NO338293B1 - Modifiserte bouganinproteiner, cytotoksiner samt anvendelse derav, og fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytikum, samt nukleinsyremolekyl og et T-celle epitope peptid - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Oppfinnelsen angår modifiserte bouganinproteiner og cytotoksiner inneholdende de modifiserte proteinene anvendelige som terapeutiske midler mot kreft. Spesifikt blir T-celle-epitoper fjernet eller endret for å redusere immunogenisiteten av bouganintoksinene.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Det er mange tilfeller hvorved effektiviteten av et terapeutisk protein begrenses av en uønsket immunreaksjon mot det terapeutiske proteinet. Mange mus monoklonale antistoffer har sett lovende ut som terapier i forbindelse med flere humane sykdommer men har i visse tilfeller mislyktes på grunn av induksjon i betydelig grad av en human anti-murin antistoff (HAMA)-respons [Schroff, R. W. et al (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. et al (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. For monoklonale antistoffer har det blitt utviklet flere teknikker i forsøk på å redusere HAMA-responsen [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. Disse rekombinant DNA-metodene har generelt redusert den genetiske informasjonen fra mus i den endelige antistoffkonstruksjonen mens den har økt den humane genetiske informasjonen i den endelige konstruksjonen. Ikke desto mindre har de resulterende "humaniserte" antistoffene fortsatt, i mange tilfeller, fremkalt en immunrespons hos pasienter [Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

WO 03103715 Al beskriver bestemte modifikasjoner av ribosomin aktiverende protein bryodin 1.

WO 9855623 Al beskriver et ikke-modifisert bouganinprotein.

Nøkkelen til induksjon av en immunrespons er tilstedeværelsen innenfor proteinet av peptider som kan stimulere aktiviteten av T-celler via presentasjon på MHC klasse II-molekyler, såkalte "T-celle-epitoper". Slike T-celle-epitoper er vanlig definert som hvilken som helst sekvens av aminosyrerester med evne til å binde til MHC klasse II-molekyler. Underforstått betyr en "T-celle-epitop" en epitop som når bundet til MHC-molekyler kan gjenkjennes av en T-celle-reseptor (TCR) og som kan, i det minste i prinsippet, bevirke aktivering av disse T-cellene ved å engasjere en TCR til å fremme en T-celle-respons.

MHC klasse II-molekyler er en gruppe svært polymorfe proteiner som spiller en sentral rolle i hjelper T-celle seleksjon og aktivering. Den humane leukocytt antigen-gruppen DR (HLA-DR) er den dominerende isotypen av denne gruppen av proteiner; imidlertid utfører isotypene HLA-DQ og HLA-DP lignende funksjoner. I den humane populasjonen bærer individer to til fire DR-alleler, to DQ og to DP-alleler. Strukturene av flere DR-molekyler har blitt funnet og disse viser seg som en åpen-endet peptidbindings-grop med flere hydrofobe lommer som engasjerer hydrofobe rester (lomme-rester) av peptidet [Brown et al (1993) Nature 364: 33; Stern et al (1994) Nature 368: 215]. Polymorfisme som identifiserer de forskjellige allotypene av klasse II-molekyl bidrar til en stor diversitet av forskjellige bindingsoverflater for peptider innenfor gropen for peptidbinding og på populasjonsnivå sørger for maksimal fleksibilitet med hensyn til evnen til å gjenkjenne fremmede proteiner og iverksette en immunrespons mot patogene organismer.

En immunrespons mot et terapeutisk protein forløper via MHC klasse II peptid presentasjons-veien. Her blir eksogene proteiner oppslukt og prosessert for presentasjon i forbindelse med MHC klasse II-molekyler av DR, DQ eller DP-typen. MHC klasse II-molekyler uttrykkes ved profesjonelle antigenpresenterende celler (APC), slik som makrofager og dendrittiske celler blant andre. Engasjering av et MHC klasse II peptid-kompleks ved en beslektet T-celle-reseptor på overflaten av T-cellen, sammen med kryssbinding av visse andre koreseptorer slik som CD4-molekylet, kan indusere en aktivert tilstand av T-cellen. Aktivering fører til frigjøring av cytokiner som videre aktiverer andre lymfocytter slik som B-celler for å produsere antistoffer eller aktivere T-dreperceller som en fullstendig cellulær immunrespons.

Identifisering av T-celle-epitoper er det første trinnet i epitop eliminering som kjent fra W098/52976; WO00/34317; WO02/069232; WO02/079232; og WO02/079415.1 disse angivelsene blir predikterte T-celle-epitoper fjernet ved anvendelse av veloverveid aminosyresubstitusjon innenfor proteinet av interesse. I tillegg til beregningsteknikker, finnes det in v/Yro-metoder for å måle evnen av syntetiske peptider til å binde til MHC klasse II-molekyler. Ved et eksempel på en metode anvendes B-cellelinjer av definert MHC-allotype som en kilde for MHC klasse II bindingsoverflate og kan anvendes for identifisering av MHC klasse D-ligander [Marshall K.W. et al. (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; 0'Sullivan et al (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. et al

(1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. Imidlertid er ikke slike teknikker tilpasset for screening av multiple potensielle epitoper til et stort mangfold av MHC allotyper, de kan heller ikke bekrefte evnen av et bindingspeptid til å fungere som en T-celle-epitop.

Teknikker for anvendelse av oppløselige komplekser av rekombinante MHC-molekyler i kombinasjon med syntetiske peptider har også blitt tatt i bruk [Kern, F. et al

(1998) Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. et al (2001) TRENDS in Immunol.

22:583-588]. Disse reagensene og fremgangsmåtene blir anvendt for å identifisere tilstedeværelsen av T-cellekloner fra perifere blodprøver fra humane subjekter eller forsøksdyr som er i stand til å binde til bestemte MHC-peptidkomplekser og ikke er tilpasset for screening av multiple potensielle epitoper for et stort mangfold av MHC-allotyper.

Biologiske analyser av T-celleaktivering gir en praktisk mulighet til å tilveiebringe en fortolkning av evnen av en test-peptid/proteinsekvens til å fremkalle en immunrespons. Eksempler på denne type metode omfatter arbeidet til Petra et al hvor det anvendes T-celleproliferasjonsanalyser for det bakterielle proteinet stafylokinase, etterfulgt av epitop-kartlegging ved anvendelse av syntetiske peptider for å stimulere T-cellelinjer [Petra, A.M. et al (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. Tilsvarende har T- celleproliferasjonsanalyser ved anvendelse av syntetiske peptider av tetanustoksin-proteinet ført til definisjon av immundominante epitop-regioner av toksinet [Reece J.C. et al (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. WO99/53038 beskriver en metode hvorved T-celle-epitoper i et testprotein kan bestemmes ved anvendelse av isolerte subsett av humane immunceller, fremme deres deres differensiering in vitro og dyrke cellene i nærvær av syntetiske peptider av interesse og måle enhver indusert proliferasjon i de dyrkede T-cellene. Samme teknikk er også beskrevet av Stickler et al. [Stickler, M.M. et al (2000) J. Immunotherapy 23:654-660], hvor metoden i begge tilfeller anvendes for deteksjon av T-celle-epitoper innenfor bakterielt subtilisin. En slik teknikk krever nøye anvendelse av teknikker for isolering av celler og cellekultur med multiple cytokinsupplementer for å oppnå de ønskede immuncelle subsettene (dendrittiske celler, CD4+ og eller CD8+ T-celler) og bidrar ikke til rask høykapasitets screening ved anvendelse av multiple donorprøver.

Nylig har en kombinasjonsmetode ved anvendelse av populasjonsbaserte T-celleproliferasjonsanalyser og in silico simulering av peptid MHC-binding ved utformingen av epitop-depleterte proteiner også blitt fremmet [WO 03/104803].

Som vist ovenfor og som følge derav, ville det være ønskelig å identifisere og å fjerne eller i det minste å redusere T-celle-epitoper fra et vesentlig terapeutisk verdifullt men opprinnelig immunogent peptid, polypeptid eller protein.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen er ment å overvinne den praktiske realiteten at oppløselige proteiner innført med terapeutiske formål hos mennesker kan utløse en immunrespons som fører til utvikling av vertsantistoffer som binder til det oppløselige proteinet. Foreliggende oppfinnelse forsøker å ta tak i dette ved å tilveiebringe bouganinproteiner med redusert tendens til å fremkalle en immunrespons. I henhold til fremgangsmåtene beskrevet her, har oppfinnerene identifisert områdene av bouganinmolekylet omfattende de kritiske T-celle-epitopene som driver immunresponsen til dette proteinet.

Foreliggende oppfinnelse angår et modifisert bouganinprotein hvor det modifiserte bouganinet har en redusert tilbøyelighet til å fremkalle en immunrespons. I en foretrukket utførelsesform har det modifiserte bouganinet en redusert tendens til å aktivere T-celler og det modifiserte bouganinet blir modifisert ved én eller flere aminosyrerester i en T-celle-epitop.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig et modifisert bouganinprotein, kjennetegnet ved at nevnte modifiserte bouganin har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert bouganin, hvor nevnte bouganin har en aminosyresubstitusjon av en eller flere av X<1>, X<2>, X<3>, X<4>eller X<5>i en T-celle epitope valgt fra gruppen bestående av:

a) AKX<X>DRKX<2>LX<3>LGVX<4>KL (epitoperegion RI, SEQ ID NO:8)

b) LGVX<4>KLEFSIEAIHG (epitoperegion R2, SEQ ID NO:9); og

c) NGQEX<5>AKFFLIVIQM (epitoperegion R3, SEQ ID NO: 10)

hvor:

X<1>er T eller A eller Q;

X<2>er G eller A;

X<3>er Q eller G;

X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S; ogX5er Q eller A.

Foreliggende oppfinnelse angår også et cytotoksin, idet det omfatter

(a) en målrettet gruppe bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et cytotoksin, idet det omfatter

(a) en ligand som binder til en kreftcelle bundet til;

(b) et modifisert bouganinprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

I én utførelsesform er den målrettende gruppen en ligand som binder til en kreftcelle. I en ytterligere utførelsesform, er liganden et antistoff eller antistoffragment som binder til en kreftcelle. I en spesiell utførelsesform gjenkjenner antistoffet Ep-CAM eller tumor-assosiert antigen. Cytotoksinet kan omfatte VB6-845 eller VB6-011.

Enda ytterligere tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling av et dyr med kreft idet den omfatter: (a) identifisering av T-celle epitoper av bouganin; (b) modifisering av en eller flere aminosyreresidier i en T-celle epitope for å fremstille et modifisert bouganin som har redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7; (c) fremstille et cytotoksin som har en cancer-bindende ligand koblet til det modifiserte bouganinet; og (d) suspendering av cytotoksinet i en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.

Idet fremgangsmåten omfatter at canceren er valgt fra gruppen bestående av kolorektal cancer, brystcancer, ovariecancer, bukspyttkjertelcancer, hode og nakke cancer, blærecancer, levercancer, nyrecancer, melanomer, gastrointestinal cancer prostatacancer, småcellet og ikke-småcellet lungecancer, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk blanding idet den omfatter cytotoksiner ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15 og en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.

Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyremolekyl, idet det koder for et modifisert bouganin ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et nukleinsyremolekyl, idet det koder for et cytotoksin ifølge kravene 8-15.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et T-celle epitope peptid, idet det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert T-celle epitope omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor minst en av XI, X2, X3, og X4 er modifisert fra den ikke-modifiserte sekvensen som følger: XI er T eller A eller Q;

X2 er G eller A;

X3 er Q eller G; og

X4 er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S (SEQ ID NO: 8).

Oppfinnelsen tilveiebringer også et T-celle epitope peptid, idet det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med den ikke-modifiserte T-celle epitopen omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor X4 er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S

(SEQ ID NO:9).

Oppfinnelsen tilveiebringer også et T-celle epitope peptid, idet det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med den ikke-modifiserte T-celle epitopen omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor X5 er Q eller A (SEQ ID NO: 10).

Oppfinnelsen tilveiebringer også et nukleinsyremolekyl, idet det koder for T-celle epitope peptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 26-28.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et modifisert bouganin protein, idet det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert bouganin omfattende sekvensen:

Andre trekk og fordeler ifølge foreliggende oppfinnelse vil være innlysende fra den følgende detaljerte beskrivelsen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i relasjon til figurene hvor:

Figur 1 viser resultater av aktivitetsanalyser av de T-celle epitop-utarmede modifiserte bouganinproteinene Boul56 (panel A) og Boul57 (panel B). Boul56 omfatter substitusjonene V123A, D127A, Y133N og I152A. Boul57 omfatter substitusjonene V123A, D127A, Y133Q og I152A. Begge analysesettene utføres ved anvendelse av villtypeprotein og et uskadeliggjort modifisert bouganin (Y70A) som kontroller. Aktivitet uttrykkes som % målt luciferaseaktivitet versus konsentrasjon av bouganinprotein i analysen. Figur 2 viser resultater av T-celleproliferasjonsanalyse for tre syntetiske peptider og 2 forskjellige PBMC donor-prøver. Peptidene betegnet DeI-41, DeI-44 og DeI-50 ble testet ved l\ iM endelig konsentrasjon (panel A) og 5\ iM endelig konsentrasjon (panel B). Disse peptidene er avledet fra de immunogene regionene av bouganinmolekylet og inneholder substitusjoner utformet for å oppheve deres immunogenisitet. Figur 3 illustrerer VB6-845, et modifisert bouganin-cytotoksin som har en Fab anti-Ep-CAM, hvor de-bouganin (Boul56) er bundet til den C-terminale enden av CH-domenet via en furinlinker. Figur 3A illustrerer den dicistroniske enheten som koder for pro-sekvensene, Figur 3B illustrerer den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR: 15) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 16) av pro-sekvensene og Figur 3C illustrerer det sammensatte VB6-845-proteinet uten pelB-sekvensene. Figur 4 viser kartet av ekspresjonsvektoren pING3302. Innskuddene ifølge eksemplene ble ligert i 3302 vektor ved anvendelse av EcoRI og Xhol-restriksjonsseter. Figur 5 illustrerer kontroll Fab anti-Ep-CAM-konstruksjonen uten plantetoksinet, de-bouganin (VB5-845). Figur 5A viser den dicistroniske enheten som koder for pro-sekvensene, Figur 5B viser den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR: 17) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 18) av pro-sekvensene og Figur 5C viser det sammensatte VB5-845-proteinet uten pelB-sekvensene. Figur 6 illustrerer Fab anti-Ep-CAM de-bouganin-konstruksjonen VB6-845-CL-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet ved den C-terminale enden av CL-domenet. Figur 6A illustrerer de dicistroniske enhetene som koder for pro-sekvensene, Figur 6B illustrerer den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR: 19) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:20) av pro-sekvensene og Figur 6C illustrerer det sammensatte VB6-845-CL-de-bouganin-proteinet uten pelB-sekvensene. Figur 7 illustrerer Fab anti-Ep-CAM, de-bouganinkonstruksjon, VB6-845-NVH-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet til den N-terminale enden av VH-domenet. Figur 7A illustrerer de dicistroniske enhetene som koder for pro-sekvensene, Figur 7B viser den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR:21) og aminosyresekvensen (SEKV ID

NR:22) av pro-sekvensene og Figur 7C illustrerer det sammensatte VB6-845-NVH-de-bouganinproteinet uten pelB-sekvensene. Figur 8 viser Fab anti-Ep-CAM de-bouganinkonstruksjonen, VB6-845-NVL-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet til N-terminalen av VL-domenet. Figur 8A viser de dicistroniske enhetene som koder for pro-sekvensene, Figur 8B viser den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR:23) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:24) av pro-sekvensene og Figur 8C illustrerer det sammensatte VB6-845-NVL-de-bouganinproteinet uten pelB-sekvensene. Figur 9 er et Western Blot som viser ekspresjonen av VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3) og VB6-845-CL-de-bouganin (Boul56) (konstruksjon ifølge Figur 6) i supernatanten fra induserte E104-celler ved laboratorieskala. Figur 10 illustrerer resultatene av strømningscytometri reaktivitetsstudiene. Figur 10A viser reaktiviteten av VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3) og VB6-845-CL-de-bouganin (konstruksjon ifølge Figur 6) i Ep-CAM-positive cellelinjer CAL 27 og OVCAR-3 og Ep-CAM-negativ cellelinje A-375, mens Figur 10 B, viser resultatene av de samme testene utført med VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3) og VB6-845-gelonin (konstruksjon ifølge Figur 14C) og kontroll (PBS). Figur 11 er en kurve som illustrerer resultatene av konkurranseforsøket VB6-845 og Proxinium™ i NIH:OVCAR-3-celler og som beskrevet i Eksempel 7. Figur 12 er en kurve som illustrerer resultatene av cellefri analyse ifølge Eksempel 7. Figur 13 illustrerer resultatene av MTS cytotoksisitetsanalysen ifølge Eksempel 8 som sammenliger cytoksisiteten av VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3), VB6-845-CL-de-bouganin (konstruksjon ifølge Figur 6) og de-bouganin (Boul 56) i CAL 27 (Figur 13A) og NIH:OVCAR3 (Figur 13B)-celler. Figurene 14A og B illustrerer resultatene av MTS cytotoksisitetsanalysen ifølge Eksempel 8 for sammenligning av cytoksisiteten av VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3), VB6-845-gelonin (konstruksjon ifølge Figur 14C) og gelonin i CAL 27 (Figur 14A) og NIH:OVCAR3 (Figur 14B)-celler. Figur 14C viser den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR:25) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:26) av VB6-845-geloninkonstruksj onen. Figur 15 viser den kodende sekvensen av nukleinsyren (SEKV ID NR: 27) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:28) av pro-sekvensene av VB6-011. Figur 16 illustrerer resultatene av MTS cytotoksisitetsanalysen ifølge Eksempel 9 som viser cytotoksisiteten av VB6-011 i MB-435S-celler.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnerene har identifisert T-celle epitoper i bouganin og har utformet og fremstilt modifiserte bouganinproteiner som har redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler sammenlignet med det umodifiserte bouganinproteinet.

(A) Modifiserte bouganinproteiner

Foreliggende oppfinnelse angår et modifisert bouganinprotein hvor bouganin er

blitt modifisert for å ha en redusert tilbøyelighet til å fremkalle en immunrespons, foretrukket en T-celle-respons, sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein. Modent bouganinprotein er et enkelt polypeptid på 250 aminosyrer med en molekylvekt på omtrent 26,200 Da [Den Hartog et al (2002) Eur. J. Biochem. 269: 1772-1779; US-patent nr. 6,680,296]. Bouganin er en type 1 ribosom inaktiverende protein (RIP) opprinnelig isolert fra planten Bougainvillea spectabilis Willd [Bolognesi et al (1997) Planta 203: 422-429]. RIP fra planter er RNA N-glykosidaser som depurinerer viktig ribosomalt RNA i celler, hvilket derved skader ribosomene og fører til et opphør av proteinsyntese og celledød.

