KR101165867B1 - 변형 부가닌 단백질, 그 세포독소 및 이의 생산방법과 용도 - Google Patents

변형 부가닌 단백질, 그 세포독소 및 이의 생산방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비변형 부가닌 단백질에 비하여 인간 T 세포를 활성화시키는 성향이 감소된 생물학적 활성을 가지는 부가닌 단백질의 변형된 형태를 제공한다. 본 발명은 또한 부가닌의 T-세포 항원결정인자 펩티드와 비변형 T-세포 항원결정인자 펩티드에 비하여 인간 T 세포를 활성화시키는 성향이 감소된 부가닌의 변형 T 세포 항원결정인자 펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 변형 부가닌 단백질에 부착된 암 세포와 결합하는 리간드를 가지고 있는 세포독소를 제공한다. 또한, 본 발명의 세포독소와 인간의 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 이용하여 포유동물의 암세포를 억제하거나 파괴하는 방법을 제공한다.
부가닌 단백질, 세포독소, 면역원성(immunogeniciity), 암치료

Description

변형 부가닌 단백질, 그 세포독소 및 이의 생산방법과 용도{Modified Bouganin proteins, Cytotoxins and Methods and Uses Thereof}
기술분야
본 발명은 암의 치료제로 유용한 변형 단백질을 포함하고 있는 변형 부가닌 단백질과 그 세포독소에 관한 것이다. 구체적으로는, 부가닌 세포독소의 면역원성( immunogeniciity)을 감소시키기 위해 T-세포의 항원결정인자(epitope)를 제거하거나 대체시키는 것에 관한 것이다.
배경기술
질병의 치료에 쓰이는 단백질의 치료효과는 치료 단백질에 대한 불필요한 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 마우스의 몇가지 단일클론 항체는 인간의 질병에 대한 치료제로서 가능성을 보여주고 있으나, 특정 사례에서는 인간의 항-생쥐 항체(human anti-murine antibody, HAMA) 반응의 정도가 매우 강해 치료제로서 이용할 수가 없다[Schroff, R. W. et al (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. et al (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. 이에 단일클론 항체에 대하여 HAMA 반응을 감소시키기 위한 기술이 많이 개발되고 있다[WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이는 일반적으로 재조합 항체 DNA의 최종구 성에서 인간의 유전정보를 증가시키는 반면 마우스의 유전정보를 감소시키는 방법으로 접근하여 왔다. 그럼에도 불구하고 "인체화된(humanised)" 항체 결과물은 아직 여러 사례에서 환자에게 면역 반응을 일으키고 있다[Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417-1420].
면역반응 유도의 열쇠는 T-세포 항원결정인자인 MHC 클래스 Ⅱ를 통해 T-세포의 활성을 촉진하는 펩티드의 단백질에 존재한다. 그러한 T-세포의 항원결정인자는 보통은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 특정 아미노산 잔기 서열로서 정의된다. 함축적으로 T-세포 항원결정인자는 T-세포 수용체(T-cell receptor, TCR)가 인식할 수 있도록 MHC 분자에 결합하는 항원결정기(항원결정인자)를 의미하고, 이는 적어도 이론적으로는 T-세포의 반응을 촉진하는 TCR을 조절하여 이러한 T-세포의 활성을 유도할 수 있다.
MHC 클래스 II 분자는 T-세포의 선택과 활성에서 중추적인 역할을 하는 매우 다형인(polymorphic) 단백질 그룹에 속한다. 인간의 백혈구 항원 그룹 DR (human leukocyte antigen group DR, HLA-DR)은 이러한 단백질 그룹에 현저한 동형(predominant isotype)이나, 동형 HLA-DQ 와 HLA-DP 는 유사한 기능을 수행한다. 인간은 개인마다, 2 내지 4의 DR 대립형질을 가지고 있고, 이는 2DQ 및 2DP 대립형질이다. 많은 수의 DR 분자의 구조는 용해되고 이는 펩티드의 소수성 잔기로 이루어진 많은 소수성 포켓을 가진 그루브(groove)에 결합하는 열린 말단 펩티드로서 나타난다 [Brown et al (1993) Nature 364: 33; Stern et al (1994) Nature 368: 215]. 클래스 Ⅱ 분자의 다른 동종이형(allotypes)을 구분하는 다형성(polymorphism)은 그루브(groove)에 결합하는 펩티드 안에서 펩티드의 다른 결합 표면에 폭넓은 다양성을 제공하고, 집단적 수준에서 외래 단백질을 동정하고 병원성 유기체에 면역반응을 일으키는 능력에 관련하여 최대한 유연성을 부여한다.
치료 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 Ⅱ 펩티드 제시(presentation) 경로를 통하여 진행된다. 여기서 외인성 단백질은 완전히 감싸져서 DR, DQ 또는 DP 타입의 MHC 클래스 II 분자와의 연합 하에 제시를 위하여 가공된다. MHC 클래스 II 분자는 특히 대식세포와 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포(professional antigen presenting cells, APCs)에 의하여 발현된다. T-세포의 표면에서 동족의 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체 처리는 CD4 분자와 같은 특정한 다른 공수용체(co-receptor)의 교차 결합(cross-binding)과 함께 T-세포에서 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 항체를 생산하는 B 세포와 같은 림프구를 더 활성화시키거나 전체 면역 반응으로서 T-킬러 세포를 활성화시키는 사이토카인의 분비를 유도한다.
T-세포 항원결정인자의 동정을 위하여 WO98/52976; WO00/34317; WO02/069232; WO02/079232 및 WO02/079415 에서 보이는 바과 같이 첫번째 단계로 항원결정인자를 제거하는데, 흥미 있는 단백질 내에서 적절한 아미노산 치환으로 거된다는 것을 예측할 수 있다. 또한, 컴퓨터 기술은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 합성 펩티드의 능력을 실험실 내에서 측정하는 방법을 제공한다. 예를 들어 MHC 클래스 II 결합 표면의 소스(source)로서 동종이형의 MHC의 B-세포주를 이용하고 이는 MHC 클래스 Ⅱ 리간드 동정에도 적용될 수 있다 [Marshall K.W. et al. (1994) J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan et al (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. et al (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. 그러나, 이러한 기술은 MHC 동종이형의 넓은 다양성에 대한 복합적이고(multiple) 잠재적인 항원결정인자를 스크리닝하거나, T-세포 항원결정인자로서 펩티드에 결합하는 능력을 확인할 수는 없다.
합성 펩티드에서 재조합 MHC 분자의 녹을 수 있는 복합체를 탐색하는 기술도 또한 이용되고 있다[Kern, F. et al (1998) Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. et al (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. 이러한 시약과 과정은 인간이나 실험 동물 재료의 말초 혈액 샘플에서 T-세포 클론의 존재를 동정하는 데 이용되고, MHC 동종이형의 넓은 다양성에 대한 복합적 잠새적 항원결정인자에 대하여는 적용되지 않는다.
T-세포 활성에 대한 생물학적 분석으로 면역 반응을 유발할 수 있는 검사(test) 펩티드/프로테인 서열의 능력을 실질적으로 읽을 수 있다. 이러한 접근의 예로, 박테리아 단백질 스타필로키나아제(staphylokinase)에 대한 T-세포 증식을 분석하고, 다음으로 T-세포주를 자극하는 합성 펩티드를 이용하여 항원결정인자를 맵핑한 Petra et al 의 연구가 있다 [Petra, A.M. et al (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. 유사하게, 파상풍 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T-세포 증식 분석에서는 독소의 면역지배적 항원결정인자 영역의 정의를 이끌어 냈다[Reece J.C. et al (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. WO99/53038는 인간 면역 세포에 서 분리된 서브-세트(sub-sets)를 이용하여 검사 단백질에서 T-세포 항원결정인자를 결정할 수 있음을 보이는데, 이는 목적하는 합성 펩티드 존재하에 시험관 내 분화와 배양을 촉진하고 배양된 T-세포에서 유도된 증식을 측정하는 것이다. 동일한 기술이 Stickler et al. 에 의해서도 기술되었다 [Stickler, M.M. et al (2000) J. Immunotherapy 23:654-660], 상기 두 가지 예는 모두 박테리아 서브틸리신(subtilisin)의 존재하에 T-세포 항원결정인자의 감지에 적용된다. 그러한 기술을 세포 분리 기술과 원하는 면역 세포 서브-세트(수지상 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포)를 획득하기 위한 복합적(multiple) 사이토카인을 공급한 세포 배양에 적용할 때에는 주의를 요하고, 이는 복합적 공여체(donor) 샘플을 이용한 빠른 스루풋(through-put) 스크리닝에 도움이 되지 않는다.
또한, 최근에는 T-세포 증식 분석에 기초한 개체군(population)을 이용하고 항원결정인자가 제거된 단백질의 디자인에서 MHC 결합 단백질의 컴퓨터 가상(in silico) 시뮬레이션이 개발되어[WO 03/104803], 이들을 조합한 접근이 이루어 지고 있다.
상기한 바와 같이 그 결과로서, 치료적으로는 중요한 가치가 있으나 면역원성을 가지고 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 부인 T-세포 항원결정인자를 동정하여 제거하거나 적어도 감소시키는 것이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 인간 질병 치료의 의도로 알려진 가용성 단백질이 가용성 단백질 에 결합하는 숙주 항체를 만들어 내는 면역반응을 유발할 수 있다는 사실을 극복하기 위한 것이다. 본 발명은 이러한 면역 반응을 유발하는 성향을 감소시킨 부가닌 단백질을 제공한다. 여기에 기술된 방법에 따라, 본 발명자들은 상기 단백질의 면역 반응을 유발하는 결정적인 T-세포 항원결정인자를 포함하는 부가닌 분자 영역을 확인하고 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 양태는 면역 반응 유발 감소 성향을 가진 변형 부가닌 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 변형 부가닌은 T-세포 항원결정인자에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 T-세포를 활성화하는 성향을 감소시킨 것이다. 보다 구체적으로, T-세포의 항원결정인자는 하기 a), b) 및 c)로 이루어진 그룹에서 선택한다.
a) AKVDRKDLELGVYKL (항원결정인자 영역 R1, 서열번호: 2),
b) LGVYKLEFSIEAIHG (항원결정인자 영역 R2, 서열번호: 3); 및
c) NGQEIAKFFLIVIQM (항원결정인자 영역 R3, 서열번호: 4).
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 변형 부가닌 단백질에 부착된 표적화 부 위(targeting moiety)를 포함하는 세포독소에 관한 것이다. 구체적으로, 표적화 부위는 암 세포에 결합하는 리간드이다. 보다 구체적으로, 상기 리간드는 암 세포에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 보다 더 구체적인 양태로, 상기 항체는 Ep-CAM 또는 종양관련항원(tumor-associated antigen)을 인식한다. 가장 구체적인 양태로, 본 발명은 VB6-845 또는 VB6-011을 포함하는 세포독소를 제공한다..
본 발명은 또 다른 양태로, 암 세포에 본 발명의 세포독소를 투여하는 것을 포함하는 암 세포를 억제하거나 파괴하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요에 따라 동물에게도 본 발명의 세포독소를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
더 나아가, 부가닌의 T-세포 항원결정인자를 동정하는 단계, T-세포를 활성화하는 성향을 감소시킨 변형을 부가닌을 제조하기 위해 T-세포 항원결정인자에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 변형하는 단계; 변형 부가닌에 부착된 암-결합 리간드를 가진 세포독소를 제조하는 단계; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제에 세포독소를 현탁하는 단계를 포함하는 암을 가진 동물을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로는, 본 발명의 세포독소와 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암을 가진 동물을 치료하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포독소, 조성물 및 방법은 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암(head and neck cancer), 방광암, 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암(small cell and non small cell lung cancer), 육종(sarcomas), 신경아교종(gliomas), T-세포 림프종 및 B-세포 림프종 등 다양한 형태의 암을 치료하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 부가닌 단백질의 T-세포 항원결정인자 펩티드와 본 발명의 변형된 T-세포 항원결정인자 펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 특징과 이점은 이하의 상세한 설명에 의하여 명백해질 것이 다. 그러나, 발명의 바람직한 양태를 나타내기 위한 상세한 설명과 실시예는 단지 예시에 불과하고, 상세한 설명으로부터 본 발명의 발명의 사상과 영역안에서의 다양한 변형과 수정은 당업자에게 자명할 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 이제 다음의 도면과 관련하여 설명되어질 것이다.
도 1 에서는 T-세포 항원결정인자 결핍 변형 부가닌 단백질 Bou156 (패널 A) 및 Bou157 (패널 B)에 대한 활성도 분석 결과를 보인다. Bou156 은 치환기 V123A, D127A, Y133N 및 I152A 를 포함하고, Bou157 는 치환기 V123A, D127A, Y133Q 및 I152A를 포함한다. 양쪽의 분석 세트는 대조군으로 야생형 단백질과 능력을 상실한(disabled) 변형 부가닌(Y70A)을 사용하여 수행하였다. 활성도는 %측정 루시퍼라아제 활성도 대 부가닌 단백질의 농도로 표현하였다.
도 2 에서는 3개의 합성 펩티드와 2개의 다른 PMBC 공여체 샘플에 대한 T-세포의 증식율 분석 결과를 보인다. 지정된 펩티드 DeI-41, DeI-44 및 DeI-50를 1μM 최종 농도(패널 A) 와 5μM 최종 농도(패널 B)로 검사하였다. 이러한 펩티드는 부가닌 분자의 면역원성 영역에서 유래하였고, 면역원성을 제거하기 위하여 디자인된 치환기를 포함하고 있다.
도 3 에서는 Fab 항-Ep-CAM 를 가지고 있는 변형 부가닌 세포독소 VB6-845를 보인다. 여기서 드-부가닌(de-bouganin, Bou156) 퓨린 연결부(furin linker)를 통 해 CH 영역의 C-말단에 연결되어 있다. 도 3A 에서는 프로서열(pro-서열)을 암호화하는 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 3B 에서는 프로서열의 코딩서열(서열번호:15)과 아미노산 서열(서열번호:16)을 암호화하는 핵산을 보이며, 도 3C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된(assembled) VB6-845 단백질을 보인다.
도 4 에서는 발현 벡터 pING3302 의 지도를 보인다. 삽입부(Insert)는 EcoRI 와 XhoI 의 절단 부위를 이용하여 3302벡터에서 연결하였다.
도 5 에서는 식물 독소, 드-부가닌(de-bouganin, VB5-845)이 없는 대조군 Fab 항-Ep-CAM 구조를 보인다. 도 5A 에서는 프로서열을 암호화하는 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 5B에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:17) 및 아미노산 서열(서열번호:18)을 보이며, 도 5C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB5-845 단백질을 보인다.
도 6 에서는 Fab 항-Ep-CAM 드-부가닌(de-bouganin) 구조, VB6-845-CL-드-부가닌을 보인다. 여기서 Bou156은 CL 영역의 C-말단에 연결되어 있다. 도 6A 에서는프로서열을 암호화하는 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 6B 에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:19) 및 아미노산 서열(서열번호:20)을 보이며, 도 6C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-CL-드-부가닌 단백질을 보인다.
도 7 에서는 Fab 항 Ep-CAM, 드-부가닌(de-bouganin)구조, VB6-845-NVH-드-부가닌을 보인다. 여기서 Bou156 은 VH 영역의 N-말단에 연결되어 있다. 도 7A 프로 서열을 암호화하는 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 7B 에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:21) 및 아미노산 서열(서열번호:22)을 보이며, 도 7C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-NVH-드-부가닌 단백질을 보인다.
도 8 에서는 Fab 항 Ep-CAM 드-부가닌(de-bouganin)구조, VB6-845-NVL-드-부가닌을 보인다. 여기서 Bou156 은 VL영역의 N-말단에 연결되어 있다. 도 8A에서는 프로서열을 암호화하는 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 8B 에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:23) 및 아미노산 서열(서열번호:24)을 보이며, 도 8C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-NVL-드-부가닌 단백질을 보인다.
도 9 에서는 실험실 저울에서 유도된 E104 세포의 상층액에서 VB6-845 (도 3의 구조)와 VB6-845-CL-드-부가닌(Bou156)(도 6의 구조)의 발현을 웨스턴 블롯으로 보인다.
도 10 에서는 흐름세포측정(flow cytometry) 반응성 연구 결과를 보인다. 도 10A 에서는 Ep-CAM-양성 세포주 CAL 27 과 OVCAR-3 및 Ep-CAM-음성 세포주 A-375 에서 VB6-845(도 3의 구조)와 VB6-845-CL-드-부가닌(도 6의 구조)의 반응성을 보이는 반면, 도 10B 에서는 VB6-845(도 3의 구조) , VB6-845-겔로닌(도 14C의 구조)과 대조군(PBS)으로 수행한 동일한 검사의 결과를 보인다.
도 11 은 NIH:OVCAR-3 세포에서 VB6-845 과 프록시니움(ProxiniumTM)의 경쟁적 분석 결과를 보이는 그래프이고, 이에 대하여는 실시예 7에서 기술하고 있다.
도 12 는 실시예 7일 무세포 분석(cell free assay)의 결과를 보이는 그래프이다.
도 13 에서는 실시예 8에서 CAL 27(도 13A)과 NIH:OVCAR3 (도 13B) 세포에서 VB6-845 (도 3의 구조), VB6-845-CL-드-부가닌(도 6의 구조) 및 드-부가닌(Bou156)의 세포독성을 비교한 MTS 세포독성 분석 결과를 보인다.
도 14A 와 B에서는 실시예 8에서 CAL 27(도 14A)과 NIH:OVCAR3 (도 14B) 세포에서 VB6-845 (도 3의 구조),VB6-845-겔로닌(도 14C의 구조) 및 겔로닌의 세포독성을 비교한 MTS 세포독성 분석 결과를 보인다. 도 14C 에서는 VB6-845-겔로닌 구조의 핵산 코딩서열(서열번호:25)과 아미노산 서열(서열번호:26)을 보인다.
도 15 에서는 VB6-011의 프로서열의 핵산 코딩서열(서열번호:27)과 아미노산 서열(서열번호:28)을 보인다.
도 16 에서는 MB-435S 세포에서 VB6-011의 세포독성을 보이는 실시예 9의 MTS 세포독성 분석의 결과를 보인다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 부가닌에서 T-세포 항원결정인자를 동정하고, 비변형 부가닌 단백질에 비하여 인간 T 세포를 활성화하는 성향이 감소된 변형 부가닌 단백질을 디자인하여 만들었다.
(A) 변형 부가닌 단백질
본 발명은 비변형 부가닌 단백질에 비해 면역 반응 유발 성향을 감소시키기 위해서 변형된 부가닌 단백질에 관한 것이다. 바람직하게 상기 면역 반응은 T-세포 반응이다. 성숙한 부가닌 단백질은 분자무게가 약 26,200Da 인 250 아미노산의 단일 폴리펩티드이다[Den Hartog et al (2002) Eur. J. Biochem. 269: 1772-1779; US Patent No. 6,680,296]. 부가닌은 식물 부게인빌레아 스펙타빌리스 윌드(Bougainvillea spectabilis Willd) 에서 분리된 타입1 리보솜 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein, RIP)이다[Bolognesi et al (1997) Planta 203: 422-429]. 식물에서 유래한 RIP는 세포의 대부분의 리보솜 RNA에 퓨린계가 없는 RNA N-글리코시다아제(N-glycosidases)이고, 이는 리보솜을 손상시켜 단백질 합성이 중단되고 세포사에 이르게 한다. .
성숙한 부가닌 단백질의 아미노산 서열(1문자 코드로 표현)은:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK [서열번호. 1]이다.
본 발명에서 "비변형 부가닌 단백질" 이라 함은 면역 반응을 유발하는 성향을 감소시키기 위하여 변형되지 않은 부가닌 단백질을 말한다. 야생형 또는 비변형부가닌의 서열은 서열번호:1에서 보인다. 그러나, "비변형 부가닌"은 면역 반응을 유발하는 성향이 감소되지 않은 변형인 서열번호:1의 변형 또한 포함한다. 서열번 호:1에 가해질 수 있는 변형의 예로 단백질의 면역원성을 감소시키지 않는 펩티드 단편과 보존적 아미노산의 치환을 포함한다.
본 발명에서 "변형 부가닌 단백질"이라 함은 상기 비변형 부가닌 단백질과 비교하여 변형된 부가닌 단백질로 상기 변형은 면역 반응을 유발하는 성향이 감소된 것을 말한다. 변형 부가닌 단백질은 또한 면역성이 제거된(deimmunized) 부가닌일 수 있다. "변형 부가닌 단백질"은 변형된 전체 길이 서열(full length sequence)이나 비변형 부가닌 단백질의 변형 단편일 수 있다. 또한, "변형 부가닌 단백질"은 펩티드의 면역원성을 바꾸지 못하는 야생형 부가닌 서열과 비교하여 다른 변경이 있는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형 부가닌 단백질은 비변형 부가닌과 동일한 생물학적 활성을 가질 것이다.
본 발명에서 "면역 반응 유발이 감소된 성향" 이라 함은 변형 부가닌 단백질이 비변형 부가닌 단백질에 비하여 면원원성이 적은 것을 의미한다.
본 발명에서 "면역 반응"이라 함은 세포와 체액의 면역 반응을 포함한다. 바람직한 양태로, 변형 부가닌은 T-세포를 활성화하는 것이 감소된 성향을 가진다.
본 발명에서 "T-세포를 활성화하는 것이 감소된 성향" 이라 함은 변형 부가닌 단백질이 비변형 부가닌 단백질에 비하여 인간 T-세포를 활성화하는 것이 감소된 성향을 의미한다. 부가닌 단백질의 자극 지수(stimulation index)를 평가하는 것을 포함하는 당해 분야에서 알려진 분석법을 이용하여 부가닌 단백질의 T-세포를 활성화하는 성향이 감소되었는지 여부를 검사할 수 있다.
