JP2000512008A

JP2000512008A - Ｔ細胞反応性をモニタリングするための方法

Info

Publication number: JP2000512008A
Application number: JP09542727A
Authority: JP
Inventors: ジー．スパック，エドワード; ジー．ウェナー，ナンシー; エイ．マッカチェオン，マイケル
Original assignee: アナージェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2000-09-12
Also published as: CA2256693A1; EP0912895A1; AU3138797A; EP0912895A4; WO1997045735A1; US5750356A; US6218132B1; AU718527B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗原によるＴ細胞の刺激により分泌が誘導される可溶性因子を検出することによる、この抗原に対して反応性のＴ細胞の検出のための高感度のアッセイを提供する。本アッセイは、照射された抗原提示細胞（APC）および抗原での再刺激の前に、特異的Ｔ細胞の抗原駆動増殖を含む。例示的な実施態様において、本アッセイを用いてインターフェロン-γ（IFN-γ）およびインターロイキン-2（IN-2）を分泌するヒト末梢血単核細胞（PBMC）の検出限界を高める。本アッセイは、予め凍結されたPBMCで実施され得、このことは、試料処理でのさらに大きな利便性、内部標準としての単一試料の複数の使用、および異なる時点で収集した試料の同時分析を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ細胞反応性をモニタリングするための方法関連出願への相互参照本出願は、同一人に譲渡された、1996年５月31に出願された特許出願である米国特許出願657,939号の一部継続出願である。この出願は、本明細書中に参考として援用される。発明の背景本発明は、活性化Ｔ細胞による可溶性因子分泌の検出に関する。特に、本発明は、標準的なELISPOTアッセイの改変に関する。ワクチンの設計からＴ細胞特異的免疫抑制に及ぶ治療的ストラテジーは、免疫優性Ｔ細胞エピトープの同定およびＴ細胞頻度の数値化を必要とする。いくつかのアッセイは、この情報を提供するために現在用いられる。改変された増殖アッセイは、≧2.0の刺激指数に基づいてＴ細胞エピトープを同定するために用いられている（Plebanski，M.およびBurtles，S.S.，J．Immunol．Meth．170:15(199 4)）が、このアッセイは血清の変化に非常に敏感であり、そしてしばしば大規模臨床スクリーニングは困難であると判明する。限界希釈アッセイ（LDA）は、比較的大きなPBMC量および２回のインビトロ刺激を用いて、抗原全体またはペプチドに対するＴ細胞応答を検出する（Sharrock，C．E．M.ら，Immunol．Today 11: 281-286(1990)）。このアッセイは、同種異系反応性Ｔ細胞についておよそ1/10³ 〜1/10⁵（Sharrock，前出）から自己反応性Ｔ細胞についての10⁶〜1/10⁷（Weine r，H．L.ら，Science 259:1321(1993)）の範囲の抗原特異的CD4+Ｔ細胞頻度の推定値を提供した。LDAは、臨床試験における効力をモニタリングするために用いられてきたが、必要とされるPBMC（末梢血単核細胞）の量により、頻繁な採血または多数の候補ペプチドのスクリーニングを必要とする場合には、このアッセイの適用は制限される。いくつかのフローサイトメトリー方法は、CD69のような特徴的なマーカーのアップレギュレーションによりＴ細胞活性化を検出し得る。活性化により誘導されたＴ細胞リンホカイン産生は、分泌のモネンシンブロック、サポニン透過化、および間接的免疫蛍光染色（Jung，T.ら、J．Immunol． Meth．159:197(1993)）を用いるフローサイトメトリーにより、または分泌細胞の表面上での分泌されたリンホカインの捕捉（Manz，R．ら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 92:1921(1995)）により測定され得る。これらのフローサイトメトリー技術は、同種異系反応性またはスーパー抗原刺激において生じるような比較的高頻度のＴ細胞応答の場合は十分に敏感であるが、しかし、これらはほとんどの稀な抗原特異的Ｔ細胞を検出し得ない。リンホカイン分泌のELISAアッセイは、同様に、プライムされたＴ細胞、Ｔ細胞クローン、または高頻度のＴ細胞の応答が測定される場合に制限される。リンホカインmRNAのインサイチュハイブリダイゼーションは、1/10⁴〜1/10⁵の範囲の頻度の抗原特異的Ｔ細胞を検出するために十分に敏感である（Link，J.ら，Neurol．44:728(1994)；Link，J．ら，Ann．Ne urol．35:197(1994)）が、この技術は、大きな試料数を容易に測定し得ない。イムノスポットまたはELISPOTアッセイと称されるELISAアッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の改変物が、抗原刺激後の個々のＴ細胞によるリンホカイン分泌を検出するために開発されている（Czerinsky，C.ら，J．Immunol．Methods 1 10:29-36(1988)；Olsson，T.ら，J．Clin．Invest．86:981-985(1990)）。しかし、標準的なELISPOTアッセイの感度は低い。例えば、多くの多発性硬化症（MS ）患者については、自己抗原に対するＴ細胞応答の標準的なELISPOTアッセイは、CSFから標本抽出した細胞においてしか検出され得ない。CSFは、困難な標本抽出および低い細胞収量を必然的に伴う。このアッセイによってMBP（ミエリン塩基性タンパク質）のような自己抗原内のペプチドエピトープを同定することは、比較的低い前駆体頻度を考慮するとさらにより困難である。さらに、光学顕微鏡下でELISPOT試料ウェルを計数することは、緩慢であり、そしていくらか主観的である。活性化Ｔ細胞、特に低頻度で生じるＴ細胞によるリンホカイン分泌を測定する改善された方法を有することが望ましい。本発明は、この必要性および関連する必要性を満たす。発明の要旨本発明の１つの局面は、抗原反応性Ｔ細胞を含む疑いのある生物学的試料中のこのＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法は、以下の工程： (a)生物学的試料中のＴ細胞を、Ｔ細胞増殖を可能にするのに十分な第１の期間、抗原で刺激する工程； (b)Ｔ細胞を、可溶性因子の分泌を誘導するために、抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量で再刺激する工程； (c)固体支持体上で可溶性因子を捕捉することにより可溶性因子の存在を検出する工程；および (d)固体支持体上での可溶性因子の存在を、抗原反応性Ｔ細胞の存在と関連付ける工程、を包含する。必要に応じて、例えば、単数または複数のサイトカインおよび／または単数または複数の増殖因子のような第２の可溶性因子が添加されて、継続したＴ細胞増殖を促進し得る。この第２の可溶性因子は、その検出が抗原反応性Ｔ細胞の存在に関連する、可溶性因子と同じかまたは異なり得る。本明細書中に開示される方法を用いて、稀なＴ細胞、特に、自己抗原に反応性のＴ細胞および10⁵個のPBMCあたり１個のＴ細胞ほどの低頻度で生じるＴ細胞を検出し得る。本発明の関連する局面は、アッセイを確認するための内部コントロールとして、凍結されたＴ細胞を用いる。以下の目的のための方法も提供される。 (1)患者の生物学的試料におけるＴ細胞を刺激する抗原の同定、 (2)自己抗原に反応性のＴ細胞を有する患者の同定、 (3)Ｔ細胞の枯渇または不応答を誘導し得る推定薬物のスクリーニング、 (4)抗原特異的クローンの作製における使用のための潜在的な血液ドナーのスクリーニング、 (5)Ｔ細胞エピトープの同定、 (6)免疫抑制の全身状態を誘導し得る薬物／処置の、安全性または効力についてのモニタリング、および (7)単数または複数の抗原に対する経時的な免疫応答のモニタリング。図面の簡単な説明図１は、10日間ELISPOTアッセイを例示する流れ図を示す。図２は、MS患者からのPBMCにおけるMBPおよびMBP 84-102の反応性を示す。図３は、３日間および10日間のELISPOT形式におけるMBPおよびMBP 84-102に対するELISPOT応答の比較を示す。図４は、MS患者の血液から単離されたPBMCが、異なる抗原で処理された場合のアッセイの結果を示す。図4A：平均（大きなバー）および標準偏差（短いバー）を含む、６連試料におけるスポット数の分布。データは、JUMPプログラムにより分析およびプロットされる。図4B：複製試料偏差のレベルを示すために拡大縮尺でプロットした、TTおよびPPD応答を有さない、図4Aからのデータ。図５は、IFN-γおよびIL-2捕捉を用いて測定した、経時的なＴ細胞反応性を示す。図６は、ドナーAN.M043についてIFN-γおよびIL-2捕捉を用いて測定した、経時的なＴ細胞反応性を示す。図７は、選択された抗原による二次刺激の後に多発性硬化症PBMCにより産生されたIFN-γを示す。図８は、３日間および10日間のアッセイ形式で得られたIFN-γスポットの比較を示す。抗原：TT、PPD、自己抗原（MBP、MBP 84-102）。図９は、新鮮に単離されたPBMCおよび融解された凍結PBMCで行ない、次いで10 日間ELISPOTアッセイで行なった２つの実験の比較を示す。細胞は、健康なドナーに由来する。図10は、Ｔ細胞の供給源としての凍結PBMCの使用およびこのアッセイのための再現性のある内部コントロールとしてのその有用性を示す。図11は、アッセイの３日目および５日目におけるIL-2添加の効果を示す。図12は、クローニングにおけるRecall Elispotの使用を示す。図13は、エピトープ同定におけるRecall Ellspotの使用を示す。図14は、抗原特異的臨床試験についての患者反応性の同定を示す。図15は、全身性免疫抑制で見た場合の呼び戻し抗原応答のモニタリングを示す。発明の詳細な説明本発明は、可溶性因子の検出による、抗原と反応性であるＴ細胞の検出に関する。この可溶性因子の分泌は、抗原によるＴ細胞の刺激により誘導される。１つの局面において、本発明は、ELISPOTアッセイに関する。ELISPOTアッセイは、可溶性因子の分泌の検出の前に抗原応答性Ｔ細胞の割台を増大させ、低頻度で存在するＴ細胞のスクリーニングを可能にするのに充分な感度を提供する。結果として、自己抗原ペプチドに反応性であるＴ細胞のような稀なＴ細胞が、以前に可能であったよりも高い信頼性で検出され得、そしてモニターされ得る。アッセイは、代表的に、固相ELISAとして実施される。これは、応答するＴ細胞それぞれからのシグナルを生成し、従ってＴ細胞の数値化を可能にする。１つの実施態様において、シグナルは、酵素標識（「スポット」、ELISPOTの用語による）からの色素原沈降の形態で生成され、そして所望であれば、スポットは分析ソフトウェアに連結されたビデオカメラで定量される。ソフトウェアは、非特異的色素原沈降を総シグナルから客観的に差し引き、そしてスポットの数を迅速に定量する。これらの改変は、エピトープ同定、患者の自己抗原反応性の経時追跡、および臨床試験における治療効力の評価を含むもの由来の適用の際のＴ細胞応答についての高容量のスクリーニングとしてのELISPOTアッセイの使用を容易にする。本発明の１つの局面は、単一細胞によるリンホカイン分泌の標準的なELISPOT アッセイを改変して、方法の感度を増大させる。本明細書中に記載のように、本発明は、種々の可溶性因子を分泌する抗原反応性のＴ細胞の検出を提供する。