JP3183666B2 - 内因性サイトカイン類の測定方法およびキット - Google Patents
内因性サイトカイン類の測定方法およびキットInfo
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- cytokines
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒトまたは動物における免疫学的機能を監
視する方法に関するものである。より詳細には、本発明
は、これに限定されるものではないが、血液、並びに唾
液、鼻分泌物、涙および汗などを含む他の体液内のサイ
トカイン濃度を正確に測定することに関する。
視する方法に関するものである。より詳細には、本発明
は、これに限定されるものではないが、血液、並びに唾
液、鼻分泌物、涙および汗などを含む他の体液内のサイ
トカイン濃度を正確に測定することに関する。
発明の背景 ここで用いる言葉「サイトカイン（cytokine）］は、
免疫または他の細胞が分泌する成長因子として定義さ
れ、これは、免疫システムの細胞、例えばこれに限定さ
れるものではないがＴ細胞、Ｂ細胞、NK細胞およびマク
ロファージなどに作用する。代表的なサイトカイン類に
は、これに限定されるものではないが、インターロイキ
ン１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−
２、インターロイキン−６、インターフェロン−アルフ
ァ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子−α、成
長因子、例えばTGFβ、NGF、EGF、およびオンコジー
ン、例えばｃ−mycおよびｃ−fosなどから成る群が含ま
れる。言葉「EIA」は、標識として酵素が用いられてい
るイムノアッセイのいずれをも意味している。ここで用
いる言葉「内因性サイトカイン類」は、インビボで産生
されそして通常血液および他の種々の生物学的流体の中
を循環するサイトカイン類を意味している。この言葉
は、まだ転写後修飾を受けていない、より大きな分子量
形態のサイトカイン類であるプロホルモン類も包含して
いる。
免疫または他の細胞が分泌する成長因子として定義さ
れ、これは、免疫システムの細胞、例えばこれに限定さ
れるものではないがＴ細胞、Ｂ細胞、NK細胞およびマク
ロファージなどに作用する。代表的なサイトカイン類に
は、これに限定されるものではないが、インターロイキ
ン１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−
２、インターロイキン−６、インターフェロン−アルフ
ァ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子−α、成
長因子、例えばTGFβ、NGF、EGF、およびオンコジー
ン、例えばｃ−mycおよびｃ−fosなどから成る群が含ま
れる。言葉「EIA」は、標識として酵素が用いられてい
るイムノアッセイのいずれをも意味している。ここで用
いる言葉「内因性サイトカイン類」は、インビボで産生
されそして通常血液および他の種々の生物学的流体の中
を循環するサイトカイン類を意味している。この言葉
は、まだ転写後修飾を受けていない、より大きな分子量
形態のサイトカイン類であるプロホルモン類も包含して
いる。
健康そしてエイズ、癌および自己免疫病などの病気へ
の感受性に対する種々の因子の影響（行動および環境の
ストレスを含む）には、免疫システムが介在していると
考えられている（Ader,R.他編集、「精神神経免疫学」
（PSYCHONEUROIMMUNOLOGY）、第２版、Academic Pres
s、New York（1991））。しかしながら、この免疫の機
能および宿主の防御システムに対してこれらの影響の多
くが示す効果を確実に評価するのは困難であった。これ
は、部分的には、この免疫システム活性の評価方法の多
くは、血清または細胞であろうと血液成分に焦点を当て
ているということが原因となっている。
の感受性に対する種々の因子の影響（行動および環境の
ストレスを含む）には、免疫システムが介在していると
考えられている（Ader,R.他編集、「精神神経免疫学」
（PSYCHONEUROIMMUNOLOGY）、第２版、Academic Pres
s、New York（1991））。しかしながら、この免疫の機
能および宿主の防御システムに対してこれらの影響の多
くが示す効果を確実に評価するのは困難であった。これ
は、部分的には、この免疫システム活性の評価方法の多
くは、血清または細胞であろうと血液成分に焦点を当て
ているということが原因となっている。
新しく生まれた精神神経免疫学として知られている分
野は、生行動因子が内的に変換されて免疫システムに影
響を与えそしてこれによって種々の病理学的過程への敏
感性または耐性が影響を受ける様式を、より機構的な様
式で定義付けすることを求めている。ストレスの如き生
行動因子は、病理学的結果にとって正もしくは負の危険
因子となり得る（Maier,S.F.他、BRAIN BEHAV.IMMUN.2:
8791（1988））。何人かの研究者は、ヒトにおける正も
しくは負の心構えは癌、エイズまたは自己免疫病におけ
る宿主の全体的応答に貢献する有意な因子であり得ると
考えている（例えば上記Ader他参照）。
野は、生行動因子が内的に変換されて免疫システムに影
響を与えそしてこれによって種々の病理学的過程への敏
感性または耐性が影響を受ける様式を、より機構的な様
式で定義付けすることを求めている。ストレスの如き生
行動因子は、病理学的結果にとって正もしくは負の危険
因子となり得る（Maier,S.F.他、BRAIN BEHAV.IMMUN.2:
8791（1988））。何人かの研究者は、ヒトにおける正も
しくは負の心構えは癌、エイズまたは自己免疫病におけ
る宿主の全体的応答に貢献する有意な因子であり得ると
考えている（例えば上記Ader他参照）。
単一個体における免疫システムが有する個々の成分を
経時的に評価して定量する我々の能力（例えばエイズに
関連した病気の開始点および／または治療を監視するに
とって重要である）は弱いものであった（Kiecolt他、B
RAIN BEHAV.IMMUN.2:67−78（1988）;Glaser,R他、BRAI
N BEHAV.IMMUN.1:107−112（1987））。免疫システムの
調整に参加させ得る行動戦略に関する研究には、幅広い
種類の研究者（インビトロの免疫学的技術の複雑さに必
ずしも慣れていない研究者を含む）が用いることが可能
な容易に利用できる分析手段が必要である。現在のとこ
ろこのような方法は明らかに不足している。
経時的に評価して定量する我々の能力（例えばエイズに
関連した病気の開始点および／または治療を監視するに
とって重要である）は弱いものであった（Kiecolt他、B
RAIN BEHAV.IMMUN.2:67−78（1988）;Glaser,R他、BRAI
N BEHAV.IMMUN.1:107−112（1987））。免疫システムの
調整に参加させ得る行動戦略に関する研究には、幅広い
種類の研究者（インビトロの免疫学的技術の複雑さに必
ずしも慣れていない研究者を含む）が用いることが可能
な容易に利用できる分析手段が必要である。現在のとこ
ろこのような方法は明らかに不足している。
精神神経免疫学研究で幅広く用いられている１つの方
法は、リンパ球芽球形成またはリンパ球形質転換試験と
しても知られている、マイトジェンを用いインビトロで
リンパ球を刺激する方法である（Maluish,A.E.他、「臨
床実験室免疫学のマニュアル」（MANUAL OF CLINICAL L
ABORATORY IMMUNOLOGY）（第３版）、Rose,N.R.他（編
集）、274−281（1986））。この方法は、血液から分離
させたリンパ球を、種々の用量のマイトジェンの存在
下、インビトロで数日間培養することを伴っている。こ
れらのマイトジェンは、典型的には、植物誘導または微
生物誘導された非特異的リンパ球増殖活性因子である。
細胞応答の尺度として、一般に、その培養されたリンパ
球が示す3H−チミジンを取り込む能力（よく知られてい
るDNA合成および細胞増殖の尺度）が用いられている。
このような操作は高い変動性を示すことで熟練者に依存
していると共に、被験者の血清（もしこの検定の中に組
み込まれるとしたならば）が与えるミクロ環境を含む数
多くの未知因子の影響を受ける。
法は、リンパ球芽球形成またはリンパ球形質転換試験と
しても知られている、マイトジェンを用いインビトロで
リンパ球を刺激する方法である（Maluish,A.E.他、「臨
床実験室免疫学のマニュアル」（MANUAL OF CLINICAL L
ABORATORY IMMUNOLOGY）（第３版）、Rose,N.R.他（編
集）、274−281（1986））。この方法は、血液から分離
させたリンパ球を、種々の用量のマイトジェンの存在
下、インビトロで数日間培養することを伴っている。こ
れらのマイトジェンは、典型的には、植物誘導または微
生物誘導された非特異的リンパ球増殖活性因子である。
細胞応答の尺度として、一般に、その培養されたリンパ
球が示す3H−チミジンを取り込む能力（よく知られてい
るDNA合成および細胞増殖の尺度）が用いられている。
このような操作は高い変動性を示すことで熟練者に依存
していると共に、被験者の血清（もしこの検定の中に組
み込まれるとしたならば）が与えるミクロ環境を含む数
多くの未知因子の影響を受ける。
内分泌ホルモン類に関するより典型的なイムノアッセ
イとは対照的に、確立されたベースラインとなる応答が
存在していないことから、実験室間そして実験室内でさ
えも、比較を行うのが非常に困難である。しかしなが
ら、リンパ球形質転換試験は、全種類の細胞、即ち用い
るマイトジェンに応じてＴリンパ球またはＢリンパ球両
方の細胞が示す応答能力を試験していることから、この
試験では、免疫システムに関する機能的な情報が得られ
る。不幸なことは、このアッセイの不正確さが理由で、
それの利用性が大きく低下している。
イとは対照的に、確立されたベースラインとなる応答が
存在していないことから、実験室間そして実験室内でさ
えも、比較を行うのが非常に困難である。しかしなが
ら、リンパ球形質転換試験は、全種類の細胞、即ち用い
るマイトジェンに応じてＴリンパ球またはＢリンパ球両
方の細胞が示す応答能力を試験していることから、この
試験では、免疫システムに関する機能的な情報が得られ
る。不幸なことは、このアッセイの不正確さが理由で、
それの利用性が大きく低下している。
精神神経免疫学研究で通常に用いられている２番目の
アッセイは、ナチュラルキラー（NK）細胞活性を測定す
る方法である（Herberman,R.B.、臨床実験室免疫学のマ
ニュアル」（MANUAL OF CLINICAL LABORATORY IMMUNOLO
GY）（第３版）、Rose,N.R.他（編集）、308−314（198
6）;Irwin,M.他、BRAIN BEHAV.IMMUN.1:98−104（198
7）;Jemmott,J.B.、3d、J.BEHAV.MED.13:53−73（199
0））。再び、このアッセイもまた上に示した欠点の多
くに苦しんでいる。このアッセイが普及した１つの理由
は、最も抗原に特異的であるか或は抗体に依存している
細胞毒性アッセイに比較してそれを行うのが比較的容易
な点である。しかしながら、内分泌ホルモンで通常用い
られているイムノアッセイに比較すると、これはまだ行
うのがむしろ困難なバイオアッセイとしてランク付けさ
れている。
アッセイは、ナチュラルキラー（NK）細胞活性を測定す
る方法である（Herberman,R.B.、臨床実験室免疫学のマ
ニュアル」（MANUAL OF CLINICAL LABORATORY IMMUNOLO
GY）（第３版）、Rose,N.R.他（編集）、308−314（198
6）;Irwin,M.他、BRAIN BEHAV.IMMUN.1:98−104（198
7）;Jemmott,J.B.、3d、J.BEHAV.MED.13:53−73（199
0））。再び、このアッセイもまた上に示した欠点の多
くに苦しんでいる。このアッセイが普及した１つの理由
は、最も抗原に特異的であるか或は抗体に依存している
細胞毒性アッセイに比較してそれを行うのが比較的容易
な点である。しかしながら、内分泌ホルモンで通常用い
られているイムノアッセイに比較すると、これはまだ行
うのがむしろ困難なバイオアッセイとしてランク付けさ
れている。
NK細胞アッセイは、典型的には51Crで予め標識を付け
た適当な感受性を示す腫瘍細胞系由来の標的細胞をある
種の白血球細胞が自然発生的に溶解することでそのラジ
オアイソトープを媒体の中に放出する能力を基としてい
る。このアッセイは、定量可能なベースラインが不足し
ており、個体間の比較は、血液細胞サンプルを連続的に
希釈することによって影響を受ける溶解産物の差を基に
している。NK機能を有する細胞と、よく知られている種
類の白血球およびリンパ球との間の正確な関係はまだ不
明確である。更に、癌または感染病に対する免疫学的機
能および宿主の防御でNK細胞が果す役割は、確実には確
立されていない。
た適当な感受性を示す腫瘍細胞系由来の標的細胞をある
種の白血球細胞が自然発生的に溶解することでそのラジ
オアイソトープを媒体の中に放出する能力を基としてい
る。このアッセイは、定量可能なベースラインが不足し
ており、個体間の比較は、血液細胞サンプルを連続的に
希釈することによって影響を受ける溶解産物の差を基に
している。NK機能を有する細胞と、よく知られている種
類の白血球およびリンパ球との間の正確な関係はまだ不
明確である。更に、癌または感染病に対する免疫学的機
能および宿主の防御でNK細胞が果す役割は、確実には確
立されていない。
普及して来ている、免疫システムを監視する３番目の
アプローチは、細胞表面マーカーに特異的な抗体を用い
たフロー血球計算法によるリンパ球サブセットの計算で
ある（Ault,K.、「臨床実験室免疫学のマニュアル」（M
ANUAL OF CLINICAL LABORATORY IMMUNOLOGY）（第３
版）、Rose,N.R.他（編集）、247−253（1986））。こ
のアプローチは、循環内の種々の種類のリンパ球分布を
即座に示すものであるが、如何なる細胞に関しても機能
的情報を与えるものではない。数多くの心理生物学研究
には前処理、処理および後処理設計が必要とされている
ことから、このアッセイは、いくつかの細胞数変化があ
まりにも早過ぎて一過的であることで意味をなさなくな
るといった欠点を有している。それとは対照的に、リン
パ球サブセットを循環させる長期状態ではあまりにも安
定になり過ぎることから、穏やかな刺激に対する正確な
応答測定を得ることはできない。サブセットを計算する
アプローチは、このように、主要な医学的病気で起こる
より恒久的な変化、例えばエイズにおけるCD4+T細胞の
損失などを試験するにより適当である。従って、行動因
子に対する免疫システムの応答を測定する目的でこの方
法を利用するには限界がある。
アプローチは、細胞表面マーカーに特異的な抗体を用い
たフロー血球計算法によるリンパ球サブセットの計算で
ある（Ault,K.、「臨床実験室免疫学のマニュアル」（M
ANUAL OF CLINICAL LABORATORY IMMUNOLOGY）（第３
版）、Rose,N.R.他（編集）、247−253（1986））。こ
のアプローチは、循環内の種々の種類のリンパ球分布を
即座に示すものであるが、如何なる細胞に関しても機能
的情報を与えるものではない。数多くの心理生物学研究
には前処理、処理および後処理設計が必要とされている
ことから、このアッセイは、いくつかの細胞数変化があ
まりにも早過ぎて一過的であることで意味をなさなくな
るといった欠点を有している。それとは対照的に、リン
パ球サブセットを循環させる長期状態ではあまりにも安
定になり過ぎることから、穏やかな刺激に対する正確な
応答測定を得ることはできない。サブセットを計算する
アプローチは、このように、主要な医学的病気で起こる
より恒久的な変化、例えばエイズにおけるCD4+T細胞の
損失などを試験するにより適当である。従って、行動因
子に対する免疫システムの応答を測定する目的でこの方
法を利用するには限界がある。
簡単でストレスのないサンプリングであるといった明
らかな利点を有する４番目のアプローチは、唾液内の分
泌免疫グロブリンであるIgAの測定を伴うものである（J
ohnson R.B.,Jr.他、J.IMMUNOASSAY 3:73−89（1982）;
Stone,A.A.他、J.HUMAN STRESS 13:136−140（1987）;J
emmott,J.B.3d他、BEHAV.MED.15:63−71（1989）;Jemmo
tt,J.B.3d他、J.PERS.SOC.PSYCHOL.55:803−810（198
8）:Jemmott,J.B.3d他、LANCET 1:1400−1402（198
3））。この唾液IgAの全濃度は、未知の抗原特異性を示
す抗体の大きな集合が存在していることを反映したもの
である。更に、唾液内の全IgAレベルがどのように免疫
システムの全体的動力学に関係しているかは明らかでな
い。IgA抗体は粘膜の表面と会合して、これらの表面を
感染から保護していると考えられている。その結果とし
て、分泌IgAは、唾液内のみでなく気管支分泌物、初
乳、ミルクおよび尿生殖器分泌物内にも見付け出され
る。全体としての免疫システム活性の有効な指数とし
て、分泌されたIgAの監視を用いることは、問題視され
ている（上記Stone他；上記Jemmott他）。
らかな利点を有する４番目のアプローチは、唾液内の分
泌免疫グロブリンであるIgAの測定を伴うものである（J
ohnson R.B.,Jr.他、J.IMMUNOASSAY 3:73−89（1982）;
Stone,A.A.他、J.HUMAN STRESS 13:136−140（1987）;J
emmott,J.B.3d他、BEHAV.MED.15:63−71（1989）;Jemmo
tt,J.B.3d他、J.PERS.SOC.PSYCHOL.55:803−810（198
8）:Jemmott,J.B.3d他、LANCET 1:1400−1402（198
3））。この唾液IgAの全濃度は、未知の抗原特異性を示
す抗体の大きな集合が存在していることを反映したもの
である。更に、唾液内の全IgAレベルがどのように免疫
システムの全体的動力学に関係しているかは明らかでな
い。IgA抗体は粘膜の表面と会合して、これらの表面を
感染から保護していると考えられている。その結果とし
て、分泌IgAは、唾液内のみでなく気管支分泌物、初
乳、ミルクおよび尿生殖器分泌物内にも見付け出され
る。全体としての免疫システム活性の有効な指数とし
て、分泌されたIgAの監視を用いることは、問題視され
ている（上記Stone他；上記Jemmott他）。
注目すべきは、免疫システムに対する心理的ストレス
の如き行動因子を試験するにとって、ストレスのない様
式で体液のサンプリングを行うことができることが特に
重要である。例えば、静脈に針を刺して血液サンプルを
得ることそれ自身は、その得られるデータを汚染し得る
心理的変化を生じさせ得る。従って、唾液のサイトカイ
ンまたは他の免疫システム産物レベルの測定を可能にす
る方法は、現存しているアプローチに比べて下記の如き
いくつかの主要な利点を有している：例えば、（ａ）静
脈切開に関連した危険およびストレスがなくなること；
（ｂ）内部環境を見るウインドーとして働くこと；
（ｃ）簡単で「家に居て（at home）」採取が可能であ
ること；（ｄ）経時的な動的評価が可能なこと；（ｅ）
脳／免疫システム相互作用を評価するための本質的に新
規な手段が得られること；（ｆ）健康に対するストレス
の影響を評価する補助となる方策として用いられるこ
と；そして（ｇ）エイズにおけるHIV感染のように、初
期の病理学的出来事が生じたあと症状が出ることに関係
し得る尺度が得られること。
の如き行動因子を試験するにとって、ストレスのない様
式で体液のサンプリングを行うことができることが特に
重要である。例えば、静脈に針を刺して血液サンプルを
得ることそれ自身は、その得られるデータを汚染し得る
心理的変化を生じさせ得る。従って、唾液のサイトカイ
ンまたは他の免疫システム産物レベルの測定を可能にす
る方法は、現存しているアプローチに比べて下記の如き
いくつかの主要な利点を有している：例えば、（ａ）静
脈切開に関連した危険およびストレスがなくなること；
（ｂ）内部環境を見るウインドーとして働くこと；
（ｃ）簡単で「家に居て（at home）」採取が可能であ
ること；（ｄ）経時的な動的評価が可能なこと；（ｅ）
脳／免疫システム相互作用を評価するための本質的に新
規な手段が得られること；（ｆ）健康に対するストレス
の影響を評価する補助となる方策として用いられるこ
と；そして（ｇ）エイズにおけるHIV感染のように、初
期の病理学的出来事が生じたあと症状が出ることに関係
し得る尺度が得られること。
免疫システムが有する２種の調節分子はインターロイ
キン１および２（IL−１およびIL−２）である。このIL
−１およびIL−２がサイトカインの「カスケード」を調
整する能力、およびそれに付随した細胞増殖、分化、お
よびリンパ球細胞が示すエフェクタ機能などは、詳細に
特徴付けされている（例えばKampschmidt,R.F.、J.LEU
K.BIOL.36:341−355（1984）;Smith,K.A.、ANN.REV.IMM
UNOL.2:319−333（1984））。
キン１および２（IL−１およびIL−２）である。このIL
−１およびIL−２がサイトカインの「カスケード」を調
整する能力、およびそれに付随した細胞増殖、分化、お
よびリンパ球細胞が示すエフェクタ機能などは、詳細に
特徴付けされている（例えばKampschmidt,R.F.、J.LEU
K.BIOL.36:341−355（1984）;Smith,K.A.、ANN.REV.IMM
UNOL.2:319−333（1984））。
最近の研究において、これらのサイトカイン類の両方
が免疫システム外で恒常性維持調節因子として作用して
いることが示されたように、これらの２つの分子が示す
シグナルは明らかに免疫システム内作用のみに限定され
ているものではない。例えば、IL−１は、視床下部−下
垂体−副腎から成る軸の有効な調節因子として働くこと
が示されており（Besedovsky,H.他、SCIENCE 233:652−
654（1986）;Bernton,E.W.他、SCIENCE 1987:519−521
（1987））、一方IL−２は、ライディッヒ細胞ステロイ
ド産生に影響を与えることが示されている（Gou,H.他、
ENDOCRINOLOGY 127:1234−1239（1990））。研究の結
果、IL−１およびIL−２は、インビトロおよびインビボ
において直接（マクロファージまたはＴ細胞の存在な
し）ホルモン依存ヒト乳癌細胞の増殖を抑制することが
示されている（Paciotti,G.F.他、NOL.ENDOCRINOL.2:45
9−464（1988）;Paciotti,G.F.他、ANTICANCER RES.8:1
233−1240（1988）;Paciotti,G.F.他、ANTICANCER RES.
