KR20040103970A - 변형된 펙터 ⅷ - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체내에서 사용되는 경우 임의의 미변형된 인간 펙터 VIII(FVIII) 보다 실질적으로 비면역원성이거나 또는 면역원성이 더 낮은 FVIII 단백질을 초래하는 인간 펙터 VIII에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 감소된 면역원성을 갖는 변형된 FVIII 변이체의 생성이 가능한 수단에 의해 미변형된 단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프에 관한 것이다.
Description
치료용 단백질에 대한 원치 않는 면역 반응으로 인해서 치료용 단백질의 효능이 제한되는 많은 경우가 있다. 몇 몇의 마우스 모노클로날 항체는 많은 인간의 질병 환경에서 치료법으로서 희망을 보여주었지만, 어떤 경우에는 심각한 정도의 인간 항뮤린 항체 (HAMA) 반응이 유도되어 실패하였다 [Schroff, R. W. 등 (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D.L. 등(1985)J.Immunol.135: 1530-1535]. 모노클로날 항체의 경우, HAMA 반응을 감소시키고자 많은 기술이 개발되어 왔다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이러한 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구축물(construct) 중에 마우스 유전 정보는 감소시키는 반면에 최종 구축물 중에 인간 유전 정보는 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화된" 항체는, 몇 몇의 경우에 있어서, 환자에게서 여전히 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J.D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P.R. 등(1999)Transplantation 68: 1417-1420].
항체가 면역반응을 상승시킬 수 있는 치료제로서 투여되는 폴리펩티드 분자의 유일한 부류는 아니다. 인간내에서 나타나는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 인간 기원의 단백질조차도 인간에게서 여전히 면역반응을 유도할 수 있다. 그 중에서도 주목할만한 예로는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 [Wadhwa, M. 등 (1999)Clin. Cancer Res. 5:1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등 (1996)Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988)New Engl. J. Med. 318: 1409-1413]의 치료 용도가 포함된다. 이와 같이 인간 단백질이 면역원성을 갖는 상황에서는, 면역 용인성(immunological tolerance)의 단절이 없었다면 이러한 개체에서 이러한 단백질들에 작용하였을, 추정되는 면역 용인성의 단절이 있다.
예를 들면 단백질의 체질적 결핍이 있는 유전병에서, 예컨대 혈우병 A, 크리스마스병, 고셔병 (Gauchers disease) 및 많은 다른 예와 같은 병의 경우에서처럼 인간 단백질이 대체요법으로서 투여되는 경우는 상황이 다르다. 상기 경우에는, 치료용 대체 단백질이 처음부터 외래(foreign)분자로서 면역적으로 기능을 할 수 있고, 치료제에 대한 면역반응이 상승될 수 있는 개인의 경우는 치료의 효능이 상당히 상쇄될 가능성이 많다.
단백질 치료제가 숙주의 면역시스템에 의해 외래분자로서 인식이 되는지에 관계없이, 또는 그 분자에 대해 존재하는 용인성(tolerance)이 극복되었다면, 단백질에 대한 면역반응의 기전은 동일하다. 면역 반응 유도의 열쇠는, MHC 클래스 II 분자상의 제시를 통하여 T-세포의 활성을 자극할 수 있는, 단백질내의 펩티드, 소위 "T-세포 에피토프"의 존재이다. 상기 T-세포 에피토프는 통상적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로, "T-세포 에피토프" 는, MHC 분자에 결합될 경우, T-세포 수용체 (TCR)에 의해 인식될 수 있으며, 적어도 원칙적으로는, TCR로 하여금 T-세포 반응을 촉진하는데 관여하게 하여 상기 T-세포의 활성을 유발할 수 있는 에피토프를 의미한다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포 선별 및 활성화에 있어 중심적인 역할을 하는 상당히 다형성(polymorphic)인 단백질의 군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR)은 이러한 단백질군의 우세한 이소타입(isotype)이지만, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능들을 수행한다. 인간 집단에서, 각 개인은 두 개 내지 네 개의 DR 대립유전자, 두 개의 DQ와 두 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 대략 70개의 상이한 DR 이소타입의 알로타입, DQ의 경우 30개의 상이한 알로타입 및 DP의 경우는 47개의 상이한 알로타입이 있다. 많은 DR 분자의 구조가 해석되었으며 이러한 구조는 펩티드의 소수성 잔기(포켓 잔기)를 체결하는(engage) 많은 소수성 포켓을 갖는 개방 말단형(open-ended)의 펩티드 결합 그루브인 것으로 보인다 [Brown 등Nature(1993)364: 33; Stern 등 (1994)Nature 368: 215]. MHC DR 분자는 하나의 알파 사슬 및 하나의 베타 사슬로 이루어져 있으며 이들의 C-말단으로 세포막을 관통하고 있다. 비록 결합 그루브는 최대 11개 아미노산을 수용할 수 있지만, 각각의 이종 이량체는 길이가 9 내지 20개 아미노산 사이에서 변하는 펩티드에 결합하는 리간드 결합 도메인(domain)을 가진다. DQ 분자는 최근에 상동 구조를 갖는 것으로 밝혀졌으며 DP 패밀리 단백질도 매우 유사한 것으로 예측된다. 클래스 II 분자의 상이한 알로타입을 규명하는 다형성은 펩티드 결합 그루브내의 펩티드에 대해 상이한 결합 표면의 광범위한 다양성(diversity)에 기여하고, 집단 수준에서 외래 단백질을 인식하며 병원성 유기체에 대한 면역반응을 상승시키는 능력과 관련해서 최대의 융통성을 보장한다.
치료 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 이 과정에서 외부 단백질은 삼켜지고 DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 제시되기 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 전문적인 항원 제시 세포(APC), 그 중에서도 예컨대 대식세포 및 수지상세포(dendritic cell)에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 일정한 다른 공동수용체의 교차 결합과 함께, T-세포 표면상에 있는, 코그네이트(cognate) T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 체결(engagement)은 T-세포내의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 사이토카인들의 방출로 이어지고 나아가 B-세포와 같은 다른 림프구의 항체 생산을 활성화시키거나 또는 전면적인 세포성 면역반응으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다.
T-세포 에피토프의 동정은 에피토프 제거를 위한 첫 단계이지만, 당업계에서에피토프 동정과 제거가 하나의 절차로 통합된 수개의 명백한 경우가 있다. 요컨대 WO98/52976 및 WO00/34317은 인간 MHC 클래스 II DR 알로타입의 서브세트에 결합할 잠재성이 있는 폴리펩티드 서열을 동정하는 컴퓨터적 스레딩(threading) 접근법을 교시한다. 상기 교시에서는, 예측된 T-세포 에피토프가 관심 있는 단백질 내에서의 신중한 아미노산 치환으로 제거된다. 그러나 에피토프 동정을 위한 상기 절차 및 컴퓨터에 기본을 둔 방법[예를 들면, Godkin, A.J. 등(1998)J. Immunol.161: 850-858; Sturniolo, T. 등 (1999)Nat. Biotechnol.17: 555-561]들도, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 것으로 예측된 펩티드가 처리 경로 또는 다른 현상으로 인해, 모든 경우에, 특히, 생체내에서 T-세포 에피토프로 기능하지 않을 수도 있다. 추가하여, 비록 이들 시스템간에 인식에 있어 중첩되는 부분이 있다고 해도 T-세포 에피토프 예측에 대한 컴퓨터적 접근법은 일반적으로 DP 또는 DQ 한정을 갖는 에피토프 예측은 할 수 없었다.
컴퓨터적 기술이외에, 합성 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에의 결합능력을 측정하는 생체내 방법이 있다. 예시적인 방법은 MHC 클래스 II 결합 면의 출처(source)로서 정의된 MHC 알로타입의 B-세포주를 사용하며 MHC 클래스 II 리간드 규명에 적용될 수 있다 [Marshall K.W. 등(1994)J. Immunol.152:4946-4956; O'Sullivan 등 (1990)J. Immunol.145: 1799-1808; Robadey C. 등 (1997)J. Immunol.159: 3238-3246]. 그러나 상기의 기술도 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 적합하지 않을 뿐만 아니라, 결합하는 펩티드가 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 능력을 확인할 수 있는 것도아니다.
최근 합성 펩티드와 조합하여 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 이용한 기술이 사용되어지고 있다 [Kern, F. 등 (1998)Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. 등 (2001)TRENDS in Immunol.22:583-588]. 상기의 시약과 방법들은, 인간 또는 실험동물 대상체 유래의 말초 혈액시료에서, 특정한 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T-세포 클론의 존재를 규명하는데 사용된다. 이러한 절차는 또한 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 쉽게 적용되지 않는다.
T-세포 활성화의 생물학적인 분석법은 시험 펩티드 또는 전 단백질 서열이 면역반응을 유발할 수 있는가의 능력에 관한 판단을 제공하는데 대한 실질적인 선택권을 제공한다. 이러한 종류의 접근의 예로는 박테리아 단백질인 스타필로키나제에 대한 T-세포 증식 분석법을 이용한 Petra 등의 연구, 뒤이어 T-세포주를 자극하기 위해 합성펩티드를 이용한 에피토프 맵핑이 [Petra, A.M. 등 (2002)J. Immunol.168: 155-161] 있다. 유사하게, 파상풍 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T-세포 증식 분석법으로 상기 독소의 면역우세한 에피토프 도메인을 정의하게 되었다[Reece J.C. 등 (1993)J. Immunol.151: 6175-6184]. WO99/53038에서는, 분리된 인간 면역세포의 서브 세트를 이용하고, 시험관내에서 이들 세포의 분화를 촉진하며 관심 있는 합성 펩티드의 존재하에서 세포의 배양 및 배양된 T-세포에서 임의의 유발된 증식의 측정으로, 시험 단백질의 T-세포 에피토프를 결정할 수 있는 접근법에 대해 공개한다. 동일한 기술이 또한 Stickler 등 [Stickler, M.M. 등(2000)J. Immunotherapy 23:654-660]에 의해서도 설명되는데, 양 경우 모두에 있어서 상기 방법은 박테리아의 서브틸리신 내의 T-세포 에피토프들의 검출에 적용된다. 이러한 기술은, 원하는 면역세포의 서브세트(수지상세포들, CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포들)를 얻기 위해서 세포 분리 기술의 조심스러운 적용 및 다수의 시토카인 보충제를 넣은 세포배양이 요구되어 제공된 다수의 시료를 이용한 신속한 처리를 요구하는 스크리닝에는 도움이 되지 않는다.
상기 기술한 바대로 그리고 그것의 결과로서, 원칙적으로는 치료제로서 가치가 있으나 본래는 면역원성이 있는 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T-세포 에피토프들을 동정하고 제거하거나 또는 적어도 감소시키는 것이 바람직하다. 이러한 치료제로서 가치 있는 분자들 중의 하나가 FVIII 이다. 본 발명은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 제거된 변형된 형태의 인간 FVIII를 제공한다.
FVIII는 내재하는 혈액응고 경로의 응고펙터이다. FVIII는 펙터 IXa에 대한 코펙터이며, 칼슘 이온 및 인지질의 존재중에서, 펙터 X를 활성화된 형태인 Xa로 전환한다. 최소한 FVIII의 X-연관된 유전자의 결함이 혈우병A를 유발하는 것 이상으로 FVIII의 분자유전학은 잘 연구되었다. FVIII 유전자는 큰 당단백질인 FVIII 이소타입 A 및 작은 이소타입 B를 생성하는 두개의 교대로(alternatively) 스플라이싱되는 전사체를 코딩한다. 본래 상태에서 이소타입 A 전구체에서 유래한 다수의 분해 또는 처리된 형태를 확인할 수 있으며 특정한 기능적 활성은 특정한 단편에 기인하는 것이다. FVIII 분자는 6개의 구조적 도메인으로 나뉘어진다 ; 삼중의 A 도메인(A1, A2, A3), 탄수화물이 풍부하고 없어도 되는 중앙 도메인(B-도메인),및 중복된 C 도메인(C1, C2). 트롬빈 및 펙터 Xa에 대한 FVIII 단백질 분해성 절단 부위는 잔기 372, 740 및 1669후에 나타난다. 활성화된 단백질 C와 함께 Xa에 의한 절단은 잔기 336후에 나타난다.
FVIII 단백질은 기능적으로는 혈우병 A가 걸린 환자 유래의 혈장의 응고 결함을 고칠 수 있는 펙터로 정의된다. 혈우병 A의 치료를 위해, FVIII는 인간 또는 돼지 혈장으로 부터, 최근에 들어서는 재조합 DNA 기술로 정제된 형태로 생산되어 왔다. 인간 FVIII 유전자는 1984년에 2개 이상의 독립적 연구 그룹에 의해 분리되었으며 포유류 세포에서 발현되었다 [Toole, J.J. 등(1984),Nature 312: 342-347; Gitschier, J. 등(1984),Nature 312:326-330; Wood, W.I., 등(1984),Nature 312:330-337; Vehar, G.A.,등(1984),Nature 312: 337-342; WO87/04187; WO88/08035; WO88/03558; US.,4,757,006]. 아미노산 서열은 cDNA로 부터 유추되었으며 치료적 양의 FVIII의 재조합 생산을 위한 방법이 개발되었으며, 예를 들면 US,4,965,199는 포유류 숙주세포에서 FVIII를 생산하는 방법 및 인간 FVIII의 정제를 개시한다. CHO(Chinese Hamster Ovary)세포 및 BHKC(Baby Hamster Kidney Cells) 세포에서 인간 FVIII의 발현이 보고되었으며 최근에 들어서는 FVIII가 B 도메인 일부 또는 전부를 결실하기 위해 변형되었으며[U.S. 특허 제4,868,112호] 이러한 분자는 임상시험에서 효능을 나타내었다[Lusher, J.M. 등(2003)Haemophilia 9:38-49]. 이러한 분자는 실제로 사용에 허가되었으며 Refacto가 Genetic Institute 및 Pharmacia Upjohn 간의 공동작업으로 CHO 세포에서 만들어진다.