これらの改変は以下を含む：（1）可溶性因子の検出の前の７日間の抗原応答性Ｔ細胞の増幅、（2）第２の可溶性因子（例えば、サイトカイン（単数または複数）および／または増殖因子（単数または複数））を添加して継続したＴ細胞の増殖を促進にすること、（3）２回目の抗原を抗原提示細胞と共に添加することによりＴ細胞を再刺激して、さらなる可溶性因子を分泌させること、および（4）以前に凍結させたPBMCを内部コントロールとして使用すること。本発明の方法は、本明細書中で多様に言及される。これは、「ELISPOT」アッセイ、「10日間ELISPOT」アッセイ、および「RECALL ELISPOT」アッセイなどを含む。伝統的なELISPOTアッセイを、本明細書中では「標準的な」ELISPOT，「３日間」ELISPOT、「文献で引用されるELISPOTアッセイ」などという。このようなＴ細胞反応性のアッセイは、いくつかの適用を有する：１．自己免疫疾患の早期検出。２．患者の亜集団（例えば、特定のHLA-DR対立遺伝子）および患者全体の集団における重要な自己抗原ペプチドの同定（例えば、Ｔ細胞エピトープの同定）。３．臨床試験への参加のために所定のＴ細胞反応性を有する患者の選択。４．慢性進行疾患の経過および疾患の再発−寛解の間の患者のＴ細胞反応性のモニタリング。Ｔ細胞反応性のパターンは、臨床症状が悪化する前に疾患の再発の発症を予想し、治療養生法の滴定を補助するのに有用であり得る。５．治療養生法の効力の測定。６．Ｔ細胞の欠失もしくは無応答性を誘導し得る推定薬物についてのスクリーニング、または全身性状態の免疫抑制を誘導し得る薬物／処置の安全性もしくは効力についてのモニタリング、および７．抗原（単数または複数）に対する免疫応答の経時モニタリング。従って、本発明の１つの局面は、抗原反応性Ｔ細胞を含むと疑われる生物学的試料中の抗原反応性Ｔ細胞の検出法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（a）Ｔ細胞増殖を可能にするのに充分な時間の間、生物学的試料中のＴ細胞を抗原で刺激する工程、（b）抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量でＴ細胞を再刺激して、可溶性因子の分泌を誘導する工程、（c）固相支持体上で捕捉することにより、可溶性因子の存在を検出する工程、および（d）可溶性因子の存在とＴ細胞の存在とを相関付ける工程。必要に応じて、サイトカイン（単数または複数）および／または増殖因子（単数または複数）を添加して、工程（a）の間または後の継続したＴ細胞の増殖を促進し得る。生物学的試料は、例えば、全血、血清、血漿、鼻分泌物、痰、尿、汗、唾液、経皮浸出液、咽頭浸出液、気管支肺胞洗浄液、気管吸引物、脳脊髄液、滑液、関節由来液、硝子体液、膣分泌物または尿道分泌物などの生物学的液体であり得るが、それらに限定されない。本明細書中において、例えば、毛髪、皮膚、滑膜組織、組織生検、および爪あかのような脱凝集した細胞性組織もまた、生物学的試料とみなされる。アッセイは、血液試料におけるＴ細胞のアッセイに特に有用である。血液試料は、通常赤血球および血小板を除去するために処理され（例えば、フィコル密度遠心分離または他の当業者に公知のこのような方法）、そして目的のＴ細胞、ならびにＢ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む残存PBMC試料はアッセイにおいて直接使用される。Ｔ細胞株は、大量の血液、しばしば一単位程度を必要とする。このような大量の採血は、自己免疫疾患を患う患者にとってしばしば危険である。本明細書中で記載するアッセイは、４×10⁵PBMC／ウェル（すなわち、最初の抗原刺激について２×10⁵のPBMCおよび再刺激について２×10⁵の照射PBMC）を使用する。それゆえ、抗原あたり少なくとも６ウェルの抗原反応性分析には、何本かの15mlの血液収集管が一般に充分である。用語「可溶性因子」は、抗原刺激に反応してＴ細胞により分泌されるタンパク質をいう。分泌された種々の可溶性因子は、本明細書中に開示されるアッセイにより検出され得る。可溶性因子は、サイトカイン、リンホカイン、またはケモカインであり得る。代表的には、この分泌される因子は、以下に列挙されるようなリンホカインである。このアッセイの感度の増大の結果として、低頻度で生じる稀なＴ細胞により分泌される因子が検出され得る。この方法により検出される因子としては、例えば、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-13、TGF- β、およびGM-CSFのような、リンホカイン、サイトカイン、およびケモカインが挙げられるが、それらに限定されない。当業者が理解するように、エピトープの各々が引き続くサンドイッチアッセイ検出工程において使用される特異的結合対メンバーにより認識され得る、２つのエピトープを有する任意の分泌因子が、このアッセイにより検出され得る。この方法は、自己抗原ペプチドに反応性であるＴ細胞のような稀なＴ細胞を検出する際に特定の用途を見出す。用語「サイトカイン」は、他の細胞の挙動に影響を与える細胞により生成されるタンパク質をいう。リンパ球により生成されるサイトカインは、一般に「リンホカイン」またはインターロイキン（略してIL）といわれる。用語「ケモカイン」は、細胞の移動および活性化に影響する、低分子量のサイトカインの部分集合をいう。サイトカインは、インターロイキン（例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6 、IL-10、IL-13など）、マクロファージ武装化因子（macrophage arming factor ）、リンパ球阻害因子、マクロファージ阻害因子、走化因子、インターフェロン、増殖因子（例えばGM-CSF）などを含む。Ｔ細胞増殖の期間は、代表的には３日間より長い。結果が必要とされる速さおよび要求されるアッセイ感度に依存して、この期間は５〜７日間であり得、または10〜14日間程度であり得る。このような長い増殖相では、サイトカインおよび／または増殖因子を増殖相の間の中間点で添加して、継続したＴ細胞の増殖を促進し、そしてアポトーシスによる未熟細胞死を妨害することは一般に有利である。継続したＴ細胞の増殖を促進するためにアッセイ培地に添加されるサイトカインおよび／または増殖因子の選択は、検出されるＴ細胞の部分集合により、部分的に制御される。例えば、IL-2は、IL-2レセプターの発現をアップレギュレートし、そしてＴ_h1細胞の増殖を支持する。一方で、IL-4は、T_h2細胞の増殖を支持する。他の場合において、１つ以上のサイトカインおよび／または増殖因子の組合せが使用され得る。標準的なELISPOTアッセイのこの改変において、単一の前駆Ｔ細胞由来の子孫細胞の数および結果として可溶性因子分泌細胞の量が増大する。これは、使用される固体表面上の「スポット」の数の増大をもたらし、従ってより強いアッセイ応答を提供する。このようなアッセイ応答の増大は、統計学的標本抽出でより敏感に反応し、そしてバックグラウンドに対してより高いシグナル比、より低い標準偏差、およびより高い信頼性を提供する。結果として、生物学的試料中における１／10⁵のPBMCの範囲、頻繁には５／10⁶PBMC程度の低さで、しばしば１／10⁶程度の低さのPBMCの期待頻度を有するＴ細胞が検出可能である。ELISPOTアッセイ以外の検出方法が使用される場合、同様の利点が生じる。「特異的結合対メンバー」（sbpメンバー）は、２つの異なる分子の１つである分子を意味する。この分子は、表面上にまたは空洞内に、他の分子の特定の空間的構成および極性構成に特異的に結合し、それゆえ相補的であると定義される領域を有する。この２つの分子は、それらのお互いへの結合の結果、それらが同様の特徴を有する他のアッセイ構成物からそれらの結合パートナーを識別し得るという意味において、関連している。特異的結合対のメンバーは、リガンドおよびレセプター（抗リガンド）、sbpメンバーおよびsbpパートナーなどといわれる。相補的sbpメンバーは、例えば、リガンドおよびその相補的レセプターとして互いに結合する。sbpメンバーは通常、抗原−抗体のような免疫学的結合対のメンバーであるが、他の特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ホルモン− ホルモンレセプター、核酸二重鎖、IgG−プロテインＡなど）は、免疫学的結合対ではない特異的結合対である。本発明の文脈において、特異的免疫学的結合対は、分泌可溶性因子（例えば、以上に列挙したリンホカイン、サイトカイン、およびケモカイン）に対する抗体、特に抗ヒト抗体およびこれらの分泌因子の特異的なエピトープに対する抗体を含むが、これらに限定されない。「抗体」は、その表面上にまたは空洞内に、別の分子の特定の空間的構成および極性構成に特異的に結合し、それゆえ相補的であると定義される領域を有するイムノグロブリンを意味する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体は、完全なイムノグロブリンまたはそのフラグメントを含み得る。これらのイムノグロブリンは、種々のクラスおよびイソ型（例えば、IgA(IgA1 およびIgA2)、IgD、IgE、IgM、およびIgG（IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4）など）を含む。それらのフラグメントは、Fab、Fv、およびF(ab')₂、Fab'などを含み得る。代表的に、検出前に、複数の二連の試料での上記の刺激／増殖相を実施して、次いで増殖試料をプールすることは有利である。これは、原試料において、ほんのわずかしか存在し得ない（例えば、１〜２個のＴ細胞／10⁵個の細胞程度に低く、ときどき５個のＴ細胞／10⁶個の細胞程度に低い）稀なＴ細胞についてアッセイする場合に特に有用である。検出工程の前に試料をプールすることにより、試料毎の変動が低減し、そしてアッセイの統計学的信頼性は増大する。代表的に、アッセイは、プールする前に三連または六連で行われるが、異なるレベルの多連もまた、使用され得る。プラスチックの丸底ウェル上でアッセイの刺激相を実施することは一般に望ましい。種々のアッセイ形式は、本明細書中に記載されるアッセイにより生成される分泌因子のレベルの増大を検出するために使用され得る。適切なアッセイは、固相（不均質）プロトコルまたは非固相（均質）プロトコルの両方を含む。アッセイは、競合形式または非競合形式を用いて、そして広範な種々の標識（例えば、放射性同位体、酵素、蛍光体、化学発光体、スピン標識など）を用いて、行われ得る。このような方法は、直接形式および逆転形式の酵素結合免疫吸着アッセイ（ ELISA）、ならびに他の固相アッセイを含むが、これらに限定されない。ネガティブコントロール（すなわち、抗原を添加しないで行う試料）、およびポジティブコントロール（すなわち、破傷風トキソイドのような、Ｔ細胞からのリンホカイン分泌を誘発することが公知の抗原を用いて行う試料）は、必要に応じて、アッセイ結果を確証するために、別な方法では多連な条件下で実施される。いくつかのアッセイは、分泌因子に相補的なリガンド（例えば、分泌因子に対する抗体）が、分泌因子を捕捉するために使用される固相へ結合されている、不均質プロトコルに頼る。リガンドは、種々の固相（例えば、ポリビニルジフルオリド（PVDF）（例えば、PVDFメンブレンベース（Millipore MAIPS45-10）を有する96ウェルプレート）およびELISAグレードプラスチックを含む、ディップスティック、粒子、ミクロスフェア、磁気粒子、試験管、マイクロタイターウェル、およびプラスチックメンブレン、ニトロセルロースメンブレンもしくはナイロンメンブレンなど）に都合良く固定化され得る。次いで、捕捉された因子は、直接標識または間接標識されたこの因子の第二のリガンドが、洗浄された固相に曝露される、非競合「サンドイッチ」技術を使用して検出され得る。このようなアッセイ技術は周知であり、そして特許および科学文献の両方において十分に記載される。