11:25−32（1991））。従って、これらのサイトカイン
類は、免疫システムにおける古典的な自己分泌／パラ分
泌ループに影響を与えるばかりでなく内部分泌回路にも
影響を与え、従って、内分泌と免疫システムの間の相互
作用を調節し得る。
が免疫システム外で恒常性維持調節因子として作用して
いることが示されたように、これらの２つの分子が示す
シグナルは明らかに免疫システム内作用のみに限定され
ているものではない。例えば、IL−１は、視床下部−下
垂体−副腎から成る軸の有効な調節因子として働くこと
が示されており（Besedovsky,H.他、SCIENCE 233:652−
654（1986）;Bernton,E.W.他、SCIENCE 1987:519−521
（1987））、一方IL−２は、ライディッヒ細胞ステロイ
ド産生に影響を与えることが示されている（Gou,H.他、
ENDOCRINOLOGY 127:1234−1239（1990））。研究の結
果、IL−１およびIL−２は、インビトロおよびインビボ
において直接（マクロファージまたはＴ細胞の存在な
し）ホルモン依存ヒト乳癌細胞の増殖を抑制することが
示されている（Paciotti,G.F.他、NOL.ENDOCRINOL.2:45
9−464（1988）;Paciotti,G.F.他、ANTICANCER RES.8:1
233−1240（1988）;Paciotti,G.F.他、ANTICANCER RES.
11:25−32（1991））。従って、これらのサイトカイン
類は、免疫システムにおける古典的な自己分泌／パラ分
泌ループに影響を与えるばかりでなく内部分泌回路にも
影響を与え、従って、内分泌と免疫システムの間の相互
作用を調節し得る。
「内分泌様」ホルモンとして役割を果すIL−１および
IL−２は、それらの仮想標的部位に到達して影響を与え
るに充分な量で存在している必要がある。従って、従来
から免疫システムに属していると考えられている上記シ
グナル分子に関する内分泌作用の生物学的基本を確かめ
ることは、これらの分子の内因性濃度を定量的様式で検
出して監視することができるか否かに依存している。血
液内で直接IL−１およびIL−２並びに他のサイトカイン
類を測定する通常方法は満足されるものでなかった。
IL−２は、それらの仮想標的部位に到達して影響を与え
るに充分な量で存在している必要がある。従って、従来
から免疫システムに属していると考えられている上記シ
グナル分子に関する内分泌作用の生物学的基本を確かめ
ることは、これらの分子の内因性濃度を定量的様式で検
出して監視することができるか否かに依存している。血
液内で直接IL−１およびIL−２並びに他のサイトカイン
類を測定する通常方法は満足されるものでなかった。
今日まで、IL−１およびIL−２に関する研究は、主
に、リンパ球増殖に刺激を与えること、並びに適応性の
ある免疫応答および他の形態の宿主防御におけるヘルパ
ーおよびエフェクター機能でそれらが果す役割に関する
ものであった。このような焦点を当てた結果として、こ
れらのサイトカイン類に関する研究は、インビトロで培
養した細胞の刺激か、或は免疫学的病気における血液の
サイトカインレベルをインビボで測定することに限定さ
れていた。最近の研究において、IL−１は循環の「内因
性」成分であると見なすべきであるが、その濃度は数多
くの「現実の（real life）」状態で変化し得ることが
示されている。
に、リンパ球増殖に刺激を与えること、並びに適応性の
ある免疫応答および他の形態の宿主防御におけるヘルパ
ーおよびエフェクター機能でそれらが果す役割に関する
ものであった。このような焦点を当てた結果として、こ
れらのサイトカイン類に関する研究は、インビトロで培
養した細胞の刺激か、或は免疫学的病気における血液の
サイトカインレベルをインビボで測定することに限定さ
れていた。最近の研究において、IL−１は循環の「内因
性」成分であると見なすべきであるが、その濃度は数多
くの「現実の（real life）」状態で変化し得ることが
示されている。
一般に、IL−１およびIL−２または他のサイトカイン
類をインビボにおける免疫競合の尺度として見る場合、
研究者達は、白血病および関節炎の如きひどい病態生理
学的条件下の大きな濃度変化に焦点を当ててきた。更
に、循環しているサイトカインレベルに関する報告は、
対照と比較して患者内ではそのレベルが上昇することに
関係付けられており、正常な被験者内でもIL−１および
IL−２が検出され得ると共に種々の潜在的因子による調
整を受け得るといった事実に対してはほとんど注意が払
われていない（Michie,H.R.他、NEW ENG.J.MED.318:148
1−1486（1988）;Grau,G.E.他、LYMPHOKINE RES.7:335
（1988）;Shenkin,A.他、LYMPHOKINE RES.7:333（198
8））。
類をインビボにおける免疫競合の尺度として見る場合、
研究者達は、白血病および関節炎の如きひどい病態生理
学的条件下の大きな濃度変化に焦点を当ててきた。更
に、循環しているサイトカインレベルに関する報告は、
対照と比較して患者内ではそのレベルが上昇することに
関係付けられており、正常な被験者内でもIL−１および
IL−２が検出され得ると共に種々の潜在的因子による調
整を受け得るといった事実に対してはほとんど注意が払
われていない（Michie,H.R.他、NEW ENG.J.MED.318:148
1−1486（1988）;Grau,G.E.他、LYMPHOKINE RES.7:335
（1988）;Shenkin,A.他、LYMPHOKINE RES.7:333（198
8））。
血清または血漿内のサイトカイン類を測定することに
加えて、他の生物学的流体内でも種々のサイトカイン類
が検出された。例えば、Kimball,E.C.他（J.IMMUNOL.13
3:256−260（1984））は、ヒト尿内のIL−１生活性を報
告した。Tamatani,T.他（IMMUNOLOGY 65:337−342（198
8））は、クロマトグラフィーおよびバイオアッセイ方
法を用いて、ヒト洋膜液内にIL−１αおよびIL−１βが
存在していることを開示した。同じグループは酵素イム
ノアッセイを用いて、ヒト洋膜液内のIL−１αおよびIL
−１βを測定した（Tsunoda,H.他、LYMPHOKINE RES.7:3
33（1988））。Wilmott,R.W.他（LYMPHOKINE RES.7:334
（1988））は、他の病気と比較して、のう胞性線維症に
おけるヒト気管支肺胞洗浄液内のIL−１β（EIAによ
る）およびIL−１生活性を測定した。Khan他（MOL.CEL
L.ENDOCRINOL.58:221−230（1988））は、ヒト卵胞液内
に高レベルのIL−１様生活性が存在していることを示す
報告を行った。天疱瘡患者の水疱液内にリンフォトキシ
ンが存在していることが報告された（Jeffes,E.W.他、
J.CLIN.IMMUNOL.4:31−35（1984））。また、ヒトの汗
の中にIL−１が存在していることも報告された（Didier
jean他「ヒト外分泌汗内の生物学的活性を示すインター
ロイキン1:α／β比に関する部位依存変動、およびスト
レスで誘発されて上昇した分泌」、CYTOKINE 2:438−44
6（1990））。
加えて、他の生物学的流体内でも種々のサイトカイン類
が検出された。例えば、Kimball,E.C.他（J.IMMUNOL.13
3:256−260（1984））は、ヒト尿内のIL−１生活性を報
告した。Tamatani,T.他（IMMUNOLOGY 65:337−342（198
8））は、クロマトグラフィーおよびバイオアッセイ方
法を用いて、ヒト洋膜液内にIL−１αおよびIL−１βが
存在していることを開示した。同じグループは酵素イム
ノアッセイを用いて、ヒト洋膜液内のIL−１αおよびIL
−１βを測定した（Tsunoda,H.他、LYMPHOKINE RES.7:3
33（1988））。Wilmott,R.W.他（LYMPHOKINE RES.7:334
（1988））は、他の病気と比較して、のう胞性線維症に
おけるヒト気管支肺胞洗浄液内のIL−１β（EIAによ
る）およびIL−１生活性を測定した。Khan他（MOL.CEL
L.ENDOCRINOL.58:221−230（1988））は、ヒト卵胞液内
に高レベルのIL−１様生活性が存在していることを示す
報告を行った。天疱瘡患者の水疱液内にリンフォトキシ
ンが存在していることが報告された（Jeffes,E.W.他、
J.CLIN.IMMUNOL.4:31−35（1984））。また、ヒトの汗
の中にIL−１が存在していることも報告された（Didier
jean他「ヒト外分泌汗内の生物学的活性を示すインター
ロイキン1:α／β比に関する部位依存変動、およびスト
レスで誘発されて上昇した分泌」、CYTOKINE 2:438−44
6（1990））。
ネコ（Coceani,F.他、BRAIN RES.446:245−250（198
8））およびヒト（例えばPeter,J.B.他、NEUROLOGY 41:
121−123（1991年１月）参照）の脳脊髄液（CSF）内にI
L−１を見付け出したことが報告された。Peter他（上
記）は、多発性硬化症患者および正常な対照が有するCS
Fおよび血清内のIL−１βおよび腫瘍壊死因子（TNF）を
試験した結果、彼らは、これらの２種の流体内に存在し
ている上記サイトカイン類のレベルを予後もしくは診断
で利用することはできないと結論付けた。Westacott,C.
I.他（ANN.RHEUM.DIS.49:676−681（1990））はイムノ
アッセイを用いて、リウマチ性疾患にかかった患者の滑
液内のサイトカイン類を測定した（IL−１βに関しては
EIA;IL−2,TNF、IFNアルファおよびガンマに関してはRI
A）。
8））およびヒト（例えばPeter,J.B.他、NEUROLOGY 41:
121−123（1991年１月）参照）の脳脊髄液（CSF）内にI
L−１を見付け出したことが報告された。Peter他（上
記）は、多発性硬化症患者および正常な対照が有するCS
Fおよび血清内のIL−１βおよび腫瘍壊死因子（TNF）を
試験した結果、彼らは、これらの２種の流体内に存在し
ている上記サイトカイン類のレベルを予後もしくは診断
で利用することはできないと結論付けた。Westacott,C.
I.他（ANN.RHEUM.DIS.49:676−681（1990））はイムノ
アッセイを用いて、リウマチ性疾患にかかった患者の滑
液内のサイトカイン類を測定した（IL−１βに関しては
EIA;IL−2,TNF、IFNアルファおよびガンマに関してはRI
A）。
臨床的に正常なヒトの歯肉液内で、IL−１様生活性を
示す因子が検出されたが（Oppenheim,J.J.他、TRANSPLA
NT.PROC.14:553−555（198））、炎症を起こしていない
歯肉領域よりも炎症を起こした領域内の活性の方が高か
った。この歯肉液内因子は、IL−１および表皮胸腺細胞
活性化因子の両方に相当する分子量を示していた（Char
on,J.A.他、INFEC.IMMUN.38:1190−1195（1982））。EI
Aを用いたJandinskiおよび同僚による研究（Jandinski,
J.他、J.DENT.RES.67:2307（1988）;Jandinski,J.他、
J.DENT.RES.68:526（1988）;Jandinski,J.他、J.DENT.R
ES.68:1233（1988））では、歯周組織内にIL−１αが存
在している一方、歯周病にかかった患者の歯肉間隙液内
ではIL−１が主流であると報告された。組換え型ヒトIL
−１αおよびIL−１βに対するポリクローナル抗血清を
用いた最近の研究およびウエスタンブロッティングによ
る測定により、慢性的な炎症性歯周病にかかった患者の
歯肉間隙液内に見いだされるIL−１生活性の主要部分
は、一般に、膜結合型IL−１と見なされるIL−１である
ことが開示された（Kabashimi,H.他、INFEC.IMMUN.58:2
621−2627（1990））。細胞表面からの酵素的開裂によ
ってIL−１が誘導されるといった示唆がなされた。この
後者の研究では、歯肉液が唾液で汚染されることを避け
る特別な注意が払われた。これらの事実は、歯肉液内の
IL−１が唾液を基としていることに対する強力な論争を
与えている。
示す因子が検出されたが（Oppenheim,J.J.他、TRANSPLA
NT.PROC.14:553−555（198））、炎症を起こしていない
歯肉領域よりも炎症を起こした領域内の活性の方が高か
った。この歯肉液内因子は、IL−１および表皮胸腺細胞
活性化因子の両方に相当する分子量を示していた（Char
on,J.A.他、INFEC.IMMUN.38:1190−1195（1982））。EI
Aを用いたJandinskiおよび同僚による研究（Jandinski,
J.他、J.DENT.RES.67:2307（1988）;Jandinski,J.他、
J.DENT.RES.68:526（1988）;Jandinski,J.他、J.DENT.R
ES.68:1233（1988））では、歯周組織内にIL−１αが存
在している一方、歯周病にかかった患者の歯肉間隙液内
ではIL−１が主流であると報告された。組換え型ヒトIL
−１αおよびIL−１βに対するポリクローナル抗血清を
用いた最近の研究およびウエスタンブロッティングによ
る測定により、慢性的な炎症性歯周病にかかった患者の
歯肉間隙液内に見いだされるIL−１生活性の主要部分
は、一般に、膜結合型IL−１と見なされるIL−１である
ことが開示された（Kabashimi,H.他、INFEC.IMMUN.58:2
621−2627（1990））。細胞表面からの酵素的開裂によ
ってIL−１が誘導されるといった示唆がなされた。この
後者の研究では、歯肉液が唾液で汚染されることを避け
る特別な注意が払われた。これらの事実は、歯肉液内の
IL−１が唾液を基としていることに対する強力な論争を
与えている。
上に示した文献の概略から分かるであろうように、血
液および他の体液内の内因性サイトカイン類を測定する
数多くの試みが行われてきた。しかしながら、これらの
報告を再考する時、血液内サイトカイン濃度および血液
内サイトカイン濃度変動に関して報告された結果が幅広
く変化していることは明らかである。
液および他の体液内の内因性サイトカイン類を測定する
数多くの試みが行われてきた。しかしながら、これらの
報告を再考する時、血液内サイトカイン濃度および血液
内サイトカイン濃度変動に関して報告された結果が幅広
く変化していることは明らかである。
数多くの報告は、イムノアッセイを用いたのでは正常
な被験者のサイトカイン類（即ちIL−２）を検出するこ
とは不可能であることを示唆している。充分に記述され
ている可溶IL−２レセプタと、循環しているIL−２とを
結合させることは可能であり得る。その結合部位が、サ
ンドイッチアッセイシステムの捕捉用抗体による認識の
障害になる可能性があり、これが、IL−２の検出を不可
能にしているように見える。二者択一的に、この分子が
捕捉されたとしても、その捕捉用抗体とその可溶IL−２
レセプタの両方がIL−２と結合することによる立体障害
で第二抗体による検出が邪魔され得る。実際、３番目の
大きな蛋白質を結合させるに充分なスペースは存在して
いない可能性がある。鍵となる要素は、これらのサンド
イッチELISAアッセイの設計では全体の一部のみの検出
を可能にすることが示唆されている点である。
な被験者のサイトカイン類（即ちIL−２）を検出するこ
とは不可能であることを示唆している。充分に記述され
ている可溶IL−２レセプタと、循環しているIL−２とを
結合させることは可能であり得る。その結合部位が、サ
ンドイッチアッセイシステムの捕捉用抗体による認識の
障害になる可能性があり、これが、IL−２の検出を不可
能にしているように見える。二者択一的に、この分子が
捕捉されたとしても、その捕捉用抗体とその可溶IL−２
レセプタの両方がIL−２と結合することによる立体障害
で第二抗体による検出が邪魔され得る。実際、３番目の
大きな蛋白質を結合させるに充分なスペースは存在して
いない可能性がある。鍵となる要素は、これらのサンド
イッチELISAアッセイの設計では全体の一部のみの検出
を可能にすることが示唆されている点である。
いくつかのアッセイ操作は、非常に少ない量のサイト
カインを検出することを可能にしているが、他の操作で
は全く検出されない。この差は、そのアッセイシステム
に関係しているか或はそのサイトカインに関係している
か或はそれの両方に関係している可能性がある。Canno
n,J.G.他、LYMPHOKINE RES.、7:457−465（1988）が行
った観察には、この問題が報告されており、ここでその
著者は、ある種の血漿物質がそのアッセイを阻害してい
る結果として検出が影響を受けることを示している。こ
の研究において、これらの著者は、障害となっている物
質を除去する目的で血漿のクロロホルム抽出を行うこと
を推奨している。単にこれらの血漿の因子がそのアッセ
イの性能に影響を与えているか或はサイトカインそれ自
身に関係しているかは、この研究では明らかでない。こ
のような問題を更にCapper,S.J.他、CYTOKINE 2:182−1
89（1990）が記述している。Capper,S.J.他は、IL−１
αおよびβは蛋白質と結合することが示しており、そし
てこの血漿を酸性にすることによって、これらの血清に
結合している蛋白質から上記分子を解離させると、その
検出可能レベルが変化することを示している。このマス
キング問題は、インビボ源から採取した生物学的サンプ
ルにユニークであると見られ、インビトロ細胞培養物の
上澄み液に含まれている血清結合蛋白質は多くない。
カインを検出することを可能にしているが、他の操作で
は全く検出されない。この差は、そのアッセイシステム
に関係しているか或はそのサイトカインに関係している
か或はそれの両方に関係している可能性がある。Canno
n,J.G.他、LYMPHOKINE RES.、7:457−465（1988）が行
った観察には、この問題が報告されており、ここでその
著者は、ある種の血漿物質がそのアッセイを阻害してい
る結果として検出が影響を受けることを示している。こ
の研究において、これらの著者は、障害となっている物
質を除去する目的で血漿のクロロホルム抽出を行うこと
を推奨している。単にこれらの血漿の因子がそのアッセ
イの性能に影響を与えているか或はサイトカインそれ自
身に関係しているかは、この研究では明らかでない。こ
のような問題を更にCapper,S.J.他、CYTOKINE 2:182−1
89（1990）が記述している。Capper,S.J.他は、IL−１
αおよびβは蛋白質と結合することが示しており、そし
てこの血漿を酸性にすることによって、これらの血清に
結合している蛋白質から上記分子を解離させると、その
検出可能レベルが変化することを示している。このマス
キング問題は、インビボ源から採取した生物学的サンプ
ルにユニークであると見られ、インビトロ細胞培養物の
上澄み液に含まれている血清結合蛋白質は多くない。
サイトカイン「結合蛋白質（binding protein）」の
最良例は、循環内で見いだされる可溶IL−２レセプタを
記述しているデータから推論され得る。この分子は、Ｔ
細胞上の低親和性を示すIL−２レセプタ「Tac」と免疫
学的に類似していることが示された。Ｔ細胞が存在して
いない循環内にそれが存在していることは、それは細胞
の外側から細胞の内側にシグナルを伝達し得るレセプタ
でない可能性があると言った強力な論争を与えている。
しかしながら、これらのデータは、この分子がまだIL−
２と結合する能力を有することを示していない。この循
環内のIL−２がこの蛋白質に結合し、そしてこのような
結合した複合体が、「サンドイッチ」アッセイによる内
因性IL−２の検出を本質的に不可能にしているものであ
る、と言った論争を我々は与えるものである。他のサイ
トカイン類（例えばIL−１）は、それらの検出を有効に
隠している血清内の他のキャリアー分子と結合すること
ができる。
最良例は、循環内で見いだされる可溶IL−２レセプタを
記述しているデータから推論され得る。この分子は、Ｔ
細胞上の低親和性を示すIL−２レセプタ「Tac」と免疫
学的に類似していることが示された。Ｔ細胞が存在して
いない循環内にそれが存在していることは、それは細胞
の外側から細胞の内側にシグナルを伝達し得るレセプタ
でない可能性があると言った強力な論争を与えている。
しかしながら、これらのデータは、この分子がまだIL−
２と結合する能力を有することを示していない。この循
環内のIL−２がこの蛋白質に結合し、そしてこのような
結合した複合体が、「サンドイッチ」アッセイによる内
因性IL−２の検出を本質的に不可能にしているものであ
る、と言った論争を我々は与えるものである。他のサイ
トカイン類（例えばIL−１）は、それらの検出を有効に
隠している血清内の他のキャリアー分子と結合すること
ができる。
加うるに、IL−１を含む種々のサイトカイン類は、特
定の正常もしくは病理上の生物学的流体の中に存在して
いると報告されているが、唾液または鼻分泌物内のサイ
トカイン類またはリンフォカイン類の報告は全くなされ
ていない。実際、インターフェロンの薬力学研究を報告
している論文（Diez,R.A.他、J.INTERFERON RES.7:553
−557（1987年10月））には次のように述べられてい
る：「...現在のところ、唾液および鼻分泌物内にイン
ターフェロンが存在しているか否かは明らかでない」。
定の正常もしくは病理上の生物学的流体の中に存在して
いると報告されているが、唾液または鼻分泌物内のサイ
トカイン類またはリンフォカイン類の報告は全くなされ
ていない。実際、インターフェロンの薬力学研究を報告
している論文（Diez,R.A.他、J.INTERFERON RES.7:553
−557（1987年10月））には次のように述べられてい
る：「...現在のところ、唾液および鼻分泌物内にイン
