KR20100017142A - 혈우병 ａ 환자의 치료를 위한 만노오스화되지 않은 재조합 인자 ｖｉｉｉ - Google Patents

혈우병 ａ 환자의 치료를 위한 만노오스화되지 않은 재조합 인자 ｖｉｉｉ Download PDF

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Abstract

본 발명의 실행에 따라, 인자 Ⅷ의 면역원성이 실질적으로 인간에서 감소되거나 제거된, 만노오스화되지 않은 인자 Ⅷ가 제공된다. 변성된 인자 Ⅷ는 적어도 하나의 치환에 의해 변형된, 변성 아미노산 서열과 함께 개시된다. 변성 인자 Ⅷ는 anti-FⅧ 항체의 작용을 방지하거나 예방하여, 혈우병에 유용하다.

Description

혈우병 Ａ 환자의 치료를 위한 만노오스화되지 않은 재조합 인자 ＶＩＩＩ{DEMANNOSYLATED RECOMBINANT FACTOR ＶＩＩＩ FOR THE TREATMENT OF PATIENTS WITH HAEMOPHILIA Ａ}
본 발명은 실질적으로 비 면역성 또는 면역성이 낮게 변성된 인자 Ⅷ에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주세포 또는 유기체서 변성된 FⅧ를 발현 및 생성하는 방법뿐만 아니라 변성된 FⅧ를 인코딩하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 출혈성 질환(bleeding disorder)을 치료하기 위하여 변성 FⅧ를 환자에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
인간 인자 Ⅷ(FⅧ)는 X-염색체-관련 출혈성 질환(bleeding disorder) 혈우병(hemophilia) A에서 결핍된 응고 인자로서, 영향을 받은 남성의 출혈성 질환의 발병률 및 사망률의 중요한 원인이다. 전통적으로, 혈우병 환자는 전혈(whole blood)의 수혈로 치료되었다. 최근에, 인간 혈장(plasma)에서 유래한 FⅧ 농축물을 제조하여 치료하였다. 그러나 혈장(plasma) 유래품을 사용하면 혈우병 환자가 간염과 AIDS 등과 같은 바이러스-전달 질병의 위험에 노출된다. 이 위험을 줄이기 위한 고비용의 정제 체계로 인해 치료 비용이 증가한다. 비용 증가 및 혈장(plasma)-유래 FⅧ의 한정된 이용가능성으로 인해, 환자는 예방적 목적이 아닌 수요 근거에 일 시적으로 치료된다. 재조합하여 생성된 FⅧ는 증가한 이용가능성뿐만 아니라 순도 및 안전의 측면에서 혈장(plasma)-유래 FⅧ보다 실질적 이점을 가지며, 따라서 재조합하여 생성된 FⅧ의 개발을 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. FⅧ의 불안정한 특성으로 인해, 그 활성화가 뒤따르고, 혈장 또는 재조합 유래의 많고 반복된 양의 단백질이 치료의 이득을 달성하기 위하여 투여되어야 한다. 그러나 환자에게 노출되는 FⅧ 단백질의 양은 그 활성을 저해하는 항체의 생성과 관련된다. 이러한 알려진 면역원성(immunogenicity)에 비추어, 치료제(therapeutic agent)로 사용하기 위한 FⅧ의 새로운 재조합 형태를 개발함에 있어 목표 중 하나는 그런 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 산물의 개발이다. FⅧ는 인자 Ⅸa에 의해 인자 Ⅹ의 활성화를 촉진하기 위한 공동 인자로 혈액 응고의 본질적인 경로에서 작용하며, 반응은 칼슘 이온의 존재시 마이너스로 충전된 인지질(인지질) 표면에서 발생한다.
FⅧ 분자는 6개의 구조상 도메인(domain)으로 분할된다: 3개의 A 도메인(A1, A2, A3), 탄수화물이 풍부한(carbohydrate-rich) 필요없는 중앙 도메인(B 도메인) 및 2개의 C 도메인(C1, C2) (도 5 참조). FⅧ는 A1 도메인과 A3 도메인 사이의 비공유 2가 금속 이온 결합(noncovalent divalent metal ion linkage)을 통해 연결된 중연쇄(도메인 A1-A2-B) 및 경쇄(도메인 A3-C1-C2)의 헤테로디머(heterodimer)로서 혈장에 분비된다. 혈장(plasma)에서, FⅧ는 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor)와의 결합을 통해 안정된다. 특히, FⅧ 경쇄는 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor)의 아미노 말단(terminus)의 1처 결합 위치와 비공유(noncovalent) 상호작용에 의해 결합한다. 트롬빈(thrombin)에 의해 단백질 가수 분해 활성화가 되자마자, FⅧ는 2개의 중연쇄 단편(A1, 50 kDa 단편, 및 A2, 43 kDa 단편)과 경쇄(A3-C1-C2, 73 kDa 체인)의 헤테로트리머(heterotrimer)로 활성화된다. FⅧ (FⅧa)의 활성 형태는 2가 금속 이온 결합에 의해 트롬빈으로 절단된 A3-C1-C2 경쇄에 연결된 A1-서브유닛 및 이온 결합을 통해 A1 서브유닛에 연결된 자유 A2 서브유닛으로 이루어져 있다. 이 FⅧa 헤테로트리머(heterotrimer)는 불안정하고 생리적인 조건 하에서 A2 서브유닛이 분리되어 급속히 불활성화된다. FⅧ 분자는 N-연결 당화(N-linked glycosylation)를 허용하는 25 공통 서열(consensus sequence) (Asn-Xxx-Thr/Ser)을 포함하며, 그 중 20개가 당화(glycosylation)된 것으로 나타나며(1), FⅧ 단백질은 혈우병 A 환자에게서 유래한혈장(plasma)에서 응고 결합을 보충할 수 있는 인자로서 기능적으로 정의될 수 있을 것이다. 혈우병 A를 치료하기 위하여, FⅧ가 인간 또는 돼지 혈장(plasma)에서 정제되고 재조합 DNA 기술에 의해 최근 생성되었다. 예를 들면, 미국특허 4,965,199에 포유류 숙주세포에서 FⅧ를 치료에 필요한 양을 생성하기 위한 재조합 방법의 개발에 대해 개시하고 있다. CHO(Chinese hamster ovary) 세포와 BHKC(baby hamster kidney cells)에서 인간 FⅧ을 발현시킨 것이 또한 보고되었고, 최근에, B-도메인이 결핍된 FⅧ의 효능이 임상 실험에서 증명되었다(US 4,868,112, ref. 2).
상업적으로 이용가능한 FⅧ 치료제는 혈장(plasma) 유래 FⅧ(pdFⅧ) 및 전체 길이의 rFⅧ(Kogenate® Bayer, Advate® Baxter, Helixate® CSL-Behring) 및 B-도메인 결핍 rFⅧ(Refactoⓒ Wyeth)과 같은 재조합 FⅧ(rFⅧ) 약품을 포함한다. 그러나 치료 단계 FⅧ의 이용가능성에도, 향상된 성질을 가지는 FⅧ 유사 물(analogue)에 대한 요구가 높게 남아 있다. 실제로, FⅧ 치료제로 혈우병 A 환자를 치료한 결과 케이스의 15 내지 30%에서, 치료목적으로 투여된 FⅧ의 항응고제 활성(pro-coagulant activity)을 중화하는 항(anti)-FⅧ 항체(억제제)가 출현하였다(3, 4). 억제제의 발생은 외래(exogeneous) FⅧ 단백질의 반복한 투여에 대한 알레르기(allogeneic) 면역 반응이 반영된 것으로 보인다. 일부 혈우병 환자는 외래 재조합 인자 Ⅷ에 매우 민감하며 그들의 치료효과를 제한하는 항-인자 Ⅷ 항체를 만들어 낸다. 그러므로 FⅧ 억제제를 생성하는 환자가 전통적 대체 치료에 저항성을 가지기 때문에, FⅧ 억제제의 생성은 중요한 의학적 장애 및 주요 사회 관심사를 나타낸다. FⅧ 억제제의 발생은 치료 비용이 3중으로 증가할 뿐만 아니라(5), 발병률 및 사망률이 증가하여 환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 이런 맥락에서, 인간에 면역 반응을 유도할 가능성이 줄어든 또는 없는 FⅧ를 제공하는 것은 매우 바람직하다. 또한, 혈우병 A의 경우와 같이 만성적이고 재발하는 질병에 특히 유용한 인체 안에서 순환 시간(circulation time)이 증가한 FⅧ를 제공하는 것이 바람직하다. FⅧ-관련 특정 면역 반응의 첫 단계는 항원제시세포(Antigen Presenting cells; APCs)에 의해 FⅧ가 엔도시토시스(endocytosis)를 포함하는 것으로 보였다. 수지상 세포(dendritic cells; DCs)는 naive T 세포의 프라이밍(priming)과 대응하는 항원-특이 면역반응의 개시를 위한 유력한 APC로 제안되었다(6, 7).
DCs에 의한 항원 엔도시토시스는 대음세포작용(macropinocytosis)에 의해 또는 수용체매개성 엔도시토시스(receptor mediated endocytosis)에 의해 일반적으로 실행된다. 실제로, DC 표면은 대부분이 2가 이온, 주로 칼슘의 존재에 의존하는 무 수히 많은 엔도시토시스 수용체(endocytic receptor)를 제공한다. 많은 엔도시토시스 수용체(endocytic receptor)는, 노출된 탄수화물 인지 도메인(carbohydrate recognition domains; CRDs) 때문에, 항원(S)에 존재하는 당 잔기에 특이하며, C 유형 렉틴 수용체(C type lectin receptors; CLRs)로 불린다. 따라서 항원의 만노오스(mannose) 잔기는 만노오스 수용체(mannose receptor)(MR, CD206), 수지상 세포 특이적 ICAM3을 잡는 비 인티그린(dendritic cell-specific ICAM3 grabbing non-integrin)(DC-SIGN, CD209), 덱틴(dectin), DEC-205(CD205)을 포함하는, DC 표면의 일련의 만노오스 민감 CLRs에 의해 인지될 수 있다. 다당류(polycarbohydrate) 만난은 특히 MR 및 DC-SIGN에 있어 이러한 만노오스 민감CLRs를 위한 리간드인 것으로 보였다. DCs의 DC-SIGN 분자는 T 세포의 ICAM-3를 고정한다. 이 특이한 상호작용은 DCs와 T 세포 사이의 면역학적 시냅스의 개시에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 그러므로 림프구(lymphocyte)의 활성화는 차단항체(blocking antibody) anti-DC-SIGN과 함께 억제될 수도 있다.
일부 치료에서 FⅧ 면역 반응의 결과를 감소시키는 것이 나타났다. 예를 들면 내성(tolerance)을 유도하기 위하여 데스모프레신(desmopressin) (FⅧ 생성을 자극하는 합성 호르몬), 응고 촉진제(coagulation promoter agent) (예를 들면, 프로트롬빈-복합 농축물(prothrombin-complex concentrate) 또는 활성화된 프로트롬빈-복합 농축물), 재조합 인자 Vila 또는 FⅧ의 살포를 사용하는 것으로 이루어진다.
다른 항체의 가변 영역과 상호작용하는, anti-idiotypic 항체를 사용하는, 최근 방법은 억제제 항체를 중화하기 위하여 개발되었다(12). 따라서, FⅧ의 공동인자 활성 및 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor; vWF)에의 결합을 차단하는, anti-FⅧ C1 도메인에 대한 IgG4kappa 인간 단일클론항체를 분리하였다(13). 유사하게, vWF와 인지질에 FⅧ의 결합을 억제하는, 인간 단일클론항체 anti-FⅧ C2 도메인, BO2C11(IgG4kappa)를 분리하였다(14). 그러므로 이 항체는 천연 FⅧ 및 활성화된 FⅧ의 전구응고(procoagulant) 활성을 완전하게 억제한다. 단일클론항체의 다른 예는 FⅧ 활성은 99%의 FⅧ 활성을 차단하는, FⅧ A2 도메인에 대한 BOⅱB2이다. 그러나 FⅧ-유도 면역반응은 다클론 반응이고, anti-FⅧ 항체에 대한 anti-idiotypic 항체의 사용을 포함하는 치료는 단지 부분적으로 FⅧ 면역반응만 중화할 수 있었다.
본 출원인은 최근에 FⅧ에서의 만노오스-말단 당화(mannose-ending glycosylations)가 미성숙한 인간 수지상 세포(dendritic cell) (DCs)에 의하여 FⅧ의 내면화(internalization)를 중재한다는 것을 증명하였다. 이 결과는 FⅧ에 위치한 만노오스화된(mannosylated) 당과 DCs 만노오스 수용체 사이의 상호작용의 차단하는 것이 FⅧ의 내면화를 및 FⅧ 특이 T 세포를 제공하는 것을 줄인 것을 증명하였다. FⅧ 면역원성(immunogenicity)의 감소는 만노오스-민감 수용체와 상호작용하는 능력을 감소시켜서 달성될 수 있다.
본 출원인은 또한 DCs에 의해 제공될 때 T 세포를 활성화하기 위해 아스파라긴(asparagin) 239(Asn239) 및 아스파라긴 2118 (Asn2118)에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 대체되거나 제거되는, 변성 FⅧ의 능력을 발견하였고, 이는 환자에게 비면역성 또는 면역성이 낮은 FⅧ 치료제를 제공할 수 있는 기회를 제공한다.
본 발명은 변성된 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질을 제공하며, 엔도시토시스 가능한 세포와 상호작용하거나 상기 엔도시토시스 가능한 세포에 의해 엔도시토시스되는(endocyted) 상기 변성된 FⅧ 폴리펩티드의 능력이 대응하는 비-변성 FⅧ 폴리펩티드에 대하여 감소하거나 또는 제거되는 것을 특징으로 한다.
특정한 구체화에서, 본 발명은 엔도시토시스 가능한 세포로부터 표면 수용체와 상호작용하는 능력이 감소 또는 제거된 변성 FⅧ 폴리펩티드, 특히 표면 수용체가 만노오스-민감 수용체일 때, 특히 표면 수용체가 만노오스 수용체(mannose receptor)(MR, CD206), 수지상 세포 특이적 ICAM3을 잡는 비 인티그린(dendritic cell-specific ICAM3 grabbing non-integrin)(DC-SIGN, CD209), 덱틴(dectin) 및 DEC-205(CD205)로 이루어진 그룹에서 선택될 때 그 능력이 감소 또는 제거된 변성 FⅧ 폴리펩티드를 제공한다. 특정한 구체화에서, 엔도시토시스 가능한 세포는 항원제시세포(Antigen Presenting cells; APCs), 및, 특히, 수지상 세포, 대식세포(Macrophages), 내피세포(endothelial cells) 또는 B 림프구 세포이다.
다른 특정한 구체화에서, 본 발명은 인간에 있어 면역원성(immunogenicity)이 실질적으로 감소 또는 제거되는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 실질적으로 당화되지 않으며(deglycosylated), 특히 본 발명의 변성 FⅧ는 실질적으로 만노오스 잔기가 당화되지 않은(deglycosylated) FⅧ 폴리펩티드로 종결된 글리칸(glycan) 구조이다.
특히, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 공통서열 Asn-Xxx-Thr/Ser를 가지는 당화(glycosylation) 공통위치의 적어도 하나의 아미노산이 치환 또는 제거되며, 이때 Xxx는 모든 아미노산을 나타낸다. 특히, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 서열번호(SEQ ID No) 2로 표시한 전체 길이의 인간 FⅧ 폴리펩티드 서열에 대하여, 아스파라긴(Asparagin) 239, 아스파라긴(Asparagin) 2118, 세린(Serine) 241 및 트레오닌(Threonine) 2120으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 아미노산을 치환 또는 제거된다. 특정한 구체화에서는, 아스파라긴(Asparagin) 239는 알라닌(Alanine), 글라이신(Glycine), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine), 트레오닌(Threonine), 아스파르트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환된다. 다른 특정한 구체화에서, 아스파라긴(Asparagin) 2118은 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine), 트레오닌(Threonine), 아스파르트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환된다. 다른 구체화에서, 아스파라긴(Asparagin) 239는 알라닌(Alanine)으로 치환되고 및/또는 아스파라긴(Asparagin) 2118은 알라닌(Alanine)으로 치환된다. 다른 구체화에서, 아스파라긴(Asparagin) 239는 글루타민(Glutamine)으로 치환되고, 및/또는 아스파라긴(Asparagin) 2118은 글루타민(Glutamine)으로 치환된다. 다른 구체화에서, 아스파라긴(Asparagin) 239는 알라닌(Alanine)으로 치환되고 아스파라긴(Asparagin) 2118은 글루타민(Glutamine)으로 치환된다. 다른 구체화에서, 아스파라긴(Asparagin) 239는 글루타민(Glutamine)으로 치환되고 아스파라긴(Asparagin) 2118은 알라닌(Alanine)으로 치환된다. 다른 특정한 구체화에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 (i) 서열번호(SEQ ID No) 6으로 표시한 아미노산 서열, 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 8로 표시한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 (i) 서열번호(SEQ ID No) 12로 표시한 아미노산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 14로 표시한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 (i) 서열번호(SEQ ID No) 6으로 표시한 아미노산 서열 및 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 14로 표시한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 (i) 서열번호(SEQ ID No) 12로 표시한 아미노산 서열 및 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 8로 표시한 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 전구응고(procoagulant)-활성 FⅧ 단백질이다.
다른 측면에서는, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 서열번호(SEQ ID No) 10으로 표시되는 B 도메인의 전체 또는 일부가 삭제된다. 다른 바람직한 구체화에서, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 B 도메인의 일부만 삭제되며, 더 바람직하게, 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드는 (서열번호(SEQ ID No) 10에 관하여) B 도메인의 적어도 처음의 226 아미노산을 여전히 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산분자 또는 변성된, 분리 핵산 서열을 제공하는 것이다. 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 5로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 7로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 5로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 7로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나와 높은 엄격도(stringency) 조건하에서 혼성화될 수 있는 가능한 분리된 핵산 분자를 포함한다.
다른 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 11로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 13으로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 더 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 11로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 13으로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나와 높은 엄격도(stringency) 조건하에서 혼성화될 수 있는 가능한 분리된 핵산 분자를 포함한다.
다른 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 5로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 13으로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 더 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 5로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 13으로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나와 높은 엄격도(stringency) 조건하에서 혼성화될 수 있는 가능한 분리된 핵산 분자를 포함한다. 다른 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 11로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 7로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 더 특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 (i) 서열번호(SEQ ID No) 11로 표시한 핵산 서열 및/또는 (ⅱ) 서열번호(SEQ ID No) 7로 표시한 핵산 서열 중 적어도 하나와 높은 엄격도(stringency) 조건하에서 혼성화될 수 있는 가능한 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자 또는 본 발명의 변성 FⅧ 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 FⅧ 단백질 또는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 발현시키는 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 감염된(transfected) 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 FⅧ 단백질을 발현하는 인간이 아닌 형질전환 유기체를 제공하며, 특히 미생물, 인간이 아닌 동물 또는 식물에서 선택된 유기체 및 특히 포유동물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 개시된 FⅧ 단백질을 포함하는 조성물, 및 특히 약학 조성물 또는 동결건조된(lyophilised) 조성물을 제공하는 것이며, 약학적으로 이용가능한 캐리어를 더 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 FⅧ 단백질의 생산방법을 제공하는 것으로, 본 발명의 핵산분자 또는 본 발명의 FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산분자가 형질전환된 또는 감염된(transfected) 숙주세포를 배지에서 성장시키는 단계 및 숙주세포에서 및/또는 배지에서 핵산 분자의 발현에 기인한 FⅧ 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 출혈성 질병, 특히 FⅧ 결핍으로 특징화된 질병, 더 특히 혈우병 A와 후천적(acquired) 혈우병 A의 치료에 있어 본 발명에 따른 FⅧ 단백질의 사용을 제공한다.
특정한 구체화에서, 본 발명은 FⅧ 단백질을 필요로 하는 환자에게 FⅧ 단백질의 응고 유효량(clotting effective amount)을 투여하는 것을 포함하는, 혈우병 A 환자를 치료하는 방법뿐만 아니라 혈우병 A 또는 후천적 혈우병 A를 치료하기 위한 의약 제조를 위한 본 발명의 FⅧ 단백질의 사용을 제공한다.
도 1: 수지상 세포(dendritic cell)(DCs)로의 FⅧ의 만노오스-민감 침투(mannose-sensitive entry).
(A) 2시간 동안 FⅧ (40μg/ml) 첨가 전에 DCs를 5mM EDTA, 1mg/ml 만난(mannan) 또는 1mg/ml D- 갈락토스로 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 보고된 값은 [(37℃MFIinh- 4℃MFImedim)/(37℃MFImedium-4℃MFImedium)]×100으로 정의된 관련 항원 흡수(uptake)를 묘사하며, 여기서 MFIinh는 억제제의 존재시 검출된 MFI를 나타낸다. 결과는 12명의 기증자에게서 얻었고 statistical significance는 unpaired Student's test를 사용하여 원데이터에서 산출되었다,
(B) 만난(mannan)에 의한 DCs의 엔도시토시스의 억제. 만난(1mg/ml)으로 DCs 를 전배양(pre-incubation)을 한 후, 덱스트란(dextran)-FITC(50μg/ml) 또는 루시퍼 옐로우(lucifer yellow)(200μg/ml)를 2시간 동안 추가하였다.
도 2: DCs에 의한 FⅧ의 만노오스-민감 흡수(mannose-sensitive uptake)는 FⅧ-특이 CD4+ T 세포에 FⅧ-유래 펩티드의 제시에 귀착된다,
(A) DRB1*1501/DRB5*01 건강한 기증자에서 생성된 DCs는 배지에서 단독으로 또는 만난(1mg/ml) 또는 anti-CD206 IgG(10μg/ml)의 존재하에서 배양되고, 37℃ㅇ에서 20시간 동안 FⅧ의 다양한 복용량(5.56, 2.78 또는 1.39μg/ml) 및 20U/ml rhIL-2의 존재 하에 FⅧ-특이 T 세포 클론 D9E9(5000세포/well)로 배양하였다. T 세포의 활성화를 배양 상청액에 INF-감마를 방출한 후 사정하였다. 3 내지 8번의 독립 실험에서 하나의 대표적인 실험에서 결과를 얻었다. IFN-감마 수확량은 D9E9의 다른 배치 및 각 실험에서 사용된 기증자 DCs의 다른 근원마다 변화했다.
(B) MHC Ⅱ-일치된(matched) 기증자에서 생성된 DCs는 만난(1mg/ml) 또는 anti-CD206 IgG (10 μg/ml)로 전배양한 후, FⅧ(5.56μg/ml) 또는 서열번호(SEQ ID No) 9의) 펩티드 I2144-T2161(2μg/ml)와 D9E9를 첨가하였다. 각 처리에 있어, 각 실험에서 얻은 최대값에 대해 IFN-감마 생성을 묘사하였다(Mann-Whitney test를 이용하여 평가한 대로, *:P<0.0001). 결과를 3개의 개별 시험에서 얻었다.
(C) 인간 FⅧ-특이 HLA-일치된(matched) B 세포라인 LE2E9와 BO2C11, 또는 DCs를 FⅧ(10μg/ml)와 D9E9의 존재 하에 배양하였다.
도 3: B 도메인의 바깥쪽으로 위치한 만노오스 잔기가 T 세포 활성화를 유도 하는 DCs에 의한 FⅧ 엔도시토시스에서 상당한 역할을 하는 것으로 예상됨.
(A) FⅧ(40μg/ml 143nM, full circles)와 BDD-FⅧ(24.31μg/ml, 143 nM, empty circles) 또는 덱스트란(dextran)-FITC(50μg/ml)를 첨가하기 전에, DCs를 만난(1, 5, 10, 100 및 1000μg/ml)으로 전배양하였다. 항원의 흡수를 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다. 퍼센트 억제를 만난이 없는 상태에 대한 각 상태에 대해 산출하였다. 대표적인 두 독립 실험이 실행되었다.
(B) 천연 또는 EndoF1-처리된 BDD-FⅧ(3.7μg/ml)를 7.5% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 옮겨진 단백질이 Protogold®를 사용하여 E또는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)-결합 anti-human IgG를 사용하여 10μg/ml CTLD4-7-Fc로 배양하여 드러냈다. 경쇄(LC) 및 중연쇄(HC)를 LC- 및 HC-특이 단일클론 anti-FⅧ IgG로 블롯팅(blotting)하여 확인하였다.
(C) BDD-FⅧ를 EndoF1로 처리하자 마다 T 세포의 활성이 감소하였다. 결과는 3개의 독립 실험 중 1개를 대표로 묘사한다. IFN-감마 수확량은 D9E9의 다른 배치 및 다른 실험에서 사용된 인간 DCs의 다른 근원으로 변화했다. 통계적으로 3세트의 실험을 비교하기 위하여, IFN-감마의 생성을 각 개별 실험에서 얻은 최대값에 관하여 정상화했다. ANOVA와 Fisher' PSLD test 동안 평가된 것처럼, T 세포 활성화의 정상화하는 수준은 통계적으로 "배지" 및 "EndoF1-처리" 사이에서 상당한 차이가 있다(P<O.0001, 데이터 미도시).
도 4: 야생형(wild-type) 또는 돌연변이 FⅧ 경쇄에 의한 FⅧ-특이 T 세포 클론(D9E9)의 활성화.
(A) 및 (B) T 세포 활성화를 유도하는 FⅧ의 야생형 경쇄의 만노오스-민감 DC 침투의 확인. FⅧ(야생형 LCh)의 정제된 혈장(plasma)-유래 경쇄를 Endo-F1으로 처리하였다. 만난(1mg/ml)의 존재 하에 천연 야생형 Lch, 야생형 경쇄 및 EndoF1-처리된 야생형 경쇄를 DCs(패널 A) 또는 FⅧ-특이 B 세포 클론(B02C11, 패널 B)에 첨가하고, 20시간 동안 D9E9 세포와 공동배양하였다. D9E9의 활성화를 ELISA에 의하여 배지 상청액의 IFN-감마를 측정하여 사정하였다.
(C) 및 (D) FⅧ 경쇄의 특정부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis)에의한 D9E9의 활성화의 상실. BO2C11 B 세포 클론 및 단핵세포(monocyte)-유래 DCs를 야생형 Lch (패널 C)의 존재 하에 또는 돌연변이 Asn2118Ala LCh (패널 D)의 존재 하에 D9E9로 배양하였다. Ala 잔기에 의해 Asn2118를 치환하여 N-만노스화(N-mannosylation) 자리를 제거한다. D9E9의 활성화를 20 시간 후에 배지 상청액에서의 IFN-감마를 측정하여 사정하였다.
도 5: 전체-길이 FⅧ 구조의 개략적 표현.
(서열번호(SEQ ID No) 2의) 전체-길이 헤테로디머의(heterodimeric) 인간 FⅧ는 2332 아미노산으로 이루어져 있고 잔기 1 내지 1648에 대응하고 도메인 A1-a1-A2-a1-B를 포함하는 "중연쇄" 및 잔기 1649 내지 2332에 대응하고 도메인 a3-A3-C1-C2을 포함하는 "경쇄"를 포함한다(아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호(SEQ ID No) 2에 나타난 아미노산 서열을 의미한다). FⅧ 분자는 N-결합 당화(N-linked glycosylation)를 허용하는 25의 공통 서열(Asn-Xxx-Thr/Ser)를 포함하며, 그 중 20가 당화(glycosylated)된 것으로 보인다.
도 6: (서열번호(SEQ ID No) 1)에 개시된) 천연 전체-길이 인간 FⅧ의 아미노산 서열
밑줄이 그어진 아미노산 서열은 천연 전체-길이 인간 FⅧ의 처음 19 아미노산을 포함하는 신호 펩티드에 대응한다. (서열번호(SEQ ID No) 2의) 전체-길이 헤테로디머의 인간 FⅧ의 전형적인 아미노산 넘버링은 위치 20에 위치한 알라닌(Alanine) 잔기에서 시작한다. 볼드체로 표시된 아미노산 잔기는 본 발명의 구체예에서 바람직하게 변성된, 공통 당화(glycosylation) 위치에 대응한다.
B 도메인은 서열번호(SEQ ID No) 1로 표시한 아미노산 서열의 위치 760에서 위치 1667까지를 배열하는 아미노산 서열에 대응하며, 도 6에 개시한다.
"FⅧ의 정제된 혈장(plasma)-유래 경쇄"로 불리는, 실시예 6의 대조구로 이용되는 천연 경쇄는 서열번호(SEQ ID No) 1에 표시된 아미노산 서열의 위치 1668에서 위치 2351까지를 배열하는 아미노산 서열에 대응하며, 도 6에 개시한다.
천연 인간 FⅧ의 중연쇄는 서열번호(SEQ ID No) 1에 표시된 아미노산 서열의 위치 19에서 위치 759까지를 배열하는 아미노산 서열에 대응하며, 도 6에 개시한다.
도 7a 내지 7c: (삭제되는 B 도메인을 위한) BDD-인간 FⅧ.
인자 Ⅷ의 B 도메인은 전구응고(procoagulant) 활성에 필요 없는 것으로 보였다. 도 7a 내지 7c은 B 도메인이 서열번호(SEQ ID No) 2로 표시된 전체-길이 인간 FⅧ에서 제거될 때 얻어진 B-도메인-삭제된 인간 FⅧ에 일치하는 아미노산 서열 및 핵산 서열을 개시한다. (상부의) 각 아미노산이 (하부의) 대응하는 핵산 코 돈(codon)에 향하도록 아미노산 서열 및 핵산 서열이 함께 결합한다. BDD-인간 FⅧ에 일치하는 아미노산 서열 및 핵산 서열은 서로 각자 넘버링된다(넘버링은 서열의 오른쪽에 개시된다). 도 7a 내지 7c에 개시된 BDD-인간 FⅧ의 아미노산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 4로 표시된 서열과 대응한다. 도 7a 내지 7c에 개시된 인간 FⅧ의 핵산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 3에 개시된 서열에 대응한다. 볼드체로 표시된 아미노산 잔기 (또는 대응하는 핵산 잔기)는 본 발명의 구체예에서 바람직하게 변성된 공통 당화(glycosylation) 자리에 대응한다. 특성 "*"는 정지 코돈의 위에 위치한다.