例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,817,837号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第 3,879,262号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,99 6,345号；同第4,034,074号；および同第4,098,876号を参照のこと。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）方法は、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,879,262号；および同第4,034,074号に詳細に記載される。ELISAアッセイは、分泌因子の非常に低い力価を検出する。「Enzyme immuno histochemistry」、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays、P．Tijssen (Elsevier 1985)もまた、参照のこと。一般に使用されるアッセイ形式は、抗体捕捉アッセイである。一般的なプロトコルは単純である：リガンド（例えば、分泌因子に対する標識されていない抗体）を固相に固定化し、そして分泌因子を固定化抗体へ結合させる。次いで、結合した分泌因子は、捕捉因子に特異的に結合する標識二次試薬を使用することにより検出される（「直接サンドイッチアッセイ」）。あるいは、二次試薬は、標識されていないが、引き続く第二の結合試薬に相補的な標識三次結合試薬への結合により検出される（「間接サンドイッチアッセイ」）。結合標識からのシグナル強度は、試料中に存在する分泌因子の量の決定を可能にし、次いでこれは試料中に存在する活性化Ｔ細胞の数の定量を可能にする。上記のように、サンドイッチアッセイは、エピトープの各々が特異的結合対メンバーにより認識され得る２つのエピトープを有する、任意の分泌因子を検出するために使用され得る。適切な捕捉抗体および検出抗体対の選択は、このアッセイの種々の可溶性因子を分泌するＴ細胞の検出への適用を可能にする。このアッセイにおいて使用され得る抗体対の部分的な表は表１に示される。略語：b.ウシ：g、ヤギ：m、マウス：r、ウサギ：α、抗種々の標識した二次および／または三次試薬が、結合分泌因子の存在を検出するために使用され得る。例は、抗サイトカイン抗体、抗イムノグロブリン抗体、ペルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体、プロテインＡ、およびプロテインＧを含むが、これらに限定されない。本発明での使用に適した検出可能な標識は、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、あるいは化学的手段によって検出可能な任意の組成物を含む。本発明で有用な標識は、蛍光色素および／または蛍光基質（例えば、フルオレッセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質、ELF^TM（Molecular Probes，Eugene，OR，catalog # E-6600）など）が結合した標識したストレプトアビジン結合体を有する染色のためのビオチン、蛍光色素および／または蛍光基質（例えば、フルオレッセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質、ELF^TM（Molecular Probes，Eugene，O R，catalog # E-6600）など）、放射標識（例えば、³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、または³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に使用される他の酵素）、比色標識（例えば、コロイド状金または着色ガラスまたは着色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）性のビーズ）、および化学発光標識を含む。このような標識の使用を教示する特許は、米国特許第3,817,837号;第3,850,752号; 第3,93 9,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;および第4,366,241号を含む。このような標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、放射標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーまたは化学発光マーカーは、放射された光を検出するための写真検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、代表的には、酵素を基質に供給すること、および酵素の作用によって生成された基質上の反応生成物を検出することによって検出され、そして比色標識または蛍光標識は、着色標識または蛍光生成物を単純に可視化することによって検出される。本明細書に記載のように、EL ISPOTアッセイで特に有用な標識は、粒状の生成物を生成し得る標識（例えば、色や蛍光に基づいて検出され得る沈澱生成物を生成する酵素および基質の組合せのような標識）である。このような酵素基質対の組合せは、アルカリホスファターゼおよび4-ブロモ-3-クロロインドリルリン酸/テトラゾリウム塩、ナフトール AS-MXまたはナフトールASリン酸/Fast Blue BBNまたはFast Red TR；西洋ワサビペルオキシダーゼおよび4-クロロ-1-ナフトール、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB )、p-フェニレンジアミン、3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)、5,5'-テトラメチルベンジジンなど；グルコースオキシダーゼ、t-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(t-NBT)/m−フェナジンメト硫酸塩、ならびにアルカリホスファターゼおよびELF^TM-97(Molecular Probes Cat．# E-6602)である。本発明の別の局面で、２回目の刺激が実施される。頻繁には、上記に記載のようなプールされた試料になされるアッセイおよび２回目の刺激が、プールされた試料上でなされる。１つの実験態様では、この２回目の刺激は患者自身の細胞になされる。患者の試料の一部は、代表的には、しばしば液体窒素温度ほど低い温度でアッセイの開始時に凍結することによって、別に保存され、そして残りの部分は上記のように増殖およびプールされる。保存された部分は、増殖能力をブロックするために、照射、化学処理（例えば、マイトマイシンＣ）などによって解凍、処理されて、そして別の回の抗原とともに増殖された試料に加えられる。この手順は、２回目の抗原提供細胞でＴ細胞を刺激するのに役立ち、そして放射は、添加された細胞が独立に増殖しないことを確実にする。代表的には、この２回目の刺激は１〜３日間、好ましくは１日間なされる。細胞が、ゼロ抗原ネガティブコントロールウェル中で混合リンパ球反応および容認出来ないほどの高いバックグラウンドを生じ得るMHC class Iまたはclass I I対立遺伝子のいくつかでのミスマッチを避ける限りは、この２回目の刺激で使用される抗原提示細胞もまた、元の患者とは異なる供給源に由来し得る。例えば、ペプチド結合およびＴ細胞認識に関連する適切なMHC II分子をトランスフェクトされたリンパ球細胞を使用し得る。また、EBV(エプスタイン・バーウイルス) 形質転換Ｂ細胞、患者のMHCハプロタイプと適合する市販の同型接合性の細胞株、または前に調製された患者由来のEBV形質転換Ｂ細胞株のいずれかを使用し得る。最後に、ウェルの表面上に固定化されたMHC II-抗原複合体を用いて、この２回目の刺激を実施し得る。本明細書中で開示される方法は、自己免疫疾患を示す自己抗原を含む種々の抗原に対して反応性であるＴ細胞を検出するのに使用され得る。表２は、疾患状態およびそれらに関連する自己抗原のうちの代表的なおよび制限的でない選択肢を列挙する。ミエリン塩基性タンパク質およびそのペプチド成分は、多発性硬化症を示す。本アッセイで使用され得る特定の自己抗原ペプチドは、MBP 83-102（これは、MB Pの残基83〜102からなるペプチドをいう）および4BP 144-163、主要な神経膠細胞タンパク質ペプチドのMOG 1-20およびMOG 41-60、ならびにプロテオリピドタンパク質ペプチドのPLP 40-60、PLP 89-106、PLP 105-124、PLP 30-49、PLP 95- 116、およびPLP 180-199である。本発明の別の局面は、患者内の抗原反応性Ｔ細胞のレベルを周期的にモニターする方法である。これは、患者内の疾患の進行および寛解を追跡することおよび治療養生法の効力を追跡することも可能にする。本発明の方法は以下を含む：（ａ）患者からPBMCの試料を提供する工程；（ｂ）コントロール試料を提供するためにPBMCの試料の一部を凍結する工程；（ｃ）上記のアッセイを用いて、周期的間隔で患者の抗原反応性Ｔ細胞のレベルをアッセイする工程；（ｄ）上記のアッセイを用いて、コントロール試料の新たに解凍した部分中の抗原反応性Ｔ細胞のレベルをアッセイする工程；および（ｅ）工程（ｃ）と工程（ｄ）とで観測されるレベルを比較して、患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルをモニターする工程。 27．１つの局面では、上記の本発明の方法は、処置前後にRECALL ELISPOTを実行し、そしてアッ七セイの結果を比較することによって、薬物または処置の患者に対する効果をモニターするのに有用である。実施例中でより詳細に記載したように、本明細書中に記載された方法を用いて、細胞の生存度またはそれに続くＴ細胞数値化の正確さに影響をおよぼすことなしに、（代表的には、凍結することによって）保存されたＴ細胞を解凍およびアッセイし得ることを、本発明は実証した。これらの保存されたＴ細胞を進行中のコントロールとして使用することは、患者のＴ細胞レベル中の時間ゆらぎが比較され得る基底線を提供する。それゆえ、患者のＴ細胞カウントにおける任意の観測される変化は、このコントロールに対して正規化され得、もしあれば、残りの変化が、モニターされる特定の疾患状態の進行または寛解に帰属され得る。このような研究は、６カ月ほどの間、頻繁には１〜２年の間保存されているＴ細胞を使用し得る。患者の初期状態の安定したスナップ写真を提供するこのような外部標準を有することの利点は、アッセイにおける低レベルの変化が、患者の状態における実際の変化に帰属され得ることである。疾患状態の目的の測定とは別に、それは、より劇的な臨床的症状が現れる前に、疾患の状態における変化の検出を可能にする。本明細書で開示される方法はまた、どの患者が推定のまたは既知の自己抗原に応答するかを決定するために用いられる。本発明の方法は、推定のまたは既知の自己抗原によって引き起こされる疾患状態のための特定の薬物の効力を試験することを所望する場合の、臨床試験のための患者を選択するのに有用である。本発明の方法はまた、抗原提示細胞として阻止抗体またはトランスフェクトしたＬ細胞を用いることによって、この応答のDR、DP、またはDQ制限を決定するのに役立ち得る。また、抗原、代表的にはそのタンパク質または構成成分が、患者集団の有意な割合において自己抗原であるかどうかを決定／確認する方法を提供する。いくつかの疾患（例えば、慢性関節リウマチ）においては、確認された優性の自己抗原タンパク質はなく、そして本明細書に記載のアッセイは、患者試料のＴ細胞応答と、炎症性の関節由来の種々の全タンパク質とを比較するために使用され得る。他の疾患（例えば、重症筋無力症または多発性硬化症）において、疾患の原因である自己抗原は、既知または推定であるが、しかしＴ細胞応答を支配する自己抗原タンパク質の免疫優性部分は既知ではない。