상기 "자극 지수"라 함은 변형 또는 비변형 부가닌 단백질의 인간 T-세포를 활성화하는 능력의 수치를 의미한다. 예를 들면, 변형 또는 비변형 부가닌 단백질이나 이들의 펩티드가 시험관 내에서 배양한 인간 T-세포에서 증식 반응을 일으키는 능력을 검사할 수 있다. 이러한 유형의 접근은 건강한 공여체에서 얻은 순수한 인간 T-세포를 이용하여 수행하고, 본 발명자들은 이러한 분석을 통하여 2.0과 같거나 그보다 큰 자극 지수를 유발된 증식의 유용한 치수로 확립하였다. 자극 지수는 일반적으로 검사 펩티드에 접촉되지 않은 세포에서 측정된 기록으로 검사 펩티드로 측정된 증식 기록(예를 들어, 3H-티미딘(thymidine) 혼합(incorporation)을 사용한다면 방사능의 분당(per minute) 계수)을 나누어서 구한다.
본 발명은 하나의 양태로, 생물학적 활성으로 가지고 비변형 부가닌 단백질에 비하여 인간 T-세포를 활성화하는 성향이 감소된 변형 부가닌 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로는, 비변형 부가닌 단백질에 비하여 인간 T 세포를 활성화하는 성향이 감소되고, 비변형 부가닌 단백질에 비하여 생물학적 활성이 낮은 변형 부가닌 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 양태로는, 인간 T 세포를 활성화하는 성향이 감소되고 생물학적 활성이 없는 변형 부가닌 단백질을 제공한다. 예를 들어, 그러한 변형 단백질은 대조군으로 사용하거나 대상을 내성화(tolerize)하는 분석에 사용할 수 있다.
본 발명에서 "생물학적 활성"이라 함은 리보솜에서 단백질 합성을 방해하는 변형 또는 비변형 부가닌 단백질의 능력을 의미하고, 이는 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 비록 비변형 부가닌 단백질보다 생물학적 활성이 낮을 지라도 변형 부가닌 단백질이 여전히 생물학적 활성을 가진다는 것은 주목할 만하다. 그러나, 감지할 수 있을 수준 만큼의 활성을 가질 필요는 있다. 예를 들면, 변형 또는 비변형 부가닌 단백질의 생물학적 활성은 그들의 N-글루코시다아제(N-glycosidase) 활성을 동정하는 것에 의하여 평가될 수 있고, 구체적으로 단백질 번역을 현저하게 방해하는 충분한 능력에 의하여 평가될 수 있다. 하나의 적절한 분석법으로는 무세포 단백질 합성 분석에서 비변형 부가닌에 비하여 다양한 부가닌 단백질의 활성을 검사하는 것이 있다. 메티오닌을 포함한 짝지어진 전사/번역 혼합물(Coupled Transcription/Translation mix), 레포터(reporter) 단백질 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA와 비변형 또는 변형 부가닌 단백질의 계단 희석액(serial dilution)을 동시에 항온처리하였다. 루시퍼라아제의 번역 수준은 기질 시약을 첨가한 후 발광 계수기(luminescence counter)를 이용하여 쉽게 감지하였다. 측정된 발광은 반응에서 존재하는 부가닌 N-글리코시다아제의 활성에 반비례하였다. 일반적으로 Y70A 치환기를 포함하는 불활성화 부가닌 단백질과 같은 음성 대조군을 제공한다.
바람직한 양태로, 변형 부가닌 펩티드는 부가닌 단백질 서열의 하나 또는 그 이상의 T-세포 항원결정인자가 변형된 것이다.
본 발명에서 "T-세포 항원결정인자"라 함은 주된 조직적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 II에 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/있거나 또한, MHC 클래스 II를 가진 복합체에서 (활성 측정 필요 없이) T-세포에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.
하나의 양상으로, 본 발명에서 변형 T-세포 항원결정인자를 포함하는 변형 부가닌 단백질을 생산하는데 사용될 수 있는 일반적인 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 상기 단백질의 아미노산 서열 또는 이들의 일부분을 결정하는 단계;
(ii) 시험관 내(in vitro) 또는 컴퓨터 가상실험(in silico) 기술이나 생물학적 분석을 이용하여 MHC 분자의 펩티드의 결합의 결정 방법에 의하여 상기 단백질의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 잠재적인 T-세포 항원결정인자를 동정하는 단계;
(iii) 시험관 내 또는 컴퓨터 가상실험 기술이나 생물학적 분석을 이용하여 펩티드가 MHC 분자에 결합하는 것에 의하여 결정되는 T-세포 항원결정인자의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방법으로 변형된 잠재적 T-세포 동정에 의해 하나 또는 그 이상의 아미노산의 새로운 서열 변이체를 디자인하는 단계; 상기 서열 변이체는 그러한 새로운 잠재적 T-세포 항원결정인자가 T-세포 항원결정인자의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방법에 의하여 차례로 변형되지 않는다면, 서열 변이체에 의하여 새로운 잠재적 T-세포 항원결정인자를 만드는 것을 회피하는 방법에 의하여 만들어 진다.
(iv) 재조합 DNA 기술에 의하여 그러한 서열 변이체를 만들고 상기 서열변이체를 잘 알려진 재조합 기술에 따라 원하는 성질을 가진 하나 또는 그 이상의 변이체를 동정하기 위하여 검사하는 단계; 및
(v) (ii) 내지 (iv)를 선택적으로 반복하는 단계
하나의 예로, 단계(iii)는 비변형 부가닌 단백질에서 T-세포 항원결정인자의 어느 아미노산 잔기를 치환, 부가 또는 제거하여 수행한다. 또 다른 예로는, 변형 부가닌 단백질을 만드는 방법은 상동 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 가상실험 모델을 참고하여 만든다.
단계(ii)에 따른 잠재적 T-세포 항원결정인자의 동정은 당해 기술분야에서 이미 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; WO 02/069232 에 기술되어 있고 MHC 클래스 II 분자 유래 펩티드에 부가닌이 결합하는 성향을 동정하는 데 이용할 수 있다. 생물학적으로 관련된 펩티드를 동정하기 위해서, 본 발명자들은 생체 밖(ex vivo)에서 인간 T-세포 증식 분석을 조사하는 접근법을 계발하였다. 이러한 접근은 특별히 효과적인 방법이라는 것이 증명되었고 전체 부가닌 서열을 조사하고 검사하기 위한 계획에서 부분적으로 일치하는(overlapping) 부가닌 유래 펩티드 서열을 검사하는 것을 포함한다. 상기 합성 펩티드가 시험관 내에서 배양된 인간 T-세포의 증식 반응을 유발하는 능력을 검사한다. 이러한 타입의 접근은 건강한 공여체로 부터 얻은 순수한 인간 T-세포를 이용하여 수행하였고, 본 발명자들은 증식 유발에 유용한 측정치로 2.0 과 동일하거나 더 큰 자극지수를 성립하였다. 자극 지수는 일반적으로 검사 펩티드에 접촉되지 않은 세포에서 측정된 기록으로 검사 펩티드로 측정된 증식 기록(예를 들어, 3H-티미딘(thymidine) 혼합(incorporation)을 사용하는 경우 방사능의 분당(per minute) 계수)을 나누어서 구한다.
따라서, 본 발명에서는 89개의 합성 15-mer 펩티드(표 1에서 나열한 바와 같이)를 순수한 공여체의(예를 들면, 부가닌에 대한 감수성이 알려지지 않은) 표재성 혈액 단핵 세포의 T-세포 증식 분석에 사용하였다. 20개의 공여체 PBMC 샘플을 MHC 클래스 II 동종이형(allotype)의 최적의 적용범위를 획득하기 위하여 선택하였다. PBMC는 증식을 3H-티미딘 혼합으로 평가하기 전에 7일 동안 3번(in triplicate)의 항온처리에서 각각의 펩티드로 자극하였다. 모든 펩티드는 2개의 다른 농도 1μM 과 5μM 로 희석하였다. 자극 지수(stimulation indices, SI)는 세포 내로 혼합된 3H의 양을 가상으로 자극한 대조군 내로 혼합된 3H양으로 나누어 계산하였다.
이러한 방법으로 인간의 부가닌 분자의 대부분의 면역원성 영역을 동정하였다. 따라서, 특별한 양태로, 변형 부가닌 단백질은 하기의 a),b) 및 c)로 구성된 그룹에서 선택된 T-세포 항원결정인자에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형된 것이다.
a) AKVDRKDLELGVYKL, 항원결정인자 영역 R1 (서열번호:2);
b) LGVYKLEFSIEAIHG, 항원결정인자 영역 R2 (서열번호:3); 및
c) NGQEIAKFFLIVIQM, 항원결정인자 영역 R3 (서열번호:4).
이러한 T-세포의 항원결정인자는 두 개 또는 그 이상의 공여체 PBMC 샘플에서 주어진 SI>2 를 기초로 식별되어 진다. 상기 알려진 펩티드 서열은 이러한 항원결정인자를 포함하는 변형 부가닌의 구조에 요구되는 중요한 정보를 나타낸다.
본 발명의 한 양태에서, 변형 부가닌 단백질은 적어도 하나의 T-세포 항원결 정인자가 제거된 것이다. 본 발명의 다른 양태에서, 변형 부가닌 단백질은 하나, 둘 또는 셋의 T-세포 항원결정인자가 제거된 것이다. 본 발명은 또한 1 내지 9 아니노산 잔기, 바람직하게는 T-세포 항원결정인자가 변형된 변형 부가닌 단백질을 예상한다. 본 발명의 또 다른 양태로는, 1 내지 5 아니노산 잔기가 변형된 것이다. 본 발명에서 "변형된"이란 아미노산 잔기가 치환, 부가 또는 제거에 의하여 변형된 것으로, 바람직하게는 치환된 것이다. 그러나, 부가닌 단백질은 인간 T 세포를 활성화하는 성향이 감소된 것이다. 또 다른 양태의 변형 부가닌 단백질은 생물학적 활성을 가진다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 변형 부가닌 단백질은 상기 서열(a),(b) 또는 (c)에서 특이적인 아미노산 중 어느 하나에 대응하는 위치에서 치환되어 변형된 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 결합을 제거하거나 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키는 변형된 항원결정인자 R1 - R3 중 어느 하나에서 MHC 클래스 II 리간드가 식별된 부가닌 단백질을 포함한다. 결합을 제거하거나 팹티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 수를 감소시키는 R1 내지 R3 영역의 아미노산은 치환, 부가 또는 제거에 의하여 변형될 수 있다.
T-세포 항원결정인자의 제거에 있어서, 아미노산 치환은 T-세포 항원결정인자의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 달성할 것으로 예상되는 펩티드 서열의 적절한 위치에서 이루어진다. 관행적으로 적절한 위치는 하나의 양태로 MHC 클래스 Ⅱ 결합 그루브(groove)에서 제공되는 포켓(pocket) 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 동등할 것이다.
하나의 양태로, 펩티드의 P1 또는 P1 고정 위치(anchor position)라 불리우는 갈라진 틈(cleft)의 첫번째 포켓에서 결합이 변형된다. 펩티드의 P1 고정 잔기(anchor residue)와 MHC 클래스 Ⅱ 결합 그루브의 첫번째 포켓 사이의 결합작용의 질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화성의 주된 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이 위치에서 적절한 치환은 포켓 안에서 덜 쉽게 수용된 잔기에서 이루어질 것이다. 예를 들면 더 소수성인 잔기에 대한 치환이다. MHC 결합 틈안의 다른 포켓 영역에 동등한 위치에서 펩티드 안의 아미노산 잔기 또한 고려되어 본 발명의 영역 내에 있다.
주어진 잠재적 T-세포 항원결정인자에서 단일 아미노산의 치환, 삭제 또는 부가는 항원결정인자가 제거되는 바람직한 루트(route)이다. 단일 항원결정인자에서 변형의 조합(예를 들어, 치환, 삭제와 부가)이 예상되는데 예를 들어 특히 개별적으로 정의된 항원결정인자는 5 잔기에서 항원결정인자 R1 과 R2 의 일부분이 중복되는 경우에 각 부분에서 중복부분이 적절하다. 게다가, 주어진 항원결정인자에서 단일 아미노산 변형 또는 단일 항원결정인자의 조합에서 변형은 MHC 클래스 Ⅱ 결합 그루브에 관하여 "포켓 잔기"에 대등하지 않은 위치에서, 그러나 펩티드 서열의 어떤 위치에서 만들어 진다. 변형은 상동 구조나 당해 기술분야에서 알려진 컴퓨터 가상실험 기술을 이용하여 생산된 구조적 방법을 참고하여 만들 수 있고, 본 발명에 따라 분자의 알려진 구조적 특징에 기초하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 있다.
부가닌의 항원결정인자 영역 R1-R3 는 각각의 서열에 둘러싸인 MHC 클래스Ⅱ 리간드의 지표로 분석하였다. 이 분석에는 WO 98/59244 과 WO 02/069232 에서 개요가 기술되어 있는 소프트웨어 툴(tool) 조사 계획을 이용하였다. 상기 소프트웨어는 어느 주어진 펩티드 서열에 대한 결합 수치를 제공하는 펩티드 MHC 클래스 II 결합 작용의 수준에서 항원 제시 과정을 촉진한다. 이러한 수치는 집단 내에 존재하는 다수의 우세한 MHC 클래스 II 동종이형에 의하여 결정된다. 이러한 계획으로 어떠한 펩티드 서열도 검사할 수 있으므로, MHC 클래스 II 결합 그루브와 상호 작용하는 펩티드의 능력에 관하여 아미노산 치환, 부가 또는 제거의 결과를 예측할 수 있다. 결과적으로 면역원성 T-세포 항원결정인자로서 기능을 하는 MHC 클래스 II와 상호작용할 수 있는 펩티드의 수를 감소시켜 새로운 서열 구성을 디자인할 수 있다.
본 발명의 한 양태로 이러한 계획 하에서 항원결정인자 영역 R1에서 치환은 위치 V123, D127 및/또는 E129에서 변화를 포함한다. 유사하게도 항원결정인자 영역 R2에서, 치환의 하나의 양태는 위치 Y133에 있다. 이러한 잔기는 R1 과 R2 사이에서 일부 중복되는 영역이 된다. Y133에서 치환은 MHC 클래스 II 리간드와 연관된 R2를 제거하는 데 충분하고 MHC 클래스 II 리간드와 연관된 R1을 자연히 제거하는 데는 충분하지 아니하다. 항원결정인자 영역 R3에 대하여는 본 발명의 하나의 양태로 치환은 잔기 E151 및/또는 I152에서 이루어진다.
모든 예에서 치환기는 하나 또는 그 이상의 대체적인 아미노산 잔기이다. MHC II 자극 소프트웨어에 의한 R1의 분석은 아미노산 잔기 123, 127, 129 및 131 가 MHC II 분자에 결합하기 위하여 이러한 항원결정인자에서 중요한 잔기(key residues)가 된다는 것을 나타내었다. 잔기 123은 활성 위치로 부터 떨어진 분자 표면이고 RIP 서열 정렬이 다양하므로 R1 영역의 돌연변이에 있어서 바람직한 위치이다. 그럼에도 불구하고, 모든 치환이 활성화 분자를 생산하는 것은 아니므로 생활성 분석에서 돌연변이를 검증할 필요가 있다. 그래서 R1의 에를 들면, V123T, V123A 및 V123Q 의 치환은 바람직한 대체적 치환의 예가 될 수 있다. 잔기 131은 RIP에서 절대적으로 보존되어 발견되었고, 따라서 이는 돌연변이에 안정적이지 못한 것 같다. 잔기 127 및 129는 매우 보존되지는 않지만 제한된 수의 잔기만이 MHC II 결합에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 치환 세트: D127G, D127A, E129Q 및 E129G 또한 바람직한 치환이다. R2에 있어서, 잔기 133은 MHC II 결합을 파괴하는 후보기(candidate) 처럼 보였고 RIP를 가로질러 매우 보존되어 있지 않다는 사실과 연합된 그것의 외견상 표면 위치선정(localization)(모델링에 의하여 결정되는)은 이를 돌연변이에 대하여 좋은 후보기로 만든다. 바람직한 대체적 치환기는 Y133N, Y133T, Y133A, Y133R, Y133D, Y133E, Y133Q, Y133G, Y133K, Y133H 및 Y133S 라는 것이 확인되었다. R3에 대하여, 아미노산 잔기 152, 155 및 158은 MHC II 결합에 중요한 잔기(key residues)인 것이 확인되었다. 그러나, 잔기 155 및 158는 매우 보존된 소수성 스트레치(stretch)의 부분이고 그래서 그들의 돌연변이는 생활성 분자를 만들지 않는다. 불충분하게 보존된 잔기가 더 후보기(candidate)가 될 수 있다는 것을 확인하였다. R3 에 대하여는, 치환 세트: I152Q 및 I152A 또한 바람직한 치환기이다.
따라서, 본 발명은 다음의 X1, X2, X3, X4 또는 X5의 하나 또는 그 이상에서 변형된 변형 부가닌 단백질을 제공한다.
a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (항원결정인자 영역 R1, 서열번호:5);
b) LGVX4KLEFSIEAIHG (항원결정인자 영역 R2, 서열번호:6); 및
c) NGQEX5AKFFLIVIQM (항원결정인자 영역 R3, 서열번호:7)
여기에서 상기 X1 내지 X5 는 임의의 아미노산일 수 있다.
특별한 양태로, X1 은 T, A 또는 Q; X2 는 G 또는 A; X3 는 Q 또는 G; X4 는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S; 및 X5 는 Q 또는 A (항원결정인자 영역 R1, 서열번호:8; 항원결정인자 영역 R2, 서열번호:9; 항원결정인자 영역 R3, 서열번호:10)이다.
가장 바람직한 치환 세트는 생체 밖에서(ex vivo) T-세포 분석, 컴퓨터 가상실험에서 MHC 펩티드 결합 자극와 서열 상동성 분석으로 구조적 고려를 이용한 면역원성 항원결정인자 맵핑(mapping) 연구에 기초하여 수집할 수 있다. 결과적으로 생활성 단백질이 바람직하다면, 시험관 내에서 활성 분석은 하나 또는 다수의 돌연변이를 포함하는 변형 단백질에 대하여 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 양태로 아미노산 서열: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDK WDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX 1 DRKX 2 LX 3 LGVX 4 KLEFSIEAIHGKTINGQE
X 5 AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK 를 포함하는 변형 부가닌 펩티드를 제공한다.
여기에서 상기 X1 내지 X5 는 임의의 아미노산 일 수 있다 (서열번호:11).
바람직한 양태로, X1 은 T, A 또는 Q; X2 는 G 또는 A; X3 는 Q 또는 G; X4 는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S; 및 X5 is Q 또는 A (서열번호: 12).
변형 부가닌 단백질은 특별한 양태로 아미노산 서열: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAK A DRK A LELGV N KLEFSIEAIHGKTINGQE A AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK (서열번호:13)를 포함한다.
변형 부가닌 단백질은 또 다른 양태로 아미노산 서열: YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAK A DRK A LELGV Q KLEFSIEAIHGKTINGQE A AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK (서열번호:14)을 포함한다.
밑줄 그은 잔기는 비변형 부가닌 단백질과 다른 치환된 잔기이다.
당해 기술분야의 숙련된 기술자에게 자명한 것으로, 변형의 복수의 대체 세 트는 바람직하지 않은 곳에서 항원결정인자가 제거되는 현상이 일어날 수 있다. 그러나 결과적인 서열은 여기서 알려진 특별한 단백질과 넓은 범위에서 상동으로 존재하여 본 발명의 영역 하에 있을 수 있다. 본 발명에 의해 알려진 서열에 명백한 화학적 등가물 또한 본 발명의 범위 내이다. 그러한 등가물은 실질적으로 동일한 방법으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 단백질을 포함한다.
본 발명의 변형 부가닌 단백질의 다른 양태로 상기 단백질은 T-세포 항원결정인자의 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 변형을 가진다.
본 발명의 변형 부가닌 단백질의 추가적 양태로, T-세포 분석으로 검사할 때 비변형 부가닌 단백질에 비하여 자극 지수의 감소를 유발한다.
본 발명의 부가닌 단백질의 또 다른 양태로, 부가닌 단백질의 T-세포 항원결정인자를 T-세포 분석을 이용하여 맵핑한 후, T-세포 분석으로 다시 검사하면 변형 부가닌 단백질의 자극 지수는 비변형 부가닌 단백질 보다 작은 지수, 바람직하게는 2.0 보다 작은 자극 지수가 유발된다.
변형 부가닌 단백질의 생물학적 활성이 실질적으로 감소되거나 제거되면, 변형 부가닌 단백질의 생물학적 활성을 복구하기 위해 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 제거에 의한 변형이 더 필요하다는 것은 당해 분야의 숙련된 기술자에게 자명할 것이다. 그러나, 실질적으로 생물학적 활성이 감소되거나 생물학적 활성을 가지지 않는 그러한 변형 부가닌 단백질 또한 본 발명의 범위 내에 있으며 분석이나 내성화에 있어서 대조군으로 사용된다.
변형 부가닌의 하나의 양태로는, 불활성화 부가닌을 생산하는 위치 70 티로 신 잔기에서 돌연변이 된 것이다. 특수한 양태로는, 위치 70의 티로신이 알라닌으로 대체된다. 변형 부가닌의 바람직한 양태로는 서열:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK [서열번호. 129]를 가진다.
본 발명의 계획하에서, 항원결정인자는 결과적으로 더 이상 T-세포 항원결정인자로서의 기능을 할 수 없는 서열로 돌연변이 된다. 표적 서열의 직접적인 돌연변이 유발을 획득하기 위해서 재조합 DNA 방법과 당해 기술분야에서 이용가능하고 잘 알려진 많은 기술을 이용하는 것이 가능하다. 실제로 다수의 변형 부가닌 단백질은 희망하는 면역성과 작용 성질에 대하여 생산하고 검사할 수 있을 것이다. 특히 중요한 것은 단백질 서열에 변형을 가할 때 예상되는 변화가 새로운 면역원성을 항원결정인자에 도입하지 않지 않도록 하는 것이다. 이러한 현상은 실제에서는 항원결정인자 및/또는 MHC 클래스 II 리간드의 존재에 대하여 어떤 적절한 방법으로 예상한 서열을 다시 검사하여 회피할 수 있다.