치료적 양의 FVIII의 사용가능성에도 불구하고, 향상된 특성을 갖는 FVIII유사체에 대한 지속적인 요구가 있다. 바람직한 향상은 상기 단백질의 발현 및 정제에 대한 대안적 절차 및 방식을 포함하지만, 그러나 또한 특히 상기 단백질의 생물학적 특성에 있어서 향상을 포함한다. 특히 치료제로서 투여될 경우에 생체내 특성의 향상에 대한 필요가 있다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역반응을 유발하는 잠재성이 감소 또는 결여된 FVIII을 제공하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 단백질은 인간 대상체에서 증가된 순환시간을 나타낼 것으로 기대되며 만성 및 재발성 질환 환경 예컨대 혈우병과 같은 질환 환경 구체적으로는 혈우병 환자가 외인성 재조합 펙터 VIII에 민감하거나 그렇지 않다면 이들의 치료의 효율성을 제한할 항-펙터 VIII 항체를 만들 경우에 특히 이롭다.
다른 연구자들도 FVIII 분자를 제공하였으며 구체적으로는 재조합의 변형된 FVIII[US 4,757,006; US 5,633,150; US 5,668,108]를 제공하였으나, 이러한 교시 중 어느 것도 단백질의 면역원성 성질에 대한 T 세포 에피토프의 중요성은 인식하지 못하였을 뿐만 아니라, 본 발명의 절차에 따른 구체적이고 조절된 방법으로 이러한 특성에 직접 영향을 미치는 것은 생각되지도 않았다.
FVIII의 변형에 대한 당업계의 여전한 예는 US 5,948,407을 포함하며 여기에는 치료 단백질 항원에 대하여 억제 T 세포 레퍼토리를 유발하는 목적으로 단백질의 점막성(예를 들면 경구) 투여를 가능하게 하는 제형을 생산하는 절차를 개시한다.
다른 연구자들도 혈우병 대상체에서 생체내 반감기를 향상시킬 목적으로 FVIII의 변형을 시도하였으며 예를 들면 US 6,037,452는 폴리(알킬렌 옥시드)펙터VIII 콘쥬게이트를 기술한다.
혈우병의 치료에 있어서 특별히 어려운 점은 특정 환자에서 투여된 FVIII 제제(preparation)에 대한 억제성 항체의 유도이다. 혈우병환자에서 FVIII에 대한 면역성 반응을 극복하기 위해 수개의 전략이 개발되어 왔다. 용인성 유도 치료는 이러한 접근법의 하나이지만 현재는 매우 많은 투여량(비용이 많이듬)의 FVIII 제제를 혈우병 환자가 매우 어린 시기에 투여하는 것을 필요로한다. 상기 접근법은 단지 일부분의 경우에서만 용인성을 달성하는데 성공적이다 [Colowick, A.B.등(2000)Blood 96:1698-1702]. 종전에 치료된 적이 없는 대상체에서의 두개의 상이한 재조합 산물의 임상 시험은 약 20% 정도의 경우에서 억제제의 발생을 보고하였다[Lusher, J.M. 등(1993)N.Engl.J.Med 328:453-459; Bray, G.L. 등(1994)Blood 83:2428-2435]. FVIII 억제제는 면역글로불린 항체로 이는 혈장에서의 FVIII 활성을 중화시킨다. FVIII 억제제는 FVIII 농축제 또는 재조합 FVIII로 치료된 중증 혈우병 A환자의 대략 25% 및 경증 및 중간 정도의 질환을 갖는 환자의 15%에서 알로항체로서 발생한다.
억제제를 갖는 환자의 경우에는 펙터 IX 복합체 또는 "프로트롬빈 복합체"로의 치료가 또한 사용된다. 일반적으로 이들은 예를 들면 펙터 II, VII, IX 및 X를 포함하는 다수의 상이한 인자들의 혼합된 제제이다. EP0044343-B1은 활성화된 성분(FVIIa)를 특징으로 하는 이러한 프로트롬빈 복합체를 제공한다. 유사하게, US 6,358,534는 낮은 비율의 FVIII 단백질 및 상대적으로 높은 비율의 다른 응고 단백질 인자 및 담체 단백질을 포함하는 면역 용인성 프로트롬빈 복합체를 기술한다.
US 5,543,145는 예를 들면 FVIII와 혼합된 F(ab')2의 형태에 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하는 FVIII 억제제 생산의 억제용 조성물을 제공한다. US 4,769,336은 결합하여 이에 의해 FVIII의 항체 억제제를 차단하는 FVIII 단편을 제공한다.
다른 전략은 인간 FVIII 대신에 돼지 펙터 VIII의 사용을 포함하지만 이러한 치료는 돼지 FVIII 자체가 면역원성이어서 임시방편이다.
이용가능한 다른 선택안은 면역 억제약물로의 치료 및/또는 체외 치료에 의해 순환으로부터 억제제의 제거를 포함하며 이해는 되지만 이러한 접근은 분명히 당장 해결해야 하는 문제에 대한 극단적이고도 위험한 해결책이다.
유전공학기술이 치료용도의 FVIII 분자의 변형 및 실제 생산에 대한 상당한 범위를 제공하여 왔다. 약학 조성물 및 혈우병 A의 치료는 US 4,965,199; US 5,618,788 및 US 5,668,108 및 이와 동등한 외국 특허의 교시에 의해 제공되며 당업계에서 이용할 수 있는 이러한 주제에 대한 많은 연구의 예시로서 간주되어야만 한다.
재조합 접근법을 사용하여 수행된 FVIII에 대한 변형의 추가의 예시적 유형은 US 5,859,204; US 6,376,463; US 6,485,563 및 US 6,180,371에 제공되며 이들은 총체적으로 부위-특이적 치환으로 억제형 항체에 대한 반응성의 감소가 유도된 이들을 코딩하는 유전자 및 FVIII 단백질을 제공한다. 이러한 특정의 교시에서 상기 치환은 FVIII A 도메인의 아미노산 484-509에 한정되어있다. 이러한 변형은 특정입체 형태(conformation)의 에피토프가 환자의 혈청에 있는 특정의 교차-반응성 항체에 의해 더이상 인식될 수 없는 식으로 FVIII 분자의 표면 토폴로지를 변화시키지만 B-세포의 항체 생산의 유도에 요구되는 근간이 되는 T-세포 에피토프는 다루지 않는다.
다른 것은 재조합 DNA 수단을 사용하여 부위-특이적 아미노산 치환[WO87/07144] 또는 관련된 분자간의 도메인교환을 사용하여 변형된 FVIII 분자를 제공한다. 후자의 접근법이 예는 WO90/05530에 있으며 여기에서 FVIII B-도메인 대신에 인간 펙터 V의 B-도메인을 포함하는 FVIII 분자를 제공한다.
다른 접근법은 여전히 인간 및 돼지(또는 다른 종) 유도된 서열 도메인을 포함하도록 조작된 재조합 FVIII 분자를 포함하는 키메라성 FVIII 제조(preparation)를 제공한다. 이러한 하이브리드 분자는 US 5,744,446; US 5,663,060; US 5,583,209; US 5,364,771; US 5,888,974 등에 기술된다.
US 5,171,844는 향상된 활성 및/또는 감소된 면역원성을 가질 수 있는 유전적으로 조작된 FVIII 분자를 제공한다. 후자의 특성은 결실에 의한 분자의 부분의 결손과 관련된다. US 4,868,112 및 동등한 외국 특허에 기술된 초기의 연구는 B-도메인이 결손된 FVIII의 기능적 결실 돌연변이체를 제공한다.
FVIII 단백질에 대한 다른 유전공학적 변형은 상기 단백질에 대한 생산 과정에 있어서의 향상과 관련된 것이었으며 구체적인 예는 US 6,271,025에 의해 제공된다. 이 예는 기술분야에서 공지되고 이용할 수 있는 추가의 방대한 양의 유사한 연구의 예시로서 제공된다.
본 발명은 특히 인간에게, 구체적으로는 치료용으로 투여하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드로서 변형으로 인해서 인간 대상체에게 투여시 폴리펩티드가 유발하는 면역 반응이 감소된 경향을 갖는다. 본 발명은 구체적으로, 생체내(in vivo)에서 사용될 경우 임의의 상응하는 미(未)변형된 단백질 보다 실질적으로 비(非)면역원성이거나 또는 더 낮은 면역원성의 펙터 VIII 단백질을 유도하는 인간 펙터 VIII(FVIII)의 변형에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 상기 미변형된 단백질에서 유래된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한것이며 이러한 방식으로 감소된 면역원성을 갖는 변형된 FVIII 변이체의 생성이 가능하다.
본 발명은 이제 예시될 것이지만, 하기의 예들로 제한되는 것은 아니다. 앞서 언급한 내용 및 다음의 실시예는 하기의 도면을 참조한다:
도 1은 잠재적 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 인간 펙터 VIII의 펩티드 서열의 리스트를 제공한다. 펩티드는 13mer이고 아미노산은 단일 문자코드를 사용하여 나타낸다.
도 2는 풀링된 펩티드 스크리닝에 대한 절차를 도시한다. 본 연구에서 펩티드는 15mer이었고 각각의 연속되는 펩티드와 12 잔기씩 중첩된다.
도 3은 FVIII 유도된 합성 펩티드로의 치료에 반응한 시험관내 T-세포 증식 분석의 결과를 도시하는 히스토그램을 제공한다. 이 예에서 혈우병 제공자에서 분리된 FVIII T-세포주가 FVIII 서열에 걸친 중첩되는 펩티드 풀을 스크리닝 하는데 사용되었다. 화살표는 T 세포 증식을 유도하고 이어서 해석된 풀을 나타낸다.
도 4는 FVIII 유도된 합성 펩티드로의 치료에 반응하는 시험관내 T-세포 증식 분석의 결과를 도시하는 히스토그램을 제공한다. 이 예에서 혈우병 제공자에서분리된 FVIII에 특이적 T-세포주가 T-세포 증식을 유도하는 두개의 펩티드 풀을 해석하는데 사용되었다. T-세포 에피토프를 포함하는 펩티드는 화살표로 나타낸다.
도 5는 FVIII 유도된 합성 펩티드로의 치료에 반응한 시험관내 T-세포 증식 분석의 결과를 도시하는 히스토그램을 제공한다. 이 예에서 두 제공자 유래의 세포가 FVIII 서열에 걸친 펩티드의 스크리닝에 사용되었다. 제공자 #1(A) 및 제공자 #2(B) 모두는 동일한 HLA-DR 알로타입 (DRB1*03, DRB1*04, DR3 및 DR4*01)을 가졌다. 화살표는 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 나타낸다.
도 6은 펩티드 8(P8)의 돌연변이체에 대한 단백질 발현 수준 및 활성 데이터를 보여주는 그래프를 제공한다: 양성 대조군은 wt 펙터 VIII이다. M1013K는 M1013K 치환을 포함하는 FVIII 분자에 대한 발현 및 활성 데이터를 나타낸다. 나머지 컬럼은 M1013K 치환과 상기 제시된 아미노산에 대한 I1011에서의 부가적 변화를 조합한 FVIII 분자이다.
도 7은 펩티드 7(P7)의 돌연변이체에 대한 단백질 발현 수준 및 활성 데이터를 보여주는 그래프를 제공한다: 양성 대조군은 wt 펙터 VIII이며, 음성 대조군은 트렌스펙션에 DNA가 없는 것이다. 나머지 시료는 제시된 대로 아미노산 변화를 갖는 V823 돌연변이체이다.
도 8은 wt 서열 펩티드가 >2.0의 자극지수를 나타내는 조건하에서 <2.0 의 자극지수를 갖는 돌연변이 펩티드를 보여주는 예시적 T-세포 분석 데이터를 제공한다. 펩티드 서열 및 PBMC 제공자 알로타입 데이터는 표에 있다.
도 9는 펩티드 MHC 클래스 II 결합의 소프트웨어 시뮬레이션을 사용하여 얻은 결과를 보여준다. 결과는 18개의 상이한 HLA-DR 알로타입에 대해 나타내며, 각각의 수직 컬럼은 단일의 알로타입에 대한 결합을 나타낸다. A 패널은 펩티드 7 부근의 wt FVIII 서열에 대해 검출된 결합 프로파일을 보여준다. 펩티드7 서열이 부각되어있다. B 패널은 V823A 치환을 포함하는 변형된 펩티드 7 서열에 대해 검출된 결합 프로파일을 보여주며 다수의 알로타입에 대해 고친화성 리간드의 손실을 보여준다. 각각의 패널에서 예측된 MHC 결합은 각각의 13mer MHC 클래스 II 리간드의 제1 잔기를 표시하여 도시된다. 결합의 강도가 나타낸대로 각각의 알로타입에 대한 각각의 리간드에 대해 계산된 결합 값에 기본을 둔 H, M 또는 L로 나타낸다. 물리적 결합 연구는 종전에 제시되었으며 <500,000의 스코어는 무시할 만한 결합 상호작용을 구성한다.
도 10은 아미노산 서열 및 야생형(WT) B-도메인 결실된 인간 FVIII 서열에 대한 번호매김을 보여준다. 아미노산은 단일 문자 코드를 사용하여 나타낸다.