そのような状況では、重複ペプチドの完全なセットまたは関連したMHC II対立遺伝子に強く結合するこれらのペプチドのみのサブセットのいずれかを使用することによって、PBMCは自己抗原由来の種々のペプチドで刺激され得る。さらに、PBMCは、初回の刺激での自己抗原の全体で刺激され得、そして推定の自己抗原ペプチドで再刺激され得る。このようなペプチドは、その配列が既知であるかもしくはペプチドフラグメントが化学的消化または酵素的消化、当業者に公知のすべての方法によって自己抗原から調製され得る場合、固相ペプチド合成法によって調製され得る。また、Ｔ細胞エピトープを決定する方法を提供する。Ｔ細胞エピトープは、しばしば短期株またはクローンの増殖アッセイによって同定される。本発明の方法は、Ｔ細胞株またはクローンを樹立するよりも速く、慣習的なクローン化より少ない血液を必要とし、そして多くの場合、増殖単独の測定より有益なサイトカインプロフィールを提供する。さらに、ペプチド誘導細胞株(Matsuoら、1995)からときに生じるアーチファクトをなくすために、本明細書に記載のアッセイは、全抗原(例えば、ミエリン塩基性タンパク質)または複合抗原混合物（例えば、全脊髄ホモジネート）の初期刺激、およびそれに続くペプチド(例えば、MBP 84-102) による７日目での再刺激によって実施され得る。従って、本発明の方法は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、糖尿病、および慢性関節リウマチ）中の免疫優性エピトープを同定するのに有用である。また、より良好なクローン化の成功を確実にするために、比較的高い前駆体頻度を有する試料を同定する本発明の方法を使用して、候補ドナーをプレスクリーニングすることによって、特定の抗原特異性を有するＴ細胞クローンを獲得する方法を提供する。さらに、アッセイは、この抗原特異的治療の臨床試験への参加 (inclusion)のための患者を認定するための迅速なスクリ−ニングを提供する。本発明はまた、優性免疫応答の安定性、および通常の反応性および自己免疫反応性でエピトープ伝播の起こる程度を決定するために有用なアッセイを提供する。さらに、複合リンホカイン応答は感度よくアッセイされ得るので、疾患発症、再発、緩解、および処置でのTh1/Th2サイトカインプロフィールの役割もまた、決定され得る。本発明はまた、以下によって患者内の抗原反応性Ｔ細胞のレベルをモニターするために有用なアッセイを提供する：(a)別々に少なくとも２回、患者からPBMC の試料を回収し、そして凍結する工程；ならびに(b)試料を解凍し、そして本明細書中に記載のアッセイを用いて試料中の抗原反応性Ｔ細胞のレベルをアッセイする工程。いくつかの場合では、工程(a)の２つの回収工程の間に、患者に対し薬物または処置が投与される場合、このモニタリングを実行することが望ましい。同様に、患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルに対する薬物または処置の効果が、以下によって決定され得る：(a)本明細書中に記載のアッセイを用いて、少なくとも１回、患者中の抗原反応性Ｔ細胞のレベルをアッセイする工程；(b) 患者に対し、薬物または処置を投与する工程；(c)薬物または処置の投与後に、少なくとも１回、患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを再アッセイする工程；および(d)工程(a)および工程(c)で観測されるレベルを比較して、患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルに対する、薬物または処置の効果を決定する工程。この方法は、副作用（例えば、免疫抑制）または効力（例えば、薬物／処置が、一般的にまたは特異的に免疫抑制であるか、もしくは一般的または特異的に免疫抑制であると推定される場合）のような、薬物または処置の特性を決定するために、有用である。本発明はまた、例えば、以下によって、疾患（例えば、自己免疫疾患）または症状に関連するＴ細胞エピトープ（例えば、免疫優性エピトープ）を同定する方法を提供する：(a)個体の第１の集団由来のＴ細胞の抗原への反応性を決定する工程（ここで、この個体は疾患または症状を有すると診断されている）；(b)個体の第２の集団由来のＴ細胞の抗原への反応性を決定する工程（ここで、この個体は疾患または症状を有すると診断されていない）；(c)個体の第1の集団由来のＴ細胞の反応性と、個体の第２の集団由来のＴ細胞の反応性とを比較する工程；および(d)個体の第２の集団と比較して、個体の第１の集団中の抗原に対する反応性のレベルが高いことと、疾患または症状と関連するＴ細胞エピトープの抗原中での存在とを相関させる工程。本発明の方法により、工程(a)および工程(b)での抗原に対する反応性の決定は、本明細書中で開示するRECALL ELISPOTアッセイを用いて実施される。さらなる別の局面で、本発明は、凍結した細胞由来の３日目のELISPOTおよび1 0日間ELISPOT(RECALL ELISPOT)応答が、新鮮な細胞から得られた応答より良好かまたは同等であったという発見に関連がある。任意の特定のメカニズムによって限定されることを意図することなしに、この結果は、阻害性低温感受性細胞（おそらくは、血小板を含む）の排除によると考えられる。従って、本発明は、インビトロで抗原を用いてＴ細胞を刺激する前に、少なくとも１回生物学的試料中の抗原反応性Ｔ細胞を凍結および解凍することによって、ELISPOTアッセイ（例えば、標準的な（「３日間」）ELISPOTアッセイ、またはRECALL ELISPOTアッセイ、または10日間ELISPOTアッセイ）におけるシグナル比に対するバックグラウンドを改良するための方法を提供する。この状況で用いられる場合、シグナルに対するバックグラウンドの比が、新鮮な細胞（すなわち、決して凍結されていない細胞）を用いて実施された同じアッセイより低い（すなわち、より少ないバックグラウンド）場合、応答は「より良好」または「改善されて」いる。「バックグラウンド」は、生物学的試料中のＴ細胞が、抗原で刺激されない場合（例えば、培地コントロールが用いられる場合）に生じる、「スポット」またはその等価物の数である。「シグナル」は、生物学的試料中のＴ細胞が、抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープを含む場合）で刺激される場合に生じる、「スポット」またはその等価物の数である。本発明の種々の局面は、行われた実験の記載によって以下に説明される。実施例実験方法抗体 PBMCによるIFN-γ分泌を誘導する能力について、以下の抗原を試験した：破傷風トキソイド(TT)(List Biologicals #191B，Campbell，CA)、Mycobacterium tub erculosisのツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)(Connaught #SP0008，Swif twater，PA)、およびヒトミエリン塩基性タンパク質(hMBP)(Chemicon Internati onal，Inc．#AG42P，Temecula，CA)。免疫優性ペプチドMBP 84-102およびMBP 14 3-168を含むペプチドを、F-MOC化学を用いて合成し、そしてHPLCおよび質量分光法によって粋度について確認した。PBMC および血清の回収血液および血清試料を、認可されたIRBプロトコル下で、健常なボランティアおよび多発性硬化症の患者(Multiple Sclerosis Unit，Sinai Hospital，Univer sity of California at San Francisco)から得た。全血は、１単位コンテナもしくは３個または４個の15mlのヘパリン処理したVacutainerHチューブ(Becton Dic kinson #6489，San Jose，CA)に回収し、そして回収後24時間以内で使用した。P BMCを、Ficoll(Pharmacia LKB，Ippsala，Sweden)上で密度遠心分離(450×ｇ、3 0分間)によって精製し、勾配界面から単離し、Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS，BioWhittaker #17-512Q，Walkersville，MD)で２回洗浄し、そしてヒトＴ細胞培地(hTCM)：Eagles培地(αMEM，BioWhittaker #17-605E)、５%熱不活化ヒトAB血清(Ultra Serum，Gemini Bio-Products Inc．#100-118，Calabasas，CA )、４mM l-グルタミン(Bio-Whittaker #17-602E)、20mM Hepes緩衝液pH 7.2(Bio -Whittaker #17-737E)、100U/mlぺニシリン、100μｇ/ml硫酸ストレプトマイシン(Bio-Whittaker #17-602E)、および５×10^-5M 2-β-メルカプトエタノール(Si gma Chemical Co．#M7522，St．Louis，MO)に再懸濁した。PBMCの60%を、凍結培地[10％ジメチルスルホキシド(Sigma Chemical Co.)、90%熱不活化ヒトAB血清(Gem ini Bioproducts Inc．#100-112)]に再懸濁し、５×10⁶細胞/mlの濃度とし、プログラム制御可能な液体窒素フリーザー(Cryo-Med #990-C，New Baltimore，MI) 内で凍結し、そして液体窒素下で抗原提示細胞(APC)として必要になるまで保存した。PBMC の抗原刺激基本の10日間RECALL ELISPOTアッセイを、図１に要約した。この要約はIFN-γ の検出を記述するが、上記に論じられるように他の因子が検出され得る。アッセイの１日目、２×10⁶細胞/mlの濃度のPBMCを、丸底滅菌マイクロタイター培養プレート(Costar #3799，Cambridge，MA)中に100μｌ/ウェルで分注した。容量10μｌの100μｇ/ml（全MBPまたはMBPペプチド）または50μｇ/ml（破傷風トキソイドまたはPPD）の抗原を、３連または６連のウェルセットに添加し、そしてプレートを５％ＣＯ₂インキュベータ中でインキュベートした。５日目、100U/mlのストック組換えIL-2(Advanced Biotechnologies Inc.)を10μｌ/ウェルで、各ウェルに添加した。８日目、凍結したPBMCを解凍し、冷hTCMで洗浄し、温hTCM中に４× 10⁶細胞/mlの濃度に再懸濁し、そしてこれにγ線(3000ラド)を照射した。50μｌの上清を各マイクロタイターウェルから取り除き、そして50μｌの照射PBMCおよび10μｌの適切な10×抗原ストックで置換した。個々の抗原刺激細胞によって分泌されるIFN-γの捕捉および検出個々の抗原刺激Ｔ細胞によるリンホカイン分泌を、標準的なELISPOTプロトコルの変法によってアッセイした。リンホカイン捕捉プレートを、１日前（アッセイ８日目）に調製した。0.1M NaHCO₃滅菌緩衝液(pH8.2)で10μｇ/mlに希釈したI FN-γ捕捉抗体（モノクローナルマウス抗ヒトIFN-γ，Endocen #M700A，Cambrid ge，MA)を、平底96ウェル滅菌マイクロタイタープレート(Comlna，#25801)に50 μｌ/ウェルで分注し、そして４℃で24時間インキュベートした。使用前に、過剰の抗体を取り除き、そしてウェルをDPBSで2回洗浄した。非特異的タンパク質結合をさらにブロックするために、プレートを室温で１時間、250μl/ウェルのP BS＋５％BSAとともにインキュベートした。ブロック溶液を棄た後、ウェルをPBS で２回、続いて抗原刺激細胞の準備として、hTCMで洗浄した。２回目の抗原刺激の24時間後（アッセイ９日目）、刺激プレートを1200RPMで５分間、Beckman CS- 6R遠心分離機で遠心し、そして各ウェルから90μｌの上清をマイクロピペットで注意深く取り除いた。