또한 본 발명의 변형 부가닌 단백질은 "펩티드 모방물(mimetics)"을 포함하거나 이를 얻거나 디자인하는데 이용될 수 있다. "펩티드 모방물"은 분자간에 상호작용에 있어서 펩티드의 치환체로서 도움을 주는 구조물이다 (See Morgan et al (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252 for a review). 펩티드 모방물은 아미노산 및/또는 펩티드 결합을 포함하거나 포함하지 아니하는 합성 구조를 가지나 생물학적 활성과 인간 T-세포를 활성화하는 감소된 성향을 가지는 본 발명의 단백질의 구조적 및 작용적 특징을 유지한다. 또한 펩티드 모방물은 펩토이드(peptoids), 올리고펩토이드(oligopeptoids)를 포함한다(Simon et al (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367).
펩티드 모방물은 다른 전자적 성질을 가진 그룹간의 곁가지의 대체인 D-아미노산에 의한 L-아미노산의 체계적 대체와 아미드 결합 대체를 가진 펩티드 결합의 체계적 대체에 의해서 얻은 정보에 기초하여 디자인할 수 있다. 또한 지역적 구조형성의 제한은 펩티드 모방물 후보의 활성에서 구조 형성의 요구를 결정하는 데 도입할 수 있다. 상기 모방물은 역방향 회전 형성(reverse turn conformation)을 안정화하거나 증진하고 그 분자를 안정화하는 것을 돕기 위한 등전자 아미드 결합(isosteric amide bond) 또는 D-아미노산을 포함할 수 있다. 고리(cyclic) 아미노산 유사체(analogue)는 아미노산 잔기에 특수한 구조 형성 상태를 강제로 유도하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 모방물은 또한 본 발명의 단백질의 2차 구조의 모방물을 포함할 수 있다. 이러한 구조물은 단백질의 알려진 2차 구조에서 아미노산 잔기의 3차원적 위치확정의 모델이 될 수 있다. 또한 펩토이드는 N-치환된 아미노산의 올리고머(oligomer)일 수 있고 신규 분자의 화학적으로 다양한 라이브러리의 생성에 모티프(motif)로서 사용할 수 있다.
이러한 발명의 분자는 다양한 방법으로 제조할 수 있으나 가장 바람직한 것은 일반적인 재조합 방법을 이용하여 수행하는 것이다. 이는 비교적 간단한 과정으로 단백질 서열과 바람직한 단백질 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(폴리 nucleotide, DNA)를 추론할 수 있는 정보를 이용한다. 예를 들어, 이는 디엔에스스타 소프트웨어 슈트(DNSstar software suite, DNAstar Inc, Madison, WI, USA)나 이와 유사한 컴퓨터 소프트웨어 툴(tool)을 이용하여 획득할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 펩티드 또는 이와 현저한 상동성을 가진 펩티드를 암호화하는 능력을 가진 DNA 서열은 본 발명의 양태로서 고려되어야 한다.
일반적으로, 바람직한 변형 부가닌 단백질 서열을 암호화하는 유전자는 유전자 합성과 적절한 발현 벡터로 복제하는 것에 의하여 만들 수 있다. 다음으로 발현벡터를 숙주세포와 선택된 세포 안으로 도입하여 배양한다. 본 발명의 단백질은 배양 배지에서 정제하여 치료적 투여를 위한 제조를 한다. 선택적으로, 예를 들어 야생형 부가닌 유전자 서열은 Bougainvillea spectabilis Willd 식물의 뿌리 조직의 RNA를 이용하여 cDNA 복제 방법에 의하여 얻을 수 있다. 야생형 유전자는 돌연변이 유발의 주형과 바람직한 변이체 서열의 구조로서 이용할 수 있다. 이러한 고려 하에서 다른 방법론이나 시스템을 쉽게 적용할 수 있고, 특히 Higuchi et al [Higuchi et al (1988) nucleic Acids Res. 16: 7351]에 기술된 바에 따라 "오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)"의 방법을 이용하는 것이 편리하다.
본 발명의 단백질의 생물학적 활성은 많은 방법에 의하여 동등하게 평가할 수 있다. 하나의 양태로, 변형 부가닌 단백질은 N-글리코시다아제 활성, 특히 단백질 번역을 현저하게 방해하는 능력에 의하여 식별된다. 한가지 적합한 분석법으로는 무세포 단백질 합성 분석에 있어서 비변형 부가닌 단백질과 변형 부가닌 단백질의 활성을 비교하는 검사를 포함한다. 메티오닌을 포함한 짝지어진 전사/번역 혼합 물(Coupled Transcription/Translation mix), 레포터(reporter) 단백질 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA와 비변형 또는 변형 부가닌 단백질의 계단 희석액(serial dilution)을 동시에 항온처리하였다. 루시퍼라아제의 번역 수준은 기질 시약을 첨가한 후 발광 계수기(luminescence counter)를 이용하여 쉽게 감지하였다. 측정된 발광은 반응에서 존재하는 부가닌 N-글리코시다아제의 활성에 반비례하였다. 일반적으로 Y70A 치환기를 포함하는 불활성화 부가닌 단백질과 같은 음성 대조군을 제공한다.
바람직하게 활성화된 부가닌 분자의 구조는 재조합 DNA 기술로 획득할 수 있고 이는 희망하는 항원이나 다른 표적화 부위(moiety)와 융합된 부가닌 분자를 포함한다. 융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 정제하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 필요한 기술은 『"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The 폴리merase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)』에 충분히 설명되어 있다.
본 발명의 단백질과 펩티드는 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 고체 상 합성(solid phase synthesis)((Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154)이나 상동용액에서 합성(Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart)과 같은 단백질 화학분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다 .
또한 본 발명은 본 발명의 변형 부가닌 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 서열, 바람직하게는 서열번호:13 또는 서열번호:14 에 기술된 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 분리되고 정제된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 "분리되고 정제된(isolated and purified)" 이라 함은 재조합 DNA 기술에 의해서 생산할 때 세포의 물질이나 배양 배지에서 실질적으로 자유로운 핵산이나, 화학적으로 합성할 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 의미한다. 또한 "분리되고 정제된" 핵산은 상기 핵산이 유래한 핵산으로부터 자연적으로 비켜서게(flank)되어(예를 들어 핵산의 5' 과 3' 말단에 위치한 서열) 실질적으로 자유롭다.
본 발명에서 "핵산"은 자연적으로 발생하는 염기, 당과 당간(intersugar, backbone)의 연결로 구성되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체(monomer)의 서열을 의미한다. 또한 핵산에는 유사한 기능을 가진 비자연적으로 생기는 단량체나 그들의 일부분을 포함하는 변형 또는 치환 서열이 포함된다. 본 발명의 핵산 서열은 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)일 수 있고 자연적으로 발생하는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 염기를 포함한다. 상기 서열은 또한 크산 틴(xanthine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 6-메틸(6-methyl), 2-프로필(2-propyl), 및 다른 알킬 아데닌(other alkyl adenines), 5-할로 우라실(5-halo uracil), 5-할로 시토신(5-halo cytosine), 6-아자 우라실(6-aza uracil), 6-아자 시토신(6-aza cytosine) 및 6-아자 티민(6-aza thymine), 슈도 우라실(pseudo uracil), 4- 티오우라실(4-thiouracil), 8-할로 아데닌(8-halo adenine), 8-아미노 아데닌(8-amino adenine), 8-티올 아데닌(8-thiol adenine), 8-티오-알킬 아데닌(8-thio-alkyl adenines), 8-하이드록실 아데닌(8-hydroxyl adenine) 및 다른 8-치환 아데닌(other 8-substituted adenines), 8-할로 구아닌(8-halo guanines), 8-아미노 구아닌(8-amino guanine), 8-티올 구아닌(8-thiol guanine), 8-티오알킬 구아닌(8-thioalkyl guanines), 8-하이em록실 구아닌(8-hydroxyl guanine) 및 다른 8-치환 구아닌(other 8-substituted guanines), 다른 아자 및 대자 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 또는 구아닌(other aza and deaza uracils, thymidines, cytosines, adenines, or guanines), 5-트리플루오로메틸 우라실(5-trifluoromethyl uracil) 및 5-트리플루오로 시토신(5-trifluoro cytosine)과 같은 변형 염기를 포함한다.
하나의 양태로, 분리되고 정제된 핵산 분자는 하기의 (a),(b),(c),(d) 또는 (e)를 포함하여 본 발명의 단백질과 펩티드, 바람직하게는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14를 암호화하는 서열을 포함한다.
(a) T가 또한 U일 수 있는 핵산 서열,
(b) (a)에 상보적인 핵산 서열 ;
(c) (a) 또는 (b)와 상동인 핵산 서열;
(d) 엄격한 혼성화 조건 하에서 (a) 내지 (c)에 혼성화 될 수 있는 적어도 15 염기, 바람직하게는 20 내지 30 염기를 가지고 있는 (a) 내지 (c)의 단편; 또는
(e) 유전 코드 퇴화(degeneracy)에 기인한 코돈 서열에서 (a) 내지 (c)의 핵산 중 어느 것과 다른 핵산 분자.
나아가, 본 발명은 본 발명의 단백질과 펩티드 및 그들의 단편과 실질적으로 상동인 서열을 가지는 핵산 서열을 가지는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 "실질적으로 상동인 서열을 가지는 서열(sequences having substantial sequence homology)" 이라 함은 상기 본 단백질과 펩티드 및 그들의 단편의 서열에서 약간의 또는 하찮은 변이가 생긴 서열을 가지는 핵산 서열로, 예를 들어 실질적으로 동일한 방법으로 기능적으로 동등한 단백질을 생산할 수 있는 기능을 가진 서열을 의미한다. 이러한 변이체는 지역적 돌연변이나 구조적 변형에 기여할 수 있다.
실직적인 상동성을 가지는 핵산 서열은 본 발명의 단백질과 펩티드를 암호화 하는 핵산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 동일성을 가시는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양상으로 혼성화 조건 하에서, 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건 하에서 본 발명의 핵산 분자에 혼성화한 적어도 15 염기를 가지는 핵산 분자 및 그들의 단편을 제공한다. DNA 혼성화를 증진하는 적합한 엄격 조건은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있거나 Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 의 Current Protocols 에서 확인할 수 있다. 예를 들어 약 45˚C에서 6.0 x 염화나트륨(sodium chloride)/구연산 나트륨(sodium citrate) (SSC), 다음으로 50˚C 에서 2.0 x SSC 의 세척이 적용될 수 있다. 엄격성은 세척 단계에서 이용된 조건을 기초로 하여 선택된다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 50˚C 에서 0.2 x SSC 정도의 높은 엄격성으로 부터 선택되어 질 수 있다. 게다가 세척단계의 온도는 약 65℃ 에서 높은 엄격 조건이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 상기 단백질 또는 펩티드의 좋은 발현을 보증하는 적절한 발현 벡터로 당해 기술분야에서 알려진 공정을 따라 도입될 수 있다. 가능한 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 또는 변형 바이러스(예를 들면 복제 결함 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스(adenoviruses) 및 아데노 관련 바이러스(adeno associated viruses))를 포함하나 사용한 숙주세포와 적합성이 있는 한 이에 제한되지는 않는다. "숙주세포의 형질 전환에 적합한 벡터"라는 표현은 발현 벡터가 본 발명의 핵산 분자와 발현에 이용되는 숙주세포에 기초하여 선택되고 핵산 분자와 작동적으로 연결된 조절(regulatory) 서열을 포함한다는 의미이다. "작동적으로 연결된(Operatively linked)"은 핵산이 그 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
그 결과 본 발명에서는 본 발명의 핵산 분자 또는 이들의 단편 및 도입된 단백질 서열의 전사와 번역에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 예상한다. 적합한 조절 서열은 세균, 곰팡이 또는 바이러스의 유전자(예를 들면, 상기 조절 서열에 대하여 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기술되어 있다)를 포함하는 다양한 기원(sources)으로부터 유래할 수 있다. 적당한 조절 서열의 선택은 숙주세포의 선택에 의존하고 당해 기술 분야에서 일반적인 기술 중 하나에 의하여 쉽게 이루어질 수 있다. 이러한 조절 서열의 예로 전사 프로모터(transcriptional promoter)와 인핸서(enhancer) 또는 RNA 폴리머라이제 결합 서열(RNA polymerase binding sequence), 번역 개시 신호를 가진 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가적으로, 선택된 숙주세포와 제공된 벡터에 따라서 복제 기점과 같은 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서 및 전사를 유발하는 서열이 발현 벡터로 융합될 수 있다. 필요한 조절 서열은 본래의(native) 단백질 및/또는 그들의 양끝(flanking)영역에 의하여 제공되는 것 또한 적당할 것이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 또한 본 발명의 재조합 분자로 형질전환되거나 감염된 숙주세포의 선별을 촉진하는 선택적 마커 유전자를 포함한다. 선택적 마커 유전자의 예로는 베타-갈락토시다아제(ß-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase) 또는 반딧불이 발광효소(firefly luciferase)와 같은 특정 약물에 대한 저항성을 부여하는 G418과 하이그로마이신(hygromycin)과 같은 단백질을 암호하는 유전자가 있다. 선택적 마커 유전자의 전사는 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 또는 반딧불이 발광효소와 같은 선택적 마커 단백질의 농도 변화에 의하여 모니터 한다. 선택적 마커 유전자가 항생제 내성을 부여하는 단백질을 암호화 한다면 네오마이신(neomycin) 저항성 변환 세포와 같은 것을 G418로 선별할 수 있다. 선택적 마커 유전자가 도입된 세포는 살아남을 것이고, 반면에 그렇지 아니한 것은 사멸할 것이다. 이는 본 발명에서 재조합 발현 벡터의 발현을 시각화(visualize)하고 분석하는 것을 가능하게 하고 특히 발현에서 돌연변이 효과와 표현형을 판별할 수 있게 한다. 선택적 마커는 대상이되는 핵산으로부터 분리된 벡터로 도입되는 것이 적절할 것이다.
재조합 발현 벡터는 또한 재조합 단백질의 발현을 증가시키고, 재조합 단백질의 안정성을 증가시키며, 친화성 정제(affinity purification)에서 리간드로 작용하여 목적 재조합 단백질을 정제하는데 도움을 주는 융합 부분을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 정제에 연속하여 융합 부분(moiety)으로 부터 재조합 단백질이 분리되도록 단백질 가수분해의 분할 위치를 목적 재조합 단백질에 첨가할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 만들기 위해 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명에서 "형질전환된 숙주세포"라 함은 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환(transformation)되거나 세포감염(transfection)된 원핵세포와 진핵세포를 포함한다. 본 발명에서 "형질전환된(transformed with)", "세포감염된(transfected with)", "형질전환" 및 "세포감염" 이라 함은 당해 기술분야에서 알려진 다수의 가능한 기술에 의하여 세포 내로 핵산(예를 들어 벡터)을 도입하는 것을 의미한다. 진핵세포는 예를 들어 전기천공법(electroporation) 또는 염화칼슘 매개 형질전환(calcium-chloride mediated transformation)에 의하여 핵산으로 형질전환된다. 핵산은 인산칼슘(calcium phosphate) 또는 염화칼슘 동반침전(calcium chloride co-precipitation), DEAE-덱스트란 매개 세포감염(DEAE-dextran mediated transfection), 리포펙틴(lipofectin), 전기천공법(electroporation) 또는 미세주입법(microinjection)과 같은 일반적인 기술을 통해 포유류의 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주세포를 형질전환하고 세포감염을 시키는 적절한 방법은 Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))과 그밖의 실험 교과서에서 확인할 수 있다.
적절한 숙주세포에는 넓은 범위의 종의 원핵세포와 진핵세포가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 E. coli와 같은 박테리아 세포, 바쿨로바이러스(baculovirus)를 이용한 곤충세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주세포는「Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)」에서 확인할 수 있다..
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적인 관련을 가지고 위치 하였을 때 "작동적으로 연결(operably linked)”되었다고 한다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)의 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)로서 발현된다면 상기 폴리펩티드의 DNA에 작동적으로 연결되었고 하고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼친다면 코딩서열에 작동적으로 연결되었고 하며; 또는 리보솜 결합 장소가 번역을 촉진하기 위해서 위치한다면 코딩서열에 작동적으로 연결되었다고 한다. 일반적으로, "작동적으로 연결"되었다 함음 연결되어 있는 DNA 서열이 인접하고 있고 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 프레임(reading frame)에 있다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연 결(linking)은 편리한 제한 부위에서 연결(ligation)에 의하여 수행된다. 만약 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor)나 링커(linker)가 일반적인 실험에 따라서 사용된다.
어떠한 양태의 발현 벡터는 발현 대조군 서열에 작동적으로 연결된 잠재적 T-세포 항원결정인자의 수가 감소된 변형 부가닌을 암호화하는 핵산서열을 포함한다. 다양한 양태의 발현 벡터는 본 발명의 단백질이나 펩티드 또는 그들의 퇴화한(degenerate) 변이체를 암호화하는 핵산서열을 포함하고 적어도 적절한 대조군과 선택서열에 작동적으로 연결된 상기 핵산의 RIP 암호화 영역을 포함할 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련한 퇴화(degeneracy)는 유전 암호에 있어서 많은 아미노산이 하나 이상의 코돈을 가진다는 잘 알려진 사실을 나타내는 것이다. 암호의 퇴화는 DNA를 포함하는 4개의 다른 염기가 만들 수 있는 64개의 3염기 서열에 의해 암호화되는 20개의 다른 아미노산에 중요하다.
본 발명에서 "RIP 암호화 영역(RIP encoding domain)" 또는 "리보솜 불활성화 단백질 암호화 영역(Ribosome Inactivating Protein encoding domain)"이라 함은 부가닌에 생물학적 활성을 주는 작용 영역을 의미한다.
또한 본 발명의 핵산 분자는 표준 기술을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 폴리데옥시뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 방법에는 펩티드 합성과 같이 상업적으로 이용가능한 DNA 합성기에서 완전히 자동화된 고체-상 합성(solid-phase synthesis)을 포함하여 다양한 방법이 알려져 있다(Itakura et al. U.S. Patent No. 4,598,049; Caruthers et al. U.S. Patent No. 4,458,066; 및 Itakura U.S. Patent Nos. 4,401,796 및 4,373,071 참조).
또한 본 발명은 본 발명의 신규 단백질(novel protein)과 선택된 단백질(selected protein) 또는 선택가능한 마커 단백질(selectable marker protein)을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 앞에서 언급한 벡터 중 적어도 하나를 포함하여 배양된 세포이다.
본 발명의 또 다른 양상은 발현 벡터의 발현을 허용하고 세포로부터 부가닌을 정제하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 변형 부가닌을 제조하는 방법이다.
(B) 변형 부가닌 세포독소( Modified Bouganin Cytotoxins ):
앞에서 언급한 바와 같이, 부가닌은 단백질 합성의 중단과 세포사가 유도되는 세포의 대부분의 리보솜 RNA에서 퓨린을 제거하는(depurinate) 타입 1 리보솜 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein, RIP)이다. 따라서, 본 발명의 변형 부가닌은 세포독소(cytotoxin)를 제조하는데 이용할 수 있다. 변형 부가닌 단백질을 포함하는 세포독소는 면역원성이 적고 표적에 도달하기 전에 면역 시스템에 의하여 파괴되는 경향이 적기 때문에 비변형 부가닌 단백질을 포함하는 세포독소 보다 우세하다.
따라서, 본 발명은 또한 (a) 본 발명의 변형 부가닌 단백질에 부착된 표적화 부위(targeting moiety)와 (b) 상기 변형 부가닌 단백질을 포함하는 세포독소를 제 공한다.
본 발명의 "변형 부가닌 단백질"은 용이하게 참조(referral)되고 도면과 실시예 뿐만 아니라 상기 섹션(A)에서 기술된 변형 부가닌 단백질과 같이 본 명세서에서 기술된 어느 것 또는 모든 변형 부가닌 단백질을 포함한다.
본 발명에서 "표적화 부위(targeting moiety)"는 변형 부가닌 단백질을 표적 세포에 도달하게 하는 물질, 수단 또는 기술을 말한다. 표적화 부위의 하나의 양태로는 항체가 있다. 표적화 부위의 하나의 양태는 리포솜(liposome)이 될 수 있다. 하나의 양태로서 리포솜은 항체에 연결될 수 있다. 또 다른 양태의 표적화 부위는 특별한 표적 세포에 특이적으로 결합 상호작용을 지시할 수 있는 단백질이다. 이와 같은 단백질 부위는 특이적 세포 표면 수용체가 있는 다양한 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 다수의 사이토카인, 펩티드와 폴리펩티드 호르몬 및 다른 생물학적 반응 조절제를 포함한다. 이와 같은 단백질의 중요한 예로 혈관 상피 성장 인자(vascular epithelial growth factor), 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 헤레굴린(heregulin), 인터루킨(the interleukins), 인터페론(interferons), 종양 괴사 인자(tumour necrosis factor) 및 다른 단백질과 당단백질(glycoprotein) 분자 등을 포함한다. 이러한 융합 단백질과 본 발명의 부가닌을 가진 다른 분자는 상보적일 수 있고 단백질 리간드 영역과 관련하여 N-말단 또는 C-말단 방향에서 변형 단백질 부위를 포함할 수 있다. 표적화 부위는 본 발명의 단백질에 직접적으로 또는 링커를 통하여 결합될 수 있다. 링커의 하나의 양태로는 펩티드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다. 동일하게, 변형 부가닌 단백질에 정제된 리간드의 화학적 교차-연결(cross-linking)은 상보적이고 본 발명의 범위 내에 있다.
바람직한 양태로, 본 발명은 (a) 본 발명의 변형 부가닌에 부착된 암세포에 결합하는 리간드; (b) 상기 변형 부가닌 단잭질을 포함하는 세포독소를 제공한다.