도 8a 내지 8b: (서열번호(SEQ ID No) 2로 표시한 전체-길이 인간 FⅧ에 대하여) 위치 239에서 Asn를 Ala로 치환하여 변성된 인간 FⅧ 중연쇄
도 8a 내지 8b은 본 발명의 특정한 구체예에서 실행된 인간 FⅧ의 변성 중연쇄에 대응하는 아미노산 서열 및 핵산 서열을 둘 다 개시한다. (상부의) 각 아미노산이 (하부의) 대응하는 핵산 코돈을 향하도록 아미노산 서열 및 핵산 서열이 함께 결합한다. 인간 FⅧ의 변성된 중연쇄에 일치하는 아미노산 서열 및 핵산 서열은 서로 각각 넘버링된다(넘버링은 서열의 오른쪽에 개시된다). 도 8a 내지 8b에 개시된 인간 FⅧ의 변성 중연쇄의 아미노산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 6에 표시한 서열에 대응한다. 도 8a 내지 8b에 개시된 인간 FⅧ의 변성 중연쇄의 핵산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 5에 표시한 서열에 대응한다. 볼드체로 표시된 아미노산 잔기(알라닌(Alanine)) (또는 대응하는 핵산 코돈)은 본 발명의 구체예에서 변성된 당화(glycosylation) 위치(Asn 239)에 대응한다.
도 9a 내지 9b: (서열번호(SEQ ID No) 2로 표시한 전체-길이 인간 FⅧ에 대하여) 위치 2118에서 Asn을 Ala으로 치환하여 변성된 인간 FⅧ 경쇄
도 9a 내지 9b는 본 발명의 특정한 구체화에서 실행된 인간 FⅧ의 변성 경쇄에 일치하는 아미노산 서열 및 핵산 서열을 둘 다 개시한다. (상부의) 각 아미노산이 (하부의) 대응하는 핵산 코돈을 향하도록 아미노산 서열 및 핵산 서열이 함께 결합한다. 인간 FⅧ의 변성된 경쇄에 일치하는 아미노산 서열 및 핵산 서열은 서로 각각 넘버링된다(넘버링은 서열의 오른쪽에 개시된다). 도 8a 내지 8b에 개시된 인간 FⅧ의 변성 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 8에 표시한 서열에 대응한다. 도 8a 내지 8b에 개시된 인간 FⅧ의 변성 경쇄의 핵산 서열은 서열번호(SEQ ID No) 7에 표시한 서열에 대응한다. 볼드체로 표시된 아미노산 잔기(알라닌(Alanine)) (또는 대응하는 핵산 코돈)은 본 발명의 구체예에서 변성된 당화(glycosylation) 위치(Asn 2218)에 대응한다.
도 10: 야생형 또는 돌연변이 FⅧ 경쇄에 의한 쥐에서 anti-FⅧ IgG의 생산.
인간 FⅧ의 정제된 혈장(plasma)-유래 경쇄(wtLCh) 및 FⅧ의 돌연변이화된 LCh(Asn2118Ala LCh)를 일주일 간격으로 4번 FⅧ-결핍 쥐에 정맥으로 (200μL PBS에서 0.2μg 단백질) 주사하였다. 4번째 주입 후 일주일 후, 쥐가 피를 흘렸고 FⅧ-특이 ELISA를 사용하여 anti-FⅧ IgG의 수준을 조사하였다. 1에서 90으로 희석한 쥐 혈청을 인간 FⅧ로 코팅한 ELISA 플레이트에서 배양하였다. (Recombinate, Baxter) 퍼옥시다아제에 결합한 anti-쥣과 IgG, 및 그 기질(OPD)을 사용하여 결합 IgG를 노출하였다. 결합의 세기를 분광계(Tecan Genyos)로 492nm에서 광밀 도(optical density)로 측정하였다.
도 11: 만노오스-잔기로 종결된 3종류의 글리칸(glycan)-구조의 개략적인 표시
여기에 사용된 것처럼, "FⅧ 단백질"은 적어도 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 분자를 의미하나, 이 폴리펩티드로 제한되지 않는다. 그러므로 본 발명의 FⅧ 폴리펩티드는 본 발명의 FⅧ 단백질의 아미노산 함량의 적어도 약 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 의미한다. FⅧ 단백질의 FⅧ 폴리펩티드의 비율이 100% 다를 때, FⅧ 단백질은 어떤 다른 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그로 인해 FⅧ 단백질은 융합 단백질(chimeric protein)로 고려되어야 한다. FⅧ 단백질에 포함된 부가적인 아미노산 서열은 FⅧ 폴리펩티드와 공유 또는 비공유 결합할 수도 있고, 어떤 자연 또는 합성 폴리펩티드와 대응하거나 그로부터 기인할 수 있다. 이 부가적인 아미노산 서열은 효소 또는 활성 단백질로, 세포 트래피킹(cellular trafficking), 트랜스로케이션(translocation), 익스포테이션(exportation), 분비(secretion)를 위한 신호 서열로 작용할 수 있고, 또는 다른 효소 및/또는 가공 단백질을 위한 인지 서열의 역할을 할 수 있다.
여기에 사용된 것처럼, "FⅧ 폴리펩티드"는 응고활성을 가지며 서열번호(SEQ ID No) 2의 전체-길이 인간 인자 Ⅷ와 비교되는 유사한 트롬빈 활성화 프로파일을 가지며, 서열번호(SEQ ID No) 2로 표시된 폴리펩티드 서열의 1-740 및 1689-2332 영역과 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100%의 상동성(identity)을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 다양한 인자 Ⅷ가 응고 활성을 가지는 한, 특정한 비보존(non-conservative) 아미노산 변화뿐만 아니라 다양한 돌연변이 및 보존(conservative) 아미노산 변화가 허용된다. 단편과 특정한 당화(glycosylation)가 또한 허용되고, 폴리펩티드가 그 고유 활성을 유지하는 한 인자 Ⅷ 폴리펩티드에 어떤 변화도 허용된다.
여기에 사용된 것처럼, "FⅧ 폴리펩티드" 또한 응고 활성과 서열번호(SEQ ID No) 2의 전체-길이 인간 인자 Ⅷ와 비교하여 유사한 트롬빈 활성화 프로파일을 가지며, 서열번호(SEQ ID No) 2의 전체-길이 인간 인자 Ⅷ에 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 다양한 인자 Ⅷ가 응고 활성을 가지는 한, 특정한 비보존(non-conservative) 아미노산 변화뿐만 아니라 다양한 돌연변이 및 보존(conservative) 아미노산 변화가 허용된다. 단편과 특정한 당화(glycosylation)가 또한 허용되고, 폴리펩티드가 그 고유 활성을 유지하는 한 인자 Ⅷ 폴리펩티드에 어떤 변화도 허용된다.
여기에 사용된 것처럼, "변성 FⅧ 폴리펩티드"는 폴리펩티드 변이체가 서열번호(SEQ ID No) 2의 적어도 약 1-740 및/또는 1689-2332 폴리펩티드 서열과 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열과 동일한 서열을 포함하는 한, 폴리펩티드의 어떤 다른 영역의 폴리펩티드 분자에서 치환 및/또는 삽입 및/또는 삭제되는 것을 포함하여, 천연, 전체-길이에 또는 BDD-FⅧ 중 요하지 않은(non-critical) 영역에서 특정 수의 아미노산 또는 아미노산의 변경을 포함할 수 있고 변이체의 존재로 인해 FⅧ 활성이 방해되지 않는다.
여기에 사용된 것처럼, "변성 FⅧ 폴리펩티드"은 지시된 참조 서열, 즉 서열번호(SEQ ID No) 2의 인간 전체-길이 인자 Ⅷ에 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 상동성 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
여기에 사용된 것처럼, 용어 "변성(modified)"은 참조 (예를 들면, 전체-길이 인자 Ⅷ 서열) 폴리펩티드에 비교하여 그 아미노산 서열에 일부 차이가 있는 분자를 의미한다. 아미노산 변경은 천연 또는 전체-길이 아미노산 서열에서 치환, 삽입, 삭제 또는 그런 변화의 어떤 원하는 조합일 수도 있다. 치환은 분자의 단지 하나의 아미노산만 치환되는, 단일일 수도 있고, 2개 이상 아미노산이 동일한 분자에서 치환되는, 다중일 수도 있다.
본 발명의 FⅧ 폴리펩티드의 특성을 개량하거나 바꾸기 위하여, 아미노산 엔지니어링이 채용될 수도 있다. 단일 또는 다중 아미노산 치환, 삭제, 추가 또는 융합 단백질(fusion protein)을 포함하여 새로운 돌연변이 폴리펩티드를 창조하기 위해 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 그런 변성 폴리펩티드는 예를 들면 증가한/감소한 활성 또는 증가한/감소한 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 그들은 더 높은 수확량으로 정제될 수 있고 적어도 특정 정제 및 저장 상태에서, 대응하는 천연 폴리펩티드보다 더 가용성을 나타낼 수도 있다.
여기에 사용된 것처럼, 용어 "폴리펩티드"는 전체-길이 단백질 분자뿐만 아니라, 그 자체로 또는 다른 단편과 함께, clotting assay에서 FⅧ 전구응 고(procoagulant) 활성을 생성하는, 단편을 포함한다. 본 발명의 신규한 단백질 생성물의 합성 폴리펩티드는 본 발명의 범위 내이며 또한 표준합성법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 여기에 이용된 아미노산 넘버링 시스템에서, 아미노산 잔기 1은 천연, 성숙한 FⅧ 단백질의 첫 번째 잔기이다. 또한, 용어 "도메인"은 당업자에게 공지된, FⅧ의 유사한(approximate) 영역을 의미한다.
본 출원에서 사용된 아미노산 심벌은 다음을 포함한다: 본 출원에 걸쳐 아미노산에 대한 1글자 약어와 3글자 약어가 모두 사용되며, 서로 교환가능하게 사용되며, 다음의 의미가 있다: A 또는 Ala=알라닌(alanine); R 또는 Arg=아르기닌(arginine); N 또는 Asn=아스파라긴(asparagine); D 또는 Asp=아스프르트산 (aspartic acid); C 또는 Cys=시스테인(cysteine); Q Gln=글루타민(glutamine); E 또는 Glu=글루탐산(glutamic acid); G 또는 Gly=글라이신(glycine); H 또는 His= 히스티딘(histidine); I 또는 Ile=이소류신(isoleucine); L 또는 Leu=류신 (leucine); K 또는 Lys=라이신(lysine); M 또는 Met=메티오닌(methionine); F 또는 Phe=페닐알라닌(phenylalanine); P 또는 Pro=프롤린(proline); S 또는 Ser=세린(serine); T 또는 Thr=트레오닌(threonine); W 또는 Trp=트립토판(tryptophan); Y 또는 Tyr=티로신(tyrosine); 및 V 또는 Val=발린(valine).
또한, 여기에 이용된 것처럼, "변성 FⅧ 폴리펩티드의 변성"은 기능 및 결과가 동일한 한, 나타낸 것과 정확한 언급한 수 또는 위치로 제한되는 것은 아니다. 트롬빈 절단 또는 전구응고(procoagulant) 기능이 유지된 것 같은 기능적 활성이 동일한 한, 일부 아미노산 위치가 N- 또는 C-터미널 말단 또는 인간 전체-길이 인 자 Ⅷ의 다른 부분에서 삽입, 추가 또는 삭제될 수 있다. 당화(glycosylation), 단백질 가수분해 절단, 항체 또는 다른 세포질 리간드(ligand)에의 결합 등등과 같은, 번역(translation) 동안 또는 그 후에 다르게 변성되는 단백질, 단편 또는 그 유래물의 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 그 유래물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
여기에 사용된 것처럼, "단편(fragment)"은 유용하고 기능적 특성을 유지하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들면 본 발명의 문구에서 사용되는 것과 같이, 인자 Ⅷ 폴리펩티드 단편은 혈액을 응고시키는 기능을 가진다.
여기에 사용되는 것과 같이, 인자 Ⅷ 전구응고(procoagulant) 활성을 가지는 단백질은 실험실 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo) 모델 시스템(model systems)에서 인자 X를 활성화하는 단백질이다. 제한하지 않은 예로서, 이 정의는 전체-길이 재조합 인간 인자 Ⅷ 및 B 도메인을 삭제한 인자 Ⅷ를 포함한다. 여기에 사용된 것처럼, 용어 "전구응고-활성(procoagulant-active)" 및 "활성" FⅧ는 clotting assay에서 전구응고(procoagulant) 활성을 나타내는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하는 것으로 바꾸어 사용될 수 있다. 용어 FⅧ는 FⅧa를 포함하는 것으로 여기에서 사용될 수 있고, 당업자는 용어 (전-트롬빈 활성화된 FⅧ 또는 트롬빈 활성화된 FⅧ(FⅧa))는 그 용어를 사용한 것으로 예정하는 것으로 이해할 것이다. 여기에 사용된 것처럼, "만노오스 잔기로 종결된 글리칸(glycan)-구조 당화되지 않은 FⅧ 폴리펩티드(glycan-structure terminated with mannose residue deglycosylated FⅧ polypeptide)"는 하나 이상의 만노오스 잔기 로 종결된 글리칸 구조가 결여된 FⅧ 폴리펩티드를 또는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 의미한다.
여기에 사용된 것처럼, "만노오스 잔기로 종결된 글리칸-구조"는 폴리펩티드 백본에서 떨어진 곳에서 하나 이상의 만노오스 잔기로 종결된 당화(glycosylation) 위치의 글리칸-구조를 의미하며, 그런 만노오스 잔기를 터미널-만노오스 잔기라 한다. 용어 "만노오스 잔기로 종결된 글리칸-구조"는 폴리펩티드 백본에서 떨어진 곳에서 하나 이상의 만노오스 잔기를 가지는 모노-안테너리(mono-antennary) 및 멀티안테너리(multi-antennary) 글리칸-구조를 포함하며, 특히 용어 "만노오스 잔기로 종결된 글리칸-구조"는 올리고만노오스-유형(oligomannose-type) 글리칸-구조를 포함한다(도 11).
여기에 사용된 것처럼, "터미널-만노오스 잔기"는 당화(glycosylation) 위치에서 글리칸 구조의 안테나를 종결하는 폴리펩티드 백본에서 떨어진 만노오스 잔기를 의미한다(도 11).
여기에 사용된 것처럼, 용어 "높은 엄격도(stringency) 조건 하에서 혼성화될 수 있는(capable of hybridizing under high stringency conditions)"은 높은 엄격도(stringency) 조건 하에서 관심 대상의 DNA에 상보적인 DNA 가닥을 어닐링(annealing)하는 것을 의미한다. 마찬가지로, "낮은 엄격도(stringency) 조건 하에서 혼성화될 수 있는"은 낮은 엄격도(stringency) 조건 하에서 관심대상의 DNA에 상보적인 DNA 가닥을 어닐링하는 것을 의미한다. 어닐링을 위한 "높은 엄격도(stringency) 조건"은 미스매치된 염기쌍 사이에서 수소결합 접촉에 불리한 예를 들면 높은 온도 및/또는 낮은 염 함량을 포함할 것이다. "낮은 엄격도(stringency) 조건"은 높은 엄격도(stringency) 조건보다 낮은 온도 및/또는 높은 염 농도를 포함할 것이다. 그런 조건은 두 가닥 사이에 완전한 상보성이 그 근처에 존재하지 않더라도, 유전암호의 퇴보(degeneracy) 때문에 서열은 다르지만 동일한 단백질을 암호화하는 DNA 가닥 사이의 경우에 두 DNA 가닥이 어닐링될 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적당한 엄격한 조건은 예를 들면, 약 45℃에서 6*SSC에 이어 50℃에서 2*SSC의 세척이 당업자에게 공지되어 있고 Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31- 6.3.6의 Current Protocols에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 세척 단계의 염 농도는 약 50℃에서 2*SSC의 낮은 엄격도(stringency)부터 약 50℃에서 2*SSC의 높은 엄격도(stringency)에서 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 실내 온도, 약 22℃의 낮은 엄격도(stringency)에서 약 75℃의 높은 엄격도(stringency) 조건으로 증가할 수 있다. 다른 엄격도(stringency) 매개변수는 Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), at pp. 387-389; 또한 Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring , N.Y. at pp. 8.46-8.47 (1989)을 참조한다.
여기에 사용된 것처럼, "캐리어(carriers)"는 채택된 복용량 및 농도에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 약학적으로 이용가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정제를 포함한다. 종종 약학적으로 이용가능한 캐리어는 pH 버퍼 수용액이다. 약학적으로 이용가능한 캐리어의 예는 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같 은 버퍼; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 이하) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈( polyvinylpyrrolidone)와 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하여 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(counterion); 및/또는 TWEEN(R), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS(R)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에 사용된 것처럼, "유효량(effective amount)"은 유리한 또는 원하는 임상 또는 생화학적인 결과를 초래하게 충분한 양이다. 유효량은 한 번 이상 투여될 수 있다. 본 발명을 위해, 억제제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행성을 누그러지게 하거나, 개량하거나, 안정시키거나, 반전하거나, 늘리게 하거나 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 본 발명의 바람직한 구체화에서, "유효량"은 혈액을 응고시킬 수 있는 화합물의 양으로 정의된다.
여기에 사용된 것처럼, "숙주세포"는 개별 세포 또는 세포 배양체를 포함하며, 본 발명의 벡터의 수용체일 수 있다. 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함하고, 자손은 반드시 자연적이고, 우발적인, 계획적인 돌연변이 및/또는 변화에 기인하여 본래 부모 세포와 (형태학적으로 또는 총 DNA complement에서) 완전하게 동일할 필요가 없다. 숙주세포는 안지오제닉 인자(angiogenic factor)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 생체외(ex vivo) 또는 생체내(in vivo)에서 감염된(transfected or infectected) 세포를 포함한다.
여기에 사용된 것처럼, "정제된(purified)" 또는 "분리된(isolated)"은 그들의 자연적인 환경에서 제거되고 고립 또는 분리되고 그들이 자연적으로 결합하는 다른 조성물요소가 없는 생물학적 분자를 의미한다.
여기에 사용된 것처럼, "치료"는 유리한 또는 원하는 임상 결과를 얻기를 위한 접근이다. 이 본 발명을 위해, 유리한 또는 원하는 임상 결과는 검출할 수 있는 또는 검출할 수 없든 간에 (부분적이든 전체적이든지) 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개량 또는 완화, 일시적 완화(remission) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 때 예상된 생존에 비하여 연장된 생존을 의미한다. "치료"는 치료적 치료 및 질병 예방적(prophylactic or preventative) 측정을 둘 다 의미한다. 치료가 필요한 사람은 질병을 예방할 사람뿐만 아니라 이미 병에 걸린 사람을 포함한다. 질병을 "완화하는 것(Palliating)"은 치료를 하지 않은 상황에 비하여 질병 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 줄어들고 및/또는 진행성의 시간 과정이 감속되거나 길어지는 것을 의미한다.
여기에 사용된 것처럼, "벡터", "폴리뉴클레오티드 벡터", "구조물(construct)" 및 "폴리뉴클레오티드 구조물(polynucleotide construct)"는 여기에서 서로 교환하여 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스 외피(retroviral coat)에 쌓인 RNA, 아데노바이러스 외피(adenovirus coat)에 쌓인 DNA, (단순포진(herpes simplex), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus; AAV)와 같은) 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태, 리포솜에 쌓인 DNA, 폴리리신(polylysine)과 결합한 DNA, 다중 양이온(polycationic) 분자와 결합한 DNA, 분자를 면역학적으로 "마스크를 씌우는" 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물에 결합한 DNA 및/또는 반감기를 증가하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물에 결합한 DNA, 또는 비바이러스성 단백질에 결합한 DNA를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
FⅧ 유래물을 인코딩하는 DNA 서열 및 예를 들면, DHFR(dihydrofolate reductase) 단백질을 둘 다 포함하는, 본 발명의 벡터에 의한 감염(transfection)을 위해 바람직한 숙주세포를 선택함에 있어, 채택된 DHFR 단백질의 유형에 따라 숙주세포를 선택하는 것이 적합하다. 야생형 DHFR 단백질을 채택하는 경우, DHFR 이 결핍된 숙주세포를 선택하는 것이 바람직하며, 이는 성공적인 감염을 위해, 하이포잔틴(hypoxanthine), 글라이신, 티미딘이 결핍된, 선택 배지에서 마커(marker)로서 DHFR 코딩 서열을 사용할 수 있게 한다. 한편, 메토트렉사트(methotrexate; MTX)에 대해 낮은 결합 친화성을 가진 DHFR 단백질을 조절 서열(regulatory sequence)로 이용하는 경우, DHFR 저항 세포를 이용할 필요가 없다. 돌연변이 DHFR는 MTX에 저항성을 가지며, 그러므로 MTX 함유 배지는 MTX에 민감한 숙주세포를 제공하는 선택 수단으로 사용될 수 있다. 또는, 야생형 DHFR 유전자는 하이그로마이신(hygromycin) 저항성과 같은, 선택 마커로서 채용되는 제2 약물을 제공하는 DHFR에 결핍되지 않은, 숙주세포의 증폭 마커로서 채용될 수 있다. 숙주세포로서 MTX에 저항성을 가지는 CHO 세포(CHO-DBX11 세포) 및 벡터에 FⅧ 유래물과 DHFR를 조정하기 위해 조절 서열로서 CMV 및 SV40 프로모터를 채용하는 예가 각각 개시되어 있다. 다른 선택 마커는 네오마이신(neomycin), 하이그로마이신, 메토트렉사트와 같은 약물에 저항성을 주는 유전자를 포함한다.
여기에 사용된 것처럼, "DNA"는 염기 A, T, C 및 G를 포함하고, 또한 메틸화된 뉴클레오티드, 비전하 결합(uncharged linkages) 및 티오산(thioate), 당 유사체의 사용, 및 폴리아미드와 같은 변성 및/또는 다른 백본 구조 같은 인터뉴클레오타이드 변성체(internucleotide modifications)와 같은 이들 염기의 유사체 또는 변성된 형태를 모두 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 위에 기술된 본 발명의 핵산 분자의 일부와 엄격한 혼성 조건 하에서 혼성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 혼성화된 폴리뉴클레오티드는 상기에서 언급한 것과 같이 프로브(probe)와 프라이머(primer)로 유용하다. FⅧ 폴리펩티드 인코딩 서열과 혼성화된 폴리뉴클레오티드의 일부는 5' 및 3' 염기 위치에 의해 또는 상술한 것과 같이 뉴클레오티드 염기에서 크기에 의하여 정확하게 특정될 수 있으며 또는 같은 방식으로 상술한 대로 정확하게 제외될 수 있다. 유사하게, FⅧ 폴리펩티드에 혼성화된 폴리뉴클레오티드의 일부는 또한 프로브(probe)와 프라이머(primer)로 이용될 수도 있다. 본 발명의 바람직한 혼성화된 폴리뉴클레오티드는 표지되고 기술분야에서 공지된 혼성화 분석방법(예를 들면, Southern and Northern blot analysis)에서 사용될 때, 등몰량(equimolar amount)으로 존재하는 다른 이종(heterologous) 서열에 관계없이 가 장 강한 신호 강도를 나타내는 것이다.
여기에 사용되는 것과 같이, 변성 핵산 서열은 뉴클레오티드 치환, 삭제, 또는 추가에 의해 생성된 것을 포함한다. 치환, 삭제 또는 추가는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할지도 모른다. 아미노산 서열의 변경은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 삭제 또는 추가를 생성할 수도 있다. 특히 그 중 본 발명 부분의 폴리펩티드의 성질 및 활성을 바꾸지 않는, 사일런스(silent) 치환, 추가 및 삭제가 바람직하다. 또한, 보존적 치환이 이런 맥락에서 바람직하다.
본 발명은 원핵세포 또는 진핵세포인, 숙주세포 및 세포라인을 감염(transfect)하는 것뿐만 아니라 발현 벡터의 서열의 사용을 허용한다. 본 발명은 또한, 발현벡터에서 표현된 폴리펩티드의 정제를 허용한다. 발현벡터는 정제를 용이하게 하기 위해 다양한 분자 태그를 포함할지도 모른다. 이어서 얻어진 발현 구조물은 선택한 어떤 숙주세포로도 변형될 수도 있다. 숙주세포에서의 세포 용출물(lysates)은 기술분야에서 공지된 일정한 방식으로 분리된다.
특정한 구체화에서, FⅧ 단백질을 인코딩하는 서열 또는 변성된 인자 Ⅷ 폴리펩티드를 포함하는 핵산은 유전자 치료로서, 본 발명의 폴리펩티드의 이상한 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 치료, 억제 또는 예방하기 위하여 투여된다. 유전자 치료는 발현된 또는 발현될 수 있는 핵산의 대상에 투여되어 실행된 치료를 의미한다. 본 발명의 이 구체화에서, 치료적 효력을 중재하는 그들의 인코딩된 단백질이 핵산에 의하여 생성된다.
기술분야에서 이용가능한 유전자 치료를 위한 어떤 방법도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직한 측면에서, 핵산 서열은 인자 Ⅷ 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 그 핵선 서열은 적당한 숙주에 있는 폴리펩티드를 발현하는 발현벡터의 일부분이다. 특히, 그런 핵산 서열은 폴리펩티드 코딩 영역에 작동가능하게 연결된(operably linked) 프로모터를 포함하며, 사기 프로모터는 유도할 수 있고, 구조적이며, 선택적으로 조직-특이적이다. 다른 특정한 구체화에서, 폴리펩티드 코딩 서열 및 어떤 다른 원하는 서열이 게놈의 원하는 위치에서 동일한 재조합(recombination)을 촉진하는 여역에 의해 측면에 위치하며, 따라서 항체 인코딩-핵산의 염색체 내의(intrachromosomal) 발현을 위해 제공한다. 환자가 핵산 또는 핵산-전달 벡터에 직접 노출되는 경우에는 직접, 또는 세포가 실험실내에서(in vitro) 핵산으로 먼저 형질전환되고 나서 환자에 이식되는 경우에는 간접적으로 핵산이 환자에 전달될 수 있다. 이러한 두 접근방식은 생체내의(in vivo) 또는 생체외의(ex vivo) 유전자 치료로서, 각각 알려졌다.
특정한 구체화에서, 핵산 서열은 직접 인코딩된 생성물을 생성하기 위하여 발현되는 생체 내에(in vivo) 직접 투여된다. 이것은 적당한 핵산 발현벡터의 일부로서 핵산 서열을 구조화하고 투여하여 핵산 서열이 세포 내로 도입시켜서, 또는 불완전한(defective) 또는 약해진(attenuated) 레트로바이러스성 또는 다른 바이러스성 벡터를 이용하여 감염시켜서, 또는 나출(naked) DNA의 직접 주입, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 감염제(transfecting agents)로 코팅, 리포솜, 마이크로파티클 또는 마이크로캡슐에 캡슐화하여, 또는 핵(nucleus)을 도입하기 위해 알려진 펩티드에 연결된 핵산 서열을 투여하여, (수용체를 특이하게 발현하는 표적 세포 유형에서 사용될 수 있는) 수용체-중재 엔도시토시스에 관한 리간드에 연결된 핵산을 투여하여 등등의 기술분야에서 공지된 많은 방법을 통해 이루어질 수 있다.
또는, 핵산은 세포 내로 도입되고, 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 발현을 위한 숙주세포 DNA 안으로 통합될 수 있다. 특정한 구체화에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스성 벡터가 사용된다. 유전자 치료에 사용되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 환자에 유전자 전달을 초진하는, 하나 이상의 벡터로 복제된다. 레트로바이러스(Retroviral) 벡터, 아데노바이러스(adenoviral) 벡터 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)가 사용될 수 있는 바이러스성 벡터의 예이다. 레트로바이러스(Retroviral) 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패킹 및 숙주세포 DNA로 통합에 필요한 조성물요소를 포함한다.
유전자 치료에 대한 다른 접근방식은 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 중재 감염(calcium phosphate mediated transfection) 또는 바이러스 감염과 같은 방법으로 조직 배양의 세포로 유전자를 옮기는 것을 포함한다. 보통, 전달 방법은 세포에 선택 마커의 전달도 포함한다. 그러고 나서 전달된 유전자를 발현하는 세포를 분리하기 위해 선택한다. 그런 세포를 환자에게 전달한다. 이 구체화에서, 재조합 세포를 생체내에서(in vivo) 투여하기 전에 핵산을 세포로 도입한다. 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지로의 감염(transfection), 전기천공, 미세주입(microinjection), 감염(infection), 세포 융합, 염색체-중재 유전자 전달, 마이크로 셀(microcell)-중 재한 유전자 전달, 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion) 등을 포함하는 기술분야에서 공지된 방법으로 세포에 도입하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포로 외래 유전자를 도입하는 많은 기술이 공지되었고, 수용체 세포의 발생 기능 및 생리 기능이 혼란되지 않는 한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 세포에 핵산이 안정되게 전달되기 위한 기술이 제공되어, 핵산이 세포에 의하여 발현되고 바람직하게 유전되어 세포 자손에 의해 발현될 수 있다.
핵산이 유전자 치료를 위해 도입될 수 있는 세포는 모든 원하는, 이용가능한 세포 유형을 포함하고, 예로서 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트(keratinocytes), 섬유아세포, 근육 세포, 간세포(hepatocyte); T-림프구, B-림프구, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포(megakaryocytes), 과립구(granulocytes)와 같은 혈핵 세포; 각종 줄기 또는 전구(prognitor) 세포, 특히, 골수, 탯줄 혈액, 말초혈액(peripheral blood), 태아 간 등과 같은 조혈간세포(hematopoietic stem cell) 또는 전구(prognitor) 세포가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체화에서, 본 발명은 혈액 응고 질병을 위한 치료와 관한 것이다. 이 방식에서, 혁신적인 치료 화합물은 혈액 응고를 자극하는 화합물을 제공하여 질병으로 고통받는 또는 고통받기 쉬운 환자에 투여될 수 있다. 특히, 질병은 혈우병, 특히 혈우병 A일 수도 있다. 치료 화합물의 제제(formulation)는 기술분야에서 일반적으로 알려져 있고 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton. Pa., USA.을 참조할 수 있다.
용량 요법(dosage regime)은 최적 치료 반응을 제공하기 위하여 조정될지도 모른다. 예를 들면, 몇 번 분할한 복용량을 매일 투여할 수 있고 또는 급박한 치료 상황에 나타낸 것과 같이 비례적으로 감소할 수도 있다. 활성 화합물은 경구루트, (수용성인) 정맥 루트, 근육 내 루트, 피하 루트, 코 안 루트, 피내 루트, 좌약 루트와 같은 편리한 방법으로 또는 (예를 들면 복강 내 루트에 의해 느린 방출 분자를 이용하여 또는 예를 들면 실험실 내에서(in vitro) 민감해지고 수령체로 채용적으로(adoptively) 전달되는 단핵세포(monocyte) 또는 수지상 세포(dendritic cell) 등과 같은 세포를 이용하여) 이식하여 투여될 수 있다. 투여 루트에 따라서, FⅧ 단백질 또는 변성 FⅧ 폴리펩티드가 효소, 산 및 상기 성분을 불활성화하는 다른 자연 상태에서 FⅧ 단백질 또는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 보호하는 물질로 코팅할 필요가 있을 수도 있다.
주사 가능한 사용을 위해 적당한 약제 형태는 (수용성인) 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 형태는 무균상태이어야 하며 실린지가능성(syringability)이 존재하는 정도까지 유동성이어야 한다. 제조와 저장 조건 하에서 안정되어야 하고 박테리아와 균류와 같은 미생물의 오염 활성에 대항하여 보존되어야 한다. 캐리어는, 예를 들면, 물, 에탄올, (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등등의) 폴리올, 그 적당한 혼합물 및 식물성 기름 등을 포함하는 용매 또는 분산매체일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산제의 경우 요구되는 파티클 사이의 유지에 의해, 및 수퍼팩턴트(superfactants)의 사용에 의 해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀, 소르빈산(sorbic acid), theomersal 등등과 같은 각종 항균제 및 항진균제에 의해 미생물 작용의 예방할 수 있다. 많은 경우, 당 또는 염화나트륨 등과 같은 등장화제(isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 주사 가능한 조성물의 흡수를 연장하기 위해서 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제의 조성물을 사용할 수 있다.
무균의 주사 가능한 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 무균-여과 용액에서 어떤 추가적인 원하는 성분에 더하여 활성 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 기술과 동결 건조 기술이다.
펩티드가 상술한 대로 적당히 보호될 때, 활성 화합물은 예를 들면, 비활성 희석액 또는 소화가능한 식용 캐리어와 함께 경구로 투여되거나 또는 단단하거나 부드러운 쉘 젤라틴 캡슐로 둘러싸일 수도 있고 또는 정제(tablet)로 압축될 수도 있으며, 또한 식품에 직접 통합될 수도 있다. 경구로 치료적으로 투여하기 위해, 활성 화합물은 부형제와 통합되고 섭취가능한(ingestible) 정제, 구중정(troches), 구강정(buccal tablet), 캡슐, 엘릭실제(elixirs), 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 이용될지도 모른다.
정제, 환약, 캡슐 등등은 다음의 것을 또한 포함할 수도 있다: 트라가칸트 고무(tragacanth gum), 아카시아(acacia), 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 바인더; 인산일수소칼슘(Dicalcium phosphate)과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자전분, 알긴산 등과 같은 붕해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로오스, 락토오스 또는 사카린(saccharin)과 감미료(sweetening agent)를 추가될 수 있고 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일(oil of wintergreen) 또는 체리향(cherry flavoring)과 같은 착향료(flavoring agents)가 추가될 수도 있다. 복용량 단위 형태가 캡슐일 때, 상술한 유형의 물질 이외에, 액체 캐리어를 포함할지도 모른다. 다양한 다른 물질이 코팅되어 또는 복용량 유닛의 물리적 형태를 변형하여 제공될 수 있다. 예를 들면, 정제, 환약 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당 또는 둘 다에 의해 코팅될 수도 있다. 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)는 활성 화합물, 감미료로서 수크로오스, 방부제로서 메틸파라벤(Methylparaben) 및 프로필 파라벤(propyl paraben), 체리 또는 오렌지향과 같은 염료 및 착향료를 포함할 수 있다. 물론, 복용량 단위 형태의 제조에 이용된 모든 물질은 채용된 양이 약학적으로 순수하며 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방출형(sustained-release) 제조 및 정제로 통합될 수 있다.
여기에 이용된 것처럼, '약학적으로 이용가능한 캐리어 및 또는 희석액(diluent)"은 모든 용매, 분산제, 코팅 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제 활성 기질을 위해 그런 매체나 약품을 사용하는 것은 기술분야에서 공지되어 있다. 유효 성분과 비상용성(incompatible)인 종래의 매체 또는 약제를 제외하고, 치료 조성물에서의 사용을 예상할 수 있다. 보충적인 유효 성분이 또한 조성물에 통합될 수 있다.
용이한 투여와 균등한 복용량을 위해 복용량 단위 형태에서의 비경구적인 조성물을 공식화하는 것이 특히 유리하다. 여기에 사용되는 것과 같이 복용량 단위 형태는 치료될 포유류를 위해 단일 복용량으로 맞춘 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각 단위는 요구되는 약학적 캐리어와 결합하여 원하는 치료적 효과를 가져오기 위해 산출된 활성 물질의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명의 복용량 단위 형태를 위한 설명서는 (a) 활성 물질의 유일한 특성 및 달성될 특정 치료효과 및 (b) 신체적인 건강이 손상된 병에 걸리는 조건을 가지는 생명체의 질병 치료를 위한 그런 활성 물질을 합성하는 기술분야에서 고유한 제한에 의해, 활성 물질 및 달성될 특정한 치료 효력에 직접적으로 의존적이라고 적혀있다.
주요한 유효 성분은 복용량 단위 형태의 적당한 허용가능한 캐리어를 가진 유효량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 합성된다.
그 투여가 투여받는 동물에 내성이 있고 동물에 투여하기에 적당하다면, 조성물은 "약리학적으로 또는 생리적으로 허용가능"하다고 한다. 투여된 양이 생리학적으로 상당하다면, 그런 약제는 "치료적으로 유효량"으로 투여되었다고 한다. 약제의 존재로 투여된 환자의 생리에 탐지가능한 결과가 일어난다면 약제는 생리적으로 상당하다.
특정한 구체화에서, 포유류 세포 배양은 본 발명에 개시된 기능적인 인간 FⅧ 유래물을 생성하기 위하여 외래 DNA를 발현하는 방법이다. 특히, CHO(Chinese hamster ovary) 세포라인, BHK(Baby hamster kidney) 세포라인, COD 세포라인, HKB11(Hybrid of Kidney and B cells; ATCC # CRL- 12568), COS-I (ATCC CRL 1650) 및 MDCK(Madin Darby canine kidney) 세포라인과 같은 재조합 단백질 생성에 사용되는 일반적인 포유류 세포가 있다. 그런 세포를 위한 발현벡터는 보통 (필요하다 면) 복제 원점, 어떤 필요한 리보솜 결합 자리를 따라, 발현될 유전자 앞에 위치한 프로모터, RNA 스플라이스 자리, 폴리아데닐레이션 자리 및 전사 종결 서열 등을 포함한다.
포유류 세포에서의 사용을 위해, 발현벡터의 조절 기능은 바이러스성 물질에 의해 제공될지도 모른다. 예를 들면, 통용되는 프로모터는 EF-1(elongation factor-1), SV40(Simian Virus 40) (15), CMV(Cytomegalovirus) (16) 및 아데노바이러스 2에서의 주요 후발 프로모터(major late promoter) (17)에서 유래된다. 또한, 게다가 그런 조절 서열이 숙주세포 체계와 호환이 되는 조건으로, 원하는 유전자 서열과 일반적으로 결합하는 프로모터 또는 조절 서열을 이용하는 것이 가능하고 때때로 바람직하다.
세포질 프로모터는 쥐 카파(kappa) 유전자 프로모터(18), 쥐 VH 프로모터 (19) 및 쥐 메탈로티오네인(metallothionein)-I 프로모터(20)를 포함한다. 발현벡터는 또한 프로모터에서 하류 및 FⅧ 서열 자체의 삽입 위치에서 상류에 위치한 RNA 스플라이싱 자리 세트를 포함할 수도 있다. 바람직한 RNA 스플라이싱 자리는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자에서 얻어질지도 모른다. 발현벡터는 또한, cDNA FⅧ 서열에 위치한 RNA 스플라이싱 자리의 세트를 포함할지도 모른다. 또한, 삽입 자리의 하류에 위치한 폴리아데닐레이션 신호가 발현 벡터에 포함된다. 특히 바람직한 폴리아데닐레이션 신호는 SV40에서의 초기(early) 또는 후발(late) 폴리아데닐레이션 신호(Kaufman and Shape, ibid.), 아데노바이러스 5 E1b 영역에 서의 폴리아데닐레이션 신호 또는 인간 성장 호르몬 유전자 종결자(21)를 포함한다. 발현벡터는 또한 프로모터와 RNA 스플라이싱 자리 사이에 위치한, 아데노바이러스 2의 삼부 리더(tripartite leader)와 같은, 비코딩(noncoding) 바이러스 선도 서열(leader sequence); 및 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따라 생성된 변성 FⅧ는 anti-FⅧ 항체 컬럼에 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수도 있다. 추가적인 정제는 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)와 같은 전통적인 화학정제방법에 의해 달성될지도 모른다. 바륨 시트레이트 침강법을 포함한, 다른 정제방법이 기술분야에 공지되어 있고, 신규한 변성된 FⅧ의 정제에 적용될지도 모른다. 실질적으로 순수한 변성 FⅧ는 약학적 용도로 사용될지도 모른다. 일단, 원하는 대로 부분적으로 또는 균일하게 정제되고 나서, 변성 FⅧ가 치료적으로 사용될지도 모른다.
여기에 사용된 것처럼, I2144-T2161 펩티드는 서열번호 9의 합성 펩티드이다. 이 펩티드는 만노오스화되지(mannosylated) 않아서, 만난은 수지상세포(dendritic cell)(DCs)와 같은, 항원 제시 세포(Antigen Presenting cell; APC)에 의해 수용체-중재 엔도시토시스에 아무 효력도 없다.
여기에 사용되는 것과 같이, D9E9 세포는 Marc Jacquemin(Ref Jacquemin Blood 2003)에 의해 개발된 인간 FⅧ-특이 CD4+ T 세포 클론이다. 이 세포는 이전에 엔도시토시스된(endocytosed) FⅧ 또는 FⅧ-유래 펩티드 I2144-T2161를 가지는 항원제시세포로 배양할 때 IFN-감마를 생산한다.
여기에 사용되는 것과 같이, LE2E9 세포는 Marc Jacquemin (Ref Peerlinck Blood 1999)에 의해 개발된 인간 FⅧ-특이 B 세포 클론이다. 이 세포는 FⅧ의 C1 도메인을 인식하는 인간 FⅧ-특이 IgG4를 생산한다.
여기에 사용되는 것과 같이, BO2C11 세포는 Marc Jacquemin (Ref Jacquemin Blood 1998)에 의해 개발된 인간 FⅧ-특이 B 세포 클론이다. 이 세포는 FⅧ의 C2 도메인을 인식하는 인간 FⅧ-특이 IgG4를 생산한다.
여기에 사용된 것처럼, CTLD4-7Fc 분자는 쥣과 대식세포 만노오스 수용체(CD206)의 도메인 2 내지 7을 포함하는 융합 구조물이다. CTLD4-7Fc 분자는 Luisa Martinez-Pomares(Linehan 2001 Eur J Immunol)에 의해 생산되었다.
여기에 사용되는 것과 같이, 수지상 세포(dendritic cell)(DC)는 다양한 특이 표면 마커(CD1a, CD11c, HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD40,…) 및 기능(항원의 엔도시토시스, T 림프구(lymphocyte)에 항원의 제시)에 의해 특징화된 항원 제시 세포이다.
여기에 사용되는 것과 같이, anti-CD206 PAM-1 항체는 인간 대식세포 만노오스 수용체(CD206)에 대항하여 특이하게 지시된 항체이다. 그것은 P. Allavena(Laboratory of Cellular Immunology, Institute Mario Negri, Milan, Italy)에 의해 생산되었다.
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 1의 아미노산 서열, 즉 19 아미노산 신호 펩티드를 포함하는 천연 전체-길이 인간 인자 Ⅷ의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00001
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 2의 아미노산 서열, 즉 19 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는 전체-길이 인간 인자 Ⅷ의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00002
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 3의 핵산 서열, 즉, 인간 BDD-Factor Ⅷ를 인코딩하는 핵산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00003
Figure 112009071072279-PCT00004
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 4의 아미노산 서열, 즉, 인간 BDD-Factor Ⅷ의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00005
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 5의 핵산 서열, 즉, 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn239Ala을 포함하는 중연쇄를 인코딩하는 핵산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00006
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 6의 아미노산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn239Ala을 포함하는 중연쇄의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00007
다음의 서열은 서열번호(SEQ ID No) 7의 핵산 서열, 즉, 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn2118Ala을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00008
다음의 서열은 서열번호 8의 아미노산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn2118Ala을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00009
다음의 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열, 즉 I2144-T2161 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00010
다음의 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열, 즉 전체-길이 인간 인자 Ⅷ의 B 도메인의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00011
다음의 서열은 서열번호 11의 핵산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn239Gln을 포함하는 중연쇄를 인코딩하는 핵산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00012
다음의 서열은 서열번호 12의 아미노산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn239Gln을 포함하는 중연쇄의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00013
다음의 서열은 서열번호 13의 핵산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn2118Gln을 포함하는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00014
다음의 서열은 서열번호 14의 아미노산 서열, 즉 인간 인자 Ⅷ의 돌연변이 Asn2118Gln을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열에 대응한다:
Figure 112009071072279-PCT00015
본 발명은 여기에 기술된 특정한 구체화에 의해 범위가 제한되는 것으로 예정되지 않는다. 실제로, 여기에 기술된 것 이외에 본 발명의 각종 변형례는 상기 설명 및 동반된 도면으로부터 기술분야의 숙련자에게 명백하게 될 것이다. 그런 변형례는 추가된 청구범위의 범위 안에 포함되는 것으로 예정된다. 다음의 실시예는 본 발명의 설명으로서 제공되며, 제한되는 것으로 이해해서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 단핵세포에서 유래된 인간 DCs
60 분 동안 10% 인간 AB 혈청, 글루타민 및 항생제로 보충된 RPMI 1640 배지의 플라스틱 세포 배양 접시에 부착된 건강한 성숙한 기증자의 heparinized buffy coat에서 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. 비 부착한 세포는 배지로 3번 온화한 씻기에 의해 제거되었다. 부착한 단핵세포를 500IU/mL 재조합 인간 인터루킨 4(rhIL-4) 및 1000IU/mL 재조합 인간 과립구 매크로파지-클로니-자극 인자(rhGM-CSF), ImmunoTools (Friesoythe, Germany)의 존재하에 1% 인간 AB 혈청, 항생제로 보충된 X-VIVO 15(Cambrex Bio Sciences, Paris, France)에서 배양하였다. 모든 보충물을 포함하여, 배지의 절반을 매 2일마다 교체하였다. 배양 5일 후, DC-풍부한 단편에 대응하는 부착되지 않은 세포 및 느슨하게 부착된 세포를 수확하고, 세척하여 연속적인 실험을 위해 이용하였다.
실시예 2: 인간 재조합 전체-길이 FⅧ, 플루오레세인(fluorescein)을 가진 B 도메인-삭제 인간 재조합 FⅧ의 결합
재조합 인간 전체-길이 FⅧ(1000IU, Kogenate, Bayer), 재조합 인간 B 도메인-삭제 FⅧ(BDD-FⅧ, 1000IU, Refacto®, Wyeth)를 물에 녹이고, 4℃에서 5mM CaCl2를 포함하는 바이카보네이트 버퍼(bicarbonate buffer; pH 9.2)에 대하여 투석하고 나서, 4℃에서 7~8시간 동안 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(fluorescein 5-isothiocyanate)(isomer I, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France)로 결합하였다. 결합되지 않은 FITC를 제거하기 위해 표지된 FⅧ를 RPMI 1640 배지에 대해 더 투석하였다. 표준으로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용하여 Bradford assay에 의해 FⅧ-FITC를 정량화하였다.
실시예 3: FⅧ 엔도시토시스에 포함되는 수용체의 본질
프로토콜
2시간 동안 FⅧ-FITC(40μg/ml)를 첨가하기 전에 DCs를 5mM EDTA, 만난(1mg/ml) 또는 갈락토스(1mg/ml)에 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 4℃에서의 엔도시토시스를 대조구로 사용하였다(미도시).
결과
도 1A: EDTA의 경우 FⅧ-FITC의 엔도시토시스가 92±6.5% (P<0.01)까지 억제되었다. 이 데이터는 DCs에 의한 FⅧ 엔도시토시스에서 2가 이온-의존적 수용체에 대한 역할에 관련된다. 다당류 만난(polycarbohydrate mannan), 만노오스 민감 흡수에 대한 모델 경쟁 리간드가 60±19%(P<0.01) 만큼 FⅧ-FITC의 흡수를 감소시켰고, 반면 갈락토스, 갈락토스-민감 흡수를 위한 경쟁 리간드는 별다른 효력이 없다.
도 1B: FITC-표지 덱스트란, 만노오스-민감 CLRs를 위한 전형적인 리간드, 및 그 내면화가 수용체-독립적 대음세포작용(macropinocytosis)에 의하여 독점적으로 진행되는, 루시퍼 옐로우(LY)를 이용하여 만노오스-민감 CLRs를 위한 만난의 특이성을 우리의 실험적인 체제에서 확인하였다. 덱스트란의 내면화가 만난의 존재시 89±9.3%만큼 저지되었으나, 반면 LY의 내면화는 영향을 받지 않았다.
결론
결과를 통해 만노오스-민감 수용체가 DCs에 의한 FⅧ의 엔도시토시스의 상당한 부분을 중재함을 알 수 있다.
실시예 4: DCs에 의한 FⅧ의 만노오스-민감 흡수는 FⅧ-특이 CD4+ T 세포에 FⅧ-유래 펩티드의 제시에 기인한다.
프로토콜
도 2A: MHC Ⅱ-일치된 기증자에서 생성된 DCs를 배지에서만 또는 만난(1mg/ml) 또는 anti-CD206 IgG(10μg/ml)의 존재하에서 배양하고 다양한 양의 전체-길이 FⅧ(Kogenate®) (5.56, 2.78 또는 1.39μg/ml) 및 20U/ml rhIL-2의 존재하에서 FⅧ-특이 T 세포 클론 D9E9(5000cells/well)로 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. T 세포의 활성화를 배지 상청액에서의 IFN-감마의 방출에 의해 사정하였다.
도 2B: MHC Ⅱ-일치된 기증자에서 생성된 DCs를 만난(1mg/ml) 또는 anti-CD206 IgG(10μg/ml)로 전배양하고 FⅧ(5.56μg/ml) 또는 펩티드 I2144-T2161(2μg/ml) 및 D9E9를 추가하였다. 각 처리에 있어, IFN-감마 생산량을 각 개별 실험에서 얻어진 최대값과 관련하여 묘사하였다(*:P<0.0001 , Mann-Whitney test를 이용하여 사정함).
도 1C: 인간 FⅧ-특이 HLA-일치된 B 세포 라인 LE2E9, BO2C11 또는 DCs를 단독으로 또는 만난(1mg/ml)의 존재 하에 배양하고 전체-길이 FⅧ(Kogenate®)(10μg/ml) 및 D9E9로 배양하였다.
결과
모두, 데이터는 D9E9 활성화에 대한 만난의 억제 효과를 확인하고, DCs에 의한 FⅧ의 만노오스-민감 엔도시토시스의 방지에서 기인한다.
실시예 5: B 도메인의 밖에 위치한 노출된 만노오스 잔기는 T 세포 활성화를 유도하는 DCs에 의한 FⅧ 엔도시토시스에서 상당한 역할을 한다.
프로토콜
도 3A: 전체-길이 FⅧ-FITC (Kogenate®) (40μg/ml, 143nM, full circles) 또는 BDD-FⅧ-FITC (24.31μg/ml, 143nM, empty circles), 또는 덱스트란-FITC (50μg/ml)을 추가하기 전에 DCs를 만난(1, 5, 10, 100 및 1000μg/ml)으로 전배양하였다. 항원의 흡수를 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다. 퍼센트 억제를 만난이 없는 조건에 대해 각 조건에 대해 산출하였다.
도 3B: 천연 또는 EndoF1-처리된 BDD-FⅧ(3.7μg)를 7.5% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 옮겨진 단백질이 Protogoldⓒ를 사용하여 또는 알카린 포스파타제 컨쥬게이트 anti-인간 IgG(alkaline phosphatase conjugated anti-human IgG)을 이용하여 10μg/ml CTLD4-7-Fc로 배양한 후 나타났다. 경쇄(LCh) 및 중연쇄(HCh)를 LCh- 및 HCh-특이 단일클론 anti-FⅧ IgG로 블럿팅하여 확인하였다.
도 3C: BDD-FⅧ를 EndoF1-처리하자마자 T 세포의 활성도가 감소하였다. 결과는 3개의 독립 실험 중 하나를 대표로 묘사한다.
결과
모두, 데이터를 통해 B 도메인의 바깥쪽에 위치한 만노오스-종결 글리칸이 FⅧ의 흡수에 관련됨을 확인하였다.
도 3B: BDD-FⅧ의 이동 프로파일에서의 변화(shift) 및 CTLD4-7-FC에 의해 인지되지 않는 것을 통해 EndoF1로 처리하자마자 올리고만노오스(oligomannose) 구조가 제거되는 것을 알게 되었다.
도 3C: 천연 BDD-FⅧ로 배양한 DC보다 적은 양에서 EndoF1-처리된 BDD-FⅧ로 배양한 DC가 D9E9를 활성화하였다(DC의 경우 P<0.0001). BDD-FⅧ가 비-만노오스화는 만난을 이용한 DC에서의 만노오스 수용체의 포화만큼 T-세포 활성화를 감소시키는데 효과적이지 않다. 만노오스 민감 수용체에 온화한 친화성을 제시하는, D9E9를 활성화시키기 위한 EndoF1-처리된 BDD-FⅧ의 잔기 능력은 FⅧ에서의 남아 있는 N-아세틸글루코사민 잔기의 존재에 기여할 수도 있다.
실시예 6: 변성된 FⅧ 경쇄 Asn2118Ala의 T 세포 활성화
프로토콜
E Saenko 박사(University of Maryland, Baltimore, MD, USA)가 제공한 정제된 FⅧ의 혈장-유래 경쇄(wtLCh)를 Endo-F1으로 처리하거나 처리하지 않았다. wtLCh, 만난(1mg/ml)의 존재 하의 wtLCh 및 Endo-F1-처리된 wtLCh를 DC(도 4A) 또는 BO2C11(도 4B)에 추가하고, 20시간 동안 D9E9과 공동배양하였다. D9E9의 활성화를 ELISA에 의하여 배지 상청액에서의 IFN-감마를 측정해서 사정하였다. 도 C와 D는 LCh-FⅧ의 특정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis)(Asn2118Ala-LCh-FVHI)되자마자의 D9E9 활성의 상실을 나타낸다. BO2C11 B 세포 클론 및 단핵세포-유래 DCs를 야생형 LCh의 존재 하에(도 4C) 또는 변이된 Asn2118Ala-LCh-FⅧ의 존 재 하에(도 4D) D9E9로 배양하였다. Asn2118를 Ala으로 치환하여 N-만노오스화(N-mannosylation)를 위한 자리를 제거한다. 20시간 후에 배지 상청액에서의 IFN-감마를 측정하여 D9E9의 활성화를 사정하였다.
결과
도 4A 및 4B: 먼저, 본 출원인은 wtLCh가 만노오스-민감 방식으로 단핵세포-유래 DCs로 침투하고 FⅧ-특이 D9E9 T 세포 클론을 활성화하는 것을 확인하였다. DCs에 의한 D9E9의 활성화는 처리되지 않는 wtLCh의 경우보다, 만난으로 배양된 wtLCh의 경우 및 Endo-F1-처리된 wtLCh의 경우가 현저하게 더 낮았다. 대조적으로, FⅧ-특이 B 세포 수용체를 통해서 FⅧ를 엔도시토시스하는, BO2C11 B 세포라인에 의한 D9E9의 활성화는 만난의 존재 하의 wtLCh의 배양 또는 Endo-F1-처리에 따라 변하지 않았다. 이 데이터는 천연 FⅧ로 관찰한 결과를 암시하고(도 3), 단핵세포-유래 DCs로의 FⅧ 경쇄의 침투가 만노오스화된 글리칸(mannosylated glycans)에 주로 달려있다는 것을 증명한다.
도 4C 및 4D: Asn2118Ala LCh의 적당한 폴딩을 FⅧ의 C2 도메인에 있는 구조적 항원결정기(conformational epitope)에 특이한 단일클론 인간 IgG(즉, BO2C11 B 세포 클론에 의하여 생성된 IgG)를 사용하여 ELISA으로 확인하였다. wtLCh는 BO2C11과 DCs 모두에 의해 제시되자마자 D9E9를 활성화하였다(도 4C). 대조적으로, D9E9가 BO2C11에 의하여 제시되자마자 Asn2118Ala-LCh-FⅧ에 의해 활성화되었지만, DCs가 항원제시세포(APS)로 사용된 때가 아니다(도 4D).
실시예 7: 재조합 FⅧ 변이체의 클로닝 및 생산
단계 1. 다른 FⅧ 변이체의 클로닝
본 실시예에서 (ATCC, 클론 pSP64-FⅧ에서) BDD-FⅧ를 인코딩하는 cDNA, 재조합 전체-길이 FⅧ(Kogenate, Bayer) 또는 모든 변성된 FⅧ를 "FⅧ"로 사용한다.
Zero Blunt® TOPOⓒ PCR을 이용하여 서브클로닝 벡터(벡터 pCR®-Blunt II-TOPO®)에서 FⅧ를 서브클론하였다. 4 다른 FⅧ 변이 cDNA를 생성하기 위하여 적당한 프라이머(primer)를 사용하여 특정부위 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 실행한다:
- 야생형 서열
- 단일 중연쇄 변이체: 코돈 AAC(Asn239) → 코돈 GCC(Ala239)
- 단일 경쇄 변이체: 코돈 AAT (Asn2118) → 코돈 GCT (Ala2118)
- 이중 변이체: Asn239Asn2118 → Ala239Ala2118
적당한 제한효소로 절단하고 정제하고 나서, 진핵세포라인에서 단백질을 발현하기 위해서 pCDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 또는 생체내에서(in vivo) 유체역학적 주입을 위해 pLIVE 벡터(Mirus, Madison, WI, USA)로 접착 말단(cohesive end)을 결찰하였다(ligate).
단계 2. 포유류 세포라인의 일시적 유전자 전달(transient transfection)
다른 pCDNA3.1(+)-FⅧ 변이체를 다른 진핵세포 라인으로 감염시켰다(transfected): Nucleofector® technology (Amaxa Biosystems)를 이용하여 Chinese Hasmter Ovary(CHO) 세포, Baby Hamster Kidney(BHK) 세포 및 HKB11(Hybrid of Kidney and B cells; ATCC # CRL-12568) 세포. 전형적으로, Nucleofector® technology는 70 내지 100%의 안정된 유전자 전달(transfection)을 허용한다. HKB11 세포는 재조합 FⅧ의 생산을 위해 특별히 개발되었다.
FⅧ는 샌드위치 ELISA, 표면 플라스마 공명(SPR, Biacore®) 및 서던 블랏팅을 사용하여 상청액에서 검출된다. FⅧ 수준은 상업적으로 이용가능한 재조합 FⅧ 표준(rFⅧ, Kogenate®, Bayer, 또는 BDD BrFⅧ Refacto® Wyeth)에 비교된다. 일시적인 유전자 전달(transfection)은 FⅧ 변이체가 세포에 의해 일어나는지 여부를 나타낸다.
단계 3. 다른 FⅧ 구조물의 생체 조건(in vivo) 유전자 전달(transfection)
pLIVE 벡터로 복제된 다른 FⅧ 구조물을 FⅧ-결핍 쥐에 주입한다. 각 플라스미드의 백 μg을 ≤5초에 2ml로 정맥으로 주입한다. "유체역학 주입(hydrodynamic injection)"이라고 불리는, 이 접근방식은 VWF-결핍 쥐에 높은 수준의 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor)(VWF)를 발현시키기 위하여 과거에 사용했다(25). 이 실험에서, VWF 발현이 야생형 쥐의 혈장(plasma)에서 찾아낸 것보다 우수한 수준으로 3주까지 유지되었다. 여기에서, ELISA, SPR 및 서던 블랏팅을 사용하여 FⅧ 발현의 동역학(kinetics)이 3주 동안 계속된다(followed).
단계 4. 포유류 세포라인 및 소량 생산의 안정한 유전자전달(transfection)
단계 2에서 설명된 대로 안정한 유전자 전달을 실행할 것이다. Nucleofector® technology를 사용하여 후보자 세포라인의 유전자전달(transfection) 다음, 세포는 한계희석(limiting dilution)에 의해 복제될 것이다. FⅧ-생성 세포가 증폭되 고, -80℃에서 동결되어 저장될 것이다.
단백질의 소규모 생산은 전통적인 방법에 이어 DMEM 1:1-F12에서 수행된다. 간단하게, 상청액(supernatant)을 모으기 전에 3 내지 4일 동안 subconfluency에서 세포가 성장한다. ELISA, 표면플라즈마공명(Biacore®) 및 서던 블랏팅에 의해, 주과 및 인간 단일클론 anti-FⅧ IgG를 사용하여, FⅧ 변이체의 존재에 대해 상청액을 테스트할 것이다. 일당 세포당 FⅧ 생산량을 측정하도록, 표준으로서 상업적으로 이용가능한 rFⅧ(Kogenate, Bayer, 또는 Refacto Wyeth)을 이용하여 FⅧ의 양을 정량화한다.
단계 5. rFⅧ 변이체의 분비량/생산량을 증가하는 제안된 용액
포유류 세포에서의 rFⅧ 생산 수준은 다른 인자에 의해 제한된다: 1) FⅧ의 분비를 억제하는, 면역글로불로빈-결합 단백질(BiP)와 같은 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 샤페론(chaperone)을 가지는 FⅧ의 A1 도메인의 상호작용; 2) LMAN1(ERGIC53)에 FⅧ 분자의 만노오스화된(mannosylated) 당의 결합은 ER에서 골지체로 적당한 전달(export)을 위해 필요하여서, LMAN1의 결합 및 FⅧ의 전달(export)을 방지하기 않게 하기 위해 모든 N-결합 당화의 제거를 피해야 한다. 반대로, FⅧ 생산량/분비량은 분자의 생물공학에 따라 증가될 수도 있다: 1) N-당화(glycosylation)를 위한 6개의 위치를 표현하는, B 도메인의 끝을 자른 부분의 추가는 rFⅧ가 삭제된 야생형 도메인에 비교하여 몇 배 rFⅧ의 생산을 증가한다; 2) Ser 잔기로 Phe309의 돌연변이는 BiP에의 결합을 감소시키고, FⅧ 분비를 증가한다. 이 점에서, 특정부위 돌연변이에 의해 N-연결 당화(glycosylation)를 위한 자리를 제거하여 FⅧ의 생산이 감소할 수도 있다. 실제로, 야생형 B 도메인-삭제 FⅧ cDNA는 당화(glycosylation)를 위한 3 자리를 가진다. 특정부위 돌연변이 후에, 단지 한 자라만 남아 있는 것으로 예상된다: A3 영역의 Asn18lO, 분자를 적당히 분비하기에 충분하지 않을 수도 있다. .
돌연변이 rFⅧ 변이체로 낮은 수확량의 FⅧ를 얻는 경우, 본 출원인은 구조물에 FⅧ의 B 도메인의 첫번째 226 아미노산을 인코딩하는 cDNA 서열을 도입할 수도 있다. 이 서열은 6개의 N-연결 당화(glycosylation)를 위한 자리를 가진다. 이 때문에, mRNA를 인간 간 추출물에서 이미 추출하고, 인간 cDNA를 제조하였다(a kind gift from Dr Cavard, Institut Cochin, Paris). 적당한 프라이머를 사용하여 B 도메인-인코딩 DNA를 증폭하고, 이를 4개의 FⅧ 구조물의 중연쇄와 경쇄 사이에 삽입한다. B-도메인 포함 구조물을 pCDNA3와 pLIVE 벡터에서 복제한다. 세포가 감염되고(transfected) 상술한 바와 같이 발현을 연구한다.
실시예 8: 변성된 FⅧ의 배지-스케일 생산
실시예 7의 FⅧ(야생형/239mut/2118mut/239mut2118mut)를 혈청이 보충된 염기 배지에서 롤러 병을 이용하여 생성한다. 롤러 벼에서 다른 FⅧ의 충분한 양을 생성하고 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제한다. 아래에 기술한 모든 연구를 하기에 필요한 추정된 양은 각 FⅧ 변이체에 있어 약 2mg(10 000UI)로 평가되었다. 정제 과정의 수확량은 거의 25%이며, 그래서 각 FⅧ 변이체의 8mg (40 000UI)를 생성 할 필요가 있다.
각 클론에 의한 FⅧ의 생산은 클론의 생산력에 따라 적용된다. 높은 생산자에 있어(>5UI/106cell/day), 배치 체계에의 롤러 병에서 생산된다. 낮은 생산자에 있어(<55UI/106cell/day), 롤러 병을 사용한 반복된 배치에서 생산된다.
실시예 9: 변성된 FⅧ의 구조적/기능적 완전성
단계 1. 재조합 FⅧ 변이체의 생체 조건(in vivo) 유전자 전달( transfection)
실시예 7 또는 8의 다른 FⅧ 구조물을 pLIVE 벡터로 복제하고 유체역학 주입에 따라 FⅧ-결핍 쥐에서 발현시킨다. 쥐 혈장(plasma)에서의 FⅧ 수준을 샌드위치 ELISA 및 기능적인 응고 분석실험을 사용하여 측정한다. 꼬리를 자른 후 출혈시간 및 출혈량의 측정하여 쥐의 응고 교정을 조사한다.
단계 2. 생체외에서(in vitro) 전응고(pro-coagulant) 활성
4개의 재조합 FⅧ 변이체(실시예 7)의 전응고 활성을 생체외에서(in vitro) 및 생체조건(in vivo)에서 조사한다. 희석한 FⅧ를 인간 FⅧ-결핍 혈장(plasma)으로 배양하고 그 활성을 기능적인 응고 분석실험(FibrinTimer CA540, Dade-Behring)을 사용하여 측정한다. 또는, FⅧ 활성을 크로모제닉 분석법(chromogenic assay)을 사용하여 측정하며, 이때 FⅧ가 활성화된 인자 Ⅸ와 혼합되고, 또한 인자 Ⅹ 및 인지질과 혼합된다. 활성화된 인자 Ⅹ의 발생은 활성화된 Ⅹ의 클로모제닉 합성 기질 을 사용하여 측정한다. B 도메인-삭제 FⅧ(Refacto®, Wyeth)가 바람직하며 분석실험에서 사용된다. FXa 발생의 결과는 테스트 샘플 t½(half maximal response)로 나눈 표준에서의 값이 비율로 표현된다.
단계 3. 단일 클론항체, 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor) 및 인지질과 FⅧ의 상호 작용
단일 클론항체, 폰빌레브란드인자(von Willebrand factor) 및 인지질과 다른 FⅧ 변이체의 상호작용을 조사한다.
단계 4. 번역-후 변성 분석 방법
a) 탈염, FⅧ의 농축 및 활성화
다른 많은 분석을 방해할 수 있는 염, 단당류 및 작은 분자를 제거하기 위해 FⅧ 샘플의 농축 및 탈염이 필요하다.
5% MeCN + TFA 0.1%로 평형화시킨 역상(reverse phase; RP) Uptisphere 10WC4-25QS 컬럼(Interchim)을 갖춘 AKTA Purifier system(Amersham Biosciences)에서 탈염시킨다. 5CV 내의 MeCN+TFA 0.1%의 5-90%의 구배를 이용하여 용출시킨다. 탈염된 생성물을 모아, Speed-Vac vacuum evaportor에서 건조한다.
정제된 FⅧ 샘플을 트롬빈 처리를 통해 활성화시킬 수 있다. 그러고 나서 FⅧ 사슬을 regular MeCN + TFA gradient을 이용하는 RP-HPLC(Uptisphere UP5WOD$25QK)를 사용하여 분리할 수 있다.
b) FⅧ의 효소적 비당화(enzymatic deglycosylation)
i) PNGase F 비당화(deglycosylation)
PNGase F는 N-glycan 구조에 특이한 효소이다. 탈염과 건조 후에, FⅧ를 환원제가 있는 효소 버퍼 및 없는 효소 버퍼에 다시 부유시키고(resuspend), 실온에서 15분 동안 배양한다. 그러고 나서 효소를 추가하고 (E/S 5mIU/2OOμg) 18시간 동안 37℃에서 배양하여 비당화시킨다.
ⅱ) Endo-H 비당화(deglycosylation)
Endo-H는 올리고만노오스(oligomannose) 및 하이브리드 유형의 N-glycan 구조에 특이한 효소이다. 탈염과 건조 후에, 환원제가 있는 효소 버퍼 및 없는 효소 버퍼에 다시 부유시키고(resuspend), 95℃에서 5분 동안 가열한다. 얼음에서 냉각시킨 후, 효소를 추가한다(E/S: 0.2mIU/μg prot). 2시간 동안 37℃에서 비당화 반응을 수행한다.
ⅲ) SDS-PAGE 분석
PNGase F 또는 Endo-H로의 효소적 비당화 전후에 얻어진 생성물의 SDS-PAGE 분석에 의해 FⅧ의 당화를 부분적으로 특성화할 수 있다. SDS-PAGE는 NOVEX system(Invitrogen, Life Technologies)로 실행된다. 4-12% 젤(Novex)에 비환원(non-reducing) 조건 및 환원(reducing) 조건 하에서 샘플을 로딩한다(0.5 및 1μg). 50분 동안 200V로 이동한 후에, 단백질은 은색으로 염색된다(silver stained). 디지털 스캐닝 및 젤의 통합(Quantity One software, Biorad) 후에, 단백질 표준과 비교하여 다른 단백질 밴드의 명백한 분자량을 결정한다.
iv) 렉틴 블랏 분석(Lectin blot analysis)
렉틴 블랏 분석(Fukuda et Kobata, Glycobiology a Pratical Approach)을 이용하여 당화된(glycosylated) (복합 유형, 높은 만노오스 유형 ....) 펩티드 및 폴리펩티드의 특이 검출을 수행한다. 상술한 것처럼 FⅧ의 10μg을 SDS-PAGE로 분리하고 제조자 지시(Novex)에 따라 니트로셀룰로오스 막 또는 나일론 막으로 옮긴다. 간단히, 일단 블랏팅되면 BSA로 막을 차단하고, PBST(PBS, Tween 20 0.05%)으로 세척하고, 퍼옥시다아제(Ey labs)로 표지된 적당한 렉틴(즉, GNA, ConA, DGA, LcH, MNA-M, VFA, PEA, PMA, AMA… )으로 4℃에서 2시간 동안 배양한다. 일부 PBST로 세척한 후에, 퍼옥시다아제를 colorimetric 또는 chemiluminescent 방법으로 노출시키고, 블랏팅 이미지를 스캐너 또는 CCD 카메라로 캡쳐한다. Quantity One software(Biorad)를 이용하여 이미지 분석 및 정량화를 한다.
단계 5. FⅧ 일차 구조 분석 방법
a) FⅧ 맵핑
FⅧ 맵핑은 일차 구조 분석을 가능하게 한다. 단백질 서열은 독특해서, 특정한 효소(trypsin 또는 endoprotease Asp N)로 분해한 후에 생성된 펩티드는 관심대사의 단백질에 특징적이다. 탈염과 건조 후에, FⅧ를 변성하고(8M Urea), 환원하고(SH의 DTT 20moles/mole), 알킬화한다(SH의 iodoacetamide 40moles/mole). 그 다음에 FⅧ를 Arg(R)와 Lys(K) 잔기 후에 단백질을 절단하는, 트립신으로 분해한다(E/S: 1/25m/m). 단백질 분해 후, 분석하기 위해 생성된 펩티드를 LC-MS/MS 시스템으로 직접 주입하거나, 증가하는 아세토니트릴 구배를 이용하는 C18 300Å 컬럼 에, 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 분리시킨다. 단편을 모아서 Edman Sequencing 및 MALDI-TOF MS에 의한 추가 분석을 위해 Speed-Vac를 사용하여 건조시킨다.
b) Edman Sequencing
FⅧ의 N-터미널 Edman Sequencing을 microsequencer(Precise 491 HT, Applied Biosystems)에서 3 단계로 실행한다: 결합-절단 및 변환. 그러고 나서 아미노산을 역상 크로마토그래피로 분리한다. N-터미널 잔기의 분석 및 확인은 Sequence Pro(Applied Biosystems)에서의 표준 아미노산을 이용하여 이루어지며 FⅧ의 이론적인 서열과 비교하고, 따라서 예를 들면 아미노산 치환을 확인할 수 있다.
c) Mass spectrometry MALDl TOF(ZTOF)
Flight Mass spectrometry MALDl TOF(ZTOF)의 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time은 매우 정확하게 분자량을 측정할 수 있는 기술이다. MALDI-TOF MS는 펩티드, 단백질 및 글리칸의 분석을 가능하게 하는 이온화 방법(ionization method)이다.
관심대상의 펩티드, 단백질 또는 글리칸(FⅧ, 그 단편 또는 글리칸)은 레이저의 파장에서 흡수하는 매트릭스와 혼합된다. 이용된 매트릭스는 주로 펩티드 분석을 위한 a-시아노-4-하이드록시신나믹산(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) (HCCA), 단백질을 위한 시나핀산(sinapinic acid; SA), 및 올리고당을 위한 2,5-디하이드록시벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid; DHB)이다. 각 펩티드의 확인은 질량 분석기에 의해 그 질량을 측정하고, 이론적인 단백질 서열에서 추론된 이론적인 질량과 비교해서 실행될 수 있다. 주어진 펩티드에 있어 이런 조건에서 얻어진 단편 이온을 표준으로 하여 MS/MS 실험(tandem mass spectrometry, TOF/TOF)를 이용하여 펩티드 서열을 결정할 수 있다. 올리고당의 확인/특징화를 위해 유사한 전략이 이용된다. Bruker Autoflex 2 기구가 이용가능하다.
electrospray ionisation mass spectrometry에 결합된 liquid chromatography(LC- ESIMS)
MALDI와 달리, electrospray ionisation(ESI)는 매트릭스의 사용을 요구하지 않는다. ESI에서, 샘플 용액이 고전압 하에서 유지된 모세관으로 도입된다. 강한 전기장이 튜브 출구에 적용되어 전기장을 동시에 교차하는 하전된 작은 물방울을 형성하고 mass spectrometry analyser의 경로에 있는 압력 구배를 유도한다. 조사 중인 펩티드를 크로마토그래피로 분리한 후에 ESIMS에 의한 분석을 할 수 있고, 펩티드 맵핑을 또한 얻을 수 있다. FⅧ 경우, 펩티드 분리는 아세토니트릴 구배를 가지는 Uptisphere UP5WOD25QK 컬럼(Interchim)에서 실행될 수 있다.
질량 분석에 의한 검출은 MS와 MS/MS 데이터의 수집을 가능하게 하는 Qq-TOF hybrid mass spectrometer(quadripole-time of flight, Qstar xl, Applied Biosystems)를 통해 실행된다. 따라서, 아미노산 서열화를 달성될 수 있다.
d) HPCE-LIF 올리고당 맵핑
아스파라긴 또는 "N-결합 구조"에 연결된 다른 올리고당 구조의 특성 및 정량화는 HPCE-LIF에 의해 실행된다. 당은 PNGase F 처리에 의해 FⅧ에서 방출되고, ice-cold 에탄올과 함께 단백질 침전법으로 분리된다. 각 분리된 구조의 정량화 및 특성화를 확실하게 하기 위해 샘플을 엑소글리코시다아제(exoglycosidases) (sialidase, galactosidase, mannosidases, hexnacase)로 처리한다. 사용된 모든 글리코시다아제(glycosidase)를 Prozyme에서 얻었다. 이 단계에서 두번째 에탄올 침강법이 실행된다. 얻은 글리칸은 flurophore(APTS)로 표지하고 그 질량 및 전하 둘 다를 기반으로 분리된다. 2 표준(포도당 단일중합체, 올리고당)을 통해 구조를 확인한다.
Beckman Coulter N-CHO 코딩 모세관(치수 50cm×50μm ID)을 capillary electrophoresis(ProteomeLab PA800, Beckman Coulter)에 거치한다. 실험 조건은: 분리 버퍼≪gel buffer-N - Beckman coulter≫, 20℃에서 20분 동안 25KV에서 이동, 및 λex 488nm 및 λem 520nm를 사용하는 레이저 탐지기.
e) NP-HPLC 올리고당 맵핑
아스파라긴 또는 "N-결합 구조"에 연결된 다른 올리고당 구조의 특성 및 정량화는 normal phase high performance liquid chromatography (NP-HPLC)로 또한 실행할 수 있다. N-글리칸을 특정한 효소(PNGase F)를 이용하여 방출하고 에탄올 침강법으로 분리한다. 얻어진 글리칸을 2-aminobenzamide(2-AB) fluorophore로 표지한다. 표지된 글리칸을 ≪Gold≫ 시스템(Beckman)에 연결된 Amide-80 coliumn(Tosohaas)를 사용하여 NP-HPLC로 분리한다.
샘플 주입 전에, 컬럼을 80% 아세토니트릴 버퍼로 평형시킨다. 50mM 포름산알루미늄 pH 4.45의 증가하는 구배에서 올리고당을 용출시킨다. λex 330nm와 λem 420nm에서 fluorescence를 사용하여 검출한다.
실시예 10: FⅧ-결핍 쥐의 Asn2118Ala LCh의 면역원성(immunogenicity)
프로토콜
인간 FⅧ의 정제된 혈장-유래 경쇄(wtLCh)를 E Saenko 박사에게서 얻었다(University of Maryland, Baltimore, MD, USA). FⅧ의 돌연변이된 LCh(Asn2118Ala LCh)를 생산하였다. wtLCh 및 돌연변이된 LCh를 FⅧ-결핍 쥐(a kind gift from Prof Kazazian, Pennsylvania University, LISA)에 주간 간격으로 4번 정맥으로(200μL PBS에서의 0.2μg 단백질) 주사하였다. 4번째 주사 후 1주, 쥐가 출혈을 일으키고 anti-FⅧ IgG의 수준을 FⅧ-특이 ELISA를 이용하여 조사하였다.
ELISA: 쥐 혈청을 90에 1로 희석하고 인간 FⅧ로 코팅한 ELISA 플레이트에서 배양하였다(Recombinate, Baxter). 플레이트를 PBS-1% BSA를 사용하여 막았다. 결합된 IgG를 퍼옥시다아제에 결합된 다클론 anti-쥐과 IgG 및 퍼옥시다아제 기질(OPD)을 사용하여 방출하였다. 결합의 세기를 specrometer(Tecan Genyos)로 492 nm의 광학 밀도로 측정하여, anti-FⅧ IgG의 수준을 결정한다.
결과
FⅧ-결핍 쥐에 인간 FⅧ의 정제 혈장-유래 경쇄(wtLCh)를 정맥으로 투여하여 anti-FⅧ IgG를 탐지가능한 수준으로 유도했다. wtLCh에 대한 쥐의 면역반응이 실 험에 포함된 6마리의 쥐에서 이질적이었다는 것이 흥미롭다. 대조적으로, 돌연변이화된 Asn2118Ala LCh로 쥐에 처리한 경우는 anti-FⅧ IgG를 상당한 수준으로 유도하지 못했다.
결론
이 데이터는 특이한 면역 반응을 유도하는 Asn2118Ala LCh의 기능이 wtLCh에 비하여 상당히 감소됨을 보여준다.
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Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn 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Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg 740 <210> 13 <211> 1932 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 agctttcaaa agaaaacacg acactatttt attgctgcag tggagaggct ctgggattat 60 gggatgagta gctccccaca tgttctaaga aacagggctc agagtggcag tgtccctcag 120 ttcaagaaag ttgttttcca ggaatttact gatggctcct ttactcagcc cttataccgt 180 ggagaactaa atgaacattt gggactcctg gggccatata taagagcaga agttgaagat 240 aatatcatgg taactttcag aaatcaggcc tctcgtccct attccttcta ttctagcctt 300 atttcttatg aggaagatca gaggcaagga gcagaaccta gaaaaaactt tgtcaagcct 360 aatgaaacca aaacttactt ttggaaagtg caacatcata tggcacccac taaagatgag 420 tttgactgca aagcctgggc ttatttctct gatgttgacc tggaaaaaga tgtgcactca 480 ggcctgattg gaccccttct ggtctgccac actaacacac tgaaccctgc tcatgggaga 540 caagtgacag tacaggaatt tgctctgttt ttcaccatct ttgatgagac caaaagctgg 600 tacttcactg aaaatatgga aagaaactgc agggctccct gcaatatcca gatggaagat 660 cccactttta aagagaatta tcgcttccat gcaatcaatg gctacataat ggatacacta 720 cctggcttag taatggctca ggatcaaagg attcgatggt atctgctcag catgggcagc 780 aatgaaaaca tccattctat tcatttcagt ggacatgtgt tcactgtacg aaaaaaagag 840 gagtataaaa tggcactgta caatctctat ccaggtgttt ttgagacagt ggaaatgtta 900 ccatccaaag ctggaatttg gcgggtggaa tgccttattg gcgagcatct acatgctggg 960 atgagcacac tttttctggt gtacagcaat aagtgtcaga ctcccctggg aatggcttct 1020 ggacacatta gagattttca gattacagct tcaggacaat atggacagtg ggccccaaag 1080 ctggccagac ttcattattc cggatcaatc aatgcctgga gcaccaagga gcccttttct 1140 tggatcaagg tggatctgtt ggcaccaatg attattcacg gcatcaagac ccagggtgcc 1200 cgtcagaagt tctccagcct ctacatctct cagtttatca tcatgtatag tcttgatggg 1260 aagaagtggc agacttatcg aggacagtcc actggaacct taatggtctt ctttggcaat 1320 gtggattcat ctgggataaa acacaatatt tttaaccctc caattattgc tcgatacatc 1380 cgtttgcacc caactcatta tagcattcgc agcactcttc gcatggagtt gatgggctgt 1440 gatttaaata gttgcagcat gccattggga atggagagta aagcaatatc agatgcacag 1500 attactgctt catcctactt taccaatatg tttgccacct ggtctccttc aaaagctcga 1560 cttcacctcc aagggaggag taatgcctgg agacctcagg tgaataatcc aaaagagtgg 1620 ctgcaagtgg acttccagaa gacaatgaaa gtcacaggag taactactca gggagtaaaa 1680 tctctgctta ccagcatgta tgtgaaggag ttcctcatct ccagcagtca agatggccat 1740 cagtggactc tcttttttca gaatggcaaa gtaaaggttt ttcagggaaa tcaagactcc 1800 ttcacacctg tggtgaactc tctagaccca ccgttactga ctcgctacct tcgaattcac 1860 ccccagagtt gggtgcacca gattgccctg aggatggagg ttctgggctg cgaggcacag 1920 gacctctact ga 1932 <210> 14 <211> 643 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg 1 5 10 15 Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 20 25 30 Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 50 55 60 Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 65 70 75 80 Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 85 90 95 Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu 100 105 110 Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 115 120 125 Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 130 135 140 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser 145 150 155 160 Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 165 170 175 Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 180 185 190 Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg 195 200 205 Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 210 215 220 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu 225 230 235 240 Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu 245 250 255 Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His 260 265 270 Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 275 280 285 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala 290 295 300 Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly 305 310 315 320 Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu 325 330 335 Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly 340 345 350 Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly 355 360 365 Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 370 375 380 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala 385 390 395 400 Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr 405 410 415 Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Gln Ser Thr Gly 420 425 430 Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His 435 440 445 Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 450 455 460 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys 465 470 475 480 Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile 485 490 495 Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala 500 505 510 Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 515 520 525 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp 530 535 540 Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys 545 550 555 560 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser 565 570 575 Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys 580 585 590 Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu 595 600 605 Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 610 615 620 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln 625 630 635 640 Asp Leu Tyr

Claims (40)

  1. 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질로서,
    엔도시토시스 가능한 세포와 상호작용하거나 상기 엔도시토시스 가능한 세포에 의해 엔도시토시스되는(endocyted) 상기 변성된 FⅧ 폴리펩티드의 능력이 대응하는 비-변성 FⅧ 폴리펩티드에 대하여 감소하거나 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  2. 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질로서,
    엔도시토시스 가능한 세포로부터 표면 수용체와 상호작용하는 상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 능력이 감소 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  3. 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질로서,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 면역원성(immunogenicity)이 인간에서 실질적으로 감소 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 표면 수용체는 만노오스-민감 수용체인 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하 는 FⅧ 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표면 수용체는 만노오스 수용체(mannose receptor)(MR, CD206), 수지상 세포 특이적 ICAM3을 잡는 비-인티그린(dendritic cell-specific ICAM3 grabbing non-integrin)(DC-SIGN, CD209), 덱틴(dectin) 및 DEC-205(CD205)로 이루어진 그룹에서 선택되는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 변성은 실질적으로 당화되지 않은(deglycosylated) FⅧ 폴리펩티드에서 기인하는 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 실질적으로 당화되지 않은 FⅧ는 터미널-만노오스 잔기로 종결된 실질적인 글리칸-구조의 당화되지 않은 FⅧ 폴리펩티드인, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 터미널-만노오스 잔기로 종결된 실질적인 글리칸-구조는 올리고만노오 스-유형 글리칸 구조인, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 엔도시토시스 가능한 세포는 항원제시세포(Antigen Presenting cells; APCs)인, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질. , 및, 특히, 수지상세포, 대식세포(Macrophages), 내피세포(endothelial cells) 또는 B 림프구 세포
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항원제시세포(Antigen Presenting cells; APCs)는 수지상세포, 대식세포(Macrophages), 내피세포(endothelial cells) 또는 B 림프구 세포인, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FⅧ 단백질은 전구응고(procoagulant)-활성 FⅧ 단백질인, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 변성은 공통서열 Asn-Xxx-Thr/Ser를 가지는 당화(glycosylation) 공통위치의 적어도 하나의 아미노산의 치환 또는 제거를 포함하며,
    상기 Xxx는 모든 아미노산을 나타내는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 변성은 서열번호(SEQ ID No) 2로 표시한 전체 길이의 인간 FⅧ 폴리펩티드 서열에 대하여, 아스파라긴 239, 아스파라긴 2118, 세린 241 및 트레오닌 2120으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 아미노산의 치환 또는 제거를 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239을 알라닌(Alanine), 글라이신(Glycine), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine), 트레오닌(Threonine), 아스파르트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환하는 것을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴(Asparagin) 2118을 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 글루타민(Glutamine), 트레오닌(Threonine), 아스파르트산(Aspartic acid) 또는 글루탐산(Glutamic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환하는 것을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 알라닌으로의 치환을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 글루타민으로의 치환을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 2118의 알라닌으로의 치환을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 2118의 글루타민으로의 치환을 적어도 하나 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 알라닌으로의 치환 및 상기 아스파라긴 2118의 알라닌으로의 치환을 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 글루타민으로의 치환 및 상기 아스파라긴 2118의 글루타민으로의 치환을 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  22. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 알라닌으로의 치환 및 상기 아스파라긴 2118의 글루타민으로의 치환을 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  23. 제13항에 있어서,
    상기 변성은 상기 아스파라긴 239의 글루타민으로의 치환 및 상기 아스파라긴 2118의 알라닌으로의 치환을 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드의 변성은 서열번호 10으로 표시된 B 도메인의 전부 또는 일부의 삭제를 더 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있엇,
    상기 변성 FⅧ 폴리펩티드는 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 변성 FⅧ 폴리펩티드를 포함하는 FⅧ 단백질:
    (i) 서열번호 6으로 표시한 아미노산 서열; 및/또는
    (ⅱ) 서열번호 8로 표시한 아미노산 서열.
  26. 제1항 내지 제25항 중 적어도 하나의 FⅧ 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 분자 또는 변성된 분리된 핵산 서열로서,
    변성된 FⅧ 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 분리된 핵산 서열 또는 상기 변성된 분리된 핵산 서열은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 분리된 핵산 분자:
    (i) 서열번호 5로 표시한 핵산 서열; 및/또는
    (ⅱ) 서열번호 7로 표시한 핵산 서열.
  27. 제26항의 분리된 핵산 분자와 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화될 수 있는 분리된 핵산 분자 또는 그에 상보적인 핵산 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  29. 제28항에 따른 발현벡터로 감염된(transfected), 또는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 FⅧ 단백질을 발현하는 숙주세포.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 FⅧ 단백질을 발현하는 인간이 아닌 형질전환 유기체.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 유기체는 미생물, 동물 또는 식물에서 선택되는, 인간이 아닌 형질전환 유기체.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 동물은 포유동물인, 인간이 아닌 형질전환 유기체.
  33. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 FⅧ 단백질을 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 조성물은 약학 조성물 또는 동결건조된(lyophilised) 조성물인, 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 이용가능한 캐리어를 더 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 FⅧ 단백질의 생산방법으로서,
    a) 제26항 또는 제27항의 핵산분자 또는 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 FⅧ 단백질을 인코딩하는 핵산분자가 형질전환된 또는 감염된(transfected) 숙주세포를 배지에서 성장시키는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포에서 및/또는 상기 배지에서 상기 핵산 분자의 발현에 기인한 FⅧ 단백질을 분리하는 단계;를 포함하는, FⅧ 단백질의 생산방법.
  37. FⅧ 결핍으로 특징화된 질병을 치료하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른, FⅧ 단백질의 사용.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 FⅧ 결핍으로 특징화된 질병은 혈우병 A 또는 후천적(acquired) 혈우병인, FⅧ 단백질의 사용.
  39. 혈우병 A 또는 후천적 혈우병 A를 치료하기 위한 의약 제조를 위한 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 FⅧ 단백질의 사용.
  40. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 FⅧ 단백질의 응고 유효량(clotting effective amount)을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈우병 A 또는 후천적(acquired) 혈우병 환자를 치료하는 방법.
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