ペレット化した細胞を、100μｌのhTCMで再懸濁し、複製( replicate)を滅菌チューブ(Costar cluster tube #4411)にプールし、調製した抗IFN-γ捕捉プレートに移し、37℃で20時間静かにインキュベートした。IFN-γ 分泌相の終期（アッセイ10日目）に、細胞を棄て(disgard)、そしてプレートをP BS＋0.1 Tween-20(PBST)で３回手で洗浄した。PBSTの最後のアリコートをウェルに加え、そして10分間静置し、取り除いて、そしてウェルをUltrawash Plus pla te washer(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)中でPBSTを用いて３回洗浄した。PBST＋１％BSA中で1:500に希釈したウサギ抗ヒトIFN-γポリクローナル抗体(Endogen #P-700)の100μｌアリコートを、穏やかに振盪しながら室温で2.5時間、各ウェルに添加した。結合しない抗IFN-γポリクローナル抗体を、自動プレートウォッシャー中でPBSTでの３回の洗浄、続いて250μｌの１×Tris緩衝化生理食塩水＋0.05％Tween 20(TBST)での洗浄により取り除いた。次に、TBST＋１％ BSA中に希釈した１:2500アルカリホスファターゼ結合マウス抗ウサギポリクローナル抗体の100μｌアリコートを、各ウェルに添加し、そして穏やかに振盪しながら室温で1.5時間、インキュベートした。アルカリホスファターゼ基質溶液(AP SS)を、使用直前に、32μｌのp-トルイジン塩(BCIP，GIBCO-BRL #19290-016，Gr and isla nd，NY)および44μｌのニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT，GIBCO-BRL #18280-016)，Grand Island，NY)および44μｌのニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT，GIBCO-BRL #18280-016)を、10mlアルカリホスファターゼ緩衝液( APB=0.1M NaCl，0.05M MgCl₂，0.1M Tris HCL，pH9.5)と混合し、そして0.22μ Ｍのフィルターを通過させることによって調製した。APSSの添加の前に、過剰の酵素結合抗体を、TBSTの３回の洗浄およびAPBでの１回の洗浄により取り除いた。発色させるために、50μｌのAPSSを各捕捉ウェルに添加し、そして反応物を、穏やかに振盪しながら室温で、発色反応物が可視化するまで（一般には５〜45分以内）インキュベートした。呈色反応を止めるために、プレートを自動プレートウォッシャー中でdH₂Oで３回洗浄し、ウェル中にほこりが推積するのを最小にするため裏返しにし、そしてほこりのない乾燥オーブン中28℃にて、暗所で一晩乾燥させた。個々の抗原刺激Ｔ細胞によって分泌されるIL-2の捕捉および検出異なるリンホカイン捕捉マトリックス(PVDFプレート)およびPBMCの再刺激後のより短いインキュベートション期間の改変を含む同様の方法に従って、IL-2分泌を評価した。リンホカイン捕捉相を、PVDF膜基部(Mlllipore MAIPS45-10)を有する96ウェルプレート中で実施した。プレートを、アッセイ７日目のIL-2捕捉のために、エタノールで予め湿らせ、NaHCO₃結合緩衝液で洗浄し、そして４℃で一晩、NaHCO₃結合緩衝液中10μｇ/mlの濃度の抗IL-2捕捉抗体(R&G Systems MAB202) とともにインキュベートすることによって調製した。各洗浄工程で、溶液を真空多岐管(Milllpore #MAVM0960l)での真空吸引によって除去した。８日目、IL-2捕捉プレートを、室温で２時間以上PBS中５％BSAを用いてブロックし、そしてhTCM を用いて洗浄した。PBMCの、洗浄および照射自己APC±抗体での再刺激を、上記で概説したように実施した。しかし、IL-2分泌のより速い速度論は、PVDF IL-2 捕捉プレート中での直接的なPBMCの抗体再刺激を必要とする。IL-2捕捉プレート中で再刺激されたPBMCを、37℃で一晩、インキュベートした。９日目、ウェルを PBST中で３回洗浄し、PBST中で10分間インキュベートし、そしてPBST中でさらに３回洗浄した。膜を完全にフラッシュし、そしてPVDF膜の下側からすべての溶液を除去するように注意を払った。次に、抗IL-2検出抗体(Endogen #P-600、ウサギ抗ヒトIL-2ポリクローナル抗体)を、PBS/１％BSA中１:500希釈で添加し、そして 2.5時間インキュベートした。次いで、プレートをTBST中で４回洗浄し、そしてT BST中１:2500希釈のアルカリホスファターゼ結合マウス抗ウサギポリクローナル抗体を1.5時間加えた。このインキュベーション後、プレートを上記2.4項に記載のように、TBSTおよびAPB中で洗浄し、その後APB中のBCIP/NBT基質を添加し、そして２〜30分間発色させた。過剰発色を防ぐよう注意を払った。過剰発色は、プラスチックプレートにおいてよりPVDF膜においてより速く起こり、そしてコンピュータ画像分析を妨げ得る、全体的に紫色のバックグラウンドを導く。ビデオ取り込み画像化およびコンピュータ支援分析によるELISPOT反応の自動定量個々のウェル中のスポットを、ビデオ取り込みおよびコンピュータ支援画像分析によってカウントした。カウントの前に、各プレートの底を、エタノールを用いて洗浄し(IL-2の場合は、プレートの底をエタノールで洗浄しない)、そしてほこりを、各ウエルからDust-Off(Falcon Safety Products，Branchburg，NJ)を用いて吹き飛ばした。乾燥したプレートを、直径0.75cmの円形孔から約31cm離れて環状イルミネータ(Leica #31-36-17-01)を有する、特製光箱に取り付けた。個々のウェルの画像を、LighToolsフレームインテグレータに接続したCohu CCDビデオカメラ(LighTools Research，Encinitas，CA)によって取り込んだ。画像を、ビデオカード(Scion LG3，Frederick，MD)を装備したMacintosh(PowerMAC 7100/ 80)コンピュータ中に記憶させ、そしてスポットの数を、NIH Image 1.59ソフトウェア(World Wide Web上のhttp://rsb.info.nih.gov/nih-image/にて入手可能) を用いて定量した。各プレートについて、ポジティブコントロールウェルおよびネガティブコントロールウェルを使用し、「Look Up Table」(LUT)パレットを介して、コントラストおよび輝度を設定した。コントラストを調整することで、スポットの解像度を最適化し、そしてポジティブプレートとネガティブプレートとの間のコントラストを際だたせることで、最適な信号対ノイズを確実にした。一旦設定した後は、このコントラスト設定を、観測(viewing)のみに使用した。次に、「Threshold」をオプションメニューから選択し、グレースケール画像を白黒に変換した。閾値設定を、LUTを用いてウェル端が侵食される点に調整した。ワンドツールを使用して、屈折およびエッジ効果のために定量ソフトウエアに問題を引き起こすウェル端を差し引いて閾値設定された画像の輪郭を描いた。IL-2プレートについては、閾値オプションを選択しない。なぜなら、プレートを上から照らし、そしてワンドツールをウェルのカウントの際に使用しないからである。その代わり、前もって設定した円を使用し、ウェルのほとんどを囲む。残りのプロセスは、標準IF N-γアッセイと同一である。次いで、「密度スライス」機能を選択し、分析用のグレースケールスペクトルの「スライス」を特定した。このことは、破片および非特異的色素原(chromagen)析出をおおうスポットの解像度を増強する。画像をバイナリ変換し、侵食し、そしてスポットサイズ限度を「Analyze Particles」機能下で設定した。このサイズ制限は、小さな、非特異的バックグラウンドスポット、破片、および大きな偽パッチを排除する。一般に、スポットサイズ制限は、最小12ピクセルおよび最大1,000ピクセルに設定した。分析の速度を増し、分析を標準化するために、パラメータを経験的に確立した最適な設定に設定するマクロを書いて、96ウェルプレート中の各ウェルに対して設定を維持した。統計分析複数連のウェルからのカウントを、Microsoft Excellスプレッドシート上で編集し、そして平均および標準偏差を計算した。Mann-Whitney統計分析を用い、培地のみのネガティブコントロールに対して抗原刺激試料中で観測される、スポット数の有意性を計算した。抗原ウェルと培地コントロールウェルとの比較で0.05 以下のp値を、ポジティブな抗原応答として規定した。略語以下の略語を、本明細書中で使用する：Ab-抗体；AP-アルカリホスファターゼ；A PC-抗原提示細胞；BCIP-5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフエート；DPBS-D ulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水；HIN-熱不活化正常；MBP-ミエリン塩基性タンパク質；ME-メルカプトエタノール；MG-重症筋無力症；MS-多発性硬化症；M TX-メトトレキセート；NBT-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド；NIH-Natio nal Institute of Health；NSAID-非ステロイド系抗炎症剤；PBMC-末梢血単核細胞；RA-慢性関節リウマチ；PVDF-ポリビニルジフルオライド。実施例Ｉ IFN- γ捕捉による抗原反応性Ｔ細胞の測定末梢血を、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）で３倍希釈し、50ml のポリプロピレン遠心分離チューブ内で40mlの希釈した血液あたり15mlのFicoll （Pharmacia Ficoll-Paque #17-0840-02，Piscataway，NJ）を下に蓄層し、そしてBeckman CS-6R遠心分離器（Beckman Inc.，Palo Alto，CA）で2000RPMで20分間回転した。DPBS/Ficoll界面の緩衝液層を取り出し、血小板を除去するために、DPBSで２回および低いRCFでヒト組織培養培地（hTCM：αMEM＋５％熱不活化ヒトAB血清（Ultraserum，BioWhittaker，Walkersville，MD)、ペニシリン／ストレプトマイシン、1-グルタミン）で１回洗浄した。60％のPBMCを凍結培地（10％ジメチルスルホキシド（Sigma Chenical Co.，St．Louis，MO）、5×10⁶細胞／m lの濃度までの90％ウシ胎児血清）中に再懸濁し、プログラム可能なCryo-Med（N ew Baltimre，MI）細胞凍結器中で凍結し、そして必要になるまで液体窒素下で貯蔵した。精製したPBMCを、96ウェルCostar細胞培養プレート中に、0.1mlの容量で2×10⁵ 細胞／ウェルでプレートした。等容量の抗原を、10μｇ/mlで、三連または六連のウェルに添加し、そしてプレートを37℃にて５％のCO₂インキュベーター内でインキュベートした。５日目に、100U/mlストック組換えIL-2（Advanced Biotec hnologies Inc.，Columbia，MD）の10μｌ/ウェルを各ウェルに添加した。８日目に、凍結したPBMCを融解させ、DPBSおよび0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）中で洗浄してDMSOを除去し、hTCM中に4×10⁶細胞/mlの濃度に再懸濁し、そしてγ- 線（3,000ラド）で照射した。50μｌ/ウェルを、40μｌ/mlのストック濃度で50 μｌの適切な抗原とともに分配し、10μｇ/mlの最終抗原濃度を得た。