상기 리간드는 단백질을 포함하는 암세포에 결합할 수 있는 분자일 수 있으나, 이제 제한되지는 아니한다. 하나의 양태로, 상기 리간드는 암세포의 표면을 인식하는 항체 또는 항체 단편이다.
따라서, 본 발명의 세포독소는 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암(head and neck cancer), 방광암, 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암(small cell and non small cell lung cancer) , 육종(sarcomas), 신경아교종(gliomas), T-세포 림프종 및 B-세포 림프종 등 다양한 형태의 암을 치료하는 데 이용될 수 있다.
하나의 양태로, 암세포 결합 리간드는 암세포에 결합하는 완전한 면역글로불린 분자를 포함한다. 암세포 결합 리간드가 항체 또는 이들의 단편일 때, 세포독소는 면역독소로서 주목될 수 있다. 다른 양태로 암세포-결합 리간드는 Fab, Fab', scFv, 단일-영역 항체 단편(single-domain antibody fragments), 또는 Fv 단편을 안정화하는 이황화물의 이합체(dimer)이다. 또 다른 양태에서, 암 항체는 다양한 무거운 사슬, 다양한 가벼운 사슬, Fab, Fab', scFv, 단일-영역 항체 또는 Fv를 안정화하는 이황화물을 포함한다. 암세포 결합 리간드의 일부분은 하나 또는 그 이상의 종에서 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간에게서 유래한 부분을 포함하고, 가 장 바람직하게는 완전하게 인간에게서 유래하거나 인간화된(humanized) 것이다. 또한, 정제를 촉진하거나 독소에 접합하기 위하여 디자인된 영역은 암세포-결합 부분에 포함되거나 첨가될 수 있다.
특별한 양태로, 암세포 결합 리간드는 Ep-CAM를 인식한다. Ep-CAM (상피세포 부착 분자; Epithelial Cell Adhesion Molecule, 또한, 17-1A, KSA, EGP-2 및 GA733-2로서도 알려져 있다)는 폐, 유방, 난소, 대장의 암종과 두경부의 편평세포암종(squamous cell carcinoma)을 포함한 많은 고형암에서 고발현되(highly expressed)되나 정상 상피세포에서는 저발현(weakly expressed)되는 막통과 단백질이다.
따라서, 하나의 양태로, 본 발명은 (a) 비변형 부가닌 단백질에 비하여 T-세포의 활성 촉진하는 경향이 감소된 변형 부가닌 단백질에 부착된 리간드(항체 또는 항체 단편 등); (b) 상기 변형 부가닌 단백질을 포함하는 Ep-CAM-표적화-변형 부가닌 세포독소를 제공한다.
특수한 양태로, 상기 세포독소는 (a) 비변형 부가닌 단백질에 비하여 T-세포의 활성 촉진하는 경향이 감소된 변형 부가닌 단백질에 부착된 항체 또는 항체 단편으로 이는 인간 Ep-CAM의 세포 밖 영역에 결합하고 MOC-31 항체에서 유래한 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 항체 단편; (b) 상기 비변형 부가닌 단백질에 비하여 T-세포의 활성 촉진하는 경향이 감소된 변형 부가닌 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 적절한 Ep-CAM-표적화-변형 부가닌은 VB6-845 및 이들의 변 이체, Ep-CAM에 선택적으로 결합하는 단일 또는 이중 사슬 면역글로불린을 포함하는 다른 세포독소, 또는 이들의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지는 아니한다. 본 발명에서 "VB6-845"은 부가닌의 변형된 형(form)인 Bou 156 (서열번호:13)에 연결된 항-Ep-CAM scFv 항체의 Fab 형(version)을 포함하는 세포독소를 의미한다. VB6-845의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은 도3B에서 보인다(각각 서열번호: 16 과 서열번호:15).
다른 양태의 암세포 결합 리간드는 종양세포에서 특이적으로 발견되나 정상 세포에서는 그러하지 아니하는 종양-관련 항원을 인식한다. 바람직한 양태로, 상기 리간드는 종양-관련 항원에 결합하는 항체이다. 항-종양-관련 항원 항체(anti-tumor-associated-antigen antibody)는 넓은 범위의 다양한 종류의 암세포를 인식한 정상 비암세포는 인식하지 못한다.
따라서 또 다른 양태의 본 발명은 (a) 비변형 부가닌 단백질에 비하여 T-세포를 활성화하는 경향이 감소된 변형 부가닌 단백질에 부착된 암세포에서 종양-관련 항원에 결합하는 리간드(항체 또는 항체 단편 등); (b) 상기 변형 부가닌 단백질을 포함하는 세포독소를 제공한다.
본 발명에 따른 적절한 종양-관련-항원-표적화 변형 부가닌은 VB6-011과 이들의 변이체, 종양-관련-항원에 결합하는 단일 또는 이중 사슬 면역글로불린을 포함하는 세포독소 또는 이들의 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서“VB6-011" 은 부가닌의 변형된 형태인 Bou 156 (서열번호:13)에 유전적으로 연결된 H11 인간 단일클론 항체 항체의 Fab 형(version)을 포함하는 세포독소를 의 미한다. H11 항체는 하이브리도마(hybridoma)를 생산하기 위해 인간의 골수종 세포주(human myeloma cell line)와 융합된 64세 남자 암환자의 백혈구의 말초 혈액 백혈구(peripheral blood lymphocytes)의 융합에 의하여 얻었다. 하이브리도마NBGM1/H11는 B6-011를 만들기 위해 Fab 형(format)으로 다시 처리된 IgMk를 생산한다(H11 항체-분비 하이브리도마의 제조에 대한 자세한 사항은 US 6,207,153 또는 WO 97/44461 참조). VB6-011의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은 도 15에서 보인다(각각 서열번호:28 과 서열번호:27).
특별한 양태로, 본 발명의 세포독소는 VB6-845 (도 3B, 서열번호.16) 또는 VB6-011 (도 15, 서열번호: 28)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 제한되지 않는 양태로서, 본 발명의 세포독소는 VB6-845 또는 VB6-011의 변이체를 포함한다.
VB6-845 변이체는 동일한 Ep-CAM 항원결정인자 또는 VB6-845에 의해 결합된 실질적으로 유사한 Ep-CAM 항원결정인자에 결합하고 그 변이체는 VB6-845 가 Ep-CAM 에 결합하는 것을 생리학적 조건하에서 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 까지 경쟁적으로 방해할 수 있다. VB6-845 변이체는 VB6-845 과 동일한 변형 부가닌을 포함하거나 본 발명의 다른 변형 부가닌을 포함할 수 있다. 또 다른 제한되지 않는 양태로, 본 발명의 세포독소는 MOC31의 가변성 부분을 포함하는 Ep-CAM-결합 부분 또는 이의 변이체를 포함한다. 또 다른 양태로, 상기 세포독소는 4D5MOCB를 포함하는Ep- CAM-결합 부분 또는 이의 변이체를 포함한다. Ep-CAM 에 대한 이러한 세포독소의 결합은 생리학적 조건 하에서 MOC31 또는 4D5MOCB 항체에 대한 경쟁에 의해 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 까지 감소할 수 있다.
VB6-011 변이체는 동일한 종양-관련-항원 항원결정인자 또는 VB6-011에 의해 결합한 실질적으로 유사한 종양-관련 항원 항원결정인자에 결합하고 그 변이체는 VB6-011이 종양-관련 항원에 결합하는 것을 생리학적 조건하에서 경쟁적으로 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 까지 방해할 수 있다. VB6-011 변이체는 VB6-011과 동일한 변형 부가닌이나 본 발명의 다른 변형 부가닌을 포함할 수 있다. 다른 제한되지 않는 양태로 상기 세포독소는 H11 단일클론 항체, H11 항원 결합 단편 또는 이들의 변이체를 포함하는 종양-관련-항원 결합 부분을 포함한다. VB6-011에 대한 세포독소의 결합은 H11 항체와 관련한 경쟁에 의하여 생리학적 조건하에서 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 까지 감소할 수 있다.
바람직한 양태로, Ep-CAM-결합 부분 또는 종양-관련-항원-결합 부분의 결합 친화성은 표준 실험 기술에 의하여 측정한 VB6-845 또는 VB6-011 각각의 결합 친화성에 비하여 적어도 4등급, 바람직하게는 3등급, 더욱 바람직하게는 2등급 적다. 제한되지 않는 양태로, Ep-CAM-결합 부분은 PANOREX 또는 MT201 등(이에 제한되지는 아니한다)알려진 항-Ep-CAM 항체의 Ep-CAM에 대한 결합을 생리학적 조건하에서 적어도 0.1%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 까지 경쟁적으로 방해할 수 있다. 제한되지 않는 양태로 , 종양-관련-항원-결합 부분은 H11과 같은(그러나 이에 제한되지는 않는다) 알려진 항-종양-관련-항원 항체가 종양-관련 항원에 결합하는 것을 생리학적 조건하에서 적어도 0.1%, 1%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 까지 경쟁적으로 방해할 수 있다.
숙련된 기술자는 특이성 결정 잔기를 식별할 수 있다. “특이성 식별 잔기(specificity determining residue)”는 또한 “SDR”로 알려져 있고 항체가 항원에 결합하는 부위(파라토프, paratope)의 부분을 형성하는 잔기, 특히 CDR 잔기, 알라닌에 의한 개별적 치환, 그 밖의 독립적인 돌연변이를 나타내고, 적어도 10배(fold), 바람직하게는 100배, 더욱 바람직하게는 1000배까지 항원결정인자에 대한 항체의 친화성을 감소시킨다. 이러한 친화성의 손실은 항원결정인자에 결합하는 항체의 능력에서 잔기의 중요성을 강조하는 것이다. 예를 들어, Tamura et al., 2000, “Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only,” J. Immunol. 164(3):1432-1441를 참조하라.
결합 활성, 특히 결합 친화성에 있어서 단일 또는 복수의 돌연변이 효과는 결합 상호작용(예를 들어, 결합에 있어 가벼운 또는 무거운 사슬 CDR2의 기여)에 대한 아미노산의 특수한 연속(series)의 중요성을 평가하는 것과 동시에 평가할 수 있다. 또한, 아미노산 돌연변이의 효과는 단일 아미노산의 기여가 하나하나 평가될 때 이러한 평가의 연속으로 평가될 수 있다. 이러한 평가는 예를 들면 시험관 내에서 포화 스캐닝(saturation scanning; U.S. Patent No. 6,180,341; Hilton et al., 1996, “Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor,” J Biol Chem. 271:4699-4708 참조)과 장소-지향적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis; Cunningham and Wells, 1989, “High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis,” Science 244:1081-1085; Bass et al., 1991, “A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor,” Proc Natl Acad Sci. USA 88:4498-4502 참조)을 이용하여 수행할 수 있다. 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(alanine-scanning mutagenesis) 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자의 복수의 잔기에 도입되고, 그 결과 돌연변이 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 동정하기 위한 생물학적 활성을 검사한다.
또한, 리간드-수용체 또는 다른 생물학적 상호작용의 장소는 물리적 구조분석에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 잠정적인 접촉 장소 아미노산의 돌연변이와 관련하여 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 결정학(crystallography), 전자회절(electron diffraction) 또는 광친화성 표지(photoaffinity labeling) 등을 이용할 수 있다.(de Vos et al., 1992, “Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex,” Science 255:306-312; Smith et al., 1992, “Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein,” J Mol Biol. 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, “Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25 A resolution,” FEBS Lett. 309:59-64 참조). 또한, 특수한 개별 아미노산 또는 아미노산 연속의 중요성은 관련 폴리펩티드 또는 유사한 결합 장소의 아미노산 서열과 비교하여 평가할 수 있다.
또한, 숙련된 기술자는 증가된 항원항체결합력(avidity)이 결합친화성의 감소를 보상할 수 있다는 것을 이해한다. 암세포 수용체에 대한 세포독소의 항원항체결합친화성은 Ep-CAM-결합 부분과 Ep-CAM의 결합 강도의 수치가 되고, 여기에는 복수의 결합 장소가 존재한다. Ep-CAM 과 Ep-CAM-결합 부분의 작용적인 결합 강도는 모든 친화성 결합의 총 세기를 나타내고, 따라서 각각의 구성성분은 상대적으로 낮은 친화성을 가지나 이러한 구성성분의 복합체는 강력한 생물학적 효과를 가질 것이다. 사실, Ep-CAM-결합 장소와 Ep-CAM 항원결정인자 사이에 복수의 상호작용은 부가적인 생물학적 효과보다 더욱 클 수 있다. 예를 들어 다면성(multivalence)의 이점은 평형 상수와 관련하여 다수의 등급이 될 수 있다.
유사하게, 암세포 수용체에 대한 세포독소의 항원항체결합력은 종양-관련 항원-결합 부분과 종양-관련 항원의 결합의 세기의 수치가 되고, 여기에는 복수의 결합 장소가 존재한다. 종양-관련 항원과 종양-관련 항원-결합 부분 사이의 작용적인 결합 강도는 모든 친화성 결합의 총 세기를 나타내고, 따라서 각각의 구성성분은 상대적으로 낮은 친화성을 가지나 이러한 구성성분의 복합체는 강력한 생물학적 효과를 가질 것이다. 사실, 종양-관련 항원-결합 장소와 종양-관련 항원 항원결정 인자 사이에 복수의 상호작용은 부가적인 생물학적 효과보다 더욱 클 수 있다. 예를 들어 다면성(multivalence)의 이점은 평형 상수와 관련하여 다수의 등급이 될 수 있다. 하나의 제한되지 않는 양태로, Ep-CAM-결합 부분은 4D5MOCB와 실질적으로 유사한 구조를 가진다. 실질적으로 유사한 구조는 세포독소의 Ep-CAM 분자에 대한 Ep-CAM-결합 부분의 결합 포인트를 반영하는 항원결정인자 지도를 참조하여 특징화할 수 있다. 또 다른 제한되지 않는 양태로, 항원결정인자 지도는 종양-관련 항원 결합 부분에서 유래할 수 있고 실질적으로 유사한 구조는 종양-관련 항원 분자에 대한 세포독소의 종양-관련 항원 결합 부분의 결합 포인트를 반영하는 항원결정인자 지도를 참조하여 특징화 할 수 있다.
본 발명의 세포독소는 고체 상 합성(solid phase synthesis; Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964)) 또는 상동용액에서 합성(Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I 및 II, Thieme, Stuttgart (1987)) 등과 같은 단백질 화학분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 화학합성에 의해 제조할 수 있다. 하나의 양태로, 암-결합 리간드와 변형 부가닌은 양자가 단백질이고 당해 분야에서 잘 알려진 기술에 의하여 접합할 수 있다. 두 단백질을 접합할 수 있는 수많은 교차링커(crosslinker)가 존재한다(그 예로“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”. 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor 참조.) 교차링커는 일반적으로 리간드나 독소에서 이용가능하거나 삽입된 반응 작용기(reactive functional group)에 기초하여 선택될 수 있다. 또한, 어떠한 반응기도 없다면 광활성화가 가능한(photoactivatible) 교차링커를 사용할 수 있다. 일정한 예로, 리간드와 독소 사이에 스페이서(spacer)를 포함하는 것을 예상할 수 있다. 당해 분야에 알려진 교차연결 제제(Crosslinking agent)에는 동종양쪽기능(homobifunctional)제제로: 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 디메틸아디피미데이트( dimethyladipimidate) 및 디아조벤지딘(Bis, diazobenzidine)과 이종양쪽기능(heterobifunctional)제제로:m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드(m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide) 및 술포-m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드(Sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)가 포함된다.
또한,리간드-부가닌 독소 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 이 경우 암-결합 리간드를 암호화하는 DNA 서열은 변형 부가닌 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 융합되어 키메라 DNA(chimeric DNA) 분자가 된다. 상기 키메라 DNA 서열은 리간드-부가닌 단백질을 발현하는 숙주 세포 내로 세포감염된다. 이러한 융합 단백질은 세포 배양에 의해 회복되고 당해 분야에서 알려진 기술에 의해 정제할 수 있다.
Ep-CAM 과 종양-관련 항원 등과 같은 세포 표면 단백질에 특이성을 가지는 항체는 일반적인 방법에 의하여 제조할 수 있다. 포유동물(예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 토끼)은 포유동물에서 항체 반응을 유발하는 펩티드의 면역원성 형(form)으로 면역화될 수 있다. 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 담체에 접합하는 것 또는 당해 분야에서 잘 알려진 다른 기술을 포함한다. 예를 들면, 펩티드를 보조제(adjuvant)의 존재하에 투여할 수 있다. 면역화의 과정은 혈청 또는 혈장에서 항체가(antibody titer)의 검출로 모니터할 수 있다. 항원과 같은 면역원 을 이용하여 표준 ELISA 또는 다른 면역분석법(immunoassay)으로 항체의 수준을 측정할 수 있다. 면역화에 따라 항혈청을 얻을 수 있고, 혈청으로부터 다클론 항체를 분리할 수 있다.
단클론 항체를 생산하기 위해서, 항체-생산 세포(림프구)를 면역화된 동물에서 수확하고 표준 체세포 융합과정으로 골수종 세포와 융합할 수 있다. 이러한 융합세포를 무한증식(immortalizing)하여 하이브리도마 세포를 얻는다. 상기 기술(the hybridoma technique originally developed by Kohler and Milstein (Nature 256:495-497 (1975) 참조)과 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983)), 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., pages 77-96 (1985)) 및 복합 항체 라이브러리의 스크리닝 기술(Huse et al., Science 246:1275 (1989)) 등은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 하이브리도마 세포는 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 면역화학적으로 스크리닝할 수 있고 단클론 항체를 분리할 수 있다.
본 발명에서 “항체”는 단클론 항체와 다클론 항체, 항체 단편(Fab 및 F(ab')2 와 단일 사슬 항체(single chain antibodies; scFv)) 및 세포 표면 성분에 특이적으로 반응하는 키메라 항체를 포함한다. 항체는 일반적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고 상기 단편은 앞에서 기술한 바와 같은 방법으로 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, F(ab’)2 단편은 펩신(pepsin)을 가진 항체 처리에 의하여 생산할 수 있다. 결과물인 F(ab’)2 단편은 Fab' 단편을 만들기 위해 이황화 가교(disulfide bridge)를 감소시키기 위하여 처리할 수 있다. 단일 사슬 항체는 단일의 안정적으로 접힌 폴리펩티드 사슬(single stably folded polypeptide chain)에서 항체의 항원-결합 영역에 결합한다. 단일 사슬 항체는 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다.
키메라 항체 유도체, 예를 들면 인간을 제외한 동물의 가변 영역과 인간의 불변 영역을 결합하는 항체 분자, 또한 본 발명의 영역 내에 있다. 예를 들어, 키메라 항체 분자는 마우스, 랫(rat) 또는 다른 종의 항원 결합 영역을 포함한다. 또한, 일반적인 방법으로 세포 표면 항원을 인식하는 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 키메라 항체를 만들 수 있다(예를 들어, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., E.P. Patent No. 171,496; European Patent No. 173,494, United Kingdom Patent No. GB 2177096B 참조). 키메라 항체는 대응하는 비-키메라(non-chimeric) 항체보다 인간에 있어서 면역원성을 더 적게 가질 것으로 예상된다. 키메라 항체는 Pluckthun et al., WO 00/61635에서 기술된 방법으로 안정화할 수 있다.
세포 표면 성분에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 또는 키메라 항체는 인간의 불변 영역 키메라를 생산하는 것에 의하여 더 인간화될 수 있다. 상기 키메 라는 가변 영역의 부분에, 특히 항원-결합 영역의 보존된 틀(framework) 영역에 존재 하는데 이는 인간에서 유래한 것(human origin)이고 단지 매우 가변적인 영역만이 인간에서 유래한 것이 아니다(non-human origin). 이러한 면역글로불린 분자는 당해 분야에서 잘 알려진 기술로 생산할 수 있다(Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982), 및 PCT Publication WO92/06193 또는 EP 239,400 참조). 인간화된 항체는 또한 상업적으로 생산될 수 있다(Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain. 참조). 또한, 세포 표면 성분에 특이적으로 반응하는 단일클론 또는 키메라 항체는 잠재적 T-세포 항원결정인자의 수를 감소시켜 면역원성을 더 적게 할 수 있다.
또한, 세포 표면 성분에 반응하는 특이적 항체 또는 항체 단편은 세포 표면 성분을 가진 박테리아에서 발현되는 면역글로불린 유전자 또는 이들의 조각을 암호화는 발현 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 완전(complete) Fab 단편, VH 영역 및 Fv 영역은 상 발현 라이브러리(phage expression libraries; Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); 및 McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990))를 이용하여 박테리아에서 발현시킬 수 있다. 선택적으로, SCID-hu 마우스가 Genpharm 에 의해 개발된 예로서 항체 또는 이의 단편을 생산하는데 이용될 수 있다.
항체 서열과 융합하여 변형 부가닌 단백질을 만드는 모든 예에서, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있거나 T 세포를 자극할 수 있거나 MHC 클래스 II분자와 관련된 T-세포에 결합할 수 있는 T 세포 항원결정인자 또는 서열이 이 제거된 항체 서열을 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태로, 변형 부가닌 단백질은 비-항체 단백질이나 특수한 표적 세포와 특이적 결합 상호작용을 지시할 수 있다. 이러한 단백질 부위는 특이적 세포 표면 수용체가 있는 다양한 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 또한, 다수의 사이토카인, 펩티드 및 폴리펩티드 호르몬과 다른 생물학적 반응 조절제를 포함한다. 이와 같은 단백질의 중요한 예로 혈관 상피 성장 인자, 표피 성장 인자, 헤레굴린, 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자 및 다른 단백질과 당단백질 분자 등을 포함한다. 이러한 융합 단백질과 본 발명의 부가닌을 가진 다른 분자는 상보적일 수 있고 단백질 리간드 영역과 관련하여 N-말단 또는 C-말단 방향에서 변형 단백질 부위를 포함할 수 있다. 표적화 부위는 본 발명의 단백질에 직접적으로 또는 링커를 통하여 결합될 수 있다. 링커의 하나의 양태로는 펩티드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다. 동일하게, 변형 부가닌 단백질에 정제된 리간드의 화학적 교차-연결(cross-linking)은 상보적이고 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 변형 부가닌 단백질은 또 다른 양태로, 하이드록시프로필메틸아크릴아미드(hydroxypropylmethacrylamide) 또는 변형 부가닌 단백질이 폴리머(polymer)에 공유결합 또는 비공유 결합 작용으로 부착되어 있는 다른 폴리머 등과 같은 가용성 폴리머를 포함하는 복합체로서 사용될 수 있다. 그러한 양태는 추 가적으로 폴리머 부가닌 복합체의 조합에서 항체 또는 항체 단편과 같은 결합 영역을 포함한다.