본 발명의 요약 및 기술
본 발명은 본원에서 "FVIII"으로 불리는 변형된 형태의 인간 펙터 VIII을 제공하며 여기에서 면역적 특성이 잠재적 T-세포 에피토프의 수가 감소 또는 제거되는 식으로 변형된다.
본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재성에 의해 잠재적 T-세포 에피토프인 FVIII 일차 서열내에서 규명된 서열을 개시한다. 상기 개시는 구체적으로 2332 아미노산 잔기의 이소형태 A인 완전한 인간 FVIII 단백질 및 B-도메인이 상기 단백질에서 결손된 작은 형태의 단백질에도 동등하게 관련된 것이다.
본 발명은 또한 단백질의 생물학적 활성은 최대로 유지하면서 본 발명에 따라 특정 아미노산의 치환, 부가 또는 결실로 변경되는 분자의 일차 서열내의 특정 위치를 개시한다. 면역원성의 손실이 오로지 생물학적 활성의 손실과 동시에 달성될 수 있는 경우에는 단백질의 아미노산 서열내의 추가의 변경에 의해 상기 활성을 회복하는 것이 가능하다.
본 발명은 나아가 이러한 변형된 분자를 생산하는 방법을 개시하며, 특히 면역원성 부위를 감소 또는 제거하기 위해 변경을 요구하는 T-세포 에피토프를 규명하는 방법을 개시한다.
본 발명은 생체내에서 향상된 특성을 나타낼 것으로 기대되는 변형된 형태의 FVIII 분자를 제공한다. 본 발명은 인간에서 면역원성인 FVIII 일차 서열의 주요 도메인을 개시하며 이러한 부위의 면역원성 효율성을 제거 또는 감소하기 위한 서열에 대한 변형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 면역원성 도메인을 함유하는 합성 펩티드는 전(whole) 분자에 대한 용인성 반응을 촉진하기 위한 목적의 약학 조성물로 제공될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 변형된 FVIII 분자는 약학조성물로 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하기의 문제와 관련된다:
생체내에서 사용된 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자보다 실질적으로 비면역원성이거나 또는 덜 면역원성이고 FVIII의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자;
상기 특정된 분자로, 상기 면역원성의 손실은 본래 미변형된 분자에서 유래한 하나 이상의 T-세포 에피토프의 제거로 달성됨;
상기 특정된 분자로, 상기 면역원성의 손실은 상기 분자에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입수의 감소로 달성되는 분자;
상기 특정된 분자로, 하나의 T-세포 에피토프가 제거됨;
상기 특정된 분자로, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열로 이는 클래스 II상의 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 또는 T-세포에 결합하는 능력을 나타냄;
상기 특정된 분자로, 상기 펩티드 서열은 하기의 펩티드 a-k의 군에서 선택됨;
상기 특정된 분자로, 상기 펩티드 서열은 표 1 및/또는 표 2에 나타낸 펩티드의 군에서 선택됨;
상기 특정된 분자로, 상기 펩티드 서열은 도 1에 나타낸 펩티드의 군에서 선택됨;
상기 특정된 분자로, 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프에서 1-9개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변경됨;
상기 특정된 분자로, 상기 아미노산 잔기의 변경은 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실임;
상기 특정된 분자로, 필요한 경우, 일반적으로 부가적인 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의한 추가의 변경이 상기 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 수행됨;
상기 임의의 펩티드 서열 a-k와 90% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 펩티드 분자;
상기 임의의 펩티드 서열 a-k와 80% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 펩티드 분자;
표 1 또는 도 1의 임의의 펩티드 서열과 90% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 펩티드 분자;
표 1 또는 도 1의 임의의 펩티드 서열과 80% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 상기 펩티드 분자;
MHC 클래스 II에 결합할 수 있는 상기의 펩티드 서열;
상기 특정된 FVIII 분자로, 하나 이상의 아미노산 치환은 상기 임의의 펩티드 a-k내에서 특정된 임의의 아미노산에 해당하는 위치에서 수행됨;
상기 특정된 FVIII 분자로, 하나 이상의 아미노산 치환은 표 1 또는 도 1내에서 특정된 임의의 아미노산에 해당하는 위치에서 수행됨;
MHC 클래스 II에 결합 활성을 갖는 임의의 상기의 펩티드 또는 변형된 펩티드를 함유하는 약학 조성물;
상기 및 하기에서 정의된 임의의 상기 특정된 변형 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;
FVIII의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 함유하는 약학 조성물;
임의적으로는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 상기에서 정의된 및/또는 청구범위에 정의된 약학 조성물;
하기의 단계를 포함하는 상기 언급된 임의의 청구항에서 정의된 FVIII의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자의 제조 방법:
(i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계; (ii) 시험관내 또는 컴퓨터이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 규명하는 단계; (iii) 시험관내 또는 컴퓨터이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 결정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로, 규명된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 변이체를 디자인하는 단계; (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 변이체를 구축하고, 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 규명하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및 (v) 임의적으로 단계 (ii) - (iv) 를 반복하는 단계;
상기 특정된 방법으로, 상기 단계 (iii)은 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중, 1 - 9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행됨;
미변형된 FVIII로부터 생성되며, 도 1에 나타낸 군으로부터 선택되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13mer T-세포 에피토프 펩티드, 및 생체내에서 사용될 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 더 낮은 면역원성을 갖는 FVIII의 제조를 위한 이의 용도;
상기 특정된 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열 및 생체내에서 사용될 경우 인간 펙터 VIII의 생물학적 활성을 가지며 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 더 낮은 면역원성을 갖는 FVIII의 제조를 위한 이의 용도;
미변형된 FVIII로부터 생성되며, 도 1 또는 표 1에 나타낸 임의의 군의 서열로부터 선택되고 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13mer T-세포 에피토프 펩티드, 및 생체내에서 사용될 경우 인간 펙터 VIII의 생물학적 활성을 가지며 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 더 낮은 면역원성을 갖는 FVIII의 제조를 위한 이의 용도;
도 1 또는 표 1의 임의의 서열에서 유래한 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열 및 생체내에서 사용될 경우 인간 펙터 VIII의 생물학적 활성을 가지며 임의의 미변형된 분자 보다 실질적으로 면역원성이 없거나 또는 더 낮은 면역원성을 갖는 FVIII의 제조를 위한 이의 용도;
본 발명의 이해에 따르면, "T-세포 에피토프" 라는 용어는 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/있거나 MHC 클래스 II와 복합체로 (반드시 측정 가능하게 활성화시키지는 않음) T-세포에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.
본원 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은(본원에서 하기에 정의됨) 펩티드 결합에 의해 서로 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20가지의 상이한 자연적으로 존재하는 아미노산이 있으며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 자연적으로 존재하는 아미노산은 모두 L-배치를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용하여 통상적인 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드는, 예를 들면 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것, 때로는 "올리고펩티드"로 불린다. 다른 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예를 들면 100 개 이상을 포함하며, "폴리펩티드"로 불린다. 관습상, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 보통 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 나아가, "펩티드" 에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 -즉 상이한 단백질의 수- 는 실제로 무한하다. "알파 탄소 (C)" 는, 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 구성원의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 단순 또는 복합적인 기 또는 부분구조를 포함할 수 있고, 펩티드의 차원과 비교하여 현저하게 변화할 수 있는 물리적 차원을 갖는, C에 대한 펜던트 기이다.
본 발명은 본원에서 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 분자의 임의의 FVIII 종에 적용될 수 있으며 그러므로 유전공학적 수단 또는 다른 방법으로 유도된 FVIII 분자를 포함하며 2332 아미노산 잔기 내외를 포함할 수 있다.
분자의 특히 바람직한 FVIII 종은 분자의 B-도메인은 없지만 하나 이상의 T-세포 에피토프 서열의 제거를 초래하는 임의의 남아 있는 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 또한 포함한다. 1438 아미노산 잔기의 치료적 B-도메인 결실된 FVIII 분자는 Lusher 등[Lusher, J.M.등 (2003)Haemophilia 9:38-49] 및 이에 있는 참조문헌에 기술된 대로 성공적 임상시험의 대상이었다. 이러한 단백질의 아미노산 서열은 본원 도 9로 도시되었다.
다른 포유류에서 규명된 것과 같은 FVIII 단백질은 본 개시의 펩티드 서열과 많이 공통되며 개시된 리스트의 것과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 서열과 많은 펩티드 서열이 공통된다. 이러한 단백질 서열은 그러므로 동등하게 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 자가성(autologous) 개체에 도입된 가용성 단백질이 이 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 발생을 초래하는 면역 반응을 유발할 수 있는 실질적 상황을 극복하기 위해 고안되었다. 혈우병 A가 있는 많은 환자의 경우에, 기존의 FVIII의 치료제제에 대한 항체 반응은 이들의 병의 관리에 중대한 문제이다. 임의의 개인에서 적은 수의 T-세포 에피토프는 원(native) FVIII 단백질의 바로 그 많은 B-세포 인식되는 표면 노출된 결정자에 대한 지속되는 항체 반응으로 귀결되는T-헬퍼 세포 시그널링을 유도할 수 있다. 혈우병 A 환자 유래의 억제제 항체를 코딩하는 유전자의 분석은 이러한 항체의 대다수가 친화도 성숙을 겪는다는 것을 보여준다[Jacquemin, M.G.등(1998)Blood 92:496-506; van den Brink, E.N. 등(2000)Blood 95: 558-563]. 친화도 성숙의 근간을 이루는 과돌연변이 현상은 오로지 T-세포 도움에 반응하여 B-세포에서만 일어난다. FVIII 억제제 항체의 많은 부분이 IgG4 서브클래스의 것이라는 것이 또한 오랫동안 인지되어 있으며[Anderson, B.R. & Terry, W.D.(1968)Nature 217;174-175] 필요한 클래스 변환 반응은 유사하게 T 헬퍼 세포 의존성 사건이다. FVIII에 대한 항체 반응이 T-세포 유도된 것이라는 추가의 증거는 FVIII 억제제를 갖는 HIV 양성 환자에서, FVIII 항체 반응이 T-세포수가 감소됨에 따라 없어진다는 관찰에서 또한 유래한다[Bray, G.L.등(1993)Am.J.Hematol.42:375-379]. 따라서, 본 발명은 인간 숙주에게 투여시 면역반응을 유발하는 변경된 성향의 FVIII 단백질을 제공함으로써 이러한 문제를 다룬다. 다수의 B-세포 에피토프가 변형된 FVIII의 표면에 완전하게 남아 있는 경우에, 계속된 T-세포 도움의 부재에서 억제제의 역가는 궁극적으로는 감소할 것이며 그리고 이러한 치료를 받는 새로운 환자에 있어서, 이는 첫번째 경우에서 확립에 실패한다고 이해된다. 본원에 기술된 방법에 따르면, 발명자들은 FVIII 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 중요한 T-세포 에피토프를 포함하는 FVIII 분자의 도메인을 발견하였다.
변형된 FVIII를 유도하는 본 발명의 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(b) 시험관내 또는 컴퓨터이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 규명하는 단계;
(c) 시험관내 또는 컴퓨터이용 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 결정된 바대로, 동정된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서, T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거시키는 방식으로 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체를 고안하는 단계. 상기 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프가 다시 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방식으로 변형되지 않는 한, 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성됨; 및
(d) 재조합 DNA 기술에 따라 상기의 서열 변이체를 구축하고 주지의 재조합 기술에 따라 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 규명하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계.
단계 (b) 에 따른 잠재적인 T-세포 에피토프의 규명은 종래의 선행 기술에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO98/59244; WO98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232에 개시되어 있으며 그리고 이는 바람직하게는 FVIII-유래된 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 성향을 규명하는데 사용될 수 있다. 실제에 있어서는, 본 발명에서 구체화된 조성물은 본 발명의 구현예인 생물학적 생체밖 인간 T-세포 증식 분석 및 WO 02/069232에 개요된 절차를 이용하는 소프트웨어 도구의 조화로운 적용으로 유도되었다.
상기 소프트웨어는 펩티드 MHC 클래스 II 결합 상호작용의 수준에서 항원 제시 과정을 시뮬레이션하여 임의의 주어진 펩티드 서열에 대한 결합 스코어를 제공한다. 이러한 스코어는 집단에 존재하는 우세한 많은 MHC 클래스 II 알로타입에 대해 결정된다. 이러한 절차가 임의의 펩티드 서열을 시험할 수 있어서, 펩티드의 MHC 클래스 II 결합 그루브와 상호작용하는 능력과 관련하여 아미노산 치환, 부가 또는 결실의 결과가 예측될 수 있다. 결과적으로 MHC 클래스 II 와 상호작용할 수 있고 따라서 면역원성 T-세포 에피토프로 작용할 수 있는 감소된 수의 펩티드를 포함하는 새로운 서열 조성물이 고안될 수 있다. 임의의 주어진 제공자 시료를 사용한 생물학적 분석이 최대 4개의 DR 알로타입에 대한 결합을 평가할 수 있는 경우에, 컴퓨터이용 방법은 동시에 >40 개 알로타입을 사용한 동일한 펩티드를 시험할 수 있다. 실제에 있어 이러한 접근법은 다수의 MHC 알로타입과 상호작용하는 이들의 능력이 절충된 새로운 서열 변이체의 고안을 유도할 수 있다.