捕捉プレートを調製するために、IFN-γ捕捉抗体（モノクローナルマウス抗ヒトIFN-γ、Endogen M700A，Cambridge，MA)を、滅菌の0.1M Na(CO₃)₂pH8.2緩衝液中に10μｇ/mlに希釈し、平底96ウェルの滅菌マイクロタイタープレート（Corni ng Coster Corp.）に１ウェルあたり50μｌずつ等分し、そして４℃にて最低24 時間インキュベートした。使用の前に、過剰の抗体を除去し、そしてウェルをdP BS＋１％Tween 20（PBST）で２回洗浄する。さらなる非特異的タンパク質の結合をブロックするために、プレートを、250μｌ/ウェルのPBS＋５％BSAで室温にて１時間インキュベートする。ブロッキング溶液を廃棄した後、ウェルをPBST（ 0.1％Tween）で１回洗浄し、次いで抗原刺激細胞の調製においてhTCMで洗浄した。アッセイの９日目に、２次抗原刺激の24時間後に、刺激プレートをBeckman CS -6R遠心分離機で1500RPMで５分間回転させ、そして90μｌの上清をマイクロピペットを使用して各ウェルから注意深く除去した。ペレット化した細胞を、100μ ｌのhTCM中に再懸濁し、滅菌チューブ（Corning Costar corp sterile ClusterT Ab#4411，Cambridge，MA）内にプールし、混合し、そして抗IFN-γ捕捉プレートの同数のウェルに移した。捕捉プレートを37℃にて16〜20時間、撹拌せずにインキュベートする。IFN-γ分泌期の終わりに、細胞を廃棄し、そしてプレートを0. 1％PBSTで３回洗浄する。最終的なPBSTのアリコートを10分間かけてウェルに添加し、除去し、そしてPBST＋１％BSA中の、100μｌの1：500希釈のウサギ抗ヒト IFN-γポリクローナル抗体（Endogen #P700，Cambridge，MA）を、穏やかに振盪しながら室温にて3.5時間かけて各ウェルに添加した。結合していない抗IFN-γ ポリクローナル抗体を、PBSTでの３回の洗浄、次いで250μｌの1×Tris緩衝化生理食塩水＋0.05％Tween 20（TBST）での洗浄によって除去した。次いで、TBSTに希釈した1：5000アルカリホスファターゼ結合マウス抗ウサギポリクローナル抗体（Jackson Immunological #211-055-109，West Grove，PA）の100μｌのアリコートを各ウェルに添加し、そして室温にて1.5〜２時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。過剰の酵素結合抗体を、PBSTでの３回の洗浄およびアルカリホスファターゼ緩衝液（APB＝0.1M Nacl、0.05M MgCl₂、0.1M Tris HCl，pH9. 5）での２回の洗浄、続くp-トルイジン塩およびニトロブルーテトラゾリウムクロライド（BCIP/NBT、GIBCO BRL #18280-016，Gaithersburg，MD）の基質混合物の添加によって除去する。比色反応を停止するために、プレートをdH₂Oで３回洗浄し、ウェル中のごみの蓄積を最小にするためにプレートを反転させ、そしてごみを含まない乾燥オーブン中で28℃にて一晩乾燥させた。個々の抗原刺激Ｔ細胞によって分泌されたリンホカインに対応するスポットの画像を、CCDビデオカメラで撮影（capture）し、そして画像をNIH画像ソフトウェアによって分析する。撮影した画像を、画像を対比させるLook Up Tableを使用して増強する。次いで、最小感度限界を各画像に強調適用し、標識手段（wand tool）を使用してウェルの縁を効果的に減じる（subtract）ように境界を強調し、従って、バックグラウンドの計数は高くはならずそして人為的ではない。次いで、限られた狭い範囲の密度スライシングを使用して分泌細胞から産生されたスポットを強調する。ピクセル限界を、小さな堆積物および大きな粒子を除くように設定し、そして規定されたピクセル範囲内に入るスポットの数をソフトウェアプログラムによって計数する。次いで、各ウェルからの総数を以後の分析のために手作業で記録する。あるいは、スポットを、他の市販されているかもしくはカスタマイズされているソフトウェアの適用によって計数し得るか、または標準的な光学顕微鏡を使用する技術者によって手作業で定量し得る。スポットをまた、光学顕微鏡下で手作業で計数し得る。図２は、上記のアッセイを使用する、MS患者および健康なドナーの、MBPおよびMBP 84-102に対する反応性の測定を示す。図３は、３日間ELISPOT形式および1 0日間ELISPOT形式における、MBPおよびMBP 84-102に対するELISPOT応答の比較を示す。合計50人のMS患者を、全ミエリン塩基性タンパク質（MBP）に対するIFN- γ応答、および免疫優性MBPペプチド（MBP 84-102）に対するIFN-γ応答について試験した。25人の患者を３日間アッセイを用いてスクリーニングし、そして刊行された報告と一致して、バックグラウンドの応答レベルが非常に低かった。対照的に、10日間ELISPOTによってスクリーニングされた25人の患者の実質的な割合は、MBPに対する応答においては19スポット形成細胞（SFC）／2×10⁵PBMCの平均、MBP 84-102に対する応答においては22 SFC／2×10⁵PBMCの平均で、全MBPおよび／またはMBP 84-102に対する統計学的に有意な応答を示した。各データポイントは、減算される培地への応答の平均とともに、個々に由来する６連の試料の応答の平均を示す。患者の各セットの平均を棒によって示す。標準的なELISPOTアッセイにおいて生成されるスポットを、解剖顕微鏡による倍率下でほとんどの研究室で計数し得る。スポットのサイズの変動は、これらのスポットの客観的数値化を妨げ得る。より高い処理量に適応させるためおよびより高い一貫性を提供するために、各ウェルの画像をCCDビデオカメラに記録し、そしてNIH画像解析ソフトウェアを用いてスポットを定量した。スポットを定量するために、直径400ピクセルの円を、計数される領域の上においた。密度スライス関数は、分析のグレースケール範囲を選択し、そして二次元に転換した後、設定したサイズ範囲内のスポットを定量する。サイズの下限を、非常に小さい堆積物（一般に、＜12ピクセル）を除去するためのネガティブコントロールプレートを使用して経験的に設定し、そして上限を、大きな塊（一般に、＞1,000ピクセル）を無視するように設定する。密度およびサイズの設定は、全ての実験の分析について一定である。図４は、種々の抗原で処理したいくつかの６連のウェルセットについてのスポットの標準偏差、平均、および分布の例を示す。PBMCをMS患者の血液から単離し、そして10日間アッセイにおいて刺激し、そして培地、ポジティブコントロール抗原（精製されたM．tuberculosisのタンパク質誘導体、PPD；破傷風毒素、TT）、ミエリンタンパク質抗原（αB-クリスタリン、αBC；ミエリン塩基性タンパク質、MBP；ミエリンオリゴ樹状細胞糖タンパク質、MOG）、または潜在的に免疫優性であるミエリンタンパク質ペプチド（αB-クリスタリン由来のαBCpl、ミエリン塩基性タンパク質由来のMBPp83、およびミエリンオリゴ樹状細胞糖タンパク質由来のMOGペプチドpl-4）に対する応答の際のIFN-γ分泌について試験した。このrecallアッセイにおいて頻繁に、より高い頻度のレスポンダーＴ細胞が、個々のスポットを溶解するアッセイの能力を超えて拡大する。例えば、図４Ａにおいて、TTおよびPPDに対するIFN-γ応答は、＞200スポットであり、正確に計数するには多すぎる。いくつかのミエリン抗原が、より小さいが統計学的に有意な応答を誘発し、これは、図４Ｂの拡大プロット中により良好に見られる。培地のみによって生成されるスポットの数は少なく、そして２つの６連のセットにおいて一致する。いくつかのミエリン抗原は上記のこのバックグラウンドの応答を誘導しないが、いくつかの他の抗原またはペプチド（例えば、MBPp1およびMOGp3）が、スポットの数において統計学的に有意な増大を誘導する。同型ウェルの間での低い標準偏差を、１セットの６連のウェルのそれぞれについての総数の分布によって示し、そして棒で示す。この一貫性は、捕捉の前に試料をプールすることによって補助され、そしてこれは、応答が統計学的に有意であることを決定することにおいて重要な点である。実施例II IL-2 捕捉による抗原反応性Ｔ細胞の測定 ELISPOTアッセイを、方法の節で先に記載するように行った。IFN-γと比較して、IL-2のより迅速な誘導および分泌は、刺激後２時間以内に細胞をプールし、そして移動させることを必要とした。IL-2の検出のために、PDVFメンブレンはより感度が良く、そしてELISAグレードのプラスチックよりも良好なシグナル：ノイズ比を生じた。（PVDFもまた、低頻度のIFN-γ応答の検出を可能にしたが、高レベルの応答細胞では、いくらかのバックグラウンド問題が生じた。）代表的には、IFN-γの10日間ELISPOTをプラスチックを使用して行い、そしてIL-2の10日間ELISPOTはPVDFを使用する。 IL-2捕捉による抗原反応性Ｔ細胞の測定を、図５および図６に図示する。経時的なＴ細胞反応性を、INF-γおよびIL-2捕捉の両方を使用して測定した。これらの研究の実施において、正常なドナーを、８週間にわたって週の同じ日に週に一度採血した。PBMCをFicoll^TM勾配遠心分離によって精製し、そして凍結保存した。細胞を、全ての試料の採集後に融解し、そしてTTおよびPPD応答の評価のためにRECALL ELISPOT中で泳動した。IFN-γ分泌細胞（図５Ａ）およびIL-2分泌細胞（図５Ｂ）を測定した。ドナーAN.F008は、各リンホカインについて研究の過程にわたって、両方の抗原に対して非常に安定な反応性を示した。多くの、しかし全てではないドナーが、これらの２つの抗原に対して同様の安定な応答を示した。これらのドナーについて、IFN-γおよびIL-2応答についてのスポット／ウェルの数は同様であり、スポットの数は通常、所定の抗原についてリンホカイン間で変化する。ドナーAN.M043（図６）は、研究の過程を通じてPPDに対する反応性においてスパイクを示す。スパイクは、両方のリンホカインプロフィールにおいて生じるが、スパイクは、同時には生じない。IFN-gプロフィール（６週目）においてよりもIL-2プロフィール（４週目）においてより早く生じる。同じ試料についての反復ELISPOTによって結果を確認する。実施例III ３日間ELISPOT形式および10日間ELISPOT形式の比較 10日間ELISPOTアッセイを使用し、免疫優性ペプチドMBP 84-102に対する反応性を有する患者を同定した。このアッセイを、MS臨床試験の２種の相、患者の回復のため、および試験の間のＴ細胞応答のモニタリングに使用した。上記のように、文献に報告されている標準なELISPOTアッセイにおいて、抗リンホカイン抗体を含有する捕捉プレート中で１〜２日、PBMCを抗原と混合し、次いで、酵素結合二次抗体で検出する（３日間形式）。このアッセイで、１ウェルあたり２×10⁵ のPBMCを試験する。そして末梢血の自己反応性Ｔ細胞の頻度が平均で１〜５／1 0⁵の範囲であるので、平均的な患者において応答し得る、ウェルあたり極僅かな特異的細胞が存在する。応答細胞の数を増大させるために、PBMCを、リンホカイン分泌による呼び戻し応答を試験する前に１回のエキソビボの抗原刺激に供した。言い換えれば、PBMCを、抗原または培地とともに８日間インキュベートし、洗浄し、新たに照射したAPCおよび抗原で再刺激し、そしてこれらの再刺激した細胞を、捕捉ELISPOTによるIFN-γの分泌について試験した（10日間形式）。６連のウェルに由来する増殖した細胞の全てをプールし、そして捕捉プレートに９日目にそれらを再アリコートして、標準偏差を改善する。表３は、同じ患者由来の血液を使用する２つのアッセイ形式の比較を示す。３日間形式は、非常に低いバックグラウンドを生じ、そしてTTに対する応答は測定可能であり、患者MS.MO27 について36.7±15.3のIFN-γスポットの平均を有する。しかし、全ヒトMBPおよび免疫優性ペプチドMBP 84-102に対する応答はバックグラウンドに近く、そして有効な統計学的分析のためには低すぎる。