Aminosyresekvensen av det modne bouganinproteinet (vist i énbokstavs-kode) er:

Betegnelsen "umodifisert bouganinprotein" betyr et bouganinprotein som ikke er modifisert for å redusere dets tilbøyelighet til å fremkalle en immunrespons. Sekvensen av villtype eller et umodifisert bouganin er vist i SEKV ID NR: 1. Imidlertid vil fagfolk på området forstå at betegnelsen "umodifisert bouganin" også omfatter modifikasjoner av SEKV ID NR:1 så lenge slike modifikasjoner ikke reduserer tendensen til å fremkalle en immunrespons. Eksempler på modifikasjoner som kan foretas i SEKV ID NR:1 omfatter peptidfragmenter og konservative aminosyresubstitusjoner som ikke reduserer immunogenisiteten av proteinet.

Betegnelsen "modifisert bougainprotein" betyr et bouganinprotein som er modifisert sammenlignet med det umodifiserte bouganinproteinet (beskrevet ovenfor) hvor nevnte modifikasjon reduserer tilbøyeligheten av bouganin til å fremkalle en immunrespons. Modifisert bouganinprotein kan også refereres til som deimmunisert bouganin. Det "modifiserte bouganinproteinet" kan være en modifisert fullengde-sekvens eller et modifisert fragment av det umodifiserte bouganinproteinet. Det "modifiserte bouganinproteinet" kan også inneholde andre endringer sammenlignet med villtype bouganinsekvensen som ikke endrer immunogenisiteten av peptidet. Det modifiserte bouganinproteinet vil fortrinnsvis ha samme biologiske aktivitet som det umodifiserte bouganinet.

Betegnelsen "redusert tilbøyelighet til å fremkalle en immunrespons" som anvendt her betyr at det modifiserte bouganinproteinet er mindre immunogent enn umodifisert bouganin.

Betegnelsen "immunrespons" omfatter både cellulære og humorale immunresponser. I en foretrukket utførelsesform har det modifiserte bouganinet en redusert tendens til å aktivere T-celler.

Betegnelsen "redusert tendens til å aktivere humane T-celler" som anvendt her betyr at det modifisere bouganinproteinet har en redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler sammenlignet med det umodifiserte bouganinproteinet. Fagfolk på området kan undersøke hvorvidt et modifisert bouganin har en redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler ved anvendelse av analyser kjent på området omfattende å fastsette stimuleringsindeksen av proteinet.

Betegnelsen "stimuleringsindeks" som anvendt her angir målingen av evnen til det modifiserte eller umodifiserte bouganinproteinet til å aktivere humane T-celler. For eksempel kan det modifiserte eller umodifiserte bouganinproteinet eller peptider derav, undersøkes for deres evne til å fremkalle en proliferativ respons i humane T-celler dyrket in vitro. Når denne type metode utføres ved anvendelse av naive humane T-celler tatt fra friske donorer, har oppfinnerene bestemt at i kraft av en slik analyse er en stimuleringsindeks lik eller større enn 2,0 et anvendelig mål på indusert proliferasjon. Stimuleringsindeksen blir konvensjonelt avledet ved deling av proliferasjons-score (f.eks. tellinger pr. minutt av radioaktivitet dersom det anvendes<3>H-tymidininkorporering) målt for testpeptidet med score målt i celler ikke kontaktet med et testpeptid.

I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et modifisert bouganinprotein, hvor det modifiserte bouganinproteinet har biologisk aktivitet og har redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein.

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et modifisert bouganinprotein, hvor det modifiserte bouganinproteinet har redusert tendens til å aktivere humane T-celler sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein og har biologisk aktivitet som er lavere enn det umodifiserte bouganinproteinet. I enda en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et modifisert bouganinprotein hvor det modifiserte bouganinproteinet har redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler og ingen biologisk aktivitet. Slike modifiserte proteiner kunne, for eksempel, anvendes som kontroller, i analyser eller for tolerisering av subjekter.

Betegnelsen "biologisk aktivitet" som anvendt her er evnen av det modifiserte eller umodifiserte bouganinproteinet til å hemme proteinsyntese ved ribosomer, hvilken kan bedømmes på flere måter. Det skal bemerkes at et modifisert bouganinprotein fortsatt vil ha biologisk aktivitet selv om slik aktivitet er lavere enn den for det umodifiserte proteinet, imidlertid ville det måtte ha et visst nivå av detekterbar aktivitet. Den biologiske aktiviteten av det modifiserte eller umodifiserte bouganinproteinet kan for eksempel bedømmes ved å identifisere deres N-glykosidase-aktivitet og spesielt med tilstrekkelig aktivitet til å gi betydelig hemning av translasjon til protein. En slik egnet analyse omfatter å teste aktiviteten av varianter av bouganinprotein sammenlignet med umodifisert bouganin i en cellefri proteinsyntese-analyse. En koblet transkripsjon/translasjonsblanding inneholdende metionin, DNA som koder for reporter-proteinet luciferase og seriefortynninger av umodifisert og modifisert bouganinprotein ko-inkuberes. Nivåene av translatert luciferase detekteres lett ved anvendelse av en luminescens teller etter tilsetning av en substratreagens. Den målte luminescensen er omvendt proporsjonal med bouganin N-glykosidaseaktiviteten til stede i reaksjonen. Det er vanlig å tilveiebringe en negativ kontroll slik som et inaktivt bouganinprotein, for eksempel inneholdende en Y70A-substitusjon.

I en foretrukket utførelsesform blir det modifiserte bouganinpeptidet modifisert ved én eller flere T-celle-epitoper i bouganinproteinsekvensen.

Betegnelsen "T-celle epitop" betyr en aminosyresekvens som er i stand til å binde major histocompatibility complex (MHC) klasse II, i stand til å stimulere T-celler og/eller også i stand til å binde (uten nødvendigvis å målbart aktivere) T-celler i kompleks med MHC klasse E.

I ett aspekt omfatter en generell fremgangsmåte som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse som fører til de modifiserte bouganinproteinene omfattende modifiserte T-celle-epitoper de følgende trinnene: (i) bestemme aminosyresekvensen av proteinet eller del derav; (ii) identifisere én eller flere potensielle T-celle epitoper innenfor aminosyresekvensen av proteinet ved metoder slik som bestemmelse av bindingen av peptidene til MHC-molekyler ved anvendelse av in vitro eller in silico teknikker eller biologiske forsøk; (iii) utforme nye sekvensvarianter hvor én eller flere aminosyrer innenfor de identifiserte potensielle T-celle epitopene er modifisert på en slik måte at de vesentlig reduserer eller fjerner aktiviteten av T-celle epitopen som bestemt ved binding av peptidene til MHC-molekyler ved anvendelse av in vitro eller in silico teknikker eller biologiske forsøk. Slike sekvensvarianter blir dannet på en slik måte at det unngås dannelse av nye potensielle T-celle epitoper ved sekvens variasjonene hvis ikke slike nye potensielle T-celle-epitoper, i sin tur, er modifisert på en slik måte at aktiviteten av T-celle epitopen hovedsakelig reduseres eller elimineres; (iv) konstruere slike sekvensvarianter ved rekombinante DNA-teknikker og teste nevnte varianter for å identifisere én eller flere varianter med ønskelige egenskaper i henhold til velkjente rekombinante teknikker; og

(v) eventuelt repetere trinn (ii) til (iv).

I et eksempel blir trinn (iii) utført ved substitusjon, addisjon eller delesjon av aminosyrerester i hvilken som helst av T-celle epitopene i det umodifiserte bouganinproteinet. I et annet eksempel gjennomføres metoden for å fremstille det modifiserte bouganinproteinet med referanse til den homologe proteinsekvensen og/eller in silico modellering.

Identifikasjon av potensielle T-celle-epitoper i henhold til trinn (ii) kan utføres i henhold til metoder beskrevet tidligere på området. Egnede metoder er beskrevet i WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 og kan anvendes for å identifisere tilbøyelighet til binding for bouganin-avledede peptider til et MHC klasse II-molekyl. For å identifisere biologisk relevante peptider har oppfinnerene utviklet en fremgangsmåte som benytter ex vivo human T- celleproliferasjonsanalyse. Denne metoden har vist seg å være en spesielt effektiv metode og har omfattet testing av overlappende bouganin-avledede peptidsekvenser ifølge et skjema slik at hele bouganinsekvensen scannes og testes. De syntetiske peptidene blir testet for deres evne til å fremkalle en proliferativ respons i humane T-celler dyrket in vitro. Når denne type metode utføres ved anvendelse av naive humane T-celler tatt fra friske donorer, har oppfinnerene bestemt at i kraft av en slik analyse er en stimuleringsindeks lik eller større enn 2,0 et anvendelig mål på indusert proliferasjon. Stimuleringsindeksen blir konvensjonelt avledet ved deling av proliferasjons-score (f. eks. tellinger pr. minutt av radioaktivitet dersom det anvendes<3>H-tymidininkorporering) målt for testpeptidet med score målt for celler ikke kontaktet med et testpeptid.

Følgelig ble, i de foreliggende undersøkelsene, 89 syntetiske 15-mer peptider (som listet opp i Tabell 1) anvendt i T-celleproliferasjonsanalyse med PBMC (perifere blod mononukleære celler) fra naive donorer (dvs. ingen kjent sensibilisering mot bouganin). 20 donor PBMC-prøver ble valgt for å oppnå en optimal dekning av MHC klasse Il-allotyper. PBMC'er ble stimulert med individuelle peptider in triplo kulturer i 7 dager før proliferasjon ble bedømt ved<3>H-tymidininkorporering. Alle peptidene ble fortynnet ved to forskjellige konsentrasjoner: l(xM og 5(xM. Stimuleringsindeksene (SI) ble beregnet som mengden av<3>H inkorporert i cellene, dividert med mengden av<3>H inkorporert i simulert-stimulerte kontroller.

Denne metoden har identifisert de mest immunogene områdene av bouganinmolekylet hos mennesker. Følgelig er, i en spesifikk utførelsesform, det modifiserte bouganinproteinet modifisert ved én eller flere aminosyrerester i en T-celle-epitop valgt fra gruppen bestående av: a) AKVDRKDLELGVYKL, heri betegnet epitopområde RI (SEKV ID NR:2);

b) LGVYKLEFSIEAIHG, heri betegnet epitopområde R2 (SEKV ID NR:3); og

c) NGQEIAKFFLIVIQM, heri betegnet epitopområde R3 (SEKV ID NR:4).

Disse T-celle epitopene har blitt identifisert på grunnlag av å gi SI > 2 med hensyn

til to eller flere donor PBMC-prøver. De ovenfor beskrevne peptidsekvensene representerer den kritiske informasjonen nødvendig for konstruksjon av modifiserte bouganinproteiner hvor én eller flere av disse epitopene er kompromittert.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er minst én T-celle-epitop fjernet i det modifiserte bouganinproteinet. I en annen utførelsesform er minst én, to eller tre T-celle-epitoper fjernet i det modifiserte bouganinproteinet ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen omfatter også et modifisert bouganinprotein hvor 1 til 9 aminosyrerester er modifisert, foretrukket i T-celle epitopen. I en annen utførelsesform er 1 til 5 aminosyrerester modifisert. Betegnelsen "modifisert" som anvendt her betyr at aminosyrerestene er modifisert ved substitusjon, addisjon eller delesjon, foretrukket ved substitusjon, men bouganinproteinet har redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler. I en annen utførelsesform har det modifiserte proteinet biologisk aktivitet. Mer foretrukket blir det modifiserte bouganinproteinet ifølge oppfinnelsen modifisert ved substitusjon i en posisjon svarende til hvilken som helst av aminosyrene spesifisert innenfor sekvensene (a), (b) eller (c) ovenfor.

En utførelsesform av oppfinnelsen omfatter bouganinproteiner for hvilke MHC klasse II-ligandene identifisert innenfor hvilke som helst av epitopene RI - R3 er modifisert for å fjerne binding eller på annen måte redusere antallet MHC-allotyper til hvilke peptidet kan binde. Aminosyrer i RI til R3-områdene kan, for å utelukke binding eller på annen måte redusere antall MHC-allotyper til hvilke peptidet kan binde, modifiseres ved substitusjon, addisjon eller delesjon.

For å fjerne T-celle epitoper, er det foretatt aminosyresubstitusjoner ved passende seter innenfor peptidsekvensen predikert å oppnå vesentlig reduksjon eller eliminering av aktiviteten av T-celle epitopen. I praksis vil et passende sete i én utførelsesform svare til en aminosyrerest som binder innenfor én av lommene gitt innenfor MHC klasse II bindingsgropen.

I én utførelsesform modifiseres bindingen innenfor den første lommen i kløften ved den såkalte Pl eller Pl anker-posisjonen. Kvaliteten av bindings interaksjon mellom Pl anker-resten av peptidet og den første lommen i MHC klasse II-bindingsgropen er kjent som en viktig determinant for total bindingsaffinitet for hele peptidet. En passende substitusjon ved denne posisjonen av peptidet vil være av en rest mindre lett tilpasset i lommen, for eksempel substitusjon til en mer hydrofil rest. Aminosyrerester i peptidet i posisjoner som svarer til binding innenfor andre lomme-områder innenfor MHC bindingsgropen er også betraktet og er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Det vil forstås at enkelt aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller addisjoner innenfor en gitt potensiell T-celle-epitop er en foretrukket metode ved hvilken epitopen kan elimineres. Kombinasjoner av modifikasjoner (dvs. substitusjoner, delesjoner og addisjoner) innenfor en enkelt epitop kan være omfattet og kan for eksempel være spesielt hensiktsmessig hvor individuelt definerte epitoper overlapper med hverandre som i foreliggende tilfelle hvor epitopområdene RI og R2 overlapper med 5 rester. Videre kan enten enkelt aminosyremodifikasjoner innenfor en gitt epitop eller i kombinasjon innenfor en enkelt epitop foretas i posisjoner som ikke svarer til "lommerestene" med hensyn til MHC klasse II-bindingsgropen, men ved hvilket som helst sete innenfor peptidsekvensen. Modifikasjoner kan foretas med referanse til en homolog struktur eller strukturell metode fremstilt ved anvendelse av in sz/zco-teknikker kjent på området og kan være basert på kjente strukturelle trekk for molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse. Epitopområdene RI - R3 av bouganin ble analysert for angivelse av MHC klasse II-ligander omfattet innenfor deres respektive sekvenser. Et programvareverktøy som benytter systemet beskrevet i WO 98/59244 og WO 02/069232 ble anvendt for denne analysen. Programvaren simulerer fremgangsmåten for antigenpresentasjon på nivået for peptid MHC klasse II-bindingsinteraksjon for å tilveiebringe en bindingsscore for hvilken som helst gitt peptidsekvens. En slik score blir bestemt for mange av de dominerende MHC klasse II-allotypene som finnes i populasjonen. Ettersom dette systemet er i stand til å teste hvilken som helst peptidsekvens, kan konsekvensene av aminosyresubstitusjoner, addisjoner eller delesjoner med hensyn til evnen av et peptid til å interagere med en MHC klasse II-bindingsgrop predikeres. Følgelig kan det utformes nye sammensetninger av sekvenser som inneholder redusert antall peptider i stand til å interagere med MHC klasse II og derved fungere som immunogene T-celle-epitoper.

I dette systemet omfatter, i én utførelsesform, substitusjoner innenfor epitopområde RI endringer i posisjonene VI23, Dl27 og/eller El29. Tilsvarende for epitopområde R2 er, i én utførelsesform, substitusjonen i posisjon Y133. Denne resten er innenfor området med overlapping mellom RI og R2 men substitusjon ved Yl33 er tilstrekkelig til å fjerne den R2-relaterte MHC klasse D-liganden og er ikke tilstrekkelig i seg selv for å fjerne Rl-relaterte MHC klasse II-ligander. For epitopområde R3 er, i én utførelsesform ifølge oppfinnelsen, substitusjoner ved restene El51 og/eller 1152.

I alle tilfeller er substitusjonene i forhold til én eller flere alternative aminosyrerester. Analyse av RI med MHC II stimulerings-programvare indikerte at aminosyrerestene 123, 127, 129 og 131 var nøkkelrester i denne epitopen for binding til MHC II-molekyler. Rest 123 er et foretrukket sete for mutasjon av RI-området fordi den finnes ved overflaten av molekylet, borte fra det aktive sete og er variabel i RIP sekvenssammenstilling. Allikevel gir ikke alle substitusjoner et aktivt molekyl og derav følger behovet for å validere mutasjoner i bioaktivitetsanalysen. Følgelig er, for eksempel innenfor RI, substitusjonene V123T, V123A og V123Q eksempler på foretrukne alternative substitusjoner. Rest 131 ble funnet å være absolutt konservert i RIP og er følgelig sannsynligvis ikke egnet for mutasjon. Restene 127 og 129 er ikke sterkt konserverte men bare et begrenset antall rester ble funnet å ha en innvirkning på MHC II-binding. Substitusjonsgruppen: D127 G, D127A, E129Q og E129 G er også foretrukne substitusjoner. For R2 ble rest 133 vist å være en sannsynlig kandidat for å oppheve MHC Il-binding og dens tilsynelatende lokalisering på overflaten (som bestemt ved modellering) kombinert med det faktum at den ikke er sterkt konservert gjennom RIP gjør den til en god kandidat for mutasjon. Foretrukne alternative substitusjoner ble funnet å være Y133N, Y133T, Y133A, Y133R, Y133D, Y133E, Y133Q, Y133 G, Y133K, Y133H og Y133S. For R3, ble aminosyrerestene 152, 155 og 158 identifisert som nøkkelrester for MHC II-binding. Imidlertid er restene 155 og 158 del av en sterkt konservert hydrofob strekning hvilket følgelig indikerer at mutasjon av disse ikke ville gi bioaktive molekyler. Rest som er lite konservert ble funnet å være en mer sannsynlig kandidat. For R3 er gruppen av substitusjoner: I152Q og I152A også foretrukne substitusjoner.

Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig et modifisert bouganinprotein hvor bouganin er modifisert ved én eller flere av X<1>, X<2>,X<3>,X<4>eller X<5>som følger: a) AKX<1>DRKX<2>LX<3>LGVX<4>KL (epitopområde RI, SEKV ID NR:5);

b) LGVX<4>KLEFSIEAIHG (epitopområde R2, SEKV ID NR:6); og

c) NGQEX<5>AKFFLIVIQM (epitopområde R3, SEKV ID NR:7)

hvor X<1>til og med X<5>kan være hvilken som helst aminosyre.

I en spesifikk utførelsesform, er X<1>T eller A eller Q; X<2>er G eller A; X<3>er Q eller G; X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S; og X<5>er Q eller A (epitopområde RI, SEKV ID NR:8; epitopområde R2, SEKV ID NR:9; epitopområde R3, SEKV ID NR: 10).

Sett under ett kan en mest foretrukket substitusjonsgruppe settes sammen basert på kartleggingsstudier av immunogene epitoper ved anvendelse av ex vivo T-celle-analyser, in silico simuleringer av MHC-peptidbinding og strukturelle betraktninger fra analyse av sekvenshomologi. Til slutt kan det, dersom et bioaktivt protein er foretrukket, foretas in vitro-aktivitetsanalyse av det modifiserte proteinet som kan omfatte én eller multiple mutasjoner.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen i en annen utførelsesform et modifisert bouganinpeptid, omfattende aminosyresekvensen:

hvor X<1>til og med X<5>kan være hvilken som helst aminosyre (SEKV ID NR: 11).