이러한 컴퓨터이용 접근법의 예시로서, 전체 인간 FVIII 서열상에서 수행된 분석의 결과가 도 1로서 제공된다. 여기에는 상당한 결합 스코어를 갖는 하나 이상의 MHC 클래스 II 알로타입에 결합하는 능력을 갖는 것으로 확인된 FVIII 유래의 13mer 펩티드 서열이 열거된다. 전체적으로 고려하면, 이러한 13mer 펩티드의 데이터세트는 높은 정도의 확실성을 가지고 인간 FVIII 단백질에 대한 허용될 수 있는 다수의 MHC 클래스 리간드 제공하는 것으로 간주된다. 완전한 FVIII 폴리펩티드의 단백질 분해성처리의 필요성 및 생체내에서 FVIII 펩티드의 제시에 이르는 다른 생리학적 단계와 같은 이유로, 상대적으로 전체 펩티드 레퍼토리의 소수의 서브세트만이 궁극적인 생물학적 연관성을 가질 것이다. 이러한 생물학적으로 의미있는 펩티드를 추가로 규명하기 위해, 본 발명자들은 생체밖 인간 T-세포 증식을 사용하는 접근법을 개발하였다.
이러한 접근법은 실질적으로 효과적인 방법으로 증명되었으며 본원에서 본 발명의 구현예로 개시된다. 상기 방법은 서열의 일부, 예를 들면 B-도메인의 전부 또는 일부가 결실된 FVIII 단백질을 시험하는데 적용될 수 있으며; 상기 방법은 서열의 선택된 도메인, 예를 들면 FVIII 펩티드의 서브세트 예컨대 도 1에 열거된 것의 전부 또는 일부에 적용될 수 있거나; 또는 상기 방법은 전 FVIII 서열을 시험하는데 적용될 수 있다. 본 연구에서, 상기 방법은 상기 B-도메인이 결실된 FVIII 서열을 스캔 및 시험하도록 절차 중에 중첩되는 FVIII-유도된 펩티드 서열의 시험을 포함한다. 합성 펩티드는 시험관내 배양된 인간 T-세포에서 증식반응을 유발하는 이들의 능력에 대해 시험된다. 이러한 유형의 접근법이 건강한 제공자에서 채취된 나이브(naive) 인간 T-세포를 사용하여 수행되며, 본 발명자는 이러한 분석의 실시 중에서, 2.0 이상의 자극지수가 유도된 증식의 유용한 측정값이라는 것을 확립하였다. 상기 자극지수는 통상적으로 시험 펩티드에 대해 측정된 증식지수(예를 들면,3H-티미딘 편입을 사용한다면 방사능의 분당 카운트)를 시험 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 값으로 나누어서 유도된다.
본 접근법의 추가의 구현예에서, 본 발명자들은 T-세포가 혈우병 환자에서유래된 경우 생체밖 생물학적 T-세포 분석을 사용하여 FVIII 서열을 T-세포 에피토프의 존재 및 위치에 대해 스캔하는 방법을 제공하였다. 이러한 환자 일부의 경우에 FVIII 단백질은 외래 단백질을 구성하며 생체내에서 강력한 항원을 구성한다. 본 발명자들은 시험관내에서 폴리클로날 및 원칙적으로는 모노클로날 T-세포주를 이러한 환자의 PBMC로 부터 유도하는 것이 가능하다는 것 및 이러한 세포주가 FVIII 단백질내의 T-세포 에피토프의 맵핑에서 효과적인 시약으로 사용될 수 있다는 것을 확립하였다.
이는 혈우병 PBMC T-세포를 시험관내에서 수회전의 항원(FVIII) 자극을 거친 후 즉시 IL-2의 존재하에서 확장하여 수득된다. 폴리클로날 T 세포주의 확립을 위해서는 일반적으로 2-3 회전의 항원자극이 많은 수의 항원 특이적 세포를 생산하기에 충분하고, 이러한 세포는 필요한 대로 후속적 사용을 위해 액체질소 냉동보관 될 수 있다. 상기 세포는 많은 수의 합성 펩티드를 스크리닝하는데 사용되었다.
본 경우에 있어서, 합성펩티드를 각각 8개의 상이한 펩티드 서열을 포함하는 풀(pool) 시스템을 사용하여 분석하였다. 상기 펩티드 풀 절차는 도 2에 도시되어 있다. FVIII 및 PBMC의 7일간의 공배양을 포함하는 초기 회전의 항원(FVIII) 자극 후에 항원으로의 후속적 재자극은 항원 제시 세포로서 자가의(autologous) 조사된 PBMC의 존재에서 수행되었다. 이러한 회전의 항원 선택 회전은 3-4일 동안 수행되며 중간 중간에 약 9일의 총 기간동안 매 3일 마다 첨가될 수 있는 IL-2로의 자극을 포함하는 확장기를 갖는다. 최종 재자극은 "재시험"되어진, 즉 약 4일 동안 IL-2로 자극되지 않은 T-세포를 사용하여 수행된다.
이러한 세포는 항원(예를 들면 합성 펩티드 또는 전단백질)으로 가장 바람직하게는 종전과 같이 자가 항원 제시 세포를 사용하여 약 4일 동안 자극되고 후속적 증식 반응(만약 있다면)은 이후 측정된다. 펩티드 풀은 각각의 풀이 후속 풀에 중첩되는 펩티드를 포함하도록 구성된다. 이러한 식으로 임의의 개별적 T-세포 에피토프는 2 개의 별개의 풀에 있게되며 유도된 증식은 상기 풀 모두를 사용한 처리로부터 확인될 것이다. 임의의 주어진 펩티드 풀에 대해 증식 반응이 확인된 경우에, 펩티드 풀은 개별적 풀 일원을 분리하여 사용한 분석을 반복하여 해석된다.
본 연구의 절차하에서 소위 "억제제 환자"라고 불리는 클래스 유래의 PBMC 시료를 사용하는 것이 특히 바람직한데 이는 이러한 개인 유래의 T-세포 레퍼토리에 의해 규정된 FVIII 단백질의 에피토프 맵은 생체내 상황에서 제시 될 수 있는 가장 우세한 펩티드 에피토프를 대표할 것으로 기대될 수 있기 때문이다. 이러한 관점에서, 종전에 면역반응을 나타낸 환자 유래의 PBMC는 생체내 시동단계의 산물을 구성하며 여기에는 임의의 주어진 자극 펩티드에 대한 훨씬 큰 정도의 증식반응에 대한 용량이 있는 실질적 장점을 기대할 수 있다. 이는 증식 측정을 수행의 기술적 어려움을 감소시킨다.
본 연구는 상당한 증식성 반응(예를 들면 SI>2.0)을 유발할 수 있는 소정의 38개 펩티드 서열을 발견하였다. 상기 펩티드는 표1에 열거되어있으며 본 발명의 구현예이다. 상기 펩티드 세트 내에서, 2가지 이상의 개별 제공자 시료에서 상당한 증식반응을 유발하는 추가의 서브 세트 펩티드가 규명되었으며 이러한 반응 중 일부의 경우는 반응의 정도가 정말로 SI=2.0 보다 상당히 더 높았다. 이러한 펩티드가 표2에 열거되어 있으며 본 발명의 추가의 구현예이다.
본원에서 상기 개시된 펩티드 서열은 변형된 FVIII 분자의 구성에 요구되는 중요한 정보를 나타내며 여기에서 하나 이상의 이러한 에피토프가 절충된다. 본 발명의 절차하에서, 에피토프는 더이상 T-세포 에피토프로서 기능할 수 없는 서열을 초래하는 돌연변이로 절충된다. 표적 서열의 유도 돌연변이화를 달성하기 위해 재조합 DNA 방법을 사용하는 것도 가능하며 많은 이러한 기술이 이용가능하며 당업계에 공지된다.
표1의 상기 열거된 하나 이상의 펩티드의 아미노산 서열을 변형하는 것이 본 발명의 목적인 경우에, 표2에 규명된 하나 이상의 펩티드 P1-P11의 서열을 변형하는 것이 바람직하다. 하나 이상의 MHC 클래스 II 알로타입에 대한 리간드인 수준에서, 또는 더욱 구체적으로는 특히 T-세포가 시험관내에서 배양된 인간 T-세포인 경우에 T-세포 증식을 유도할 수 있는 수준에서, 주제 펩티드 서열이 T-세포 에피토프로서 기능하는 능력을 감소 또는 제거하는 이중 목적을 달성하는데 적합한 변형을 본원에 개시한다.
이러한 바람직한 변형 세트의 한 예는 서열 ISQFIIMYSLDGKKW을 갖는 펩티드 P10으로 포괄되는 T-세포 에피토프의 파괴로 제공된다. 이 에피토프는 FVIII의 C1 도메인에 맵핑되며 혈우병 혈액 및 건강한 비혈우병 개인 모두에서 채취된 생체밖 T-세포의 증식을 유발할 수 있는 에피토프의 예시이다.
이의 MHC 클래스 II 리간드 활성과 관련하여 상기 펩티드 서열의 컴퓨터이용 분석의 결과를 지침으로, 부위 유도적 돌연변이화 절차가 잔기 F1207, I1208, I1209 및 M1210에서 치환을 만들기 위해 적용되었다. 잔기 번호매김은 성숙한 B-도메인 결실된 FVIII 서열(도9)에 따른다. F1207에서 돌연변이화는 FVIII 발현 상실을 초래하였으며 채택된 분석에서 검출할 수 있는 활성이 없었다. 대조적으로 치환 I1208A 또는 I1208T 또는 I1208N 및/또는 I1209C 및/또는 M1210K 또는 M1210N을 포함하는 활성 FVIII 분자가 생산되었다. 따라서, 하나 이상의 상기 열거된 치환을 갖는 활성 FVIII 단백질이 본 발명의 절차하에서 바람직한 조성물이다. 특히 바람직한 치환은 I1208A, I1209C, M1210K 또는 M1210N이며 이러한 치환된 FVIII 단백질은 본 발명의 추가의 구현예이다.
유사하게 바람직한 구현예는 서열 CNIQMEDPTFKENYR을 갖는 P8 펩티드에 의해포괄되는 T-세포 에피토프내의 치환을 포함하는 FVIII 분자를 포함한다. 이 에피토프는 FVIII 단백질의 A3 도메인에 맵핑된다. 부위 유도적 돌연변이화 절차가 이러한 서열에 적용되었으며 치환 M1013K, I1011A 또는 C 또는 D 또는 E 또는 G 또는 H 또는 K 또는 P 또는 Q 또는 R 또는 S 또는 T가 코아테스트(coatest) 분석 및 컴퓨터이용 면역학적 파라미터 및 시험관내 면역학적 분석과 관련하여 기능적 활성을 보유한 분자를 제공하기 위해 확립되었다. 치환 M1013K, I1011A 또는 C 또는 D 또는 E 또는 G 또는 H 또는 K 또는 P 또는 Q 또는 R 또는 S 또는 T를 포함하는 FVIII 분자는 따라서 본 발명의 추가의 구현예이다.
유사하게 바람직한 구현예는 서열 MSSSPHVLRNRAQSG를 갖는 P7 펩티드에 의해 포괄되는 T-세포 에피토프내의 치환을 포함하는 FVIII 분자를 포함한다. 상기 에피토프는 또한 FVIII 단백질의 A3 도메인에 맵핑된다. 위치 V823에서의 치환이 특히 바람직한 변형으로 간주되며 본 발명의 구현예이다. 부위 유도적 돌연변이화 절차가 이러한 서열에 적용되었으며 치환 V823A, 또는 D 또는 E 또는 G 또는 H 또는 N 또는 P 또는 S 또는 T가 코아테스트 분석 및 컴퓨터이용 면역학적 파라미터 및 시험관내 면역학적 분석과 관련하여 기능적 활성을 보유한 분자를 제공하기 위해 확립되었다. 치환 V823A, 또는 D 또는 E 또는 G 또는 H 또는 N 또는 P 또는 S 또는 T를 포함하는 FVIII 분자는 따라서 본 발명의 추가의 구현예이다.
혈우병 혈액 시료에서 활성이 있는 것으로 나타난 T-세포 에피토프 펩티드 서열의 추가의 예는 서열 IARYIRLHPTHYSIRSTLRM을 갖는 펩티드 P11에 의해 제공된다. 이러한 에피토프는 FVIII 단백질의 C1 도메인에 맵핑되며 종전에 FVIII 억제제 생산의 중요한 유도자로서 규명되었다[Jacquemin, M 등(2003)Blood 101: 1351-1358]. 위치 Y1254, I1255, L1257, Y1262, I1264, L1268에서의 치환이 특히 바람직한 변형으로 간주되며 본 발명의 구현예이다.
유사하게 추가의 바람직한 구현예는 펩티드 P9(STLFLVYSNKCQTPL)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 L1119, F1120, L1121, V1122 및 Y1123에서의 치환 또한 펩티드 P6(VAYWYILSIGAQTDF)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 Y636, Y638, I637, L638 및 I639에서의 치환; 펩티드 P5(ASNIMHSINGYVFDS)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 I613 및 I617에서의 치환; 펩티드 P4(YKWTVTVRDGPTKSD)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 V515 및 V517에서의 치환; 펩티드 P3(GPQRIGRKYKKVRFM)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 I419에서의 치환; 펩티드 P2(SYKSQYLNNGPQRIG) 의해 포괄되는 에피토프의 위치 Y407, Y411 및 L412에서의 치환 및 펩티드 P1(ILLFAVFDEGKSWSH)에 의해 포괄되는 에피토프의 위치 L197, L198, F199, V201 및 F202에서의 치환을 포함하는 FVIII 분자를 포함한다.
