを行った。丸底マイクロタイターウェルでの増殖アッセイにて、クローンを３連で試験した（図３）。各クローンのＴ細胞（１×10³）を１回洗浄し、２〜３×10⁴個の照射された（4500 rad）自己PBMCまたは照射された（16,000 rad）Epstein-Barrウィルス（EBV）形質転換Ｂ細胞（後述）に、10μg/mlの適切なペプチドとともに添加した。採取および計測前の最後の６時間の間に、0.5μC l[³Ｈ]-チミジンを添加した。刺激指数（SI）を、（Ｔ細胞、APC（抗原提示細胞）、および抗原での総cpm／Ｔ細胞およびAPCのみでのcpm）として計算した。試験した全ての４つのクローンは、GAD65のペプチド521〜535に応答した（図３）。実施例４抗原特異的ヒトＴ細胞株増殖アッセイ増殖アッセイ。増殖アッセイを、２０μl／ウェルの最終容量中に１ウェルあたり２×１０⁵細胞を用いて、９６ウェル丸底プレート（Nunc，Roskilde，Denma rk）で行った。破傷風毒素（ＴＴ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，Difco，E ast Molesey，UK）、および１組の免疫優性破傷風毒素ペプチド（Reeceら、J．I mmunol．115: 6175-6184，1993）を、ポジティブコントロールとして使用した。各ペプチドプール（ＧＡＤ−またはＴＴ−ペプチド）に１６ウェル、３２ネガティブコントロールウェル、および両方のポジティブコントロール（ＰＨＡおよびＴＴ）に８ウェルを使用した。あるいは、７日間のアッセイでは、１ペプチドあたり１２ウェル、２４ネガティブコントロールウェル、および１ポジティブコントロールあたり３ウェルをプレーティングした。培養物を、３７℃、５％ＣＯ₂ 雰囲気で、４日または７日間インキュベートした。最後の６時間、１ウェルあたり０．５μCiの［³Ｈ］−チミジン（Amersham，Little Chalfont，UK）を添加し、その後、回収しそしてベータプレートカウンター（Wallac，Turku，Finland）を使用してシンチレーション計数した。本発明者らの研究によると、正常と比較して、分子のどの領域がＩＤＤＭＴ細胞によって認識されるかに差異があるということが示された。正常な人およびＩＤＤＭ患者両方のＴ細胞によって認識されたＧＡＤの免疫優性領域が、分子の中心を指向した一方で（例えば、残基161-243）、領域473-555は、ＩＤＤＭ患者からのＴ細胞によってしか認識されなかった。図２に示すように、１型糖尿病患者は、ペプチド173-187(3/7)、177-191(2/7)、193-207(2/7)、201-215(1/7)、21 3-227(1/7)、521-535(3/7)、525-539(1/7)、および537-551(1/7)にのみ応答した。別のペプチド533-547は、コントロールの１つと比較して、糖尿病患者由来のＴ細胞７つのうち３つを刺激した。さらに、２人の非糖尿病の双生児の相手は、ペプチド521-535に対して応答しなかったが、彼らの糖尿病の双生児は、このペプチドに実際応答した。さらに、先に示すように、161-175領域に対する応答は、非糖尿病にのみ見られた（データ示さず）。ＧＡＤ521-535に特異的なＴ細胞クローンは、ＩＤＤＭ患者および図３に示すこの患者のペプチドに対する応答から確立された。本発明の具体的な実施態様が、例示を目的として、本明細書中で記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得るということが、前述の内容から理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によって以外は制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/573 Ｂ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/56 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人セントバーソロミューズホスピタルセンターフォークリニカルリサーチイギリス国イーシー１エイ７ビーイーロンドン，バーソロミュークローズウエストスミスフィールド 59，ドミニオンハウス (72)発明者ロンディ，マルコイギリス国ダブリュー４２エルユーロンドン，チッスウィックハイロード，プレベンドマンションズ３ (72)発明者レスリー，アール．デイビッドジー. イギリス国エスダブリュー３５エルエイロンドン，ブラメルトンストリート 24 (72)発明者コンロン，ポールジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92075, ソラナビーチ，サンタドミンガ 450 (72)発明者リン，ニコラスアメリカ合衆国カリフォルニア 92121, サンディエゴ，ボローチストリート 5324 (72)発明者ガウル，アミタブアメリカ合衆国カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ピクルスストリート 12570

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される７個〜15個のアミノ酸からなる、ペプチド。２．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、ここで52 1〜535に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。３．前記ペプチドアナログのＮ末端アミノ酸がＤアミノ酸である、請求項２に記載のペプチドアナログ。４．１つのアミノ酸が改変され、そして該改変されたアミノ酸が、522位のアルギニン、525位のアルギニン、528位のリジン、531位のプロリン、および534位のリジンからなる群より選択される、請求項２に記載のペプチドアナログ。５．前記522位のアルギニン残基が、別のアミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。６．前記522位のアルギニン残基が、アラニン残基に改変されている、請求項５に記載のペプチドアナログ。７．前記525位のアルギニン残基が、別のアミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。８．前記525位のアルギニン残基が、アラニン残基に改変されている、請求項７に記載のペプチドアナログ。９．前記528位のリジン残基が、別のアミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。 10．前記528位のリジン残基が、アラニン残基に改変されている、請求項９に記載のペプチドアナログ。 11．前記531位のプロリン残基が、別のアミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。 12．前記531位のプロリン残基が、アラニン残基に改変されている、請求項11に記載のペプチドアナログ。 13．前記534位のリジン残基が、別のアミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。 14．前記534位のリジン残基が、アラニン残基に改変されている、請求項13に記載のペプチドアナログ。 15．前記改変されたアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されており、該改変されたアミノ酸残基が、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、ロイシン、セリン、グリシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびアラニンからなる群より選択される、請求項２に記載のペプチドアナログ。 16．前記アナログが、12個のアミノ酸である、請求項２に記載のペプチドアナログ。 17．前記アナログが、15個のアミノ酸である、請求項２に記載のペプチドアナログ。 18．前記改変されたアミノ酸が、非保存的アミノ酸に改変されている、請求項２に記載のペプチドアナログ。 19．前記ペプチドアナログのＮ末端およびＣ末端アミノ酸が、Ｄアミノ酸である、請求項２に記載のペプチドアナログ。 20．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも10個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、521〜535 に対応するそれらの残基由来の少なくとも２つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 21．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、525位のアルギニン、528位のリジン、531位のプロリン、および534位のリジンからなる群より選択される１〜３個のＬアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 22．