(C) 세포독소의 용도
본 발명의 변형 부가닌 단백질은 포유류의 암에 영향을 받은 세포를 특이적으로 억제하거나 파괴하는 데 이용할 수 있다. 본 발명의 세포독소는 면역원성이 감소된 이점을 가지고 있어, RIP가 세포 내로 들어가서 효과적으로 암세포를 죽일 수 있도록 한다. 따라서, 상기 세포독소는 특이적으로 암세포를 표적화하는데 이용될 수 있다. 부가닌은 암세포의 대부분의 리보솜 RNA에서 퓨린을 제거하여 리보솜을 손상시켜 단백질 합성의 중단과 세포사(cell death)를 유발한다.
따라서, 하나의 양태로, 본 발명은 필요에 따라 동물에 본 발명의 세포독소를 투여하는 것을 포함하는 암세포의 억제 또는 파괴 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 암세포를 억제하거나 파괴하는 본 발명의 세포독소의 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 암세포를 억제하거나 파괴하는 치료제의 제조에 있어서 본 발명의 세포독소의 용도를 포함한다.세포독소에 의하여 억제되거나 파괴되는 암세포의 타입은 그것의 항체 부분의 항원 특이성에 의하여 결정된다.
또 다른 양태로, 본 발명은 본 발명의 세포독소의 제조와 세포로 상기 세포독소를 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 억제 또는 제거방법을 제공한다. 암에는 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암, 방광암,간암, 신장암, 흑색종, 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 세포독소가 동물의 암세포를 선택적으로 억제하거나 파괴하는 능력은 동물 암세포주를 이용하여 시험관 내에서 쉽게 검사할 수 있다. 본 발명의 세포독소의 선택적인 억제 효과는 예를 들어, 암세포에서 세포증식을 선택적으로 억제하는 것을 나타내는 것에 의하여 결정될 수 있다.
독성은 세포 생존율에 기초하여 측정될 수 있는데, 예를 들어 정상세포와 세포독소에 노출된 암세포 배양물의 생존율을 비교하여 측정할 수 있다. 세포 생존율은 트리판 블루 색소 배제법(trypan blue exclusion assay)과 같은 알려진 기술에 의하여 평가할 수 있다.
또 다른 예로, 다수의 모델이 세포독소의 독성을 검사하는 데 이용될 수 있다. Thompson, E.W. et al. (Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994))은 시험관 내에서 인간 유방암 세포의 침투성(invasiveness)을 결정하는 모델에 대하여 기술한 바 있는데, 이는 세포 밖 기질의 종양 세포-매개 단백질 분해(proteolysis)와 가공 기저막(reconstituted basement membrane)(콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 매트리겔(Matrigel) 또는 젤라틴(gelatin))의 종양 세포 침입을 측정하는 것이다. 다른 적용가능한 암세포 모델에는 배양된 난소 선암(ovarian adenocarcinoma) 세포(Young, T.N. et al. Gynecol. Oncol. 62:89-99 (1996); Moore, D.H. et al. Gynecol. Oncol. 65:78-82 (1997)), 인간 소포 갑상선 암(follicular thyroid cancer) 세포(Demeure, M.J. et al., World J. Surg. 16:770-776 (1992)), 인간 흑색종(melanoma; A-2058) 및 섬유 육종(fibrosarcoma; HT-1080) 세포주(Mackay, A.R. et al. Lab. Invest. 70:781-783 (1994))와 폐 편평(squamous)세포주(HS-24) 및 선암종(adenocarcinoma) 세포주(SB-3) (Spiess, E. et al. J. Histochem. Cytochem. 42:917-929 (1994))가 포함된다. 가슴샘 없는 생쥐(athymic nude mice)에 종양을 이식하고 종양 성장과 전이의 측정을 포함하는 생체 내 검사 시스템 또한 알려져 있다(Thompson, E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994); Shi, Y.E. et al., Cancer Res. 53:1409-1415 (1993)).
본 발명은 또한 필요에 따라 동물에 본 발명의 세포독소 중 하나 또는 그 이상 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 암치료 방법과 관련된다. 본 발명은 암을 치료하는 본 발명의 세포독소의 용도를 포함한다. 또한 본 발명은 암을 치료하는 치료제로 사용되는 본 발명의 세포독소의 용도를 포함한다.
본 발명의 “동물”에는 인간을 포함한 동물계의 모든 동물이 포함된다.
본 발명에서 “암 치료 (treating cancer 또는 treat cancer)"는 암세포의 복제를 억제, 암의 전이를 억제, 종양의 성장을 억제, 암세포수 또는 종양 성장의 감소, 악성등급의 암의 감소 또는 암 관련 증상의 개선을 의미한다.
바람직한 양태로, 상기 동물은 인간이다. 또 다른 양태로, 상기 암은 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암, 방광암, 간암, 신장암, 흑색종, 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암, 육종, 신경아교종과 T-세포 및 B-세포 림프종으로 구성되는 그룹에서 선택되어 진다.
본 발명의 세포독소를 이용한 암 치료의 치료적 결과는 외과의사와 같은 당 해 분야의 기술자에 의하여 쉽게 이해될 수 있다. 예를 들면, 암의 중요한 마커를 측정하는 표준 의학적 검사는 치료의 효과에 대한 강력한 지표가 될 수 있다. 그러한 검사는 외과적 검사(physical examination), 신체기능실행척도(performance scales), 질병 마커(disease markers), 12-납(lead) ECG, 종양 측정(tumor measurements), 조직검사(tissue biopsy), 세포검사(cytoscopy), 세포학(cytology), 가장 긴 종양의 직경 계산(longest diameter of tumor calculations), 방사선촬영(radiography), 종양의 디지털 영상(digital imaging of the tumor), 생체신호(vital signs), 무게(weight), 유해사례의 기록(recordation of adverse events), 감염 사례의 평가(assessment of infectious episodes), 동시변이 처치의 평가(assessment of concomitant medications), 고통 평가(pain assessment), 혈액 또는 혈청 화학(blood or serum chemistry), 소변검사(urinalysis), CT 촬영(CT scan) 및 약물동태학 분석(pharmacokinetic analysis)을 포함하나 이에 제한되지는 아니한다. 또한, 세포독소와 다른 암 치료법 병용의 상승효과는 단일치료를 받고 있는 환자와의 비교법적 연구에 의하여 결정될 수 있다.
악성 종양의 완화는 숙련된 기술자에게 알려진 기준을 이용하여 평가할 수 있다. 「Therasse et al., 2000, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada,” J Natl Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16.」를 참조하라.
특이적 세포독소의 효과적인 투여량은 연령, 무게 및 환자의 건강 뿐만 아니라 암의 종류, 종양의 크기, 암의 진행 단계, 환자에 대한 세포독소의 독성, 암세포 표적화의 특이성 등 다양한 요소를 고려하여 결정할 수 있다.
변형 부가닌을 포함하는 세포독소는 주입물에서 세포독소의 투여량과 농도에 따라 분 단위에서 수 시간 이상 i.v.주입(i.v. infusion)에 의하여 투여될 수 있다.
하나의 양태로, 세포독소는 3시간 이상 주입된다.
하나의 양태로, 세포독소의 i.v. 투여에 의한 효과적인 투여량은 약 1 내지 100 mg/kg/dose 일 수 있다. 다른 양태로, 투여량은 약 2 내지 50 mg/kg/dose 일 수 있다. 특수한 양태로, 투여량은 적어도 약 2, 4, 8, 13, 20, 28, 40, 50 mg/kg/dose 일 수 있다.
하나의 양태로, 1회 투여량은 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 주 동안 매주 마다 투여하는 것이다. 1회 투여는 1주마다 연속하여 이루어질 수 있고, 한 주 또는 그 이상 건너뛰면서 이루어질 수 있다. 이러한 주기(cycle) 후, 연속되는 주기는 약 2, 4, 6 또는 12주 후에 시작할 수 있다. 이러한 치료 요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 순환주기(cycles)를 포함할 수 있으며, 각각의 주기는 약 1, 2, 4, 6, 또는 12 주의 간격을 두고 떨어져 있을 수 있다.
또 다른 양태로, 1회 투여는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 연속되는 달 동안 매달마다 투여될 수 있다. 이러한 주기 후에, 연속되는 주기는 약 1, 2, 4, 6 또는 12 달 후에 시작할 수 있다. 이러한 치료 요법은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 주기를 포함할 수 있다. 각각의 주기는 약 1, 2, 4, 6 또는 12 달의 간격을 두고 떨어져 있을 수 있다.
특별히 제한되지 않는 양태로, 세포독소의 효과적인 투여량은 1 내지 50 mg/kg/tumor/day 사이에 있고, 이 경우 환자에게 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 연속하여 매일 1회씩 투여한다(1일 또는 그 이상 선택적으로 건너뛸 수 있다). 이러한 주기 후에, 연속하는 주기는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주 후에 시작할 수 있다. 이러한 치료 요법은 또는 그 이상의 주기를 포함할 수 있고, 각각의 주기는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 주의 간격을 두고 떨어져 있을 수 있다.
바람직한 주입 부피는 종양의 유형 및/또는 위치에 효과적인 양이다. 1회 투여량의 최대의 주입 부피는 종양 부피의 약 25% 내지 75% 사이로 예를 들어, 추정되는 표적 종양 부피의 약 1/4, 1/3 또는 3/4 이다. 특수한 양태로, 1회 투여량의 최대 주입 부피는 종양 부피의 약 30% 이나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로, 세포독소는 1 내지 10 mg 세포독소/mL를 포함하고 있는 용액으로 시간 당 100cc의 비율로 3시간 동안 주입한다. 상기 세포독소는 생리학적으로 적절한 용해 가능한 용액으로 희석할 수 있다.
한 주기 동안에 세포독소와 함께 투여되는 다른 암치료제의 효과적인 1회 투여량 또한 투여의 유형에 따라 다양할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 암치료제는 종양 내부로 전달되거나 또는 다른 유형으로 투여될 수 있다. 전형적으로 화학치료제는 체계적으로 투여한다. 표준 투여량과 처리 요법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다(the Merck Index and the Physician's Desk Reference의 가장 최근 판; NCCN Practice Guidelines in Oncology 참조).
세포독소의 병용 치료에 의해 추가적인 암 치료법의 적용에 암 또는 종양을 민감하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과적인 양의 세포독소를 우선 투여하고 순차적으로 감소된 양의 암치료제를 투여하거나 세포독소와 동시에 투여하는 것을 포함하는 암예방, 치료 및/또는 재발방지에 대한 병용 치료에 이용될 수 있다. 예를 들면, 세포독소를 최초에 투여하고 연속적으로 다른 암치료제를 투여하는 경우 상기 세포독소는 다른 암치료제에 대한 암 또는 종양에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 이러한 경우 투여량은 암치료법이 단독 또는 세포독소 없이 적용될 때 표준 투여량의 낮은 범위에 가깝거나 그보다 낮다. 동시에 투여될 때, 세포독소는 암치료법과 분리되어 투여되고 선택적으로 투여의 다른 유형을 통하여 투여될 수 있다.
또 다른 양태로, 세포독소는 적어도 하나의 다른 면역치료법에 적용된다.
또 다른 양태로, 세포독소는 방사선 치료요법과 병용하여 적용될 수 있다. 상기 치료요법은 또한 외과적 수술 및/또는 화학요법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포독소는 방사선 치료와 시스플라틴(cisplatin (Platinol)), 플루오로우라실(fluorouracil (5-FU, Adrucil)), 카보플라틴(carboplatin (Paraplatin)) 및/또는 파크릴탁셀(paclitaxel (Taxol)과의 조합이 적용될 수 있다. 세포독소를 가진 치료제는 방사선의 투여량을 더 적게 하고/하거나 처지 횟수를 줄이도록 할 수 있고, 이는 예를 들어 바람직하지 않은 체중 감소나 탈수증상을 유발하는 심각한 목 통증의 발병을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 세포독소는 하나 또는 그 이상의 사이토카인과 병용하여 투여된다. 상기 사이토카인에는 림포킨(lymphokine), 종양 괴사 인자, 사이토카인 유사-종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-like cytokine), 림포톡신(lymphotoxin), 인터페론(interferon), 대식세포 염증유발 단백질(macrophage inflammatory protein), 과립구단 콜로니 자극 인자(granulocyte monocyte colony stimulating factor), 인터루킨(interleukin; 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-18을 포함하나 이에 제한되지는 않는다) 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염을 포함한 이들의 변이체가 포함되나 이에 제한 되지는 아니한다.
또 다른 양태에서, 세포독소는 자기유래(autologous) 세포나 조직, 비자기 유래(non-autologous) 세포나 조직, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen), 알파태아단백(alpha-fetoprotein), 인간 융모성 생식샘자극호르몬(human chorionic gonadotropin), BCG 생(生)백신(BCG live vaccine), 멜라닌세포 계통 단백질(melanocyte lineage proteins) 및 돌연변이, 종양-특이 항원(tumor-specific antigens)을 포함하는 암 백신과 병용하여 적용되나, 이에 제한되지는 아니한다.
또 다른 양태로, 세포독소는 호르몬 치료와 병용하여 적용된다. 호르몬 치료제는 호르몬 작용제(agonist), 호르몬 대항제(antagonist)(예를 들어, 플루타미드(flutamide), 타모시펜(tamoxifen), 루프로리드 아세테이트(leuprolide acetate, LUPRON)) 및 스테로이드(steroid)(예를 들어, 덱사메타존(dexamethasone), 레티노이드(retinoid), 베타메타손(betamethasone), 크리티솔(cortisol), 코티손(cortisone), 프레드니손(prednisone), 디하이드로테스토스테 론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 미네랄로코르티코이드(mineralocorticoid), 에스트로겐(estrogen), 테스토스테론(testosterone), 프로제스틴(progestin)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로, 세포독소는 암을 치료하거나 예방하는 유전자 치료 프로그램과 병용하여 적용될 수 있다.
또 하나의 다른 양태로, Ep-CAM-표적화 세포독소는는 대상 종양 세포에서 Ep-CAM의 발현을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 제제와 병용하여 투여될 수 있다. Ep-CAM 발현이 바람직하게 증가되어 Ep-CAM 분자의 많은 수가 종양 세포 표면에서 발현된다. 예를 들어, 상기 제제는 Ep-CAM 항원 세포내이입(endocytosis) 정상 주기를 방해할 수 있다. 이러한 병용 치료는 Ep-CAM-표적화 세포독소 단독 또는 다른 암세포 치료제나 방사선 치료와 병용하는 경우 상기 세포독소의 치료적 효과를 증가시킬 수 있다. 특히, 종양 세포에서 Ep-CAM 발현을 증가시키는 상기 제제로는 비노렐바인 타트레이트(vinorelbine tartrate, Navelbine) 및/또는 파크리탁스(paclitax, Taxol)가 있으나, 이에 제한되지는 아니한다. 「Thurmond et al., 2003, “Adenocarcinoma cells exposed in vitro to Navelbine or Taxol increase Ep-CAM expression through a novel mechanism.” Cancer Immunol Immunother. Jul;52(7):429-37」를 참조하라.
병용요법은 적용되는 세포독소 및/또는 부가적인 암치료제의 암 또는 종양에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 이러한 방법으로, 보다 짧은 치료주기가 가능해지고 약물에 중독되는 경우를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 필요에 따라 효과적인 양의 세포독소와 적어도 하나의 다른 치료제를 병용하여 치료주기를 짧게 하는 것을 특징으로 하는 암치료법 또는 예방법을 제공한다. 상기 주기는 사용되는 특수한 암 치료법에 따라 다양할 수 있다. 본 발명에는 또한 연속적 또는 비연속적 투여나 몇 번의 부분적 투여로 나누어져 매일 투여하는 방법이 포함될 수 있다. 각각의 특이적인 암치료법에 대한 적당한 주기는 숙련된 기술자가 이해할 수 있고, 본 발명은 개별적인 암치료에서 최적의 치료 계획을 수립하는 것을 고려하고 있다. 이러한 특이성의 가이드라인(guideline)은 당해 분야에서 숙련된 기술자에게 알려져 있다. 「Therasse et al., 2000, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada,” J Natl Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16를 참고하라.
선택적으로, 더 긴 치료 주기가 바람직하다. 따라서 치료기간은 약 10 내지 56, 12 내지 48, 14 내지 28, 16 내지 24 또는 18 내지 20 일에 걸쳐 있을 수 있다. 이러한 주기는 이용되는 특이적인 암 치료법에 따라 다양하다.
본 발명은 단일의 암치료법 또는 암치료법의 시리즈(series)를 적용하는 데 있어서 적어도 하나의 주기를 고려하고, 바람직하게는 하나 이상의 주기를 고려한다. 주기의 적절한 전체 수와 주기 사이의 간격은 숙련된 기술자에게 이해될 수 있다.주기의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 주기일 수 있다. 주기 사이에 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 일 수 있다. 본 발명은 각각의 세포독소와 부가적인 암치료에 있어서 최적의 치료 계획을 계속 평가할 것을 고려한다.
또 다른 양태로, T-세포를 활성화하는 성향이 감소된 부가닌의 T-세포 항원결정인자를 동정하는 단계; 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제에 하나 또는 그 이상의 T-세포 항원 결정인자를 가진 세포독소 단백질을 현탁하여 암에 걸린 포유동물을 치료하는 약물을 제조하는 단계를 포함하는 암에 걸린 포유동물을 치료하는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 세포독소와 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암에 걸린 포유동물을 치료하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포독소는 생체 내로 투여하는 데 생물학적으로 적합한 재료에 적용되는 약학적 조성물로 형성될 수 있다. “생체 내로 투여하는데 적절한 생물학적으로 적합한 형태(biologically compatible form suitable for administration in vivo)”라 함은 치료적 효과에 의해서 어떠한 독소 효과가 가중되는 데 적용되는 물질의 형태를 의미한다. 상기 물질은 인간 및 동물을 포함하는 살아있는 생물체에 적용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 치료적으로 활성화될 수 있는 투여량은 1회 투여량과 원하는 결과를 얻기 위해 필요한 시간에 대하여 효과량(amount effective)으로 정의된다. 예를 들어, 어떠한 물질의 치료적으로 활성화된 양은 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 무게와 각 개체에서 원하는 반응을 유발 하기 위한 항체의 능력에 따라 다양할 수 있다. 투여량은 최적의 치료 반응을 위하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 1회 투여량을 몇으로 나누어 매일 투여하거나 상태가 긴급한 경우 1회 투여량은 비율적으로 감소될 수 있다.
활성물질은 주사(injection; 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등), 경구 투여, 흡입, 경피 투여(국소 크림 또는 연고 등), 또는 좌약 등 편리한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성물질은 화합물을 불활성화할 수 있는 효소, 산 또는 다른 자연 상태로부터 화합물을 보호하기 위하여 특정 재료로 코팅할 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상에 투여될 수 있도록 약학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위해 알려진 방법에 의하여 제조할 수 있고, 활성물질의 효과적인 양을 약학적으로 허용 가능한 담체(vehicle)와 혼합할 수 있다. 적합한 담체의 예는 「Remington's Pharmaceutical Sciences」 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)에 기술되어 있다. 이를 기초로, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에 관련된 물질의 용액을 포함하고 상기 용액은 적당한 pH와 생리학적 액체와 등삼투압(iso-osmotic)을 가진 완충용액일 수 있으나, 이제 한정되지는 아니한다.
상기 약학적 조성물은 암에 걸린 포유류를 포함한 동물, 바람직하게는 인간의 치료방법에서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암, 방광암, 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종 환자를 치료하는 데 특히 유용하다. 투여하는 1회량과 세포독소의 타입은 인간을 대상으로 하는 경우 쉽게 모니터 할 수 있 는 다양한 인자에 따라 결정될 수 있다. 이러한 인자에는 종양의 원인(etiology)과 중증도(severity; 등급 및 단계)가 포함된다.
직접적으로 투여되는 약학적 조성물에는 동결건조된 파우더나 액체 또는 액체가 아닌 멸균된 주입가능한 용액 또는 현탁액이 포함되고, 여기에는 상기 조성물에 수용자(recipient)의 혈액과 실질적인 등장성을 부여하는 항산화제, 완충용액, 정균제(bacteriostat)와 용질이 포함될 수 있다. 상기 조성물에 존재할 수 있는 다른 구성성분에는 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 야채 오일 등이 있다. 임시주사용액과 현탁액은 무균 파우더, 과립(granule) 및 정제(tablet)로 제조할 수 있다. 세포독소는 환자에게 투여하기 전에 무균 물(water) 또는 식염수로 재구성하여 멸균하여 공급할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적절한 약학적으로 허용가능한 담체에는 필수적으로 약학적 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 아니하는 화학적으로 불활성화되고 비독성인 조성물을 포함한다. 적절한 담체의 예로는 물, 식염수, 글리세롤 용액, 에탄올, N-(1(2,3-올레일옥시)프로필)N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (N-(1(2,3-dioleyloxy)propyl)N,N,N-trimethylammonium chloride; DOTMA), 디올레실포스포티딜-에탄올아민(diolesylphosphotidyl-ethanolamine; DOPE) 및 리포솜이 있으나, 이에 제한되지는 아니한다. 상기 조성물은 환자에세 직접적으로 투여하기 위한 형태로 제공하기 위해서 적당한 양의 담체와 함께 약학적으로 효과적인 양의 혼합물을 포함하여야 한다.