ターフェロンが存在しているか否かは明らかでない」。
体液内の種々の内因性サイトカイン類濃度を簡単に、
正確にそして再現可能様式で測定することができるなら
ば、多大な利益となり得るであろう。これにより、免疫
システムへの有効なウインドーが作り出されるばかりで
なく、生理学的に相互作用する無数の過程への有効なウ
インドーが作り出されるであろう。このような手段は、
種々の環境で有効性を示すことで、基本的な医科学、臨
床薬剤、疫学および法廷科学にとって重要なデータ集積
を可能にするであろう。
正確にそして再現可能様式で測定することができるなら
ば、多大な利益となり得るであろう。これにより、免疫
システムへの有効なウインドーが作り出されるばかりで
なく、生理学的に相互作用する無数の過程への有効なウ
インドーが作り出されるであろう。このような手段は、
種々の環境で有効性を示すことで、基本的な医科学、臨
床薬剤、疫学および法廷科学にとって重要なデータ集積
を可能にするであろう。
必要とされている方法は、循環しているサイトカイン
に結合し得る結合蛋白質の影響を受けないで血液の正確
なサイトカイン濃度をもたらす、血液内の内因性サイト
カイン類を測定する信頼できる方法である。加うるに、
唾液または鼻分泌物の如き生物学的流体内のサイトカイ
ン類を測定することが可能であるならば、個体の免疫シ
ステムの分析が簡潔になり、これによって恐らくは、培
養物内でこれらの細胞が示す行動を長期間に渡って分析
する、厄介でありそして高い変動性を示すアッセイを用
いることに取って代わるであろう。
に結合し得る結合蛋白質の影響を受けないで血液の正確
なサイトカイン濃度をもたらす、血液内の内因性サイト
カイン類を測定する信頼できる方法である。加うるに、
唾液または鼻分泌物の如き生物学的流体内のサイトカイ
ン類を測定することが可能であるならば、個体の免疫シ
ステムの分析が簡潔になり、これによって恐らくは、培
養物内でこれらの細胞が示す行動を長期間に渡って分析
する、厄介でありそして高い変動性を示すアッセイを用
いることに取って代わるであろう。
発明の要約 本発明は、ヒトまたは動物内の内因性サイトカイン類
の検出および監視で用いるための競合固相イムノアッセ
イである。この競合固相イムノアッセイは、「サンドイ
ッチ」アッセイよりはむしろ「１部位」イムノアッセイ
である。本発明は、血液および他の生物学的流体内の内
因性サイトカインレベルを測定するに特に有効である。
従来技術の方法では、サイトカインに結合する蛋白質
（または他の血液産物）が明らかにそのサイトカイン蛋
白質を隠していることから、血液内のサイトカインレベ
ルを信頼できる様式で測定することはできなかった。本
発明を用いてサイトカイン類を測定することにより、特
別なサイトカインの濃度を正確に測定することができ
る。加うるに、本発明は、唾液、鼻分泌物および涙の如
き流体内の内因性サイトカイイン類の測定で特に有効で
ある。
の検出および監視で用いるための競合固相イムノアッセ
イである。この競合固相イムノアッセイは、「サンドイ
ッチ」アッセイよりはむしろ「１部位」イムノアッセイ
である。本発明は、血液および他の生物学的流体内の内
因性サイトカインレベルを測定するに特に有効である。
従来技術の方法では、サイトカインに結合する蛋白質
（または他の血液産物）が明らかにそのサイトカイン蛋
白質を隠していることから、血液内のサイトカインレベ
ルを信頼できる様式で測定することはできなかった。本
発明を用いてサイトカイン類を測定することにより、特
別なサイトカインの濃度を正確に測定することができ
る。加うるに、本発明は、唾液、鼻分泌物および涙の如
き流体内の内因性サイトカイイン類の測定で特に有効で
ある。
本発明は、体液のサンプリングが容易であることによ
り、「正常な」並びに「刺激された」レベルのサイトカ
イン類を測定することを可能にするものである。本発明
は、病原体、化学品、治療薬、並びに生行動因子による
チャレンジに直面した時の、これらの化学的伝達シグナ
ルおよびそれらの調節不良（dysregulation）を監視す
る新規な手段を提供するものである。
り、「正常な」並びに「刺激された」レベルのサイトカ
イン類を測定することを可能にするものである。本発明
は、病原体、化学品、治療薬、並びに生行動因子による
チャレンジに直面した時の、これらの化学的伝達シグナ
ルおよびそれらの調節不良（dysregulation）を監視す
る新規な手段を提供するものである。
従って、本発明はまた、新規な競合イムノアッセイを
用いてヒトまたは動物の唾液または鼻分泌物内のサイト
カイン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物内の
サイトカインレベルを非侵入測定する方法を意図したも
のである。このイムノアッセイは、酵素イムノアッセイ
であるが、或は放射能元素、蛍光標識などの他の標識を
用いたイムノアッセイであり得る。
用いてヒトまたは動物の唾液または鼻分泌物内のサイト
カイン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物内の
サイトカインレベルを非侵入測定する方法を意図したも
のである。このイムノアッセイは、酵素イムノアッセイ
であるが、或は放射能元素、蛍光標識などの他の標識を
用いたイムノアッセイであり得る。
本発明は、血液および他の体液内の蛋白質を測定する
に特に有効であり、これらの蛋白質には、これに限定さ
れるものではないが、インターロイキン−１α、インタ
ーロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロ
イキン−６、インターフェロン−アルファ、イターフェ
ロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アルファを含む群か
ら選択される蛋白質が含まれる。本発明は、まだ特徴付
けされていないところの、血液内の他のサイトカイン様
分子を検出して定量するに有効であると考えられる。
に特に有効であり、これらの蛋白質には、これに限定さ
れるものではないが、インターロイキン−１α、インタ
ーロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロ
イキン−６、インターフェロン−アルファ、イターフェ
ロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アルファを含む群か
ら選択される蛋白質が含まれる。本発明は、まだ特徴付
けされていないところの、血液内の他のサイトカイン様
分子を検出して定量するに有効であると考えられる。
別の具体例において、本発明は、被験者の血液でない
体液内のサイトカイン濃度を測定することを含む、被験
者の免疫学的活性を監視する方法を意図したものであ
る。好適な具体例において、この体液は唾液である。別
の具体例において、この体液は鼻分泌物である。
体液内のサイトカイン濃度を測定することを含む、被験
者の免疫学的活性を監視する方法を意図したものであ
る。好適な具体例において、この体液は唾液である。別
の具体例において、この体液は鼻分泌物である。
従って、本発明の１つの目的は、ヒトまたは動物の体
液内の内因性サイトカイン濃度を正確に測定する方法を
提供することにある。
液内の内因性サイトカイン濃度を正確に測定する方法を
提供することにある。
本発明の更に別の目的は、ヒトまたは動物の血液内の
内因性サイトカイン濃度を正確に測定する方法を提供す
ることにある。
内因性サイトカイン濃度を正確に測定する方法を提供す
ることにある。
本発明の別の目的は、唾液および鼻分泌物内の内因性
サイトカイン濃度を正確に測定する方法を提供すること
にある。
サイトカイン濃度を正確に測定する方法を提供すること
にある。
本発明の更に別の目的は、体液内のサイトカイン濃度
を病理学的状態に関係させ得る方法を提供することにあ
る。
を病理学的状態に関係させ得る方法を提供することにあ
る。
本発明の更に別の目的は、サイトカイン類を測定する
方法を提供することにある。
方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、これらの試験を行うための臨床
的環境を必要としない、サイトカインレベルを監視する
方法を提供することにある。
的環境を必要としない、サイトカインレベルを監視する
方法を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、行動上の不安定さに応答し
たサイトカインレベルを評価して測定する方法を提供す
ることにある。
たサイトカインレベルを評価して測定する方法を提供す
ることにある。
本発明のさらなる目的は、化学的、ウイルスまたは細
菌のチャレンジに対する応答として、サイトカインレベ
ルを評価する方法を提供することにある。
菌のチャレンジに対する応答として、サイトカインレベ
ルを評価する方法を提供することにある。
本発明の更に別の目的は、同じ病気の過程の間に生じ
るサイトカインレベルを監視する方法を提供することに
ある。
るサイトカインレベルを監視する方法を提供することに
ある。
本発明の１つの目的は、病気の危険を示す指数として
サイトカインレベル測定を用いる方法を提供することに
ある。
サイトカインレベル測定を用いる方法を提供することに
ある。
本発明の別の目的は、臨床的信号の指示としてサイト
カインレベルを用いる方法を提供することにある。
カインレベルを用いる方法を提供することにある。
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、以
下に開示する具体例および添付請求の範囲の詳述を再考
することで明らかになるであろう。
下に開示する具体例および添付請求の範囲の詳述を再考
することで明らかになるであろう。
図の簡単な説明 図１は、組換え型ヒトインターロイキン−１αに対す
るラビットポリクローナル抗血清の相対的抗体タイター
を示すグラフである。
るラビットポリクローナル抗血清の相対的抗体タイター
を示すグラフである。
図２は、クロマトグラフィーを受けさせた抗IL−１抗
血清の画分が示す免疫反応性を表すグラフである。
血清の画分が示す免疫反応性を表すグラフである。
図３は、EIAにおけるアッセイ希釈液に関するIL−１
α標準曲線を示すグラフである。
α標準曲線を示すグラフである。
図４は、IL−１αに特異的なEIAに関する血清平行性
をを示すグラフである。このグラフは、図３のデータを
ロジット変換したものであり、IL−１αEIAの血清平行
性の確認である。
をを示すグラフである。このグラフは、図３のデータを
ロジット変換したものであり、IL−１αEIAの血清平行
性の確認である。
図５は、EIAにおけるアッセイ希釈液（図４）に関す
るIL−２標準曲線を示すグラフである。
るIL−２標準曲線を示すグラフである。
図６は、図４に関して行った血清平行性を示すグラフ
である。
である。
図７は、サイトカインでスパイクされている（spike
d）血清をIL−１（図7A）またはIL−２（図7B）に特異
的な抗体で処理し分別したHPLC確認を示すグラフであ
る。
d）血清をIL−１（図7A）またはIL−２（図7B）に特異
的な抗体で処理し分別したHPLC確認を示すグラフであ
る。
図８は、17kDaのWHO標準（レーン１）と一緒に泳動す
る免疫反応性材料の単一帯を示すウエスタンブロットで
ある。
る免疫反応性材料の単一帯を示すウエスタンブロットで
ある。
図９から11は各々、３人の正常な女性志願者由来のIL
−１αおよびIL−２の24時間プロファイルを示すグラフ
である。
−１αおよびIL−２の24時間プロファイルを示すグラフ
である。
図12は、唾液内のIL−１α免疫反応性を示すグラフで
ある。唾液を1:5、1:50および1:500に希釈し、そしてこ
の希釈の対数としてプロットした。
ある。唾液を1:5、1:50および1:500に希釈し、そしてこ
の希釈の対数としてプロットした。
図13は、唾液内のIL−２免疫反応性を示すグラフであ
る（図９と同様に希釈）。
る（図９と同様に希釈）。
図14から20は、肉体的および心理的ストレスを受けた
４人の被験者における唾液のIL−１およびIL−２レベル
を示している。
４人の被験者における唾液のIL−１およびIL−２レベル
を示している。
図21は、唾液内のIL−２免疫反応性とIL−２標準との
HPLC分離を示している。
HPLC分離を示している。
詳細な説明 本発明は、ヒトまたは動物由来の生物学的流体、例え
ば血液、唾液、鼻分泌物または涙などの中のサイトカイ
ンレベルを測定する方法を提供するものである。通常の
アッセイにおいてサイトカイン活性を隠していたサイト
カイン結合蛋白質が存在していたとしても、本発明に従
い、血液内のサイトカイン型蛋白質を正確に測定するこ
とができる。
ば血液、唾液、鼻分泌物または涙などの中のサイトカイ
ンレベルを測定する方法を提供するものである。通常の
アッセイにおいてサイトカイン活性を隠していたサイト
カイン結合蛋白質が存在していたとしても、本発明に従
い、血液内のサイトカイン型蛋白質を正確に測定するこ
とができる。
これらの方法は、被験者の免疫学的活性を監視するに
特に有効である。このような監視は、（１）サイトカイ
ン免疫治療または他の形態の治療を受けている被験者、
（２）唾液のリンフォカインまたはサイトカインレベル
が異常な免疫学的障害を有する患者、（３）免疫機能に
対する行動の影響の効果を試験すべき個人などで用いら
れ得る。これらの方法は、種々の生行動刺激、例えば心
理社会学的（psychosocial）ストレスに応答する個人に
おける免疫学的活性を非侵入様式およびストレスのない
様式で監視するに特によく適合している。
特に有効である。このような監視は、（１）サイトカイ
ン免疫治療または他の形態の治療を受けている被験者、
（２）唾液のリンフォカインまたはサイトカインレベル
が異常な免疫学的障害を有する患者、（３）免疫機能に
対する行動の影響の効果を試験すべき個人などで用いら
れ得る。これらの方法は、種々の生行動刺激、例えば心
理社会学的（psychosocial）ストレスに応答する個人に
おける免疫学的活性を非侵入様式およびストレスのない
様式で監視するに特によく適合している。
本発明の方法は、これに限定されるものではないが、
IL−１、IL−２、IL−４、IL−６、IFN−アルファ、IFN
−ガンマ、TNF−アルファおよびTNF−ベータなどを含む
数多くの公知サイトカイン類またはリンフォカイン類の
いずれかが存在していることを検出するか或はそれの濃
度またはレベルを測定する目的で用いられ得る。
IL−１、IL−２、IL−４、IL−６、IFN−アルファ、IFN
−ガンマ、TNF−アルファおよびTNF−ベータなどを含む
数多くの公知サイトカイン類またはリンフォカイン類の
いずれかが存在していることを検出するか或はそれの濃
度またはレベルを測定する目的で用いられ得る。
本発明者らは、血清並びに唾液および鼻分泌物内のサ
イトカイン類を正確に測定する目的で用いられ得る競合
EIAを開発した。唾液および鼻分泌物内のサイトカイン
類を測定することが可能なことより、血液よりも容易に
入手可能な体液内の該蛋白質を測定することが可能にな
る。
イトカイン類を正確に測定する目的で用いられ得る競合
EIAを開発した。唾液および鼻分泌物内のサイトカイン
類を測定することが可能なことより、血液よりも容易に
入手可能な体液内の該蛋白質を測定することが可能にな
る。
本発明は、好適にはポリクローナル抗体を基としてい
る１部位アッセイシステムのいずれかを包含している。
本発明者らは、サイトカインは生物学的流体内の他の分
子と結合するが、部位認識で利用され得るその分子の部
分は少なくとも一部であることを発見した。この部位は
ポリクローナル抗体結合を達成することが可能であり、
これが、１部位システムを用いてそれを検出することを
可能にしている。
る１部位アッセイシステムのいずれかを包含している。
本発明者らは、サイトカインは生物学的流体内の他の分
子と結合するが、部位認識で利用され得るその分子の部
分は少なくとも一部であることを発見した。この部位は
ポリクローナル抗体結合を達成することが可能であり、
これが、１部位システムを用いてそれを検出することを
可能にしている。
このような仮定は、本発明者らが行った直接的観察に
よって更に支持されている。IL−２サンドイッチアッセ
イを用いて細胞培養物の上澄み液および血漿サンプルを
試験した研究において、培養物の上澄み液内のIL−２は
検出可能であるが、血漿サンプル内のそれは検出不可能
であることが確認された。次に、これらの血漿サンプル
を57℃で30分間加熱した。これらのサンプルを再び分析
した結果、IL−２レベルの検出は可能であった。これら
のデータは、２部位アッセイは厄介であり、１部位ポリ
クローナル抗体システムの開発を示唆していた。この１
部位システムは、さらなる処理を行うことなく、通常の
血清または血漿内のIL−２検出を可能にするものであ
る。実際、この血清を上述したように加熱すると、加熱
していないサンプルに比較して、検出されるIL−２が少
なくなる。これらは観察は、下記によって説明され得
る。サンドイッチアッセイを用いた場合、加熱すると、
いずれとも比較しないで何かを見ることになる。しかし
ながら、この競合アッセイシステムを用いる場合、その
全体は既に検出されている。
よって更に支持されている。IL−２サンドイッチアッセ
イを用いて細胞培養物の上澄み液および血漿サンプルを
試験した研究において、培養物の上澄み液内のIL−２は
検出可能であるが、血漿サンプル内のそれは検出不可能
であることが確認された。次に、これらの血漿サンプル
を57℃で30分間加熱した。これらのサンプルを再び分析
した結果、IL−２レベルの検出は可能であった。これら
のデータは、２部位アッセイは厄介であり、１部位ポリ
クローナル抗体システムの開発を示唆していた。この１
部位システムは、さらなる処理を行うことなく、通常の
血清または血漿内のIL−２検出を可能にするものであ
る。実際、この血清を上述したように加熱すると、加熱
していないサンプルに比較して、検出されるIL−２が少
なくなる。これらは観察は、下記によって説明され得
る。サンドイッチアッセイを用いた場合、加熱すると、
いずれとも比較しないで何かを見ることになる。しかし
ながら、この競合アッセイシステムを用いる場合、その
全体は既に検出されている。
本発明の方法は、免疫システムに関する迅速で敏感な
動的「スナップショット」が得られる新規な手段を基礎
的研究者および臨床医の両方に与えるものである。本発
明の方法を用いることで、エイズまたは自己免疫病など
における主要な崩壊が生じている間ばかりでなく、通常
のストレスを受けた生活上の出来事に呼応した、ヒトま
たは動物内の免疫システムの状態を示す、より明確な図
を得ることが可能になる。このような情報は、免疫シス
テムに対する影響を通して健康または病気を助長する種
々の因子に関する知識を増大させ得ると共に、健康促進
行動に関して、個人、ヘルスケア提供者および社会がよ
り理論的な決定を充分に行うことを可能にするものであ
る。
動的「スナップショット」が得られる新規な手段を基礎
的研究者および臨床医の両方に与えるものである。本発
明の方法を用いることで、エイズまたは自己免疫病など
における主要な崩壊が生じている間ばかりでなく、通常
のストレスを受けた生活上の出来事に呼応した、ヒトま
たは動物内の免疫システムの状態を示す、より明確な図
を得ることが可能になる。このような情報は、免疫シス
テムに対する影響を通して健康または病気を助長する種
々の因子に関する知識を増大させ得ると共に、健康促進
行動に関して、個人、ヘルスケア提供者および社会がよ
り理論的な決定を充分に行うことを可能にするものであ
る。
生物学的流体内のサイトカインレベルを測定するため
の本発明の方法は、典型的には、このサイトカインに結
合し得る抗体の存在下でその生物学的流体を培養して、
その抗体に結合するか或は結合しないサイトカイン量を
検出することを含んでいる。
の本発明の方法は、典型的には、このサイトカインに結
合し得る抗体の存在下でその生物学的流体を培養して、
その抗体に結合するか或は結合しないサイトカイン量を
検出することを含んでいる。
通常のイムノアッセイ、特にEIAは、本分野でよく知
られている（例えばVoller,A.、DIAGNOSTIC HORIZONS
2:1−７、Microbiological Associates Quarterly Publ
ication、Walkersville、MD（1978）;Voller,A.他、BUL
L.WHO 53:55−65（1976）;Voller,A.他、J.CLIN.PATHO
L.31:507−520（1978）;Butler,J.E.、METH.ENZYMOL.7
3:482−523（1981）;Maggio,E.（編集）、ENZYME IMMUN
OASSAY、CRC Press、Boca Raton、FL（1980）;Hevey
他、米国特許第4,228,237号;Parikh他、米国特許第4,29
8,685号（これらの引用文献はここでは参照にいれられ
る））。
られている（例えばVoller,A.、DIAGNOSTIC HORIZONS
2:1−７、Microbiological Associates Quarterly Publ
ication、Walkersville、MD（1978）;Voller,A.他、BUL
L.WHO 53:55−65（1976）;Voller,A.他、J.CLIN.PATHO
L.31:507−520（1978）;Butler,J.E.、METH.ENZYMOL.7
3:482−523（1981）;Maggio,E.（編集）、ENZYME IMMUN
OASSAY、CRC Press、Boca Raton、FL（1980）;Hevey
他、米国特許第4,228,237号;Parikh他、米国特許第4,29
8,685号（これらの引用文献はここでは参照にいれられ
る））。
本発明者らは、生物学的材料内のホルモン類および成
長因子を測定するための新規な競合形態の酵素結合イム
ノソルベントアッセイ（ELISA）（またはPlebani他、J.