I en foretrukket utførelsesform, er X<1>T eller A eller Q; X<2>er G eller A; X<3>er Q eller G; X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S; og X<5>er Q eller A (SEKV ID NR: 12).

I en bestemt utførelsesform omfatter det modifiserte bouganinproteinet aminosyresekvensen:

I enda en annen utførelsesform omfatter det modifiserte bouganinproteinet aminosyresekvensen:

Understrekede rester er substituerte rester forskjellig fra det umodifiserte bouganinproteinet.

Som det vil være tydelig for fagfolk på området, kunne det oppnås mangfoldige alternative grupper av modifikasjoner for å oppnå målet med å avskaffe uønskede epitoper. De resulterende sekvensene ville imidlertid fortsatt i store trekk være homologe med de spesifikke proteinene beskrevet her og er derfor innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Kjemiske ekvivalenter av sekvensene beskrevet ifølge foreliggende oppfinnelse er selvfølgelig også ment å omfattes innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Slike ekvivalenter omfatter proteiner som utfører hovedsakelig samme funksjon på hovedsakelig samme måte.

I en annen utførelsesform har det modifiserte bouganinproteinet ifølge oppfinnelsen 1, 2, 3, 4, 5 eller flere aminosyremodifikasjoner i T-celle epitopene i proteinet.

I en ytterligere utførelsesform fremkaller det modifiserte bouganinproteinet ifølge oppfinnelsen når testet i en T-celle-analyse en redusert stimuleringsindeks sammenlignet med det umodifiserte bouganinproteinet.

I en ytterligere utførelsesform, blir T-celle epitopene i bouganinproteinet kartlagt ved anvendelse av en T-celle-analyse og deretter modifisert slik at det modifiserte bouganinproteinet ved retesting i T-celle-analyse fremkaller en stimuleringsindeks mindre enn det umodifiserte bouganinproteinet, foretrukket er stimuleringsindeksen mindre enn 2,0.

Det vil være klart for fagfolk på området at hvis det modifiserte bouganinproteinet har vesentlig redusert eller ingen biologisk aktivitet, kan det være nødvendig med ytterligere modifikasjon ved substitusjon, addisjon eller delesjon av aminosyrerester for å gjenopprette den biologiske aktiviteten av det modifiserte bouganinproteinet. Imidlertid er slike modifiserte bouganinproteiner som har vesentlig redusert eller ingen biologisk aktivitet fortsatt omfattet innenfor omfanget av oppfinnelsen og er anvendelige som kontroller i analyser eller for tolerisering.

I én utførelsesform er det modifiserte bouganinet er mutert ved tyrosinresten i posisjon 70, hvilket gir et inaktivt bouganin. I en spesifikk utførelsesform, blir tyrosin i posisjon 70 erstattet med alanin. I en foretrukket utførelsesform har det modifiserte bouganinet sekvensen:

Under systemet ifølge foreliggende oppfinnelse, blir epitopene kompromitert ved mutasjon hvilket resulterer i sekvenser som ikke lenger er i stand til å fungere som T-celle epitoper. Det er mulig å anvende rekombinant DNA-metoder for å oppnå kontrollert mutagenese av målsekvensene og mange slike teknikker er tilgjengelig og velkjente på området. I praksis vil flere modifiserte bouganinproteiner fremstilles og testes for de ønskede immune og funksjonelle egenskapene. Det er spesielt viktig når det foretas modifikasjoner i proteinsekvensen at de beregnede endringene ikke innfører nye immunogene epitoper. Denne hendelsen blir unngått i praksis ved retesting av den omfattede sekvensen for tilstedeværelse av epitoper og/eller av MHC klasse II-ligander ved hvilken som helst egnet metode.

De modifiserte bouganinproteinene ifølge oppfinnelsen kan også inneholde eller anvendes for å oppnå eller utforme "peptidmimetika". "Peptidmimetika" er strukturer som tjener som substitutter for peptider i interaksjoner mellom molekyler (Se Morgan et al

(1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252 for en oversikt). Peptidmimetika omfatter syntetiske strukturer som kan, eller ikke kan, inneholde aminosyrer og/eller peptidbindinger men beholder de strukturelle og funksjonelle trekkene av protein ifølge oppfinnelsen, omfattende biologisk aktivitet og en redusert tilbøyelighet til å aktivere humane T-celler. Peptidmimetika omfatter også peptoider, oligopeptoider (Simon et al

(1972) Proe. Nati. Acad, Sei USA 89:9367).

Peptidmimetika kan utformes basert på informasjon oppnådd ved systematisk erstatning av L-aminosyrer med D-aminosyrer, erstatning av sidekjeder med grupper som har forskjellige elektroniske egenskaper og ved systematisk erstatning av peptidbindinger med amidbindings-erstatninger. Lokale konformasjonelle restriksjoner kan også innføres for å bestemme konformasjonelle krav for aktivitet av et kandidat-peptidmimetika. Mimetika kan omfatte isostere amidbindinger eller D-aminosyrer for å stabilisere eller fremme "revers turn"-konformasjoner og for å bidra til å stabilisere molekylet. Sykliske aminosyreanaloger kan anvendes for å styre aminosyrerester til bestemte konformasjonelle tilstander. Mimetika kan også omfatte etterligner av sekundærstrukturene av proteinene ifølge oppfinnelsen. Disse strukturene kan modellere den 3-dimensjonale orienteringen av aminosyrerester til de kjente sekundære konformasj onene av proteiner. Peptoider kan også anvendes, hvilke er oligomerer av N-substituerte aminosyrer og kan anvendes som motiver for dannelse av kjemisk ulike biblioteker av nye molekyler.

Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved hvilken som helst av mange metoder, men mest foretrukket ved bruk av rutinemessige rekombinante metoder. Det er en relativt enkel prosedyre å anvende proteinsekvensene og informasjonen gitt her for å dedusere et polynukleotid (DNA) som koder for hvilken som helst av de foretrukne proteinsekvensene. Dette kan oppnås for eksempel ved anvendelse av datamaskinprogramvare-verktøy slik som DNSstar programvare suite [DNAstar Inc, Madison, WI, USA] eller lignende. Hvilken som helst slik DNA-sekvens med evne til å kode for de foretrukne polypeptidene ifølge foreliggende eller signifikante homologer derav, skulle betraktes som utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som et generelt system, kan gener som koder for hvilke som helst av de foretrukne modifiserte bouganinproteinsekvensene fremstilles ved anvendelse av gensyntese og kloning inn i en egnet ekspresjonsvektor. I sin tur blir ekspresjonsvektoren innført i en vertscelle og celler selektert og dyrket. Proteinene ifølge oppfinnelsen blir renset fra dyrkningsmediet og formulert til et preparat for terapeutisk administrering. Alternativt kan en villtype bouganin-gensekvens oppnås for eksempel ifølge en cDNA-kloningsstrategi ved anvendelse av RNA fremstilt fra rotvevet av Bougainvillea spectabilis Willd plante. Villtypegenet kan anvendes som et templat for mutagenese og konstruksjon av foretrukne variantsekvenser. I dette henseende er det spesielt hensiktsmessig å anvende strategien med "overlap extension PCR" som beskrevet av Higuchi et al [Higuchi et al (1988) Nucleic AcidsRes. 16: 7351] selv om andre metoder og systemer lett kunne anvendes.

Den biologiske aktiviteten av proteinene ifølge oppfinnelsen kan i like stor grad bedømmes på mange måter. I én utførelsesform identifiseres modifiserte bouganinmolekyler ved N-glykosidaseaktivitet og spesielt med tilstrekkelig aktivitet til å gi betydelig hemning av translasjon til protein. En slik egnet analyse omfatter å teste aktiviteten av de modifiserte bouganinproteinene sammenlignet med umodifisert bouganin i en cellefri proteinsynteseanalyse. En koblet transkripsjon/translasjonsblanding inneholdende metionin, DNA som koder for reporter-proteinet luciferase og seriefortynninger av umodifisert og modifisert bouganinprotein ko-inkuberes. Nivåene av translatert luciferase detekteres lett ved anvendelse av en luminescens-teller etter tilsetning av en substratreagens. Den målte luminescensen er omvendt proporsjonal med bouganin N-glykosidaseaktiviteten til stede i reaksjonen. Det er vanlig å tilveiebringe en negativ kontroll slik som et inaktivt bouganinprotein, for eksempel inneholdende en Y70A-substitusjon.

Opprettelse av de foretrukne og aktive bouganinmolekylene kan oppnås ved rekombinant DNA-teknikker og dette omfatter bouganinmolekyler fusjonert med ønsket antistoff eller andre målrettede grupper. Metoder for rensning av og manipulering av rekombinante proteiner omfattende fusjonsproteiner er velkjent på området. Nødvendige teknikker er forklart fullstendig i litteraturen, slik som, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", andre utgave (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology"

(Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

Proteinene og peptidene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av rekombinant DNA-metoder. Proteinene ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved kjemisk syntese ved anvendelse av teknikker velkjente innenfor proteinkjemi slik som fastfase syntese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) eller syntese i homogen løsning (Houbenweyl, 1987, Methods for Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I og II, Thieme, Stuttgart).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et renset og isolert nukleinsyremolekyl ifølge patentkravene 24 og 25.

Betegnelsen "isolert og renset" som anvendt her angir en nukleinsyre hovedsakelig fri for cellulært materiale eller dyrkningsmedium når fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker eller kjemiske forløpere eller andre kjemikalier når syntetisert kjemisk. En "isolert og renset" nukleinsyre er også hovedsakelig fri for sekvenser som naturlig flankerer nukleinsyren (dvs. sekvenser lokalisert ved 5' og 3' -endene av nukleinsyren) fra hvilken nukleinsyren er avledet.

Betegnelsen "nukleinsyre" som anvendt her angir en sekvens av nukleotid eller nukleosidmonomerer bestående av naturlig forekommende baser, sukkere og inter sukker (ryggrad)-bindinger. Betegnelsen omfatter også modifiserte eller substituerte sekvenser omfattende ikke naturlig forekommende monomerer eller deler derav, som fungerer på lignende måte. Nukleinsyresekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ribonukleinsyre (RNA) eller deoksyribonukleinsyrer (DNA) og kan inneholde naturlig forekommende baser omfattende adenin, guanin, cytosin, tymidin og uracil. Sekvensene kan også inneholde modifiserte baser slik som xantin, hypoxantin, 2-aminoadenin, 6-metyl, 2-propyl og andre alkyladeniner, 5-halogenuracil, 5-halogencytosin, 6-azauracil, 6-azacytosin og 6-azatymin, pseudouracil, 4-tiouracil, 8-halogenadenin, 8-aminoadenin, 8-tioladenin, 8-tio-alkyl-adeniner, 8-hydroksyladenin og andre 8-substituerte adeniner, 8-halogenguaniner, 8-aminoguanin, 8-tiolguanin, 8-tioalkyl-guaniner, 8-hydroksylguanin og andre 8-substituerte guaniner, andre aza og deazauraciler, tymidiner, cytosiner, adeniner eller guaniner, 5-trifluormetyluracil og 5-trifluorcytosin.

Videre vil det forstås at nukleinsyremolekylene kan omfatte nukleinsyresekvenser som har vesentlig sekvenshomologi med nukleinsyresekvensene som koder for proteinene og peptidene ifølge oppfinnelsen og fragmenter derav. Betegnelsen "sekvenser som har vesentlig sekvenshomologi" betyr de nukleinsyresekvensene som har liten eller inkonsekvente sekvensvariasjoner fra disse sekvenser, dvs. sekvensene fungerer på hovedsakelig samme måte for å fremstille funksjonelt ekvivalente proteiner. Variasjonene kan være tilskrevet lokale mutasjoner eller strukturelle modifikasjoner.

Nukleinsyresekvenser som har vesentlig homologi omfatter nukleinsyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis 90% identitet med nukleinsyresekvensen som koder for proteinene og peptidene ifølge oppfinnelsen.

I et annet aspekt kan nukleinsyremolekylene og fragmenter derav ha minst 15 baser, som hybridiserer til nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen under hybridiseringsbetingelser, fortrinnsvis stringente hybridiseringsbetingelser. Passende stringensbetingelser som fremmer DNA-hybridisering er kjent for fagfolk på området eller kan finnes i Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6,3,1-6,3,6. For eksempel kan den følgende anvendes: 6,0 x natriumklorid/natriumcitrat (SSC) ved ca. 45°C, fulgt av en vask med 2,0 x SSC ved 50°C. Stringensen kan velges basert på betingelsene anvendt i vasketrinnet. For eksempel kan saltkonsentrasjonen i vasketrinnet velges fra en høy stringens på ca. 0,2 x SSC ved 50°C. I tillegg kan temperaturen i vasketrinnet være ved høy stringens-betingelser, ved ca. 65°C.

Følgelig kan nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse som har en sekvens som koder for et protein eller peptid ifølge oppfinnelsen, innføres i henhold til fremgangsmåter kjent på området inn i en passende ekspresjonsvektor som sikrer god ekspresjon av proteinet eller peptidet. Mulige ekspresjonsvektorer omfatter men er ikke begrenset til kosmider, plasmider eller modifisert virus (f.eks. replikasjonsdefekt retrovirus, adenoviruser og adenoassosiert virus), så lenge vektoren er kompatibel med vertscellen anvendt. Uttrykket "vektorer egnet for transformasjon av en vertscelle", betyr at ekspresjonsvektorene inneholder et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen og regulatorsekvenser, valgt på grunnlag av vertscellene som skal anvendes for ekspresjon, hvilken er operativt bundet til nukleinsyremolekylet. "Operativt bundet" skal bety at nukleinsyren er bundet til reguleringssekvenser på en måte som tillater ekspresjon av nukleinsyren.

En rekombinant ekspresjonsvektor kan inneholdende et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav og de nødvendige reguleringssekvensene for transkripsjon og translasjon av den inserterte proteinsekvensen. Egnede regulatoriske sekvenser kan avledes fra en rekke kilder, omfattende bakterielle, fungale eller virale gener (Se for eksempel reguleringsssekvensene beskrevet i Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Seleksjon av passende regulatorsekvenser er avhengig av den valgte vertscellen og kan lett oppnås av fagfolk på området. Eksempler på slike regulatoriske sekvenser omfatter: en transkripsjonspromoter og enhancer eller RNA-polymerasebindende sekvens, en ribosombindende sekvens, omfattende et signal for translasjonsinitiering. I tillegg kan, avhengig av vertscellen valgt og vektoren anvendt, andre sekvenser, slik som et replikasjonsorigo, ytterligere DNA-restriksjonsseter, enhancere og sekvenser som gir induserbarhet av transkripsjon innføres i ekspresjonsvektoren. Det vil også forstås at de nødvendige reguleringssekvensene kan tilføres av det native proteinet og/eller dets flankerende regioner.

De rekombinante ekspresjonsvektorene kan også inneholde et selekterbart markørgen som letter seleksjonen av vertsceller transformert eller transfektert med et rekombinant molekyl ifølge oppfinnelsen. Eksempler på selekterbare markørgener er gener som koder for et protein slik som G418 og hygromycin som gir resistens mot visse medikamenter, J3-galaktosidase, kloramfenikol acetyltransferase eller luciferase fra ildflue. Transkripsjon av det selekterbarte markørgenet blir overvåket ved endringer i konsentrasjonen av det selekterbare markørproteinet slik som J3-galaktosidase, kloramfenikol acetyltransferase eller luciferase fra ildflue. Hvis det selekterbare markørgenet koder for et protein som gir antibiotikaresistens slik som neomycinresistens kan transformerte celler selekteres med G418. Celler som har inkorporert det selekterbare markørgenet vil overleve, mens de andre cellene dør. Dette gjør det mulig å visualisere og analysere for ekspresjon av rekombinante ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen og spesielt å bestemme effekten av en mutasjon på ekspresjon og fenotype. Det vil forstås at selekterbare markører kan innføres på en separat vektor fra nukleinsyren av interesse.

De rekombinante ekspresjonsvektorene kan også inneholde gener som koder for en fusjonsgruppe som tilveiebringer økt ekspresjon av det rekombinante proteinet; økt oppløselighet av det rekombinante proteinet; og bidrar til rensing av et rekombinant mål-protein ved å tjene som en ligand ved affinitetsrensning. For eksempel kan et proteolytisk spaltningssete tilføyes til det rekombinante mål-proteinet for å muliggjøre separering av det rekombinante proteinet fra fusjonsgruppen etter rensning av fusjonsproteinet.

Rekombinante ekspresjonsvektorer kan innføres i vertsceller for å fremstille en transformert vertscelle. Betegnelsen "transformert vertscelle" skal omfatte prokaryote og eukaryote celler som har blitt transformert eller transfektert med en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. Betegnelsene "transformert med", "transfektert med", "transformasjon" og "transfeksjon" skal omfatte innføring av nukleinsyre (f.eks. en vektor) inn i en celle ved én av mange mulige teknikker kjent på området. Prokaryote celler kan transformeres med nukleinsyre ved, for eksempel elektroporering eller kalsiumkloridmediert transformasjon. Nukleinsyre kan innføres i pattedyrceller via konvensjonelle teknikker slik som kalsiumfosfat eller kalsiumklorid kopresipitering, DEAE-dekstranmediert transfeksjon, lipofektin, elektroporering eller mikroinjeksjon. Egnede metoder for å transformere og transfektere vertsceller kan finnes i Sambrook et al.

(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory press

(1989)) og andre slike lærebøker for laboratorier.

Egnede vertsceller omfatter en rekke prokaryote og eukaryote vertsceller. For eksempel kan proteinene ifølge oppfinnelsen uttrykkes i bakterieceller slik som E. coli, insektceller (ved anvendelse av baculovirus), gjærceller eller pattedyrceller. Andre egnede vertsceller kan finnes i Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

Nukleinsyre er "operabelt bundet" når den er plassert i en funksjonell forbindelse med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operabelt bundet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operabelt bundet til en kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operabelt bundet til en kodende sekvens hvis det er plassert slik at det letter translasjon. Generelt betyr "operabelt bundet" at DNA-sekvensene som er bundet er tilgrensende og, i tilfellet av en sekretorisk leder, tilgrensende og i leseramme. Imidlertid trenger ikke enhancere å være tilgrensende. Bindingen oppnås ved ligering ved passende restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, blir syntetiske oligonukleotid-adaptere eller linkere anvendt i henhold til konvensjonell praksis.

Ekspresjonsvektoren kan omfatte en nukleinsyresekvens som koder for et modifisert bouganin med et redusert antall av potensielle T-celle epitoper, operabelt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens. I forskjellige utførelsesformer kan ekspresjonsvektoren inneholde en nukleinsyresekvens som koder for proteinene eller peptidene ifølge oppfinnelsen eller en degenerert variant derav og vil omfatte i det minste det RIP-kodende domenet av nevnte nukleinsyrer operabelt bundet med egnede ekspresjonskontroll og seleksjonssekvenser. Degenerert i relasjon til polynukleotider refererer til det velkjente faktum at i den genetiske koden er mange aminosyrer spesifisert ved mer enn ett kodon. Degenereringen av koden gjør rede for 20 forskjellige aminosyrer kodet for av 64 mulige triplettsekvenser av de fire forskjellige basene som innbefattes i DNA.