또 다른 양태의 약학적 조성물은 세포독소와 하나 또는 그 이상의 부가적 암치료제와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 이는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래한 자유 아미노 그룹을 가지고 형성되고, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철(ferric hydroxide), 이소프로필아민(isopropylamine), 트리에틸아민(triethylamine), 2-에틸아미노 에탄올(2-ethylarnino ethanol), 히스티딘(histidine), 프로카인(procaine) 등에서 유래한 자유 카르복실 기(free carboxyl groups)를 가지고 형성되나, 이에 제한되지는 아니한다.
본 발명은 변형 부가닌에 관한 것으로, 이러한 변형 부가닌 단백질 또는 변형 부가닌 단백질의 단편을 포함하고 있는 조성물과 관련 조성물은 본 발명의 범위 내에 있다. 이에 대한 중요한 예로 펩티드 매개 내성 유도 전략(peptide mediated tolerance induction strategies )을 들 수 있는데 이는 하나 또는 그 이상의 펩티드를 면역치료를 위해 환자에게 투여하는 것이다. 예를 들어 합성 펩티드 분자는 앞에서 기술한 항원결정인자 영역 R1 내지 R3 중 어느 것의 전부 또는 부분을 포함하는 하나 또는 그 이상의 또는 합성 펩티드 분자일 수 있다. 이러한 펩티드는 본발명의 하나의 양태로 고려된다.
본 발명의 다른 양상은 변형 부가닌 조성물을 이용하여 인간을 치료하는 방법에 관한 것이다. 개체에 투여하기 위한, 변형 조성물은 적어도 80% 순도를 가지고 발열원(pyrogen)과 다른 오염물질이 없는 것이어야 한다.
본 발명은 또한 선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 암치료제와 혼합된 효과적인 양의 세포독소를 포함하는 키트(kit)와 암을 치료하기 위한 이들의 용도를 제공한다.
(D) T-세포 항원결정인자 펩티드
본 발명의 추가적인 양태는 T-세포 항원결정인자 펩티드이다. 예를 들어, T-세포 항원결정인자 펩티드는 T-세포 분석에 있어서 1.8 이상, 보다 바람직하게는 2.0 이상의 자극지수를 유발한다. 본 발명의 T-세포 항원결정인자 펩티드는 MHC 클래스 II에 결합할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로 T-세포 항원결정인자 펩티드는 적어도 9개의 연속하는 상기 R1, R2 또는 R3의 서열에서 유래하는 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 양태로, T-세포 항원결정인자 서열은 펩티드 서열 R1, R2 또는 R3 중 어느 하나와 90% 이상의 아미노산 동일성을 가지고; 더욱 바람직하게는 T-세포 항원결정인자 서열은 펩티드 서열 R1, R2 또는 R3 중 어느 하나와 80% 이상의 아미노산 동일성을 가진다.
본 발명에서 “펩티드”는 둘 이상의 아미노산을 가지고 있는 화합물을 말한다. 아미노산은 하기에서 정의하고 있는 펩티드 결합에 의하여 서로 연결되어 있다. 자연적으로 발생하는(naturally occurring) 아미노산에는 20개의 다른 아미노산이 있으며, 이들은 펩티드의 생물학적 제제에 속하고, 아미노산 중 어떠한 것은 펩티트 사슬이나 고리를 형성하여 특정 순서를 가지고 연결될 수 있다. 펩티드의 생물학적 제제인 자연에서 발견되는 아미노산은 모두 L-입체형상(L-configuration)을 가지고 있다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 두 가지 다른 형상의 아미노산의 다양한 조합을 이용하여 일반적인 합성방법으로 제조할 수 있다. 어떠한 펩티드는 단지 몇 개의 아미노산 단위만을 포함한다. 10개의 이하의 아미노산을 가지고 있는 짧은 펩티드를 "올리고펩티드(oligopeptides)"라고 한다. 100개 또는 그 이상의 많은 수의 아미노산을 가지고 있는 펩티드는 “폴리펩티드(polypeptides)”라 한다. 약정에 의하여,“폴리펩티드는”2 또는 그 이상의 아미노산을 가지고 있는 펩티드 사슬을 의미할 수 있으나,“올리고펩티드”는 이 중에서 대개 “짧은” 폴리펩티드의 특수한 타입을 일컫는 것이다. 따라서, 본 발명에서는 “폴리펩티드”에 올리고펩티드 또한 포함되는 것으로 한다. 또한, “펩티드”는 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포함하는 것으로 한다. 아미노산은 각각의 다른 배열로 다른 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 따라서 다수의 폴리펩티드와 다수의 상이한 단백질이 무제한으로 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로는 본 발명의 변형 부가닌 단백질과 T-세포 항원결정인자 펩티드를 만드는 T-세포 항원결정인자 펩티드의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태로 비변형 T-세포 펩티드 보다 인산 T 세포를 활성화하는 성향이 감소된 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드인 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드를 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드는 비변형 T-세포 항원결정인자 펩티드에 비하여 자극지수의 감소를 유발하는 T-세포 분석에서 검사된 변형을 포함한다.
본 발명의 T-세포 항원결정인자 펩티드의 하나의 양태는 하기의 서열을 가진다.
AKX 1 DRKX 2 LX 3 LGVX 4 KL
상기의 X1, X2, X3 및 X4 중 적어도 하나는 다음의 비변형 서열로부터 변형된 것이다.
X1 은 T , A 또는 Q;
X2 는 G 또는 A;
X3 는 Q 또는 G; 및
X4 는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S (서열번호:8)이다
본 발명의 또 다른 양태로 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드는 하기의 서열을 가진다.
LGVX 4 KLEFSIEAIHG
상기 X 4 는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S (서열번호:9)이다.
본 발명의 또 다른 양태로 변형-세포 항원결정인자 펩티드는 하기의 서열을 가진다.
NGQEX 5 AKFFLIVIQM
상기의 X 5 는 Q 또는 A (서열번호:10)이다.
본 발명은 또한 T-세포 항원결정인자 펩티드 또는 본 발명의 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다음의 도면, 서열목록과 실시예는 본 발명의 이해에 도움을 줄 것이다. 알려져 있는 과정에 의하여 본 발명의 사상을 벗어나지 아니하는 범위 내에서 변형이 될 수 있다고 이해된다.
다음의 실시예로 본 발명은 더 자세히 설명되어지나, 이에 제한되지는 아니한다.
실시예
실시예 1: 나이브 ( naive ) 인간 T-세포 증식 분석을 이용한 부가닌의 항원결정인자 지도 작성 방법
성숙한(mature) 부가닌 단백질 서열을 가지고 있는 펩티드를 Den Hartog et al [ibid]에 의하여 기술된 바에 따라 합성하였다. 각각의 펩티드의 길이는 15 아미노산이고, 성공적인 펩티드는 12개의 잔기에 의하여 부분적으로 중복(overlap)되었다. 이러한 펩티드의 서열과 번호는 표 1에서 나타내었다.
나이브 공여체(naive donor)(예를 들어, 부가닌에 대한 감수성이 알려지지 않은)에서 얻은 PBMC(말초 혈액 단핵세포;peripheral blood mononuclear cell)를 이용한 T-세포 증식 분석에 상기 펩티드를 이용하였다. 최적의 MHC 클래스 II 동종이형의 적용범위를 얻기 위하여 20개의 공여체 PBMC를 선택하였다. 동종이형의 적용범위는 85%를 초과하였다. HLA-DR 동종이형은 표 2에서 보였다.
PBMC는 3H-티미딘 (3H-Thy) 혼합(incorporation)으로 평가한 증식 전에 7일 동안 3번 배양물(in triplicate cultures)에서 각각의 펩티드로 자극하였다. 모든 펩티드는 1μM 과 5μM의 2개의 다른 농도로 검사하였다. 자극지수(Stimulation indices; S.I.)는 혼합된 3H양으로 계산하고, 모의-자극(mock-stimulated) 대조군 세포에 혼합된 3H 양으로 나누었다.
12시간 이하로 저장한 인간의 혈액의 연막(Buffy coat)을 국립혈액원(National Blood Service, Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK)에서 얻었다. 피콜-파끄(Ficoll-paque)는 아마샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK)으로 부터 구입하였다. 1차 인간 림프구의 배양을 위한 무혈청 AIM V 배지(Serum free AIM V media)는 L-글루타민, 50μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 10μg/ml 겐토마이신(gentomycin) 및 0.1% 인간 혈청 알부민을 포함하는 것으로 기비코(Gibco-BRL, Paisley, UK)에서 구입하였다. 합성 펩티드는 유로시퀀스(Eurosequence, Groningen, The Netherlands)와 바브람테크닉스(Babraham Technix, Cambridge, UK)에서 구입하였다.
적혈구와 백혈구를 연막의 가벼운 원심분리로 혈장과 혈소판에서 분리하였 다. 혈장과 혈소판을 포함하고 있는 상층액을 제거하고 폐기하였다. 적혈구와 백혈구는 15ml 피콜-파끄에 층을 형성(layering)하기 전에 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 1:1로 희석하였다. 원심분리는 제조자가 추천하는 조건에 따라 수행하였고 PBMC는 혈청+PBS/피콜 파끄 경계면으로부터 수확하였다. PBMC는 PBS와 (1:1)혼합하여 원심분리로 모았다. 상층액을 제거하고 폐기하였으며 PBMC 펠렛은 50ml PBS에서 재현탁하였다. 세포는 원심분리에 의하여 다시 펠렛화(pelleted) 되었고 PBS 상층액은 폐기되었다. 세포는 50ml AIM V 배지를 이용하여 재현탁하고 이 시점(point)에서 계수하여 트리판 블루 염색 배제(trypan blue dye exclusion)를 이용하여 생존율을 평가하였다. 원심분리에 의해 세포를 다시 모아서 상층액을 폐기하였다. 세포는 3x107/ml의 밀도에서 저온저장을 위하여 재현탁하였다. 저장 배지는 90%(v/v) 열 불활성화 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, UK)과 10%(v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK)를 사용하였다. 세포를 조절된 냉동 컨테이너(regulated freezing container, Sigma)로 옮겨 -70℃에서 하룻밤 동안 놓아두었다. 필요할 때, 세포를 즉시 37℃의 물에 녹여 예열된(pre-warmed) 10ml AIM V 배지로 옮겼다.
PBMC는 2x105 PBMC/well의 밀도에서 96 웰 플레이트 밑판(well flat bottom plate)에서 단백질과 펩티드 항원으로 자극하였다. PBMC는 3H-Thy(Amersham-Pharmacia, Amersham, UK)로 펄싱(pulsing)을 하기 전에 37℃에서 7일동안 항온처리하였다. 앞에서 면역원성을 보인 2개의 대조군 펩티드, C-32 와 C-49 및 효능있 는(potent) 전체 단백질 비-회상(non-recall) 항원 케이홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)을 각각의 공여체 분석에 사용하였다. C-32 의 서열은 PKYVKQNTLKLAT 로 플루 혈구응집소(Flu haemagglutinin)잔기 307-319(서열번호:127)에서 유래한 것이다. C-49 의 서열은 KVVDQIKKISKPVQH 로 클라미디아(Chlamydia) HSP 60 (서열번호:128)에서 유래한 것이다.
펩티드는 최종농도 10mM 까지 DMSO에서 녹였고, 이러한 원액(stock solution)은 AIM V 배지(최종 종도 20μM)에서 1/500 희석하였다. 펩티드는 100μl에서 1 내지 5μM의 최종 농도를 주기위해서 편평한 바닥 96 웰 플래이트(flat bottom 96 well plate)에 첨가하였다.
녹인 PBMC의 생존율은 트리판 블루 염색 배제에 의하여 평가하였다. 그 후 세포를 2x106 cells/ml의 농도에서 다시 현탁하였고, 펩티드를 포함한 100μl (2x105 PBMC/well)를 각각의 웰로 옮겼다. 3번 웰 배양물을(Triplicate well cultures)은 각각의 펩티드 농도에서 분석하였다. 플레이트는 37℃에서 5% CO2의 습한 공기 하에서 7일동안 항온처리하였다. 세포는 18-21 시간동안 1μCi 3H-Thy/웰과 함께 펄싱하고 필터 매트(filter mats)에서 수확하였다. CPM 수치는 왈락 마이크로플래이트 베타 탑 플래이트 카운터(Wallac microplate beta top plate counter, Perkin Elmer)를 이용하여 결정하였다. 결과는 검사 펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 증식 스코어(score)로 검사 펩티드에서 측정된 증식 스코어(예를 들 어, 방사능을 분당(per minute) 계수한 것)를 나눈 것에서 유래하는 자극지수로 표현하였다.
상기 분석의 결과는 단백질의 가공된 영역(processed region)인 성숙한 펩티드 41, 44 및 50와 가공되지 않은 형태(unprocessed form)에서 펩티드 88에 대응하는 4가지의 T 세포 항원결정인자 영역의 존재를 나타내었다. 펩티드 88의 항원결정인자 영역은 성숙한 부분이 아니므로, 본 발명의 계획에서 그것은 배제하였다.
펩티드41(항원결정인자 영역 R1이라 불리우는)에는 4개의 반응 공여체; 공여체 4, 5, 10 및 11가 있다. 이에 대한 자극지수(S.I.)는 5μM에서 각각 3.6, 4.9, 2.1 및 2.0 이었다.
펩티드 44(항원결정인자 영역 R2라 불리우는)에는 2개의 반응 공여체; 공여체(S.I.=3.5) 4 및 11(S.I.=2.3)이 있다.
이웃하는 펩티드 43 및 45는 펩티드 44의 12개의 아미노산에 일부분이 중복(overlap)되기 때문에 낮은 수준의 T 세포 증식을 유발하였다.
펩티드 50에는 이 펩티드에 대한 2개의 반응 공여체; 공여체 4(S.I.=2.9) 및 공여체 14(S.I.=2.0)가 있다. 펩티드 51은 공여체 14(S.I.>1.9)에서 더 낮은 수준의 증식률을 보였다.
모든 PBMC 샘플에 대한 조직 타입은 상업적으로 이용 가능한 시약 시스템(commercially available reagent system, Dynal, Wirral, UK)을 이용하여 분석하였다. 분석은 공급자의 추천 프로토콜, 표준 보조 시약(standard ancillary reagents)과 아가로스 전기영동 시스템(agarose electrophoresis systems)에 따라 수행하였다. 반응 공여체 샘플 각각의 유전적 특징의 특이성은 표 2에서 나타내었다.
실시예 2: Bougainvillea spectabilis 로부터 부가닌의 복제
공급자(Promega, Southampton, UK)에 의하여 제공된 SV 총 RNA 분리 시스템(SV Total RNA Isolation System)과 프로토콜을 이용하여 Bougainvillea spectabilis 의 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 신선한 잎 조직은 액체 질소 하에서 미세한 가루로 갈았고 약 50 mg의 갈은 조직에서 RNA를 분리하였다. RNA 질과 양은 1% 아가로스 젤에서 시각화(visualization)하여 검토하였고, 부가닌 유전자는 반응 당 약 1μg RNA와 유전자 특이적 프라이머 OL1032 및 OL1033을 이용하여‘액세스 RT-PCR 시스템(Access RT-PCR System)’(Promega)으로 총 RNA로부터 증폭하였다. 프라이머 서열은 하기 표 3에서 보였다. 이러한 반응은 선천적 리더 서열과 전체-길이(full-length) 부가닌 서열을 포함하는 1242bp 단편을 생성하였다. 이러한 단편은 pGEM-T 이지 벡터(pGEM-T easy vector; Promega)로 클론하였고, 키트의 사용설명서(kit instruction)에 따라 pBou1를 지정하였다. 서열은 DNA 시퀀싱에 의하여 확인하였다.
부가닌 유전자는 주형으로 pBou1 플라스미드를 사용하여 PCR 클로닝에 의해pET21a (Novagen, Nottingham,UK)로 이입되었다. pelB (pectate lyase) 리더 서열을 부가닌 코딩 서열의 5’말단에 첨가하였고 6x 히스티딘 태그를 암호화하는 서열을 3’말단에 첨가하였다. pelB 리더는(Nde1 위치에 혼합되는) 프라이머 OL1322와 프라이머 OL1067를 이용하여 벡터 pPMI-his [Molloy, P. et al, (1995) J. Applied Bacteriology, 78: 359-365]로부터 증폭하였다. 부가닌-his 단편은 (Not1 위치에 혼합된)OL1068 과 OL1323를 이용하여 pBou1로부터 증폭하였다. pelB 리더는 오버랩 PCR을 이용하여 부가닌-his 단편의 틀(frame)에 융합되었고 결과 단편은 pGEM-T 이지(Promega)로 클론되었다. 서열 확립 다음으로 pelB-부가닌-his 단편을 Nde1-Not1 단편으로서 Nde1-Not1 다이제스쳔된(digested) pET21a로 클론하였다. 이러한 클론을 pBou32로 지정하였다.
실시예 3: 변형 부가닌 단백질의 제조
다수의 변형(돌연변이) 부가닌 단백질은 T-세포 항원결정인자 지도작성에 의하여 제공된 데이터와 인간 MHC 클래스 II 결합 그루브를 가진 펩티드의 결합을 자극할 수 있는 소프트웨어를 이용하여 디자인하였다.
후자의 기술에 대하여는 [WO 02/069232]에 자세히 설명되어 있다. 변이된 유전자를 구조하고 돌연변이 단백질의 작용활성에 대하여 검사하였다. 일반적으로는, 각각 하나의 아미노산 치환체를 포함하고 있는“단일 돌연변이”단백질을 첫 번째로 구조하여 검사한 후, 복수가 치환된 변형 단백질을 생산하기 위하여 활성 변형 단백질에 대한 유전자를 결합하였다.
돌연변이 유전자는 각각 돌연변이 아미노산 코돈을 “오버랩 프라이머(overlap primer)”에서 돌연변이를 이용하여 유전자 내로 도입하는 오버랩 PCR 과정을 이용하여 구조하였다. 이러한 기술은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, [Higuchi, et al (1900) Nucl. Acids Res. 16:7351]에 잘 기술되어 있다. 37개의 단일 돌연변이 변형 단백질 전체를 구조하고 존속하는 기능적 활성에 대하여 검사하였다. 또한, 치환기 Y70A를 포함하고 있는 음성 대조군 변형 단백질을 구조하고 모든 분석에서 검사하였다. 사실 37개의 “단일 돌연변이”중 하나의 변형 부가닌 단백질은 두 개의 직접적으로 연결되어 있는 치환기(E151T와 I152E)를 포함하는 데 본 발명에서는 단일 돌연변이로서 계수하였다. 상기 치환체를 검사하여 대응하는 활성치를 표 4 에서 보였다.
11 개의 복수 치환 변형 단백질 전체를 구조하고 존속하는 활성에 대하여 검사하였다. 상기 치환체를 검사하여 대응하는 활성치를 표 5에서 보였다.
표 6 에서는 치환 변형 단백질의 서열을 설명하였다.
표 7 에서는 몇가지 특이적 서열목록을 보인다.
모든 예에서, 단백질은 정제하여 실시예 4 및 하기 실시예 5에서 기술된 과정에 따라 검사하였다.
실시예 4: 부가닌 단백질의 발현과 정제
제조자의 설명에 따라 플라스미드 pBou32를 BL21(DE3)(Novagen) 적격세포(competent cell)내로 형질전환 시키고, 50μg/ml 카르베니실린(carbenicillin)을 포함하는 LB (Invitrogen, Paisley, UK) 플레이트에서 선별하였다. 이렇게 형질전환된 신선한 콜로니에 항생제가 없는 5 ml 2xYT(Invitrogen) 브로스(broth)를 접 종하여, 250rpm 으로 37℃에서 OD600 = 1.5-2.0 까지 흔들어 증식시켰다. 다음으로 이러한 배양물을 실온에서 2500rpm 으로 15 분간 원심분리하여 세포를 5 ml 신선한 2xYT 와 1mM IPTG에 다시 현탁시켰다. 이러한 배양물은 30℃에서 300rpm으로 1.5시간동안 흔들어 항온처리하였고 세포는 원심분리와 페기된 상층액에 의하여 모았다.
세포 펠렛은 1 ml PEB2 (50mM Tris-HCl pH8), 20% 수크로스(sucrose), 1 mg/ml 리소자임(lysozyme), 1x 완벽 프로테아제 인히비터 정제(Complete Protease Inhibitor Tablet, Roche, Lewes, UK)에서 다시 현탁시키고 얼음에서 1시간 동안 항온처리하고 가볍게 혼합하였다. 세포 부스러기는 14,000 rpm으로 4℃에서 원심분리하고 펠렛은 폐기하였다. 결과물인 상층액은‘원형질막 주위 부분(periplasmic fraction)인 것으로 생각된다. 부가닌 단백질은 원형질막 주위 부분으로부터 상업적으로 판매되고 있는 “스핀 컬럼(spin column)”을 이용하여 제조자(Qiagen, Crawley, UK)의 지시에 따라 니켈 친화성 컬럼 크로마토그래피(nickel affinity column chromatography)에 의하여 정제하였다. 결과물은 4 리터의 인산완충식염수(0.138M NaCl, 0.0027M KCl , pH 7.4)에 대항하여 10000 분자량 분리(cut-off) ‘슬라이드 에이 라이저(Slide-A-Lyzer)’(Pierce, Chester, UK)를 이용하여 하룻밤동안 4℃에서 투석하였다. 투석에 따라, 단백질 농도를 마이크로 BCA 분석 키트 (Micro BCA Assay Kit;Pierce)를 이용하여 산정하였고 샘플을 -20℃에 저장하였다.