対照的に、リンホカイン分泌のアッセイの前の７日間の増殖は、より高いバックグラウンド（25.0±1.4）を生じたが、 hMBPおよびMBP 84-102に対する応答においても測定可能な改善を生じた。TTに対する応答はまた、10日間形式においても増大し、１ウェルあたりほぼ100スポットの平均を有した。この応答の密度は、ビデオカメラおよびソフトウェアの解像限界に接近し、これは、末梢血におけるTT反応性Ｔ細胞のより高い頻度を反映している。多くの患者および健常なコントロールについて、TTおよび／またはPPD に対する応答は、この10日間形式においては尺度からはずれている。しかし、測定可能な限界内のこの抗原に対する10日間の呼び戻し応答を維持する希釈物が使用され得ることが予想される。図７および図８に見られ得るように、多くの患者がhMBPおよび／またはMBP 84-102、ならびにTTおよびPPDのような呼び戻し抗原に対して強力な応答を有し、これを、Mann-Whitney分析による培地コントロールと比較し得る。表４中のデータは、標準的なELISPOTに比較して「RECALL ELISPOT」アッセイの改善された感受性を示す。21人のRA患者由来の血液をELISPOT（標準法およびr ecall法）で試験して、異なる形式におけるTTおよびPPDに対する反応性を評価した。患者は、MTX、プレドニソン（prednisone）、および種々のNSAIDを含む、採血時にRAのための標準的な薬物療法を受けた。TTおよびPPDに対する反応性を検出するための能力における有意な改善が見られ、そして正常なドナー中で見られるこれらの抗原に対する反応性のレベル（約70％）に近い。 TMTC＝多すぎて数えられない太字は、ｐ≦0.05で統計学的に有意な試料を示す。実施例IV 10 日間ELISPOTアッセイにおける、新鮮なPBMC対凍結したPBMCの比較これらの実験の目的は、抗原に対する反応性が比較可能であるかどうか、およびMS患者の全血から単離された新鮮なPBMCと同じ患者由来の凍結細胞のPBMCとの間に一貫性があるかどうかを決定することである。そうであれば、凍結細胞は、臨床試験の間、患者由来の将来の採血との内部標準を提供し得る。アッセイを、新鮮なPBMCまたはアッセイにおける使用の前に融解した凍結PBMCのいずれかを１日目に使用して上記のように行った。最初の実験によって、反応性が検出され得るかどうかを見るために、患者の凍結細胞を使用して実行した。この最初の実験において、ポジティブなTT応答に加えて、MBP応答が存在することがMS患者（MS.F165およびMS.M122）の２つの実行によって観察され得る（表５および６）。結果は、凍結PBMCが完全なELISPOTアッセイにおいて使用され得、そしてスポットの形成においてポジティブな結果を生じ得ることを示す。第２の実験において、図９に示すように、７の健康なドナーを、アッセイにおいてそれらのTT応答について評価した。TTに対する統計学的に有意な応答が、７のドナー全てにおいて見出された。凍結細胞による応答は、新鮮な細胞から得られる応答と同等であるか、またはそれよりも良好であった。シグナル比に対するこの改善されたバックグラウンドはまた、MS.122においても見出された（表６）。可能性のある解釈は、阻害性低温感受性細胞（例えば、血小板）の排除である。第３の実験は、既知のＴＴポジティブの、１つの集団内のドナーAN.MO36の凍結細胞の応答を観察した。凍結細胞は、単位血液採集日に処理および凍結され、そして液体窒素中に保存された提供血液の単位に由来した。細胞のアリコートを、b種々の時間の間隔で融解させ、そして上記のようなアッセイにおいて実行した。示された時点で３つの異なる技術により行った。図10は、11週間の期間にわたる応答の安定性／再現性を示す。この安定性／再現性は、このような細胞のアッセイのための内部標準としての使用を可能にする。凍結したPBMCの安定性は、いくつかの重要な意味を有する。凍結したPBMCの応答が新鮮なPBMCにおいて測定される応答に匹敵するかまたはそれよりも良好であるので、試料を、適切な時間アッセイのために安全に凍結し得る。さらに、数週間の試料の再現性は、試料を再び実行して事前の結果を確認し得ることを示す。凍結した試料の安定性はまた、研究の最後での同時アッセイのための経時的な試料採集を可能にする。これは、臨床試験の適用、および複数の試料が所定の日に採集される場合に特に有用であることが証明されている。あるいは、試料が異なる日にアッセイされる場合、可能なアッセイの変動を内部標準の算入によりモニターし得る。例えば、血液を、その凍結されたPBMCが、10日間RECALL ELISPOTにおいて抗原（例えば、TTまたはPD）に応答する最適な数のSFC（一般に、20〜60 ）を生じるドナー（例えば、健康なドナー）から採集し得る。次いで、同じ採血のアリコートを、試薬、時期、または実験者に起因する可能性のある変動についての内部標準として、異なる日にアッセイされるプレート上で含み得る。実施例Ｖリンホカイン捕捉およびIL-2添加の速度論この実験において、Th1細胞への外因性IL-2添加の添加時期を研究した。抗原性刺激の数日後のIL-2の添加は、抗原特異的Ｔ細胞頻度が低い場合にしばしば所望される。図11は、TTおよびPPDに応答するMS患者の10日間RECALL ELISPOTにおける、SFCの数に対する外因性IL-2の効果の一例を示す。PBMCを、2×10⁵細胞／ウェルでプレートし、そして破傷風毒素（TT、50μｇ/ml）、PPD（50μｇ/ml）、またはコントロールとしての培地のいずれかで刺激した。各抗原群についての４連は、３日間、５日間のいずれかで10ユニット/mlのIL-2を与えたか、または全くIL-2なしであった。この患者の事前の３日間ELISPOTは、TTに対する比較的高い応答を示し、そしてほとんどの細胞がＰＰＤに応答性しないことを示した（データは示さない）。10日間RECALL ELISPOTにおいて、３日目または５日目のIL -2の添加は、バックグラウンドSFCのレベルを極僅かに上昇させたが、PPDに応答するSFCの数を有意に改善した。対照的に、TTに対する呼び戻し応答は、IL-2による効果が測定不可能な程に高かった。細胞が最適な自己分泌増殖を駆動するために十分なIL-2を供給し得る閾値反応細胞頻度（threshold responder frequenc y）が存在し得る。明らかに、SFCの数は、これらの細胞の頻度が低い場合に外因性IL-2によって増大され、そして３日目または５日目のIL-2の添加が同等に有効である。実施例VI Ｔ細胞クローンの生成この実施例は、クローニングにおけるRECALL ELISPOTの使用を記載する。MBP8 4-102、DR2拘束Ｔ細胞クローンの良好なクローニングの可能性を拡大するために、３つのスクリーニング基準が確立されている。１）ドナーは、単位寄付についての血液バンクの資格を満たさなければならない。これは、クローニング手順を行うために血液の十分な量を確実にする。２）ドナーは、DRb1^*1501およびDRb5^* 0101であらねばならない。HLA型の決定を、Cross Clinical Laboratories（Kans as City，MO）によって行った。３）ドナーは、RECALL ELISPOTアッセイにおいてMBP 84-102に対するポジティブＴ細胞反応性を示さなければならない。これは、目的のペプチドを認識し得る細胞が存在することを確実にするが、正確なDRの状況で必ずしも認識するとは限らない。患者MS.F132は、これらの要件を満たし、そしてこれをクローニングプロジェクトのために使用した（表７）。この患者は、本研究の２年目（Year 2）の１月に悪化を伴う再発の進行性MSを有した。図12は、表７に記載の「６月20日」のRECALL ELISPOTを示す。上記のクローニング基準の使用は、MBPへの反応性についてポジティブである3 00ウェルのうちの６つで、MBP 84-102に特異的なDR2拘束Ｔ細胞の成功したクローニングをもたらした（表８）。クローンD5、D9、およびF9の不十分な増殖は、後の時間のさらなる特徴付けのために凍結に導いた。特徴付けのために十分に増殖した３つのクローン（D3、E6、およびE11）のうち、２／３（66％）がDR2拘束およびMBP 84-102反応性であった。MBP 84-102がDR2の免疫優性エピトープであり、そして試験した重複MBPペプチドがどれもDR3に結合しないと仮定すると（Va lliら、1993，J．Clin．Invest．91：616）、３つの特徴づけられていないクローンもまたクローニングの目的を満たす良好な可能性を有する。実施例VII エピトープの同定 RECALL ELISPOTアッセイを、図１３に示すように、エピトープの同定のために使用し得る。MS患者由来の45mlの末梢血をRECALL ELISPOT中で実行して、種々のミエリン関連タンパク質およびペプチドに対する反応性を評価した。統計学的に有意な応答（ｐ≦0.05）を（^*）で示す。RECALL ELISPOTは、少量の血液を使用する多数の患者および抗原の迅速なスクリーニングを可能にする。実施例VIII 目的のペプチドに対してＴ細胞応答を示す患者の同定 RECALL ELISPOTアッセイを使用して、臨床試験における封入のための目的の抗原に対して反応性である患者を同定し得る。MS試験についての4つの封入ELISPOT の結果を示す（図14）。ここで、封入は、MBP84-102反応性がｐ値が≦0.05である培地よりも大きいことを必要とする。実施例IX 免疫抑制剤および推定の免疫抑制剤の投与後の抗原反応性のモニタリング TT、MBP、およびMBP 84-102に一貫してポジティブ反応性であることが既知の正常なドナーを、RECALL ELISPOTのために１日目に採血した。５日目にドナーを発疹の処置のために高用量のプレドニゾンを施した。２日後（７日目）の採血の ELISPOTは、統計学的に有意にならないMBPに対する反応性とともに、３つの全ての抗原に対する反応性において劇的な減少を示した（図15Ａ）。これらの結果は、免疫抑制処置の効果のアッセイのためのRECALL ELISPOTアッセイの使用を示す。図15Bは、可能性のある免疫抑制効果を有する薬物の臨床試験において登録された３人の患者のTTおよびPPDのELISPOTアッセイによる結果を示す。患者は、示された24週間の間の薬物の複数回の投与およびTT追加免疫（６〜８週間）を受けた。全ての患者は、統計学的に有意な（ｐ≦0.05）反応性から開始し、そして24 週の終わりでこれらの反応性を持続した。＊＊＊上記の本発明は、明確化および理解の目的のために説明および例示としていくらか詳細に記載されている。変更および改変が添付の請求の範囲内で実施され得ることが当業者に明らかである。従って、先の記載が例示を意図し、限定を意図しないことが理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、上記を参照して決定されるべきではなく、以下の添付の請求の範囲を参照して、与えられるこのような請求の範囲に対して等価な全ての範囲とともに決定されるべきである。本出願に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物が、個々の特許、特許出願、または刊行物が個々に記載するように、同じ範囲で全ての目的についてそれらの全体が本明細書中で参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｋ 33/53 Ｄ 33/545 Ａ 33/545 33/564 Ｚ 33/564 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者マッカチェオン，マイケルエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94305, スタンフォード，ドロアズストリート 761