Betegnelsen "RIP-kodende domene" eller "domene som koder for ribosom inaktiverende protein" som anvendt her betyr det funksjonelle domenet som gir bouganin dets biologiske aktivitet.

Nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen kan også bli kjemisk syntetisert ved anvendelse av standardteknikker. Forskjellige metoder for kjemisk syntese av polydeoksynukleotider er kjent, omfattende fastfasesyntese som, i likhet med peptidsyntese, er fullstendig automatisert i kommersielt tilgjengelige DNA-syntesemaskiner (Se f.eks. Itakura et al. U.S. Patent nr. 4,598,049; Caruthers et al. U.S.

Patent nr. 4,458,066; og Itakura U.S. Patent nr. 4,401,796 og 4,373,071).

(B) Modifiserte bouganin- cytotoksiner:

Som nevnt tidligere er bouganin et type 1 ribosom inaktiverende protein som

depurinerer viktig ribosomalt RNA fra celler hvilket fører til opphør av proteinsyntese og celledød. Som sådan kan de modifiserte bouganinene ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille cytotoksiner. Cytotoksiner inneholdende et modifisert bouganinprotein er foretrukket fremfor cytotoksiner inneholdende et umodifisert bouganinprotein siden førstnevnte er mindre immunogent og det er mindre sannsynlig at det vil bli ødelagt av immunsystemet før det når sitt mål.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også et cytotoksin omfattende (a) en målrettende gruppe bundet til (b) et modifisert bouganinprotein ifølge oppfinnelsen.

Betegnelsen "modifisert bouganinprotein ifølge oppfinnelsen" blir anvendt for enklere henvisning og omfatter hvilke som helst og alle de modifiserte bouganinproteinene beskrevet her slik som de modifiserte bouganinproteinene beskrevet ovenfor i avsnitt (A) så vel som i figurene og eksemplene.

Betegnelsen "målrettende gruppe" som anvendt her angir en substans, metode eller teknikk for å levere det modifiserte bouganinproteinet til en målcelle. I én utførelsesform er den målrettede gruppen et antistoff. I én utførelsesform kunne den målrettede gruppen være et liposom. I én utførelsesform kan liposomet være bundet til et antistoff. I en annen utførelsesform er den målrettede gruppen et protein i stand til å styre en spesifikk bindingsinteraksjon til en bestemt målcelle. Slike proteingrupper omfatter en rekke polypeptidligander for hvilke det finnes spesifikke celleoverflatereseptorer og omfatter derfor en rekke cytokiner, peptid og polypeptidhormoner og andre modifikatorer av biologisk respons. Fremtredende eksempler omfatter slike proteiner som vaskulær epitelvekstfaktor, epidermal vekstfaktor, heregulin, interleukinene, interferoner, tumornekrosefaktor og andre protein og glykoproteinmolekyler. Fusjonsproteiner av disse og andre molekyler med bouganin ifølge foreliggende oppfinnelse kan være medregnet og kan omfatte den modifiserte bouganin-gruppen i enten N-terminal eller C-terminal orientering med hensyn til proteinligand-domenet. Den målrettede gruppen kan være forbundet direkte til proteinene ifølge oppfinnelsen eller gjennom en linker. I én utførelsesform er bindingene en peptidlinker eller en kjemisk linker. I like stor grad kan kjemisk kryssbinding av den rensede liganden til det modifiserte bouganinproteinet være omfattet og innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et cytotoksin omfattende (a) en ligand som binder til en kreftcelle bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein ifølge oppfinnelsen.

Liganden kan være hvilket som helst molekyl som kan binde til en kreftcelle omfattende, men ikke begrenset til, proteiner. I én utførelsesform er liganden et antistoff eller antistoffragment som gjenkjenner overflaten av en kreftcelle.

Følgelig kan cytotoksinene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å behandle forskjellige former for kreft slik som cancer coli, brystkreft, cancer ovarii, cancer pancreatis, hode- og halskreft, cancer vesicea, gastrointestinal kreft, cancer prostatae, småcellet lungekreft og ikke-småcellet lungekreft, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer.

I én utførelsesform omfatter liganden som binder til kreftceller et komplett immunglobulinmolekyl som binder til kreftcellen. Når liganden som binder til kreftceller er et antistoff eller fragment derav, kan cytotoksin refereres til som immuntoksin. I en annen utførelsesform er den kreftcelle-bindende liganden en dimer av Fab, Fab', scFv, enkelt-domene antistoffragmenter eller disulfid-stabilisert Fv-fragment. I en annen utførelsesform omfatter kreft antistoffet en variabel tung kjede, variabel lett kjede, Fab, Fab', scFv, enkelt-domene antistoffragment eller disulfid stabilisert Fv-fragment. Deler av den kreftcelle-bindende liganden kan være avledet fra én eller flere arter, foretrukket omfattende deler avledet fra mennesket og er mest foretrukket fullstendig human eller humanisert. Områder utformet for å lette rensning eller for konjugering til toksin kan også være omfattet i eller tilføyd til den kreftcelle-bindende delen.

I en spesiell utførelsesform gjenkjenner den kreftcelle-bindende liganden Ep-CAM. Ep-CAM (for Epitelcelleadhesjonsmolekyl, som også er kjent som 17-1 A, KS A, EGP-2 og GA733-2) er et transmembranprotein som uttrykkes i stort monn i mange faste tumorer, omfattende karsinomer i lunge, bryst, ovarie, kolorektum og platecellekarsinom fra hodet og halsen, men uttrykkes i liten grad i de fleste normale epitelvev.

Et Ep-CAM-målrettet-modifisert bouganincytotoksin kan omfatte (a) en ligand (slik som et antistoff eller antistoffragment) som binder til Ep-CAM på kreftcellen bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein som har en redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein.

Cytotoksinet kan omfatte (a) et humanisert antistoff eller antistoffragment som binder til det ekstracellulære domenet av human Ep-CAM og omfatter komplementaritetsbestemmende region (CDR)-sekvenser avledet fra et MOC-31-antistoff bundet til: (b) et modifisert bouganinprotein som har en redusert tendens til å aktivere T-celler sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein.

Egnede Ep-CAM-målrettede modifiserte bouganiner kan omfatte, VB6-845 og varianter derav, andre cytotoksiner som omfatter andre enkelt eller dobbeltkjede immunglobuliner som selektivt binder Ep-CAM eller varianter derav. Betegnelsen "VB6-845" som anvendt her betyr et cytotoksin som omfatter en Fab-versjon av et anti-Ep-CAM scFv-antistoff bundet til en modifisert form av bouganin, Bou 156 (SEKV ID NR: 13). Aminosyresekvensen og nukleotidsekvensen av VB6-845 er vist i Figur 3B (SEKV ID NR: 16 og SEKV ID NR: 15, henholdsvis).

I en annen utførelsesform gjenkjenner den kreftcelle-bindende liganden et tumor-assosiert antigen som er funnet spesifikt på neoplastiske celler og ikke på normale celler. I en foretrukket utførelsesform er liganden et antistoff som binder tumor-assosiert antigen. Anti-tumor-assosiert antigen-antistoff gjenkjenner spesifikt kreftceller fra en rekke kreftformer men gjenkjenner ikke normale, ikke-kankrøse celler.

Cytotoksinet kan omfatte (a) ligand (slik som et antistoff eller antistoffragment) som binder til tumorassosiert antigen på kreftcellen bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein som har en redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler sammenlignet med et umodifisert bouganinprotein.

Egnede tumorassosierte antigen-målrettede modifiserte bouganiner kan omfatte VB6-011 og varianter derav, andre cytotoksiner som omfatter andre enkelt eller dobbeltkjede immunglobuliner som selektivt binder tumorassosiert antigen eller varianter derav. Betegnelsen "VB6-011" som anvendt her betyr et cytotoksin som omfatter en Fab-versjon av det Hl 1 humane monoklonale antistoffet genetisk bundet til en modifisert form av bouganin, BOU 156 (SEKV ID NR. 13). Hil-antistoffet ble oppnådd ved fusjon av perifere blodlymfocytter fra en 64 år gammel mannlig kreftpasient fusjonert til human myelomcellelinje for å fremstille hybridomer. Hybridomet NBGM1/H11 produserer et IgMksom ble rekonstruert til et Fab-format for å fremstille VB6-011 (se US 6,207,153 eller WO 97/44461 for detaljer for fremstilling av det Hil antistoff-sekreterende hybridomet). Aminosyresekvensen og nukleotidsekvensen av VB6-011 er vist i Figur 15 (SEKV ID NR:28 og SEKV ID NR:27, henholdsvis).

Cytotoksinet kan omfatte VB6-845 (Figur 3B, SEKV ID NR, 16) eller VB6-011 (Figur 15, SEKV ID NR:28), eller en variant av VB6-845 eller VB6-011.

En VB6-845-variant binder til samme Ep-CAM-epitop eller til en vesentlig lik Ep-CAM-epitop som bindes av VB6-845, og varianten kan kompetitivt hemme VB6-845-binding til Ep-CAM, under fysiologiske betingelser med minst 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95%. En VB6-845-variant kan omfatte samme modifiserte bouganin som VB6-845 eller kan omfatte et annerledes modifisert bouganin ifølge oppfinnelsen. Cytotoksinet kan omfatte en Ep-CAM-bindende del omfattende den variable regionen av MOC31 eller en variant derav, eller en Ep-CAM-bindende del omfattende 4D5MOCB eller en variant derav. Binding av hvilken som helst av disse cytotoksinene til Ep-CAM kan reduseres med minst 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95% ved konkurranse med referanse MOC31 eller 4D5MOCB-antistoffet under fysiologiske betingelser.

En VB6-011 -variant binder til samme tumorassosierte antigenepitop eller til en vesentlig lik tumorassosiert antigenepitop som bindes av VB6-011 og varianten kan kompetitivt hemme VB6-011-binding til tumorassosiert antigen, under fysiologiske betingelser, med minst 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95%. En VB6-011 -variant kan omfatte samme modifiserte bouganin som VB6-011 eller kan omfatte et annerledes modifisert bouganin ifølge oppfinnelsen. Cytotoksinet kan omfatte en tumorassosiert antigenbindende del omfattende det monoklonale antistoffet Hil, Hil antigenbindende fragmenter eller varianter derav. Binding av hvilke som helst av disse cytotoksinene til VB6-011 kan reduseres med minst 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95% ved konkurranse med referanseantistoffet Hl 1 under fysiologiske betingelser.

I en foretrukket utførelsesform er bindingsaffiniteten for den Ep-CAM-bindende delen eller den tumorassosierte antigenbindende delen minst fire størrelsesordener, fortrinnsvis minst tre størrelsesordener, mer foretrukket mindre enn to størrelsesordener av bindingsaffiniteten for VB6-845 eller VB6-011 henholdsvis som målt ved standard laboratorieteknikker. Den Ep-CAM-bindende delen kan kompetitivt blokkere binding av et kjent anti-Ep-CAM-antistoff, slik som, men ikke begrenset til, PANOREX® eller MT201, til Ep-CAM, under fysiologiske betingelser, med minst 0,1%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95%. Den tumorassosierte antigenbindende delen kan kompetitivt blokkere bindingen av et kjent anti-tumorassosiert antigen antistoff, slik som, men ikke begrenset til, Hil, til tumorassosiert antigen, under fysiologiske betingelser, med minst 0,1%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% eller 95%.

Fagfolk ville forstå at spesifisitetsbetemmende rester kan identifiseres. Betegnelsen "spesifisitetsbestemmende rest," også kjent som "SDR," angir en rest som danner del av paratopen av et antistoff, spesielt CDR-rester, av hvilken en enkelt substitusjon ved alanin, uavhengig av hvilke som helst andre mutasjoner, reduserer affiniteten til antistoffet for epitopen med minst 10 ganger, fortrinnsvis med minst 100 ganger, mer foretrukket med minst 1000 ganger. Dette tapet i affinitet understreker denne restens betydning for evnen av antistoffet til å binde epitopen. Se, feks. Tamura et al., 2000, "Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only", J. Immunol. 164(3):1432-1441.

Effekten av enkelt eller multiple mutasjoner på bindingsaktivitet, spesielt på bindingsaffinitet, kan evalueres samtidig for å bedømme betydningen av en bestemt rekke av aminosyrer på bindingsinteraksjonen (feks. bidraget av den lette eller tunge kjede CDR2 til binding). Effekter av en aminosyremutasjon kan også evalueres sekvensielt for å bedømme bidraget av en enkelt aminosyre når bedømt individuelt. Slike evalueringer kan utføres, for eksempel ved in vitro saturasjon scanning (se feks. U.S. Patent nr. 6,180,341; Hilton et al, 1996, "Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoetin receptor," J Biol Chem. 271:4699-4708) og seterettet mutagenese (se feks. Cunningham og Wells, 1989, "High-resolution epitop mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis", Science 244:1081-1085; Bass et al., 1991, "A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor", Proe Nati Acad Sei. USA 88:4498-4502). I alanin-scanning mutagenese-teknikken, blir enkelt alanin-mutasjoner innført ved multiple rester i molekylet og de resulterende mutante molekylene blir testet for biologisk aktivitet for å identifisere aminosyrerester som er kritiske for aktiviteten av molekylet.

Seter for ligand-reseptor eller annen biologisk interaksjon kan også identifiseres ved fysisk analyse av struktur som bestemt ved, for eksempel kjernemagnetisk resonans, krystallografi, elektrondiffraksjon eller fotoaffinitetsmerking, sammen med mutasjon av antatte aminosyrer i kontakt-setet (se feks. de Vos et al., 1992, "Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex", Science 255:306-312; Smith et al., 1992, "Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein," J Mol Biol. 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, "Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25 A resolution", FEBS Lett. 309:59-64). I tillegg kan betydningen av bestemte individuelle aminosyrer eller rekker av aminosyrer, evalueres ved sammenligning med aminosyresekvensen av relaterte polypeptider eller analoge bindingsseter.

Videre ville fagfolk forstå at økt aviditet kan kompensere for lavere bindingsaffinitet. Aviditeten av et cytotoksin for kreftcellereseptor er et mål for styrken av den Ep-CAM-bindende delen's binding av Ep-CAM, som har multiple bindingsseter. Den funksjonelle bindingsstyrken mellom Ep-CAM og den Ep-CAM-bindende delen representerer summen av styrken av alle affinitetsbindingene og følgelig kan en individuell komponent binde med relativt lav affinitet, men en multimer av slike komponenter kan oppvise kraftig biologisk effekt. Faktisk kan de multiple interaksjonene mellom Ep-CAM-bindingsseter og Ep-CAM-epitoper forevise mye mer enn additiv biologisk effekt, dvs. fordelen av multivalens kan være mange størrelsesordener med hensyn til likevektskonstanten.

Tilsvarende er aviditeten av et cytotoksin for en kreftcellereseptor et mål for styrken av den tumorassosierte antigenbindende delens binding av tumorassosiert antigen, som kan ha multiple bindingsseter. Den funksjonelle bindingsstyrken mellom tumorassosiert antigen og den tumorassosierte antigenbindende delen representerer summen av styrken av alle affinitetsbindingene og følgelig kan en individuell komponent binde med relativt lav affinitet, men en multimer av slike komponenter kan oppvise kraftig biologisk effekt. Faktisk kan de multiple interaksjonene mellom tumorassosierte antigenbindende seter og tumorassosiert antigen-epitoper forevise mye mer enn additiv biologisk effekt, dvs. fordelen av multivalens kan være mange størrelsesordener med hensyn til likevektskonstanten.

Den Ep-CAM-bindende delen kan ha en struktur hovedsakelig lik den for 4D5MOCB. Den hovedsakelig like strukturen kan karakteriseres ved referanse til epitop-kart som avspeiler bindingspunktene for cytotoksinets Ep-CAM-bindende del til et Ep-CAM-molekyl. Epitop-kartet kan dannes for den tumorassosierte antigenbindende delen og en hovedsakelig lik struktur kan karakteriseres ved referanse til epitop-kart som avspeiler bindingspunktene for cytotoksinets tumorassosierte antigenbindende del til et tumorassosiert antigenmolekyl.

Cytotoksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved kjemisk syntese ved anvendelse av teknikker velkjente innenfor proteinkjemi slik som fastfase syntese (Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964)) eller syntese i homogen løsning (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I og II, Thieme, Stuttgart (1987)). I én utførelsesform er den kreftbindende liganden og modifisert bouganin begge proteiner og kan konjugeres ved anvendelse av teknikker velkjent på området. Det er mange hundre kryssbindere tilgjengelig som kan konjugere to proteiner.

(Se for eksempel "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking". 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Kryssbinderen blir generelt valgt basert på de reaktive funksjonelle gruppene tilgjengelig eller insertert i liganden eller toksinet. I tillegg kan en fotoaktiverbar kryssbinder anvendes dersom det ikke finnes noen reaktive grupper. I visse tilfeller kan det være ønskelig å inkludere en spacer mellom liganden og toksinet. Tverrbindingsmidler kjent på området omfatter de homobifunksjonelle midlene: glutaraldehyd, dimetyladipimidat og Bis(diazobenzidin) og de heterobifunksjonelle midlene: m Maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid og Sulfo-/w Maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid.

Et ligand-bouganin toksin-fusjonsprotein kan også fremstilles ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker. I et slikt tilfelle blir en DNA-sekvens som koder for den kreftbindende liganden fusjonert til en DNA-sekvens som koder for det modifiserte bouganinproteinet, hvilket resulterer i et kimært DNA-molekyl. Den kimære DNA-sekvensen blir transfektert inn i en vertscelle som uttrykker ligand-bouganin-fusjonsproteinet. Fusjonsproteinet kan utvinnes fra cellekulturen og renses ved anvendelse av teknikker kjent på området.

Antistoffer som har spesifisitet for celleoverflateproteiner slik som Ep-CAM og tumorassosiert antigen kan fremstilles ved konvensjonelle metoder. Et pattedyr, (for eksempel en mus, hamster eller kanin) kan immuniseres med en immunogen form av peptidet som fremkaller en antistoffrespons i pattedyret. Teknikker for å meddele immunogenisitet til et peptid omfatter konjugering til bærere eller andre teknikker velkjent på området. For eksempel kan peptidet administreres i nærvær av adjuvans. Utviklingen av immunisering kan overvåkes ved deteksjon av antistofftitere i plasma eller serum. Standard ELISA eller andre immunanalysemetoder kan anvendes med immunogenet som antigen for å bedømme nivåene av antistoffer. Etter immunisering kan antisera oppnås og, om ønsket, polyklonale antistoffer isoleres fra sera.