또한, 부가닌 단백질 농도는 ELISA에 기초한 분석 시스템을 이용하여 결정하였다. 간단히 말해, 부가닌을 발현하는 플라스미드를 가진 2마리의 쥐의 유전적 면 역화를 통해 부가닌에 대한 항혈청을 만들었다(Genovac, Freiburg, Germany). ELISA에서, 재조합 부가닌은 His-태그를 통해 Ni-아가로스 코팅된 플래이트(plate)에 포획하고 다음으로 쥐(rat) 항혈청과 2차 HRP-접합-항-쥐 Fc 항체(Sigma, Poole, UK)에 감지되었다. 표준에 따라, E.coli에서 발현된 야생형 부가닌을 다량 제조하고 각각의 판단에서(in each determination) 전체 단백질 분석(total protein assay)을 이용하여 정량하였다.
실시예 5: 부가닌 활성의 분석
야생형 및 변형(돌연변이) 부가닌 단백질의 활성은 무세포(cell-free) 단백질 합성 분석에서 단백질 합성을 방해하는 그들의 능력을 측정하여 검사하였다.
10 μl TNT 짝지어진 전사/번역 혼합물(Coupled Transcription/Translation mix;Promega), 20μM 메티오닌, 120 ng pT7 루시퍼라아제 DNA (Promega) 및 WT의 계단 희석액의 혼합물과 돌연변이 부가닌 단백질을 최종 부피 12.5 μl로 하여 30℃에서 한 시간 동안 항온처리한 후 루시퍼라아제 분석 시약 “스테디그로우(SteadyGlow)”(Promega) 100 μl를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 루시퍼라아제의 활성은 왈락 발광 계수기(Wallac luminescence counter)를 이용하여 측정하였다. 활성 부가닌 단백질은 측정된 루시퍼라아제 활성의 감소로 검출하였다. 각각의 변형 부가닌 단백질은 각각의 데이터 포인트를 2번(in duplicate)으로 하여 적어도 5개의 농도로 검사하였다. 각 실험에서는 양성 또는 음성 대조군을 포함하였다.
단일 돌연변이 단백질의 결과는 표 4 에서 보였다. 복수 돌연변이 변형 부가 닌 단백질의 결과는 표 5 에서 보였다. 각각의 결과에서는 야생형 단백질의 활성과 관련하여 발현하였다. 모든 분석은 Y70A 치환기를 가진 불활성 돌연변이 부가닌 단백질을 포함하여 수행하였다.
또한, 루시퍼라아제 분석 결과에서 대조군에서 루시퍼라아제의 활성 대 첨가된 부가닌의 단백질 농도를 %로 보일 수 있다. 그러한 예로 도 1 에서는 두 개의 다른 복수 돌연변이 부가닌 단백질에 대하여 예상되는 결과를 보였다.
실시예 6: T-세포 항원결정인자의 손실에 따른 부가닌 서열의 변이 분석
Bou156로 지정된 복수 변형 부가닌 단백질에 대하여 면역원성 분석을 이용하여 검사하였다. 상기 변이체는 치환기 V123A, D127A, Y133N 및 152A을 포함한다. 면역원성 검사는 전체 부가닌 단백질을 이용한 검사에 의하여 손상을 받을 수 있는 살아있는 세포의 이용을 포함하고, 나아가 이러한 분석은 변이체 Bou156로 혼입될 수 있는 치환기를 포함하는 합성 단백질을 이용하여 수행하였다. 검사한 단백질 목록은 표 8에서 보였다. 상기 분석은 20개체의 PBMC 공여체 풀(pool)을 이용하여 상기 실시예 1에서 기술한 과정에 따라 수행하였다. 펩티드는 두 개의 다른 최종 펩티드 농도(1μM 과 5μM)에서 각각 공여체 샘플에 대하여 3번(in triplicate)검사하였다.
결과는 공여체 샘플 당 펩티드 당 SI(SI per peptide per donor sample)로서 표현하였고 이는 도 2에서 보였다. DeI-41은 펩티드 서열 AK A DRK A LELGV N KL(서열번호:29)이다. Del-44는 펩티드 서열 LGV N KLEFSIEAIHG(서열번호:30)이다. DeI-50는 펩티드 서열 NGQE A AKFFLIVIQM(서열번호:31)이다. 변형 펩티드는 어느 공여체에서도 T 세포 반응을 보이지 않았다(S.I.<2). 대조적으로 면역원성 대조군 펩티드는 6개의 공여체의 T 세포를 자극하였다(S.I.>2).
실시예 7: VB6-845: 면역원성을 제거한(de-immunized) 부가닌(De-bouganin)의 최적의 전달을 위한 Ep-CAM-특이적 Fab 항체의 재조합 공정
본 예와 실시예 8에서, 면역원성을 제거한 부가닌은 Bou156이다.
종양-표적화 세포독소는 박테리아, 곰팡이 또는 식물 독소에 관련된 항원의 가변 영역으로 구성되어 있다. 본 연구는 표적화 부위에 연결되어 있는 면역원성을 제거한 부가닌을 포함하는 본 발명의 면역원성을 제거한 부가닌의 구조가 면역원성을 감소시키나 여전히 그들의 생물학적 활성은 남아있다는 것을 설명한다. 표 12는 몇가지 타입의 종양에 대한 Ep-CAM 항체의 결합을 보이고 이는 이러한 종류의 암의 치료에 이용될 수 있다는 것을 보인다.
면역원성을 제거한( De - immunized ) 부가닌 구조: 드- 부가닌에 연결된 표적화부위를 지시하는 Ep - CAM
항-Ep-CAM scFv 항체의 Fab 형(version)인 VB5-845는 유전적으로 부가닌의 면역원성을 제거한 형(de-bouganin)인 Bou 156에 연결되어 있다. Bou 156는 효능이 있는 식물유래 타입 Ⅰ 리보솜-불활성화 단백질(ribosome-inactivating protein, RIP)로 항체-독소 구조 VB6-845를 만든다. 도 3에서는 VB6-845의 구조를 보인다. 도 3A에서는 pelB 리더 서열을 가진 프로(pro)-VB6-845의 디시스트론 단위(dicistronic unit)를 보인다. 이의 아미노산 서열(서열번호: 16) 과 핵산서열(서열번호: 15) 는 도 3B에서 보인다. 도 3C에서는 응집된(assembled) VB6-845 단백질을 보이는데 이는 아래에 더 자세히 설명하였다. 이러한 구조의 검사로 상기 구조가 생물학적 활성(독성)과 표적화 부위(Ep-CAM 항체)에 대한 특이성을 유지한다는 것을 보였다.
면역원성을 제거한 부가닌 구조의 위치확정
(Orientation of the de-immunized bouganin construct)
최적의 항원-드-부가닌의 위치를 결정하기 위해서, 몇 가지 형태의 디시스트로닉 발현 단위를 생성하여 발현시키고 그 효능(potency)을 검사하였다.
각 경우에서, 디시스트로닉 단위는 아라비노스-유도 아라BAD(arabinoseinducible araBAD)하에서 pING3302 벡터에 클론하였고(도 4), E104 E.coli로 형질전환하였다. 이러한 도입에서, pelB 리더 서열의 존재는 배양 상층액에 Fab-드-부가닌 융합 단백질의 분비를 지시하였다. 갈라질 수 있는 링커(cleavable linker)는 드-부가닌이 표적화 부위로부터 갈라지도록 하였고 그의 생물학적 활성을 나타내도록 하였다. 하나의 양태로서 상기 링커는 퓨린 링커이고, 당해 분야에서 숙련된 기술자는 또 다른 갈라질 수 있는 링커가 적절할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 링커는 표적화 특이성과 환경에 기초하여 선택될 수 있다. 구조의 샘플을 만들고 아래와 같이 검사하였다:
도 3: VB6-845, 상기 드-부가닌은 퓨린 링커를 통하여 CH 영역의 C-말단에 연결되었다. 도 3A는 프로-서열의 디시스트로닉 단위를 나타내고, 도 3B는 핵산 코딩 서열(서열번호:15)와 서열(서열번호:16)을 나타내며, 도 3C은 pelB 서열이 없는 응집 VB6-845 단백질을 나타낸다.
도 5는 대조군 식물 독소, 드-부가닌(VB5-845)이 없는 Fab 항-Ep-CAM 구조를 보인다. 도 5A는 이의 프로-서열의 디스트로닉 단위를 보이고, 도 5B는 이의 핵산 코딩 서열(서열번호:17)과 프로-서열의 핵산 서열(서열번호:18)을 보이며, 도 5C는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845 단백질을 보인다.
도 6은 항-Ep-CAM 드-부가닌 구조 VB6-845-CL-드-부가닌을 보이며, 여기서 Bou156 는 CL 영역의 C-말단에 연결되어 있다, 도 6A 는 그 프로-서열의 디시스트로닉 단위를 보이고, 도 6B는 핵산 코딩 서열(서열번호:19)과 프로-서열의 아미노산 서열(서열번호:20)을 보이며, 도 6C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-CL-드-부가닌 단백질을 보인다.
도 7 에서는 Fab 항 Ep-CAM, 드-부가닌(de-bouganin)구조, VB6-845-NVH-드-부가닌을 보인다. 여기서 Bou156 은 VH 영역의 N-말단에 연결되어 있다. 도 7A 는 프로서열의 디시스트로닉 단위를 보이고, 도 7B 에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:21) 및 아미노산 서열(서열번호:22)을 보이며, 도 7C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-NVH-드-부가닌 단백질을 보인다.
도 8 에서는 Fab 항 Ep-CAM 구조, VB6-845-NVL-드-부가닌을 보인다. 여기서 Bou156 은 VL영역의 N-말단에 연결되어 있다. 도 8A에서는 프로서열의 디시스트로닉 단위(dicistronic unit)를 보이고, 도 8B 에서는 프로서열의 핵산서열(서열번호:23) 및 아미노산 서열(서열번호:24)을 보이며, 도 8C 에서는 pelB 서열이 없는 응집된 VB6-845-NVL-드-부가닌 단백질을 보인다.
하나의 양태로, 드-부가닌 분자는 무거운 또는 가벼운 사슬의 C-말단 끝에 연결되어 있다. 최적의 형상으로 첫 번째 단위로 N-말단 히스티딘 친화성을 가진 VH-CH 영역에 인접한 pelB 리더 서열을 포함하였다. 바로 그 다음으로는 프로테아제-감수성 링커(protease-sensitive linker)에 의해 드-부가닌에 연결되어 있는 pelB-VL-CL 영역을 포함하는 두 번째 단위였다(도 6). 드-부가닌이 N-말단에 재위치선정을 한(re-positioned) 구조에 대하여, 웨스턴 블롯 분석은 어떠한 감지 가능한 결과물을 보이지 않았고, 단지 드-부가닌에 연결된 C-말단(도 3 및 6의 구조)만이 불활성화 가용성 단백질(도 9)을 산출하였는데, 이는 흐름세포측정(flow cytometry)의 반응성 검사에서 Ep-CAM-양성 세포주에 잘 결합하는 성질을 보였다. 웨스턴 블롯 분석에서, 도 9는 실험실에서(at lab scale) 유도된 E104의 상층액에서 VB6-845 와 VB6-845-CL-드-부가닌의 발현을 보인다. 상층액의 일부분, 16 마이크로리터(microlitres)를 감소되지 않은 조건(non-reducing conditions)에서, SDS-PAGE 아크릴아미드 젤에 로딩하였고 재조합 단백질의 동일성과 크기를 확인하기 위 하여 토끼의 다클론 항 anti-4D5 항체(rabbit polyclonal anti-4D5 antibody), 다음으로 염소 항-토끼(goat anti-rabbit)(1/2000) 또는 염소 항-인간 카파-가벼운 사슬-HRP 항체(anti-human Kappa-light chain-HRP)(1/1000)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 화살표는 전체-길이 VB6-845 (도 3의 구조) 및 VB6-845-CL-드-부가닌(도 6의 구조)를 나타낸다. 유도되지 않은(non-induced) E104 배양 상층액의 웨스턴 블롯팅은 항체의 특이성을 나타내는 대응 밴드를 나타내지 않았다(not shown).
대조군(Ep-CAM-음성 세포주, A-375)과 비교한 Ep-CAM 양성 세포주 CAL 27 과 NIH:OVCAR-3에 대한 Ep-CAM 양성 세포주 VB6-845(도 3)과 VB6-845-CL-드-부가닌(도 6)의 반응 결과물은 도 10A에서 보인다. 그 결과는 또 다른 항-Ep-CAM 구조, 드-부가닌이 또 다른 식물 독소인 겔로닌(gelonin)으로 대체된 VB6-845-겔로닌(도 14C 에서는 이의 아미노산 서열(서열번호:26)과 핵산 서열(서열번호:25)를 보인다)으로 수행한 동일한 반응성 검사와 비교할만 하였다. 겔로닌 구조의 반응성 검사의 결과는 도18B에서 보였다. 최적의 위치선정(orientation)을 가진 분자에서 두 번째 드-부가닌 영역(domain)의 첨가는 결과물을 생산하지 못했다.
흐름세포측정(flow cytometry) 검사는 얼음에서 한시간 동안 0.45 x 106 세포의 구조물 또는 대조군을 배양하여 수행하였다. 세척 후, 세포 표면 구조물은 얼음에서 한시간 동안 토끼-항-부가닌(도 10A) 또는 마우스 항-His 태그(도 10B)에 의해 감지하였다. 상기 세포를 세척하고 FITC-접합 양(sheep) 항-토끼 IgG (도 10A)와 FITC-접합 양(sheep) 항-마우스(IgG)(도 10B)로 얼음에서 30분 동안 항온처리하였다. 연속적으로 세포를 세척하고, 흐름세포측정에 의한 항체 결합의 평가를 위해 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 포함한 PBS 5% FCS에서 재부유하였다. A-375를 가진 VB6-845 및 VB6-845-CL-드-부가닌의 배양에 따른 중앙 형광(median fluorescence)에서는 어떠한 이동도 감지되지 않았다. 대조적으로, Ep-CAM 양성 세포주, CAL 27 및 :OVCAR-3의 중앙 형광에서 표지된 이동이 관찰되었다(도 10A). 앞에서 언급한 바와 같이 VB6-845의 결과물은 겔로닌 구조와 유사하였다(도 10B).
Ep - CAM 특이성
VB6-845의 scFv 형태이나 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A)를 포함하고 있는 프록시니움(Proxinium™) VB6-845(도 3의 구조)의 경쟁 분석(competition assay)은 VB6-845의 Ep-CAM 특이성이 Fab 형태로 제조되었을 때 대체되지 못한다는 것을 보인다(도 11).
도 11은 1 및 10 μg/mL에서 VB6-845 와 0 에서 100 μg/mL 까지 증가된 농도의 프록시니움 경쟁 분석의 흐름세포측정 결과로 NIH:OVCAR-3 세포(Ep-CAM 양성 종양 세포주)함께 항온처리한 것을 보인다. 4℃에서 1시간 항온처리 후에, 세포를 세척하고 결합된 VB6-845는 이차항체(biotinylated) 스트렙타비딘-사이크롬(streptavidin-cychrome)에 따른 토끼 항-부가닌에 의해 감지되었다. 같은 실험 을 음성 대조군으로 사용된 4B5-PE에 대하여 수행하였다. 반응 조건은 도 11에 표시하였다.
효능(생물학적 능력)
(Potency (biological activity))
무세포(도 12)와 MTS(도 13A 및 B) 분석은 Fab 단편에 접합하였을 때 드-부가닌의 잔존하는 효능을 나타낸다. 효능 측정에 사용한 MTS 분석은 당해 기술분야에서 알려진 표준 기술을 이용하여 수행하였고, 하기 실시예 8에서 더 상세히 기술하였다. Ep-CAM-양성 세포주, CAL 27 및 NIH:OVCAR-3 를 이용하여, VB6-845의 IC50 는 각각 3 내지 4 nM 및 2 내지 3 nM 이었다. VB6-845-CL-드-부가닌의 경우에, 효능은 1 내지 2 nM CAL 27 및 0.6 내지 0.7 nM NIH:OVCAR-3에서 측정하였다. 면역원성을 제거한(de-immunized) 부가닌에 연결된 인간 종양 표적화 항체 단편을 포함하는 Fab 항-Ep-CAM 구조의 발달(development)은 이러한 약물의 체계적인 투여를 반복하는 것을 허용하여야 하는데 이는 더 치료적 이점을 낳기 때문이다.
구조물( constructs )의 수확
당해 분야에서 알려진 기술에 의하여 세포 배양물에서 상기 구조물을 수확할 수 있다. 예를 들면 His 태그가 펩티드 구조의 N-말단에 놓인다면, Fab- 부가닌 단백질은 Ni2 + 킬레이팅 포획(chelating capture) 방법을 이용하여 정제할 수 있다.
VB6-845 변이체의 페드 배치 발효공정(fed batch fermentation)을 TB 배지를 이용한 15L CHEMAP 발효기(fermenter)로 수행하였다. 20(mid-log)의 OD600에서, 배양물은 50% 글리세롤과 200g/l L-아라비노스(arabinose)를 포함한 피드(feed)와 유도체(inducer)의 혼합물로 유도되었다. 유도 후 30시간에서, 배양물을 수확하여 30분동안 8000 rpm 에서 원심분리하고, VB6-845 변이체를 CM 세파로스(sepharose) 및 금속-대전된 킬레이팅 세파로스 컬럼(Metal-Charged Chelating sepharose column) 다음으로 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 이용하여 정제하였다. 요약하면, 상층액을 농축하고 20 mM 인산 나트륨(sodium phosphate) pH 6.9 ± 0.1에 대하여 초여과(diafilter)하였다. 다음으로 초여과 농축 상층액은 CM 세파로스 컬럼에 적용하였고, 20 mM 인산 나트륨, 25 mM NaCl pH 6.9 ± 0.1로 평형이 되게 하였다. 컬럼은 20 mM 인산 나트륨, 25 mM NaCl pH 6.9 ± 0.1으로 세척하고, 결합된 VB6-845은 연속적으로 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl pH 7.5± 0.1으로 희석하였다. CM 세파로스 희석액은 최종 농도 0.25% 트리톤(Triton)-X100로 조절하고 대전된 킬레이팅 세파로스 컬럼에 적용하였다. 그 후 킬레이팅 세파로스 컬럼 (chelating sepharose column)을 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 0.25% 트리톤-X100 pH 7.5 ± 0.1 이어서 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl pH 7.5 ± 0.1 이어서 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 10mM 이미다졸(imidazole) pH 7.5 ± 0.1의 3개의 다른 완충용액으로 세척하였다. 다음으로 결합된 VB6-845를 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 pH 7.5 ± 0.1로 희석하고 2 mL 분획(fraction) 으로 수집하였다. A280에서 흡광도는 각 분획마다 결정하였고 재료를 병합한(pooled) 분획을 순도 >80%을 얻기 위하여 크기 배제 컬럼 S200에 적용하였다. 단백질 순도와 내부독소를 제거하기 위한 한 양태로, 병합 SEC 20mM NaPO4, pH 7.5로 5배(5-fold) 희석하였고, 약 5 ml/min의 흐름 속도에서 20 mM NaPO4, 25 mM NaCl pH 7.5로 평형화된 Q-세파로스 15ml 빠른 흐름 컬럼(fast flow column )을 통과시켰다. 샘플을 상기 컬럼을 통과시킨 후에, 컬럼을 평형 완충용액 10CV로 세척하고 세척물은 초기 Q-세파로스 흐름 관통물(flow through)과 병합하였다. 흘러나온물은 최종농도 7.5 mg/ml를 얻기 위하여 30kDa MWCO 막(Sartorius hydrosart membrane)을 이용하여 ~10배(10-fold)까지 농축하였다. 그 후 Tween-80은 0.1%의 최종농도에 첨가하였다. 최종 생산물은 무균 필터로 걸러서 -80℃에서 저장하였다. 공정 각 단계의 샘플은 항-4D5 항체와의 면역블롯팅 후에 웨스턴 블롯에 의하여 분석하였다. 순도는 콜로이드 블루 염색(colloidal blue staining)으로 확인하였다. VB6-845 변이체의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석과 ELISA에 의하여 판단하였다.
실시예 8: 면역원성이 제거된 부가닌(드-부가닌)과 유전적으로 연결된 재조합 Ep-CAM-특이적 Fab 항체인 VB6-845의 기능적 및 생물학적 특징화
화학요법제(Chemotherapeutics)는 많은 고형암의 치료에 있어서 종종 치료의 기준을 나타내는 세포독성이 매우 강한 제제이다. 이러한 약물의 세포독성 작용은 빠르게 분열하는 정상세포와 암세포 모두를 표적으로 한다. 따라서 매우 다양한 치 료 부작용을 만든다. VB6-845은 식물 유래 독소 부가닌의 면역원성을 제거한 형태에 연결된 Fab 항체이다. 정의된 종양-표적 특이성이 부족한 화학요법제와는 다르게, VB6-845는 오로지 Ep-CAM-양성 종양 표적화에 대한 세포용해 효과만을 제한한다. 본 연구에서, 흐름세포측정 분석과 세포독성은 VB6-845의 효능(potency)과 선택능(selectivity)을 평가하기 위하여 측정하였다.
흐름세포측정( Flow Cytometry )
본 연구에서 사용한 종양 세포주는 ATCC로부터 구입하였고 10% FCS를 각각 추가한 RPMI 1640 또는 DMEM에서 증식시킨 세포주 C-4I, TOV-112D를 제외하고는 ATCC의 권유에 따라 증식시켰다. 종양 세포는 생존율이 90%를 넘는 60-70% 합류점(confluence)에서 수확하였다. 인간 정상 유방 상피 세포(human normal mammary epithelial cells, HMEC)는 CAMBREX에서 구입하였고, CAMBREX에서 제공된 과정에 따라 특별한 배지에서 유지하였다. 세포는 생존율이 90%를 넘는 70% 합류점(confluence)에서 수확하였다.