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原反応性Ｔ細胞を含む疑いのある生物学的試料中の該Ｔ細胞を検出するための方法であって、該方法は以下の工程： (a)該生物学的試料中の該Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖を可能にするのに十分な第１の期間、該抗原で刺激する工程； (b)該Ｔ細胞を、可溶性因子の分泌を誘導するのに有効な第２の期間、該抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量で再刺激する工程； (c)固体支持体上で該可溶性因子を捕捉することにより該可溶性因子の存在を検出する工程；および (d)該固体支持体上での該可溶性因子の存在を、該抗原反応性Ｔ細胞の存在と関連付ける工程、を包含する、方法。２．工程(a)における前記期間が、少なくとも４日間である、請求項１に記載の方法。３．前記生物学的試料が、血液である、請求項１に記載の方法。４．前記生物学的試料が、脳脊髄液または滑液である、請求項１に記載の方法。５．工程(b)の前記抗原と抗原提示細胞との組合せが、以下のこと： (1)前記生物学的試料の凍結部分を別々に保存すること； (2)該試料の該凍結部分を融解すること； (3)該融解細胞の増殖能力をブロックすることおよびこれを該抗原と組み合わせること、により調製される、請求項１に記載の方法。６．前記生物学的試料が、末梢血単核細胞（PBMC）を含む、請求項３に記載の方法。７．抗原反応性Ｔ細胞が、10⁵個のPBMC当たり約１〜５個未満のＴ細胞の濃度で検出される、請求項６に記載の方法。８．前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。９．前記Ｔ細胞が、自己抗原に対して反応性である、請求項１に記載の方法。１０．前記可溶性因子が噛乳動物リンホカインであり、そしてこれがIFN-γ、TN F-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β、またはGM-CSFである、請求項１に記載の方法。１１．前記可溶性因子が、IFN-γ、TNF-α、またはIL-2である、請求項１０に記載の方法。１２．前記可溶性因子が、IL-4またはIL-10である、請求項１０に記載の方法。１３．サイトカイン、増殖因子、またはそれらの組合せが、工程(a)の間または後に添加されて、継続したＴ細胞増殖を促進する、請求項１に記載の方法。１４．前記抗原が、自己免疫疾患の自己抗原である、請求項１に記載の方法。１５．前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１４に記載の方法。１６．前記抗原が、ヒトミエリン塩基性タンパク質またはそれらに由来するペプチドである、請求項１に記載の方法。１７．前記抗原が、PPDまたは破傷風トキソイドである、請求項１に記載の方法。１８．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質である、請求項１４に記載の方法。１９．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質のペプチド成分である、請求項１８に記載の方法。２０．前記ペプチド成分が、MBP 83-102である、請求項１９に記載の方法。２１．前記可溶性因子が、工程(c)において、前記固体支持体上に固定化された抗体に結合されることにより捕捉される、請求項１に記載の方法。２２．前記固体支持体が、プラスチック製支持体である、請求項１に記載の方法。２３．前記固体支持体が、ポリビニルジフルオライド（PVDF）である、請求項１に記載の方法。２４．前記固体支持体が、前記可溶性因子の第１の特異的結合対メンバーを含み、そして検出工程(d)が以下のこと： (1)前記捕捉された可溶性因子に対して、アッセイされる該可溶性因子の第２の特異的結合対メンバーを結合すること； (2)標識に結合した第３の特異的結合対メンバーを結合することであって、ここで該第３の特異的結合対メンバーが、該第２の特異的結合対メンバーに相補的である、こと；および (3)該標識の存在を検出すること、をさらに包含する、請求項１に記載の方法。２５．前記第１および第２の特異的結合対メンバーが、前記可溶性因子に対する抗体であり、前記第３の特異的結合対メンバーが、該第２の特異的結合対メンバーに対する抗体であり、そして前記標識が酵素である、請求項２２または請求項２３に記載の方法。２６．患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを定期的にモニタリングする方法であって、以下の工程： (a)該患者からPBMCの試料を提供する工程； (b)PBMCの該試料の一部を凍結してコントロール試料を提供する工程； (c)該患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを、請求項１に記載のアッセイを用いて定期的な間隔でアッセイする工程； (d)該コントロール試料の新鮮に融解した部分における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを、請求項１に記載のアッセイを用いてアッセイする工程；および (e)(c)および(d)において観察されたレベルを比較して、該患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルをモニタリングする工程、を包含する、方法。２７．工程(c)の前記間隔が、等しい期間である、請求項２６に記載の方法。２８．薬物または処置が、工程(c)の２つのアッセイの間に前記患者に投与される、請求項２６に記載の方法。２９．患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルをモニタリングする方法であって、以下の工程： (a)少なくとも２つの異なる時点で該患者からのPBMCの試料を収集し、そして凍結する工程；および (b)該試料を融解し、そして該試料における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを、請求項１に記載のアッセイを用いてアッセイする工程、を包含する、方法。３０．薬物または処置が、工程(a)の２つの収集の間に前記患者に投与される、請求項２９に記載の方法。３１．患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルに対する薬物または処置の効果を決定する方法であって、以下の工程： (a)該患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを、１回目に、請求項１に記載のアッセイを用いてアッセイする工程； (b)該患者に該薬物または処置を投与する工程； (c)該患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルを、２回目に、請求項１に記載のアッセイを用いてアッセイする工程； (d)(a)および(c)において観察されたレベルを比較して、該患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルに対する該薬物または処置の効果を決定する工程、を包含する、方法。３２．前記薬物または処置の投与前の前記患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルの前記アッセイが、少なくとも２回行われる、請求項２１に記載の方法。３３．前記薬物または処置の投与後の前記患者における抗原反応性Ｔ細胞のレベルの前記アッセイが、少なくとも２回行われる、請求項３２に記載の方法。３４．前記薬物または処置が、免疫抑制性である、請求項３１に記載の方法。３５．患者の生物学的試料においてＴ細胞を刺激する抗原を同定する方法であって、該方法が以下の工程： (a)該生物学的試料を、Ｔ細胞増殖を可能にするのに十分な期間、疑わしい抗原へ曝露する工程； (b)必要に応じて、単数または複数のサイトカインおよび／または増殖因子を添加して、継続したＴ細胞増殖を促進する工程； (c)該Ｔ細胞を、前記抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量で、アッセイされる可溶性因子の分泌を誘導するのに有効な第２の期間、再刺激する工程； (d)固体支持体上で該可溶性因子を捕捉することにより、該可溶性因子の存在を検出する工程；および (e)アッセイされる該可溶性因子の存在を、該Ｔ細胞を刺激する該抗原の能力と関連付ける工程、を包含する、方法。３６．自己抗原に対して反応性のＴ細胞を有する患者を同定する方法であって、該方法が以下の工程： (a)該患者由来の生物学的試料を、Ｔ細胞増殖を可能にするのに十分な期間、該自己抗原へ曝露する工程； (b)必要に応じて、サイトカイン、増殖因子、またはその組合せを添加して、継続したＴ細胞増殖を促進する工程； (c)該Ｔ細胞を、前記抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量で、可溶性因子の分泌を誘導するのに有効な第２の期間、再刺激する工程； (d)固体支持体上で該可溶性因子を捕捉することにより、該可溶性因子の存在を検出する工程；および (e)該可溶性因子の存在を、該自己抗原に対する該患者の反応性と関連付ける工程、を包含する、方法。３７．Ｔ細胞の枯渇または不活化を誘導し得る推定薬物をスクリーニングする方法であって、該方法が以下の工程： (a)生物学的試料を、該推定薬物の存在下または非存在下で、Ｔ細胞増殖を可能にするのに十分な期間、Ｔ細胞を刺激し得る抗原へ曝露する工程； (b)必要に応じて、サイトカイン、増殖因子、またはその組合せを添加して、継続したＴ細胞増殖を促進する工程； (c)該Ｔ細胞を、前記抗原と抗原提示細胞との組合せの有効量で、可溶性因子の分泌を誘導するのに有効な第２の期間、再刺激する工程； (d)固体支持体上で該可溶性因子を捕捉することにより、該可溶性因子の存在を検出する工程；および (e)(a)における該推定薬物の存在下または非存在下における該可溶性因子の存在を、該薬物がＴ細胞の枯渇または不活化を誘導する能力と関連付ける工程、を包含する、方法。３８．疾患または症状に関連した免疫優性Ｔ細胞エピトープを同定するための方法であって、以下の工程： (a)第１の複数の個体由来のＴ細胞の抗原に対する反応性を決定する工程であって、ここで該個体が、該疾患または症状と診断される、工程； (b)第２の複数の個体由来のＴ細胞の抗原に対する反応性を決定する工程であって、ここで該個体が、該疾患または症状とは診断されない、工程； (c)該第１の複数の個体由来のＴ細胞の反応性を、該第２の複数の個体由来のＴ細胞の反応性と比較する工程；および (d)該第２の複数の個体と比較しての、第１の複数の個体における該抗原に対する反応性のレベルの増加を、該疾患または症状に関連するＴ細胞エピトープの該抗原の存在と関連付ける工程、を包含し、ここで、工程(a)および(b)における該抗原に対する反応性を決定する工程は、請求項１に記載のアッセイを用いて行われる、方法。３９．前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、請求項３８に記載の方法。４０．前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、糖尿病、重症筋無力症、または慢性関節リウマチである、請求項３９に記載の方法。４１．前記抗原が、公知かまたは疑わしい自己抗原のペプチドフラグメントである、請求項３８に記載の方法。４２．ELISPOTアッセイにおけるバックグラウンド対シグナル比を改善するための方法であって、抗原反応性Ｔ細胞を含むと疑われる生物学的試料における該Ｔ細胞を凍結し、そして融解する工程を、該生物学的試料におけるＴ細胞をインビトロで該抗原で１回目に刺激する前に少なくとも１回包含する、方法。４３．前記ELISPOTアッセイが、標準的な（「３日間」）ELISPOTアッセイである、請求項４２に記載の方法。４４．前記ELISPOTアッセイが、請求項１に従って行われる、請求項４２に記載の方法。