For å fremstille monoklonale antistoffer, kan antistoffproduserende celler (lymfocytter) høstes fra et immunisert dyr og fusjoneres med myelomceller ved standard metoder for fusjon av somatiske celler, hvilket følgelig immortaliserer disse cellene og gir hybridomceller. Slike teknikker er velkjent på området, (feks. hybridomteknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein { Nature 256:495-497 (1975)) så vel som andre teknikker slik som human B-celle hybridomteknikk (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72

(1983)), EBV-hybridomteknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., sidene 77-96

(1985)) og screening av kombinatoriske antistoffbiblioteker (Huse et al., Science 246:1275

(1989)). Hybridomceller kan screenes immunokjemisk for produksjon av antistoffer spesifikt reaktive med peptidet og de monoklonale antistoffene kan isoleres.

Betegnelsen "antistoff som anvendt her skal omfatte monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer, antistoffragmenter (feks. Fab og F(ab')2og enkeltkjede-antistoffer (scFv)) og kimære antistoffer som også spesifikt reagerer med en celleoverflatekomponent. Antistoffer kan fragmenteres ved anvendelse av konvensjonelle teknikker og fragmentene screenes for nytte på samme måte som beskrevet ovenfor. For eksempel kan F(ab')2-fragmenter dannes ved behandling av antistoff med pepsin. Det resulterende F(ab')2-fragmentet kan behandles for å redusere disulfidbroer for å fremstille Fab'-fragmenter. Enkeltkjede-antistoffer kombinerer de antigen-bindende regionene av et antistoff i en enkelt stabilt foldet polypeptidkjede. Enkeltkjede antistoffer kan dannes ved rekombinant teknologi.

Kimære antistoff-derivater, dvs. antistoffmolekyler som kombinerer en variabel region fra et ikke-humant dyr og en human konstant region er også omfattet innenfor omfanget av oppfinnelsen. Kimære antistoffmolekyler kan for eksempel omfatte det antigenbindende domenet av et antistoff fra en mus, rotte eller andre arter, med humane konstante regioner. Konvensjonelle metoder kan anvendes for å fremstille kimære antistoffer inneholdende den immunglobulin variable regionen som gjenkjenner et celleoverflateantigen (se for eksempel Morrison et al., Proe. Nati Acad. Sei. U. S. A. 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., U.S. Patent nr. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent nr. 4,816,397; Tanaguchi et al., E.P. Patent nr. 171,496; Europeisk patent nr. 173,494, United Kingdom patent nr. GB 2177096B). Det er forventet at kimære antistoffer ville være mindre immunogene i et humant subjekt enn det tilsvarende ikke-kimære antistoffet. Kimære antistoffer kan stabiliseres ved metoden beskrevet i Pluckthun et al., WO 00/61635.

Monoklonale eller kimære antistoffer spesifikt reaktive mot celleoverflatekomponenter kan ytterligere humaniseres ved fremstilling av human konstant region kimærer, hvor deler av de variable regionene, spesielt de konserverte struktur ("framework")-regionene av det antigenbindende domenet, er av human opprinnelse og bare de hypervariable regionene er av ikke-human opprinnelse. Slike immunglobulinmolekyler kan fremstilles ved teknikker kjent på området, (f.eks. Teng et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982) og PCT-publikasjon WO92/06193 eller EP 239,400). Humaniserte antistoffer kan også fremstilles kommersielt (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Storbritannia.) I tillegg kan monoklonale eller kimære antistoffer spesifikt reaktive mot celleoverflatekomponenter gjøres mindre immunogene ved å redusere deres antall av potensielle T-celle epitoper.

Spesifikke antistoffer eller antistoffragmenter reaktive mot celleoverflatekomponenter kan også fremstilles ved screening av ekspresjonsbiblioteker som koder for immunglobulingener eller deler derav, uttrykt i bakterier med celleoverflatekomponenter. For eksempel kan komplette Fab-fragmenter, VH-regioner og Fv-regioner uttrykkes i bakterier ved anvendelse av fag-ekspresjonsbiblioteker (Se for eksempel Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); og McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)). Alternativt kan en SCID-hu mus, for eksempel modellen utviklet av Genpharm, anvendes for å fremstille antistoffer eller fragmenter derav.

I alle tilfeller hvor et modifisert bouganinprotein blir fremstilt i fusjon med en antistoffsekvens er det mest ønsket å anvende antistoffsekvenser i hvilke T-celle-epitoper eller sekvenser i stand til å binde MHC klasse II-molekyler eller stimulere T-celler eller binder til T-celler i forbindelse med MHC klasse II-molekyler har blitt fjernet.

Det modifiserte bouganinproteinet kan være bundet til et ikke-antistoff-protein likevel et protein i stand til å dirigere en spesifikk bindingsinteraksjon til en bestemt målcelle. Slike proteingrupper omfatter en rekke polypeptidligander for hvilke det finnes spesifikke celleoverflatereseptorer og omfatter derfor en rekke cytokiner, peptid og polypeptidhormoner og andre modifikatorer av biologisk respons. Fremtredende eksempler omfatter slike proteiner som vaskulær epitelvekstfaktor, epidermal vekstfaktor, heregulin, interleukinene, interferoner, tumornekrosefaktor og andre protein og glykoproteinmolekyler. Fusjonsproteiner av disse og andre molekyler med bouganin ifølge foreliggende oppfinnelse kan være omfattet og kan omfatte den modifiserte bouganingruppen i enten N-terminal eller C-terminal orientering med hensyn til proteinligand-domenet. På samme måte kan kjemisk kryssbinding av den rensede liganden til det modifiserte bouganinproteinet være omfattet og innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Det modifiserte bouganinproteinet kan anvendes som et kompleks inneholdende en vannoppløselig polymer slik som hydroksypropylmetakrylamid eller andre polymerer hvor det modifiserte bouganinproteinet er i kovalent forbindelse med polymeren eller i en ikke-kovalent bindingsinteraksjon med polymeren. En slik utførelsesform kan i tillegg omfatte et antigenbindende domene slik som et antistoff eller et fragment av et antistoff i kombinasjon med polymer bouganin-komplekset.

(C) Anvendelser av cytotoksinene

De modifiserte bouganinproteinene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å spesifikt

hemme eller nedbryte pattedyrceller angrepet kreft. Det er en fordel for cytotoksinene ifølge oppfinnelsen at de har mindre immunogenisitet, tillater RIP å rykke inn i cellen og effektivt drepe kreftcellen. Følgelig kan cytotoksinet anvendes til å spesifikt målrette kreftceller. Bouganinet, når det først er i kreftcellen, depurinerer viktig ribosomalt RNA, hvilket derved derved skader ribosomene og fører til et opphør av proteinsyntese og celledød.

Det er følgelig mulig å hemme eller nedbryte en kreftcelle omfattende å administrere et cytotoksin ifølge oppfinnelsen til et dyr med behov for dette. Typen av kreftceller som hemmes eller nedbrytes av et cytotoksin vil bestemmes av antigenspesifisiteten av dets antistoff-andel.

Kreften kan være av en type som angitt i krav 20.

Evnen av cytotoksinene ifølge oppfinnelsen til å selektivt hemme eller nedbryte kreftceller fra dyr kan lett testes in vitro ved anvendelse av kreftcellelinjer fra dyr. Den selektivt hemmende effekten av cytotoksinene ifølge oppfinnelsen kan bestemmes, for eksempel ved å påvise den selektive hemningen av cellulær proliferasjon i kreftceller.

Toksisitet kan måles basert på celleviabilitet, for eksempel kan viabiliteten av normale og kankrøse cellekulturer eksponert for cytotoksinene sammenlignes. Celleviabilitet kan bedømmes ved kjente teknikker, slik som trypanblå eksklusjonsanalyse.

I et annet eksempel kan flere modeller anvendes for å teste cytotoksisiteten av cytotoksiner. Thompson, E.W. et al. ( Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994)) har beskrevet en modell for bestemmelsen av invasiviteten av humane brystkreftceller in vitro ved å måle tumorcellemediert proteolyse av ekstracellulær matriks og tumorcelleinvasjon av rekonstituert basalmembran (kollagen, laminin, fibronektin, Matrigel eller gelatin). Andre anvendbare kreftcellemodeller omfatter celler fra dyrket ovarialt adenokarsinom (Young, T.N. et al. Gynecol. Oncol. 62:89-99 (1996); Moore, D.H. et al. Gynecol. Oncol. 65:78-82 (1997)), human follikulær tyreoideakreft-celler (Demeure, MJ. et al., World J. Surg. 16:770-776 (1992)), human melanom (A-2058) og fibrosarkom (HT-1080) cellelinjer (Mackay, A.R. et al. Lab. Invest. 70:781-783 (1994)) og lunge plateepitel cellelinjer (HS-24) og adenokarsinom (SB-3)-cellelinjer (Spiess, E. et al. J. Histochem. Cytochem. 42:917-929 (1994)). Et in vzvo-testsystem som involverer implantasjon av tumorer og måling av tumorvekst og metastase i atymiske nakne mus er også beskrevet (Thompson, E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994); Shi, YE. et al., Cancer Res. 53:1409-1415 (1993)).

Betegnelsen "dyr" omfatter alle medlemmer av dyreriket, omfattende mennesker.

Betegnelsen "behandling av kreft" eller "behandle kreft" angir hemning av kreftcellereplikasjon, hemning av kreftspredning (metastase), hemning av tumorvekst, reduksjon av celletallet av kreftceller eller tumorvekst, reduksjon av graden av ondartethet av eller forbedring av kreftrelaterte symptomer.

I en foretrukket utførelsesform er dyret et menneske. I en annen utførelsesform er kreften valgt fra gruppen bestående av cancer coli, brystkreft, cancer ovarii, cancer pancreatis, hode- og halskreft, cancer vesicea, leverkreft, nyrekreft, melanomer, gastrointestinal kreft, cancer prostatae, småcellet lungekreft og ikke-småcellet lungekreft, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer.

Kliniske resultater av kreftbehandlinger ved anvendelse av et cytotoksin ifølge oppfinnelsen er lett merkbar av fagfolk på området, slik som en lege. For eksempel kan standard medisinske tester for å måle kliniske markører for kreft være sterke indikatorer for behandlingens effektivitet. Slike tester kan omfatte, uten begrensning, fysisk undersøkelse, ytelsesskalaer, sykdomsmarkører, 12-lead ECG, tumormålinger, vevsbiopsi, cytoskopi, cytologi, lengste diameter av tumorberegninger, radiografi, digital avbildning av tumoren, vitale tegn, vekt, registrering av ugunstige hendelser, bedømmelse av infeksiøse episoder, bedømmelse av ledsagende medisineringer, smertebedømmelse, blod eller serumkjemi, urinalyse, CT-scan og farmakokinetisk analyse. Videre kan synergistiske effekter av en kombinasjonsterapi omfattende cytotoksinet og et annen kreft terapeutikum bestemmes ved komparative studier med pasienter som gjennomgår monoterapi.

Remisjon av maligne tumorer kan evalueres ved anvendelse av kriterier anerkjent av fagfolk. Se, f.eks. Therasse et al., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National cancer institute of USA, National cancer institute of Canada," J Nati Cancer Inst. Feb2;92(3):205-16.

Den effektive dosen av en bestemt cytotoksinkonstruksjon kan avhenge av forskjellige faktorer, omfattende typen av kreft, størrelsen av tumoren, stadiet av kreften, cytotoksinets toksisitet overfor pasienten, spesifisiteten av målretting til kreftceller, så vel som alder, vekt og helse for pasienten.

Cytotoksiner omfattende det modifiserte bouganinet kan administreres ved i.v. infusjon over en periode på minutter til timer, avhengig av dosen og konsentrasjonen av cytotoksinet i infusatet.

I én utførelsesform blir cytotoksinet infusert over en periode på 3 timer.

I én utførelsesform kan den effektive dosen ved i.v. administrering av cytotoksin være i området fra ca. 1 til 100 mg/kg/dose. I andre utførelsesform er kan dosen kan være i området fra omtrent 2 til 50 mg/kg/dose. I spesifikke utførelsesformer kan dosen være minst omtrent 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 mg/kg/dose.

I én utførelsesform blir enkeltdosen administrert omtrent hver uke i omtrent 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 uker. Enkeltdosen kan administreres i påfølgende uker eller, alternativt, kan en hoppe over én eller flere uker. Etter denne syklusen kan en påfølgende syklus starte omtrent 1, 2, 4, 6 eller 12 uker senere. Behandlingsregimet kan omfatte 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller flere sykluser, hvor hver syklus er atskilt med omtrent 1, 2, 4, 6 eller 12 uker.

I en annen utførelsesform blir enkeltdosen administrert hver måned i omtrent 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 påfølgende måneder. Etter denne syklusen kan en påfølgende syklus starte omtrent 1, 2, 4, 6 eller 12 måneder senere. Behandlingsregimet kan omfatte 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller flere sykluser, hvor hver syklus er atskilt med omtrent 1, 2, 4, 6 eller 12 måneder.

I en bestemt ikke-begrensende utførelsesform er den effektive dosen av cytotoksinet mellom ca. 1 og 50 mg/kg/tumor/dag, hvor pasienten blir administrert en enkelt dose pr. dag. Enkeltdosen blir administrert omtrent hver dag (en kan eventuelt hoppe over én eller flere dager) i omtrent 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7 påfølgende dager. Etter denne syklusen kan en påfølgende syklus starte omtrent 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 uker senere. Behandlingsregimet kan omfatte 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller flere sykluser, hvor hver syklus er atskilt med omtrent 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 uker.

Injeksjons volumet er foretrukket minst en effektiv mengde, som er passende til typen og/eller lokaliseringen av tumoren. Maksimalt injeksjonsvolum i en enkelt dose kan være mellom ca. 25% og 75% av tumorvolumet, for eksempel omtrent en fjerdedel, en tredjedel eller trekvart av det beregnede måltumor-volumet. I en spesifikk, ikke-begrensende utførelsesform er maksimalt injeksjonsvolum i en enkelt dose omtrent 30% av tumorvolumet.

I en annen utførelsesform blir cytotoksinet infusert i 3 timer ved en hastighet på 100 kubikkcentimeter pr. time med en løsning inneholdende fra 1 til 10 mg cytotoksin/ml Cytotoksinet vil bli fortynnet i en egnet fysiologisk kompatibel løsning.

Den effektive dosen av et annet kreft terapeutikum som skal administreres sammen med et cytotoksin i en syklus varierer også i henhold til administreringsmetoden. Det ene eller de flere terapeutiske midlene mot kreft kan leveres intratumoralt eller ved andre administreringsmetoder. Kjemoterapeutiske midler blir typisk administrert systemisk. Standarddose og behandlingsregimer er kjent på området (se feks. de siste utgavene av Merck Index og Physician's Desk Reference; NCCN Practice Guidelines in Oncology)).

Kombinasjonsterapi med et cytotoksin kan sensibilisere kreften eller tumoren for administrering av et ytterligere kreft terapeutikum Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse kombinasjonsterapi er for forebygging, behandling av og/eller forhindring av tilbakefall av kreft omfattende å administrere en effektiv mengde av et cytotoksin før, etter eller samtidig med en redusert dose av et terapeutisk middel mot kreft. For eksempel kan innledende behandling med et cytotoksin øke sensitiviteten av kreft eller tumor for påfølgende provokasjon med en dose av terapeutisk middel mot kreft. Denne dosen er nær eller under, det laveste område for standarddoser når det terapeutiske midlet mot kreft administreres alene eller i fravær av et cytotoksin. Ved samtidig administrering kan cytotoksinet administreres atskilt fra det terapeutiske midlet mot kreft og eventuelt, via en ulik administreringsmetode.

I en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert i kombinasjon med minst ett annet immunterapeutisk middel.

I en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert i kombinasjon med et regime for strålingsterapi. Terapien kan også omfatte kirurgi og/eller kjemoterapi. Cytotoksinet kan for eksempel administreres i kombinasjon med strålingsterapi og cisplatin (Platinol), fluoruracil (5-FU, Adrucil), karboplatin (Paraplatin) og/eller paklitaxel (Taxol). Behandling med cytotoksinet kan tillate anvendelse av lavere doser av stråling og/eller mindre hyppige strålebehandlinger, som for eksempel kan redusere forekomsten av alvorlig vond hals som hindrer svelgefunksjonen hvilket potensielt fører til uønsket vekttap eller dehydrering.

I en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert i kombinasjon med ett eller flere cytokiner som omfatter, uten begrensning, et lymfokin, tumornekrosefaktorer, tumornekrosefaktorlignende cytokin, lymfotoksin, interferon, makrofag inflammatorisk protein, granulocytt monocytt kolonistimulerende faktor, interleukin (omfattende, uten begrensning, interleukin-1, interleukin-2, interleukin-6, interleukin-12, interleukin-15, interleukin-18) og en variant derav, omfattende et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I enda en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert i kombinasjon med kreftvaksine omfattende, uten begrensning, autologe celler eller vev, ikke-autologe celler eller vev, carcinoembryonisk antigen, alfa-fetoprotein, humant chorionisk gonadotropin, levende BCG-vaksine, melanocyttlinje-proteiner og muterte, tumor-spesifikk antigener.

I enda en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert sammen med hormonterapi. Hormonterapeutiske midler omfatter, uten begrensning, en hormonell agonist, hormonell antagonist (feks. flutamid, tamoxifen, leuprolid-acetat (LUPRON)) og steroid (feks. dexametason, retinoid, betametason, kortisol, kortison, prednison, dehydrotestosteron, glukokortikoid, mineralokortikoid, østrogen, testosteron, progestin).

I enda en annen utførelsesform blir et cytotoksin administrert sammen med et genterapiprogram for å behandle eller forebygge kreft.

I enda en annen utførelsesform blir et Ep-CAM-målrettet cytotoksin administrert i kombinasjon med ett eller flere midler som øker ekspresjon av Ep-CAM i tumorcellene av interesse. Ep-CAM-ekspresjon blir foretrukket økt slik at et større antall Ep-CAM-molekyler uttrykkes på overflaten av tumorcellen. For eksempel kan midlet hemme de normale syklusene av Ep-CAM antigen-endocytose. Slik kombinasjonsbehandling kan forbedre den kliniske effektiviteten av Ep-CAM-målrettet cytotoksin alene eller sammen med andre terapeutiske midler mot kreft eller strålingsterapi. I spesifikke, ikke- begrensende utførelsesformer, er midlet som øker Ep-CAM-ekspresjon i tumorcellene vinorelbin-tartrat (Navelbin) og/eller paklitax (Taxol). Se feks. Thurmond et al., 2003, "Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism". Cancer Immunol Immunother. Jul; 52(7):429-37.