앞서 언급한 것으로부터 본 발명에 따른 다수의 FVIII 단백질 변이체가 생산될 수 있으며 바람직한 면역 및 기능적 특성에 대해 시험될 수 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 FVIII 변이체 단백질을 만들고 시험하는 예시적 방법은 실시예 내에 기술된다. 이러한 모든 기능적 단백질은 본 발명의 구현예이다. 더구나 수행된 변형은 모(parental) 또는 "야생형"(wt)펩티드 서열과 동일한 친화성으로 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 없는 펩티드 서열을 초래하는 것이 WO 02/069232의 예측성 컴퓨터이용 MHC 클래스 II 결합 수단을 사용하여 증명되었다. 나아가, 생체밖 인간 T-세포 생물학적 증식분석을 사용한 예시적 변이체 펩티드 에피토프의 물리적 시험은 이러한 펩티드가 T-세포 증식을 지원하며 따라서 이에 의해 T-세포 에피토프로 기능할 수 있는 바람직한 능력의 상실을 확인한다. 본 경우에서 이는 생물학적 분석을 사용하여 규명된 펩티드 서열을 포함하고 이에 의해 T-세포 활성을 지원할 수 있는 것으로 확인되었다. 중요하게 이러한 펩티드의 다수가 혈우병 혈액에서 유도된 T-세포의 시험관내 증식을 촉진할 수 있으며 그리고 처리된 에피토프를 대표하며 애매하거나 또는 면역학적으로 관련성이 없는 결정가로 간주될 수 없다.
변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있을 것이며 다만 FVIII 단편의 화학적 합성을 포함하는 다른 방법도 고려될 수 있다. 임의의 바람직한 변이체 FVIII 분자 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA)서열을 유추하기 위해 본원에 제공된 단백질 서열 정보를 제공하는 것이 손쉬운 방법이다. 이는 컴퓨터 소프트웨어 도구 예컨대 DNAstar software suite[DNAstar Inc. Madison WI, USA] 또는 유사한 것을 사용하여 가장 용이하게 달성된다. 본원의 또는 이의 상당한 상동체의 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 이러한 DNA 서열이 본 발명의 구현예로서 간주되어야만 한다.
본 발명은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 단백질로부터 하나 이상의 잠재적 T- 세포 에피토프의 제거 또는 활성의 실질적 감소를 초래하는 위치에서 수행되는 FVIII 유사체에 관한 것이다. 도 1에서 규명된 임의의 잠재적 MHC 클래스 II 리간드 내에 또는 더욱 바람직하게는 표 1 및 2의 펩티드 에피토프 서열에서 특정 지점에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 인간 대상체에게 치료제로서 투여시 감소된 면역원성 잠재성을 갖는 FVIII 분자를 초래할 수 있다.
아미노산 변형(예를 들면 치환)이 모 분자의 가장 면역원성 도메인에서 수행된 FVIII 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. T-세포 에피토프의 제거를 위해, 아미노산 치환은 바람직하게는 T-세포 에피토프 활성의 제거 또는 실질적 감소를 달성할 것으로 예측되는 펩티드 서열내의 적절한 지점에서 수행된다. 실제에 있어서는 적절한 지점은 MHC 클래스 결합 그루브 내에 제공된 포켓 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 동등할 것이다. 펩티드의 소위 P1 또는 P2 고정자 위치에서 클레프트의 제1 포켓내의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 상기 펩티드의 P1 고정자 잔기 및 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제1 포켓 사이의 결합 상호작용의 질이 전체 펩티드에 대한 전반적 결합 친화도의 주요 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이러한 지점에서의 적합한 치환은 상기 포켓내에 덜 용이하게 수용되는 잔기에 대한 것일 것이며, 예를 들면 더욱 친수성 잔기로의 치환일 것이다. MHC 결합 클레프트내의 다른 포켓 도메인내의 결합과 동등시되는 위치에서 펩티드의 아미노산 잔기가 또한 고려되며 본 발명의 범위에 속한다.
기술분야의 당업자에게 자명하듯이, 원치 않는 에피토프를 제거하는 목적을 달성하기 위해 다수의 대안적 치환 세트가 있을 수 있다. 상기 초래된 서열은 그러나 본원에 개시된 특정 조성과 아주 상동적인 것으로 인식되며 따라서 본 발명의 범위내에 속한다.
주어진 잠재적 T-세포 에피토프내의 단일 아미노산의 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 하나의 에피토프 내에서 치환의 조합이 고려될 수 있으며, 예를 들면 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중첩되는 경우에 특히 적합할 수 있다. 더구나, 주어진 하나의 에피토프 내에서 하나의 치환 또는 하나의 에피토프 내에서 조합의 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브와 관련하여 "포켓잔기"와 동등시되는 지점이 아니라, 펩티드 서열내의 임의의 지점에서 수행될 수 있다. 치환은 기술분야에서 알려진 컴퓨터이용 기술을 사용하여 생산된 구조적 방법 또는 상동적 구조를 참조로하여 만들어 질 수 있으며, 본 발명에 따른 분자의 공지된 구조적 특징을 기본으로 할 수 있다. 이러한 모든 치환이 본 발명의 범위내에 속한다.
상기 규명된 펩티드내 이외의 아미노산 치환이 고려될 수 있는데 특히 열거된 펩티드내에 만들어진 치환과 조합으로 만들어지는 경우이다. 예를 들면 변이체 분자의 생물학적 활성 또는 구조를 회복하기 위해 변화가 고려될 수 있다. 이러한 보충적 변화 및 목적하는 활성을 갖는 변이체를 초래하는 FVIII 폴리펩티드 유래의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하는 변화 및 임의의 개시된 펩티드에서의 변화와 조합된 변화는 본 발명의 범위에 속한다.
이러한 발명이 변형된 FVIII에 관한것인 한, 이러한 변형된 FVIII 단백질 또는 변형된 FVIII 단백질의 단편을 포함하는 조성물 및 관련된 조성물도 본 발명의 범위내로 간주되어야만 한다. 이러한 점에서 관련 있는 예는 펩티드 매개된 용인성 유도 전략의 개발일 수 있으며 여기에서 하나 이상의 개시된 펩티드가 면역치료 의도가 있는 환자에게 투여된다. 따라서, 합성 펩티드 분자, 예를 들면 하나 이상의 표1에 열거된 것들이 본 발명의 구현예로 간주된다. 다른 측면에서, 본 발명은 변형된 FVIII 실체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 추가의 양태에서 본 발명은 상기 변형된 FVIII 단백질을 사용한 인간의 치료적 처리 방법에 관한 것이다. 여전히 추가의 양태에서, 본 발명은 펩티드 또는 본원에 개시된 서열과 서열 동일성 또는 일부 동일성을 갖는 유도체 분자를 포함하는 약학 제제를 사용한 치료적 처리 방법에 관한 것이다.
T 세포주 및 클론의 확립 방법
말초혈액단핵구 세포(PBMC)를 혈우병 환자에서 수득한 혈액에서 분리하고 액체질소하에서 냉동보관하였다. 혈액 시료는 Addenbrooke's Health Care Trust의 지역 윤리 승인하에서 기능하는 충분한 설명에 입각한 동의하에 제공되었다.
T 세포주는 수 회의 IL-2 유도된 확장이 뒤따르는 FVIII를 사용한 부피 배양에서 항원 특이적 T 세포를 자극하여 확립되었다. 초기에 PBMC는 24웰 플레이트에서 4㎍/ml FVIII(RefactoTM)를 포함하는 2ml의 AIM V 배지에서 2x106으로 배양되었다(5% CO2가습대기의 37℃에서). 7일간의 배양 후에 100U/ml IL-2를 첨가하고 배양물을 추가로 3일 동안 배양하였다. T 블라스트를 수집하여 10일간의 항원/IL-2 자극의 종료시 수를 세었다. 항원 특이성을 유지하기 위해 항원 제시 세포로서 γ-조사된 자가 PBMC를 사용하여 T 블라스트에 제2 회전의 항원자극을 하였다. 이는 0.75ml AIM V(5%의 열불활성화된 인간 AB 혈청 포함)중에서 1시간 동안 4㎍/ml FVIII로 24웰 플레이트에서 1x106자가 PBMC/웰을 배양한 후 4000 rads γ-방사선조사를 하여 달성하였다. 자가 T 블라스트를 0.25ml AIM V중에서 4x105세포/ml로 γ-방사선조사된 항원 제시 세포(FVIII로 미리 부하됨)에 첨가하고 3일 동안 배양하였다. T 블라스트를 세포를 100U/ml IL-2로 3일간 자극하여 확장하였다; 배양물에 이어서 총 9일 동안 3일 간격으로 신선한 IL-2(최종 농도 100U/ml)를 공급하였다. 모든 확장된 T 블라스트가 항원 특이적인 것을 담보하기 위해 제3회전의 항원자극을 수행하였고, 여기에서 T 블라스트를 수집하여 AIM V 배지에서 4x105세포/ml로 재현탁하였다. 앞서 언급한 것처럼 항원제시 세포는 0.75ml AIM V(5%의 열불활성화된 인간 AB 혈청 포함)중에서 1시간 동안 4㎍/ml FVIII로 24웰 플레이트에서 1x106γ-방사선조사된 자가 PBMC/웰을 배양하여 생성하였다. 0.25ml AIM V 중에 4x105세포/ml의 자가 T 블라스트를 γ-방사선조사된 항원 제시 세포에 첨가하고 3일 동안 배양하였다. 10U/ml IL-2에서의 최종 확장은 T 블라스트가 수집되어 펩티드 풀을 스크리닝에 사용하기 3일 전에 수행하였다.
부피 배양물로부터 클로닝
FVIII 항원으로의 제3 자극 후에 T 블라스트를 수집하고 단계 희석으로 4x102- 1x104세포/ml(2x 최종 배양 밀도)의 밀도로 재현탁하였다. 자가 PBMC를 해동하여 폴리프로필렌 튜브에서 2x106세포/ml(2x 최종 배양 밀도)로 재현탁하였다. PBMC를 이어서 4000 rads γ-방사선에 노출시키고 제한 희석법으로 항원 반응성 T 세포 클론을 선택하기 위해 항원제시 세포로 사용하였다. γ-방사선조사된 항원제시 세포(1x106최종 밀도)를 T 블라스트(2x102- 5x103최종 밀도), 1-10㎍/ml FVIII 항원 및 100U/ml IL-2와 혼합하였다. T 세포 클론을 Terasaki 플레이트에서 20㎕의 APC, T 블라스트, FVIII 및 IL-2 혼합물을 각각의 웰에 첨가하여 확립하였다. 제한 희석 클로닝을 2-50 T 블라스트/Terasaki 플레이트 웰을 사용하여 수행하였다.
T 세포 클론의 선택 및 관리 유지
T 블라스트를 FVIII 항원, IL-2 및 γ-방사선조사된 자가 항원제시 세포와 약 14일 동안 배양하였다. 확실한 성장을 나타내는 세포를 포함하는 웰을 식별한 후, T 블라스트를 최종 부피 200㎕ AIM V(1% 열로 불활성화된 인간 혈청이 들어 있음) 중에 1x105γ-방사선조사된 알로제닉 PBMC, 100U/ml IL-2 및 1㎍/ml 피토헤마글루티닌(PHA)을 포함하는 둥근 바닥의 96웰 플레이트의 단일 웰에 전달하였다. T 세포 클론을 세포가 무성하게 되면 분리하여, 궁극적으로는 최종 부피 2ml AIM V(1% 열로 불활성화된 인간 혈청이 들어 있음) 중에 1x106γ-방사선조사된 알로제닉 PBMC(피더세포(feeder cell)), 100U/ml IL-2 및 1㎍/ml 피토헤마글루티닌(PHA)을 포함하는 24 웰 플레이트의 단일 웰로 전달하였다. T 세포 클론의 일상적 유지관리는 매 2-3주(세포의 성장에 의존함)마다 알로제닉 영양세포 및 신선한 PHA로의 자극 및 매주 2회의 100U/ml IL-2로의 자극을 포함하였다. FVIII 특이적인 것으로 증명된 T 세포 클론만이 확장되었으며 FVIII 펩티드를 스크리닝하기 위해 사용되었다.
자가 B 세포의 EBV 형질전환
B 임파양(lymphoblastoid) 세포주(BLCL)를 생성하기 위해 3ml의 필터된(0.45μ) B95.8 상층액을 4x106PBMC에 첨가하고 1시간 동안 37℃ 에서 배양하여 PBMC로부터 준비된 B 세포를 불멸화하였다. PBMC를 침전하고 5% 열불활성된 소태아 혈청(FCS) 및 1㎍/ml 사이클로스포린 A를 포함하는 2ml의 RPMI 중에 재현탁하였다. 7일 간의 배양 후에 1ml의 배양 배지를 5% FCS 및 2㎍/ml 사이클로스포린 A(1㎍/ml의 사이클로스포린 A의 최종농도가 됨)포함하는 신선한 RPMI 배지로 대체하였다. 이러한 영양공급법은 14일 및 21일째에 반복되었으며 이후에 필요한 경우 5% FCS를 포함하는 RPMI를 사용하여 세포를 분리하여 조직 배양 플라스크로 확장하였다.
T 세포주/클론을 사용한 FVIII 펩티드 스크리닝
길이 15개 잔기 및 종전 펩티드와 12개 아미노산 증가분씩 중첩되는 펩티드를 합성하였다(Pepscan, Netherlands). 펩티드를 초기에 보관용으로 100% 디메틸술폭시드(DMSO)에 10mM 로 용해하였다. FVIII 특이적 T 세포주에 대하여 동시에 다수의 펩티드를 스크리닝 하기위해 펩티드 풀을 생성하였다. 풀은 각각의 풀이 후속 풀과 중첩 펩티드를 포함하며 이 접근법을 사용하여 두개 펩티드가 중첩되는 T 세포 에피토프는 두개의 별개의 풀에서 증식을 유도하는 식으로 구성되었다. 각각의 풀은 전형적으로 8개의 펩티드로 구성되며 각각의 펩티드는 1 또는 5μM로 시험된다. 상기 펩티드 풀 전략은 도 2에 도시되어 있다.