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基173〜187から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、173〜187 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 23．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基177〜191から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、177〜191 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 24．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基193〜207から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、193〜207 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 25．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基201〜215から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、201〜215 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 26．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基213〜227から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含む、プチドアナログであって、213〜227 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 27．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基493〜507から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、493〜507 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 28．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基505〜519から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、505〜519 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 29．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基525〜539から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、525〜539 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 30．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基533〜547から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、533〜547 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 31．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基537〜551から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、537〜551 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変されている、ペプチドアナログ。 32．前記改変されたアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、ロイシン、セリン、グリシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、およびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている、請求項20〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 33．前記ペプチドアナログのＮ端末アミノ酸が、Ｄアミノ酸である、請求項20〜 31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 34．前記ペプチドアナログが、15個のアミノ酸である、請求項20〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 35．前記ペプチドアナログが、12個のアミノ酸である、請求項20〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 36．前記改変されたアミノ酸の少なくとも１つが、非保存的アミノ酸に改変されている、請求項20〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 37．前記Ｎ端末アミノ酸および前記Ｃ端末アミノ酸が、Ｄアミノ酸に改変されている、請求項20〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 38．ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基521〜535から選択される少なくとも７個のアミノ酸を含むペプチドアナログであって、521〜535 に対応するそれらの残基由来の少なくとも１つのアミノ酸が、天然のタンパク質中でその位置に存在するアミノ酸以外のアミノ酸に改変され、かつ、該ペプチドアナログのＮ端末アミノ酸およびＣ端末アミノ酸が別のアミノ酸に改変され、これにより、該ペプチドアナログのインビボでの投与の際にタンパク質分解が低減される、ペプチドアナログ。 39．請求項２〜31のいずれかに記載のペプチドアナログを、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する、薬学的組成物。 40．糖尿病を処置するための医薬の製造に使用するための、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせた、請求項２〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 41．患者において自己免疫応答を改善するための医薬の製造に使用するための、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせた、請求項２〜31のいずれかに記載のペプチドアナログ。 42．糖尿病を検出する方法であって、 (a)患者からの生物学的サンプルの一部を、請求項１〜31のいずれかに記載の第１のペプチドまたはペプチドアナログに接触させる工程と、 (b)ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基161〜175から選択される７個〜15個のアミノ酸を含む第２のペプチドに、該生物学的サンプルの別の一部を接触させる工程と、 (c)該第１および第２のペプチドに対する応答を検出し、これによって該患者が糖尿病を有するかどうかを決定する工程と、を包含する、方法。 43．糖尿病の素因を検出する方法であって、 (a)糖尿病を発症する危険性のある個体由来の生物学的サンプルを、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65kDのイソ型の残基161〜175から選択される７個〜15個のアミノ酸を含むペプチドに接触させる工程と、 (b)工程(a)からの該ペプチドに対する応答を検出する工程と、 (c)免疫応答を成熟させるのに十分な時間が工程(a)後に経過した時点で、該個体由来の第２の生物学的サンプルを、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼの65 kDのイソ型の残基161〜175から選択される７個〜15個のアミノ酸を含むペプチドに接触させる工程と、 (d)工程(c)からの該ペプチドに対する応答を検出する工程と、 (e)工程(b)および(d)から得た値を比較し、これによって糖尿病の素因を決定する工程と、を包含する、方法。