자궁내막(endometrial ovarian) 및 자궁목(cervical) 암의 부인과적 세포주(gynaecological cell lines)에 대한 흐름세포측정에서 VB6-845 결합에 대한 검사를 하였다(표 9). VB6-845의 10 μ㎍/mL을 각각의 세포주(3 x 105 cells)에 첨가하였고 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. A-375 및 CAL 27 는 각각 음성 및 양성 세포주 대조군으로 사용하였다. 결합하지 않은 재료를 씻어낸 후에. 마우스 단 클론 항-히스티딘 항체(mouse monoclonal anti-Histidine antibody, Amersham Pharmacia, Cat # 27471001)를 10% FCS를 포함하고 있는 PBS에서 1/800으로 희석하고 4℃에서 1시간 더 항온처리하였다. 다음으로, PBS-10% FCS 에서 1/100으로 희석한 FITC-표지된 항-마우스 IgG (The Binding Site, Cat# AF271)를 4℃에서 30 분 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 죽은 세포를 제거하기 위하여 프로피디움 요오드화물 염색(propidium iodide staining)에 따른 FACS 칼리버(Calibur)로 분석하였다.
세포독성( Cytotoxicity )
흐름세포측정 연구에서 열거된 세포에서 VB6-845의 파괴(killing) 수준은 표 10 에서 나타내었는데, 이는 상기 구조물이 Ep-CAM-양성 세포주에 대항하여 드-부가닌 세포독성 활성을 유지한다는 것을 나타낸다. 세포독성은 다른 식물유래 독소, 겔로닌을 포함하는 또 다른 Fab VB6-845 변이체와 비교할만 하다(도 14). 도 14A 에서는 겔로닌, Fab 항-Ep-CAM-겔로닌 구조(VB6-845-Gelonin)와 CAL 27 (도 14A) 및 NIH:OVCAR-3 세포(도 14B)에서 Fab 항-Ep-CAM-드-부가닌(Bou156) 구조(VB6-845)의 세포독성을 비교하였다. VB6-845-겔로닌 구조의 핵산 서열과 아미노산 서열은 도 14C에서 보인다.
VB6-845 (도 3의 구조)의 특이성과 선택성을 연구하기 위하여, VB6-845 (90% 순도)의 세포독성은 17가지의 화학요법제 약물(LKB Laboratories Inc.)과 함께 Ep-CAM-양성(NIH:OVCAR-3) 및 Ep-CAM-음성(HMEC, DAUDI, A-375) 세포주(표 11)에 대항 하여 검사하였다.
MTS 분석은 당해 분야에서 알려진 표준 기술을 이용하여 수행하였다. 보다 구체적으로는, 50 마이크로리터(microlitres) 세포 (2 x 104 cells/ml)를 각 웰마다 심었고(seeded), 플레이트를 2시간 동안 5% CO2 37℃에서 항온처리하였다. 다음으로 50 마이크로리터 스파이크된 약물(spiked drug)(예를 들어 검사되거나 대조군인 구조물)을 증가하는 농도(increasing concentration)에서 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 가지거나 가지지 않는 배양 배지를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트는 5일 동안 5% CO2 37℃에 두었다. 5일 후에, 세포 증식률의 억제를 MTS 시약(Promega, Cat# G5430) 20 마이크로리터를 첨가하여 평가하였다. 플레이트는 2시간 동안 5% CO2 37℃에서 더 항온처리 하였고, OD는 플레이트 리더 분광광도계(spetrophotometer)를 이용하여 490nm 에서 읽었다. 배경 값(Background values)을 각 농도에서 얻은 샘플 값에서 빼고(subtracted) 결과는 생존 세포의 퍼센트로서 표현하였다. 각각의 약물에 대한 IC50 값을 각각 세포주에 대하여 계산하였다.
표준 화학요법제 패널(panel)을 이용하여 NIH:OVCAR-3, Ep-CAM-양성 난소암에 대항하는 세포독성에 대한 분석을 하였을 때, VB6-845는 검사한 17가지 약물 중에 12가지 보다 더 좋은 효능을 보였다(표 11). 5가지 화학요법제는 더 독성이었는데, 그들이 어떠한 세포 특이적 파괴(killing)가 부족한 경우에 더 높은 독성을 보였다. 난소암의 치료에 있어서 추천되는 5가지 화학요법 치료제, 파클리탁 셀(Paclitaxel), 카보플라틴(Carboplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 독소루비신(oxorubicin) 및 토포테칸(Topotecan)중 단지 2가지, 파클리탁셀(Paclitaxel) 과 토포테칸(Topotecan)만이 더 세포독성이 있었다. VB6-845는 1 내지 2nM의 범위에서 높은 세포융해 반응을 보인 반면에, 파괴(killing) 능력은 1 내지 2 nM의 범위에서, Ep-CAM-양성 종양 세포주 NIH:OVCAR-3에 배타적으로(exclusively) 제한된다. Ep-CAM-음성 세포주의 파괴(killing) 능력은 VB6-845와 함께 나타남에도 불구하고 세포독성 효과는 적어도 200-배(fold)이고 최대로 >1000-배(fold) 독성이 적다. 따라서, VB6-845는 더 낮은 독성 프로파일(profile)과 결합할 때 화학요법제를 대체하는 효능있는 항체-지시 치료제(potent antibody-directed treatment)가 되고, 고형암의 다수의 다른 형태의 치료에 있어서 많은 희망을 가져다 준다.
실시예 9: VB6 -011: 면역원성이 제거된 부가닌(드-부가닌)의 최적의 전달을 위한 종양-관련 항원-특이적 Fab 항체의 재조합 공정
종양-표적화 세포독소는 세균, 곰팡이 또는 식물 독소와 연결된 항체의 가변 영역으로 구성된다. 본 연구에서는 표적화 부위에 연결된 면역원성이 제거된 부가닌을 포함하는 본 발명의 면역원성이 제거된 부가닌 구조가 감소된 면역원성을 가지는 반면, 그들의 생물학적 활성이 여전히 남아있다는 것을 보였다. 표 13 에서는 종양-관련 항원 항체가 몇가지 유형의 종양에 결합하는 것을 보이고, 따라서 이러한 유형의 암을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 보였다.
면역원성이 제거된 부가닌 구조: 드- 부가닌에 연결된 표적화 부위를 지시하는 종양 -관련 항원
종양-관련 항원을 인식하는 단클론 H11 항체는 부가닌의 면역원성을 제거한 형태(드-부가닌)로 효능있고, 식물에서 유래한, 타입 Ⅰ 리보솜-불활성화 단백질(ribosome-inactivating protein, RIP)인 Bou 156 에 유전적으로 연결되어, 항체-독소 구조 VB6-011를 생성한다. 도 15는 VB6-011의 핵산 코딩 서열과 아미노산 서열이다. 이러한 구조의 검사는 상기 드-부가닌의 구조가 생물학적 활성(세포독성)을 유지하고 있다는 것을 나타낸다.
효능 (생물학적 활성)
Potency ( biological activity )
MTS 분석은 드-부가닌이 Fab 단편과 접합되어(conjugated) 있을 때 그 효능을 유지한다는 것을 보인다(도 16). 효능을 측정하기 위하여 사용된 MTS 분석은 당해 분야에서 알려진 표준 기술을 이용하여 수행하였고 이는 실시예 8 에서 더 상세히 기술하였다.
세포독성( Cytotoxicity )
VB6-011의 특이성과 선택성을 탐구하기 위하여, 세포독성 활성을 MB-435S에 대하여 검사하였다. MTS 분석은 당해 기술분야에서 알려진 표준 기술을 이용하여 수행하였다. 구체적으로는, 50 마이크로리터의 세포(2 x 104 cells/ml)을 각 웰(well)마다 심어(seeded) 2시간 동안 5% CO2 하에서 37℃에서 항온처리하였다. 다음으로 50 마이크로리터 스파이크된 약물(spiked drug)(예를 들어 검사되거나 대조군인 구조)을 증가하는 농도(increasing concentration) 에서 배양배지에 첨가하였다. 세포를 가지거나 가지지 않는 배양 배지를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트는 5일 동안 5% CO2 37℃ 에 두었다. 5일 후에, 세포 증식률의 억제는 MTS 시약(Promega, Cat# G5430) 20 마이크로리터를 첨가하여 평가하였다. 플레이트는 2시간 동안 5% CO2 37℃에서 더 항온처리하였고, OD는 플레이트 리더 분광광도계(spetrophotometer)를 이용하여 490nm 에서 읽었다. 배경 값(Background values)을 각 농도에서 얻은 샘플 값에서 빼고(subtracted) 결과는 생존 세포의 퍼센트로서 표현하였다. 결과는 VB6-011의 IC50 값은 350nM 라는 것을 보였다.
본 발명은 현재 바람직한 예로서 고려되는 것을 참조하여 기술되었으나, 본 발명은 기술된 실시예에 한정되지 아니한다. 대조적으로, 본 발명은 다양한 변경을 포함하고, 추가된 청구항의 발명의 사상과 범위 안에 균등한 배열이 포함된다.
각각의 개별적 공개특허, 특허, 또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 그 전체로서 참고문헌으로 포함되도록 지시된 것과 마찬가지의 정도로 모든 공개특허, 특허 및 특허출원은 그 전체로서 본 발명의 참고문헌으로서 포함된다.
표 1
Figure 112006075510457-pct00001
부가닌 서열 펩티드. 밑줄친 잔기는 성숙한 단백질에 존재하지 않는다.
표 2
Figure 112006075510457-pct00002
PBMC 공여체의 MHC 동종이형
표 3
Figure 112006075510457-pct00003
프라이머 서열은 WT 부가닌 유전자의 구조에 사용된다.
표 4
구조되고 검사된 단일 치환 부가닌 변이체.
Figure 112006075510457-pct00004
＊ 루시퍼라아제 분석에서 활성도
++= WT 단백질과 같거나 높음. += WT 활성도의 2-배(fold) 이내. +/-= WT 활성도의 3-배(fold) 이내. --= WT 활성도의 1/3 이하. WT= 야생형(Wild-type) 단백질.
** 클론ID. 기능적 활성 변이체만 지정.
표 5
구조되고 검사된 복수 치환 부가닌 변이체.
Figure 112006075510457-pct00005
＊ 루시퍼라아제 분석에서 활성도:
++= WT 단백질과 같거나 높음. += WT 활성도의 2-배(fold) 이내. +/-= WT 활성도의 3-배(fold) 이내. --= WT 활성도의 1/3 이하. WT= 야생형(Wild-type) 단백질.
표 6
Figure 112006075510457-pct00006
*번호 붙이기(numbering)은 부가닌의 리딩 프레임(reading frame)의 잔기 1로 부터 시작하고 대부분의 구조물에 포함된 PelB 리더 서열(leader sequence)을 배제한다.
표 7
Figure 112006075510457-pct00007
표 8
T 세포 분석으로 더 검사한 부가닌의 변형 펩티드 및 WT 펩티드.
Figure 112006075510457-pct00008
*밑줄친 부분은 치환된(돌연변이) 잔기.
표 9
흐름세포측정에 의한 부인과적 세포주에 대한 VB6 -845 결합
결과는 MF±SEM 에서 증가 배수(fold-increase) 로서 표현하였다.
Figure 112006075510457-pct00009
표 10
MTS 분석에 의한 VB6-845-매개 세포독성
Figure 112006075510457-pct00010
표 11
VB6-845 대(versus) 화학요법제(Chemotherapeutics)의 특이성과 선택성
Figure 112006075510457-pct00011
표 12: VB6-845 종양 세포 표시(VB6-845 Tumor Cell Indications)
Figure 112006075510457-pct00012
1N 은 각 암종에서 검사한 세포주의 수이다
2 는 각 암종에서 모든 세포주로부터 대조군 항체를 넘어서는(over) 중앙 형광(median fluorescence) 증가 배수(fold-increase)를 의미한다.
표 13: VB6 -011 종양 세포 표시( VB6 -011 Tumor Cell Indications )
Figure 112006075510457-pct00013
1N 은 각 암종에서 검사한 세포주의 수이다
2 값은 각각의 암종에서 모든 세포주로부터 대조군 항체를 넘어서 중앙 형광에서 평균 증가된 배수(fold increase)의 합으로 부터 계산된 평균을 의미한다. 0(Zero) 값은 대조군 활성에 관련한 반응성을 측정할 수 없음을 의미한다.
<110> MERCK PATENT GMBH <120> MODIFIED BOUGANIN PROTEINS, CYTOTOXINS AND METHODS AND USES THEREOF <130> 10241-43 <140> PCT/CA2005/000410 <141> 2005-03-18 <150> US 60/554,580 <151> 2004-03-19 <150> US 60/630,571 <151> 2004-11-26 <160> 129 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis Wild <400> 1 Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys 20 25 30 Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val 35 40 45 Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly 65 70 75 80 Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser 85 90 95 Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly 100 105 110 Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu 115 120 125 Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 130 135 140 Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile 145 150 155 160 Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val 165 170 175 Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu 180 185 190 Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser 195 200 205 Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro 210 215 220 Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp 225 230 235 240 Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys 245 250 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 2 Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 3 Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 4 Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Ala Lys Xaa Asp Arg Lys Xaa Leu Xaa Leu Gly Val Xaa Lys Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Leu Gly Val Xaa Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 7 Asn Gly Gln Glu Xaa Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be T or A or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Q or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be N or D or T or A or R or Q or E or G or H or K or S <400> 8 Ala Lys Xaa Asp Arg Lys Xaa Leu Xaa Leu Gly Val Xaa Lys Leu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be N or D or T or A or R or Q or E or G or H or K or S <400> 9 Leu Gly Val Xaa Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Q or A <400> 10 Asn Gly Gln Glu Xaa Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 11 <211> 250 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (127)..(127) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys 20 25 30 Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val 35 40 45 Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly 65 70 75 80 Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser 85 90 95 Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly 100 105 110 Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Xaa Asp Arg Lys Xaa Leu 115 120 125 Xaa Leu Gly Val Xaa Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile 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30 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 30 Leu Gly Val Asn Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 31 Asn Gly Gln Glu Ala Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 32 Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 33 Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ile 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 34 Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ile Gln Asp Leu 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 35 Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 36 Glu Tyr Pro Thr Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 37 Thr Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 38 Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys Gln 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 39 Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys Gln Leu Pro Val 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 40 Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 41 Gly Thr Pro Val Cys Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 42 Val Cys Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 43 Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 44 Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val Leu Val Asp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 45 Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val Leu Val Asp Ile Thr Thr 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 46 Asp Asp Lys Arg Phe Val Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 47 Arg Phe Val Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 48 Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 49 Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile Asp Val 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 50 Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile Asp Val Thr Asp Val 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 51 Lys Thr Val Lys Val Ala Ile Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 52 Lys Val Ala Ile Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 53 Ile Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 54 Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 55 Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 56 Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 57 Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 58 Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 59 Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 60 Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 61 Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe Pro Gly Val 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 62 Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 63 Ala Thr Ser Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 64 Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 65 Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 66 Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 67 Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 68 Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 69 Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 70 Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 71 Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 72 Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 73 Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 74 Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 75 Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 76 Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 77 Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 78 Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 79 Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 80 Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 81 Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 82 Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 83 Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 84 Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 85 Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 86 Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 87 Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 88 Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 89 Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 90 Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 91 Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 92 Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 93 Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 94 Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 95 Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 96 Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 97 Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 98 Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr 1 5 10 15 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 99 Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 100 Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 101 Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile 1 5 10 15 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 102 Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 103 Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro 1 5 10 15 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 104 Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 105 Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 106 Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile 1 5 10 15 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 107 Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 108 Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp Met Gly Ile 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 109 Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe 1 5 10 15 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 110 Ser Gln Ile Ser Pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser 1 5 10 15 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 111 Ser Pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr 1 5 10 15 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 112 Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala 1 5 10 15 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 113 Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile 1 5 10 15 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 114 Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala 1 5 10 15 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 115 Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 116 Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp 1 5 10 15 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 117 Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu 1 5 10 15 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 118 Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile 1 5 10 15 <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 119 Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile Leu Glu Pro 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 120 Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile Leu Glu Pro Asn Ile Ala 1 5 10 15 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1032 <400> 121 cattacaaac gtctaccaag ttt 23 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1033 <400> 122 ttacaaaagt agataagtaa tgtg 24 <210> 123 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1322 <400> 123 gatatacata tgaaatacct attgcctacg 30 <210> 124 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1067 <400> 124 tgacacagtg ttgtacgctg gttgggcagc gagtaa 36 <210> 125 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1068 <400> 125 gctgcccaac cagcgtacaa cactgtgtca tttaac 36 <210> 126 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OL1323 <400> 126 cgagtgcggc cgctcaatgg tgatggtgat ggtgt 35 <210> 127 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 127 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Chlamydia sp. <400> 128 Lys Val Val Asp Gln Ile Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His 1 5 10 15 <210> 129 <211> 250 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 129 Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys 20 25 30 Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val 35 40 45 Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asp Val Ala Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly 65 70 75 80 Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser 85 90 95 Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly 100 105 110 Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu 115 120 125 Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 130 135 140 Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile 145 150 155 160 Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val 165 170 175 Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu 180 185 190 Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser 195 200 205 Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro 210 215 220 Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp 225 230 235 240 Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys 245 250

Claims (34)

  1. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형 T-세포 항원결정인자를 포함하는, 면역 반응을 활성화하는 성향이 감소된 변형 부가닌 단백질:
    (a) AKX1DRKX2LX3LGVX4K (서열번호: 8)
    상기에서,
    X1은 T, A 또는 Q이고;
    X2는 G 또는 A이고;
    X3은 Q 또는 G이고;
    X4는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S임;
    (b) LGVX4KLEFSIEAIHG (서열번호: 9)
    상기에서,
    X4는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S임; 및
    (c) NGQEX5AKFFLIVIQM (서열번호: 10)
    상기에서,
    X5는 Q 또는 A임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 것인 변형 부가닌 단백질:
    YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
    LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT
    SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1 DRKX2 LX3 LGVX4 KLEFSIE
    AIHGKTINGQEX5 AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPN
    FKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQ
    ISPDMGILKFKSSK (서열번호: 12)
    상기에서,
    X1은 T, A 또는 Q이고;
    X2는 G 또는 A이고;
    X3은 Q 또는 G이고;
    X4는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S이고;
    X5는 Q 또는 A 임.
  7. 제1항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 변형 부가닌 단백질:
    X1이 T이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 Q이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 G이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 A이고, X3가 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 Q이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 G이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 N이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 T이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 A이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 R이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 D이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 E이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Q이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 G이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 H이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 K이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 S이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 Q인 아미노산 서열;
    X1이 V이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 A인 아미노산 서열;
    X1이 Q이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Q이고, X5가 Q인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 N이고, X5가 A인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 D이고, X3이 E이고, X4가 Q이고, X5가 A인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 G이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 A이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 Q이고, X2가 G이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 Q이고, X2가 A이고, X3이 E이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 Q이고, X2가 D이고, X3이 G이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열;
    X1이 A이고, X2가 D이고, X3이 G이고, X4가 Y이고, X5가 I인 아미노산 서열; 및
    X1이 A이고 X2가 A이고, X3이 E이고, X4가 Q이고, X5가 A인 아미노산 서열.
  8. 제1항에 있어서, 상기 변형 부가닌이 하기 서열을 포함하는 것인 변형 부가닌 단백질:
    YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
    LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT
    SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIH
    GKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVL
    NLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD
    MGILKFKSSK (서열번호:13).
  9. 제1항의 변형 부가닌 단백질과 이에 부착된 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 세포독소 (cytotoxin).
  10. 제1항의 변형 부가닌 단백질과 이에 부착된 암 세포 결합 리간드를 포함하는 세포독소.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드는 암 세포에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 세포독소.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 암세포 표면의 Ep-CAM에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 세포독소.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Ep-CAM에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 인간 Ep-CAM 세포 외 영역에 결합하고 MOC-31 항체에서 유래한 상보적 결정 영역 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 항체단편인 세포독소.
  14. 제12항에 있어서, 상기 변형된 부가닌 단백질에 부착된 암-결합 리간드의 가변 영역은 4D5MOCB인 세포독소.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포독소.
  16. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 암 세포 표면상의 종양관련항
    원에 결합하는 것인 세포독소.
  17. 제16항에 있어서, 서열번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포독소.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항의 세포독소, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암 (head and neck cancer), 방광암, 간암, 신장암, 흑색종 (melanomas), 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암 (small cell and non small cell lung cancer), 육종 (sarcomas), 신경아교종 (gliomas), T-세포 림프종, B-세포 림프종, 자궁내막암 및 자궁목암으로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 약학적 조성물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. (a) 부가닌의 T-세포 항원결정인자를 동정하는 단계; (b) T-세포를 활성화하는 성향이 감소된 변형 부가닌을 제조하기 위해, T-세포 항원결정인자 내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 변형하는 단계; (c) 변형 부가닌에 부착된 암-결합 리간드를 가진 세포독소를 제조하는 단계; 및 (d) 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제에 상기 세포독소를 현탁시키는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 치료제의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암은 직장결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 두경부암 (head and neck cancer), 방광암, 간암, 신장암, 흑색종 (melanomas), 위장암, 전립선암, 소세포 및 비소세포 폐암 (small cell and non small cell lung cancer), 육종 (sarcomas), 신경아교종 (gliomas), T-세포 림프종, B-세포 림프종, 자궁내막암 및 자궁목암으로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항의 변형 부가닌 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  26. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항의 세포독소를 암호화하는 핵산 분자.
  27. 삭제
  28. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드:
    (a) AKX1DRKX2LX3LGVX4K (서열번호: 8)
    상기에서,
    X1은 T, A 또는 Q이고;
    X2는 G 또는 A이고;
    X3은 Q 또는 G이고;
    X4는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S임;
    (b) LGVX4KLEFSIEAIHG (서열번호: 9)
    상기에서,
    X4는 N, D, T, A, R, Q, E, G, H, K 또는 S임; 및
    (c) NGQEX5AKFFLIVIQM (서열번호: 10)
    상기에서,
    X5는 Q 또는 A임.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제28항의 변형 T-세포 항원결정인자 펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 하기 아미노산 서열을 가지는 변형 부가닌 단백질:
    YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
    YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
    LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT
    SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIH
    GKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVL
    NLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD
    MGILKFKSSK (서열번호: 129).
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