Kombinasjonsterapi kan således øke sensitiviteten av kreften eller tumoren for det administrerte cytotoksinet og/eller ytterligere terapeutiske midler mot kreft. På denne måten kan kortere behandlingssykluser være mulig for derved å begrense toksiske hendelser. Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av kreft omfattende å administrere til en pasient med behov for dette en effektiv mengde av et cytotoksin og minst ett annet terapeutisk middel mot kreft i en kort behandlingssyklus. Syklusens varighet kan variere i henhold til det bestemte terapeutiske midlet mot kreft som anvendes. Oppfinnelsen omfatter også kontinuerlig eller diskontinuerlig administrering eller daglige doser delt opp i mange partielle administreringer. En passende varighet av syklusen for et bestemt terapeutisk middel mot kreft vil være kjent for fagfolk og oppfinnelsen omfatter fortsatt bedømmelse av optimale behandlingsplaner for hvert terapeutisk middel mot kreft. Spesifikke retningslinjer for fagfolk er kjent på området. Se, feks. Therasse et al., 2000, "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National cancer institute of USA, National cancer institute of Canada," J Nati Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16.

Alternativt kan lengre behandlingssykluser være ønsket. Følgelig kan syklusens varighet være i området fra omtrent 10 til 56, 12 til 48, 14 til 28, 16 til 24 eller 18 til 20 dager. Syklusens varighet kan variere i henhold til det spesifikke terapeutiske midlet mot kreft som anvendes.

Et passende totalt antall sykluser og intervallet mellom sykluser, vil være forstått av fagfolk. Antallet sykluser kan være 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 eller 21 sykluser. Intervallet mellom sykluser kan være 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 eller 21 dager. I en annen utførelsesform tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk middel for behandling av et pattedyr med kreft omfattende trinnene med å identifisere T-celle epitoper av bouganin som har redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler; fremstille et cytotoksin ifølge oppfinnelsen som har én eller flere av T-celle epitopene og suspendere proteinet i en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller tilsetningsmiddel.

Cytotoksinene ifølge oppfinnelsen kan formuleres til farmasøytiske blandinger for administrering til subjekter i en biologisk kompatibel form egnet for administrering in vivo. Med "biologisk kompatibel form egnet for administrering in vivo" menes en form av substansen som skal administreres hvor hvilke som helst toksiske effekter oppveies av de terapeutiske effektene. Substansene kan administreres til levende organismer omfattende mennesker og dyr. Administrering av en terapeutisk aktiv mengde av de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse er definert som en mengde effektiv, i doser og i tidsrom nødvendig for å oppnå det ønskede resultatet. For eksempel kan en terapeutisk aktiv mengde av en substans variere i henhold til faktorer slik som sykdomstilstanden, alder, kjønn og vekt av individet og evnen av antistoffet til å fremkalle en ønsket respons i individet. Doseringsregime kan reguleres for å gi den optimale terapeutiske responsen. For eksempel kan mange oppdelte doser administreres daglig eller dosen kan reduseres proporsjonalt som indikert ved kravene ifølge den terapeutiske situasjonen.

Den aktive substansen kan administreres på en hensiktsmessig måte slik som ved injeksjon (subkutan, intravenøs, intramuskulær, osv.), oral administrering, inhalering, transdermal administrering (slik som topisk krem eller salve, osv.) eller ved bruk av suppositorium. Avhengig av administreringsveien, kan den aktive substansen belegges med et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkningen av enzymer, syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen.

Blandingene beskrevet her kan fremstilles ved per se kjente metoder for fremstilling av farmasøytisk akseptable blandinger som kan administreres til subjekter, slik at en effektiv mengde av den aktive substansen blir kombinert i en blanding med en farmasøytisk akseptabel konstituent. Egnede konstituenter er beskrevet, for eksempel, i Remington's Pharmaceutical sciences (Remington's Pharmaceutical sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Med dette utgangspunktet omfatter blandingene, om ikke utelukkende, løsninger av substansene sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable konstituenter eller fortynningsmidler og inneholdt i bufrede løsninger med en egnet pH og isoosmotisk med de fysiologiske væskene.

De farmasøytiske blandingene kan anvendes ved fremgangsmåter for behandling av dyr, omfattende pattedyr, fortrinnsvis mennesker, med kreft. Det er antatt at blandingene vil være spesielt anvendelige for behandling av pasienter med cancer coli, brystkreft, cancer ovarii, cancer pancreatis, hode- og halskreft, cancer vesicea, gastrointestinal kreft, cancer prostatae, småcellet lungekreft og ikke-småcellet lungekreft, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer. T- og B-celle lymfomer. Dosen og typen av cytotoksin som skal administreres vil avhenge av en rekke faktorer som lett kan overvåkes i mennesker. Slike faktorer omfatter etiologien og alvorlighetsgraden (grad og stadium) av neoplasi.

Farmasøytiske blandinger tilpasset for direkte administrering omfatter, uten begrensning, lyofiliserte pulvere eller vandige eller ikke-vandige sterile injiserbare løsninger eller suspensjoner, som videre kan inneholde antioksidasjonsmidler, buffere, bakteriostatiske midler og oppløsninger som gjør blandingene hovedsakelig isotoniske med blodet til en tilsiktet resipient. Andre komponenter som kan være til stede i slike blandinger omfatter vann, alkoholer, polyoler, glyserin og vegetabilske oljer, for eksempel. Ekstemporerte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan fremstilles fra sterile pulvere, granuler og tabletter. Cytotoksin kan leveres, for eksempel men ikke som begrensning, som et lyofilisert pulver som rekonstitueres med sterilt vann eller saltløsning før administrering til pasienten.

Farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. Egnede farmasøytisk akseptable bærere omfatter i det vesentlige kjemisk inerte og ikke-toksisk sammensetninger som ikke forstyrrer effektiviteten av den biologiske aktiviteten til den farmasøytiske blandingen. Eksempler på egnede farmasøytiske bærere omfatter, men er ikke begrenset til, vann, saltoppløsninger, glyserol-løsninger, etanol, N-(l (2,3-dioleyloksy)propyl)N,N,N-trimetylammoniumklorid (DOTMA), diolesylfosfotidyl-etanolamin (DOPE) og liposomer. Slike blandinger skulle inneholde en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen, sammen med en egnet mengde bærer for å tilveiebringe formen for direkte administrering til pasienten.

Den farmasøytiske blandingen kan omfatte et cytotoksin og ett eller flere ytterligere terapeutiske midler mot kreft, eventuelt i en farmasøytisk akseptabel bærer.

Blandingen kan være i form av et farmasøytisk akseptabelt salt som omfatter, uten begrensning, slike som er dannet med frie aminogrupper slik som de avledet fra saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, oksalsyre, vinsyrer, osv. og de dannet med frie karboksylgrupper slik som de avledet fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jern(JJI) hydroksider, isopropylamin, trietylamin, 2-etylarnino-etanol, histidin, prokain, osv.

For så vidt som foreliggende oppfinnelse angår modifisert bouganin, skulle blandinger inneholdende slike modifiserte bouganinproteiner eller fragmenter av modifiserte bouganinproteiner og relaterte blandinger omfattes innenfor omfanget av oppfinnelsen. Et relevant eksempel i dette henseende kunne være utvikling av peptidmediert toleranse induksjons-strategier hvor ett eller flere av de beskrevne peptidene administreres til en pasient med immunterapeutisk hensikt. Følgelig, syntetiske peptidmolekyler, for eksempel én av flere omfattende hele eller del av hvilke som helst av epitopområdene RI - R3 som definert ovenfor. Slike peptider betraktes som utforminger ifølge oppfinnelsen.

(D) T- celle epitop- peptider

En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen angåer et T-celle epitop-peptid. I

et eksempel kan T-celle epitop-peptidet fremkalle en stimuleringsindeks høyere enn 1,8 i en T-celle-analyse, mer foretrukket høyere enn 2,0. T-celle epitop-peptidet ifølge oppfinnelsen kan binde MHC klasse II.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter T-celle epitop-peptidet minst 9 etterfølgende aminosyrerester fra hvilke som helst av sekvensene av RI, R2 eller R3 (ovenfor). I en annen utførelsesform har T-celle epitop-peptidsekvensen mer enn 90% aminosyreidentitet med hvilke som helst av peptidsekvensene RI, R2 eller R3; mer foretrukket har T-celle epitop-peptidet mer enn 80% aminosyreidentitet med hvilke som helst av peptidsekvensene RI, R2 eller R3.

Betegnelsen "peptid" som anvendt her er en forbindelse som omfatter to eller flere aminosyrer. Aminosyrene er bundet sammen ved en peptidbinding (definert her nedenfor). Det er 20 forskjellige naturlig forekommende aminosyrer involvert i biologisk fremstilling av peptider og hvilket som helst antall av dem kan være bundet i hvilken som helst rekkefølge for å danne en peptidkjede eller ring. De naturlig forekommende aminosyrene anvendt ved biologisk fremstilling av peptider har alle L-konfigurasjonen. Syntetiske peptider kan fremstilles ved anvendelse av konvensjonelle syntesemetoder, ved anvendelse av L-aminosyrer, D-aminosyrer eller forskjellige kombinasjoner av aminosyrer av de to forskjellige konfigurasjonene. Noen peptider inneholder bare noen få aminosyreenheter. Korte peptider, feks. med færre enn ti aminosyreenheter, blir noen ganger referert til som "oligopeptider". Andre peptider inneholder et stort antall aminosyrerester, feks. opptil 100 eller mer og blir referert til som "polypeptider". Ifølge konvensjon kan et "polypeptid" betraktes som hvilken som helst peptidkjede inneholdende tre eller flere aminosyrer, mens et "oligopeptid" vanligvis betraktes som en bestemt type av "kort" polypeptid. Følgelig vil det, som anvendt her, forstås at enhver referanse til et "polypeptid" også omfatter et oligopeptid. Videre vil enhver referanse til et "peptid" omfatte polypeptider, oligopeptider og proteiner. Hvert ulikt arrangement av aminosyrer danner forskjellige polypeptider eller proteiner. Antall polypeptider -og følgelig antall forskjellige proteiner- som kan dannes er praktisk talt ubegrenset.

T-celle epitop-peptidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å fremstille de modifiserte bouganinproteinene ifølge oppfinnelsen og modifiserte T-celle epitop-peptider.

En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår et modifisert T-celle epitop-peptid som er modifisert slik at det modifiserte T-celle epitop-peptidet har redusert tendens til å aktivere humane T-celler sammenlignet med det ikke-modifiserte T-celle epitop-peptidet. I et eksempel inneholder de modifiserte T-celle epitop-peptidene ifølge oppfinnelsen modifikasjoner slik at de når de testes i en T-celle-analyse fremkaller en redusert stimuleringsindeks sammenlignet med det umodifiserte T-celle epitop-peptidet.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen har det modifiserte T-celle epitop-peptidet den følgende sekvensen:

hvor minst én av X<1>, X<2>, X<3>og X<4>er modifisert fra den umodifiserte sekvensen, som følger: X<1>er T eller A eller Q;

X<2>er G eller A;

X<3>er Q eller G; og

X4 er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S

(SEKV ID NR: 8).

I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen har det modifiserte T-celle epitop-peptidet den følgende sekvensen:

hvor X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S

(SEKV ID NR: 9).

I en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen har det modifiserte T-celle epitop-peptidet den følgende sekvensen:

hvor X<5>er Q eller A (SEKV ID NR: 10).

Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som koder for T-celle epitop-peptidene eller modifiserte T-celle epitop-peptider ifølge oppfinnelsen.

De følgende figurene, sekvenslistene og eksemplene er gitt for å bidra til forståelsen av foreliggende oppfinnelse.

De følgende eksemplene er illustrative for foreliggende oppfinnelse:

EKSEMPLER

Eksempel 1: Fremgangsmåter for kartlegging av epitoper i bouganin ved anvendelse av naive human T-celleproliferasjonsanalyse

Peptider som omfatter sekvensen av det modne bouganinproteinet, som beskrevet av Den Hartog et al [ ibid] ble syntetisert. Lengden av hvert peptid er 15 aminosyrer og suksessive peptider overlapper med 12 rester. Sekvensen av disse peptidene og deres nummerering er angitt i TABELL 1.

Peptidene ble anvendt i T-celleproliferasjonsanalyser med PBMCs (perifere blod mononukleære celler) fra naive donorer (dvs. ingen kjent sensibilisering til bouganin). 20 donor PBMC-prøver ble valgt for å oppnå en optimal dekning av MHC klasse Il-allotyper. Den allotypiske dekningen er mer enn 85%. HLA-DR-allotypene er vist i TABELL 2.

PBMC'er ble stimulert med individuelle peptider in triplo kulturer i 7 dager før proliferasjon ble bedømt ved<3>H-tymidin (<3>H-Thy)-inkorporering. Alle peptidene ble testet ved to forskjellige konsentrasjoner ( l\ iM og 5\ iM). Stimuleringsindekser (S.I.) ble beregnet som mengden av<3>H inkorporert, dividert med mengden av<3>H inkorporert i simulert-stimulerte kontrollceller.

Buffy coats fra humant blod lagret i mindre enn 12 timer ble oppnådd fra National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK). Ficoll-paque ble oppnådd fra Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, UK). Serumfri ATM V-media for dyrking av primære humane lymfocytter og inneholdende L-glutamin, 50 ug/ml streptomycin, 10Hg/ml gentomycin og 0,1% humant serumalbumin var fra Gibco-BRL (Paisley, UK). Syntetiske peptider ble oppnådd fra Eurosequence (Groningen, Nederland) og Babraham Technix (Cambridge, UK).

Erytrocytter og leukocytter ble separert fra plasma og blodplater ved forsiktig sentrifugering av buffy coats. Den øverste fasen (inneholdende plasma og blodplater) ble fjernet og kastet. Erytrocytter og leukocytter ble fortynnet 1:1 i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) før de ble lagt på 15 ml ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham UK). Sentrifugering ble utført i henhold til produsentens anbefalte betingelser og PBMCer ble høstet fra serum+PBS/ficoll paque-interfasen. PBMCer ble blandet med PBS (1:1) og oppsamlet ved sentrifugering. Supernatanten ble fjernet og kastet og PBMC-pelleten resuspendert i 50 ml PBS. Celler ble igjen pelletert ved sentrifugering og PBS- supernatanten kastet. Celler ble resuspendert ved anvendelse av 50 ml ATM V media og på dette tidspunkt tellet og viabilitet ble bedømt ved anvendelse av trypanblå fargeeksklusjon. Celler ble igjen oppsamlet ved sentrifugering og supernatanten kastet. Celler ble resuspendert for kryogen lagring med en tetthet på 3x10<7>pr. ml. Lagringsmediet var 90%

(volum/volum) varmeinaktivert AB humant serum (Sigma, Poole, UK) og 10%

(volum/volum) DMSO (Sigma, Poole, UK). Celler ble overført til en regulert frysebeholder (Sigma) og plassert ved -70°C natten over. Når nødvendig for anvendelse, ble celler tint raskt i et vannbad ved 37°C før overføring til 10 ml forhåndsoppvarmet ATM V-medium.

PBMC ble stimulert med protein og peptidantigener i en 96-brønners flatbunnet plate med en tetthet på 2x10<5>PBMC pr. brønn. PBMC ble inkubert i 7 dager ved 37°C før pulsing med<3>H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK). To kontrollpeptider betegnet C-32 og C-49 som tidligere har blitt vist å være immunogene og et potent helprotein ikke-recall antigen Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ble anvendt i hver donoranalyse. C-32 = sekvens PKYVKQNTLKLAT fra Flu haemagglutinin restene 307-319 (SEKV JD NR: 127). C-49 = sekvens KWDQIKKISKPVQH fra Chlamydia HSP 60 (SEKV JD NR: 128).

Peptider ble oppløst i DMSO til en endelig konsentrasjon på lOmM, disse stock-løsningene ble deretter fortynnet 1/500 i AJM V-media (endelig konsentrasjon 20(xM). Peptider ble tilsatt til en flatbunnet 96-brønners plate, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 1 og 5\ iM i lOOul. Viabiliteten av tinte PBMCer ble bedømt ved trypanblå frageeksklusjon, celler ble deretter resuspendert med en tetthet på 2x10<6>celler/ml og 100^1 (2x10<5>PBMC/brønn) ble overført til hver brønn inneholdende peptider. Kulturer fra triplikate brønner ble analysert ved hver peptidkonsentrasjon. Plater ble inkubert i 7 dager i en fuktet atmosfære av 5% CO<2>ved 37°C Celler ble pulset i 18-21 timer med l(xCi<3>H-Thy/brønn før høsting på filtermatter. CPM-verdier ble bestemt ved anvendelse av en Wallac microplate beta top plateteller (Perkin Eimer). Resultater ble uttrykt som stimuleringsindekser, avledet ved deling av proliferasjonsscore (feks. tellinger pr. minutt av radioaktivitet) målt for testpeptidet med score målt for celler ikke kontaktet med et testpeptid.

Kompilering av resultatene av analysen ovenfor indikerer tilstedeværelsen av fire T-celle-epitoper, svarende til peptidene 41, 44 og 50 i den modne, prosesserte regionen av proteinet og peptid 88 i den ubehandlede formen. Siden epitopen i peptid 88 ikke er del av det modne proteinet, blir den ikke tatt hensyn til under planen ifølge foreliggende oppfinnelse.

For peptid 41 (betegnet epitopområde RI) var det fire responsive donorer for dette peptidet; donorene 4, 5, 10 og 11. S.I. for disse ved 5[ iM er 3,6, 4,9, 2,1 og 2,0 henholdsvis.

For peptid 44 (betegnet epitopområde R2). Det er to responsive donorer for dette peptidet; donorene 4 (S.I.=3,5) og 11 (S.I.=2,3). Nærliggende peptider 43 og 45 induserte lavere nivå av T-celleproliferasjon siden begge disse peptidene overlapper med 12 aminosyrer med peptid 44.

For peptid 50 var det 2 responsive donorer til dette peptidet; donorene 4 (S.I. =2,9) og 14 (S.I. =2,0). Peptid 51 induserte lavere nivå av T-celleproliferasjon i donor 14 (S.L>1,9).

Vevstypene for alle PBMC-prøvene ble analysert ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig reagens-system (Dynal, Wirral, UK). Analyser ble utført i henhold til leverandørenes anbefalte fremgangsmåter og standard tilhørende reagenser og agaroseelektroforesesystemer. De allotypiske spesifisitetene for hver av de responsive donorprøvene er gitt i TABELL 2.

Eksempel 2: Kloning av bouganin fra Bougainvillea spectabilis

Totalt RNA ble ekstrahert fra bladene av Bougainvillea spectabilis ved anvendelse av 'SV Total RNA Isolation System og fremgangsmåter gitt av leverandøren (Promega, Southampton, UK). Friskt bladvev ble malt til et fint pulver under flytende nitrogen og omtrent 50 mg malt vev ble anvendt for RNA-isoleringen. RNA-kvalitet og mengde ble kontrollert ved visualisering på en 1% agarosegel og bouganin-genet ble amplifisert fra det totale RNA ved anvendelse av "Access RT-PCR System" (Promega) ved anvendelse av omtrent ljxg RNA pr. reaksjon og med de genspesifikke primerene OLI 032 og OLI 033. Primersekvenser er gitt i TABELL 3 nedenfor. Denne reaksjonen dannet et fragment på 1242 bp omfattende den native ledersekvensen og fullengde bouganinsekvensen. Dette fragmentet ble klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega), ifølge kit-instruksjoner og betegnet pBoul. Sekvensen ble bekreftet ved DNA-sekvensering.