IMMUNOL.METH.90:241（1986）も参照）を開発した。未
知のリガンド、例えばサイトカインなどを検出する様式
は、競合ラジオイムノアッセイのそれに類似している。
簡単に言えば、標識を付けた被検体、例えば標識を付け
たビオチニル化IL−１の特異的量は、制限された数の抗
体結合部位に関して、標識を付けていないIL−１と競合
状態にある（未知のサンプル内か或は標準内におい
て）。
長因子を測定するための新規な競合形態の酵素結合イム
ノソルベントアッセイ（ELISA）（またはPlebani他、J.
IMMUNOL.METH.90:241（1986）も参照）を開発した。未
知のリガンド、例えばサイトカインなどを検出する様式
は、競合ラジオイムノアッセイのそれに類似している。
簡単に言えば、標識を付けた被検体、例えば標識を付け
たビオチニル化IL−１の特異的量は、制限された数の抗
体結合部位に関して、標識を付けていないIL−１と競合
状態にある（未知のサンプル内か或は標準内におい
て）。
上述した方法は、好適にはイムノアッセイであり、よ
り好適には酵素イムノアッセイであり、最も好適には競
合酵素イムノアッセイである。上述した方法は、被験者
の免疫学的活性を監視する方法を提供するものであり、
ここでの測定は１回以上行われる。更に、上述した方法
は、被験者におけるサイトカイン治療を監視する方法を
提供するものであり、ここで監視されるべき被験者は、
サイトカイン治療を受けている人である。好適には、監
視されるべきサイトカインは、免疫治療を示すサイトカ
インである。
り好適には酵素イムノアッセイであり、最も好適には競
合酵素イムノアッセイである。上述した方法は、被験者
の免疫学的活性を監視する方法を提供するものであり、
ここでの測定は１回以上行われる。更に、上述した方法
は、被験者におけるサイトカイン治療を監視する方法を
提供するものであり、ここで監視されるべき被験者は、
サイトカイン治療を受けている人である。好適には、監
視されるべきサイトカインは、免疫治療を示すサイトカ
インである。
本発明の好適な具体例において、このアッセイの第一
段階では、サイトカイン分子上の数多くのエピトープ類
を認識する抗体、好適にはラビットポリクローナル抗体
を、固相支持体または担体、好適にはポリスチレン製EI
Aプレートのウエルの上に吸着させる。次に、この「捕
捉用抗体」として知られている抗体を用いて、これを、
そのサンプルまたは標準内の、その標識を付けた被検
体、例えばビオチニル化したIL−１と、標識を付けてい
ない被検体と結合させる。適当な洗浄段階を行った後、
その標識のための酵素接合結合相手、例えばストレプト
アビジンまたは抗ビオチン抗体などを、その抗体−被検
体複合体と一緒に培養することにより、その酵素をその
複合体に結合させる。結合していない酵素接合結合相手
のいずれも除去した後、色素形成する酵素基質を添加す
る。この結合した酵素が、その基質を着色生成物に変化
させ、これを比色手段で検出することができる。単位時
間当たりに現れる色度合は、そのサンプルの中に存在し
ている被検体量に反比例している。被検体、例えばIL−
１の濃度が上昇するにつれて、その発生する色度合が低
下する。これは、固定量の固定化抗体への結合に関し
て、このサンプル内に存在している多量のIL−１と固定
量のビオチニル化IL−１とが成功裏に競合し、そしてそ
の結合した標識なしのIL−１は、その結果として、次に
起こる結合相手−酵素複合体の結合を生じないからであ
る。
段階では、サイトカイン分子上の数多くのエピトープ類
を認識する抗体、好適にはラビットポリクローナル抗体
を、固相支持体または担体、好適にはポリスチレン製EI
Aプレートのウエルの上に吸着させる。次に、この「捕
捉用抗体」として知られている抗体を用いて、これを、
そのサンプルまたは標準内の、その標識を付けた被検
体、例えばビオチニル化したIL−１と、標識を付けてい
ない被検体と結合させる。適当な洗浄段階を行った後、
その標識のための酵素接合結合相手、例えばストレプト
アビジンまたは抗ビオチン抗体などを、その抗体−被検
体複合体と一緒に培養することにより、その酵素をその
複合体に結合させる。結合していない酵素接合結合相手
のいずれも除去した後、色素形成する酵素基質を添加す
る。この結合した酵素が、その基質を着色生成物に変化
させ、これを比色手段で検出することができる。単位時
間当たりに現れる色度合は、そのサンプルの中に存在し
ている被検体量に反比例している。被検体、例えばIL−
１の濃度が上昇するにつれて、その発生する色度合が低
下する。これは、固定量の固定化抗体への結合に関し
て、このサンプル内に存在している多量のIL−１と固定
量のビオチニル化IL−１とが成功裏に競合し、そしてそ
の結合した標識なしのIL−１は、その結果として、次に
起こる結合相手−酵素複合体の結合を生じないからであ
る。
本発明に従う競合EIAは、迅速に、好適には７時間以
内に行うことができるように設計されているが、これを
一晩アッセイとして用いる柔軟性も有している。このア
ッセイの好適な形態において、これの最初の２時間の
間、その捕捉用抗体、好適にはラビット抗ヒトサイトカ
イン抗体を、96個ウエルのイムノプレートのウエルに吸
着させる。次の２時間の間に、結合していない抗体をそ
のプレートから洗い流した後、標準もしくは未知物と共
に、特定量の標識サイトカイン、好適にはビオチニル化
サイトカインを添加する。次に、その結合相手、好適に
は酵素、好適にはアルカリ性ホスファターゼに接合させ
たストレプトアビジンを添加した後、色素形成基質、好
適にはｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加すること
によって、その結合した標識サイトカイン量を検出す
る。次に、その得られる色を、適当な波長、例えばｐ−
ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウムに関しては
405nmの波長における吸収（または光学密度、O.D.）と
して読み取る。この色は、いくつかの時点、例えば４時
間および24時間で、比色計、例えばELISAプレート読み
装置を用いて読み取られ得る。
内に行うことができるように設計されているが、これを
一晩アッセイとして用いる柔軟性も有している。このア
ッセイの好適な形態において、これの最初の２時間の
間、その捕捉用抗体、好適にはラビット抗ヒトサイトカ
イン抗体を、96個ウエルのイムノプレートのウエルに吸
着させる。次の２時間の間に、結合していない抗体をそ
のプレートから洗い流した後、標準もしくは未知物と共
に、特定量の標識サイトカイン、好適にはビオチニル化
サイトカインを添加する。次に、その結合相手、好適に
は酵素、好適にはアルカリ性ホスファターゼに接合させ
たストレプトアビジンを添加した後、色素形成基質、好
適にはｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加すること
によって、その結合した標識サイトカイン量を検出す
る。次に、その得られる色を、適当な波長、例えばｐ−
ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウムに関しては
405nmの波長における吸収（または光学密度、O.D.）と
して読み取る。この色は、いくつかの時点、例えば４時
間および24時間で、比色計、例えばELISAプレート読み
装置を用いて読み取られ得る。
言葉「固相支持体」は、抗原もしくは抗体と結合し得
る如何なる支持体も意味している。よく知られている支
持体または担体には、これに限定されるものではない
が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガ
ラス、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然も
しくは改質セルロース類、ポリアクリルアミド類、アガ
ロース類および磁鉄鉱などが含まれる。この支持体材料
は、その抗原が抗体に結合し得る限り、本質的に如何な
る構造配置を有していてもよい。従って、この支持体の
構造はビードの如く球形であるか、試験管の内部表面の
如く筒状であるが、或は棒の外部表面などであってもよ
い。二者択一的に、この表面はシート、試験片などの如
く平らであってもよい。好適な担体は、ポリスチレン製
ミクロタイタープレートウエルの底または側面である。
本分野の技術者は、抗体または抗原と結合させるための
数多くの他の適切な担体を認識しているか、或は常規実
験を用いて上記を確かめることができるであろう。
る如何なる支持体も意味している。よく知られている支
持体または担体には、これに限定されるものではない
が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガ
ラス、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然も
しくは改質セルロース類、ポリアクリルアミド類、アガ
ロース類および磁鉄鉱などが含まれる。この支持体材料
は、その抗原が抗体に結合し得る限り、本質的に如何な
る構造配置を有していてもよい。従って、この支持体の
構造はビードの如く球形であるか、試験管の内部表面の
如く筒状であるが、或は棒の外部表面などであってもよ
い。二者択一的に、この表面はシート、試験片などの如
く平らであってもよい。好適な担体は、ポリスチレン製
ミクロタイタープレートウエルの底または側面である。
本分野の技術者は、抗体または抗原と結合させるための
数多くの他の適切な担体を認識しているか、或は常規実
験を用いて上記を確かめることができるであろう。
被検体、例えばサイトカイン（或は以下に記述する如
き抗サイトカイン抗体）に標識を付ける好適な方法は、
EIAで酵素に接合させる結合相手と結合し得る標識にそ
れを連結させる方法である。この酵素は、今度は、後で
その基質に暴露されると、分光光度測定、蛍光測定また
は可視手段などで検出され得る化学的部分を生じるよう
な様式で、その基質と反応する。本発明のEIA方法で有
効な酵素には、これに限定されるものではないが、アル
カリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ
球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラー
ゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリ
セロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
スパラギナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタ
ラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラー
ゼなどが含まれる。
き抗サイトカイン抗体）に標識を付ける好適な方法は、
EIAで酵素に接合させる結合相手と結合し得る標識にそ
れを連結させる方法である。この酵素は、今度は、後で
その基質に暴露されると、分光光度測定、蛍光測定また
は可視手段などで検出され得る化学的部分を生じるよう
な様式で、その基質と反応する。本発明のEIA方法で有
効な酵素には、これに限定されるものではないが、アル
カリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ
球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラー
ゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリ
セロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
スパラギナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタ
ラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラー
ゼなどが含まれる。
蛍光を示す化合物を用いてその被検体（または抗体）
に標識を付けることも可能である。蛍光標識を付けた結
合被検体を、適当な波長を有する光に暴露すると、これ
は発光することからその存在が検出され得る。最も通常
に用いられている蛍光標識用化合物の中には、フルオレ
セインイソチオシネート、ローダミン、フィコエリトリ
ン、フィコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルデ
ヒドおよびフルオレサミンなどがある。
に標識を付けることも可能である。蛍光標識を付けた結
合被検体を、適当な波長を有する光に暴露すると、これ
は発光することからその存在が検出され得る。最も通常
に用いられている蛍光標識用化合物の中には、フルオレ
セインイソチオシネート、ローダミン、フィコエリトリ
ン、フィコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルデ
ヒドおよびフルオレサミンなどがある。
蛍光を発する金属、例えば152Eu、またはランタニド
群の他のものを用いて、被検体または抗体に標識を付け
ることができる。これらの金属は、ジエチレン−トリア
ミンペンタ酢酸（DTPA）またはエチレンジアミンテトラ
酢酸（EDTA）の如き金属キレート群を用いて、その被検
体または抗体に結合させ得る。
群の他のものを用いて、被検体または抗体に標識を付け
ることができる。これらの金属は、ジエチレン−トリア
ミンペンタ酢酸（DTPA）またはエチレンジアミンテトラ
酢酸（EDTA）の如き金属キレート群を用いて、その被検
体または抗体に結合させ得る。
この被検体または抗体を化学発光化合物に連成させる
ことによっても、それに標識を付けることができる。化
学発光標識が付いている結合分子が存在していること
を、その化学反応過程の間に生じる発光の存在を検出す
ることによって測定する。特に有効な化学発光標識用化
合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティ
ック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩およびしゅう酸エステルなどで
ある。
ことによっても、それに標識を付けることができる。化
学発光標識が付いている結合分子が存在していること
を、その化学反応過程の間に生じる発光の存在を検出す
ることによって測定する。特に有効な化学発光標識用化
合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティ
ック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩およびしゅう酸エステルなどで
ある。
同様に、生発光化合物を用いてその被検体または抗体
に標識を付けることができる。生発光は、生物学的シス
テムの中で見いだされる種類の化学発光であり、ここで
は、触媒蛋白質がその化学発光反応の効率を上昇させて
いる。発光の存在を検出することにより、生発光蛋白質
の存在を測定する。標識を付けるに重要な生発光化合物
は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンな
どである。
に標識を付けることができる。生発光は、生物学的シス
テムの中で見いだされる種類の化学発光であり、ここで
は、触媒蛋白質がその化学発光反応の効率を上昇させて
いる。発光の存在を検出することにより、生発光蛋白質
の存在を測定する。標識を付けるに重要な生発光化合物
は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンな
どである。
酵素イムノアッセイを用いることに加えて、本発明の
方法は、他の種々のイムノアッセイのいずれかを用いて
サイトカインのレベルを測定することができる。例え
ば、サイトカイン（または以下に示す如き、サイトカイ
ンに特異的な抗体または抗体フラグメント）を放射能標
識することにより、ラジオイムノアッセイ（RIA）の使
用を通してサイトカインを検出することも可能である。
RIAに関する良好な説明が、Weintraub,B.著、「PRINCIP
LES OF RADIOIMMUNOASSAYS」の「放射リガンドアッセイ
技術に関する第七トレーニング過程」、The Endocrine
Society、１−５頁、46−49頁および68−78頁（1986年
３月）の中に見付け出され得る。そしてまた、Work T.
S.他著「分子生物学における実験室技術および生化学」
（LABORATORY TECHNIQUES AND BIOCHEMISTRY IN MOLECU
LAR BIOLOGY）、North Holland Publishing Company、N
ew York（1978）も参照のこと。
方法は、他の種々のイムノアッセイのいずれかを用いて
サイトカインのレベルを測定することができる。例え
ば、サイトカイン（または以下に示す如き、サイトカイ
ンに特異的な抗体または抗体フラグメント）を放射能標
識することにより、ラジオイムノアッセイ（RIA）の使
用を通してサイトカインを検出することも可能である。
RIAに関する良好な説明が、Weintraub,B.著、「PRINCIP
LES OF RADIOIMMUNOASSAYS」の「放射リガンドアッセイ
技術に関する第七トレーニング過程」、The Endocrine
Society、１−５頁、46−49頁および68−78頁（1986年
３月）の中に見付け出され得る。そしてまた、Work T.
S.他著「分子生物学における実験室技術および生化学」
（LABORATORY TECHNIQUES AND BIOCHEMISTRY IN MOLECU
LAR BIOLOGY）、North Holland Publishing Company、N
ew York（1978）も参照のこと。
ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンター
などの如き手段を用いるか或はオートラジオグラフィー
などを用いることで、放射性アイソトープを検出するこ
とができる。本発明の目的で特に有効なアイソトープ類
は、3H、125I、131I、35S、14Cおよび好適には125Iであ
る。
などの如き手段を用いるか或はオートラジオグラフィー
などを用いることで、放射性アイソトープを検出するこ
とができる。本発明の目的で特に有効なアイソトープ類
は、3H、125I、131I、35S、14Cおよび好適には125Iであ
る。
よく知られている方法に従って、与えられたロットの
抗サイトカイン抗体が示す結合活性を測定することがで
きる。本分野の技術者は、常規実験を用いることによ
り、各々の測定で用いられ得る最適なアッセイ条件を決
定することができるであろう。
抗サイトカイン抗体が示す結合活性を測定することがで
きる。本分野の技術者は、常規実験を用いることによ
り、各々の測定で用いられ得る最適なアッセイ条件を決
定することができるであろう。
特別な状態に通常であるか或は必要とされている如
き、洗浄、撹拌、振とう、濾過などの如き他の段階をこ
れらのアッセイに加えることも可能である。
き、洗浄、撹拌、振とう、濾過などの如き他の段階をこ
れらのアッセイに加えることも可能である。
標識を付けた抗体またはその標識を付けた被検体のた
めの結合相手の検出は、例えばもしその検出可能標識が
放射性を示すガンマ発光体である場合、シンチレーショ
ンカウンターを用いることで達成されるか、或は例えば
その標識が蛍光材料である場合、蛍光測定装置を用いて
達成され得る。酵素標識または色素形成基質の場合の検
出は、比色方法を用いて達成され得る。同様に調製した
標準物質との比較において、基質が示す酵素反応の度合
を可視的に比較することによっても、検出を行うことが
できる。
めの結合相手の検出は、例えばもしその検出可能標識が
放射性を示すガンマ発光体である場合、シンチレーショ
ンカウンターを用いることで達成されるか、或は例えば
その標識が蛍光材料である場合、蛍光測定装置を用いて
達成され得る。酵素標識または色素形成基質の場合の検
出は、比色方法を用いて達成され得る。同様に調製した
標準物質との比較において、基質が示す酵素反応の度合
を可視的に比較することによっても、検出を行うことが
できる。
本発明の１つの具体例において、唾液または鼻分泌物
などの如き体液を試験管の中に集める。例えば、適当に
位置させた収集用容器の中に被験者の唾液を吐き出させ
るか或は流し込ませるようにその被験者に依頼する。唾
液分泌の刺激物、例えばチューインガム片または結晶性
刺激物、例えばクエン酸飲料ミックスまたは酸っぱいキ
ャンディーなどを用いて、その唾液の流出を増強しても
よい。
などの如き体液を試験管の中に集める。例えば、適当に
位置させた収集用容器の中に被験者の唾液を吐き出させ
るか或は流し込ませるようにその被験者に依頼する。唾
液分泌の刺激物、例えばチューインガム片または結晶性
刺激物、例えばクエン酸飲料ミックスまたは酸っぱいキ
ャンディーなどを用いて、その唾液の流出を増強しても
よい。
別の具体例において、より洗練された収集操作は、歯
科用綿を用いて浄化された唾液抽出物を伴うものであ
る。好適な具体例は、糖が入っていない粉末飲料ミック
スをその歯科用綿にコートすることで、唾液分泌のため
の刺激物および唾液収集のための「液だめ」の両方とし
て用いる。次に、5ccの使い捨て用プラスチック製シリ
ンジの胴部の中にその飽和させた綿を置くことで、浄化
された唾液を抽出するプランジャーを再びその胴部の中
に挿入して、そのシリンジの先端の所に収集用試験管を
置く。次に、この歯科用綿を圧縮することで、その綿か
ら、浄化された唾液を押し出させる。
科用綿を用いて浄化された唾液抽出物を伴うものであ
る。好適な具体例は、糖が入っていない粉末飲料ミック
スをその歯科用綿にコートすることで、唾液分泌のため
の刺激物および唾液収集のための「液だめ」の両方とし
て用いる。次に、5ccの使い捨て用プラスチック製シリ
ンジの胴部の中にその飽和させた綿を置くことで、浄化
された唾液を抽出するプランジャーを再びその胴部の中
に挿入して、そのシリンジの先端の所に収集用試験管を
置く。次に、この歯科用綿を圧縮することで、その綿か
ら、浄化された唾液を押し出させる。
別の具体例において、より洗練された収集装置、例え
ば経口拡散液だめ（Wade,S,E.の米国特許第4,594,326
号；米国特許第4,798,207号（ここではそれらの全体が
参照にいれられる））などを用いることができる。上記
装置は、流体、好適には唾液内の物質濃度を時間積分
（time−integrated）様式で測定することを可能にする
ものである。この装置を、被験者の口に取り付け、受動
的な拡散により、興味の持たれている化合物、好適には
本文中で記述する如きサイトカインをそれに集める。こ
の装置は、透析膜の如き選択的透過性を示す膜で覆われ
ている小さな口が多数備わっている、小型の密封された
プラスチック製シリンダーである。これらの口は、測定
すべき物質を拡散させるための制限された通路を限定し
ており、上記物質は、それの濃度勾配に関係して、その
装置の中に集められる。測定すべき物質と結合し得る物
質、例えばサイトカインに特異的な抗体などをこの装置
の内部チャンバの中に供給することによって、勾配を維
持することができる。より最近になって、ヒト唾液内コ
ルチコステロイド類の時間積分測定を行う目的で上記装
置を利用することが示された（Wade,S.E.他、CLIN.CHE
M.37:1166−1172（1991））。これらの研究は、（ａ）
その装置によるホルモンの吸収速度は、それが用いられ
ている媒体が示す質量流量の影響を受けないこと、
（ｂ）唾液が本質的に血液で汚染されていても、その装
置の性能は影響を受けないこと、（ｃ）ホルモン濃度が
偶然的に極めて変化した時でも、この装置はそれの総和
を正確に示すことができること、そして（ｄ）ヒト被験
者由来の唾液に関する個人差を容易に示すことが可能な
ことを示している。
ば経口拡散液だめ（Wade,S,E.の米国特許第4,594,326
号；米国特許第4,798,207号（ここではそれらの全体が
参照にいれられる））などを用いることができる。上記
装置は、流体、好適には唾液内の物質濃度を時間積分
（time−integrated）様式で測定することを可能にする
ものである。この装置を、被験者の口に取り付け、受動
的な拡散により、興味の持たれている化合物、好適には
本文中で記述する如きサイトカインをそれに集める。こ
の装置は、透析膜の如き選択的透過性を示す膜で覆われ
ている小さな口が多数備わっている、小型の密封された
プラスチック製シリンダーである。これらの口は、測定
すべき物質を拡散させるための制限された通路を限定し
ており、上記物質は、それの濃度勾配に関係して、その
装置の中に集められる。測定すべき物質と結合し得る物
質、例えばサイトカインに特異的な抗体などをこの装置
の内部チャンバの中に供給することによって、勾配を維
持することができる。より最近になって、ヒト唾液内コ
ルチコステロイド類の時間積分測定を行う目的で上記装
置を利用することが示された（Wade,S.E.他、CLIN.CHE
M.37:1166−1172（1991））。これらの研究は、（ａ）
その装置によるホルモンの吸収速度は、それが用いられ
ている媒体が示す質量流量の影響を受けないこと、
（ｂ）唾液が本質的に血液で汚染されていても、その装
置の性能は影響を受けないこと、（ｃ）ホルモン濃度が
偶然的に極めて変化した時でも、この装置はそれの総和
を正確に示すことができること、そして（ｄ）ヒト被験
者由来の唾液に関する個人差を容易に示すことが可能な
ことを示している。
本発明はまた、本発明の方法で用いるための試験キッ
トを提供する。本発明のキットは、体液、好適には唾液
または鼻分泌物内のサイトカイン類を測定するに有効性
を示す。各キットには、生物学的流体、例えば唾液など
の収集、アッセイ方法および結果の解釈などに関する詳
細な指示が含まれている。このキットを、好適には、FD
A（Food and Drug Administration）が医学装置として
認可するインビトロ診断製品に適用可能な品質保証操作
の下で組み立てる。
トを提供する。本発明のキットは、体液、好適には唾液
または鼻分泌物内のサイトカイン類を測定するに有効性
を示す。各キットには、生物学的流体、例えば唾液など
の収集、アッセイ方法および結果の解釈などに関する詳
細な指示が含まれている。このキットを、好適には、FD
A（Food and Drug Administration）が医学装置として
認可するインビトロ診断製品に適用可能な品質保証操作
の下で組み立てる。
好適な具体例において、このキットには、 （ａ）上記唾液または鼻分泌物を集めるための容器手
段； （ｂ）測定すべきサイトカインに特異性を示す第一結合
相手が入っている第二容器； （ｃ）標識を付けた形態の精製サイトカインが入ってい
る第三容器；および （ｄ）上記標識を付けたサイトカイン上の上記標識のた
めの第二結合相手が入っている第四容器； が備わっている。上記キットには、好適には （ｅ）固相担体 が更に備わっている。
段； （ｂ）測定すべきサイトカインに特異性を示す第一結合
相手が入っている第二容器； （ｃ）標識を付けた形態の精製サイトカインが入ってい
る第三容器；および （ｄ）上記標識を付けたサイトカイン上の上記標識のた
めの第二結合相手が入っている第四容器； が備わっている。上記キットには、好適には （ｅ）固相担体 が更に備わっている。
好適な様式において、１つのキットの中には、80種の
未知物の分析（二重に）を行うに充分な試薬が入ってい
る。
未知物の分析（二重に）を行うに充分な試薬が入ってい
る。
好適には、このキットには、生物学的流体を集めるた
めの装置、例えば唾液用サンプリング管、上述した如き
受動的経口拡散液だめか或はそれの同等物、或は鼻分泌
物を得るためのアスピレーターなどが備わっている。任
意に、このキットには、体液の産生またはそれが流れ出
すのを刺激するための物質、例えば唾液が流れ出すのを
刺激するためのチューインガム、鼻の分泌を刺激するた
めのメタコリンなどが含まれている。
めの装置、例えば唾液用サンプリング管、上述した如き
受動的経口拡散液だめか或はそれの同等物、或は鼻分泌
物を得るためのアスピレーターなどが備わっている。任
意に、このキットには、体液の産生またはそれが流れ出
すのを刺激するための物質、例えば唾液が流れ出すのを
刺激するためのチューインガム、鼻の分泌を刺激するた
めのメタコリンなどが含まれている。
好適な具体例において、本発明のキットには、 （１）測定すべきサイトカインに特異的な捕捉用抗体； （２）標識を付けた形態の精製サイトカイン； （３）アッセイ標準として働かせるための標準ヒトサイ
トカイン；および （４）標識を付けたサイトカイン上の標識のための酵素
接合結合相手； が含まれている。
トカイン；および （４）標識を付けたサイトカイン上の標識のための酵素
接合結合相手； が含まれている。
このキットには、任意に、 （５）該酵素のための色素形成物質； （６）15.9g/のNa2CO3、29.3g/のNaHCO3および0.1
から１μg/mLのゼラチンを含んでいるコーティング緩衝
液； （７）標準希釈液； （８）基質用緩衝液； （９）洗浄用緩衝液；および （10）96個ウエルのポリスチレン製EIAプレートが２
枚； 含まれている。
から１μg/mLのゼラチンを含んでいるコーティング緩衝
液； （７）標準希釈液； （８）基質用緩衝液； （９）洗浄用緩衝液；および （10）96個ウエルのポリスチレン製EIAプレートが２
枚； 含まれている。
好適な具体例においてIL−１αを測定するための本発
明のキットには、 （１）精製したポリクローナルラビット抗ヒトIL−１α
抗体（捕捉用抗体）； （２）ビオチン接合させたヒト組換え型ILヒト組換え型
IL−１α；および （３）アルカリ性ホスファターゼに接合させたストレプ
トアビジン； が含まれている。
明のキットには、 （１）精製したポリクローナルラビット抗ヒトIL−１α
抗体（捕捉用抗体）； （２）ビオチン接合させたヒト組換え型ILヒト組換え型
IL−１α；および （３）アルカリ性ホスファターゼに接合させたストレプ
トアビジン； が含まれている。
好適な具体例において、上述した如きキットには、追
加的に、 （４）ｐ−ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウム
（基質）； （５）15.9g/のNa2CO3、29.3g/のNaHCO3および40mg
/のBSAを含んでいるコーティング緩衝液； （６）0.1％のBSAと0.1％のNaN3を補った燐酸塩緩衝食
塩水（pH7.4）を含んでいる標準希釈液； （７）1.255g/のNa2CO3、0.844g/のNaHCO3および0.
203g/のMgCl2を含んでいる基質用緩衝液； （８）0.2％のTween−20と0.1％のNaN3を補ったPBSを含
んでいる洗浄用緩衝液； （９）96個ウエルのポリスチレン製ELISAプレートが２
枚； 含まれている。
加的に、 （４）ｐ−ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウム
（基質）； （５）15.9g/のNa2CO3、29.3g/のNaHCO3および40mg
/のBSAを含んでいるコーティング緩衝液； （６）0.1％のBSAと0.1％のNaN3を補った燐酸塩緩衝食
塩水（pH7.4）を含んでいる標準希釈液； （７）1.255g/のNa2CO3、0.844g/のNaHCO3および0.
203g/のMgCl2を含んでいる基質用緩衝液； （８）0.2％のTween−20と0.1％のNaN3を補ったPBSを含
んでいる洗浄用緩衝液； （９）96個ウエルのポリスチレン製ELISAプレートが２
枚； 含まれている。
上記キットには、小びん、試験管などの容器の１個以
上を密に限定された状態でその中に入れるように区分さ
れた担体が含まれており、上記容器の各々には、イムノ
アッセイの個々の要素が含まれている。
上を密に限定された状態でその中に入れるように区分さ
れた担体が含まれており、上記容器の各々には、イムノ
アッセイの個々の要素が含まれている。
例えば、流体相の捕捉用抗体が入っているか、或は二
者択一的に、固相支持体の上に既に固定されている捕捉
用抗体が入っている容器であってもよい。さらなる容器
には、標識を付けた（例えばビオチン接合させたか或は
酵素接合させた）サイトカインか、或は溶液内の標識抗
体が含まれている。さらなる容器には、検出すべきサイ
トカインを連続希釈することを包括する標準が含まれて
いてもよい。サイトカインの標準溶液を用いて、横軸上
にサイトカイン濃度をプロットしそして縦軸上に検出シ
グナルをプロットした標準曲線を作成する。サイトカイ
ンが含まれているサンプル、例えば唾液などから得られ
る結果を、上記プロットから補間を行うことで、サイト
カイン濃度を得ることができる。
者択一的に、固相支持体の上に既に固定されている捕捉
用抗体が入っている容器であってもよい。さらなる容器
には、標識を付けた（例えばビオチン接合させたか或は
酵素接合させた）サイトカインか、或は溶液内の標識抗
体が含まれている。さらなる容器には、検出すべきサイ
トカインを連続希釈することを包括する標準が含まれて
いてもよい。サイトカインの標準溶液を用いて、横軸上
にサイトカイン濃度をプロットしそして縦軸上に検出シ
グナルをプロットした標準曲線を作成する。サイトカイ
ンが含まれているサンプル、例えば唾液などから得られ
る結果を、上記プロットから補間を行うことで、サイト
カイン濃度を得ることができる。
上述したキットでは、インターロイキン−１α、イン
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−アルファ、インター
フェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アルファを含む
群から選択されるサイトカインが好適である。最も好適
には、このサイトカインはインターロイキン−１α、イ
ンターロイキン−１βまたはインターロイキン−２であ
る。
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−アルファ、インター
フェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アルファを含む
群から選択されるサイトカインが好適である。最も好適
には、このサイトカインはインターロイキン−１α、イ
ンターロイキン−１βまたはインターロイキン−２であ
る。
上述したキットの１つの具体例において、このサイト
カインに好適な標識はビオチンであり、好適な第二結合
相手はストレプトアビジンである。好適な具体例におい
て、第一結合相手は、サイトカインに特異的な捕捉用抗
体であり、その第二結合相手は酵素接合結合相手、好適
には酵素接合ストレプトアビジンである。好適には、こ
の酵素はアルカリ性ホスファターゼである。このキット
は、追加的に、この酵素のための色素形成基質を含んで
いてもよい。
カインに好適な標識はビオチンであり、好適な第二結合
相手はストレプトアビジンである。好適な具体例におい
て、第一結合相手は、サイトカインに特異的な捕捉用抗
体であり、その第二結合相手は酵素接合結合相手、好適
には酵素接合ストレプトアビジンである。好適には、こ
の酵素はアルカリ性ホスファターゼである。このキット
は、追加的に、この酵素のための色素形成基質を含んで
いてもよい。
本発明のキットには、生物学的流体、例えば唾液など
の収集、分析方法およびその結果の解釈などに関する詳
細な指示が含まれている。キット形態の中に組み込まれ
得るアッセイの種類は多く、それには例えば競合アッセ
イおよび非競合アッセイが含まれ、そしてこれらには、
RIA、EIA、ELISA、並びに免疫測定（immunometric）も
しくはサンドイッチイムノアッセイなどが含まれる。
の収集、分析方法およびその結果の解釈などに関する詳
細な指示が含まれている。キット形態の中に組み込まれ
得るアッセイの種類は多く、それには例えば競合アッセ
イおよび非競合アッセイが含まれ、そしてこれらには、
RIA、EIA、ELISA、並びに免疫測定（immunometric）も
しくはサンドイッチイムノアッセイなどが含まれる。
本発明の方法は、静脈切開によるサンプル収集に関連
した危険およびストレスをなくさせるものである。本発
明のアッセイ方法は、正常および病気両方の、ヒトもし
くは動物被験者における研究を容易にする有効な監視手
段を提供するものである。本発明の方法は、まず第一
に、ヒトの免疫システムを研究しようとしている人、例
えば脳−免疫システムの相互作用に興味を示している研
究者にか、或はサイトカイン類か、サイトカインレベル
に影響を与える薬剤か、或は免疫システムに作用しそし
て唾液の如き体液内のサイトカイン濃度が変化するとき
影響を受け得る作用を示す薬剤などを用いて治療した患
者を追跡している医者の手に、簡潔で、侵入性を示さ
ず、信頼性が高く、再現性を示すと共に客観的分析装置
を渡すことである。
した危険およびストレスをなくさせるものである。本発
明のアッセイ方法は、正常および病気両方の、ヒトもし
くは動物被験者における研究を容易にする有効な監視手
段を提供するものである。本発明の方法は、まず第一
に、ヒトの免疫システムを研究しようとしている人、例
えば脳−免疫システムの相互作用に興味を示している研
究者にか、或はサイトカイン類か、サイトカインレベル
に影響を与える薬剤か、或は免疫システムに作用しそし
て唾液の如き体液内のサイトカイン濃度が変化するとき
影響を受け得る作用を示す薬剤などを用いて治療した患
者を追跡している医者の手に、簡潔で、侵入性を示さ
ず、信頼性が高く、再現性を示すと共に客観的分析装置
を渡すことである。
ここに本発明を一般的に記述して来たが、説明として
提供しそして特に明記されていない限り本発明を制限す
ることを意図したものでない下記の実施例を参照するこ
とにより、上記がより容易に理解されるであろう。
提供しそして特に明記されていない限り本発明を制限す
ることを意図したものでない下記の実施例を参照するこ
とにより、上記がより容易に理解されるであろう。
実施例Ｉ インターロイキン−１αおよびインターロイキン−２に
特異的なポリクローナル抗体の発生および精製 体重が約２−3kgの、病原体を有していないニュージ
ーランド白色ラビットを、その各動物から免疫前の血液
サンプルを得るに先立って、病原体のない施設の中で２
週間隔離して環境に慣らす。この前免疫採血して１週間
後、抗原溶液と金を2:1の比率で混合したアルカリ性pH
を有するコロイド状金を含んでいる1:1希釈の免疫原性
エンハンサー（Assay Research,Inc.）を、500μｇの各
ペプチドと混合する。このエンハンサーを用いること
で、そのペプチドを、他のより大型でより高い抗原性を
示す分子、例えばBSAまたはKLHなどと先に接合させるこ
となく、免疫原性を示す分子としてそれらを働かせるこ
とが可能になる。この第一免疫化では、そのペプチド−
アジュバント混合物をフロインド完全アジュバンドの中
に乳化させた後、１匹のラビットに皮下注射する。２週
間後、このペプチド／エンハンサー混合物をフロインド
不完全アジュバンドの中に乳化させた後、皮下注射す
る。この注射を行って３日後、耳の静脈を通して血液を
5mL取り出し、そしてその得られる血清の抗体タイター
を試験する（以下に示す）。その２番目の注射を行って
約２週間後、各ラビットに、ペプチド／エンハンサー混
合物のみを追加し、そして４日後採血した。後で行う、
そのペプチド／エンハンサー混合物のみが入っている注
射と採血を、月に一度行う。
特異的なポリクローナル抗体の発生および精製 体重が約２−3kgの、病原体を有していないニュージ
ーランド白色ラビットを、その各動物から免疫前の血液
サンプルを得るに先立って、病原体のない施設の中で２
週間隔離して環境に慣らす。この前免疫採血して１週間
後、抗原溶液と金を2:1の比率で混合したアルカリ性pH
を有するコロイド状金を含んでいる1:1希釈の免疫原性
エンハンサー（Assay Research,Inc.）を、500μｇの各
ペプチドと混合する。このエンハンサーを用いること
で、そのペプチドを、他のより大型でより高い抗原性を
示す分子、例えばBSAまたはKLHなどと先に接合させるこ
となく、免疫原性を示す分子としてそれらを働かせるこ
とが可能になる。この第一免疫化では、そのペプチド−
アジュバント混合物をフロインド完全アジュバンドの中
に乳化させた後、１匹のラビットに皮下注射する。２週
間後、このペプチド／エンハンサー混合物をフロインド
不完全アジュバンドの中に乳化させた後、皮下注射す
る。この注射を行って３日後、耳の静脈を通して血液を
5mL取り出し、そしてその得られる血清の抗体タイター
を試験する（以下に示す）。その２番目の注射を行って
約２週間後、各ラビットに、ペプチド／エンハンサー混
合物のみを追加し、そして４日後採血した。後で行う、
そのペプチド／エンハンサー混合物のみが入っている注
射と採血を、月に一度行う。
IL−１およびIL−２抗血清の滴定および精製 IL−１またはIL−２の２番目の注射をラビットに行っ
た後、血液サンプルを5mL取り出して、その血清の抗体
タイターを試験した。図1aは、その免疫原性エンハンサ
ーがIL−１αに特異的な抗血清を非常に高いタイターで
生じさせることを容易にしていることを示している。示
すように、混ぜ物が入っていない血清を２対数希釈（即
ち1:100希釈から1:10,000希釈）しても、その発生する
シグナルは低下しない。IL−２に特異的な抗血清に関し
ても同様なタイターが観察される。これらの抗血清タイ
ターは高いが、その混ぜ物が入っていない血清は、許容
されない背景色が発生することから、さらなるアッセイ
開発で用いることはできない。その結果として、両方の
抗血清共、以下に示す如き精製を行った。
た後、血液サンプルを5mL取り出して、その血清の抗体
タイターを試験した。図1aは、その免疫原性エンハンサ
ーがIL−１αに特異的な抗血清を非常に高いタイターで
生じさせることを容易にしていることを示している。示
すように、混ぜ物が入っていない血清を２対数希釈（即
ち1:100希釈から1:10,000希釈）しても、その発生する
シグナルは低下しない。IL−２に特異的な抗血清に関し
ても同様なタイターが観察される。これらの抗血清タイ
ターは高いが、その混ぜ物が入っていない血清は、許容
されない背景色が発生することから、さらなるアッセイ
開発で用いることはできない。その結果として、両方の
抗血清共、以下に示す如き精製を行った。
混合イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィ
ー（J.T.Baker.Inc.、Phillipsburg、NJ）を用いて、各
ポリクローナル抗血清の精製を行う。25mMのMES（２−
［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）の中に入ってい
る０から0.75MのNaCl一次勾配（NaClなしの時pH5.6、0.
75MのNaClの時pH7.0）を用いて、そのカラムから樹脂結
合抗体を溶離させる。5mLの画分を集めて蛋白質含有量
を分析する（280nmの吸収）。直接酵素イムノアッセイ
（EIA）を用いて、特異的抗体の存在を試験する。アル
カリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビット抗体を用いて
ラビット抗体を検出する。ノイズに対するシグナルの比
率が５以上である画分をプールして、PBSに対して透析
する。その得られるプールした一定分量を、それらの個
々のEIAのための抗体溶液として用いる。
ー（J.T.Baker.Inc.、Phillipsburg、NJ）を用いて、各
ポリクローナル抗血清の精製を行う。25mMのMES（２−
［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）の中に入ってい
る０から0.75MのNaCl一次勾配（NaClなしの時pH5.6、0.
75MのNaClの時pH7.0）を用いて、そのカラムから樹脂結
合抗体を溶離させる。5mLの画分を集めて蛋白質含有量
を分析する（280nmの吸収）。直接酵素イムノアッセイ
（EIA）を用いて、特異的抗体の存在を試験する。アル
カリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビット抗体を用いて
ラビット抗体を検出する。ノイズに対するシグナルの比
率が５以上である画分をプールして、PBSに対して透析
する。その得られるプールした一定分量を、それらの個
々のEIAのための抗体溶液として用いる。
IL−１α抗血清の混合イオン交換精製で観察された典
型的なクロマトグラムを、図２に示す。この樹脂は、こ
の血清を主要な２つの画分に分配し、その１つの画分に
は、アルブミンおよびトランスフェリンの如き血清不純
物が含まれており（画分１−10:黒丸）、そしてもう１
つの画分には、免疫グロブリンが非常に豊富な画分が含
まれている（画分12−30:穴の開いた丸）。試験を行っ
た後、ノイズに対するシグナル比が５もしくはそれより
良好な画分のみをプールして、PBSに対して透析を行う
（図2:穴の開いた丸）。
型的なクロマトグラムを、図２に示す。この樹脂は、こ
の血清を主要な２つの画分に分配し、その１つの画分に
は、アルブミンおよびトランスフェリンの如き血清不純
物が含まれており（画分１−10:黒丸）、そしてもう１
つの画分には、免疫グロブリンが非常に豊富な画分が含
まれている（画分12−30:穴の開いた丸）。試験を行っ
た後、ノイズに対するシグナル比が５もしくはそれより
良好な画分のみをプールして、PBSに対して透析を行う
（図2:穴の開いた丸）。
実施例II 直接および競合酵素イムノアッセイ 1. 抗血清の滴定 両方のペプチドに関して試験した血液（bleed）、そ
してその後行った全ての産生血液を、直接EIAにより相
対的抗体タイターに関して試験した。IL−１またはIL−
２のどちらかを、濃度が10μg/mLになるようにコーティ
ング緩衝液（15.9g/のNa2CO3、29.3g/のNaHCO3、pH
9.6）で希釈する。この溶液の100μＬを、96個ウエルの
ミクロタイタープレートの中の16個のウエルに分配した
後、室温で２時間培養する。この培養を行っている間、
その前免疫血液および各ペプチドのための試験血液の両
方から得られる血清サンプルを、アッセイ希釈液（NaN3
が0.1％入っている燐酸塩緩衝食塩水（PBS））で1:10
0、1:1,000、1:10,000および1:100,100に希釈する。
してその後行った全ての産生血液を、直接EIAにより相
対的抗体タイターに関して試験した。IL−１またはIL−
２のどちらかを、濃度が10μg/mLになるようにコーティ
ング緩衝液（15.9g/のNa2CO3、29.3g/のNaHCO3、pH
9.6）で希釈する。この溶液の100μＬを、96個ウエルの
ミクロタイタープレートの中の16個のウエルに分配した
後、室温で２時間培養する。この培養を行っている間、
その前免疫血液および各ペプチドのための試験血液の両
方から得られる血清サンプルを、アッセイ希釈液（NaN3
が0.1％入っている燐酸塩緩衝食塩水（PBS））で1:10
0、1:1,000、1:10,000および1:100,100に希釈する。
培養後、これらのウエルを300μＬの洗浄用緩衝液（P
BS中0.2％のTween−20溶液）で洗浄し、そして指示した
ウエルに、その希釈した血清を100μＬ加えて、１時間
培養する。この培養に続いて、これらのウエルを洗浄用
緩衝液で洗浄した後、各ウエルに100μＬのアルカリ性
ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビット抗血清を添加する。
この混合物を１時間培養した後、洗浄を行う。ELISAプ
レート読み装置を用いて15分以内に、色素形成基質であ
るｐ−ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウム（Si
gma Chemical Co.、St.Louis、MO）と色反応（405nmに
おける吸収:A405）を測定する。
BS中0.2％のTween−20溶液）で洗浄し、そして指示した
ウエルに、その希釈した血清を100μＬ加えて、１時間
培養する。この培養に続いて、これらのウエルを洗浄用
緩衝液で洗浄した後、各ウエルに100μＬのアルカリ性
ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビット抗血清を添加する。
この混合物を１時間培養した後、洗浄を行う。ELISAプ
レート読み装置を用いて15分以内に、色素形成基質であ
るｐ−ニトロフェニルホスフェートの二ナトリウム（Si
gma Chemical Co.、St.Louis、MO）と色反応（405nmに
おける吸収:A405）を測定する。
2. IL−１およびIL−２の測定 精製した、IL−１またはIL−２に対する抗血清を、コ
ーティング緩衝液で1:10,000に希釈した後、ミクロプレ
ートのウエルに100μＬ加え、そして２時間培養する。
次に、これらのウエルを洗浄用緩衝液で洗浄した後、標
準または未知サンプルを50μＬの量で加え、そして１時
間培養する。IL−１またはIL−２の６種の濃度（100、2
5、6.25、1.563、0.39および0.098ng/mL）を用いて標準
曲線を作成する。起こり得るマトリックスの影響を考慮
して、アッセイ希釈液でか、或は内因性IL−１もしくは
IL−２を前吸収させる時に用いた50％血清溶液（以下に
記述）で、その標準を希釈した。１時間培養した後、こ
れらのウエルに、接合させたIL−１またはIL−２（Assa
y Research,Inc.）を50μＬ加え、そしてこれらと、標
準またはサンプル内のIL−１もしくはIL−２とを、更に
１時間競合させる。次に、これらのウエルを洗浄した
後、アルカリ性ホスファターゼ接合抗ラビット抗体（As
say Research,Inc.）と一緒に45分間培養し、そして続
いて基質を添加する。その得られる色反応を405nmの吸
収で測定する。コンピューター補助の４つのパラメータ
ーログ−ロジット曲線ソフトウエア（Microplate Manag
er,Bio−Rad、Richmond、CA）を用いて、その標準曲線
に関するデータ、並びに未知物に関する力価見積もり値
を解析する。
ーティング緩衝液で1:10,000に希釈した後、ミクロプレ
ートのウエルに100μＬ加え、そして２時間培養する。
次に、これらのウエルを洗浄用緩衝液で洗浄した後、標
準または未知サンプルを50μＬの量で加え、そして１時
間培養する。IL−１またはIL−２の６種の濃度（100、2
5、6.25、1.563、0.39および0.098ng/mL）を用いて標準
曲線を作成する。起こり得るマトリックスの影響を考慮
して、アッセイ希釈液でか、或は内因性IL−１もしくは
IL−２を前吸収させる時に用いた50％血清溶液（以下に
記述）で、その標準を希釈した。１時間培養した後、こ
れらのウエルに、接合させたIL−１またはIL−２（Assa
y Research,Inc.）を50μＬ加え、そしてこれらと、標
準またはサンプル内のIL−１もしくはIL−２とを、更に
１時間競合させる。次に、これらのウエルを洗浄した
後、アルカリ性ホスファターゼ接合抗ラビット抗体（As
say Research,Inc.）と一緒に45分間培養し、そして続
いて基質を添加する。その得られる色反応を405nmの吸
収で測定する。コンピューター補助の４つのパラメータ
ーログ−ロジット曲線ソフトウエア（Microplate Manag
er,Bio−Rad、Richmond、CA）を用いて、その標準曲線
に関するデータ、並びに未知物に関する力価見積もり値
を解析する。
図３から６は、IL−１（図３および４）およびIL−２
（図５および６）両方に関するEIAにおける古典的な競
合速度を示している。その得られる405nmにおける吸収
（OD405）に対して、サイトカイン標準濃度の対数をプ
ロットすると、Ｓ字曲線が生じる（図３および５）。そ
の観察された吸収値をロジット関数に変換すると、直線
が生じる（図４および６）。両方のアッセイの検出限界
は98pg/mLであり、これは、１個のウエル当たり2.8X10
-16モルのIL−１から成るモル値と、１個のウエル当た
り3.6X10-16モルのIL−２から成るモル値に相当してお
り、直線範囲は0.4から25ng/mLである。更に、両方の分
析に関するED50（50％競合が生じる濃度）は約1.0から
1.5ng/mLである。
（図５および６）両方に関するEIAにおける古典的な競
合速度を示している。その得られる405nmにおける吸収
（OD405）に対して、サイトカイン標準濃度の対数をプ
ロットすると、Ｓ字曲線が生じる（図３および５）。そ
の観察された吸収値をロジット関数に変換すると、直線
が生じる（図４および６）。両方のアッセイの検出限界
は98pg/mLであり、これは、１個のウエル当たり2.8X10
-16モルのIL−１から成るモル値と、１個のウエル当た
り3.6X10-16モルのIL−２から成るモル値に相当してお
り、直線範囲は0.4から25ng/mLである。更に、両方の分
析に関するED50（50％競合が生じる濃度）は約1.0から
1.5ng/mLである。
この反応物に血清を添加すると、生じる色は有意に低
くなる。このことは、生じる結合が低く、100％血清内
で未知サンプルを測定することは無価値であることを示
している。しかしながら、この血清を連続的に希釈する
ことの影響を検査すると、血清とアッセイ希釈液との50
％混合物では、検出閾値およびED50の両方に関して、ア
ッセイ希釈液単独のとき得られる標準曲線に匹敵する結
果が得られる。その標準曲線に悪影響を与えることなく
最大で50％の血清または血漿を用いることができる。
くなる。このことは、生じる結合が低く、100％血清内
で未知サンプルを測定することは無価値であることを示
している。しかしながら、この血清を連続的に希釈する
ことの影響を検査すると、血清とアッセイ希釈液との50
％混合物では、検出閾値およびED50の両方に関して、ア
ッセイ希釈液単独のとき得られる標準曲線に匹敵する結
果が得られる。その標準曲線に悪影響を与えることなく
最大で50％の血清または血漿を用いることができる。
実施例III アッセイの確認 1. 血清の影響 PBS内の標準物質に対する血清内標準物質の平行試験
を行い、そして血清内の添加したサイトカイン類を定量
的に回収することによって、IL−１とIL−２両方のEIA
を確認する。免疫反応性を示すIL−１およびIL−２が入
っている血清サンプルをアッセイ希釈液で連続的に希釈
することによって血清平行実験を実施し、これらを、IL
−１およびIL−２のEIA両方における未知物として用い
た。これらのEIAを開発する時点で、標準曲線と、連続
的に希釈した血清サンプル両方に関する吸収値を、平行
性に関して解析する。
を行い、そして血清内の添加したサイトカイン類を定量
的に回収することによって、IL−１とIL−２両方のEIA
を確認する。免疫反応性を示すIL−１およびIL−２が入
っている血清サンプルをアッセイ希釈液で連続的に希釈
することによって血清平行実験を実施し、これらを、IL
−１およびIL−２のEIA両方における未知物として用い
た。これらのEIAを開発する時点で、標準曲線と、連続
的に希釈した血清サンプル両方に関する吸収値を、平行
性に関して解析する。
IL−１およびIL−２のEIAが示す性能に対する血清の
影響を試験する必要がある、と言うのは、このアッセイ
の主要な目的の１つは、循環内にIL−１およびIL−２が
内因的に存在しているか否かを測定することであるから
である。下記の如き２つの独立した方法を用いてこれを
達成する。試験を行った１番目の研究は、公知量のサイ
トカイン類を予め添加した血清（「サイトカインでスパ
イクされている血清（cytokine−spiked serum）」）か
らサイトカイン類を定量的に回収する試験である。この
アッセイでは、標準希釈液またはアッセイ希釈液で1:1
に希釈したヒト血清に関する標準曲線を生じさせた。
影響を試験する必要がある、と言うのは、このアッセイ
の主要な目的の１つは、循環内にIL−１およびIL−２が
内因的に存在しているか否かを測定することであるから
である。下記の如き２つの独立した方法を用いてこれを
達成する。試験を行った１番目の研究は、公知量のサイ
トカイン類を予め添加した血清（「サイトカインでスパ
イクされている血清（cytokine−spiked serum）」）か
らサイトカイン類を定量的に回収する試験である。この
アッセイでは、標準希釈液またはアッセイ希釈液で1:1
に希釈したヒト血清に関する標準曲線を生じさせた。
平行試験により、アッセイ希釈液または50％ヒト血清
に関して生じさせた標準曲線は平行であることが示され
ている（図４および６）。従って、血清が入っているサ
ンプルは、マトリックスの影響を表しているが、そこに
含まれている非特異的因子はIL−１またはIL−２がそれ
らの個々の抗体に結合するのを阻害していない。更に、
両方のアッセイ（アッセイ希釈液または予め吸収させた
血清に関して行った）に関するスロープおよびED50値は
非常に類似しており、このことは、免疫反応性を示すIL
−１もしくはIL−２を取り出した元の血清を、内因性IL
−１およびIL−２レベルを検出するための担体マトリッ
クスとして用いることができることを示している。
に関して生じさせた標準曲線は平行であることが示され
ている（図４および６）。従って、血清が入っているサ
ンプルは、マトリックスの影響を表しているが、そこに
含まれている非特異的因子はIL−１またはIL−２がそれ
らの個々の抗体に結合するのを阻害していない。更に、
両方のアッセイ（アッセイ希釈液または予め吸収させた
血清に関して行った）に関するスロープおよびED50値は
非常に類似しており、このことは、免疫反応性を示すIL
−１もしくはIL−２を取り出した元の血清を、内因性IL
−１およびIL−２レベルを検出するための担体マトリッ
クスとして用いることができることを示している。
2. 吸収の分析 ２番目のアプローチは、個々の抗体によるサイトカイ
ンの吸収、そしてその吸収された材料を高性能液クロ
（HPLC）で分析することを伴うものである。この試験で
は、抗体をコーティング緩衝液で1:500に希釈した後、E
IAプレートに、どちらかの抗体を100μＬ加える。24時
間後、これらのプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そし
てIL−１またはIL−２が入っている100μＬの血清を適
当なウエルに添加して、一晩培養する。培養後、これら
のプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そして2MのNaClを
100μＬ添加することによって、ウエルに結合した材料
をそのウエルから溶離させた後、そのプレートを−80℃
で急速冷凍する。その溶離して来た材料を、100mMのNaH
PO4緩衝液の中に100μg/mL入っているBSAを用いて予め
平衡にしたゲル濾過HPLCサイジングカラムで分離する。
1.5mLの画分を１分毎に集めて、急速冷凍する。次に、
各画分の免疫反応性を、HPLC分別した標準が示す免疫反
応性と比較する。
ンの吸収、そしてその吸収された材料を高性能液クロ
（HPLC）で分析することを伴うものである。この試験で
は、抗体をコーティング緩衝液で1:500に希釈した後、E
IAプレートに、どちらかの抗体を100μＬ加える。24時
間後、これらのプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そし
てIL−１またはIL−２が入っている100μＬの血清を適
当なウエルに添加して、一晩培養する。培養後、これら
のプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そして2MのNaClを
100μＬ添加することによって、ウエルに結合した材料
をそのウエルから溶離させた後、そのプレートを−80℃
で急速冷凍する。その溶離して来た材料を、100mMのNaH
PO4緩衝液の中に100μg/mL入っているBSAを用いて予め
平衡にしたゲル濾過HPLCサイジングカラムで分離する。
1.5mLの画分を１分毎に集めて、急速冷凍する。次に、
各画分の免疫反応性を、HPLC分別した標準が示す免疫反
応性と比較する。
アッセイ希釈液で希釈したサイトカインの線形HPLC勾
配分離で１分間集めた画分を、それらの個々のEIAで試
験する。次に、その得られる免疫反応性を、HPLCで分別
し、抗体で捕捉しそしてサイトカインでスパイクされて
いる血清が示す免疫反応性と比較する（図７）。これら
のEIAで用いたIL−１またはIL−２抗体を用いて、その
サイトカインでスパイクされている血清からIL−１また
はIL−２を捕捉する。そのプレートの上に捕捉された材
料は、その標準と同じクロマトグラム位置に移ること
を、上記結果は示している。280nmにおける吸収を基に
して他の蛋白質も検出されるが、根拠のあるIL−１また
はIL−２標準と一緒に溶離させた画分の中では、抗体吸
収血清が示す免疫反応性が最も高いことを、図７は示し
ている。
配分離で１分間集めた画分を、それらの個々のEIAで試
験する。次に、その得られる免疫反応性を、HPLCで分別
し、抗体で捕捉しそしてサイトカインでスパイクされて
いる血清が示す免疫反応性と比較する（図７）。これら
のEIAで用いたIL−１またはIL−２抗体を用いて、その
サイトカインでスパイクされている血清からIL−１また
はIL−２を捕捉する。そのプレートの上に捕捉された材
料は、その標準と同じクロマトグラム位置に移ること
を、上記結果は示している。280nmにおける吸収を基に
して他の蛋白質も検出されるが、根拠のあるIL−１また
はIL−２標準と一緒に溶離させた画分の中では、抗体吸
収血清が示す免疫反応性が最も高いことを、図７は示し
ている。
3. ウエスタン分析 ウエスタンブロット分析を用いてまた、IL−１抗体捕
捉サンプルを試験した。SDS−PAGEゲルのクーマシーブ
ルー染色は数多くの追加的蛋白質が存在していることを
示しているが、免疫反応性を示す材料の単一帯が17kDa
のWHO標準と一緒に泳動することを、図８は示してい
る。
捉サンプルを試験した。SDS−PAGEゲルのクーマシーブ
ルー染色は数多くの追加的蛋白質が存在していることを
示しているが、免疫反応性を示す材料の単一帯が17kDa
のWHO標準と一緒に泳動することを、図８は示してい
る。
4. IL−２バイオアッセイを用いた交差確認 血清で希釈した組換え型IL−２標準を用いて、このIL
−２のEIAをIL−２バイオアッセイに対して交差確認す
る。このバイオアッセイは、その標準または他の参考標
準内の種々のIL−２濃度によって引き起こされる、培養
ウエル内の乳酸量の関数として、IL−２依存細胞系であ
るCTLL−２の増殖応答を測定することを含んでいる。こ
の応答を、そのIL−２のEIA標準曲線から計算した時の
その標準が示す力価見積もり値と比較する。最後に、IL
−１またはIL−２抗体を用いた免疫吸収を行った後、IL
−１とIL−２の免疫反応性を含んでいる血清が示すIL−
１またはIL−２レベルが小さくなっているか否かを測定
する交差吸収試験を実施する。この実験に先立って、こ
のサンプルはIL−１を2.5ng/mLそしてIL−２を20ng/mL
含有していることが示されている。このサンプルを２つ
の一定分量に分割して、標準的アッセイ条件下、IL−１
またはIL−２抗体と一緒にインキュベートする。その
後、これらのウエルからサンプルを取り出して、後のア
ッセイで、IL−１およびIL−２レベルの分析を行う。
−２のEIAをIL−２バイオアッセイに対して交差確認す
る。このバイオアッセイは、その標準または他の参考標
準内の種々のIL−２濃度によって引き起こされる、培養
ウエル内の乳酸量の関数として、IL−２依存細胞系であ
るCTLL−２の増殖応答を測定することを含んでいる。こ
の応答を、そのIL−２のEIA標準曲線から計算した時の
その標準が示す力価見積もり値と比較する。最後に、IL
−１またはIL−２抗体を用いた免疫吸収を行った後、IL
−１とIL−２の免疫反応性を含んでいる血清が示すIL−
１またはIL−２レベルが小さくなっているか否かを測定
する交差吸収試験を実施する。この実験に先立って、こ
のサンプルはIL−１を2.5ng/mLそしてIL−２を20ng/mL
含有していることが示されている。このサンプルを２つ
の一定分量に分割して、標準的アッセイ条件下、IL−１
またはIL−２抗体と一緒にインキュベートする。その
後、これらのウエルからサンプルを取り出して、後のア
ッセイで、IL−１およびIL−２レベルの分析を行う。
バイオアッセイで常規通り４および15U/mLとして測定
された内部標準は、このEIAではそれぞれ3.1および17.5
U/mL含んでいると計算される。他のサイトカイン類また
は血清因子を用いて、各EIAを交差反応性に関して試験
する。
された内部標準は、このEIAではそれぞれ3.1および17.5
U/mL含んでいると計算される。他のサイトカイン類また
は血清因子を用いて、各EIAを交差反応性に関して試験
する。
5. 交差反応性の分析 各アッセイにおいて、他のサイトカイン類および主要
な血清因子を用いて、該試薬が示す交差反応性も試験す
る。この試験では、各EIAにおいて、最大標準濃度（100
ng/mL）で各サイトカインを試験する一方、これらの血
清因子に関しては、1mg/mL以下の濃度で試験する。以下
に示す方程式で計算した如き各サイトカインの交差反応
性％として、これらの結果を示す。
な血清因子を用いて、該試薬が示す交差反応性も試験す
る。この試験では、各EIAにおいて、最大標準濃度（100
ng/mL）で各サイトカインを試験する一方、これらの血
清因子に関しては、1mg/mL以下の濃度で試験する。以下
に示す方程式で計算した如き各サイトカインの交差反応
性％として、これらの結果を示す。
このIL−１およびIL−２両方のEIAは、非常に高い度
合の特異性を示している。どちらのアッセイ共、試験し
た他のサイトカイン類のいずれも有意な度合では認識せ
ず、その交差反応性範囲は０から0.5％である（表
１）。更に、試験した血清因子は、その標準濃度を100,
000倍越える濃度でも、そのアッセイを邪魔しない。こ
の交差吸収試験により、IL−１およびIL−２抗体はそれ
らの個々のサイトカインを血清内で特異的に認識するこ
とが示された。例えば、IL−１のレベルは、この血清サ
ンプルをIL−２抗体で処理したとしても変化しない。
合の特異性を示している。どちらのアッセイ共、試験し
た他のサイトカイン類のいずれも有意な度合では認識せ
ず、その交差反応性範囲は０から0.5％である（表
１）。更に、試験した血清因子は、その標準濃度を100,
000倍越える濃度でも、そのアッセイを邪魔しない。こ
の交差吸収試験により、IL−１およびIL−２抗体はそれ
らの個々のサイトカインを血清内で特異的に認識するこ
とが示された。例えば、IL−１のレベルは、この血清サ
ンプルをIL−２抗体で処理したとしても変化しない。
抗IL−２抗体を用いてこのサンプルの吸収を行った
後、IL−１レベルは、３から2.5ng/mLにまで低下する。
それとは対照的に、このサンプルを抗IL−１抗体で吸収
させると、そのIL−１濃度は1.5ng/mLまで降下する。同
様に、抗IL−２抗体を用いた吸収では、その測定したIL
−２レベルは18ng/mLから2ng/mLにまで低下する一方、
抗IL−１抗体を用いた吸収では本質的に影響を受けない
（16ng/mLのIL−２濃度）。
後、IL−１レベルは、３から2.5ng/mLにまで低下する。
それとは対照的に、このサンプルを抗IL−１抗体で吸収
させると、そのIL−１濃度は1.5ng/mLまで降下する。同
様に、抗IL−２抗体を用いた吸収では、その測定したIL
−２レベルは18ng/mLから2ng/mLにまで低下する一方、
抗IL−１抗体を用いた吸収では本質的に影響を受けない
（16ng/mLのIL−２濃度）。
実施例IV ヒトにおけるIL−１およびIL−２の24時間プロファイル
の測定 Neuroendocrinology Branch、National Institutes o
f Mental Healthが行っている進行中の24時間神経内分
泌プロファイルの一部として、Normal Volunteer Progr
am、National Institutes of Healthを通して、正常な
女性志願者を３人募る。内在へパリンロックを通して血
液サンプルを15分毎に24時間取り出す。サンプルを集
め、氷の上に置いた後、６時間毎にバッチ遠心分離す
る。その得られる血漿を収穫し、分析のための解凍を行
うまで−70℃で保存する。各アッセイでサンプルを二重
分析し、そしてIL−１αとIL−２の両方に関する分析を
同時に行う。Cluster Analysisを用いてピーク周波数お
よび期間を測定する（Veldhuis,J.D.他、AM.J.PHYSIOL.
250:E48693（1986））。
の測定 Neuroendocrinology Branch、National Institutes o
f Mental Healthが行っている進行中の24時間神経内分
泌プロファイルの一部として、Normal Volunteer Progr
am、National Institutes of Healthを通して、正常な
女性志願者を３人募る。内在へパリンロックを通して血
液サンプルを15分毎に24時間取り出す。サンプルを集
め、氷の上に置いた後、６時間毎にバッチ遠心分離す
る。その得られる血漿を収穫し、分析のための解凍を行
うまで−70℃で保存する。各アッセイでサンプルを二重
分析し、そしてIL−１αとIL−２の両方に関する分析を
同時に行う。Cluster Analysisを用いてピーク周波数お
よび期間を測定する（Veldhuis,J.D.他、AM.J.PHYSIOL.
250:E48693（1986））。
これらの３人の正常な志願者から得たデータは、IL−
１およびIL−２レベルはその日全体を通して安定でな
く、その日全体を通して多数のサイトカインスパイク
（spikes）が生じることを示している（図９−11）。こ
れらのデータは、IL−２レベルの変化によって一時的に
IL−１レベルの変化が影響を受けるが、各時点における
IL−２レベルは一定してそれよりも高いことを示してい
る。このような結論は更に、一時的ピークおよびそれら
の期間を同定するコンピューター補助パルス周波数分析
によって支持されている。この分析は、本質的に全ての
IL−１ピークおよびそれらの期間は、一時的に一致して
IL−２が上昇することに合致していることを示してい
る。以前に示したように、このような一時的な一致はア
ッセイ交差反応性とは関係していない、何故ならば、ど
ちらのアッセイも相互のサイトカインを検出しないから
である。
１およびIL−２レベルはその日全体を通して安定でな
く、その日全体を通して多数のサイトカインスパイク
（spikes）が生じることを示している（図９−11）。こ
れらのデータは、IL−２レベルの変化によって一時的に
IL−１レベルの変化が影響を受けるが、各時点における
IL−２レベルは一定してそれよりも高いことを示してい
る。このような結論は更に、一時的ピークおよびそれら
の期間を同定するコンピューター補助パルス周波数分析
によって支持されている。この分析は、本質的に全ての
IL−１ピークおよびそれらの期間は、一時的に一致して
IL−２が上昇することに合致していることを示してい
る。以前に示したように、このような一時的な一致はア
ッセイ交差反応性とは関係していない、何故ならば、ど
ちらのアッセイも相互のサイトカインを検出しないから
である。
基線となる24時間の規則的な分泌プロファイルが存在
しているか否かを測定する目的で、各個人に関する15分
毎のデータから平均時間レベルを計算する（図８、下の
パネル）。試験した被験者の数が限られていることか
ら、一定した分泌プロファイルが存在しているか否かを
決定するのは困難である。
しているか否かを測定する目的で、各個人に関する15分
毎のデータから平均時間レベルを計算する（図８、下の
パネル）。試験した被験者の数が限られていることか
ら、一定した分泌プロファイルが存在しているか否かを
決定するのは困難である。
従って、本発明に従うEIAを用いてヒト血清中で測定
されるサイトカインレベルは、IL−１に関して0.5−1.5
ng/mLの範囲でありそしてIL−２に関しては１から8ng/m
Lの範囲である。ここに報告するサイトカインレベルは
それらの個々のレセプタが示す報告された解離定数（Ki
lian,P.L.他、J.IMMUNOL.136:4509−4514（1986）;Dowe
r,S.K.他、J.EXP.MED.162:501−515（1985））よりも低
い位の大きさであることを示すことは興味の持たれるこ
とである。レセプタの親和力と循環ホルモン濃度との間
のこのような関係は、充分に記述されている他の内分泌
システムと一致している。
されるサイトカインレベルは、IL−１に関して0.5−1.5
ng/mLの範囲でありそしてIL−２に関しては１から8ng/m
Lの範囲である。ここに報告するサイトカインレベルは
それらの個々のレセプタが示す報告された解離定数（Ki
lian,P.L.他、J.IMMUNOL.136:4509−4514（1986）;Dowe
r,S.K.他、J.EXP.MED.162:501−515（1985））よりも低
い位の大きさであることを示すことは興味の持たれるこ
とである。レセプタの親和力と循環ホルモン濃度との間
のこのような関係は、充分に記述されている他の内分泌
システムと一致している。
ここに報告する結果は、IL−２レベルは明らかにIL−
１シグナルを反映しており、それの増幅であることを示
している。IL−１は、IL−２の産生および分泌を刺激す
ることから（上記Smith,K.A.）、これらの２つのパター
ンが一時的に一致していることとIL−２レベルがIL−１
レベルよりも高いことが確認されたことは、充分に記述
されている免疫システム内IL−1/IL−２カスケードと一
致している。
１シグナルを反映しており、それの増幅であることを示
している。IL−１は、IL−２の産生および分泌を刺激す
ることから（上記Smith,K.A.）、これらの２つのパター
ンが一時的に一致していることとIL−２レベルがIL−１
レベルよりも高いことが確認されたことは、充分に記述
されている免疫システム内IL−1/IL−２カスケードと一
致している。
実施例Ｖ 唾液内サイトカイン類の測定 Kahn,J.P.他、BIOL.PSYCHIAT.23:335−349（1988）が
記述した方法を用いて唾液を採取する。被験者は、彼ら
の唾液を飲み込むことなく、無糖ガム片の半分を３回噛
む。15mLの円錐形試験管を口の所に置きそしてその唾液
をその試験管の中に流し込むことによって、その中に唾
液を集める。その試験管の中に唾を吐くようにするので
はなくむしろ彼らの唇の所に集まってきた唾液をその試
験管の中に流し込むようにすることを、被験者に指示す
る。平均的な収集量は約２から3mLである。二者択一的
に、レモネードの風味を有するCrystal Light（商標）
の如き酸っぱい無糖飲料ミックスを歯科用綿にコートす
ることによって、唾液を集めることができる。このコー
トした綿をそのガムとほおの間に２から３分間入れてお
く。この綿を取り出して、5ccシリンジの胴部の中に入
れる。このシリンジのプランジャーを再び入れ、そして
試験管をそのシリンジの出口の所に置く。このプランジ
ャーでその綿を圧縮し、そしてその綿の中に存在してい
る唾液をその試験管の中に集める。この集めた溶液は浄
化された唾液であり、これは分析の準備ができている。
記述した方法を用いて唾液を採取する。被験者は、彼ら
の唾液を飲み込むことなく、無糖ガム片の半分を３回噛
む。15mLの円錐形試験管を口の所に置きそしてその唾液
をその試験管の中に流し込むことによって、その中に唾
液を集める。その試験管の中に唾を吐くようにするので
はなくむしろ彼らの唇の所に集まってきた唾液をその試
験管の中に流し込むようにすることを、被験者に指示す
る。平均的な収集量は約２から3mLである。二者択一的
に、レモネードの風味を有するCrystal Light（商標）
の如き酸っぱい無糖飲料ミックスを歯科用綿にコートす
ることによって、唾液を集めることができる。このコー
トした綿をそのガムとほおの間に２から３分間入れてお
く。この綿を取り出して、5ccシリンジの胴部の中に入
れる。このシリンジのプランジャーを再び入れ、そして
試験管をそのシリンジの出口の所に置く。このプランジ
ャーでその綿を圧縮し、そしてその綿の中に存在してい
る唾液をその試験管の中に集める。この集めた溶液は浄
化された唾液であり、これは分析の準備ができている。
唾液のIL−１αおよびIL−２レベルをEIAで測定した
結果をそれぞれ図12と図13に示す。この試験では、２人
の被験者から得た唾液を標準希釈液で連続的に希釈す
る。この希釈液から得られるODを、標準希釈曲線と比較
した。これらのデータは、唾液を連続的に希釈すると、
その標準を連続的に希釈した時の曲線に平行した曲線が
生じることを示している。
結果をそれぞれ図12と図13に示す。この試験では、２人
の被験者から得た唾液を標準希釈液で連続的に希釈す
る。この希釈液から得られるODを、標準希釈曲線と比較
した。これらのデータは、唾液を連続的に希釈すると、
その標準を連続的に希釈した時の曲線に平行した曲線が
生じることを示している。
実施例VI 鼻分泌物内サイトカインの測定 唾液の場合と同様、抗IL−２抗体を用いて展開した鼻
分泌物のウエスタンブロットでは、約60−30kDaの分子
量に相当する帯が観察される。この抗IL−２抗体で出発
材料を前処理すると、この帯を吸収してしまった。しか
しながら、その吸収段階に先立って、このサンプルにIL
−２抗原を過剰充填すると、この帯はもはや吸収されな
くなる。これらの結果は、より高い分子量形態のIL−２
免疫反応性材料が鼻分泌物の中に存在していることを示
している。
分泌物のウエスタンブロットでは、約60−30kDaの分子
量に相当する帯が観察される。この抗IL−２抗体で出発
材料を前処理すると、この帯を吸収してしまった。しか
しながら、その吸収段階に先立って、このサンプルにIL
−２抗原を過剰充填すると、この帯はもはや吸収されな
くなる。これらの結果は、より高い分子量形態のIL−２
免疫反応性材料が鼻分泌物の中に存在していることを示
している。
実施例VII 肉体的および心理的ストレスが唾液のサイトカイン類を
調整する 科学中間試験期間中の14から15才の男子に関する、唾
液のIL−１およびIL−２レベルを測定する。心理的スト
レスを与えるものである試験の測定に関して、背景レベ
ルの測定を行う目的で、試験５日後の唾液サンプルを入
手する。試験当日、試験が始まる前10分内（「前」）お
よび試験後５分内（「後」）の唾液サンプルを入手す
る。階段を５回上がり降りする肉体的ストレスの影響も
また、上記試験後少なくとも７日間評価する。運動に先
立って、背景レベルのためのサンプルを入手する。階段
を３回上がり降りした後、２回目の唾液サンプルを入手
する。最後に、この運動期間が終了した時点で別のサン
プルを入手する。これらのデータを、精神的および肉体
的試みを行って２週間後に採取したサンプル（「ベース
ライン」）と比較する。これらの結果を図14−20に示
し、これは、肉体的な運動には有意なIL−１およびIL−
２濃度上昇が伴うことを示している。心理的ストレス
は、より大きな不安影響を与えると見られ、ここでは、
その学校の試験前、そしてそれの予期状態で、サイトカ
インレベルが上昇する。
調整する 科学中間試験期間中の14から15才の男子に関する、唾
液のIL−１およびIL−２レベルを測定する。心理的スト
レスを与えるものである試験の測定に関して、背景レベ
ルの測定を行う目的で、試験５日後の唾液サンプルを入
手する。試験当日、試験が始まる前10分内（「前」）お
よび試験後５分内（「後」）の唾液サンプルを入手す
る。階段を５回上がり降りする肉体的ストレスの影響も
また、上記試験後少なくとも７日間評価する。運動に先
立って、背景レベルのためのサンプルを入手する。階段
を３回上がり降りした後、２回目の唾液サンプルを入手
する。最後に、この運動期間が終了した時点で別のサン
プルを入手する。これらのデータを、精神的および肉体
的試みを行って２週間後に採取したサンプル（「ベース
ライン」）と比較する。これらの結果を図14−20に示
し、これは、肉体的な運動には有意なIL−１およびIL−
２濃度上昇が伴うことを示している。心理的ストレス
は、より大きな不安影響を与えると見られ、ここでは、
その学校の試験前、そしてそれの予期状態で、サイトカ
インレベルが上昇する。
実施例VIII 臨床的症状を予測するための唾液サイトカインレベルの
使用 数多くの自己免疫病（Theofilopoulos,A.著、D.P.Sti
tes他編集「基礎および臨床免疫学」（BASIC AND CLINI
CAL IMMUNOLOGY）、Lange Medical Publications、Los
Altos、CA（1988））が生行動因子（Weiner,H.著「心理
生物学およびヒトの病気」（PSYCHOBIOLOGY AND HUMAN
DISEASE）、Elsevier、New York（1977）；上記Ader
他）に関係していると考えられている。この実施例で
は、自己免疫病に苦しむ患者を選択する。これらの患者
は、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトー
デス、自己免疫甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、Graves病、
炎症性腸病、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎およ
び特定種の糖尿病などが含まれる。これらは患者に、カ
テコールアミンレベルの上昇と心拍数上昇が伴うことが
知られている通常の行動ストレス（例えば口頭の数学試
験）または冷昇圧試験（cold pressor test）を含むス
トレスを受けさせる。唾液のサイトカインレベルを上と
同様に測定する。このストレスを予期している状態およ
びそれを受けている途中の両方で、唾液のIL−１とIL−
２が上昇する。このようなサイトカイン類の変化を病気
の症状と関係させることが可能であり、これは、これら
の症状の開始に関する有効な指示となり得る。
使用 数多くの自己免疫病（Theofilopoulos,A.著、D.P.Sti
tes他編集「基礎および臨床免疫学」（BASIC AND CLINI
CAL IMMUNOLOGY）、Lange Medical Publications、Los
Altos、CA（1988））が生行動因子（Weiner,H.著「心理
生物学およびヒトの病気」（PSYCHOBIOLOGY AND HUMAN
DISEASE）、Elsevier、New York（1977）；上記Ader
他）に関係していると考えられている。この実施例で
は、自己免疫病に苦しむ患者を選択する。これらの患者
は、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトー
デス、自己免疫甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、Graves病、
炎症性腸病、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎およ
び特定種の糖尿病などが含まれる。これらは患者に、カ
テコールアミンレベルの上昇と心拍数上昇が伴うことが
知られている通常の行動ストレス（例えば口頭の数学試
験）または冷昇圧試験（cold pressor test）を含むス
トレスを受けさせる。唾液のサイトカインレベルを上と
同様に測定する。このストレスを予期している状態およ
びそれを受けている途中の両方で、唾液のIL−１とIL−
２が上昇する。このようなサイトカイン類の変化を病気
の症状と関係させることが可能であり、これは、これら
の症状の開始に関する有効な指示となり得る。
実施例IX 唾液由来サイトカインと標準サイトカインとの比較 登録されている約100ng/mLの唾液サンプルを凍結乾燥
した後、元の体積の1/10に再構成する（その結果、理論
濃度は1ug/mLであった）。この溶液の100uLを、100mMの
NaHPO4緩衝液1mL当たり100ugのBSAを用いて予め平衡に
したゲル濾過サイジングカラム（Zorbax GF−250、DuPo
nt、Wilmington、DE）が用いられているイソクラティッ
ク（isocratic）高性能液クロ（HPLC）に注入した。１
分毎に500uLの画分を溶離させて集めた。
した後、元の体積の1/10に再構成する（その結果、理論
濃度は1ug/mLであった）。この溶液の100uLを、100mMの
NaHPO4緩衝液1mL当たり100ugのBSAを用いて予め平衡に
したゲル濾過サイジングカラム（Zorbax GF−250、DuPo
nt、Wilmington、DE）が用いられているイソクラティッ
ク（isocratic）高性能液クロ（HPLC）に注入した。１
分毎に500uLの画分を溶離させて集めた。
この実験の後、そのカラムにIL−２標準（10ug/mL）
を注入した。上に記述したのと同様に、この溶液を100u
L注入して画分を集めた。全てのサンプルを、EIAで分析
するまで−20℃で冷凍した。
を注入した。上に記述したのと同様に、この溶液を100u
L注入して画分を集めた。全てのサンプルを、EIAで分析
するまで−20℃で冷凍した。
標準および未知物に関して50uLのサンプルを用い、AR
Iの指示に従ってIL−２のEIAを行った。各プレートには
それ自身の標準曲線を含ませ、そして全てのサンプルを
同じ日に分析した。これらの得られるODに関して、それ
らの個々の標準曲線から補間を行うことで、力価見積も
り値が得られた。
Iの指示に従ってIL−２のEIAを行った。各プレートには
それ自身の標準曲線を含ませ、そして全てのサンプルを
同じ日に分析した。これらの得られるODに関して、それ
らの個々の標準曲線から補間を行うことで、力価見積も
り値が得られた。
これらのデータを図21に示す。IL−２免疫反応濃度を
ｙ軸上に示し、そして画分番号をそのｘ軸上に示す。こ
の図から分かるように、唾液サンプル内と標準内のIL−
２の量は異なっている。このような差は、標準溶液に比
較して唾液内のIL−２の濃度が1/10であることによるも
のである。
ｙ軸上に示し、そして画分番号をそのｘ軸上に示す。こ
の図から分かるように、唾液サンプル内と標準内のIL−
２の量は異なっている。このような差は、標準溶液に比
較して唾液内のIL−２の濃度が1/10であることによるも
のである。
これらのクロマトグラムは、同じ位置（画分番号15か
ら22）に明確な免疫反応性（連続的に上昇させた３つの
サンプルが限定している）を示している。また、２つの
クロマトグラム全体に渡って免疫反応性が一致している
ことを特記する。唾液内で測定したIL−２は標準IL−２
と類似していることは明らかである。
ら22）に明確な免疫反応性（連続的に上昇させた３つの
サンプルが限定している）を示している。また、２つの
クロマトグラム全体に渡って免疫反応性が一致している
ことを特記する。唾液内で測定したIL−２は標準IL−２
と類似していることは明らかである。
ここに本発明を充分に記述して来たが、本発明の精神
および範囲から逸脱しない限りそして必要以上の実験を
行うことなく、幅広い範囲の相当するパラメーター、濃
度および条件内で上記が行われ得ることは、本分野の技
術者は理解するであろう。本発明の特定具体例に関連さ
せて本発明を記述して来たが、さらなる修飾を行い得る
ことは理解されるであろう。添付請求の範囲で以下に示
す如く、本出願は、一般に本発明の原理に従う本発明の
