MXPA04010061A

MXPA04010061A - Factor viii modificado.

Info

Publication number: MXPA04010061A
Application number: MXPA04010061A
Authority: MX
Inventors: Baker Matthew
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2004-12-13
Also published as: JP2005538694A; WO2003087161A1; EP1495052B1; CN1646564A; EP1495052A1; PL371278A1; US20050256304A1; ES2319758T3; ATE412671T1; AU2003232482A1; CA2482926A1; EP1495052B9; RU2004133761A; KR20040103970A; BR0308860A; DE60324406D1

Abstract

La invencion se refiere a la modificacion del Factor VIII humano (FVIII) para resultar en proteinas de FVIII que son substancialmente no inmunogenicas o menos inmunogenicas que cualquier contraparte no modificada cuando se usa in vivo. La invencion se refiere ademas a peptidos del epitopo de celulas T derivados de la proteina no modificada, por medio de los cuales es posible crear variante modificadas de FVIII con inmunogenicidad reducida.

Description

FACTOR VIII MODIFICADO Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos que van a administrarse especialmente a humanos y en particular para el uso terapéutico. Los polipéptidos son polipéptidos modificados por medio de los cuales la modificación resulta en una propensión reducida del polipéptido para obtener una respuesta inmune luego de la administración al sujeto humano. La invención se refiere en particular, a la modificación del Factor VIII de humano (FVIII) que resulta en proteínas FVIII que son sustancialmente no inmunogénicas o menos inmunogénicas que cualquiera de sus contrapartes no modificadas cuando se usan in vivo. La invención se refiere además, a péptidos epítopos de células T derivados de las proteínas no modificadas por medio de las cuales es posible crear variantes del FVIII modificado con inmunogenicidad reducida . Antecedentes de la Invención Existen muchos ejemplos en donde la eficacia de una proteína terapéutica se ve limitada por una reacción inmune no deseada para la proteína terapéutica. Varios anticuerpos monoclonales de ratón han demostrado ser una promesa como terapias en un número de situaciones de enfermedades humanas, pero que en ciertos casos han fallado debido a la inducción REF: 158135 de grados significativos de una respuesta del anticuerpo antimurino de humano (HAMA) [Schroff, R. W. et al (1985) Cáncer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. et al (1985) J. Immunol. 135 : 1530-1535] . Para los anticuerpos monoclonales , se han desarrollado un número de técnicas en un esfuerzo por reducir la respuesta del HAMA [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667] . Estas metodologías de ADN recombinantes han reducido generalmente la información genética en el constructo del anticuerpo final aunque se incrementa la información genética en el constructo final. No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes han obtenido aún en varios casos, una respuesta inmune en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Inmuno1. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417-1420] . Los anticuerpos no son la única clase de molécula de polipeptido administrada como un agente terapéutico contra la cual puede montarse una respuesta inmune. Incluso las proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de aminoácidos como se presentan dentro de humanos, pueden aun inducir una respuesta inmune en humanos. Ejemplos notables incluyen el uso terapéutico del factor de estimulación de colonias de granulocitos macrófagos [ adhwa, M. et al (1999) Clin. Cáncer Res. 5: 1353-1361] y el alfa 2 de interferón [Russo, D. et al (1996) Bri . J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. et al (1998) New Engl . J. Med. 318: 1409-1413]. En tales situaciones, cuando estas proteínas de humano son inmunogénicas, existe una ruptura supuesta de tolerancia inmunológica que por otra parte ha estado operando en estos sujetos para estas proteínas. Esta situación difiere cuando la proteína de humano se administra como una terapia de reemplazo, por ejemplo, en una enfermedad genética en donde existe una carencia en la constitución de la proteína, tal como puede ser el caso de enfermedades tales como la hemofilia A, la enfermedad de Christmas, enfermedad de Gauchers y otros ejemplos más. En tales casos, la proteína de reemplazo terapéutico puede funcionar inmunológicamente como una molécula exterior desde el principio, y en donde los individuos son capaces de elevar una respuesta inmune a la terapéutica, es probable que la eficacia de la terapia esté significativamente comprometida. Independientemente de si la proteína terapéutica es vista por el sistema inmune hospedero como una molécula externa, o si se supera una tolerancia existente para la molécula, el mecanismo de la reactividad inmune a la proteína es el mismo. La clave para la inducción de una respuesta inmune es la presencia dentro de la proteína de péptidos que puede estimular la actividad de las células T vía la presentación de las moléculas tipo II MHC llamadas "epítopos de células T" . Tales epítopos de células T se definen comúnmente como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos con la capacidad para enlazar moléculas tipo II MHC. Implícitamente, un "epítopo de células T" significa un epítopo que cuando se enlaza a las moléculas MHC puede reconocerse por un receptor de células T (TCR) , y que puede al menos al principio, provocar la activación de estas células T mediante el acoplamiento a TCR para promover una respuesta de células T. Las moléculas tipo II MHC son un grupo de proteínas altamente polimórficas que juegan un papel central en la selección y activación de las células T. El grupo DR de antígenos de leucocitos de humano (HLA-DR) son el isotipo predominante de este grupo de proteínas, sin embargo, los isotipos HLA-DQ y HLA-DP realizan funciones similares. En la población humana, los individuos llevan de dos a cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos alelos DP. Existen aproximadamente 70 alotipos diferentes del isótopo DR, 30 alotipos diferentes para DQ y 47 diferentes alotipos para DP. La estructura de un número de moléculas DR ha sido resuelta y se presenta como una ranura de enlace de péptidos abierta en un extremo, con un número de cavidades hidrofóbicas que se acoplan a los residuos hidrofóbicos (residuos de cavidad) del péptido [Brown et al Nature (1993) 364: 33; Stern et al (1994; Nature 368 : 215] . La molécula DR MHC se elabora a partir de una cadena alfa y beta que se inserta en su terminal C a través de la membrana celular. Cada heterodímero posee un dominio de enlace a ligando, que enlazan a péptidos que varían de entre 9 y 20 aminoácidos en longitud, a pesar de que la ranura de enlace puede acomodar un máximo de 11 aminoácidos. Las moléculas DQ han demostrado recientemente tener una estructura homóloga y se espera que las proteínas de la familia DP sean muy similares. El polimorfismo que identifica a los diferentes alotipos de las moléculas tipo II, contribuye a una diversidad muy amplia de superficies de enlace diferentes para los péptidos dentro de la ranura que enlaza péptidos, y asegura la máxima flexibilidad al nivel de la población con respecto a la capacidad para reconocer a las proteínas externas y elevar una respuesta inmune para los organismos patogénicos. Una respuesta inmune para una proteína terapéutica actúa vía la trayectoria de presentación del péptido tipo II MHC. En la presente, las proteínas exógenas se sumergen y procesan para la presentación en asociación con las moléculas tipo II MHC del tipo DR, DQ o DP. Las moléculas del tipo II MHC se expresan mediante células que presentan antígenos profesionales (APC) , tales como macrófagos y células dendríticas entre otras. El acoplamiento de un complejo de péptido de tipo II MHC mediante un receptor de células T similar en la superficie de la célula T, junto con el enlace transversal de ciertos co-receptores tales como la molécula CD4 , puede inducir un estado activado dentro de la célula T.

La activación conduce a la liberación de citocinas además de la activación de otros linfocitos tales como las células B, para producir anticuerpos o activar a las células asesinas T como una respuesta inmune celular completa. La identificación del epítopo de células T es la primera etapa para la eliminación del epítopo, sin embargo, existen pocos casos claros en el arte en los cuales la identificación del epítopo y la eliminación del epítopo se integren a un esquema simple. Así, la WO 98/52976 y la WO00/34317 enseñan la metodología computacional para identificar las secuencias de polipéptidos con el potencial para enlazar un subconjunto de alotipos D de tipo II MHC. En estas enseñanzas, los epítopos de células T pronosticados se eliminan mediante la sustitución juiciosa de aminoácidos dentro de la proteína de interés. Sin embargo, con este esquema y otros procedimientos basados en el cómputo para la identificación de epítopos [por ejemplo, Godkin, A. J. et al (1998) J". Immunol. 161 : 850-858; Sturniolo, T. et al (1999) iVat. Biotechnol . 17: 555-561], péptidos pronosticados para ser capaces de enlazar moléculas del tipo II MHC pueden no funcionar como epítopos de células T en todas las situaciones, particularmente in vivo debido a los efectos de la trayectoria de procesamiento u otros fenómenos. Además, las metodologías computacionales para la predicción de los epítopos de células T no han podido en general, predecir epítopos con una restricción DQ o DP a pesar de que en general existe un traslape para el reconocimiento entre estos sistemas. Además de las técnicas computacionales, existen métodos in vi tro para medir la capacidad de los péptidos sintéticos para enlazar moléculas del tipo II MHC. Un método ejemplar usa líneas de células B de alotipos MHC definidos como una fuente de superficie que enlaza moléculas del tipo II MHC y que puede aplicarse a la identificación del ligando de las moléculas del tipo II MHC [Marshall, K. . et al (1994) J". Immunol. 152 : 4946-4956; O'Sullivan et al (1990) J". Immuno1. 145: 1799-1808; Robadey, C et al (1997) J". Tmmunol . 159 : 3238-3246] . Sin embargo, tales técnicas no están adaptadas para proyectar epítopos potenciales múltiples contra una amplia diversidad de alotipos MHC, ni pueden confirmar la capacidad de un péptido de enlace para funcionar como un epítopo de células T. Han entrado en uso recientemente, técnicas que aprovechan complejos solubles de moléculas MHC recombinantes en combinación con los péptidos sintéticos [Kern, F. et al (1998) iVature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. et al (2001) TRENDS in Immunol. 22_: 583-588]. Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones de células T a partir de las muestras sanguíneas de sujetos humanos o animales experimentales que son capaces de enlazar complejos de péptido MHC particulares. Tampoco estos procedimientos se adaptan fácilmente a la proyección de epítopos potenciales múltiples para una amplia diversidad de alotipos MHC. Los ensayos biológicos de activación de células T ofrecen una opción particular para proporcionar una lectura de la capacidad de un péptido de prueba, o una secuencia de proteína completa, para evocar una respuesta inmune. Ejemplos de esta clase de metodología incluyen el trabajo de Petra et al., usando ensayos de la proliferación de las células T a la estafilocinasa de la proteína bacteriana, seguido por el mapeo de epítopo usando péptidos sintéticos para estimular las líneas de células T [Petra. A. M. et al (2002) J. Immunol. 168: 155-161] . Similarmente , los ensayos de proliferación de células T que usan péptidos sintéticos de la proteína de toxina del tétano, han resultado en una definición de las regiones inmunodominantes de la toxina [Reece, J. C. et al (1993) J. Inmmunol . 151 : 6175-6184] . La O99/53038 describe una metodología por medio de la cual los epítopos de células T en una proteína pueden determinarse usando subconjuntos aislados de células inmunes de humanos, que promueven su diferenciación in vitro y cultivan las células en presencia de péptidos sintéticos de interés, y miden cualquier proliferación inducida en las células T cultivadas. La misma técnica se describe también por Stickler et al [Stickler, . M. et al (2000) J. Immunotherapy 22_: 654- 660] , cuando en ambos ejemplos, el método se aplica a la detección de epítopos de células T dentro de la subtilisina bacteriana. Tal técnica requiere la aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento celular y cultivo celular con suplementos de citosina múltiples, para obtener los subconjuntos de células inmunes deseadas (células dendríticas, células T CD4+ y o CD8 ) y no es conducente a una separación por exclusión de producción rápida usando muestras de donadores múltiples. Como se describe arriba y como consecuencia de ello, sería deseable identificar y eliminar o al menos reducir epítopos de células T dados a partir de un péptido, polipéptido o proteína originalmente inmunogénicos pero en principio, terapéuticamente valiosos. Una de estas moléculas terapéuticamente valiosas es el FVIII. La presente invención proporciona formas modificadas de FVIII de humano con uno o más epítopos de células T eliminados. El FVIII es un factor de coagulación dentro de la trayectoria intrínseca de la coagulación sanguínea. El FVIII es un cofactor para el factor IXa que, en presencia de iones calcio y fosfolípidos, convierte el factor X a la forma Xa activada. La genética molecular del FVIII no se estudia bien en lo más mínimo como defectos en el gen enlazado X para que el FVIII dé lugar a la hemofilia A. El gen del FVIII codifica dos transcriptos empalmados alternativamente dando lugar a la isoforma A de FVIII de la glicoproteína grande y a la isoforma B más pequeña. En estado nativo la degradación múltiple o las formas procesadas derivadas del precursor de la isoforma A, pueden identificarse y las actividades funcionales particulares han sido atribuidas a los fragmentos particulares. La molécula de FVIII se divide en 6 dominios estructurales, un dominio A triple (Al, A2 , A3) , un dominio central prescindible y rico en carbohidratos (dominio B) y un dominio C duplicado (Cl, C2) . Los sitios de escisión proteolíticos FVIII para la trombina y el factor Xa se presentan después de los residuos 372, 740 y 1689. La escisión de Xa en conjunto con la proteína C activada C se presenta después del residuo 336. La proteína del FVIII puede ser definida funcionalmente como un factor capaz de corregir el defecto de coagulación en el plasma derivada de pacientes afectados por la hemofilia A. Para el tratamiento de la hemofilia A, la FVIII ha sido producida en forma purificada a partir de un plasma de porcino o humano, y recientemente mediante tecnologías de ADN recombinante . El gen FVIII de humano se aisló y se expresó en células de mamíferos mediante al menos 2 grupos de laboratorios independientes en 1984 [Toóle, J. J. et al. 81984), Nature 312: 342-347; Gitschier, J. , et al (1984), Nature 312 330-337; Wood, . I., et al. (1984), Nature 312 330-337; Venar, G. A.., et al. (1984), Nature 312: 337-342; O87/04187; WO88/08035; VIO88/03558 US., 4,757,006] . La secuencia de aminoácidos se dedujo a partir del cADN y los métodos para la producción recombinante de cantidades terapéuticas de FVIII que han sido desarrollados, por ejemplo, la US 4,965,199 describe un método para producir FVIII en células hospedadoras de mamífero y la purificación de FVIII de humano. La expresión de FVIII de humano en células CHO (ovarios de hámster chino) y BHKC (células de riñon de hámster bebé) ha sido reportada recientemente, y la FVIII ha sido modificada para eliminar parte o todo el dominio B [Patente norteamericana No. 4,868,112] tal molécula ha demostrado ser eficaz en pruebas clínicas [Luster, J. M. et al (2003) Haemophilia 9: 38-49] . De hecho, esta molécula está licenciada para usar -Refacto el cual se hace bajo colaboración entre el Instituto de Genética y Pharmacia Upjohn en células CHO. A pesar de la disponibilidad de las cantidades terapéuticas de FVIII, existe una necesidad continua de análogos de FVIII con propiedades mejoradas. Las mejoras deseadas incluyen esquemas y modalidades alternas para la expresión y purificación de la proteína, pero también y especialmente, una mejora en las propiedades biológicas de la proteína. Existe una necesidad particular de mejorar las características in vivo cuando se administran como un terapéutico. A este respecto, es altamente deseable proporcionar FVIII con potencial reducido o ausente para inducir una respuesta inmune en el sujeto humano. Tales proteínas esperarían mostrar un tiempo de circulación incrementado dentro del sujeto humano y serían benéficas particularmente en enfermedades recurrentes y crónicas establecidas tales como es el caso de la hemofilia A, en particular, en casos en donde los hemofílieos puedan ser sensible al factor FVIII recombinante exógeno y que podría por otra parte, desarrollar anticuerpos VIII anti-factor que podrían limitar la efectividad del tratamiento. Otros han proporcionado moléculas FVIII y en particular, FVIII modificados recombinantes [US 4,757,006; US 5,633,150; US 5,668,108], pero ninguna de estas enseñanzas reconoce la importancia de los epítopos de las células T para las propiedades inmunogénicas de la proteína ni han concebido la influencia directa de estas propiedades en una forma controlada y específica de acuerdo al esquema de la presente invención . Los ejemplos no exhaustivos en el arte para la modificación de FVIII incluye la US 5,948,407 en donde se describen esquemas para producir formulaciones que permitan la administración mucosa (por ejemplo, oral) de la proteína con el propósito de evocar un repertorio de células T supresoras al antígeno de la proteína terapéutica. Se han intentado otras modificaciones para la FVIII con el propósito de mejorar la vida media in vivo en el sujeto hemofílico, por ejemplo, la US 6,037,452 describe los conjugados del factor VIII poli (óxido de alquileno) . Una complicación particular en la terapia de la hemofilia A es la inducción en ciertos pacientes de anticuerpos inhibidores para la preparación de FVIII administrada. Se ha avanzado en varias estrategias para superar la respuesta inmunológica al FVIII en los hemofílicos. La tolerancia a la terapia de inducción es una metodología que requiere comúnmente de una dosis muy grande (y costosa) de una preparación de FVIII que va a ser administrada a edad temprana en un hemofílico. La metodología es exitosa solamente al lograr una tolerancia en una proporción de casos [Colowick, A. B. et al (2000) Blood 96: 1698-1702] . Los ensayos clínicos de dos diferentes productos recombinantes en sujetos no tratados previamente, reportaron un desarrollo inhibidor alrededor del 20% de los casos [Lusher, J. M. et al (1993) N. Engl . J. Med 328: 453-459; Bray, G. L. et al (1994) Blood 82:2428-2435] . Los inhibidores FVIII son anticuerpos de inmunoglobulina que neutralizan la actividad de la FVIII en el plasma. Los inhibidores surgen como aloanticuerpos en aproximadamente el 25% de los pacientes con hemofilia A severa, y de 5 a 15% de los pacientes con enfermedad de media a moderada, que se tratan con concentrados FVIII o FVIII recombinantes.

Para pacientes con un tratamiento inhibidor se usa también el complejo del factor IX o "complejo de protrombina" . En general, son preparaciones mezcladas de factores diferentes múltiples que incluyen por ejemplo, factores II, IV, IX y X. La EP0044343-B1 proporciona tal complejo de protrombina que ofrece un componente (FVIIa) activado. De igual manera, la US 6,358,534 describe un complejo de protrombina inmunotolerante que comprende una proporción baja de proteína FVIII y proporciones relativamente altas de otros factores de proteína coagulada y proteínas portadoras. La US 5,543,145 proporciona composiciones para la supresión de la producción del inhibidor FVIII que comprende anticuerpos policlonales o monoclonales por ejemplo, en la forma de F(ab')2 mezclado con FVIII. La US 4,769,336 proporciona fragmentos FVIII que enlazan y bloquean por lo tanto a los inhibidores del anticuerpo de FVIII. Otras estrategias incluyen el uso de un factor porcino VIII en lugar de FVIII de humano, sin embargo, tal tratamiento es una medida temporal ya que el FVIII porcino es en sí mismo inmunogénico . Otras opciones disponibles incluyen el tratamiento con fármacos supresores inmunes y/o la eliminación de inhibidores a partir de la circulación mediante tratamientos extracorporales, y es comprensible que tales metodologías representan soluciones peligrosas y extremas al problema en mano. Las técnicas de ingeniería genética han proporcionado un alcance considerable para la modificación y la producción verdadera de moléculas FVIII para el uso terapéutico. El tratamiento y las composiciones farmacéuticas de la hemofilia A se proporcionan mediante las enseñanzas de la US 4,965,199; US 5,618,788 y la US 5,668,108 y sus equivalentes extranjeras deberán considerarse como ejemplos de un cuerpo grande de trabajos dentro del tema disponible en el arte. Ejemplos adicionales de tipos de modificación para FVIII, se efectúan usando metodologías recombinantes como las que se proporcionan en la US 5,859,204; US 6,376,463; US 6,485,563 y la US 6,180,371 que proporcionan colectivamente, proteínas FVIII y sus genes de codificación en los cuales, las sustituciones de sitio específicas han resultado en la reducción de la reactividad de un anticuerpo inhibidor. Particularmente en estas enseñanzas, las sustituciones se confinan a 484-509 aminoácidos del domino A de FVIII. Aunque tales modificaciones cambian la topología de superficie de la molécula FVIII, de manera que los epítopos conformacionales particulares ya no se reconocen por los anticuerpos particulares que reaccionan transversalmente en el suero del paciente, no se dirigen a los epítopos de las células T subyacentes requeridos para impulsar la producción de células B de los anticuerpos.

Otros han usado medios de ADN recombinante para proporcionar moléculas FVIII modificadas usando sustituciones de aminoácidos de sitio específico [WO87/07144] o intercalando dominios entre las moléculas relacionadas. Un ejemplo de metodología más reciente se proporciona en la WO90/05530 en donde se proporciona una molécula FVIII que contiene el dominio B del factor V de humano en lugar del dominio B de FVIII. Se han proporcionado incluso otras preparaciones de FVIII quiméricas, que comprenden moléculas FVIII recombinantes creadas mediante ingeniería genética para contener dominios de secuencias derivadas de porcino (u otras especies) y humano. Tales moléculas híbridas se describen en la US 5,774,446; US 5,663,060; US 5,583,209; US 5,364,771; US 5,888,974 y en otras partes. La US 5,171,844 proporciona moléculas FVIII creadas mediante ingeniería genética que pueden tener una actividad mejorada y o inmunogenicidad disminuida. La propiedad última se relaciona con la ausencia de secciones de la molécula por eliminación. El trabajo más reciente descrito en la US 4,868,112 y equivalentes extranjeras, proporcionan imitantes de eliminación funcionales de FVIII que carecen del dominio B. Otras modificaciones generadas mediante ingeniería genética para la proteína FVIII se han dirigido hacia la mejora en los procesos de producción para la proteína y los ejemplos particulares se proporcionan en la US 6,271,025. Este ejemplo se proporciona como ejemplo de un cuerpo grande de trabajos similares disponibles y conocidos en el arte. Descripción detallada de la Invención La presente invención proporciona formas modificadas del FVIII de humano, llamadas en la presente "FVIII", en las cuales la característica inmune se modifica por medio de números reducidos o eliminados de epítopos de células T potenciales. La invención describe secuencias identificadas dentro de la secuencia primaria FVIII que son epítopos de células T potenciales, en virtud de su potencial para enlazar moléculas tipo II MHC. Esta descripción pertenece específicamente por igual, a la proteína FVIII completa de humano en la isoforma A de 2332 residuos de aminoácido y una versión más pequeña en la cual el dominio B está ausente de la proteína. La invención describe también posiciones específicas dentro de la secuencia primaria de la molécula que de acuerdo a la invención son alteradas por la sustitución de aminoácidos específica, adición o eliminación a pesar de retener un máximo grado de la actividad biológica de la proteína. En casos en los que la pérdida de la inmunogenicidad puede lograrse sólo mediante una pérdida simultánea de la actividad biológica, es posible restaurar la actividad mediante alteraciones adicionales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína. La invención describe además, métodos para producir tales moléculas modificadas y sobre todos los métodos, identificar los epítopos de las células T que requieren alteración para reducir o eliminar los sitios inmunogenicos. La presente invención proporciona formas modificadas de las proteínas FVIII que se espera muestren propiedades in vivo mejoradas. La presente invención describe las principales regiones de la secuencia primaria FVIII, que son inmunogénicas en el hombre y que proporcionan la modificación de las secuencias para eliminar o reducir la efectividad inmunogénica de estos sitios. En una modalidad, los péptidos sintéticos que comprenden las regiones inmunogénicas pueden ser proporcionados en una composición farmacéutica para el propósito de promover una respuesta tolerogénica para la molécula completa. En una modalidad adicional, las moléculas FVIII modificadas de la presente invención pueden ser usadas en composiciones farmacéuticas. En resumen, la invención se refiere a las siguientes cuestiones : una molécula modificada que tiene actividad biológica de FVIII y es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquiera de las moléculas no modificadas que tienen la misma actividad biológica cuando se usan in vivo; una molécula específica correspondiente, en donde la pérdida de inmunogenicidad se logra mediante la eliminación de uno o más epítopos de células T derivados de la molécula originalmente no modificada; una molécula específica correspondiente, en donde pérdida de inmunogenicidad se logra mediante la reducción en el número de alotipos MHC capaces de enlazar péptidos derivados de la molécula; Una molécula específica correspondiente, en donde un epítopo de células T se elimina; Una molécula específica correspondiente, en donde dichos epítopos de células T presentes originalmente son secuencias de péptido o ligandos del tipo II MHC que muestran la capacidad para estimular o enlazar células T vía la presentación en la clase II; Una molécula específica correspondiente, en donde las secuencias de péptido se seleccionan a partir del grupo de péptidos a-k de arriba, en donde; a) ILLFAVFDEGKSWHS b) SYKSQYLNNGPQRIG, c) GPQRIGRKYKKVRFM, d) YKWTVTVEDGPTKSD, e) ASNIMHSINGYVFDS , f) = VAY YILSIGAQTDF, g) = MSSSPHVLRNRAQSG h) = CNIQMEDPTFKENYR i) = STLFLVYSNKCQTPL j) = ISQFIIMYSLDGKKW k) = IARYIRLHPTHYSIRSTLRM; una molécula específica correspondiente, en donde las secuencias de péptido se seleccionan a partir del grupo de péptidos como se describe en la TABLA 1 y/o la TABLA 2. una molécula específica correspondiente, en donde las secuencias de péptido se seleccionan a partir del grupo de péptidos como se describe en la FIGURA 1 ; una molécula específica correspondiente, en donde los residuos de 1-9 aminoácidos, se altera preferiblemente un residuo del aminoácido en cualquiera de los epítopos de células T presentes originalmente; una molécula específica correspondiente, en donde la alteración de los residuos del aminoácido es la sustitución o eliminación presente en los residuos de los aminoácidos mediante otros residuos de aminoácidos en las posiciones específicas; una molécula específica correspondiente, en donde, si es necesario, la alteración además de ser usualmente por sustitución, adición o eliminación de los aminoácidos específicos se conduce para restaurar la actividad biológica de la molécula; una molécula de péptido de arriba comparte más del 90%, de la identidad del aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido a-k de arriba; una molécula de péptido de arriba comparte más del 80%, de la identidad del aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido a-k de arriba; una molécula de péptido de arriba comparte más del 90% de la identidad del aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido de la TABLA 1 o de la FIGURA 1; una molécula de péptido de arriba comparte más del 80% de la identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptido de la TABLA 1 o de la FIGURA 1; las secuencias de péptido de arriba permiten enlazar moléculas del tipo II MHC; una molécula FVIII especificada correspondiente, en donde uno o más sustituciones de aminoácido se conduce en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos especificados dentro de cualquiera de los péptidos a-k de arriba; una molécula FVIII especificada correspondiente, en donde una o más de las sustituciones de aminoácido se conducen a una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos especificados dentro de la TABLA 1 o la FIGURA l; una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los péptidos o péptidos modificados de arriba que tienen la actividad de enlazar moléculas del tipo II MHC; una molécula o secuencia de ADN que codifica a cualquiera de las moléculas modificadas especificadas, como se definió arriba y abajo; una composición farmacéutica que comprende una molécula modificada que tiene la actividad biológica de FVIII. una composición farmacéutica como se definió arriba y/o en las reivindicaciones, opcionalmente junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable; un método para fabricar una molécula modificada que tiene actividad biológica de FVIII definida en cualquiera de las reivindicaciones citadas arriba, que comprenden las siguientes etapas: (i) determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o parte del mismo; (ii) identificar uno o más epítopos de células T potenciales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína, mediante cualquier método que incluye la determinación de enlazar los péptidos a las moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos; (iii) diseñar nuevas variantes de secuencia con uno o más aminoácidos dentro de los epítopos de células T potenciales identificados, modificados de tal forma que reduzcan sustancialmente o eliminen la actividad del epítopo de la célula T determinada por el enlace de los polipéptidos a las moléculas MHC usando técnicas in vi tro o in silico o ensayos biológicos; (iv) construir tales variantes de secuencia mediante pruebas y técnicas de ADN recombinante de las variantes para identificar una o más variantes con propiedades deseadas; y (v) repetir opcionalmente las etapas (ii) -(iv) ; un método especificado correspondiente, en donde la etapa (iii) se lleva a cabo mediante la sustitución, adición o eliminación de residuos de 1 a 9 aminoácidos en cualquiera de los epítopos de células T presentes originalmente; un péptido de epítopo de células T 13 -mero, que tiene una actividad de enlace de moléculas tipo II MHC potencial y creado a partir del FVIII no modificado, seleccionado del grupo descrito en la FIGURA 1 y su uso para la fabricación de FVIII que tiene o no sustancialmente una inmunogenicidad menor que cualquier molécula no modificada con la misma actividad biológica cuando se usa in vivo; una secuencia de péptidos que consiste de al menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos de un péptido epítopo de células T 13 -mero como se especificó arriba, y su uso para la fabricación de FVIII que tiene o no sustancialmente una inmunogenicidad menor que cualquier molécula no modificada y que tiene una actividad biológica de un factor VIII de humano cuando se usa in vivo; un péptido epítopo de células T 13- mero, que tiene una actividad de enlace de moléculas tipo II MHC potencial y creado a partir de FVIII no modificado, seleccionado a partir de cualquier grupo de secuencias de la TABLA 1 o la FIGURA 1, y su uso para la fabricación de FVIII, que tiene sustancialmente o no una inmunogenicidad menor que cualquier molécula no modificada, que tiene la actividad biológica de un factor VIII de humano cuando se usa in vivo; una secuencia de péptido que consiste de al menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos de un péptido epitopo de células T 13 -mero derivado de cualquiera de las secuencias de la TABLA 1 o la FIGURA 1, y su uso para la fabricación de FVIII que tiene sustancialmente o no una inmunogenicidad menor que cualquier molécula no modificada, que tiene la actividad biológica de un factor VIII de humano cuando se usa in vivo. El término "epitopo de células T" significa de acuerdo con la comprensión de esta invención, una secuencia de aminoácidos capaz de enlazar moléculas tipo II MHC, capaz de estimular células T y/o enlazar también células T (sin necesidad de medir la activación) en el complejo con el tipo II MHC. El término "péptido" como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos se enlazan al mismo tiempo por un enlace de péptido (definido aquí abajo) . Existen 20 diferentes aminoácidos que se presentan naturalmente involucrados en la producción biológica de péptidos, y cualquier número de ellos pueden enlazarse en cualquier orden para formar un anillo o cadena de péptido. Los aminoácidos que se presentan naturalmente empleados en la producción biológica de todos los péptidos tienen la configuración L. Los péptidos sintéticos pueden prepararse empleando métodos sintéticos convencionales utilizando aminoácidos L, aminoácidos D o varias combinaciones de aminoácidos de dos diferentes configuraciones. Algunos péptidos contienen solo unas pocas unidades de aminoácidos. Los péptidos cortos, por ejemplo, que tienen menos de diez unidades de aminoácidos son referidos algunas veces como "oligopéptidos" . Otros péptidos contienen un gran número de residuos de aminoácidos, por ejemplo, de hasta 100 o más, y son referidos como "polipéptidos" . Por convención, un "polipéptido" puede considerarse como cualquier cadena de péptido que contiene tres o más aminoácidos, por medio de los cuales un "oligopéptido" se considera usualmente como un tipo particular de polipéptido "corto". Así, como se usa en la presente, se comprende que cualquier referencia a un "polipéptido" incluye también un oligopéptido. Además, cualquier referencia a un "péptido" incluye polipéptidos, oligopéptidos y proteínas. Cada arreglo distinto de aminoácidos forma distintos polipéptidos o proteínas. El número de polipéptidos- y de aquí el número de diferentes proteínas- que pueden formarse es prácticamente ilimitado. "carbón alfa (Coc) " es el átomo de carbono del componente carbono-hidrógeno (CH) que está en la cadena de péptido. Una "cadena lateral" es un grupo colgante al Ca que puede comprender una porción o grupo complejo o simple, que tiene dimensiones físicas que pueden variar significativamente comparadas a las dimensiones del péptido. La invención puede aplicarse a cualquier especie de FVIII de la molécula con sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos primarias como aquellas descritas aquí y que incluirían por lo tanto, las moléculas FVIII creadas mediante ingeniería genética u otros procesos, que pueden contener más o menos de 2332 residuos de aminoácidos. Una especie de molécula FVIII particularmente preferida, es aquella en la cual el dominio B de la molécula está ausente, que comprende también una o más sustituciones de aminoácidos en cualquiera de los dominios restantes que resulta en la eliminación de la secuencia de uno o más epítopos de células T. Una molécula FVIII anulada con un dominio B terapéutico de 1438 residuos de aminoácidos, ha sido el tema de ensayos clínicos exitosos descritos por Lusher et al y sus referencias [Lusher, J. M. et al (2003) Haemophilia 9: 38-49] . La secuencia de aminoácidos de tal proteína se describe aquí como la FIGURA 9.

Las proteínas FVIII identificadas a partir de otras fuentes de mamíferos, tienen en común muchas secuencias de péptidos de la presente descripción y tienen en común muchas secuencias de aminoácidos sustancialmente con la misma secuencia como aquellas de la lista descrita. Por lo tanto, tales secuencias de proteínas caen igualmente dentro del alcance de la presente invención. La invención se concibe para superar la realidad práctica en la que se introduce proteínas solubles en organismo autólogos, que pueden activar una respuesta inmune que resulta en el desarrollo de anticuerpos hospedadores que enlazan a la proteína soluble. Para muchos pacientes con hemofilia A, la respuesta del anticuerpo para las preparaciones terapéuticas existentes de FVIII es un problema significativo en la administración de su enfermedad. En cualquier individuo un número pequeño de epítopos de células T, puede conducir a la señalización de las células auxiliadoras T dando como resultado respuestas del anticuerpo sostenidas para la superficie reconocida de muchas células B que exponen determinantes de la proteína FVIII nativa. El análisis de los genes que codifican anticuerpos inhibidores de pacientes con hemofilia A, han demostrado que muchos de tales anticuerpos experimentan una maduración de afinidad [Jacquemin, M. G. et al (1998) Blood 92: 496-506; van den Brink, E. N. et al (2000) Blood 95: 558-563]. La maduración de afinidad esencial del fenómeno de hipermutación se presenta sólo en células B en respuesta al auxilio de las células T. Se reconoce también, que una proporción elevada de anticuerpos inhibidores de FVIII son la subclase IgG4 [Andersen, B.R. & Terry, W. D. (1968) Nature 217 : 174-175] y la clase necesaria que cambia las reacciones son similares a los eventos dependientes de las células auxiliadoras T. Una evidencia adicional en la que el anticuerpo responde a FVIII proviene de la observación hecha en pacientes con VIH positivo, con inhibidores de FVIII, en los cuales la respuesta del anticuerpo FVIII se pierde al declinar el número de células T [Bray, G. L. et al (1993) Am. J. Hematol. 42: 375-379]. Por lo tanto, la presente invención pretende dirigirse a esto, proporcionando proteínas FVIII con tendencia alterada para extraer una respuesta inmune en la administración de un hospedador humano. Se comprende que cuando la multiplicidad de epítopos de células B permanecen intactos en la superficie del FVIII modificado, en ausencia de una ayuda continua de células T, las concentraciones de inhibidor disminuirán finalmente y para los pacientes nuevos que reciban tal terapia fallará en establecerse en el primer caso. De acuerdo a los métodos descritos en la presente, los inventores han descubierto las regiones de la molécula FVIII que comprende los epítopos de células T críticas que conducen a la respuesta inmune para esta proteína.

El método general de la presente invención conduce a la FVIII modificada que comprende las siguientes etapas: a) determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o parte de la misma; b) identificar uno o más epítopos de células T potenciales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante cualquier método que incluye la determinación del enlace de los péptidos a las moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos. c) diseñar nuevas variantes de secuencias con uno o más aminoácidos dentro de los epítopos de células T potenciales identificados modificados, de tal forma que reducen sustancialmente o eliminan la actividad del epítopo de células T determinadas por el enlace de los péptidos de las moléculas MHC usando técnicas in vitro o in silico o ensayos biológicos. Tales variantes de secuencia se crean de tal forma que evitan la creación de nuevos epítopos de células T potenciales mediante las variaciones de las secuencias, a menos que tales epítopos de células T potenciales nuevas sean a su vez, modificadas de tal forma que reduzcan sustancialmente o eliminen la actividad del epítopo de las células T; y d) construir tales variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinantes y la prueba de las variantes para identificar una o más variantes con propiedades deseables de acuerdo con las técnicas recombinantes bien conocidas . La identificación de epítopos de células T potenciales de acuerdo a la etapa (b) puede llevarse a cabo de acuerdo a los métodos descritos previamente en la técnica. Los métodos adecuados se describen en la WO 98/59244; O 98/52976; O 00/34317; WO 02/069232 y pueden usarse para identificar la propensión de enlace de los péptidos derivados de FVIII a una molécula del tipo II MHC. En la práctica, las composiciones incluidas en la presente invención se han derivado a partir de la aplicación convenida de los ensayos de proliferación de células T de humano ex vivo biológicas y una herramienta del programa que aprovecha el esquema descrito en la WO 02/069232 que es una modalidad de la presente invención. El programa de cómputo estimula el proceso de la presentación antígena al nivel de la interacción de enlace de moléculas tipo II MHC de péptidos, para proporcionar una señal de enlace en cualquier secuencia de péptido dado. Tal señal está determinada para muchos de los alotipos tipo II MHC predominantes existentes en la población. Ya que este esquema es capaz de probar cualquier secuencia de péptido, pueden predecirse las consecuencias de las sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un péptido para interactuar con una ranura de enlace de moléculas tipo II MHC. Consecuentemente, las nuevas composiciones de la secuencia pueden diseñarse de manera que contengan números reducidos de péptidos capaces de interactuar con el tipo II MHC, y funcionen por consiguiente como epítopos de células T inmunogénicas . Donde el ensayo biológico que usa cualquier muestra del donador dado, puede valorar el enlace de un máximo de 4 alotipos DR, el proceso in silico puede probar la misma secuencia de péptido usando >40 alotipos simul neamente. En la práctica esta metodología es capaz de dirigir el diseño de las nuevas variantes de secuencia que están comprometidas por su capacidad para interactuar con los múltiples alotipos MHC. A manera de un ejemplo in silico dentro de esta metodología, los resultados de un análisis conducidos en la secuencia FVIII de humano completa se proporcionan como FIGURA 1. A este respecto, se enlistan secuencias de péptidos 13 -mero derivadas de FVIII detectadas por tener la capacidad de enlazar uno o más alotipos tipo II MHC con una señal de enlace significativa. Tomados en su totalidad, se considera que el conjunto de datos de los péptidos 13 -meros proporcionan un alto grado de certeza, un universo de ligandos tipo II MHC permisibles para la proteína FVIII de humano. Por razones tales como el requerimiento del proceso proteolítico del polipéptido FVIII de humano completo y otras etapas fisiológicas que conducen a la presentación de los péptidos FVIII in vivo, estaría claro entonces, que un subconjunto relativamente menor del repertorio completo de los péptidos tendrán una relevancia biológica fundamental. Para identificar además tales péptidos biológicamente relevantes, los inventores han desarrollado una metodología que aprovecha los ensayos de proliferación de células T de humano ex vivo. Esta metodología ha demostrado ser un método particularmente efectivo y se describe en la presente como una modalidad de la invención. El método puede aplicarse para probar parte de la secuencia, por ejemplo, una falta total de proteína FVIII o una parte del dominio B, el método puede aplicarse a regiones seleccionadas de la secuencia, por ejemplo, un subconjunto de péptidos FVIII tales como algunos o todos aquellos enlistados en la FIGURA 1; o el método puede aplicarse para probar la secuencia FVIII completa. En los estudios actuales, el método ha involucrado probar secuencias de péptido derivadas de FVIII traslapadas en un esquema tal que puedan examinarse y probar una secuencia de FVIII que carece del dominio B. Los péptidos sintéticos se prueban por su capacidad para evocar una respuesta proliferativa en células T de humano cultivadas in vitro. Cuando este tipo de metodología se conduce usando células T de humano nativas tomadas de donadores saludables, los inventores han establecido que en la operación de tal ensayo, un índice de estimulación igual o mayor de 2.0 es una medida útil de la proliferación inducida. El índice de estimulación se deriva convencionalmente por la división de la señal de proliferación (por ejemplo, un conteo por minuto de la radioactividad, si se usa una incorporación de 3H-timidina) medida para el péptido de prueba mediante la señal medida en las células que no están en contacto con un péptido de prueba . En una modalidad adicional de esta metodología, los inventores han proporcionado un método por medio del cual la secuencia FVIII se explora por la presencia y situación de los epítopos de células T usando ensayos de células T biológicos ex vivo cuando las células T se derivan de pacientes hemofílicos. Para una proporción de tales pacientes, la proteína FVIII constituye una proteína externa y un antígeno in vivo potente. Los inventores han establecido que es posible derivar líneas de células T monoclonales y en principio, policlonales in vitro a partir de PBMC de tales individuos y estas líneas pueden usarse como reactivos efectivos en el mapeo de epítopos de células T dentro de la proteína FVIII. Esto se logra sometiendo células T PBMC hemofílicas a varias rondas de estimulación antígena (FVIII) in vitro seguido por la expansión en presencia de IL-2. Para establecer líneas de células T policlonales, una estimulación antígena de 2 a 3 rondas son generalmente suficientes para generar un gran número de células específicas antígenas, tales células pueden almacenarse criogénicamente para usarse posteriormente como se requiera. Las células se usaron para separar por exclusión una gran cantidad de péptidos sintéticos . En el caso actual, los péptidos sintéticos se analizaron usando un sistema de estanques que contienen cada uno 8 diferentes secuencias de péptido. El esquema de acumulación de péptidos se ilustra en la FIGURA 2. Después de la ronda inicial de la estimulación del antígeno (FVIII) , que comprende la coincubación de FVIII y PBMC durante 7 días, las pruebas inmunogénicas subsecuentes con el antígeno se realizaron en presencia de PBMC autóloga irradiada como células que se presentan como antígeno. Estas rondas de selección antígena se realizan de 3 a 4 días y se esparcen mediante fases de expansión que comprenden la estimulación con IL-2, que pueden agregarse cada 3 días durante un periodo total de alrededor de 9 días. Las pruebas inmunogénicas subsecuentes finales se realizan usando células T que han sido puestas en "reposo", esto es, células T que no han sido estimuladas por IL-2 alrededor de 4 días. Estas células se estimulan con un antígeno (por ejemplo, un péptido sintético o proteína completa) usando preferiblemente antígenos autólogos que presentan previamente células alrededor de 4 días y en consecuencia, se mide la respuesta proliferativa subsecuente (si la hay) . Los acumulados de péptidos se organizan de tal forma que cada acumulado contenga péptidos traslapados para el acumulado subsecuente. De esta forma, cualquier epítopo de células T se representa en 2 acumulados por separado y la proliferación inducida se descubrirá a partir de los tratamientos usando ambos acumulados . Cuando se detecta una respuesta proliferativa para cualquier acumulado de péptido dado, el acumulado de péptido se descifra repitiendo el ensayo usando los miembros del acumulado individual aislándolos. Bajo el esquema de la presente, se ha deseado particularmente aprovechar las muestras PBMC de la clase de los llamados "pacientes inhibidores" ya que podría esperarse que el mapa del epítopo de la proteína FVIII definida por el repertorio de las células T a partir de estos individuos, serán representativas de los epítopos del péptido más prevalecientes, que son capaces de la presentación en el contexto in vivo. En este sentido el PBMC de pacientes en los cuales existe una respuesta inmune demostrada previamente, constituye los productos de la etapa primitiva in vivo y podría esperarse un beneficio práctico que es la capacidad de una magnitud más grande de la respuesta proliferativa para cualquier péptido de estimulación dado. Esto reduce el reto técnico de dirigir una medida de la proliferación. Los presentes estudios han descubierto algunas de las 38 secuencias de péptido capaces de evocar una respuesta proliferativa significativa (es decir, SI > 2.0). Estos péptidos se listan en la TABLA 1 y son una modalidad de la invención. Dentro de este conjunto de péptidos, se ha identificado un subconjunto adicional de péptidos que evocan una respuesta proliferativa significativa en 2 o más muestras de donadores individuales y para algunas de estas respuestas, la magnitud de las respuestas han sido de hecho, significativamente más altas que SI = 2.0. Estos péptidos se enlistan en la TABLA 2 y son una modalidad adicional de la invención. TABLA 1: Secuencia de péptido Residuo #* ATRRYYLGAVELSWD 1 SWDYMQSDLGELPVD 13 PVDARFPPRVPKSFP 25 SWYKKTLFVEFTDH 43 VEFTDHLFNIAKPRP 52 PWMGLLGPTIQAEVY 67 LKNMASHPVSLHAVG 88 VSY KASEGAEYDDQ 103 PGGSHTY QVLKEN 130 ASDPLCLTYSYLSHV 148 ILLFAVFDEGKS HS 196 SLPGLIGCHRKSVY 241 VYWHVIGMGTTPEVH 253 QASLEISPITFLTAQ 283 YIAAEEEDWDYAPLV 385 SYKSQYL NGPQRIG 406 GPQRIGRKYKKVRFM 415 PYNIYPHGITDVRPL 472 YKWTVTVEDGPTKSD 511 KESVDQRGNQIMSDK 556 QIMSDKRNVILFSVF 565 PAGVQLEDPEFQASN 598 ASNIMHSINGYVFDS 610 LQLSVCLHEVAYWYI 625 VAY YILSIGAQTDF 634 GAQTDFLSVFFSGYT 643 GCHNSDFRNRGMTAL 691 TGDYYEDSYEDISAY 712 LLSKNNAIEPRSFSQ 728 MSSSPHVLRNRAQSG 817 NEHLGLLGPYIRAEV 859 AWAYFSDVDLEKDVH 940 CNIQMEDPTFKENYR 1009 IGEHLHAGMSTLFLV 1108 STLFLVYSNKCQTPL 1117 ISQFIIMYSLDGKKW 1204 IARYIRLHPTHYSIR 1251 RLHPTHYSIRSTLRM 1256 * Número de la secuencia de acuerdo al dominio B de la secuencia eliminada (FIGURA 9) . TABLA 2 : Secuencias de péptido FVIII capaces de estimular las células T humanas ex vivo de dos o más muestras de donador.

* Numeración de secuencia de conformidad con el dominio B de la secuencia eliminada (FIGURA 9) . La secuencia de péptido descrita en la presente representa la información crítica requerida para la construcción de moléculas FVIII modificadas en los cuales uno o más de estos epítopos está comprometido. Bajo el esquema de la presente, los epítopos se comprometen por mutación para resultar en secuencias no más largas capaces de funcionar como epítopos de células T. Es posible usar métodos de ADN recombinante para realizar la mutagénesis dirigida de las secuencias objetivo y muchas de tales técnicas están disponibles y son bien conocidas en el arte. Ya que es el objetivo de esta invención modificar esta secuencia de aminoácido de uno o más de los péptidos enlistados arriba de la Tabla 1, es más preferible modificar la secuencia de uno o más de los péptidos Pl-Pll identificados en la Tabla 2. Hay una descripción en la presente de modificaciones apropiadas que realizan los objetivos duales de reducir o eliminar las capacidades de la secuencia de péptido objetivo para funcionar como un epítopo de célula T, ya sea al nivel de ser de un ligando para uno o más de los alotipos de clase II MHC, o más especialmente ser capaces de inducir la proliferación de células T y especialmente donde las células T son células T humanas cultivadas in vitro. Un ejemplo de tal conjunto de modificaciones preferidas se proporciona por la disrupción del epítopo de células T abarcado por el péptido PIO con la secuencia ISQFII YSLDGKK . Este epítopo mapea al dominio Cl de FVIII y es ejemplar de un epítopo capaz de evocar la proliferación de células T ex vivo tomadas tanto de sangre hemofílica, como de las células de un individuo no hemofílico saludable.

Guiado por los resultados de análisis in silico de esta secuencia de péptido con respecto a su actividad de ligando de clase II MHC, los procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio se han aplicado para producir sustituciones en los residuos F1207, 11208, y 1210. La numeración de los residuos está de conformidad con la secuencia FVIII que elimina el dominio B (Figura 9) . La mutagénesis en F1207 resulta en la pérdida de la expresión de FVIII y la actividad no detectable en los ensayos empleados. En contraste, las moléculas FVIII activas se producen que comprenden substituciones 11208 o I1208T o I1208N y/o I1209C y/o M1210K o M1210N. En consecuencia, las proteínas FVIII activas con una o más de las sustituciones enlistadas arriba son composiciones preferidas bajo el esquema de la presente. Las substituciones particularmente preferidas son I1208A, I1209C, M121K o M1210N y tales proteínas FVIII substituidas son además una modalidad de la invención. Las modalidades similarmente preferidas comprenden moléculas FVIII que contienen substituciones dentro del epítopo de célula T abarcado por el péptido P8 con la secuencia CNIQMEDPTFKE YR. Este epítopo mapea el dominio A3 de la proteína FVIII. Los procedimientos de mutagénesis dirigida del sitio se han aplicado a esta secuencia y las substituciones M1013K, I1011A 0 C 0 D 0 E 0 G 0 H 0 K 0 P 0 Q o R o S o T se han establecido para proporcionar una molécula con una actividad funcional retenida con respecto al ensayo de recubrimiento y los parámetros inmunológicos in silico y ensayos inmunológicos in vitro. Las moléculas FVIII que abarcan las substituciones M1013K, I1011A 0 C 0 D 0 E 0 G 0 H 0 K 0 P 0 Q 0 R 0 S 0 T son, en consecuencia, modalidades adicionales de la invención. Las modalidades similármente preferidas comprenden moléculas FVIII que contienen substituciones dentro del epítopo de célula T abarcado por el péptido P7 con la secuencia MSSSPHVLRNRAQSG. Este epítopo también mapea el dominio A3 de la proteína FVIII. La sustitución en la posición V823 se considera una modificación especialmente deseada y es una modalidad de la invención. Los procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio se han aplicado a esta secuencia y las sustituciones V823A, o D o E o G o H o N o P o S o T se han establecido para proporcionar una molécula con un actividad funcional retenida con respecto al ensayo de recubrimiento y los parámetros inmunológicos in silico y ensayos inmunológicos in vitro. Las moléculas FVIII que abarcan las substituciones V823A, 0 D 0 E 0 G 0 H 0 N 0 P o S o T son, en consecuencia, modalidades adicionales de la invención. Un ejemplo adicional de la secuencia de péptido de epítopo de célula T que muestra que es activo en muestras de sangre hemofílica se proporciona por el péptido Pll con la secuencia lARYIRLHPTHYSIRSTLRM. Este epítopo mapea el domino Cl de la proteína FVIII y se ha identificado previamente como un conductor importante de la producción de inhibidor FVIII [Jacquemin, M. et al (2003) Blood 101 : 1351-1358] . Las substituciones en las posiciones Y1254, 11255, L1257, Y1262, 11264, L1263 se consideran modificaciones especialmente deseadas y son una modalidad de la invención. Las modalidades similármente preferidas adicionales comprende moléculas FVIII que contiene sustituciones en las posiciones L1119, F1120, L1121, V1122 y Y1123 del epítopo abarcado por el péptido P9 (STLFLVYSNKCQTPL) también substituciones en las posiciones Y636, Y638, 1637, L638 y 1639 del epítopo abarcado por el péptido P6 (VAYWYILSIGAQTDF) ; substituciones en las posiciones 1613 y 1617 del epítopo abarcado por el péptido P5 (ASNIMHSINGYVFDS) ; substituciones en las posiciones V515 y V517 del epítopo abarcado por el péptido P4 (YKWTVTVRDGPTKSD) substituciones en la posición 1419 del epítopo abarcado por el péptido P3 (GPQRIGRKYKKVRFM) : substituciones en las posiciones Y407, Y411, y L412 del epítopo abarcado por el péptido P2 (SYKSQYLNNGPQRIG) y substituciones en las posiciones L197, L198, F199, V201 y F202 del epítopo abarcado por el péptido Pl (ILLFAVFDEGKSWSH) .

De lo anterior se puede apreciar que de conformidad con esta invención, un número de proteínas FVIII variantes puede producirse y probarse para la característica inmuno y funcional deseada. Los métodos ejemplares para hacer y probar tales proteínas variantes FVIII se describe dentro de los Ejemplos. Todas estas proteínas funcionales son modalidades de la presente invención. Por otro lado las modificaciones conducidas han demostrado que resultan en secuencias de péptido no capaces de enlazar moléculas de clase II MHC con la misma fuerza como la secuencia péptido precursora o "de tipo silvestre" (ts) usando la herramienta de enlace de clase II MHC in silico predictiva de WO02/069232. Adicionalmente, las pruebas físicas de los epítopos de péptido variante ejemplar usando los ensayos de proliferación biológica de célula T humana ex vivo, confirman la pérdida deseada de capacidad para estos péptidos de soportar la proliferación de células T y por ello funcionan como un epítopo de célula T. En el presente caso, esto incluye secuencias de péptido identificadas usando ensayos biológicos y por ello confirman que son capaces de soportar la activación de célula T. De manera importante, un número de tales péptidos son capaces de promover la proliferación in vitro de células T derivadas de sangre hemofílica y son, por ello, representativos de epítcpos procesados y no se consideran determinantes inmunológicamente irrelevantes o encriptadas. Las proteínas variantes se producirán más preferiblemente por técnicas de ADN recombinante a través de otros procedimientos que incluyen la síntesis química de fragmentos FVIII que puede contemplarse. Es un procedimiento fácil para usar la información de secuencia de proteína proporcionada en la presente para deducir los polinucleótidos (ADN) que codifican cualesquiera de la moléculas FVIII variantes preferidas o fragmentos. Esto se realiza más fácilmente usando herramientas de software de computadora tales como el conjunto de software DNAstar [DNAstar Inc. Madison WI , USA] o similares. Cualquiera de tal secuencia de ADN que codifica los polipéptidos de la presente, u homólogos importantes de los mismos, se considerará como modalidades de esta invención. La invención se refiere a análogos FVIII en los cuales la substituciones de al menos un residuo de aminoácido se hace en las posiciones que resulta en una reducción substancial en la actividad de o eliminación de uno o más epítopos de célula T potenciales de la proteína. Una o más de substituciones de aminoácido en puntos particulares dentro de cualesquiera de los ligandos de clase II MHC potenciales identificados en la Figura 1, o más preferiblemente secuencias de epítopo del péptido de las Tablas 1 y 2, pueden resultar en un molécula FVIII con un potencial inmunogénico reducido cuando se administran como un terapéutico a un hospedador humano. Es más preferiblemente proporcionar una molécula FVIII en la cual la modificación del aminoácido (por ejemplo, una substitución) se conduce dentro de la mayoría de las regiones inmunogénicas de la molécula precursora. Para la eliminación de epítopos de células T, las substituciones de aminoácidos se hacen preferiblemente en puntos apropiados dentro de la secuencia de péptidos predicha para realizar una reducción o eliminación substancial de la actividad de epítopo de célula T. En la práctica, un punto apropiado preferiblemente se igualará a un enlace de residuo de aminoácido con uno de las bolsas proporcionadas con el canal de enlace de clase II MHC. Es más preferible para alterar el enlace con la primera bolsa de la grieta en la llamada Pl ó posición de ancla Pl del péptido. La calidad de la interacción del enlace entre el residuo de ancla Pl del péptido y la primera bolsa de la ranura de enlace de clase II MCH, se reconoce como que es una determinante principal de la afinidad de enlace general para el péptido completo. Una substitución apropiada en este punto del péptido será para un residuo que se acomoda menos rápidamente dentro de la bolsa, por ejemplo, substitución para un residuo más hidrofílico. Los residuos de aminoácido en el péptido en las posiciones que se igualan al enlace con otras regiones de la bolsa dentro de la grieta de enlace MHC, también se consideran y caen dentro del alcance de la presente invención. Como será claro para la persona experta en la técnica, múltiples conjuntos alternativos de substituciones podrán llegar a realizar el objetivo de remover los epítopos indeseados. Las secuencias resultantes podrían, sin embargo, reconocerse para ser homólogos cercanos con las composiciones específicas descritas en la presente, y por lo tanto caen bajo el alcance de la presente invención. Se entenderá que las substituciones de aminoácidos sencillos con un epítopo de célula T potencial dado son la ruta más preferida por la cual el epítopo puede eliminarse. Las combinaciones de substitución con un epítopo sencillo pueden contemplarse y, por ejemplo, puede ser particularmente apropiadas donde los epítopos individualmente definidos están en traslape con cada uno de los otros. Por otro lado, las sustituciones de aminoácidos ya sea sencillamente con un epítopo dado o en combinación con un epítopo sencillo, pueden hacerse en posiciones que no igualan a los "residuos de bolsa" con respecto a la grieta de enlace de clase II MHC pero en cualquier punto con la secuencia de péptidos . Las substituciones pueden hacerse con referencia a una estructura homologa o un método estructural que producir usando técnicas in silico conocidas en el arte, y pueden basarse en características estructurales conocidas de la molécula de conformidad con esta invención. Todas estas substituciones están dentro del alcance de la presente invención. Las substituciones de aminoácidos diferentes a aquellas dentro de los péptidos identificados arriba, pueden contemplarse particularmente cuando se hacen en combinación con substituciones hechas con un péptido enlistado. Por ejemplo, puede contemplarse un cambio para restaurar la estructura o la actividad de biológica de la molécula variante. Tales cambios compensatorios y cambios para incluir la eliminación o adición de residuos de aminoácidos particulares del polipéptido FVIII, resulta en una variante con una actividad deseada y combinación con cambios en cualesquiera de los péptidos descritos, caen bajo el alcance de la presente. En cuanto a que esta invención se refiere a FVIII modificados, las composiciones que contienen tales proteínas FVIII modificadas o fragmentos de proteínas FVIII modificadas y composiciones relacionadas, podrían considerarse dentro del alcance de la invención. Un ejemplo pertinente a este respecto podrá ser el desarrollo de estrategias de inducción de tolerancia mediadas por el péptido en donde uno o más de los péptidos descritos se administra a un paciente con intento inmunoterapéutico . En consecuencia, las moléculas de péptidos sintéticos, por ejemplo una o más de aquellas enlistadas en la Tabla 1, se consideran modalidades de la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a ácido nucleicos que codifican las entidades FVIII modificadas. En aspecto adicional, la presente invención se refiere a métodos para tratamiento terapéutico humano que usan las proteínas FVIII modificadas. Todavía en un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos para el tratamiento terapéutico usando preparaciones farmacéuticas que comprenden el péptido o moléculas derivadas con una identidad de secuencia o una identidad de parte con la secuencias descritas en la presente. La invención se ilustra ahora, pero no se limita, por los siguientes ejemplos. El texto anterior y los ejemplos siguientes se refieren a las siguientes figuras: La Figura 1 proporciona una lista de las secuencias del péptido en el Factor VIII humano con una actividad de enlace de clase II de MHC humana potencial. Los péptidos son 13-meros los aminoácidos se identifican usando un código de letras . La Figura 2 describe el esquema de una separación por exclusión de péptido agrupado. En el presente estudio los péptidos fueron 15 meros y traslaparon cada péptido sucesivo por 12 residuos. La Figura 3 proporciona histogramas que describen los resultados de los ensayos de proliferación de célula T in vitro en respuesta al tratamiento con péptidos sintéticos derivados de FVIII. En este ejemplo, una línea de célula T FVIII aislada de un donador hemofílico se usó para separar or exclusión los grupos de péptido traslapados que miden la secuencia FVIII. Las flechas indican grupos que inducen la proliferación de células T y las cuales se decodifican posteriormente . La Figura 4 proporciona histogramas que describen los resultados de los ensayos de proliferación de célula T in vitro en respuesta al tratamiento con péptidos sintéticos derivados de FVIII. En este ejemplo, una línea de célula T especifica para FVIII aislada de un donador hemofílico se usa para decodificar dos grupos de péptidos que inducen la proliferación de célula T. Los péptidos que contiene epítopos de célula T se indican con una flecha. Las Figuras 5A - 5B proporcionan histogramas que describen los resultados de los ensayos de proliferación de célula T in vitro en respuesta al tratamiento con péptidos sintéticos derivados de FVIII. En este ejemplo, las células de dos donadores se usaron para separar por exclusión péptidos que miden la secuencia FVIII. Tanto el donador #1 (A) como el donador #2 (B) tienen alotipos HLA-DR idénticos (DRB1*03, DRB1*04, DR3 y DR4*01) . Las flechas indican los péptidos que contienen epítopos de célula T. La Figura 6 proporciona una gráfica que muestra los datos de actividad y los niveles de expresión de proteína para imitantes del péptido 8 (P8) . El control positivo es el factor VIII ts. M1013K describe la expresión y los datos de actividad para la molécula FVIII que contiene la substitución M1013K. Las columnas restantes son moléculas FVIII que se combinan en la substitución M1013K con cambios adicionales en I 1011 para el aminoácido indicado. La Figura 7 proporciona una gráfica que muestra los datos de actividad y los niveles de expresión de proteína para mutantes del péptido 7 (P7) . El control positivo es el factor VIII, el control negativo no es ADN en la transfección. La muestras restantes son mutantes V823 con los cambios de aminoácido como se indica. La Figura 8 proporciona datos de ensayo de célula T ejemplares que muestran los péptidos mutantes con un índice de estimulación de <2.0 bajo las condiciones por los que el péptido de secuencia ts muestra un índice de estimulación de >2.0. La secuencia de péptidos y los datos de alotipo de donador PBMC se tabulan. Las Figuras 9A - 9B muestran una representación de los resultados realizados usado el software de simulación del enlace de CPH de clase II del péptido. Los resultados se muestran para 18 alotipos HLA-DR diferentes, cada columna vertical indica el enlace de un alotipo sencillo. El panel A muestra el perfil de enlace detectado por la secuencia FVIII ts alrededor del péptido 7. La secuencia 7 del péptido está remarcada. El panel B muestra el perfil de enlace detectado por una secuencia de péptido 7 modificada que contiene la substitución V823A, y demuestra la pérdida de un ligando de alta afinidad para alotipos múltiples. En cada panel el enlace MHC predicho se describe al denotar el primer residuo de ligando de clase II MHC de 13 mero. Se indica la intensidad de enlace se denota con H, M o L con base en el registro de enlace calculado para cada ligando para cada alotipo. Los estudios de enlace físico han indicado previamente que los registros de <500,000 constituyen una interacción de enlace insignificante. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácido y la numeración para la secuencia FVIII humana eliminada del domino B de tipo silvestre (TS) . Los aminoácidos se describen usando un código de letras. EJEMPLO 1 Método para estabilizar líneas y clones de células T. Se aislan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre obtenida de pacientes hemofílieos, y se almacenan criogénicamente bajo nitrógeno líquido. Las muestras de sangre se proporcionan con el consentimiento completamente informado y se trabajan bajo la ética local aprobada del Tratado de Cuidado de Salud Addenbrooke . Las líneas de células se establecen al estimular células T especificas de antígeno en cultivo de volumen usando FVIII seguido por varios ciclos de expansión inducida por IL-2. Los PBMC inicialmente se incuban (a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5%) a 2X106 en 2 mi de medio AIM V que contiene 4ug/ml de FVIII (Refacto™) en placas 24 de pozos. Después de 7 días se incubación se agrega 100U/ml de IL-2 y los cultivos se incuban durante 3 días adicionales . Se colectan los blastos T y se cuentan una vez completada la estimulación antígeno/IL-2 de 10 días. Con objeto de mantener la especificidad de antígeno, los blastos se someten a una segunda ronda de estimulación de antígeno usando PBMC autólogo irradiado por ? como las células que presentan antígeno. Esto se realiza al incubar 1X10S PBMC autólogo/pozo en una placa de 24 pozos con µg/ml de FVIII durante 1 hora en 0.75ml de AIM V (que contiene suero AB inactivado por calor al 5%) antes de someter a una irradiación ? de 4000 rads . Los blastos T autólogos se agregan en 0.25ml de AIM V a 4X 105 células/ml a las células que presentan el antígeno irradiado ? (previamente cargado con FVIII) y se incuba por 3 días. Los blastos T se expanden por células estimuladas con 100U/ml IL-2 por 3 días; los cultivos se suministran entonces con IL-2 fresco (concentración final de 100U/ml) a intervalos de 3 días durante un total de 9 días. Para asegurar que todos los blastos T expandidos sean específicos del antígeno, se realizan una tercera ronda de estimulación de antígeno, donde los blastos T se colectan y se vuelven a suspender a 4 X 105 células/ml en medio AIM V. Como se describe arriba, las células que presentan al antígeno se generan al incubar 1 X 106 PBMS autólogo irradiado por ? en una placa de 24 pozos con 4ug/ml de FVIII durante 1 hora en 075ml de AIM V (que contiene suero AB humano inactivado por calor al 5%). Los blastos T autólogos en 0.25ml AIM V a 4X 105 células/ml se agregan a las células que presentan en antígeno irradiado por ?, y se incuban durante 3 días. Una expansión final en 10U/ml IL-2 se realiza tres días antes de que los blastos T se colecten y se usen para separación por exclusión de grupos de péptidos. Clonación de Cultivos en Volumen Después de la tercera estimulación con antígeno FVIII, se colectaron los blastos T y se volvieron a suspender por dilución en serie hasta una densidad de 4X102-1X104 células/ml (densidad de cultivo final 2x) . Se descongeló PB C autólogo y se volvió a suspender hasta 2X1O6 células/ml (densidad de cultivo final 2x) en un tubo de polipropileno. Se expusieron entonces los PBMC a una irradiación ? de 4000 rads y se usaron como las células que presentan el antígeno para seleccionar los clones de célula T reactivos al antígeno por dilución limitada. Las células que presentan el antígeno irradiado por ? (densidad final 1 x 106) se mezclaron con los blastos T (2xl02-5xl03 densidad final) , l-10ug/ml de antígeno FVIII y 100U/ml de IL-2. Los clones de célula T se estabilizaron en placas Terasaki al agregar 20µ1 del APC, blasto T, FVIII y mezcla IL-2 a cada pozo. La clonación de dilución limitante se realizó usando 2-50 blastos T/pozo de una placa Terasaki. Selección y Mantenimiento de Clones de Célula T Se incubaron blastos T con el antígeno FVIII, IL-2 y antígeno autólogo irradiado por ? que presenta células por aproximadamente 14 días. Después de identificar los pozos que contienen células que muestran un crecimiento inequívoco, se transfieren los blastos T a un pozo sencillo de una placa de 96 pozos de fondo redondo que contiene lxlO5 de PBMC alogénico irradiado por y, 100 U/ml de IL-2 y ^g/ml de fitohemaglutinina (PHA) en un volumen final de 200µ1 AIM V (con suero AB inactivado por calor al 1%) . Los clones de células T se empalman cuando las células se vuelven confluentes, y se transfieren por último a un pozo sencillo de una placa de 24 pozos que contiene lxlO6 de PBMC alogénico irradiado por ? (células alimentadoras) , 100U/ml de IL-2 y ^g/ml de fitohemaglutinina (PHA) en un volumen final de 2ml de AIM V (con suero AB inactivado por calor al 1%) . El mantenimiento de rutina de los clones de células T involucra la estimulación con PHA fresco y células alimentadoras alogénicas cada 2-3 semanas (dependiendo del crecimiento celular) y una estimulación dos veces a la semana con 100U/ml de IL-2. Sólo los clones de células T que se proporcionan para ser FVIII específico se expanden y se usan para separar por exclusión péptidos FVIII. Transformación EBV de Células B Autólogas Las células B de preparaciones PBMS se inmortalizaron para generar líneas de célula linfoblastoide B (BLCL) al agregar 3ml de sobrenadante filtrado B95.8 (0.45µ) a 4xl06 de PBMC y se incuba a 37°C durante 1 hora. Los PBMC se peletizaron y se volvieron a suspender en 2mi de RPMI que contiene suero de becerro fetal inactivo por calor al 5% (FCS) y ^g ml de ciclosporina A. Después de 7 días de incubación, se reemplazó lml de medio de cultivo con RPMI fresco que contiene FCS al 5% y 2ug/ml de ciclosporina A (para dar una concentración final de ]^g/ml de ciclosporina A) . Este régimen alimenticio se repitió los días 14 y 21, después de lo cual las células se dividen cuando sea necesario usando RPMI que contiene FCS al 5% y se expanden en los matraces de cultivo de tej ido. Separación por Exclusión de Péptidos FVIII Usando Clones/Líneas de Célula T Los péptidos de 15 residuos en longitud y traslapados con el péptido previo al incrementar 12 aminoácidos se sintetizaron (Pepscan, Países Bajos) . Los péptidos se solubilizan inicialmente a lOmM en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% para su almacenamiento. Los grupos de péptidos se generan para separar por exclusión simultáneamente un gran número de péptidos contra líneas de células T específicas de FVIII. Los grupos se organizan de tal manera de que cada grupo contiene péptidos traslapados de grupos subsecuentes al usar este enfoque de epítopos de células T que traslapan dos péptidos, lo que resulta en la proliferación inducida de dos grupos separados. Cada grupo consiste típicamente de 8 péptidos con cada péptido siendo probado ya sea a l o 5µ?. La estrategia del grupo péptido se ilustran en la FIGURA 2. El PB C autólogo (para líneas de células T) o BLCL transformado por EBV (para clones de células T) , se usan como células que conservan el antígeno al suspender lxlO5 PBMC o BLCL en 50 µ? de medio AIM V que se agrega a cada pozo de una placa de 96 pozos de fondo redondo. Los grupos de péptidos se agregan en pozos triplicados para cada grupo a ambas concentraciones (1 ó 5µ?) . Las células que presentan el antígeno y los grupos de péptidos se incuban durante 1 hora a 37°C antes de exponerse a una irradiación por ? de 4000 rads . Los BLCL se tratan previamente con ^g/ml de mitocina C durante 1 hora a 37°C seguido por un lavado 4 veces en AIM V cuando se usan como células que presentan el antígeno (en lugar de PBMC autólogo irradiado por ?) para clones de células T. Las líneas de células T específicas de antígeno o clones de células T se agregan entonces a 5X104 células por pozo y los cultivos se incuban durante 3 días. El tercer día cada pozo se pulsa con ?µ?? [3H] -timidina durante un mínimo de 8 horas. Después de cosechar las placas en mantos filtros, el cpm/pozo se determina usando un contador Wallac Microplate Beta. La Figura 3 muestra un mapa epítopo generado usando una línea de célula T, donde los blastos T se usan para identificar grupos péptidos que contiene los epítopos de células T, aquellos grupos se decodifican después para identificar el péptido individual que contiene el epítopo de célula T. Mapa de Epítopo de Célula T Nativo usando PBMC de Donadores Saludables Se usó sangre de 40 donadores del tipo HLA-DR saludables para aislar PBMC que se usaron para separar por exclusión péptidos FVIII individuales a dos concentraciones (1 y 5µ?) . Ya que estos fueron números insuficientes de PBMC de cada donador por separar por exclusión en todos los péptidos FVIII, los donadores se partieron en dos grupos donde los primeros 20 donadores se usaron para separar por exclusión péptidos que miden la primera mitad de la molécula, y el segundo conjunto de donadores se usó para separar por exclusión los péptidos restantes. Los donadores se seleccionaron de conformidad con los alotipos de clase II MHC expresados con objeto de cubrir un gran número de alotipos presentes en la población mundial. Los alotipos MHC se detectaron usando alotipos. Los tipos de tejido para todas las muestras PBMC se analizaron usando un sistema reactivo comercialmente disponible (Dynal, irral, RU) . Los ensayos se conducen de conformidad con los protocolos recomendados por el distribuidor y reactivos auxiliares estándar y sistemas de electroforesis de agarosa. El PBMC contiene números fisiológicos de células T nativas y células que presentan el antigeno. Estas células se usan a una densidad de 2xl05 células/pozo (placas de fondo plano de 96) para separar por exclusión péptidos a 1 y 5µ? en cultivos de 200µ1 triplicados. Las células se incuban con péptidos a 37°C durante 6 días antes de colocar cada pozo con 1µ<G? [3H] -timidina durante un mínimo de 8 horas. Los cultivos se cosechan en mantos filtro y el cpm/pozo se determina usando un contador Wallac Microplate Beta. La Figura 5 muestra un mapa epítopo de FVIII generado usando dos donadores para separar 'por exclusión mitades separadas de la molécula. EJEMPLO 2 Método para clonación y expresión del Factor VIII Extracción del ARNm y Síntesis del ADNc: Se obtiene tejido de hígado humano del departamento de patología de un hospital . La muestra se cortó en cubos y se dispensó como alícuotas de 50mg y se almacenó en nitrógeno líquido. Una alícuota de 50 mg se homogenizó y el ARNm se extrajo directamente usando el kit PolyATrac System 1000 (Promega) de conformidad con las instrucciones del fabricante, proporcionando aproximadamente 10µg de ARNm. Alícuotas de lug de ARNm se transcribieron de manera inversa en reacciones de 20µ1 usando el sistema de transcripción inversa ImProm-II (Promega) usando un cebador oligo(dT)15 de conformidad con las instrucciones del fabricante. La enzima de transcriptasa inversa se inactivo entonces por calentamiento hasta 70 C durante 15 minutos.

Amplificación de la Reacción de Cadena de Polimerasa de las Secuencias de Factor VIII: Ya que la variante que elimina el dominio B del factor VIII se clona, el ADN se amplifica del ADNc en dos divisiones. El extremo 5' de ARNm se amplifica usando los siguientes cebadores : SEQ ID N0.1 GCATCGCGCGCTAGCAATAAGTCATGCAAATAGAG SEQ ID NO.2 GAAGCTCCTAGGTTCAATGGCATTGTTTTTACTCA La Seq ID No. 1 contiene dos sitios de enzima de restricción para facilitar la clonación más 24 nucleótidos de la secuencia de ARNm del factor VIII que rodea el codón de inicio ATG (negritas) . La Seq ID No. 2 es complementaria a los nucleótidos 2420 hasta 2454 del ARNm del factor VIII y contiene dos nucleótidos cambiados en las posiciones 2445 y 2448 (mostrado en negritas) que introduce un sitio de enzima de restricción mientras mantiene sin afectación la secuencia de proteína . El extremo 3' del gen del factor VIII se amplifica usando el siguiente par cebador: SEQ ID NO.3: TGAGTCTTAAGCTAGCTAGATACCTAGGAGCTTCTCCCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCC SEQ ID NO.4 : TACGTCTCGAGTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCGCA La Seq ID No. 3 contiene el sitio de enzima de restricción Nhel para facilitar la clonación más los nucleótidos 2442 a 2457 del AR m del factor VIII fusionado a los nucleótidos 5140 a 5164. Este cebador crea por lo tanto, la unión entre las cadenas pesada y ligera mientras casi la totalidad B del dominio está ausente. Este cebador también contiene los cambios de nucleótido de las posiciones 2445 y 2448 (mostrado en negritas) que crean el sitio de enzima de restricción nuevo también encontrado en la Seq ID No. 2. La Seq ID No. 4 contiene los 24 nucleótidos finales de la secuencia que codifica el factor VIII más el sitio de enzima de restricción para facilitar la clonación. Las reacciones PCR se dan usando la polimerasa Expand Hifi (Roche) que usa la solución amortiguadora suministrada que contiene MgCl2 en un volumen final de 50µ1. Las reacciones se hacen para lx solución amortiguadora que contiene 200µ? de cada dNTP, 50pmoles de cada cebador (ya sea seq ID No. 1 más No. 2 o seq ID No. 3 más No. 4), 2.5 unidades de RnasaH y 5µ1 de mezcla de reacción de transcriptasa inversa. Las reacciones se incuban a 37°C durante 30 minutos en orden para el ARN en el híbrido del ARN/ADNc para degradarse por la RnasaH con objeto de incrementar la eficiencia de la reacción PCR. La reacción se calienta entonces hasta 94 °C durante 2 minutos para una desnaturalización inicial, seguido por un ciclizado para las temperaturas siguientes y tiempos: 94°C 30seg, 55°C 30seg., 72°C 2.5min. Durante la primera etapa de combinaciones en sus pares base, la cantidad agregada de polimerasa se agrega y la reacción se procesa en ciclo a 20 veces. Durante la etapa de combinación de sus pares base que sigue a la 20a' etapa de extensión, una segunda alícuota de polimerasa se agrega y la reacción se procesa en ciclo durante 20 veces adicionales. La reacción se incuba entonces a 72 °C durante 10 minutos para asegurar la polimerización completa de todas las hebras. Clonación y ensamble del gen del factor VIII: La mitad de las reacciones PCR se separan en un gel de agarosa al 1% y la banda de 2286 pares base correspondiente al extremo 5' del ADNc de factor VIII y la banda de 2015 pares base correspondiente al extremo 3' se cortan y purifican de la agarosa por medio del kit de extracción del gel Qiagen. Los productos PCR se ligan entonces en un vector de clonación de • producto PCR (pGEM-T Easy Vector System Promega) como se instruye por el fabricante. Se procesa por electroforesis ?µ? de cada reacción de ligación en 20µ1 de cepa E.coli electrocompetente XLI-azul (Stratagene) como se recomienda por el distribuidor usando un cubeta de hueco de 0.1 cm. Las células se vuelven a suspender y se permiten que se recubran también como se recomienda por el distribuidor. Se forman en placas alícuotas de ??µ? y ???µ? de las células electroforadas en las placas de agar LB que contienen 100µg/ml ampicilina 80µg/ml Xgal y 0.5m IPTG y se hacen crecer a 37°C durante la noche . Las colonias blancas se recolectan y se dispersan en 20 µ? de agua. Una muestra de cada colonia resuspendida se analiza por medio de PCR en un volumen de reacción de 20µ1 usando la polimerasa Taq (Roche) con la solución amortiguadora suministrada. Las reacciones se hacen en lx de solución amortiguadora que contiene 200µ? de cada dNTP, 50 pmoles de cada cebador siendo el delantero M13 estándar y los cebadores inversos (SEQ'ID NO: 5 y 6 en la presente), y ?µ? de colonia resuspendida. Las reacciones se calientan entonces hasta 94°C durante 2 minutos para una desnaturalización inicial, seguido por ciclizado x20 para las siguientes temperaturas y tiempos: 94°C 30seg, 60°C 30seg, 72°C 2min. La reacción se incuba entonces a 72°C durante 10 minutos para asegurar la polimerización completa de todas las hebras. Una muestra de 5µ1 de cada reacción se separa en un gel de agarosa el 1%. Las muestras que contienen bandas a aproximadamente 2300 pares base se juzgan como positivas por el inserto a la mitad 5' de factor VIII y aquellas que contiene bandas a aproximadamente 2150 pares base se juzgan positivas por el inserto de mitad 3' de factor VIII. Para cada inserto se inoculan ocho colonias cada una en cultivos líquidos de 5mi de caldo 2YT/ 100 ug/ml de ampicilina y se hacen crecer durante la noche a 37°C con agitación. El plásmido se prepara a partir de 1.5ml de cada cultivo usando el kit Qiagen mini Prep y los plásmidos se envían hasta una instalación formadora de secuencias por contrato para la determinación de secuencias usando los siguientes cebadores: Clones de mitad 5': SEQ ID NO: 5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (MI3 delantero) SEQ ID NO: 6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13 inverso) SEQ ID NO: 7 ATGATCAGACCAGTCAAAGG (factor VIII ARNm nt573- 592) SEQ ID NO: 8 CAGGAAATCAGTCTATTGGC (factor VIII ARNm nt975-994) SEQ ID NO: 9 TGGGTACATTACATTGCTGC (factor VIII ARNm ntl372- 1391) SEQ ID NO: 10 ACAGTGACTGTAGAAGATGG (factor VIII ARNm ntl768-1787) SEQ ID NO: 11 GTCTTCTTCTCTGGATATAC (factor VIII ARNm nt2179-2199) Clones de mitad 3' : SEQ ID NO: 5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC (M13 delantero) SEQ ID NO: 6 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA (M13 inverso) SEQ ID NO: 12 GAGTAGCTCCCCACATGTTC (factor VIII ARNm nt5370-5361) SEQ ID NO: 13 GTGCACTCAGGCCTGATTGG (factor VIII ARNm nt5786-5767) SEQ ID NO: 14 AGGTGTTTTTGAGACAGTGG (factor VIII ARNm nt6187- 6168) SEQ ID NO: 15 GAGGAAATTCCACTGGAACC (factor VIII ARNm nt6594- 6575) SEQ ID NO: 16 AATCTCTGCTTACCAGCATG (factor VIII ARNm nt6993-6974) El plásmido pCF85 se encontró que codifica la secuencia de aminoácido correcta para la mitad 5' del gen de factor VIII. El plásmido pCF83 se encontró que codifica la secuencia de aminoácido correcta para la mitad 3' del gen de factor VIII . El pCF83 se digiere con Bst981 y Xholl y el fragmento de 2.0K pares base liberado que contiene la mitad 3' del gen de factor VIII, se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa y se clonó en un corte similar y pLitmus (NEB) purificado usando las técnicas estándar. Las colonias bacterianas positivas se identificaron por medio de PCR como se describe arriba y un clon pCLF83 seleccionado, creció y preparó el ADN. El pCF85 se digirió con BssHII y los extremos se hacen lavar con polimerasa de ADN T4 (NEB) en presencia de ???µ? de cada dNTP. La reacción se calienta entonces hasta 70°C durante 10 minutos y luego se digiere con Avrll. El fragmento de 2.3k pares base liberado se purifica por medio de electroforesis en gel de agarosa en pCLF83 que se ha digerido con Bst98I, se lavan los extremos como arriba, se digieren con Avrll y se purifican en gel . Las colonias bacterianas positivas se identifican por separación por exclusión de PCR como arriba usando los cebadores Seq ID NO.11 y Seq ID NO: 17 (ATCAGTAAATTCCTGGAAAAC [Factor VIII mRNA nt5448-5428] ) . Estos cebadores amplifican el fragmento a través de la unión entre las dos divisiones del gen del factor VIII y por lo tanto un producto de aproximadamente 570 pares base se observa solo si la clonación ha sido exitosa. Se selecciona una colonia positiva y se llama pCLF8. Esta colonia se hace crecer y se prepara y se procesa por secuencia de ADN. Las secuencias de unión correctas se confirman usando los cebadores Seq ID No 6 y Seq ID No. 5. La unión entre las divisiones 5' y 3' también se verifica usando el cebador Seq ID No. 17. Expresión y Análisis de Actividad del factor VIII. La proteína FVIII se expresó usando una variante modificada del vector pCI (Promega, Southampton, U ) . El vector pCI sin modificar tiene 4. Ok pares base de largo y contiene un promotor mejorador de CMV y una señal de poliadelinación tardía de SV40 para la expresión de mamíferos y contiene secuencias necesarias para la preparación bacteriana. El vector también contiene un origen Fl de bacteriófago y este se retira por expresión del plásmido con las enzimas de restricción BamHI y EcoO109I. Los productos de digestión se completan en sus pares base en las terminales usando polimerasa de ADN T4 como se describe arriba seguido por una separación a través de un gel de agarosa al 1%. Se purifica el fragmento del vector de 3.2k pares base a partir del gel, se auto-liga y se transforma en la cepa bacteriana XL-1 azul como se describe arriba. Se recolectan las colonias, se hacen crecer durante la noche y se hace una minipreparación de plásmidos como se describe arriba. Las muestras de los plásmidos purificados se digirieron con la enzima de restricción NgoMIV que está presente en la secuencia de origen Fl, y se analiza por medio de la electrofresis del gel de agarosa. Se selecciona un plásmido resistente y se denomina pClA. pClA se digiere con las enzimas de restricción Nhel y Xhol y el fragmento del vector se purifica por medio de electroforesis con gel de agarosa. pCLF8 se digiere similarmente y el fragmento de 4.4k pares base que contiene el gen del factor VIII se purifica por medio de electroforesis en gel de agarosa, y se clona en el pClA de corte usando técnicas estándar. Se identificaron las colonias bacterianas positivas por medio de un análisis PCR usando los cebadores Seq ID NO: 11 y Seq ID NO: 17 como se describen arriba. Se seleccionó una colonia positiva denominada pCIF8 y se inoculó en un caldo 50ml 2YT que contiene 100µg/ml de ampicilina y se hizo crecer 37°C durante la noche con agitación vigorosa. Se preparó el ADN plásmido altamente puro usando un kit Qiagen midi-prep. Se cuantificó el ADN plásmido esprectofotométricamente diluido hasta 0.2µ9/µ1 y se esterilizó en un filtro a través de una unidad de filtro con un diámetro de 1.5 era con un poro de 0.2µt? (Nalgene) . Las células HEK 293 (ATCC CRL-1573) se mantuvieron en cultivo continuo en matraces de cultivo de tejido de 75cm2 en DMEM que contiene Glutamax-I piruvato de sodio y 4500 mg/ml de glucosa (catálogo Invitrogen No. 31966-021) , complementado con 10% de suero de bovino fetal inactivado con calor (catálogo Perbio No. CH30160.03) . Se hicieron crecer las células a 37°C/5% C02 y se subcultivaron al diluir 1/5 cada 48 horas. Las células HEK 293 se adhieren solamente de manera débil a un plástico de cultivo de tejido y se pueden separar al lavar la superficie del matraz. Las células HEK293 se transíectaron en placas de cultivo de te idos recubiertas con poli L lisina de 24 pozos (Beckton Dickinson) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante . Se lavaron las células casi confluentes en un matraz de cultivo de tejido de 75cm con solución salina amortiguada de fosfato (PBS) , y se separaron del matraz de cultivo de tejidos usando solución de tripsina/EDTA. La tripsina se inactivo por adición de un volumen igual de los medios de crecimiento. Se contabilizaron las células en un hemocitómetro y se centrifugó la suspensión celular a 1200 rpm por 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a suspender el peletizado de célula en medios de crecimiento a una densidad de 4X105 células/mi . 0.5 mi de suspensión celular se dosificaron en cada pozo de una placa de tejido de cultivo de 24 pozos, y se incubó durante la noche a 37°C/5% C02. Previo a la transfección, se retiraron los medios de cada pozo y se reemplazaron con 0.5 mi de medio fresco, 8 9 de un plásmido pCIF8 y un plásmido de control negativo pClA se diluyeron cada uno en 50 µ? en Optimen (Invitrogen cat . no. 51985-026) . Para transfección, se diluyeron 2µ1 de Lipofectamina 2000 hasta 50µ1, se incubaron a temperatura ambiente por 5 minutos y luego se combinaron con el plásmido diluido seguido por una incubación adicional a temperatura ambiente por 20 minutos. Se hicieron las transfecciones por triplicado en cada ???µ? de plásmido/mezcla de lípidos y luego se agrego gota a gota a un pozo de la placa de 24 pozos . Las placas luego se incubaron a 37°C/5%Co2- Se retiraron alícuotas de ??µ? de cada transfección a 24h, 48h y 72h. Las alícuotas de cada triplicado se combinaron para dar un volumen total de 30µ1 por muestra y se congelaron a -80°C previo al análisis de actividad. Se ensayó la actividad del factor VIII en el sobrenadante usando en kit Coatest F8:C/4 (Chromagenix) en un formato de microtitulación según las instrucciones del fabricante. Se deshelaron las muestras de sobrenadantes sobre hielo, se diluyeron 1/20 y 1/100 en solución amortiguadora de ensayo y se ensayaron por duplicado. Los estándares fueron muestras de plasma liofilizada cuantificadas contra los estándares internacionales para la actividad del factor VIII (Chromogenix) . Se reconstituyó un canal de plasma en lml de agua como se describe por el fabricante. La hoja de datos anexa se consultó para el nivel de la actividad del factor VIII en el plasma que luego se diluyó hasta 100% (lIU/ml) por la dilución de la solución amortiguadora de ensayo. Luego se diluyeron los estándares como -se describe en el protocolo de ensayo de microtitulación del fabricante. Después de 24 horas los sobrenadantes de las células transfectadas con pCIF8 se encontró que contenían una actividad de 0.16IU/ml, lo cual incrementó hasta 0.74 IU/ml a 48 horas y luego cayó de vuelta hasta 0.5IU/ml a 72 horas. No se observó actividad en los sobrenadantes de las células transfectadas con el vector de control. Por lo tanto se expresó exitosamente el factor VIII en cantidades suficientes para determinar la actividad de los mutantes . Mutagénesis de Aminoácidos en el Péptido PIO (tabla 2). El péptido 10 contiene 4 residuos hidrofóbicos que tienen el potencial para hacer el anclaje primario para la interacción con las moléculas de clase II HC F1207, 11208, 11209 Y M1210 (numeración según el dominio maduro B en la secuencia eliminada) . Por lo tanto se digirieron estos cuatro residuos para mutación a residuos diferentes a aquellos que pueden ser potencialmente anclajes primarios. F1207 se cambió a A, H, K, N, Q, y R; 11208 se cambió a A, T, D, N; 11209 se cambió a A, C, D, N, P, M1210 se cambió a A, K, N, y Q. La mutagenesis se hizo por medio de una PCR de traslape usando protocolos bien conocidos establecidos por aquellos expertos en la técnica. El péptido 10 se encuentra dentro de un fragmento de la secuencia de nucleotidos del factor VIII unido por los sitios de restricción PspOMI y Sphl. Los cebadores PCR para amplificación de estos fragmentos se sintetizaron y corresponden a las secuencias justo fuera de esta región (Seq ID NO: 18 y 19 a continuación) . Para la mutagénesis de F1207 se sintetizaron los cebadores internos como se describen a continuación.

SEQ ID No.l 8: GGACACATTAGAGATT1TCA (gennU463-3 82) SEQ ID No.19: CAGTAATCTGTGCATCTGAT (gen nt.3949-3930) SEQ DD No.20: CTGAGAGATGTAGAGGCT (gen nt3675-3658) SEQ ID No.21 : AGCCTCTACATCTCTCAGÍCCATCATCATGT (F1207A) SEQ ID No.22: AGCCTCTACATCTCTCAGcacATCATCATGT (F1207H) SEQ ID No.23: AGCCTCTACATCTCTCAGaagATCATCATGT (F1207K) SEQ ED No.24: AGCCTCTACATCTCTCAGaacATCATCATGT (F1207N) SEQ ID No.25: AGCCTCTACATCTCTCAGcagATCATCATGT (F1207Q) SEQ ID No.26: AGCCTCTACATCTCTCAGcgcATCATCATGT (F1207R) Se hizo la PCR usando la polimerasa Expand HiFi (Roche) usando la solución amortiguadora suministrada que contiene MgCl2 en un volumen final de 50µ1. La reacción del fragmento 5' que contenían una solución amortiguadora IX, contiene 200µ? de cada dNTP, 50 pmoles de cada cebador (Seq ID NO. 18 más No. 20) lOOng de pCIF8 y 2.5 unidades de la polimerasa Expand. Seis reacciones del fragmento 3' se prepararon y contenían solución amortiguadora que contenía lx 200µ? de cada dNTP, 50 pmoles de cada cebador (Seq ID NO. 19 ya sea Seq ID No. 21, 22, 23, 24, 25 ó 26), lOOng pCIF8 y 2.2 unidades de polimerasa Expand. Luego se calentaron las reacciones hasta calentar 94°C por 2 minutos para una desnaturalización inicial seguido para la formación de ciclos para los siguientes tiempos y temperaturas 94°C 30seg, 50°C 30 seg, 72°C 30seg. Se formaron ciclos de las reacciones 20 veces y luego se incubaron a 72°C por 10 minutos para completar la polimerización de todas la hebras. Se separó la mitad de un PCR en un gel de agarosa al 1%, y el fragmento 5' de 226 pares base y los 6 diferentes fragmentos 3' de 292 pares base se extirparon del gel y se purificaron usando un kit Qiagen Gel Extract. El fragmento 5' luego se unió a cada uno de los fragmentos 3' como sigue: se hicieron seis PCR adicionales como se describe arriba usando la polimerasa Expand HiFi que se usa como plantilla, 2µ1 del fragmento diluido 5' con 2µ1 con cada uno de los seis fragmentos eluidos 3' con los cebadores Seq ID No. 18 y Seq ID No. 19. La mitad de cada una de estas reacciones se separaron en un gel de agarosa al 1% y se purificaron las seis bandas de 486 pares base como se describen arriba. Se digirió cada producto PCR con enzimas de restricción PspOMI y Sphl en volumen total de reacción 50 µ? durante la noche a 37°C. Se digirieron similarmente 4 g del plásmido pCIF8 por 2 horas a 37°C y la mitad del plásmido y los productos de digestión de los productos PCR corrieron a través de un gel de agarosa al 1%. La banda del vector 7.2kb y los fragmentos PCR de 391 pares base se extirparon del gel y se purificaron como arriba en los volúmenes de 30µ1 cada uno en agua. Se ligó 1 µ? de vector a 3 µ? de cada uno de los seis fragmentos en reacciones estándar de ligamiento de 10 µ? usando la ADN T4 ligasa y la solución amortiguadora suministrada (Invitrogen) . Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Se trató por electroporesis ?µ? de cada reacción de ligación en 20µ1 de la cepa de E. colí electrocompetente (Stratagene) como se recomienda por el proveedor usando una cuba en un espacio de 0.1 era. Las células se volvieron a suspender y se dejó recuperar también como se recomienda por el fabricante. Alícuotas de ??µ? y ???µ? de las células electroporadas se colocaron en placas de agar LB que contiene 100µg/ml de ampicilina y crecieron a 37°C durante la noche. Se recolectaron e hicieron crecer durante la noche, cuatro colonias de cada ligación en placas en 5ml de cultivo líquido en un caldo 2YT más ???µ?/ml de ampicilina 37°C con agitación vigorosa. El ADN de plásmido se preparó a partir de cada cultivo usando un kit Qiagen Mini-Prep. Las muestras de cada plásmido formaron secuencias de ADN usando Seq ID N. 18. Un plásmido de cada grupo de cuatro con la secuencia correcta se seleccionó y almacenó para análisis por medio de transfección para actividad y niveles de expresión. Se siguió este mismo procedimiento general al crear las mutaciones 11280, 11209 y M1210. Los cebadores usados para cada aminoácido fueron como sigue. 11208: SEQ JD No.18: GGACACATTAGAGATTTTCA (gen nt.3463-3482) SEQ ID No.t9: CAGTAATCTGTGCATCTGAT (gen nt3949-3930) SEQ ID No.20: CTGAGAGATGTAGAGGCT (gea nt.3675-3658) SEQ JD No.27: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgccATCATGT (I1208A) SEQ ID No.28: AGCCTC ACATC CTCAGTTTaccATCATGT (I1208T) SEQ ID No.29: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgacATCATGT (I1208D) SEQ IDNo.30: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaacATCATGT (I1208N) II209: SEQ lD No.l8: GGACACATTAGAGATTTTCA (gen nt_3463-3482) SEQ ID No.19: CAGTAATCTGTGCATCTGAT (gen nt3949-3930) SEQ ID No.20: CTGAGAGATGTAGAGGCT (gennt3675-3658) SEQ ID No.31 : AG(lCTCTACATCTCTCAGTTTATCgccATGTATA (I1209A) SEQ ID No J2: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATClgcATGTATA (U209C) SEQ ID No.33: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgacATGTATA (I1209D) SEQ ID o.34: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCaacATGTATA G1209N) SEO ID o.35: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATrj-cpATfn-ATA ('T170QP M1210: SEQ ID No.18: GGACACATTAGAGATTTTCA (gennt3463-3482) SEQ ID No.19: CAGTAATCTGTGCATCTGAT (gen. nt3949-3930) SEQ ID No.20: CTGAGAGATGTAGAGGCT (gen nt3675-3658) SEQ ID No.36: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCgccTATAGTC ( 1210A) SEQ ID No.37: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaagTATAGTC (M1210 ) SEQ ID No.38: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaacTATAGTC (M1210N) SEQ ID No.39: AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCcagTATAGTC (M1210Q) Los clones para cada mutación que se habían verificado por el análisis de secuencia se transfectaron en la célula HEK 293 en placas de polilisina de 24 pozos por duplicado como se describen arriba. Se incubaron las transfecciones por 48 horas a 37°C 5% C02. Los sobrenadantes para cada duplicado por transfección se incubaron y ensayaron para la actividad del factor vill como se describe arriba. Los sobrenadantes también se ensayaron para los niveles de expresión del factor VIII usando un kit ELISA de anticuerpo de VIII apareado (Affinity Biologicals) . Este ensayo se modificó para cuantificar efectivamente el material sobrenadante de cultivo de tejidos y se efectuó como sigue: Se diluyó el anticuerpo de captura 1/100 en solución amortiguadora de carbonato/ bicarbonato de sodio pH9.6 y se agregaron 100 µ? de pozo a una placa ELISA de 96 pozos Dynex Immulon 4. La placa se incubó durante la noche a 4°C. Los pozos se lavaron x4 por ???µ? de cada uno de solución amortiguadora de lavado (solución salina amortiguada tris [TBS.25Mm Tris, 137mM NaCl, 3mM KCl, pH 7.4 @ 25°C] contiene 0.15 Tween 20) y las alícuotas por duplicado ???µ? de estándares diluidos y sobrenadantes de cultivo de tejidos agregado por pozos. Los estándares fueron muestras de plasma liofilizado cuantificadas contra estándares internacionales para la actividad de factor VIII (Chromogenix) . Se reconstituyó un vial de plasma en lml de agua como se describe por el fabricante. Se consultó la hoja de datos anexos para el nivel de la actividad de factor VIII en el plasma que luego se diluyó hasta 100% (HU/ml) por adición de solución amortiguadora de dilución de muestra (TBS contiene 1% de albúmina de suero de bovino p/v) . Esto luego se diluyó 1 en 4 con solución amortiguadora de dilución de muestra para dar el estándar ELISA al 100%. Esto luego se diluyó además con solución amortiguadora de dilución de muestra para dar los estándares que representan el 75%, 50%, 25%, y 5%. Se diluyeron los sobrenadantes de cultivo de tejido 1 en 4 con solución amortiguadora de dilución de muestra. La placa se incubó por 2 horas a temperatura ambiente y se lavó x4 con solución amortiguadora de lavado, ???µ? por pozo. Se agregaron ???µ? de anticuerpo conjugado de peroxidasa de raíz de rábano por pozo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó como antes y se agregaron ???µ? de substrato (TMB recién preparado/solución de peróxido:Sigma cat.no. T0440) la placa se incubó durante 15 minutos seguido por la adición de una solución de paro (ácido sulfúrico 2M) . La placa se leyó en un lector de placas HTII usando un filtro de 450nm. La comparación de los valores de actividad y los niveles de expresión relevaron que todos los cambios para F1207 resultaron en ausencia de la expresión y así de la actividad. La mutación de 11208 a A resultó en la expresión y en la actividad similar al factor VIII mientras que los cambios para T y N resultaron en 25% Y 50% pérdidas en actividad. Para 11209, solamente la mutación para C permitió la expresión y la actividad de esta variante fue similar a factor VIII sin modificar. Todos los cambios para M1210 resultaron en la expresión de proteínas con una actividad apreciable con K y N sin distinguirse del factor no modificado VIII. Por lo tanto I1208A, I1209C, M1210K y M1210N son mutaciones útiles para el retiro del epítopo de células T dentro del peptido 10. Mutagénesis de los Aminoácidos en el Péptido P8 (Tabla 2) El péptido 8 contiene dos aminoácidos que son anclajes primarios potenciales para el enlace de las moléculas de clase II MHC 11011 y M1013 (la numeración según la secuencia eliminada del dominio B maduro) . Por lo tanto se dirigieron estos dos residuos para mutación a residuos diferentes a aquellos que puede ser potencialmente anclajes primarios. La comparación en la secuencia del factor VIII en otras especies (perro, ratón y ratas) revelaron que en el factor de perro VIII, M1013 es K. K también se demuestra que es el mejor reemplazo para M1210 para la mutagénesis del péptido 10. Por lo tanto, M1013 se enlistó solamente hasta K y combinación con todos los aminoácidos de 11011 que no tienen el potencial para formar anclajes primarios (esto es, A, C, D, E, K, N, P, Q, R, S, T) . La mutagénesis se usó por medio de un PCR de traslape usando protocolos establecidos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El péptido 8 se encuentra dentro del fragmento de 490 pares base de la secuencia de nucleótidos factor VIII enlazada por los sitios de restricción PflMl y PspOMI . Los cebadores PCR para la amplificación de este fragmento se sintetizaron y corresponden a la secuencias que justo fuera de esta región (Seq ID No. 40 y No. 41 a continuación) . Para la mutagénesis de M1013K más IlOllx se sintetizaron los cebadores internos y usaron como se describen a continuación: SEQIDNo.43: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGaagGAAGA (MI013K) SEQIDNo.44: ACTGCAQGGCTCCCTGCAATgccCAGaagGAAGA (11011A, M1013K) SEQIDNo.45: AC GCAGGGCTCCCTGCAATtgcCAGaagGAAGA (Í10UC, M1013K) SEQIDNo.46: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgacCAGaagGAAGA (I1011D.M1013K) SEQI No.47: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgagCAGaagGAAGA (I10I1E,M1013 ) SEQIDNo.48: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATggcCAGaagGAAGA (I1011G, M1013 ) SEQIDNo.49: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcacCAGaagGAAGA (Í10IIH. M1013K) SEQIDNo.50: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaagCAGaagGAAGA (11011K,M1013K) SEQIDNo.51: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaacCAGaagGAAGA (I1011N.M1013 ) SEQIDNo.52: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcccCAGaagGAAGA Q\0U?, M1013 ) SEQIDNo.53: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcagCAGaagGAAGA (I10UQ, M1013 ) SEQIDNo.54: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcgcCAGaagGAAGA (I10IIR.M1013 ) SEQI No.55: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATagcCAGaagGAAGA G10HS, 1013 ) SEQIDNo.56: ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaccCAGaagGAAGA GIOUT.MIOIS ) Se hizo la mutagénesis usando el mismo procedimiento general descrito para la mutagénesis de péptido 10 anterior excepto que el fragmento 5' fue de 62 pares base de longitud y el fragmento 3' de 492 pares base. El fragmento unido tenia 534 pares base en longitud y se digirió con PspOMI y PflMI y se clonó en el pCIF8 similarmente digerido. Un clon con la secuencia correcta se seleccionó de cada mutante y sus actividades y niveles de expresión se analizaron como se describen arriba excepto que se hicieron las transcripciones por triplicado, y se analizó cada sobrenadante en lo individual de manera que se pudieran determinar las variaciones en la expresión/actividad . La comparación de los niveles de expresión y la actividad para los mutantes anteriores reveló que el M1013K fue muy similar al factor VIII sin modificar. Además los mutantes en combinación que contienen M1013K más I1011A, E, P, S, o T tampoco se distinguieron del factor VIII sin modificar. Por lo tanto son útiles estas mutaciones para el retiro de los epítopos de células T asociados con el péptido 8. Mutagénesis en los Aminoácidos en el Péptido P7 (tabla 2) . El péptido 7 contiene un aminoácido que es un anclaje primario potencial para el enlace a las moléculas MCH clase II V23, (numeración según el dominio B madura en la secuencia eliminada) . Por lo tanto se dirigió este residuo para mutación hacia residuos diferentes a aquellos que pueden ser potencialmente anclajes primarios (esto es, A, C, D, E, K, N, P, Q, R, S, T) . Se hizo la mutagénesis por medio de un PCR de traslape usando protocolos establecidos como previamente. El péptido 7 se encuentra dentro del fragmento de 766 pares base de la secuencia de nucleótidos del factor VIII unida por las enzimas de restricción Avrll y PflMl. Los cebadores PCR para amplificación de este fragmento se sintetizaron que corresponden a la secuencia justo fuera de esta región (Seq ID No. 57 y 58 a continuación) . Para la mutagénesis de V823X se sintetizaron los cebadores internos y se usaron como se describen a continuación: SEQ ID No.57: CGAGGACAGTTATGAAG (gen DL2214-2230) SEQ ID No.58: AGTGGGATCTTCCATCTG (gen m.3108-3091) SEQ ID No.59: ATGTGGGGAGCTACTCATCCC (gen nl2523-Z503) SEQ ID No.60: GGGATGAGTAGCTCC<XACATgccCTAAGAAACAG (V823A) SEQ ED No.61: GGGATGAGTAGCTCCCCACATtgcCTAAGAAACAG (V823Q SEQ ID No.62: GGGATGAGTAGCTCCCCACATgacCTAAGAAACAG (V823D) SEQ ID No.63: GGGATGAGTAGCTCCCCACATgagCTAAGAAACAG (VÍ23E) SEQ ID No.64: GGGATGAGTAGCTCCCCACATgggCTAAGAAACAG (V823G) SEQ ID o.65: G GG ATGAGTAGCTCCCCAC ATcacCTAAG AAACAG (V823H) SEQ JD No.66: GGGATGAGTAGCTCCCCACATaagCTAAGAAACAG (V823K) SEQ ID No.67: GGGATGAGTAGCTCCCCACATaacC AAGAAACAG (V823N) SEQ ED No.68: GGGATGAGTAGCTCCCCACATcccCTAAGAAACAG (V823P) SEQ ID No.69: GGGATGAGTAGCTCCCCACATcagCTAAGAAACAG (V823Q) SEQ ID No.70. GGGATGAGTAGCTCCCCACATcgcCTAAGAAACAG (V823R) SEQ ID No.71: GGGATGAGTAGCTCCCCACATagcCTAAGAAACAG (V823S) SEQ ID No.72: GGGATGAGTAGCTCCCCACATaccCTAAGAAACAG (V823T) Se hizo la mutagénesis usando el mismo procedimiento general descrito para la mutagénesis del péptido 10 anterior, excepto que el fragmento 5' fue de 310 pares base de longitud y el fragmento 3' de 606 pares base. El fragmento unido tuvo 894 pares base de longitud y se digirió con Avrll Y PflMI y se clonó en el pCIF8 similarmente digerido. Se seleccionó un clon con la secuencia correcta para cada mutante y sus actividades y sus niveles de expresión se analizaron como se describe arriba. Se hicieron las transfecciones por duplicado y se acumularon los sobrenadantes previo al ensayo. La comparación de los niveles de expresión y actividad para los mutantes anteriores reveló que puede hacer diversos cambios sin afectar substancialmente los niveles de expresión y la actividad. Estos datos se detallan en Figura 7. La alteración de V823 para A, D, E, G, H, N, P, S, o T produjo mutantes con expresión y actividad al menos equivalentes a aquellos del factor VIII wt . Por lo tanto son útiles estas mutaciones para el retiro de los epítopos de células T asociados con el péptido 7. Ejemplo 3 Los péptidos derivados de FVIII se sintetizaron y contienen mutaciones y se prueban con su capacidad continua para promover la proliferación de células T usando un ensayo ex vivo. Los péptidos fueron secuencias de 15-mero y se diseñaron para probar las substituciones I1011A o I1011T en combinación con M10113K. Se probaron péptidos usando las muestras del donador 4 PB C mostradas previamente por la respuesta a la secuencia del péptido de tipo silvestre. En todos los pasos los péptidos mutantes probados fueron incapaces de estimular la proliferación en un Sl>2.0. Los resultados de este ensayo incluyen detalles de tipo de donadores y las secuencias de péptidos se muestran en FIGURA 8. Se estimularon PBMC con antígenos de proteína y péptidos en una placa de fondo plano de 96 pozos a una densidad de 2X106 PBMC por pozo. Se incubaron los PBMC por 7 días a 37°C antes de pulsar con 3H-Timidina. Se generaron los péptidos con las substituciones específicas y se separó por exclusión cada péptido individualmente contra los PBMC aislados de cuatro donadores saludables previamente mostrados con la secuencia del péptido FVHI P8. Un péptido de control de la hemaglutinina de la influenza y una hemocianina de una variedad de lapa con un antígeno de no recuperación potente (KLH) se usaron en cada ensayo de donador. Se disolvieron los péptidos en DMSO hasta una concentración final de lOmM, estas soluciones de reserva luego se diluyen con 1/500 en un medio AIM V (concentración final 20µ?) . Se agregaron los péptidos a una placa de fondo plano de 96 pozos para dar una concentración final de 2 y 20µ? en ???µ?. La viabilidad de los PBMC deshielados se evaluó por una exclusión de colorantes de azul de tripano, se volvieron a suspender las células a una densidad de 2xl06 células/ml y ??µ? (2xl05PBMC/pozos) se transfirieron a cada pozo que contiene péptidos. Se ensayaron los cultivos de pozo por triplicado en cada concentración de péptidos. Las placas se incubaron durante 7 días en una atmósfera unificada de 5%C02 a 37°C. Se pulsaron las células por 18-21 horas con ?µ?? de 3H-Thy/pozo antes de cosechar en placas filtro. Los valores CPM se determinaron usando un contador de placas superior beta de microplacas Wallac (Perkin Elmer) . Los resultados se expresan como índices de estimulación calculados al dividir el valor CPM con el péptido de prueba, entre el valor CPM en los pozos sin tratar. Un índice de estimulación mayor a 2 se toma como proliferación positiva. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una molécula modificada del factor VIII humano que es substancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que el factor VIII humano no modificado, y que tiene esencialmente la misma especificidad y actividad biológica cuando se usa in vivo, caracterizada porque comprende específicamente residuos alterados de aminoácidos en comparación con la molécula precursora no modificada, en donde los residuos de aminoácidos alterados provocan una reducción o eliminación de uno o más de los epítopos de célula T que actúan en la molécula precursora no modificada como ligandos de enlace de la clase II MHC y estimulan las células T. 2. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las alteraciones se hacen en una o más posiciones dentro de una o más de las cadenas de residuos de aminoácidos contiguos presentes en la molécula precursora como se detalla en la tabla 1.
3. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque las alteraciones se hacen en una o más posiciones dentro de una o más de las cadenas de residuos de aminoácidos contiguos presentes en la molécula precursora como se detalla en la tabla 2.
4. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizada porque las alteraciones son substituciones de 1 a 9 residuos de aminoácidos.
5. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque uno, más o todos los residuos de aminoácidos se han substituido en las siguientes posiciones en una cadena de secuencias como se detalla en la tabla 1: 197, 198, 199, 201, 202, 407, 411, 412, 419, 515, 517, 613, 617, 636, 637, 638, 639, 823, 1011, 1013, 1208, 1209, 1210, 1254, 1255, 1257, 1262, 1264, 1268, 1119, 1120, 1121, 1122, 1123.
6. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque en la cadena PIO de la tabla 2 una, más o todas las siguientes sustituciones de los residuos de aminoácidos se han efectuado : I1208A, I1208T, I1208N; I1209C; M1210K, M1210N.
7. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 3 caracterizada porque en el péptido 8 de la tabla 2, una, más o todas las siguientes substituciones de residuos de aminoácidos se han efectuado. M1013K: I1011A, I1011C, I1011D, I1011E, I1011G, I1011H, I1011K, I1011P, I1011Q, I1011R, I1011S, I1011T.
8. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque en el péptidO 7 de la tabla 2, una, má3 o todas las siguientes substituciones de residuos de aminoácidos se han efectuado: V823A, V823D, V823E, V823G, V823H, V823N, V823P, V823S, V823T.
9. Una molécula modificada del factor VIII de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 8, caracterizada porque cuando se prueba como una proteína entera en un ensayo biológico de proliferación celular inducida de células T humanas, muestra un índice de estimulación (SI) más pequeño que la molécula precursora y más pequeño que 2 , probado en paralelo usando células del mismo donador donde el índice se toma como el valor de la proliferación celular marcada que sigue a la estimulación por la proteína, y se divide entre el valor de la proliferación celular marcada en células de control que no reciben la proteína y en donde la proliferación celular se mide por cualquier medio adecuado.
10. Una secuencia de ADN caracterizada porque codifica una molécula del factor VIII de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9.
11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una molécula modificada del factor VIII de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, opcionalmente junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Una molécula de péptido seleccionada de la tabla 1 que tiene una actividad de enlace potencial de CPH de clase II y se crea a partir de la secuencia primaria del factor VIII humano no modificado, por lo que la molécula de péptido tiene un índice de estimulación de >1.8 en un ensayo biológico de proliferación celular, caracterizada porque el índice se toma como el valor de la proliferación celular marcada que sigue por la estimulación por un péptido y dividida por el valor de la proliferación celular marcada de control que no están en el péptido receptor y en donde la proliferación celular se mide por cualquier medio adecuado.
13. Una molécula modificada de péptido derivada de la molécula de péptidos de conformidad con la reivindicación 12 por substitución de aminoácidos, caracterizada porque tienen una actividad de enlace potencial de CPH de clase II reducida o ausente expresada por un índice de estimulación menor a 2, con lo cual se toma el índice como el valor de la proliferación celular marcada que sigue a la estimulación por un péptido y se divide por un valor de la proliferación celular marcada en células de control no en el péptido receptor, y en donde la proliferación celular se mide por cualquier medio adecuado .
14. La secuencia de ADN caracterizada porque codifica un péptido de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13.
15. El uso de un péptido de conformidad con la reivindicación 13, para la fabricación de una molécula modificada del factor VIII como se define en la reivindicación 1.
16. El uso de un péptido de conformidad con la reivindicación 12, para la fabricación de una vacuna con el objeto de reducir la inmunogenicidad al factor VIII en un paciente .