Bouganingenet ble overført inn i pET21a (Novagen, Nottingham, UK) ved PCR-kloning ved anvendelse av pBoul-plasmidet som et templat. En pelB (pektat lyase)-ledersekvens ble tilføyd til 5'-enden og en sekvens som koder for en 6x histidin-tag ble tilføyd til 3'-enden av den bouganinkodende sekvensen. pelB-lederen ble amplifisert fra vektor pPMI-his [Molloy, P. et al, (1995) J. Applied Bacteriology, 78: 359-365] ved anvendelse av primer OLI 322 (omfatter et Ndel-sete) og primer OLI 067. Bouganin-his-fragmentet ble amplifisert fra pBoul ved anvendelse av OLI 068 og OLI 323 (omfatter et Noti-sete). pelB-lederen ble fusjonert i leseramme med bouganin-his-fragmentet ved anvendelse av overlap PCR og det resulterende fragmentet klonet inn i pGEM-T Easy (Promega). Etter bekreftelse av sekvensen ble pelB-bouganin his-fragmentet klonet som et Ndel-Noti-fragment inn i Ndel-Notl-kløyvet pET21a. Denne klonen ble betegnet pBou32.

Eksempel 3: Konstruksjon av muterte bouganinproteiner

Flere modifiserte (muterte) bouganinproteiner ble utformet ved anvendelse av data gitt ved T-celle epitop-kartleggingsmetoden og anvendelse av programvare i stand til å simulere bindingen av peptider med human MHC klasse JJ bindingsgrop. Denne siste metoden er beskrevet i detalj andre steder [WO 02/069232]. Varianter av gener ble konstruert og de muterte proteinene testet for funksjonell aktivitet. Generelt ble "enkeltmutanf-proteiner inneholdende én aminosyresubstitusjon hver først konstruert og testet, deretter ble gener for aktive modifiserte proteiner kombinert for å fremstille multippelt substituerte modifiserte proteiner.

Muterte gener ble konstruert ved anvendelse av en overlap PCR-metode hvor det muterte aminosyrekodonet blir innført i genet ved anvendelse av en mutant i "overlap primer". Skjemaet er velkjent på området og er beskrevet i detalj andre steder [Higuchi, et al (1900) Nucl. Acids Res. 16:7351]. Totalt ble 37 enkeltmutant modifiserte proteiner konstruert og testet for beholdt funksjonell aktivitet. I tillegg ble en negativ kontroll av modifisert protein inneholdende en Y70A- substitusjon også konstruert og testet i alle forsøkene. Ett av de 37 "enkeltmutant" modifiserte proteinene inneholdt faktisk to direkte substitusjoner i nabostilling (E151T og I152E) og er tellet her som en enkelt mutant. Substitusjonene testet og de tilsvarende verdiene for aktivitet er gitt i TABELL 4.

Totalt 11 modifiserte proteiner med multiple substitusjoner ble konstruert og testet for beholdt aktivitet. Substitusjonene testet og de tilsvarende verdiene for aktivitet er gitt i

TABELL 5.

TABELL 6 beskriver sekvensene av de substitusjonsmodifiserte proteinene. TABELL 7 lister opp noen spesifikke sekvenser.

I alle tilfeller ble proteiner renset og testet i henhold til metodene beskrevet i eksemplene 4 og 5 nedenfor.

Eksempel 4: Ekspresjon og rensning av bouganinprotein

Plasmidet pBou32 ble transformert inn i BL21(DE3) (Novagen) kompetente celler etter produsenters instruksjoner og selektert på LB (Invitrogen, Paisley, UK)-plater inneholdende 50(xg/ml karbenicillin. En fersk koloni fra denne transformasjonen ble anvendt til å inokulere 5 ml 2xYT (Invitrogen)-medium, uten antibiotika og dette ble dyrket med risting ved 250rpm ved 37°C inntil OD600 = 1,5-2,0. Kulturen ble deretter sentrifugert ved 2500 rpm i 15 minutter ved romtemperatur og cellene resuspendert i 5 ml fersk 2xYT pluss lmM IPTG. Denne kulturen ble inkubert ved 30°C med risting ved 300 rpm i 1,5 time og cellene oppsamlet ved sentrifugering og supernatanten kastet.

Cellepelleten ble resuspendert i 1 ml PEB2 (50mM Tris-HCl pH8, 20% sukrose, 1 mg/ml lysozym, lx Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche, Lewes, UK) og inkubert på is i 1 time med forsiktig blanding. Celledebris ble sentrifugert ved 14,000 rpm ved 4°C og pelleten kastet. Den resulterende supernatanten blir nå referert til som den "periplasmiske fraksjonen". Bouganinprotein ble renset fra den periplasmiske fraksjonen ved nikkel affinitet kolonnekromatografi ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig "spin kolonne" og produsentens instruksjoner (Qiagen, Crawley, UK). Det resulterende materialet ble dialysert mot 4 liter fosfatbufret saltoppløsning (0,138M NaCl, 0,0027M KC1, pH 7,4) natten over ved 4°C ved anvendelse av en 10000 molekylvekt cut-off "Slide-A-Lyzer" (Pierce, Chester, UK). Etter dialyse ble proteinkonsentrasjonen beregnet ved anvendelse av Micro BCA Assay Kit (Pierce) og prøver lagret ved -20°C.

Bouganinproteinkonsentrasjon ble videre bestemt ved anvendelse av et ELISA-basert analysesystem. I korthet ble antiserum mot bouganin fremstilt (Genovac, Freiburg, Tyskland), gjennom genetisk immunisering av to rotter med et plasmid som uttrykker bouganin. For ELISA, blir rekombinant bouganin oppfanget på Ni-agarose-belagte plater gjennom dets His-tag og deretter detektert med rotte antiserum og et sekundært HRP-konjugert anti-rotte Fc-antistoff (Sigma, Poole, UK). Som en standard ble en omfattende fremstilling av villtype bouganin uttrykt i E.coli og kvantifisert ved anvendelse av total-proteinanalysen, anvendt i hver bestemmelse.

Eksempel 5: Analyse av bouganinaktivitet

Aktiviteten av villtype og modifiserte (muterte) bouganinproteiner ble testet ved å måle deres evne til å hemme proteinsyntese i en cellefri proteinsyntese-analyse.

En blanding av 10 \ il TNT koblet Transkripsjon/Translasjon blanding (Promega), 20(jM metionin, 120 ng pT7 luciferase DNA (Promega) og seriefortynninger av villtype og mutert bouganinprotein i et endelig volum på 12,5\il ble inkubert ved 30°C i én time, hvoretter reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 100 \ il "SteadyGlow" luciferase analysereagens (Promega). Luciferaseaktiviteten ble målt ved anvendelse av en Wallac luminescens-teller. Aktivt bouganinprotein blir detektert som en reduksjon i målt luciferaseaktivitet. Hvert modifisert bouganinprotein ble testet i minst 5 konsentrasjoner, med hvert datapunkt i duplikat. Positive og negative kontroller ble omfattet i hvert forsøk.

Resultater for enkeltmutant-proteiner er vist i TABELL 4. Resultater for multippelmutant modifiserte bouganinproteiner er vist i TABELL 5. I hvert tilfelle er resultater uttrykt relativt til aktivitet av villtypeprotein. Alle analyser ble utført med inklusjon av en inaktivt mutert bouganinprotein med en Y70A-substitusjon.

I tillegg kan resultater av luciferaseanalyse plottes for å vise % luciferaseaktivitet relativt til kontroll versus proteinkonsentrasjon av tilsatt bouganin. Eksempler på slike plott er vist i Figur 1 som viser resultatene som bestemt for to forskjellige multippel muterte bouganinproteiner.

Eksempel 6: Analyse av variant bouganinsekvenser for tap av T-celle-epitoper.

Det multippelt modifiserte proteinet betegnet Boul 56 ble valgt for videre testing ved anvendelse av en immunogenisitetsanalyse. Denne varianten inneholder substitusjonene V123A, D127A, Y133N og I152A. Testing av immunogenisitet omfatter anvendelse av levende celler som kan være skadet ved testing ved anvendelse av helt bouganinprotein, derfor ble disse analysene utført ved anvendelse av syntetiske peptider omfattende substitusjonene innført i variant Boul56. Peptidene testet er listet opp i TABELL 8. Analysene ble utført i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 1 (ovenfor) ved anvendelse av en PBMC donorpool på 20 individer. Peptider ble testet in triplo for hver donorprøve ved to forskjellige endelige peptidkonsentrasjoner (ljxM og 5^iM).

Resultatene er uttrykt som SI pr. peptid pr. donorprøve og er vist i Figur 2. DeI-41 er peptidsekvens AKADRKALELGVNKL (SEKV ID NR:29). Del-44 er peptidsekvens LGVNKLEF SIE ATHG (SEKV ID NR: 30). DeI-50 er peptidsekvens NGQEAAKFFLIVIQM (SEKV ID NR:31). Ingen av de modifiserte peptidene induserte en T-celle-respons i noen av donorene (S.I.<2). I motsetning til dette stimulerte et immunogent kontrollpeptid T-celler fra 6 donorer (S.L>2).

Eksempel 7: VB6-845: rekombinant konstruksjon av et Ep-CAM-spesifikt Fab-antistoff for optimal levering av deimmunisert bouganin (De-bouganin).

I dette eksemplet og Eksempel 8, er det deimmuniserte bouganinet Boul 56.

Tumor-målrettede cytotoksiner er sammensatt av den variable regionen av et antistoff bundet til et bakterie, fungalt eller plantetoksin. Foreliggende studie illustrerer at de deimmuniserte bouganinkonstruksj onene ifølge oppfinnelsen, omfattende deimmunisert bouganin bundet til en målrettet gruppe har redusert immunogenisitet, mens de fortsatt beholder sin biologiske aktivitet. TABELL 12 viser bindingen av Ep-CAM-antistoffet til mange typer tumorer og viser følgelig at det kan anvendes for å behandle disse typene av kreft.

Deimmunisert bouganinkonstruksjon: Ep- CAM- rettet målrettet gruppe bundet til de- bouganin

VB5-845, en Fab-versjon av et anti-Ep-CAM scFv-antistoff, ble genetisk bundet til en deimmunisert form av bouganin (de-bouganin), Bou 156, et potent, planteavledet, type I ribosom inaktiverende protein (RIP), for å danne antistoff-toksin-konstruksjonen VB6-845.

Figur 3 viser konstruksjonen VB6-845. Figur 3A viser dicistronisk enhet av pro-VB6-845, med pelB-ledersekvenser. Aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 16) og den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 15) er gitt i Figur 3B. Figur 3C illustrerer det sammensatte VB6-845-proteinet, som er beskrevet mer detaljert nedenfor. Undersøkelse av denne konstruksjonen, viser at konstruksjonen beholdt dens biologiske aktivitet (cytoksisitet) og spesifisiteten av den målrettede gruppen (Ep-CAM antistoff).

Orientering av den deimmuniserte bouganinkonstruksj on

For å bestemme den optimale antistoff-de-bouganin-orienteringen, ble mange former av en dicistronisk ekspresjonsenhet fremstilt, uttrykt og testet for potens.

I hvert tilfelle ble den dicistroniske enheten klonet inn i pING3302-vektoren (Figur 4) under kontroll av den arabinoseinduserbare araBÆD-promoteren og transformert i El 04 E. coli. Ved induksjon styrte tilstedeværelsen av pelB-ledersekvens sekresjonen av Fab-de-bouganin-fusjonsproteinet inn i kultursupernatanten. Den kløyvbare linkeren satte de-bouganinet i stand til å spaltes fra den målrettede gruppen og utøve sin biologiske aktivitet. I én utførelsesform er bindingene en furin-linker, selv om fagfolk på området ville forstå at kløyvbare linkere kunne være egnet. Foretrukne linkere kunne velges basert på målspesifisitet og omgivelse. En prøve av konstruksjonene fremstilt og testet er som følger: Figur 3: VB6-845, hvori de-bouganin (Boul 56) er bundet til den C-terminale enden av CH-domenet via en furin-linker. Figur 3A illustrerer den dicistroniske enheten av pro-sekvensene, Figur 3B viser den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 15) og aminosyresekvensen av prosekvensene (SEKV ID NR: 16) og Figur 3C viser det sammensatte VB6-845-proteinet uten pelB-sekvensene. Figur 5 illustrerer kontrollen Fab anti-Ep-CAM-konstruksjonen uten plantetoksinet, de-bouganin (VB5-845). Figur 5A viser den dicistroniske enheten av pro-sekvensene, Figur 5B viser den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 17) og aminosyresekvensen av pro-sekvensene (SEKV ID NR: 18) og Figur 5C viser det sammensatte VB6-845 proteinet uten pelB-sekvensene. Figur 6 viser Fab anti-Ep-CAM de-bouganin-konstruksjonen, VB6-845-CL-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet ved den C-terminale enden av CL-domenet. Figur 6A illustrerer den dicistroniske enheten av pro-sekvensene, Figur 6B viser den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 19) og aminosyresekvensen av pro-sekvensene (SEKV ID NR:20) og Figur 6C viser det sammensatte VB6-845-CL-de-bouganinproteinet uten pelB-sekvensene. Figur 7 viser Fab anti Ep-CAM, de-bouganin-konstruksjonen, VB6-845-NVH-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet til den N-terminale enden av VH-domenet. Figur 7A viser de dicistroniske enhetene av pro-sekvensene, Figur 7B viser den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR:21) og aminosyresekvensen av pro-sekvensene (SEKV ID NR:22) og Figur 7C viser det sammensatte VB6-845-NVH-de-bouganinproteinet uten pelB-sekvensene. Figur 8 illustrerer Fab anti-Ep-CAM-konstruksjonen VB6-845-NVL-de-bouganin, hvor Boul 56 er bundet til den N-terminale enden av VL-domenet. Figur 8A viser den dicistroniske enheten av pro-sekvensene, Figur 8B viser den kodende nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR:23) og aminosyresekvensen av pro-sekvensene (SEKV ID NR:24) og Figur 8C viser det sammensatte VB6-845-NVL-de-bouganin.-proteinet uten pelB-sekvensene.

I én utførelsesform er de-bouganin-molekylet bundet til den C-terminale enden av den tunge eller lette kjeden. Den optimale konfigurasjonen omfattet en pelB-ledersekvens i nabostilling til VH-CH-domenet med en N-terminal histidin affinitets-tag som den første enheten. Umiddelbart etterfølgende var den andre enheten omfattende pelB-VL-CL-domenet bundet til de-bouganin ved en protease-sensitiv linker. (Figur 6) For konstruksjoner hvor de-bouganin ble anbrakt ved den N-terminale enden, viste en Western-blot-analyse intet detekterbart produkt og bare C-terminalt bundet de-bouganin (konstruksjoner ifølge Figurene 3 og 6) ga et intakt oppløselig protein (Figur 9), med gode bindingsegenskaper til Ep-CAM-positive cellelinjer, som illustrert i reaktivitetstestene detektert ved strømningscytometri. I Western Blot-analysen, viser Figur 9 ekspresjon av VB6-845 og VB6-845 CL-de-bouganin i supernatanten fra induserte E104-celler i laboratorieskala. En alikvot av supernatanten, 16 mikroliter, under ikke-reduserende betingelser, ble fylt på en SDS-PAGE akrylamidgel og analysert ved Western Blot ved anvendelse av enten et kanin polyklonalt anti-4D5-antistoff, etterfulgt av et geit anti-kanin (1/2000) eller et geit anti-human Kappa-lett kjede-HRP-antistoff (1/1000), for å bekrefte identiteten og størrelsen av det rekombinante proteinet. Pilen indikerer fullengde VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3) og VB6-845-CL-de-bouganin (konstruksjon ifølge Figur 6). Western blot av ikke-indusert El 04 kultursupernatant avslørte ingen tilsvarende bånd som demonstrerer spesifisiteten av antistoffene (ikke vist).

Resultatene av reaktivitetstestene med VB6-845 (Figur 3) og VB6-845-CL-de-bouganin (Figur 6) til Ep-CAM positive cellelinjer CAL 27 og NIH:OVCAR-3 sammenlignet med en kontroll (Ep-CAM-negativ cellelinje, A-375) er illustrert i Figur 10A. Resultatene var komparable med samme reaktivitetstester utført med en annen anti-Ep-CAM-konstruksjon, VB6-845-gelonin, hvor de-bouganin er erstattet med et annet plantetoksin, gelonin (Se Figur 14C som viser dens aminosyresekvens (SEKV JD NR: 26) og nukleinsyresekvens (SEKV ID NR:25) Resultatene av reaktivitetstesten med geloninkonstruksjonen er vist i Figur 10B. Tilføyelse av et andre de-bouganindomene i molekylet med optimal orientering ga ikke produkt.

Strømningscytometritestene ble utført ved inkubering av konstruksjonene eller kontroll med 0,45 x IO<6>celler i en time på is. Etter vasking ble konstruksjoner bundet til celleoverflaten detektert med et kanin anti-bouganin (for Figur 10A) eller mus anti-His-tag (Figur 10B) i en time på is. Cellene ble vasket og inkubert med FITC-konjugert sau anti-kanin IgG (Figur 10A) og FITC-konjugert sau anti-mus (IgG) (Figur 10B) i 30 minutter på is. Deretter ble cellene vasket, resuspendert i PBS 5% FCS inneholdende propidiumjodid for bedømmelse av antistoffbinding ved strømningscytometri. Ingen forandring i median fluorescens ble detektert etter inkubering med VB6-845 og VB6-845-CL-de-bouganin med A-375. I motsetning til dette ble en tydelig forandring i median fluorescens observert med Ep-CAM-positive cellelinjer, CAL 27 og NTH:OVCAR-3 (Figur 10A). Som angitt ovenfor var resultatene med VB6-845 likt med geloninkonstruksjonen (Figur 10B).

Ep- CAM spesifisitet

Et konkurranseforsøk av VB6-845 (konstruksjon ifølge Figur 3) med Proxinium™, et scFv-format av VB6-845, men inneholdende Pseudomonas exotoxin A, viste at Ep-CAM-spesifisiteten av VB6-845 var uendret når konstruert inn i et Fab-format. (Figur 11)

Figur 11 viser strømningscytometri-resultatene fra konkurranseforsøket, med VB6-845 ved 1 og 10 ug/ml og økt konsentrasjon av Proxinium™, i området fra 0 til 100 ug/ml, ble inkubert med NIH: OVCAR-3-celler (Ep-CAM-positiv tumorcellelinje). Etter 1 times inkubering ved 4°C, ble celler vasket og bundet VB6-845 ble detektert med et biotinylert kanin anti-bouganin fulgt av streptavidin-cychrome. Samme forsøk ble utført med 4B5-PE som anvendes som en negativ kontroll. Reaksjonsbetingelsene var som angitt i Figur 11.