如何なる変法、使用または応用も網羅することを意図し
ており、そして本発明が関係している技術内で公知もし
くは通常実施の範囲内に入ると共に上に挙げた必須的特
徴に適用され得る如き、本開示からの上記変更を包含し
ている。
および範囲から逸脱しない限りそして必要以上の実験を
行うことなく、幅広い範囲の相当するパラメーター、濃
度および条件内で上記が行われ得ることは、本分野の技
術者は理解するであろう。本発明の特定具体例に関連さ
せて本発明を記述して来たが、さらなる修飾を行い得る
ことは理解されるであろう。添付請求の範囲で以下に示
す如く、本出願は、一般に本発明の原理に従う本発明の
如何なる変法、使用または応用も網羅することを意図し
ており、そして本発明が関係している技術内で公知もし
くは通常実施の範囲内に入ると共に上に挙げた必須的特
徴に適用され得る如き、本開示からの上記変更を包含し
ている。
本発明の主な特徴または態様は次のとおりである。
1. １部位イムノアッセイを用いて、ヒトまたは動物由
来の生物学的流体内のサイトカイン濃度を測定すること
を含む、ヒトまたは動物内のサイトカインレベルを測定
する方法。
来の生物学的流体内のサイトカイン濃度を測定すること
を含む、ヒトまたは動物内のサイトカインレベルを測定
する方法。
2. 該サイトカインがインターロイキン−１α、インタ
ーロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロ
イキン−６、インターフェロン−α、インターフェロン
−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択さ
れる前記１の方法。
ーロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロ
イキン−６、インターフェロン−α、インターフェロン
−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択さ
れる前記１の方法。
3. 該サイトカインがインターロイキン−１αである前
記２の方法。
記２の方法。
4. 該サイトカインがインターロキイン−１βである前
記２の方法。
記２の方法。
5. 該サイトカインがインターロキイン−２である前記
２の方法。
２の方法。
6. 該サイトカインがインターロイキン−６である前記
２の方法。
２の方法。
7. 該生物学的流体が唾液および鼻分泌物から成る群か
ら選択される前記１の方法。
ら選択される前記１の方法。
8. 該イムノアッセイが該サイトカインに特異的なポリ
クローナル抗体を利用している前記１の方法。
クローナル抗体を利用している前記１の方法。
9. 該イムノアッセイが競合イムノアッセイである前記
１の方法。
１の方法。
10. １部位イムノアッセイを用いて、ヒトまたは動物
由来の生物学的流体内の、そのヒトまたは動物に投与さ
れたサイトカイン濃度を測定することを含む、ヒトまた
は動物におけるサイトカイン治療を監視する方法。
由来の生物学的流体内の、そのヒトまたは動物に投与さ
れたサイトカイン濃度を測定することを含む、ヒトまた
は動物におけるサイトカイン治療を監視する方法。
11. 該サイトカインがインターロイキン−１α、イン
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択
される前記10の方法。
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択
される前記10の方法。
12. 該サイトカインがインターロイキン−１αである
前記11の方法。
前記11の方法。
13. 該サイトカインがインターロイキン−１βである
前記11の方法。
前記11の方法。
14. 該サイトカインがインターロイキン−２である前
記11の方法。
記11の方法。
15. 該サイトカインがインターロイキン−６である前
記11の方法。
記11の方法。
16. 該生物学的流体が唾液および鼻分泌物から成る群
から選択される前記10の方法。
から選択される前記10の方法。
17. 該イムノアッセイが該サイトカインに特異的なポ
リクローナル抗体を利用している前記10の方法。
リクローナル抗体を利用している前記10の方法。
18. 該イムノアッセイが競合イムノアッセイである前
記10の方法。
記10の方法。
19. ヒトまたは動物の唾液または鼻分泌内のサイトカ
イン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物におけ
るサイトカインレベルを非侵入測定する方法。
イン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物におけ
るサイトカインレベルを非侵入測定する方法。
20. 該サイトカインがインターロイキン−１α、イン
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択
される前記19の方法。
ターロイキン−１β、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択
される前記19の方法。
21. 該サイトカインがインターロキイン−１αである
前記20の方法。
前記20の方法。
22. 該サイトカインがインターロイキン−１βである
前記20の方法。
前記20の方法。
23. 該サイトカインがインターロイキン−２である前
記20の方法。
記20の方法。
24. 該サイトカインがインターロイキン−６である前
記20の方法。
記20の方法。
25. 該サイトカインをイムノアッセイで測定する前記1
9の方法。
9の方法。
26. 該サイトカインを１部位イムノアッセイで測定す
る前記25の方法。
る前記25の方法。
27. 該イムノアッセイが競合イムノアッセイである前
記26の方法。
記26の方法。
28. 該１部位イムノアッセイがポリクローナル抗体を
用いている前記26の方法。
用いている前記26の方法。
29. a. 生物学的流体を集めるための第一容器； b. 測定すべきサイトカインに特異的な第一結合
相手が入っている第二容器； c. 標識を付けたサイトカインが入っている第三
容器； d. 上記標識を付けたサイトカイン上の上記標識
のための第二結合相手が入っている第四容器； が備わっている、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内
のサイトカインレベルを測定するためのキット。
相手が入っている第二容器； c. 標識を付けたサイトカインが入っている第三
容器； d. 上記標識を付けたサイトカイン上の上記標識
のための第二結合相手が入っている第四容器； が備わっている、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内
のサイトカインレベルを測定するためのキット。
30. 固相担体が更に備わっている前記29のキット。
31. 該標識を付けたサイトカインがビオチンで標識さ
れておりそして該結合相手がアビジンである前記29のキ
ット。
れておりそして該結合相手がアビジンである前記29のキ
ット。
32. 該アビジンがストレプトアビジンである前記31の
キット。
キット。
33. 該第一結合相手が該サイトカインに特異的な捕捉
用抗体である前記29のキット。
用抗体である前記29のキット。
34. 該第二結合相手がその標識を付けたサイトカイン
上の該標識のための酵素接合結合相手である前記29記載
のキット。
上の該標識のための酵素接合結合相手である前記29記載
のキット。
35. 該酵素のための色素形成基質を更に含んでいる前
記34記載のキット。
記34記載のキット。
36. 該酵素がアルカリ性ホスファターゼ、グルコース
オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、マレートデ
ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５
−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、リボヌクレアー
ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、ガルコアミラーゼおよびアセ
チルコリンエステラーゼから成る群から選択される前記
34のキット。
オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、マレートデ
ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５
−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、リボヌクレアー
ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、ガルコアミラーゼおよびアセ
チルコリンエステラーゼから成る群から選択される前記
34のキット。
37. 該酵素がアルカリ性ホスファターゼである前記36
のキット。
のキット。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−252265（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−40858（ＪＰ，Ａ) ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥ ＲＥＳＥＡＲ ＣＨ ｖｏｌ．９ ｎｏ．４ 1990 ｐ．595（３．41) ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭ ＵＮＩＴＹ ｖｏｌ．38 ｎｏ．３ 1982 ｐ．1190−1195 ＡＣＴＡ ＯＴＯＬＡＲＹＮＧＯＬ ｖｏｌ．103 1987 ｐ．363−368 ＥＵＲＯ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ｖ ｏｌ．18 1988 ｐ．951−956 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/543
Claims (3)
- 【請求項１】遊離もしくは結合しているかに拘わりな
く、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内の測定すべき
サイトカインに結合できる抗体を用いる１部位競合イム
ノアツセイによって、該生物学的流体内のインターロイ
キン−１以外のサイトカイン濃度を測定することを特徴
とするヒトまたは動物内のインターロイキン−１以外の
サイトカイン量の決定方法。 - 【請求項２】該サイトカインがインターロイキン−２、
インターロイキン−６、インターフェロン−α、インタ
ーフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群
から選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】該生物学的流体が血液、涙、唾液および鼻
分泌物から成る群から選択される請求項１記載の方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022038469A1 (en) * | 2020-08-17 | 2022-02-24 | Rjs Mediagnostix | Fluid testing device |
Families Citing this family (18)
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|---|---|---|---|---|
| US5965379A (en) * | 1991-07-19 | 1999-10-12 | Cytimmune Sciences Inc. | Method for measuring endogenous cytokines |
| AU735272B2 (en) * | 1996-10-04 | 2001-07-05 | Intronn Llc | Sample collection devices and methods using markers and the use of such markers as controls in sample validation, laboratory evaluation and/or accreditation |
| US6673621B1 (en) * | 1996-10-04 | 2004-01-06 | Intronn Llc | Sample collection devices and methods using markers and the use of such markers as controls in sample validation, laboratory evaluation and/or accreditation |
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| DK1340086T3 (da) * | 2000-10-17 | 2008-12-01 | Besst Test Aps | Assay til direkte detektion af en RS-virusrelateret biologisk celle i en legemsvæskepröve |
| JP2004511808A (ja) * | 2000-10-17 | 2004-04-15 | ベッスト−テスト アンパーツゼルスカブ | 体液サンプル中の生物学的細胞の直接的検出のためのアッセイ |
| EP1340077B1 (en) * | 2000-10-17 | 2006-01-25 | Besst-Test ApS | Assay for directly detecting an inflammatory indicator in a body fluid sample |
| US20020137097A1 (en) * | 2000-12-13 | 2002-09-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Standard diluent for multiplex assays |
| WO2004112691A2 (en) * | 2003-05-19 | 2004-12-29 | Intermune, Inc. | Interferon gamma therapies for idiopathic pulmonary fibrosis |
| AU2004274909B8 (en) * | 2003-09-15 | 2010-06-10 | Oklahoma Medical Research Foundation | Method of using cytokine assays to diagnose, treat, and evaluate inflammatory and autoimmune diseases |
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| US20070150310A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-06-28 | Benjamin Wiegand | A method of motivating an individual to improve lifestyle factors |
| US20070150202A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-06-28 | Benjamin Wiegand | A method for assessing the efficacy of a program to improve or maitain the pro-inflammatory immune health |
| US20070150203A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-06-28 | Benjamin Wiegand | A kit for assessing the pro-inflammatory immune health of an individual |
| US20070150205A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-06-28 | Benjamin Wiegand | Methods for assessing the pro-inflammatory immune health of an individual |
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Family Cites Families (19)
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|---|---|---|---|---|
| US3654090A (en) * | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
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| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US4016043A (en) * | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
| USRE32696E (en) * | 1975-09-04 | 1988-06-14 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for determination of antigens and antibodies |
| US4020151A (en) * | 1976-02-17 | 1977-04-26 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for quantitation of antigens or antibodies on a solid surface |
| JPS604422B2 (ja) * | 1976-10-07 | 1985-02-04 | 持田製薬株式会社 | 抗原の定量方法 |
| US4271140A (en) * | 1978-01-23 | 1981-06-02 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| AU8594382A (en) * | 1981-08-05 | 1983-02-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoassay using biotin-avidin-enzyme complex |
| EP0105714B1 (en) * | 1982-09-29 | 1988-07-27 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| US4496654A (en) * | 1983-04-08 | 1985-01-29 | Quidel | Detection of HCG with solid phase support having avidin coating |
| US4798207A (en) * | 1983-05-09 | 1989-01-17 | Wade Stephen E | Device for enabling time-integrated measurement of substances in biological fluids |
| US4594326A (en) * | 1983-05-09 | 1986-06-10 | Wade Stephen E | Time-integrated measurement for determining substances in biological fluids |
| JPS62162963A (ja) * | 1986-01-10 | 1987-07-18 | Sadao Shiosaka | 金属コロイド粒子を担体とする低分子物質に対する特異抗体の作成法 |
| ZA872784B (en) * | 1986-05-01 | 1987-10-16 | Immunex Corporation | Detection of inflammation and novel antibodies therefor |
| US4863726A (en) * | 1987-05-29 | 1989-09-05 | Cetus Corporation | Combination therapy using immunotoxins with interleukin-2 |
-
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-
1994
- 1994-10-28 US US08/331,333 patent/US5587294A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＡＣＴＡ ＯＴＯＬＡＲＹＮＧＯＬ ｖｏｌ．１０３ １９８７ ｐ．３６３−３６８ |
| ＥＵＲＯ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ｖｏｌ．１８ １９８８ ｐ．９５１−９５６ |
| ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ ｖｏｌ．３８ ｎｏ．３ １９８２ ｐ．１１９０−１１９５ |
| ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ｖｏｌ．９ ｎｏ．４ １９９０ ｐ．５９５（３．４１） |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022038469A1 (en) * | 2020-08-17 | 2022-02-24 | Rjs Mediagnostix | Fluid testing device |
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