자가 PBMC(T 세포주의 경우) 또는 EBV 형질전환된 BLCL(T 세포 클론의 경우)을 50㎕의 AIM V 배지 중에 1x105PBMC 또는 BLCL을 재현탁하고 이어서 둥근 바닥의 96웰 플레이트 각각의 웰에 첨가하여 항원제시 세포로서 사용하였다. 각각의 풀에 대해 양 농도( 1 또는 5μM)로 세벌씩 웰에 펩티드 풀을 추가하였다. 항원제시 세포 및 펩티드 풀을 1시간 동안 37℃에서 배양하고 4000 rads γ-방사선에 노출하였다. T 세포 클론에 대하여 항원제시 세포(γ-방사선조사된 자가 PBMC 대신에)로서 사용되는 경우에 BLCL을 1시간 동안 37℃에서 1㎍/ml의 마이토마이신 C로 전처리하고 AIM V 배지로 4회 세척하였다. 항원 특이적 T 세포주 또는 T 세포 클론을 이어서 웰당 5x104세포로 추가하고 배양물을 3일 동안 배양하였다. 3일 째에 각각의 웰을 1μCi[3H]-티미딘으로 최소 8시간 동안 펄스하였다. 플레이트를 필터메트위로수집한 후에 cpm/웰을 Wallac Microplate Beta counter를 사용하여 결정하였다. 도 3은 T 세포주를 사용하여 생성된 에피토프 맵을 보여주며, 여기에서 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 풀을 규명하기 위해 T 블라스트를 사용하였고, 이러한 풀을 이어서 T 세포 에피토프를 포함하는 개별 펩티드를 규명하기 위해 해석하였다.
건강한 제공자 유래의 PBMC를 사용한 나이브 T 세포 에피토프 맵
40명의 건강한 HLA-DR 유형화된 제공자의 혈액을, 두 농도(1 또는 5μM)로 개별 FVIII 펩티드의 스크리닝에 사용되는 PBMC를 분리하기 위해 사용하였다. 모든 FVIII 펩티드를 스크리닝하기에는 각각 제공자의 PBMC의 수가 불충분하기 때문에, 제공자를 두군으로 나누고 여기에서 첫번째 20 제공자를 분자의 처음 반에 걸치는 펩티드를 스크리닝하는데 사용하였고 두번째 세트의 제공자를 나머지 펩티드를 스크리닝하는데 사용하였다. 제공자는 전세계의 집단에 존재하는 많은 수의 알로타입을 포괄하기 위해 발현된 MHC 클래스 II 알로타입에 따라 선택하였다. MHC 알로타입은 사용하여 확인되었다.
모든 PBMC 시료에 대한 조직 유형은 시중에서 구입가능한 시약시스템(Dynal, Wirral, UK)을 사용하여 분석하였다. 분석은 공급자의 권고된 프로토콜에 따라 표준 보조 시약 및 아가로스 전기영동시스템으로 수행하였다.
PBMC는 생리적 수의 나이브 T 세포 및 항원제시 세포를 포함한다. 이러한 세포를 세벌씩의 200㎕ 배양에서 1 또는 5μM로 펩티드를 스크리닝하기 위해 2x105세포/웰(96웰 편편한 바닥 플레이트)의 밀도로 사용하였다. 세포를 37℃에서 6일 동안 펩티드와 배양한 후 각각의 웰을 1μCi[3H]-티미딘으로 최소 8시간 동안 펄스하였다. 배양물을 필터메트위로 수집한 후에 cpm/웰을 Wallac Microplate Beta 계측기를 사용하여 결정하였다. 도 5는 분자를 반씩 별개로 스크리닝하기 위해 두 제공자를 사용하여 생성된 FVIII의 에피토프 맵을 보여준다.
실시예 2
펙터 VIII의 클로닝 및 발현 방법
mRNA 추출 및 cDNA 합성:
인간 간 조직을 병원 병리학과에서 수득하였다. 상기 시료를 잘게 잘라 50mg 분취물로 나누어서 액체질소에 보관하였다. 50mg 분취물 하나를 균질화하여 PolyATract System 1000키트(Promega)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 직접 mRNA를 추출하였고 수율은 대략 10㎍ mRNA이었다. mRNA의 1㎍ 분취물을 제조자의 지시에 따라 ImProm-II 역전사 시스템(Promega)을 사용하고 oligo(dT)15프라이머를 사용하여 20㎕ 반응에서 역전사하였다. 역전사 효소를 이어서 70℃에서 15분 동안 가열하여 불활성화하였다.
펙터 VIII 서열의 중합효소연쇄반응 증폭
펙터 VIII의 B 도메인 결실된 변이체를 클로닝해야 하기 때문에, 상기 cDNA의 반에서 cDNA를 증폭하였다. mRNA의 5'말단은 하기의 프라이머를 사용하여 증폭되었다:
Seq ID No. 1은 클로닝의 용이성을 위한 두개의 제한효소 부위 및 ATG 개시 코돈(두꺼운 글씨) 주변의 펙터 VIII mRNA의 24개 뉴클레오티드를 포함한다.
Seq ID No. 2는 펙터 VIII mRNA의 2420 내지 2454 뉴클레오티드에 상보적이며 단백질 서열에는 영향이 없으면서 새로운 제한효소 부위를 도입하는 2445 및 2448(두꺼운 글씨로 나타냄) 위치에 두개의 변화된 뉴클레오티드를 포함한다.
펙터 VIII 유전자의 3'말단은 하기의 프라이머를 사용하여 증폭되었다:
Seq ID No. 3은 클로닝의 용이성을 위해 NheI 제한효소 부위 및 5140 내지 5164 뉴클레오티드에 융합된 2442 내지 2457 뉴클레오티드의 펙터 VIII mRNA를 포함한다. 상기 프라이머는 그러므로 중쇄 및 경쇄 사이 경계를 생성하며 여기에 B 도메인 거의 전부가 결실되어 있다. 상기 프라이머는 또한 2445 및 2448 위치(두꺼운 글씨로 나타냄)에 Seq ID No. 2에서도 또한 발견되는 새로운 제한효소부위를 생성하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. Seq ID No. 4는 펙터 VIII 코딩 서열의 최종 24 뉴클레오티드 및 클로닝의 용이성을 위한 제한효소 부위를 포함한다.
PCR 반응은 MgCl2를 포함하는 제공된 완충액을 사용하여 총 50㎕의 최종 부피에서 Expand HiFi 폴리머라제(Roche)를 사용하여 수행하였다. 상기 반응물을 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 50pmole(Seq ID No. 1 플러스 Seq ID No. 2 또는 Seq ID No. 3 플러스 Seq ID No. 4), 2.5 단위의 Rnase H, 및 5㎕의 역전사 반응혼합물을 포함하는 1 x 완충액으로 만들었다. 상기 반응을 PCR 반응의 효율을 증가시키기 위해 RNA/cDNA 하이브리드 중의 RNA가 RnaseH에 의해 분해되도록 37℃에서 30분간 두었다. 상기 반응을 이어서 초기의 변성을 위해 94℃에서 2분간 가열한 후 하기 온도 및 시간의 주기 반응을 하였다: 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2.5분. 제일 처음의 어닐링 단계 동안 권고량의 폴리머라제를 첨가하고 주기 반응을 20회 돌렸다. 20회째 연장 단계 후의 어닐링 단계동안, 폴리머라제 두번째 분취물을 첨가하고 상기 반응을 추가로 주기 반응을 20회 돌렸다. 상기 반응을 이어서 72℃에서 10분간 두어 모든 가닥의 중합의 완결을 담보하였다.
펙터 VIII 유전자의 클로닝 및 어셈블리:
PCR 반응물의 반을 1% 아가로스 겔에서 분리하여 펙터 VIII cDNA의 5' 말단에 해당하는 2286bp 밴드 및 3' 말단에 해당하는 2015bp 밴드를 잘라내어 Qiagen Gel Extraction 키트로 아가로스로부터 정제하였다. 상기 PCR 산물을 이어서 PCR 산물 클로닝 벡터(pGEM-T Easy Vector System, Promega)로 제조자의 지시에 따라 라이게이션하였다. 라이게이션 각각의 반응물 1㎕를 공급자의 권고대로 20㎕의 전기천공될 수 있는E.coli세포주 XL1-blue(Stratagene)에 0.1cm 간격의 큐벳을 사용하여 전기천공(electroporation)하였다. 상기 세포를 재현탁하고 공급자가 또한 권고한 대로 상기 세포가 회복하도록 두었다. 전기천공된 세포의 10㎕ 및 100㎕분취물을 100㎍/ml 암피실린, 80㎍/ml Xgal 및 0.5mM IPTG를 포함하는 LB 아가 플레이트상에 펴바르고(plated out) 37℃에서 하룻밤 두었다.
흰색 콜로니를 취하여 20㎕의 물에 분산하였다. 각각의 재현탁된 콜로니의 시료를 공급된 완충액에서 Taq 폴리머라제(Roche)를 이용하여 20㎕ 부피의 PCR 반응으로 분석하였다. 반응물을 dNTP 각각 200μM, 표준 M13 전방 및 후방 프라이머(본원에서 SEQ ID Nos 5 및 6) 각각 50pmoles, 및 1㎕의 재현탁된 콜로니를 포함하는 1x 완충액으로 만들었다. 상기 반응물을 이어서 초기 변성을 위해 94℃에서 2분간 가열한 후 하기의 온도 및 시간의 주기반응을 20회 하였다: 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분. 상기 반응을 이어서 72℃에서 10분간 두어 모든 가닥에서 중합의 완결을 담보하였다.
각각의 반응에서 5㎕의 시료를 1% 아가로스 겔에서 분리하였다. 약 2300bp에 밴드를 포함하는 시료를 펙터 VIII 5'반쪽 삽입에 대해 양성인 것으로 간주하고 약 2150bp에 밴드를 포함하는 시료를 펙터 VIII 3'반쪽 삽입에 대해 양성인 것으로 간주하였다. 각각의 삽입에 대하여, 8개의 콜로니를 각각 2YT 브로쓰/100㎍/ml 앰피실린의 5ml의 액체 배양에 접종하고 교반하며 37℃에서 하룻밤 키웠다. 각각의 배양물의 1.5ml에서 Qiagen mini-prep kit을 사용하여 플라스미드를 추출하고 상기 플라스미드는 하기의 프라이머를 사용한 염기서열의 결정을 위해 계약을 맺은 염기서열 분석 기관으로 보냈다.
플라스미드 pCF85가 펙터 VIII 유전자의 5'반쪽에 대한 정확한 아미노산 서열을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 플라스미드 pCF83은 펙터 VIII 유전자의 3'반쪽에 대한 정확한 아미노산 서열을 코딩하는 것으로 밝혀졌다.
pCF83을 Bst98I 및 XhoI으로 잘라 펙터 VIII 유전자의 3'반쪽을 포함하는 잘라낸 2.0kbp 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고 유사하게 자르고 정제한 pLitmus(NEB)로 표준 기술을 사용하여 클로닝하였다. 양성 박테리아 콜로니를 상기 기술한대로 PCR로 규명하였고 하나의 클론인 pCLF83을 선택하여 키우고 DNA를 추출하였다.
pCF85를 BssHII로 자르고 T4 DNA 폴리머라제(NEB)로 각각의 dNTP 100μM의존재에서 말단을 평활화(flush)하였다. 상기 반응물을 이어서 70℃에서 10분간 가열하고 이어서 AvrII로 절단하였다. 절단된 2.3kb 단편을 아가로스겔 전기영동으로 정제한 후 Bst98I로 자르고 상기와 같이 말단 평활되고, AvrII 로 절단되고 겔 정제된 pCLF83으로 클로닝하였다. 양성 박테리아 콜로니를 프라이머 Seq ID No.11 및 Seq ID No.17(ATCAGTAAATTCCTGGAAAAC [펙터 VIII mRNA nt 5448-5428])를 사용하여 상기와 같이 PCR 스크리닝으로 규명하였다. 이들 프라이머는 펙터 VIII 유전자의 두 반쪽 사이의 경계에 걸친 단편을 증폭하며 따라서 클로닝이 성공적인 경우에만 약 570bp의 산물이 보인다. 양성 콜로니를 선택하여 pCLF8이라 명명하였다. 상기 콜로니를 키워 DNA를 추출하고 염기서열분석을 하였다. 정확한 경계의 서열을 Seq ID No.6 및 Seq ID No.5의 프라이머를 사용하여 확인하였다. 5' 및 3' 반쪽 간의 상기 경계를 또한 Seq ID No.17 프라이머를 사용하여 확인하였다.
펙터 VIII의 발현 및 활성 분석
FVIII 단백질을 벡터 pCI(Promega, Southampton, UK)의 변형된 변이체를 사용하여 발현시켰다. 미변형된 벡터는 길이가 4.0kbp이고 CMV 인핸서/프로모터 및 포유류 발현을 위해 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널을 포함하고 박테리아 증식에 필요한 서열도 포함한다. 상기 벡터는 또한 박테리오파지 F1 오리진을 포함하지만 이는 플라스미드를 제한효소 BamHI 및 EcoO109I로 잘라 제거하였다. 상기 잘린 산물은 상기 기술한 대로 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 말단이 평활화된 후 1% 아가로스겔에서 분리되었다. 상기 3.2kb 벡터 단편을 겔에서 정제하고, 자가 라이게이션하고 앞서 기술된 대로 박테리아 세포주 XL-blue에 형질전환하였다. 상기 언급한대로 콜로니를 취하여, 하룻밤 기르고 플라스미드의 미니프렙(mini-prep)을 하였다. 상기 정제된 플라스미드 시료를 F1 오리진 서열에 존재하는 NgoMIV 부위를 이 제한효소로 절단하고 아가로스겔 전기영동으로 분석하였다. 저항성 플라스미드를 선택하여 pCI로 명명하였다.
pCI를 제한효소 NheI 및 XhoI으로 자르고 벡터 단편을 아가로스겔 전기영동으로 정제하였다. pCLF8을 유사하게 절단하고 펙터 VIII 유전자를 포함하는 4.4kbp 단편을 아가로스겔 전기영동으로 정제하고 표준 기술을 이용하여 잘린 pCI로 클로닝하였다. 양성 박테리아 콜로니를 상기 언급한대로 프라이머 Seq ID No.11 및 Seq ID No.17을 사용하여 PCR로 규명하였다.
pCIF8로 명명된 하나의 양성 콜로니를 선택하여 100㎍/ml 암피실린을 포함하는 50ml 2YT 브로쓰(Broth)에 접종하고 격한 교반을 하며 37℃에서 하룻밤 키웠다. 매우 순수하게 정제된 플라스미드 DNA를 Qiagen midi-prep kit을 사용하여 준비하였다. 플라스미드 DNA는 분광광도법으로 정량하여 0.2㎍/㎕로 희석하고 0.2㎛ 구멍의 1.5cm 직경의 필터 유니트(Nalgene)를 통하여 필터 멸균하였다.
HEK 293 세포(ATCC CRL-1573)를 75cm2의 조직배양 플라스크에서 Glutamax-I, 소디움 파이루베이트 및 4500mg/ml 글루코스(Invitrogen cat no.31966-021)를 포함하고, 10% 열불활성화된 소태아혈청(Perbio cat no. CH30160.03)으로 보충된 DMEM에서 연속배양으로 유지되었다. 세포를 37℃/5% CO2에서 키우고 매 48시간마다 1/5로 희석하여 계대배양(subculture)하였다. HEK 293세포는 조직-배양 플라스틱에단지 약하게 부착하여 플라스크 표면을 세척하면 떼어낼 수 있다.
HEK 293 세포를 24웰 폴리-L-리신 코팅된 조직 배양 디쉬(Beckton Dickinson)에서 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조자의 권고대로 전달이입(transfection)하였다. 75cm2의 조직배양 플라스크에 있는 거의 무성한 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 트립신/EDTA 용액을 사용하여 조직 배양 플라스크에서 떼어냈다. 상기 트립신은 동일한 부피의 성장 배지를 첨가하여 불활성화시켰다. 헤모사이토미터(Haemocytometer)로 세포의 수를 세고 세포 부유액을 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포 침전물을 4x105세포/ml의 밀도로 성장배지에 재현탁하였다. 0.5ml의 세포 현탁액을 24 웰 조직배양 디쉬의 각각의 웰에 넣고 37℃/5% CO2에서 하룻밤 키웠다. 전달이입전에 상기 배지를 각 웰에서 제거하고 0.5ml의 신선한 배지로 대체하였다. 0.8㎍의 플라스미드 pCIF8 및 음성 대조군 플라스미드 pCI를 각각 Optimem(Invitrogen cat no. 51985-026)중에 50㎕로 희석하였다. 각각의 전달이입에서, 2㎕ Lipofectamine 2000을 50㎕로 희석하고, 상온에서 5분 동안 두고 이어 희석한 플라스미드와 합한 후 추가로 실온에서 20분 동안 두었다. 전달이입은 세벌씩으로 수행하였고 각각의 100㎕ 플라스미드/리피드 혼합물을 이어서 상기 24 웰 플레이트의 하나의 웰에 적가하였다. 상기 플레이트를 이어서 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 24 시간, 48시간 및 72시간째에 각각의 전달이입에서 10㎕ 분취물을 제거하였다. 각 세벌에서 배양물의 분취물을 합하여 시료당 총 부피 30㎕를 만들어 활성분석전까지 -80℃에 냉동하였다.
상층액에서의 펙터 VIII 활성을 제조자의 지시에 따라 마이크로타이터 포맷으로 Coatest F8:C/4 kit(Chromogenix)를 사용하여 분석하였다. 상층액 시료를 얼음위에서 녹이고, 분석 완충액에서 1/20 및 1/100으로 희석하고 중복으로 분석하였다. 표준은 펙터 VIII 활성에 대한 국제적 표준에 대하여 정량된 동결건조된 플라스마 시료(Chromogenix)이었다. 하나의 플라즈마 바이알을 제조자가 기술한대로 1ml의 물에 재구성하였다. 첨부된 데이터 지를 플라스마 중의 펙터 VIII 활성 수준을 알기 위해 참조하였고 이는 이어서 분석 완충액을 첨가하여 100%(1IU/ml)로 희석하였다. 상기 표준물을 이어서 제조자의 마이크로타이터 분석 프로토콜에 기술된 대로 희석하였다. 24시간 후에 pCIF8로 전달이입된 세포 유래의 상층액은 0.16 IU/ml 활성도를 포함하는 것으로 밝혀졌고 이는 48 시간에는 0.75 IU/ml로 증가하였다가 다시 72시간에는 0.5 IU/ml로 떨어졌다. 대조군 벡터로 전달이입된 세포 유래의 상층액에서는 활성이 보이지 않았다. 그러므로 펙터 VIII이 돌연변이체의 활성을 결정하기에 충분한 양으로 성공적으로 발현되었다.
펩티드 P10 중 아미노산의 돌연변이화(표 2)
펩티드 10은 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 위한 일차 고정자일 잠재성을 갖는 4개의 소수성 잔기, F1207, I1208, I1209 & M1210을 포함한다 (성숙한 B 도메인 결실된 서열에 따른 번호매김). 따라서, 이들 4개의 잔기가 잠재적으로 일차 고정자 일 수 있는 것 이외의 잔기로의 돌연변이에 대한 표적이 되었다. F1207은 다음으로 변화되었다: A, H, K, N, Q 및 R ;I1208은 다음으로 변화되었다:A, T, D, N; I1209는 다음으로 변화되었다:A, C, D, N, P; M1210은 다음으로 변화되었다:A, K, N 및 Q. 돌연변이화는 기술분야에서 당업자에게 주지된 확립된 프로토콜을 사용하여 중첩 PCR로 수행하였다. 펩티드 10은 PspOMI 및 SphI 제한효소로 경계 지워진 펙터 VIII 핵산 서열 단편 내에 놓여 있다. 이들 단편의 증폭을 위한 PCR 프라이머를 이 도메인 바로 바깥 서열에 상응하는 것으로 합성하였다 (하기의 Seq ID No.18 및 No.19). F1207의 돌연변이화를 위해 하기에 기술된대로 내부 프라이머를 합성하였다:
PCR은 MgCl2를 포함하는 공급된 완충액을 사용하여 최종 50㎕의 부피로 Expand HiFi 폴리머라제(Roche)를 사용하여 수행하였다. 5' 단편 반응물은 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 50pmole(Seq ID No. 18 플러스 Seq ID No. 20), 100ng pCIF8, 및 2.5 단위의 Expand 폴리머라제를 포함하는 1x 완충액을 포함하였다. 여섯 개의 3' 단편 반응물을 셋업하였고 이는 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 50pmole(Seq ID No. 19 플러스 Seq ID No. 21, 22, 23, 24, 25 또는 26),100ng pCIF8, 및 2.5 단위의 Expand 폴리머라제를 포함하는 1x 완충액을 포함하였다. 상기 반응을 이어서 초기의 변성을 위해 94℃에서 2분간 가열한 후 하기 온도 및 시간의 주기 반응을 하였다: 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초. 상기 반응물을 20회 주기 반응하고 이어서 72℃에서 10분간 두어 모든 가닥의 중합의 완결을 담보하였다.
각각의 PCR의 반을 1% 아가로스겔에서 분리하고 226bp의 5' 단편 및 6개의 상이한 292bp의 3' 단편을 겔에서 잘라내어 Qiagen Gel Extract 키트를 사용하여 정제하였다. 5'단편을 이어서 다음과 같이 각각의 3'단편에 연결하였다: 주형으로서 2㎕의 용출된 5'단편을 2㎕의 각각의 6개의 용출된 3'단편과 사용하여 Seq ID No. 18 및 Seq ID No. 19를 프라이머로 하여 Expand HiFi 폴리머라제를 사용하여 상기 기술된대로 6개의 추가의 PCR을 수행하였다. 각각의 이들의 반응물의 반을 1% 아가로스겔에서 전기영동으로 분리하고 486bp의 6개의 밴드를 상기 기술한대로 정제하였다. 각각의 PCR 산물을 제한효소 PspOMI 및 SphI으로 총 부피 50㎕로 37℃에서 하룻밤 처리하였다. 4㎕ 플라스미드 pCIF8을 유사하게 37℃에서 2시간 처리하고 상기 플라스미드의 반 및 PCR 단편 절단물을 1% 아가로스겔에 걸었다. 7.2kbp의 벡터밴드 및 391bp의 PCR 산물을 겔에서 잘라내고 상기와 같이 정제하여 물에 각각 30㎕ 최종 부피로 하였다. 표준 10㎕ 라이게이션 반응에서 T4 DNA 라이게이즈 및 공급된 완충액(Invitrogen)을 사용하여 벡터 1㎕를 3㎕의 각각의 6개 단편에 라이게이션하였다. 상기 반응물을 실온에서 4시간 동안 두었다. 각각의 라이게이션 반응물 1㎕를 20㎕의 전기천공될 수 있는E.coli세포주 XL1-blue(Stratagene)로 0.1cm 간격 큐벳을 사용하여 공급자의 권고대로 전기천공하였다. 상기 세포를 재현탁하여 공급자가 또한 권고하는 대로 회복하도록 두었다. 전기천공된 세포의 10㎕ 및 100㎕ 분취물을 100㎕/ml의 암피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트상에 깔고 37℃에서 하룻밤 키웠다.
플레이트에 펴발린 각각의 라이게이션에서 4개의 콜로니를 취하여 2YT 브로쓰 플러스 100㎕/ml 암피실린의 5ml 액상 배양으로 격렬한 교반을 하며 37℃에서 하룻밤 키웠다. Qiagen Mini-Prep 키트를 사용하여 각각 배양물의 1.5ml에서 DNA를 추출하였다. 각각의 플라스미드의 시료를 프라이머 Seq ID No.18을 사용하여 DNA 서열분석 하였다. 정확한 서열을 가지고 있는 4로 이루어진 각각의 군에서 하나의 플라스미드를 선택하여 전달이입으로 활성도 및 발현수준 분석을 위해 보관하였다.
동일한 일반 절차에 따라 I1208, I1209 및 M1210에서의 돌연변이를 생성하였다. 각각이 아미노산에 사용된 프라이머는 다음과 같았다:
I1208:
I1209:
M1210:
서열분석으로 검증된 각각의 돌연변이 클론을 상기 기술한 대로 두 벌씩으로 24웰 폴리-L-리신 플레이트에서 HEK 293 세포에 전달이입하였다. 전달이입물은 37℃/5% C02에서 48 시간 동안 배양하였다. 각각의 전달이입에 대한 두 벌씩의 상층액을 풀링하고 상기 기술한대로 펙터 VIII 활성도에 대해 분석하였다.
한쌍의 항-펙터 VIII 항체 ELISA 키트(Affinity Bioloicals)를 사용하여 펙터 VIII 발현 수준에 대해 상층액을 또한 분석하였다. 상기 분석은 조직 배양 상층액 물질을 효과적으로 정량하기 위해 변형되었으며 하기와 같이 수행하였다: 포섭 항체를 소디움 카르보네이트/바이카르보네이트 완층액 pH9.6에 1/100으로 희석하고 Dynex Immulon 4 96 웰 ELISA 플레이트에 웰당 100㎕를 첨가하였다. 상기 플레이트를 4℃에 하룻밤 두었다. 상기 웰을 100㎕의 각각의 세척 완충액(0.1% Tween 20을 포함하는 트리스 완충 식염수[TBS:25mM Tris, 137mM NaCl, 3mM KCl, 25℃에서 pH7.4])으로 4번 세척하였고 희석 표준물 및 조직 배양 상층액의 두 벌씩의 100㎕ 분취물을 웰마다 추가하였다. 표준물은 펙터 VIII 활성(Chromogenix)에 대한 국제 표준에 대하여 정량된 동결건조된 플라즈마 시료이었다. 플라즈마 하나의 바이알을 제조사가 기술한 대로 1ml의 물에 재구성하였다. 첨부된 데이터 지를 플라스마 중의 펙터 VIII 활성 수준을 알기 위해 참조하였고 이는 이어서 시료 희석 완충액(1% w/v의 보바인 혈청 알부민을 포함하는 TBS)을 첨가하여 100%(1IU/ml)로 희석하였다. 이를 이어서 시료 희석 완충액으로 4중 1로 희석하여 100% ELISA 표준을 만들었다. 이를 이어서 시료 희석 완충액으로 추가로 희석하여 75%, 50%, 25% 및 5%의 표준을 만들었다. 조직 배양 상층액은 시료 희석 완충액으로 4분의 1로 희석하였다. 상기 플레이트를 2시간 동안 실온에서 배양하고 세척 완충액웰당 100㎕로 4번 세척하였다. 웰당 100㎕의 호스 래디쉬 퍼옥시다제 콘쥬게이트 항체를 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 두었다. 상기 플레이트를 종전과 같이 세척한 후 웰당 100㎕의 기질(즉시 사용하도록 제조된 TMB/퍼옥시다제 용액: Sigma cat no. T0440)을 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 15분 동안 둔 후 중단 용액(2M 황산)을 첨가하였다. 상기 플레이트를 450nm 필터를 사용하여 Anthos HTII 플레이트 판독기에서 판독하였다.
활성 값 및 발현 수준의 비교는 F1207에 대한 모든 변화는 발현의 손실 및 이에 따른 활성도의 손실을 초래한 것을 나타내었다. I1208의 A로의 돌연변이는 미변형된 펙터 VIII과 유사한 발현 및 활성도를 초래하였고 반면 T 및 N 으로의 변화는 활성에 있어 25% 및 50%의 손실을 초래하였다. I1209의 경우에, 단지 C로의 돌연변이만이 발현되었으며 이러한 변이체의 활성도는 미변형된 펙터 VIII과 유사하였다. M1210에 대한 모든 변화는 미변형된 펙터 VIII과 구별되지 않는 K 및 N의 상당한 활성을 갖는 단백질의 발현을 초래하였다. 그러므로, I1208A, I1209C, M1210K 및 M1210N은 펩티드 10내에서 T 세포 에피토프의 제거를 위한 유용한 돌연변이다.
펩티드 8의 아미노산의 돌연변이화(표 2)
펩티드 8은 MHC 클래스 II 분자에의 결합에 대한 잠재적 일차 고정자인 두개의 아미노산을 포함한다: I1011 및 M1013(번호매김은 성숙한 B 도메인 결실된 서열에 따름). 그러므로 이들 두 잔기가 잠재적으로 일차 고정자가 일 수 있는 것 이외의 잔기로의 돌연변이에 대한 표적이 되었다. 다른 종(예를 들면 개, 마우스 및 래트)의 펙터 VIII 서열에 대한 비교는 개의 펙터 VIII에서 M1013은 K라는 것을 밝혀내었다. K는 또한 펩티드 10의 돌연변이화에 있어서 M1210에 대한 가장 좋은 대체 아미노산으로 나타냈다. 그러므로 M1013은 K 단독 및 일차 고정자를 형성할 잠재성을 갖지 않는 I1011에서의 모든 아미노산(예를 들면, A, C, D, E, K, N, P, Q, R, S, T)과의 조합으로 돌연변이되었다.
돌연변이화는 기술분야의 당업자에게 주지된 확립된 프로토콜을 사용하여 중첩 PCR로 수행하였다. 펩티드 8은 PflM1 및 PspOMI 제한효소로 경계지워진 펙터 VIII 뉴클레오티드 서열 490bp 단편내에 놓여 있다. 이들 단편의 증폭을 위한 PCR 프라이머를 이 도메인 바로 바깥 서열에 상응하는 것으로 합성하였다 (하기의 Seq ID No.40 및 No.41). M1013K 플러스 I1011X의 돌연변이화의 경우, 하기에 기술된 대로 내부 프라이머를 합성하여 사용하였다:
돌연변이화는 상기 펩티드 10에 대한 돌연변이화에 대해 기술된 것과 5' 단편의 길이가 62bp이고 3'단편이 492bp라는 것만을 제외하고는 동일한 일반 절차를 이용하여 수행하였다. 연견될 단편은 534bp 길이이며 PflM1 및 PspOMI로 잘려 유사하게 잘린 pCIF8로 직접 클로닝하였다.
정확한 서열을 갖는 하나의 클론을 각각의 돌연변이에 대해 선택하고 이들의활성 및 발현 수준을 전달이입을 세벌씩으로 한 것 및 각각의 상층액을 개별적으로 분석하여 발현/활성의 변이를 평가할 수 있도록 하는 것만을 제외하고는 상기 기술된대로 분석하였다.
상기 돌연변이에 대한 발현 수준 및 활성도의 비교는 M1013K만이 미변형된 펙터 VIII에 매우 유사하다는 것을 나타내었다. 추가로, M1013K 플러스 I1011A, E, P, S 또는 T를 포함하는 조합 돌연변이도 또한 미변형된 펙터 VIII과 구분되지 않았다. 따라서, 이러한 돌연변이가 펩티드 8과 연관된 T 세포 에피토프의 제거에 유용한 것이다.
펩티드 7의 아미노산의 돌연변이화(표 2)
펩티드 7은 MHC 클래스 II 분자에의 결합에 대한 잠재적 일차 고정자인 한 개의 아미노산, V823을 포함한다(번호매김은 성숙한 B 도메인 결실된 서열에 따름). 그러므로 이 잔기가 잠재적으로 일차 고정자 일 수 있는 것 이외의 잔기(예를 들면, A, C, D, E, K, N, P, Q, R, S, T)로의 돌연변이에 대한 표적이 되었다. 돌연변이화는 종전과 같이 확립된 프로토콜을 사용하여 중첩 PCR로 수행하였다. 펩티드 7은 AvrII 및 PflM1 제한효소로 경계지워진 펙터 VIII 핵산 서열 766bp 단편내에 놓여 있다. 이 단편의 증폭을 위한 PCR 프라이머를 이 도메인 바로 바깥 서열에 상응하는 것으로 합성하였다 (하기의 Seq ID No.57 및 No.58). V823X의 돌연변이화의 경우, 하기에 기술된대로 내부 프라이머를 합성하여 사용하였다:
돌연변이화는 펩티드 10(상기) 에 대한 돌연변이화에 대해 기술된 것과 5' 단편의 길이가 320bp이고 3'단편이 606bp라는 것만을 제외하고는 동일한 일반 절차를 이용하여 수행하였다. 연견될 단편은 894bp 길이이며 AvrII 및 PflMI으로 잘려 유사하게 잘린 pCIF8로 직접 클로닝하였다.
정확한 서열을 갖는 하나의 클론을 각각의 돌연변이에 대해 선택하고 이들의 활성 및 발현 수준을 상기 기술된대로 분석하였다. 전달이입은 두 벌씩으로 수행하였으며 상층액을 분석 전에 풀링하였다.
상기 돌연변이에 대한 발현 수준 및 활성도 비교는 발현 수준 및 활성도에 실질적으로 영향을 미치지 않고 다양한 변화를 가할 수 있다는 것을 나타내었다. 이러한 데이터는 도 7에 나타내었다. V823의 A, D, E, G, H, N, P, S 또는 T로의 변경은 적어도 wt 펙터 VIII의 것과 동등한 발현 및 활성을 갖는 돌연변이를 만들었다. 따라서, 이러한 돌연변이가 펩티드 7과 연관된 T 세포 에피토프의 제거에 유용한 것이다.
실시예 3
돌연변이를 포함하는 FVIII 유래된 펩티드를 합성하고 생체밖 분석을 사용하여 이들의 T-세포의 증식을 계속적으로 촉진하는 능력에 대해 시험하였다. 상기 펩티드는 15mer 서열이며 M1013K와의 조합으로 치환 I1011A 또는 I1011T를 시험하기 위해 디자인되었다. 상기 펩티드를 종전에 야생형 펩티드 서열에 반응성을 나타낸 것으로 보여진 4개의 PBMC 제공자 시료를 사용하여 시험하였다. 모든 경우에 있어 시험된 돌연변이 펩티드는 SI>2.0로 증식을 자극할 수 없었다. 제공자의 알로타입의 상세한 정보를 포함하는 이러한 분석의 결과 및 펩티드 서열은 도 8에 나타낸다.
PBMC를 웰당 2x106PBMC의 밀도로 96웰 편편한 바닥 플레이트에서 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다. PBMC를 7일 동안 37℃에서 배양한 후3H-티미딘으로 펄스하였다. 펩티드는 특정된 치환을 갖게 생성하였으며 각각의 펩티드는 FVIII P8 펩티드 서열에 대해 종전에 반응성을 나타낸 것으로 보여진 4명의 건강한 제공자로부터 분리된 PBMC에 대하여 개별적으로 스크리닝되었다. 인플루엔자 헤마글루티닌 및 강력한 비회상 항원인 키홀림펫 헤모시아닌(KLH) 유래의 대조 펩티드가 각각의 제공자 분석에 사용되었다.
펩티드를 최종농도 10mM로 DMSO 중에 용해하고, 이 스톡 용액을 이어서1/500으로 AIM V 배지에 희석하였다(최종 농도 20μM). 펩티드를 편편한 바닥의 96웰 플레이트에 첨가하여 100㎕ 중에 최종 농도가 2μM 및 20μM가 되었다. 해동된 PBMC의 생활도는 트리판 블루 염색 배제법으로 평가하였고, 세포를 이어서 2x106세포/ml의 밀도로 재현탁하였고, 100㎕(2x105PBMC/ml)를 펩티드를 포함하는 각 웰에 전달하였다. 세벌씩의 웰 배양물을 각각의 펩티드 농도에서 분석하였다. 플레이트를 가습된 5% CO2의 대기에서 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 세포를 1μCi3H-Thy/웰로 18-21 시간 펄스한 후 필터 매트로 수집하였다. CPM 값은 Wallac microplate beta top plate counter(Perkin Elmer)를 사용하여 결정하였다. 결과는 시험 펩티드에 대한 CPM 값을 비처리된 웰의 CPM 값으로 나누어 계산한 자극지수로 표현하였다. 2를 초과하는 자극지수는 양성 증식으로 간주된다.
Claims (16)
- 미변형된 인간 펙터 VIII 보다 실질적으로 비면역원성이거나 또는 더 낮은 면역원성이며 생체에서 사용시 본질적으로 동일한 생물학적 활성 및 특이성을 갖는 변형된 인간 펙터 VIII 분자로, 미변형된 모 분자와 비교하여 특이적으로 변경된 아미노산 잔기를 함유하며, 여기에서 상기 변경된 아미노산 잔기는 미변형된 모 분자에서 MHC 클래스 II 결합 리간드로 작용하고 T-세포를 자극하는 하나 이상의 T-세포 에피토프의 감소 또는 제거를 야기하는 변형된 인간 펙터 VIII 분자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 변경은 표 1에 나타낸 모 분자에 존재하는 하나 이상의 연속된 아미노산 잔기 스트링내의 하나 이상의 위치에서 만들어지는 변형된 펙터 VIII 분자.
- 제 2 항에 있어서, 상기 변경은 표 2에 나타낸 모 분자에 존재하는 하나 이상의 연속된 아미노산 잔기 스트링내의 하나 이상의 위치에서 만들어지는 변형된 펙터 VIII 분자.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경은 1-9 아미노산 잔기의 치환인 변형된 펙터 VIII 분자.
- 제 4 항에 있어서, 표 1에 나타낸 서열 스트링의 하기의 위치에서 하나, 그 이상 또는 모든 아미노산 잔기가 치환된 변형된 펙터 VIII 분자:
- 제 3 항에 있어서, 표 2의 스트링 P10에서, 하나, 그 이상 또는 모든 하기의 아미노산 잔기 치환이 수행된 변형된 펙터 VIII 분자:I1208A, I1208T, I1208N; I1209C; M1210K, M1210N.
- 제 3 항에 있어서, 표 2의 펩티드 P8에서, 하나, 그 이상 또는 모든 하기의 아미노산 잔기 치환이 수행된 변형된 펙터 VIII 분자:
- 제 3 항에 있어서, 표 2의 펩티드 P7에서, 하나, 그 이상 또는 모든 하기의 아미노산 잔기 치환이 수행된 변형된 펙터 VIII 분자:
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 T-세포의 유도된 세포성 증식의 생물학적 분석에서 전 단백질로서 동일한 제공자 유래의 세포를 사용하여 병행으로 시험된 경우 모 분자보다 더 적은 자극 지수(SI) 및 2 보다 적은 자극지수를 나타내며 여기에서 상기 지수는 단백질로의 자극 후에 값을 매긴 세포성 증식 값으로 간주되고, 단백질을 받지 않은 대조군 세포에서 매겨진 세포성 증식 값으로 나누어지며, 여기에서 세포성 증식은 임의의 적합한 수단으로 측정되는 변형된 펙터 VIII 분자.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에서 정의된 대로의 펙터 VIII 분자를 코딩하는 DNA 서열.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 변형된 펙터 VIII 분자, 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함께 함유하는 약학 조성물.
- 잠재적 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고 미변형된 인간 펙터 VIII의 일차 서열로부터 생성된 표 1에서 선택된 펩티드 분자로, 이에 의한 상기 펩티드 분자는 세포성 증식의 생물학적 분석에서 >1.8의 자극지수를 가지며, 여기에서 상기 지수는 펩티드로의 자극 후에 값을 매긴 세포성 증식 값으로 간주되고, 펩티드를 받지 않은 대조군 세포에서 매겨진 세포성 증식 값으로 나누어지며, 여기에서 세포성 증식은 임의의 적합한 수단으로 측정되는 펩티드 분자.
- 2 미만의 자극지수로 표현되는 감소되거나 또는 결여된 잠재적 MHC 클래스 II 결합 활성을 가지며, 아미노산 치환에 의해 제 12 항의 펩티드 분자에서 유래한 변형된 펩티드 분자로, 이에 의한 상기 지수는 펩티드로의 자극 후에 값을 매긴 세포성 증식 값으로 간주되고, 펩티드를 받지 않은 대조군 세포에서 매겨진 세포성 증식 값으로 나뉘어지며, 여기에서 세포성 증식은 임의의 적합한 수단으로 측정되는 변형된 펩티드 분자.
- 제 12 항 또는 제 13 항의 펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
- 제 1 항에 정의된 변형된 펙터 VIII 분자의 제조를 위한 제 13 항에 따른 펩티드의 용도.
- 환자에서 펙터 VIII에 대한 면역원성을 감소시키기 위한 백신의 제조를 위한 제 12 항에 따른 펩티드의 용도.
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