Potens ( biologisk aktivitet)

I tillegg viste cellefri (Figur 12) og MTS (Figur 13 A og B)-analyser at de-bouganin beholdt sin potens når den var konjugert til Fab-fragmentet. MTS-analysen anvendt for å måle potens ble utført ved anvendelse av standardteknikk kjent på området og som mer fullstendig beskrevet nedenfor i Eksempel 8. Ved anvendelse av de Ep-CAM-positive cellelinjene, CAL 27 og NIH:OVCAR-3, var IC50for VB6-845 3 til 4 nM og 2 til 3 nM, henholdsvis. I tilfellet av VB6-845-CL-de-bouganin, ble styrken målt ved 1 til 2 nM for CAL 27 og 0,6 til 0,7 nM versus NTH:OVCAR-3. Utviklingen av Fab anti-Ep-CAM-konstruksjon, omfattende et human tumor-målrettet antistoffragment bundet til et deimmunisert bouganin skulle tillate gjentatt systemisk administrering av dette medikamentet og følgelig gi større klinisk fordel.

Høsting av konstruksjonene

Konstruksjonene kan isoleres fra cellekulturene ved teknikker kjent på området. For eksempel, hvis en His-tag plasseres ved den N-terminale enden av peptidkonstruksjonen, kan Fab-bouganinproteinet renses ved anvendelse av en Ni<2+->chelaterende oppfangingsmetode. Som et eksempel kan den følgende fremgangsmåten anvendes.

Utførelse av fed batch-fermentering av VB6-845-varianter utført i en 15 1 CHEMAP-fermentor ved anvendelse av TB-medium. Ved en OD600på 20 (mid-log), blir kulturen indusert med en blanding av næring og inducer inneholdende 50% glyserol og 200 g/l L-arabinose. Ved 30 timer etter induksjon, blir kulturen høstet, sentrifugert ved 8000 rpm i 30 min og VB6-845-varianter renset ved anvendelse av CM sefarose og Metal-Charged Chelaterende sefarosekolonner fulgt av en størrelse eksklusjonskolonne. I korthet blir supernatanten konsentrert og diafiltrert mot 20 mM natriumfosfat pH 6,9 ±0,1. Den diafiltrerte konsentrerte supernatanten blir deretter påført på en CM sefarosekolonne ekvilibrert med 20 mM natriumfosfat, 25 mM NaCl pH 6,9 ±0,1. Kolonnen blir vasket med 20 mM natriumfosfat, 25 mM NaCl pH 6,9 ±0,1, bundet VB6-845 blir deretter eluert med 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl pH 7,5± 0,1. CM sefarose-eluatet blir justert til å inneholde en endelig konsentrasjon på 0,25% Triton-XlOO og påført på en ladet chelaterende sefarosekolonne. Den chelaterende sefarosekolonnen blir deretter vasket med 3 forskjellige vaskebuffere ved å starte med 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, 0,25% triton-XlOO pH 7,5 ± 0,1 fulgt av 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl pH 7,5 ±0,1 og fulgt av 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 7,5 ±0,1. Det bundne VB6-845 blir deretter eluert med 20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 7,5 ± 0,1 og oppsamlet i 2 ml fraksjoner. Absorbansen ved A2soblir bestemt for hver fraksjon og fraksjonene med materiale samlet blir påført på en størrelse eksklusjonskolonne S200 for å oppnå en renhet på >80%. I én utførelsesform, for å øke renheten av protein og fjerne endotoksin, blir den samlede SEC-fraksjonen fortynnet 5 ganger med 20mM NaP04, pH 7,5 og passert gjennom en Q-sefarose 15 ml fast flow-kolonne ekvilibrert med 20 mM NaP04, 25 mM NaCl pH 7,5 ved en strømningshastighet på ca. 5 ml/min. Etter påføring av prøven gjennom kolonnen, blir kolonnen vasket med 10 kolonnevolumer av ekvilibreringsbuffer og vasken blir samlet med den initielle Q-sepharose gjennomstrømningen. Effluenten blir konsentrert til -10 ganger gjennom anvendelse av en 30 kDa MWCO-membran (Sartorius hydrosart membran] for å oppnå en endelig konsentrasjon på 7,5 mg/ml. Tween-80 blir deretter tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,1%. Sluttproduktet blir sterilfiltrert og lagret ved -80°C. Prøver fra hvert trinn av fremgangsmåten blir analysert ved Western blot etter immunblotting med anti-4D5-antistoffet. Renhet blir bekreftet ved kolloidal blå-farging. Nivået av ekspresjon av VB6-845-varianter blir bestemt ved Western Blot-analyse og ELISA.

Eksempel 8: Funksjonell og biologisk karakterisering av VB6-845, et rekombinant Ep-CAM-spesifikt Fab-antistoff genetisk koblet til deimmunisert Bouganin (de-bouganin).

Kjemoterapeutika er svært cytotoksiske midler som ofte representerer standard for forsiktighet ved behandling av mange av kreftformene med faste tumorer. Den cytotoksiske virkningen av disse medikamentene målretter raskt delende celler, både normale og tumorceller, og skaper følgelig en rekke ugunstige kliniske bivirkninger. VB6-845 er et Fab-antistoff bundet til en deimmunisert form av det plante-avledede toksinet bouganin. I motsetning til kjemoterapeutika som mangler definert tumor-mål spesifisitet, begrenser VB6-845 sin cytolytiske effekt kun til Ep-CAM-positive tumor-mål. I denne undersøkelsen ble strømningscytometri-analyse og cytotoksisitet målt for å bedømme potensen og selektiviteten av VB6-845.

Strømningscytometri

Tumorcellelinjene anvendt i denne undersøkelsen ble innkjøpt fra ATCC og ble propagert ifølge ATCCs anbefalinger bortsett fra for cellelinjene C-4I, TOV-112D som ble dyrket i RPMI 1640 eller DMEM supplert med 10% FCS, henholdsvis. Tumorceller ble høstet ved 60-70% konfluens med viabilitet over 90%. De humane normale brystepitelcellene (HMEC) ble anskaffet fra CAMBREX og opprettholdt i spesifisert medium i henhold til metoden gitt av CAMBREX. Cellene ble høstet ved 70% konfluens med viabilitet over 90%.

De gynekologiske cellelinjene fra endometrie ovarie- og cervikal cancer-indikasjoner ble testet for VB6-845-binding ved strømningscytometri (Tabell 9). Ti mikrogram/ml VB6-845 ble tilsatt til hver cellelinje (3 x 10<5>celler) og inkubert i 2 timer ved 4°C. A-375 og CAL 27 ble anvendt som negative og positive cellelinjekontroller, henholdsvis. Etter å ha vasket bort ubundet materiale, ble et mus monoklonalt anti-Histidin-antistoff (Amersham Pharmacia, Katt nr. 27471001) fortynnet 1/800 i PBS inneholdende 10% FCS tilsatt og inkubert i ytterligere 1 time ved 4°C. Deretter ble FITC-merket anti-mus IgG (The Binding Site, Kat. nr. AF271) fortynnet 1/100 i PBS-10% FCS tilsatt og inkubert i 30 min. ved 4°C. Til slutt ble cellene analysert på en FACS Calibur etter propidiumjodidmerking for å lede ut de døde cellene.

Cytotoksisitet

Nivået av dreping for VB6-845 i cellene listet opp i strømningscytometri-studiet er som angitt i Tabell 10, indikerte at konstruksjonen beholdt dens de-bouganin cytotoksisitet-aktivitet mot Ep-CAM-positive cellelinjer. Cytoksisiteten var komparabel med en annen Fab VB6-845-variant inneholdende et ulikt plante-avledet toksin, gelonin.

(Figur 14) Figur 14 A sammenligner cytotoksisiteten av gelonin, Fab anti-Ep-CAM-gelonin-konstruksjon (VB6-845-Gelonin) og Fab anti-Ep-CAM-de-bouganin (Boul 56)-konstruksjonen (VB6-845) i CAL 27 (Figur 14A) og NIH:OVCAR-3-celler (Figur 14B). Nukleinsyre og aminosyresekvensen av VB6-845-gelonin-konstruksjoner er vist i Figur 14C.

For å undersøke spesifisiteten og selektiviteten av VB6-845 (konstruksjon ifølge

Figur 3), ble den cytotoksiske aktiviteten av VB6-845 (90% ren) testet mot Ep-CAM-positive (NTH:OVCAR-3) og Ep-CAM-negative (HMEC, DAUDI, A-375) cellelinjer (Tabell 11) sammen med 17 kjemoterapeutiske medikamenter (LKB Laboratories Inc.).

MTS-analysen ble utført ved anvendelse av standar dteknikker kjent på området. Nærmere bestemt ble 50 mikroliter celler (2 x IO<4>celler/ml) sådd ut pr. brønn og plater ble inkubert ved 37°C under 5% C02i 2 timer. Deretter ble 50 mikroliter av aktuelt medikament (dvs. konstruksjon som skal testes eller kontroll) tilsatt til dyrkningsmediet ved økende konsentrasjoner. Dyrkningsmedium, med eller uten celler, ble anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Platene fikk stå ved 37°C under 5% C02i 5 dager. Ved dag 5 ble hemming av celleproliferasjon evaluert ved tilsetning av 20 mikroliter MTS-reagens (Promega, Kat. nr. G5430). Platene ble videre inkubert ved 37°C under 5% C02i 2 timer og OD ble avlest ved 490 nm ved anvendelse av plateleser spetrofotometer. Bakgrunnsverdier ble subtrahert fra prøveverdiene oppnådd for hver konsentrasjon og resultatene ble uttrykt som en prosent av viable celler. IC50-verdiene for hvert medikament ble beregnet for hver cellelinje.

Når analysert for cytotoksisitet mot NIH:OVCAR-3, ble et Ep-CAM-positivt ovariekarsinom, ved anvendelse av et panel av standard kjemoterapeutiske midler, VB6-845 vist å være mer potent enn 12 av de 17 medikamentene testet. (Tabell 11) Selv om 5 kjemoterapeutika var mer cytotoksiske, ble de også vist å være mye mer toksiske ved at de ikke hadde noen cellespesifikk dreping. Av de fem anbefalte kjemoterapeutiske midlene for behandling av ovariekreft (Paklitaxel, Karboplatin, Cisplatin, Doxorubicin og Topotekan), var bare to (Paklitaxel og Topotekan) mer cytotoksiske. Selv om VB6-845 viste svært kraftig cytolytisk aktivitet i området på 1 til 2 nM, var den potente drepingen begrenset utelukkende til den Ep-CAM-positive tumorcellelinjen NIH:OVCAR-3. Selv om noe dreping av Ep-CAM-negative cellelinjer ble vist med VB6-845, var den cytotoksisk effekten minst 220 ganger og maksimalt >1000 ganger mindre toksisk. VB6-845 representerer følgelig et potent antistoff-rettet behandlingsalternativ til kjemoterapeutika som når kombinert med den lavere toksisitetsprofilen, ser svært lovende ut ved behandling av mange forskjellige typer av faste tumorer.

Eksempel 9: VB6-011: rekombinant konstruksjon av et tumorassosiert antigen-spesifikt Fab-antistoff for optimal levering av deimmunisert bouganin (De-bouganin).

Tumor-målrettede cytotoksiner er sammensatt av den variable regionen av et antistoff bundet til et bakterielt, fungalt eller plantetoksin. Foreliggende studie viser at de deimmuniserte bouganinkonstruksj onene ifølge oppfinnelsen, omfattende deimmunisert bouganin bundet til en målrettet gruppe har redusert immunogenisitet, mens de fortsatt beholder deres biologiske aktivitet. TABELL 13 viser bindingen av det tumorassosierte antigen-antistoffet til mange typer av tumorer og viser følgelig at det kan anvendes for å behandle disse typene av kreft.

Deimmunisert bouganinkonstruksjon: Tumorassosiert antigen- rettet målrettet gruppe bundet til de- bouganin

Antistoffet Hil, et monoklonalt antistoff som gjenkjenner tumorassosiert antigen, ble genetisk bundet til en deimmunisert form av bouganin (de-bouganin), Bou 156, et potent, plante-avledet, type I ribosom inaktiverende protein (RU*), for å danne antistoff-toksin-konstruksjonen VB6-011. Figur 15 viser den kodende nukleinsyresekvensen og aminosyresekvensen. Undersøkelse av denne konstruksjonen, viser at konstruksjonen beholdt dens biologisk aktivitet (cytoksisitet).

Potens ( biologisk aktivitet)

MTS-analyse viste at de-bouganin beholdt dens potens når konjugert til Fab-fragmentet (Figur 16). MTS-analysen anvendt for å måle potens ble utført ved anvendelse av standardteknikk kjent på området og som mer fullstendig beskrevet i Eksempel 8.

Cytotoksisitet

For å undersøke spesifisiteten og selektiviteten av VB6-011, ble den cytotoksisk aktiviteten testet mot MB-435S-celler. MTS-analysen ble utført ved anvendelse av standardteknikker kjent på området. Nærmere bestemt ble 50 mikroliter celler (2 x IO<4>celler/ml) sådd ut pr. brønn og plater ble inkubert ved 37°C under 5% CO2i 2 timer. Deretter ble 50 mikroliter av det aktuelle medikamentet (dvs. konstruksjon som skal testes eller kontroll) tilsatt til dyrkningsmediet ved økende konsentrasjoner. Dyrkningsmedium, med eller uten celler, ble anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Platene fikk stå ved 37°C under 5% C02i 5 dager. Ved dag 5 ble hemming av celleproliferasjon evaluert ved tilsetning av 20 mikroliter MTS-reagens (Promega, Kat. nr. G5430). Platene ble videre inkubert ved 37°C under 5% C02i 2 timer og OD ble avlest ved 490nm ved anvendelse av plateleser spektrofotometer. Bakgrunnsverdier ble subtrahert fra prøveverdiene oppnådd for hver konsentrasjon og resultatene ble uttrykt som en prosent av viable celler. Resultater viser at IC50-verdien for VB6-011 er 350 nM.

Claims (30)

1. Modifisert bouganinprotein,karakterisert vedat nevnte modifiserte bouganin har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert bouganin, hvor nevnte bouganin har en aminosyresubstitusjon av en eller flere av X<1>, X<2>, X<3>, X<4>eller X<5>i en T-celle epitope valgt fra gruppen bestående av: a) AKX<1>DRKX<2>LX<3>LGVX<4>KL (epitoperegion RI, SEQ ID NO:8) b) LGVX<4>KLEFSIEAIHG (epitoperegion R2, SEQ ID NO:9); og c) NGQEX<5>AKFFLIVIQM (epitoperegion R3, SEQ ID NO: 10) hvor: X<1>er T eller A eller Q; X<2>er Geiler A; X<3>er Q eller G; X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S; og X<5>er Q eller A.

2. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1,karakterisert vedat aminosyresekvensen til det modifiserte bouganinproteinet omfatter:

hvor: X<1>er T eller A eller Q; X2 er G eller A; X<3>er Q eller G; X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller E eller G eller H eller K eller S; og X<5>er Q eller A (SEQ ID NO: 12).

3. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat X<1>er A.

4. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat X<2>er A.

5. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat X<4>er N.

6. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat X<5>er A.

7. Modifisert bouganinprotein ifølge krav 1, hvor det modifiserte bouganinet omfatter følgende sekvens:

8. Cytotoksin,karakterisert vedat det omfatter (a) en målrettet gruppe bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Cytotoksin,karakterisert vedat det omfatter (a) en ligand som binder til en kreftcelle bundet til; (b) et modifisert bouganinprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

10. Cytotoksin ifølge krav 9,karakterisert vedat liganden er et antistoff eller et antistoff fragment som bindes til en cancercelle.

11. Cytotoksin ifølge krav 10,karakterisert vedat antistoffet eller antistoff fragmentet bindes til Ep-CAM på overflaten av cancercellen.

12. Cytotoksin ifølge krav 11,karakterisert vedat antistoff eller antistoff fragmentet som bindes til Ep-CAM er et humanisert antistoff eller antistoff fragment som bindes til den ekstracellulære domenen av human Ep-CAM og omfatter komplementaritetsbestemmende regionsekvenser avledet fra et MOC-31 antistoff.

13. Cytotoksin ifølge krav 12,karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 16.

14. Cytotoksin ifølge krav 10,karakterisert vedat antistoffet eller antistoff fragmentet bindes til et tumor-assosiert antigen på overflaten av cancercellen.

15. Cytotoksin ifølge krav 14,karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen vist i SEQ. ID. NO:28.

16. Anvendelse av et cytotoksin ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15 for fremstilling av et medikament for å hemme eller nedbryte en cancercelle.

17. Cytotoksin ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15,karakterisert vedat den er for anvendelse ved hemming eller nedbrytning av en cancercelle.

18. Anvendelse av et cytotoksin ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15, for fremstilling av et medikament for behandling av cancer.

19. Cytotoksin ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15,karakterisert vedat det er for anvendelse av behandling av cancer.

20. Anvendelse ifølge krav 16 eller 18, eller cytotoksinet for anvendelse ifølge krav 17 eller 19, hvor canceren er valgt fra gruppen bestående av kolorektal cancer, brystcancer, ovariecancer, hode- og nakkecancer, blærecancer, levercancer, nyrecancer, melanomer, gastrointestinal cancer, prostatacancer, småcellet og ikke-småcellet cellelungecancer, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer.

21. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat ved at den omfatter cytotoksiner ifølge et hvilket som helst av kravene 8-15 og en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytikum for behandling av et dyr med cancer,karakterisert vedat den omfatter: (a) identifisering av T-celle epitoper av bouganin; (b) modifisering av en eller flere aminosyreresidier i en T-celle epitope for å fremstille et modifisert bouganin som har redusert tilbøyelighet til å aktivere T-celler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7; (c) fremstille et cytotoksin som har en cancer-bindende ligand koblet til det modifiserte bouganinet; og (d) suspendering av cytotoksinet i en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat canceren er valgt fra gruppen bestående av kolorektal cancer, brystcancer, ovariecancer, bukspyttkjertelcancer, hode og nakke cancer, blærecancer, levercancer, nyrecancer, melanomer, gastrointestinal cancer prostatacancer, småcellet og ikke-småcellet lungecancer, sarkomer, gliomer, T- og B-celle lymfomer.

24. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder for et modifisert bouganin ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7.

25. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder for et cytotoksin ifølge kravene 8-15.

26. T-celle epitope peptid,karakterisert vedat det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert T-celle epitope omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor minst en av X<1>, X<2>, X<3>, og X<4>er modifisert fra den ikke-modifiserte sekvensen som følger: X<1>er T eller A eller Q; X<2>er Geiler A; X<3>er Q eller G; og X<4>er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S (SEQ ID NO: 8).

27. T-celle epitope peptid,karakterisert vedat det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med den ikke-modifiserte T-celle epitopen omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor X4 er N eller D eller T eller A eller R eller Q eller E eller G eller H eller K eller S (SEQ ID NO:9).

28. T-celle epitope peptid,karakterisert vedat det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med den ikke-modifiserte T-celle epitopen omfattende en modifisert sekvens omfattende:

hvor X<5>er Q eller A (SEQ ID NO: 10).

29. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder for T-celle epitope peptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 26-28.

30. Modifisert bouganin protein,karakterisert vedat det har en redusert tilbøyelighet til å aktivere en immunrespons sammenlignet med ikke-modifisert bouganin omfattende sekvensen: