JP2022512533A - 腫瘍関連マクロファージへの分子の結合およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書には、腫瘍関連マクロファージに分子の結合および癌の処置および検出のための関連方法が提供される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１８年８月１０日に特許出願された、米国仮出願第６２／７１７，６５６号の利益を主張し、本明細書で全体として参照により組み込まれる。

連邦支援の資金を受けた研究の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＲ２１ＥＢ０２２６５２を受けて政府の支援で実行された。政府は本発明に一定の権利を有する。

マクロファージは、すべての主要器官にわたって分布し、正常な免疫ホメオスタシスおよび癌等の疾患進行に中心的な役割を果たし、腫瘍微小環境内に重要な調節因子である。多くの腫瘍では、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）としても知られている抗炎症性マクロファージ（代替的に活性化されるまたはＭ２サブタイプ）は、免疫抑制性の腫瘍微小環境を生成する原因であり、それは免疫系による腫瘍細胞の認識および除去を妨げる。

本明細書には、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に優先的に結合し、および標的にする分子、その医薬組成物、ならびに癌および免疫抑制性の腫瘍微小環境の処置および診断の方法が記載されている。さらに、ある部分に抱合された腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）結合分子および送達剤を含む医薬組成物、およびそのような医薬組成物の癌治療のための使用に関連する方法が提供され、ここで医薬組成物はＴＡＭに細胞溶解性であり、ＴＡＭを取り除き、減少および／または中和し、あるいはＴＡＭをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極する、そのような医薬の癌検出のための使用に関連する方法、およびＴＡＭまたは腫瘍微小環境の検出のためにそのような医薬の使用に関連する方法が提供される。

一態様では、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＴＡＭ結合分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ある部分に抱合したＴＡＭ結合分子を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、部分に抱合したＴＡＭ結合分子および結合剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子は、ＴＡＭ上のレチノイドＸ受容体ベータと結合する。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子は、ペプチド、リガンド、抗体、非ＩＧドメインまたは小分子実体である。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は単一ドメイン抗体である。いくつかの実例では、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。他の実例では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２または二重特異性抗体である。他の実施形態では、ＴＡＭ結合分子はペプチドである。いくつかの実例では、ＴＡＭ結合ペプチドは環状である。他の実例では、環状ＴＡＭ結合ペプチドは、ａ）ＣＲＶＬＲＳＧＳＣ、またはｂ）少なくとも１つの保存アミノ酸置換を備えたＣＲＶＬＲＳＧＳＣを含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子に抱合する部分は、治療剤または診断薬である。いくつかの実例では、部分は治療剤であって、ここで治療剤は、細胞毒性剤、化学療法剤、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害剤、核酸または抗ホルモン剤である。他の実例では、治療剤は細胞毒性剤であって、ここで細胞毒性剤は、リボソーム不活性化タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、チューブリン阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節剤、ＤＮＡ副溝結合剤、または放射性剤である。他の実施形態では、部分は、標識である診断薬である。いくつかの実例では、診断薬は、標識が蛍光標識、発色標識または放射性標識である標識である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は部分に直接に抱合したＴＡＭ結合分子で構成される。他の実施形態では、医薬組成物は、リンカーを介して部分に間接的に抱合したＴＡＭ結合分子で構成される。いくつかの実例では、送達剤は、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、またはウイルスベクターである。

別の態様では、癌を処置する方法は提供される。方法は、一般に、被験体へ上記の医薬組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子は、腫瘍細胞に対して細胞溶解性である。いくつかの実施形態では、ＴＡＭ結合分子は腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態では、癌を処置する方法が提供され、ここで癌は、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、乳癌、結腸癌、肺癌、頭部および頸部の扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内または頭蓋内に投与される方法が実行される。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、第２の治療剤との組み合わせで投与される方法が実行される。さらなる実施形態では、方法は第２の治療剤との組み合わせで実行され、ここで第２の治療剤は、癌化学療法剤、放射線治療、細胞毒性剤、別の抗体、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、栄養補助食品（例えば、抗酸化剤）またはそれらの組み合わせである。

別の態様では、癌を抱える被験体の腫瘍微小環境内のＴＡＭ数を減少させる方法が提供される。本方法は、一般に、上記の医薬組成物を含み、ここで医薬組成物がＴＡＭに対して細胞溶解性である。

別の態様では、癌を抱える被験体の腫瘍微小環境内の免疫抑制を排除する方法が提供される。本方法は、一般に、上記の医薬組成物を含み、ここで医薬組成物はＴＡＭを取り除き、減少させるおよび／または中和する。

別の態様では、癌を抱える被験体においてＴＡＭをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極する方法が提供される。本方法は、一般に、上記の医薬組成物を含み、ここで医薬組成物はＴＡＭをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極する。

別の態様では、被験体の癌を検知する方法は提供される。本方法は、全体的に、その被験体に上記の医薬組成物の投与を含む。

別の態様では、癌を抱える被験体の腫瘍微小環境内のＴＡＭＳを検出する方法が提供される。本方法は、一般に、その被験体に上記の医薬組成物を投与する工程を含む。

別の態様では、被験体の腫瘍微小環境を検出する方法が提供される。本方法は、一般に、その被験体に上記の医薬組成物を投与する工程を含む。

参考文献

本明細書に言及された公報、特許及び特許出願のすべては、個々の公報、特許及び特許出願の各々が参照することにより組み込まれていると具体的かつ個別に示されたかのような程度で参照することにより本明細書に組み込まれている。

本発明の新しい特徴は、添付された請求項にて具体的に説明される。本発明の特徴および利点についてのよりよい理解は、例示となる実施形態を説明する以下の詳細な説明への参照により得られるであろう。その詳細な説明には、発明の法則が利用され、その添付図面およびは：

表１は、ＣＲＶのインビボの移動定着に関する試験された腫瘍の要約である。
図１Ａは、ＦＡＭペプチド結合の描写である。異なる細胞株とのＦＡＭペプチドのインビトロの結合。細胞は、ＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳ（１０μＭ）で４°Ｃで１時間インキュベートされ、ＰＢＳで洗浄された。蛍光は、フローサイトメトリーによって測定された。ＦＡＭ－ＧＧＳと比較して、ＦＡＭ－ＣＲＶの高い結合は、Ｊ７７４、ＲＡＷおよびＴＨＰ－１分化したマクロファージの上で発見され、４Ｔ１腫瘍細胞上で発見されなかった。 図１Ｂは、ＦＡＭペプチド結合の描写である。４Ｔ１乳癌のマウスでは、様々な組織内にＦＡＭ－ＣＲＶ移動定着の代表的なＵＶ照画像。１００μＬのＰＢＳ中のＦＡＭ－ＣＲＶの１００μｇが、１時間の循環のために４Ｔ１のマウスに静脈注射された。組織はＰＢＳによる経心臓的なかん流後に収集された。 図２Ａは、異なる移動定着時間（５分、１５分および６０分）を有するＦＡＭペプチドおよびＣＤ３１による組織の免疫蛍光染色を描写する。ＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳペプチドを注入された４Ｔ１の同所性の担癌のマウスの組織切片は、抗ＦＩＴＣ（緑）および抗ＣＤ３１抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色された。異なる時点における腫瘍内のＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳの移動定着結果。上列：全体腫瘍の表示。下列：上列に白い正方形印を付けられた領域の拡大表示。 図２Ｂは、異なる移動定着時間（５分、１５分および６０分）を有するＦＡＭペプチドおよびＣＤ３１による組織の免疫蛍光染色を描写する。ＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳペプチドを注入された４Ｔ１の同所性の担癌のマウスの組織切片は、抗ＦＩＴＣ（緑）および抗ＣＤ３１抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色された。他の器官内におけるＦＡＭ－ＣＲＶの分布。ＦＡＭ－ＣＲＶシグナルは時間とともにウオッシュアウトされた。 図３は、ＦＡＭ－ＣＲＶの腫瘍マクロファージとの関連を描写する。Ａ）ＦＡＭ－ＣＲＶおよびマクロファージマーカーのための４Ｔ１マウス組織の免疫蛍光染色。組織切片は、抗ＦＩＴＣ（緑）、抗ＣＤ１１ｂ、抗Ｆ４／８０または抗ＣＤ６８抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色された。尺度図：１００μｍ。Ｂ－Ｄ）エクスビボの４Ｔ１マウスの様々な器官から分離された細胞とのＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳの結合。細胞は、ＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、およびＦ４／８０一次抗体および二次抗体で４°Ｃで１時間インキュベートされた。その後、細胞は洗浄され、フローサイトメトリーによって分析された。Ｂ： 血液および脾臓の細胞と比較した、腫瘍細胞とのＦＡＭ－ＣＲＶの選択的結合。Ｃ： 腫瘍細胞とのＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳの結合。Ｄ： ＦＡＭ－ＣＲＶ陽性の細胞内にＣＤ１１ｂおよびＦ４－８０陽性の細胞集団。Ｅ）インビボのＦＡＭ－ＣＲＶ移動定着後に４Ｔ１腫瘍から単離された細胞のフローサイトメトリー分析。腫瘍は、ＦＡＭ－ＣＲＶの静脈内投与後、１５分または６０分で得た。細胞は、ＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０一次抗体および二次抗体で４°Ｃで１時間インキュベートされ、洗浄され、フローサイトメトリーで分析された。 図４は、アテローム動脈硬化性プラーク内のマクロファージとのＦＡＭ－ＣＲＶ結合の評価を描写する。Ａ）大動脈内にアテローム動脈硬化性プラークを有するＡｐｏＥ－／－マウスにおけるＦＡＭ－ＣＲＶ、ＦＡＭ－ＡＲＡ（陰性対照）またはＦＡＭ－ＬｙＰ－１（陽性対照）のインビボの移動定着。ＦＡＭ－ＣＲＶ、ＦＡＭ－ＬｙＰ１またはＦＡＭ－ＡＲＡの１００μｇが、１時間循環のために静脈注射された。大動脈（中間）、腎臓（右）および肝臓（左）は、切除され、ＵＶ照明器で画像化された。Ｂ）プラークを有する大動脈から単離されたＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳによるエクスビボの染色。細胞は、４°Ｃで１時間インキュベートされ、その後、フローサイトメトリーによって分析された。 図５は、ＣＲＶ結合受容体としてＲＸＲＢの評価を描写する。Ａ）ＦＡＭ－ＧＧＳと比較した、ヒト固定化組み換えＲＸＲＢタンパク質との高いＦＡＭ－ＣＲＶの結合。Ｂ）ＲＸＲＢによって阻害されたＲＡＷとのＣＲＶ結合の発現の４°Ｃで１時間の停止。Ｃ）インビボのＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳの移動定着を備えた４Ｔ１腫瘍上のＲＸＲＢの免疫組織化学染色。ＲＸＲＢ ＩＨＣ染色は、免疫蛍光染色からのＦＡＭ－ＣＲＶおよびＣＤ１１ｂと共局在化した。Ｄ－Ｆ）４Ｔ１腫瘍から分離された細胞とのエクスビボのＣＲＶ結合。細胞は、ＦＡＭ－ＣＲＶまたはＦＡＭ－ＧＧＳ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０、およびＲＸＲＢ一次抗体および二次抗体で４°Ｃで１時間染色された。細胞は洗浄され、フローサイトメトリーによって分析された。Ｇ）インビボのＦＡＭ－ＣＲＶ移動定着後の細胞の染色。腫瘍は、ＦＡＭ－ＣＲＶの静脈内投与後の６０分で得た。細胞は、ＲＸＲＢ、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０一次抗体および二次抗体で４°Ｃで１時間インキュベートされた。細胞は洗浄されフローサイトメトリーによって分析された。 図６は、４Ｔ１マウス組織のＲＸＲＢ抗体による免疫蛍光染色およびインビボのＦＡＭ－ＣＲＶ移動定着を描写する。４Ｔ１の同所性の担癌のマウスの組織切片は、抗ＦＩＴＣ（フクシア）、抗ＲＸＲＢ抗体または対照ウサギＩｇＧ（緑）、抗ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０またはＣＤ３１抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色された。最後の列は、対照ＩｇＧ受容動物からの合併画像を示す。 図７は、ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰ移動定着を描写する。Ａ）ＮＰの１時間循環後の４Ｔ１マウスからの組織の蛍光画像化。上列：ｐＳｉＮＰを注射されたマウス。下列：ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰを注射されたマウス。Ｂ）インビボのＣＲＶ－ｐＳｉＮＰまたはｐＳｉＮＰ移動定着後に４Ｔ１腫瘍から単離された細胞のフローサイトメトリー分析。腫瘍は、静脈内投与後６０分で得た。細胞は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６８一次抗体、および二次抗体で４°Ｃで１時間インキュベートされ、洗浄され、フローサイトメトリーによって分析された。

マクロファージと腫瘍微小環境
インビボでは、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞、内皮細胞等の血管細胞、および繊維芽細胞等の間質細胞を含む多数の細胞類を包含する複雑な環境である。さらに、インビボでは、これらの細胞は血流および様々な生物学的な送達条件にさらされる。インビボでは、腫瘍内の微小血管細胞は、血流の影響を受け、物理的、および拡散性要因によって、腫瘍細胞および非腫瘍細胞と連絡する。さらに、腫瘍血管系は異常であり、無秩序な分岐、低流量、および漏洩毛細血管を特徴とするため、腫瘍細胞を標的にする抗癌治療に対して主な送達障壁として機能する。腫瘍細胞と内皮細胞と間質細胞との相互作用は、各細胞の種類に影響を及ぼし、血管形成と腫瘍細胞増殖の増大させる。このクロストークは、抗癌剤に対する腫瘍細胞の反応性を求めるのに重要な要因になり得る。

腫瘍微小環境において細胞は酸素欠乏および栄養欠乏を経験する。低酸素ストレスは、腫瘍細胞および腫瘍内のマクロファージの代謝を変化させた後、微小環境に変化を起こす。微小環境の変化は、腫瘍促進リプログラミングを誘発するためにマクロファージの表現型および代謝を変化させる。栄養素ストレスも、細胞生存を確保するまたは細胞死を誘発するための自食作用を引き起こす。腫瘍細胞の死亡は、マクロファージを引き寄せ、それらの表現型を管理する連絡システムである。腫瘍細胞死の形態に応じて、マクロファージの極性化は、炎症促進の活性化から抗炎症／免疫抑制の活性化まで及ぶ。

慢性炎症は癌増殖の一因となる。慢性の自然免疫細胞型（例えば、好中球、マクロファージおよび肥満細胞）の存在および活性化は、癌増殖を促進する。それ故に、慢性的に活性化された自然細胞の一部の亜集団が、新生細胞の成長を促進し、および／または生存を促すことは明白である。それらの極性化状態に応じて、免疫細胞は、抗腫瘍機能（例えば、Ｉ型ＣＤ４（＋）Ｔ細胞のヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）ｖｓＴｈ１７亜集団）または腫瘍維持機能（例えば、ｖｓＩＩ型 ＮＫＴ細胞、Ｍ１マクロファージｖｓＭ２マクロファージ、およびＮ１好中球ｖｓＮ２好中球）のいずれかを発揮させることができる。慢性的に活性化され極性化された免疫細胞（例えば、Ｍ２マクロファージおよびＮ２好中球）は、無数のケモキネス、サイトカイン、成長因子、およびプロテアーゼを生成または保有しており、これらによって組織改造、血管形成、細胞増殖、ゲノム不安定、および新生細胞の異所性組織への拡大が生じる。

マクロファージは、貪食と呼ばれる過程において、細胞デブリ、異物、微生物、癌細胞、および表面上で健康な体細胞に特異的なタンパク質の種類を有していないものを飲み込んで消化する、免疫系における白血球の一種である。マクロファージは炎症を増加させ、免疫系を刺激する。マクロファージはさらに、重要な抗炎症の役割を果たし、サイトカイニンの放出によって免疫反応を低下させることができる。炎症を促進させるマクロファージはＭ１マクロファージと呼ばれる一方、炎症を減少させ、組織修復を促進させるマクロファージはＭ２マクロファージと呼ばれる。マクロファージは、大半の固形腫瘍における優勢な免疫細胞集団である。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、マクロファージの一種である。ＴＡＭは、腫瘍の増殖および進行の原因となり、Ｍ２表現型を取得するものと考えられている。ＴＡＭは腫瘍進行を調節することができる。ＴＡＭ数を減少させるまたはＴＡＭ表現型を操作するための治療上の戦略は、癌治療の対象である。レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）は、核受容体のスーパーファミリーのメンバーであり、転写因子として欠かせない核機能および細胞質機能を有している。ＲＸＲは、９－シスレチノイン酸によって活性化される核受容体の一種であり、それは内因的に関連があると考慮される。ＲＸＲは、９－シス－１３，１４－ジヒドロレチノイン酸によっても活性化され、それは主な内因的哺乳類のＲＸＲ選択的アゴニストであり得る。レチノインＸ受容体（ＲＸＲ）、すなわち、ＲＸＲアルファ（ＲＸＲＡ）、ＲＸＲベータ（ＲＸＲＢ）およびＲＸＲガンマ（ＲＸＲＧ）の３つが存在し、それぞれＲＸＲＡ遺伝子、ＲＸＲＢ遺伝子、ＲＸＲＧ遺伝子によってコードされている。ＲＸＲは、価格的な活性化の後に、多数の標的遺伝子の転写を調節するＩＩ型サブファミリーの核受容体のメンバーに対するヘテロ二量体化パートナーである。ＲＸＲは、ＣＡＲ、ＦＸＲ、ＬＸＲ、ＰＰＡＲ、ＰＸＲ、ＲＡＲ、ＴＲ、およびＶＤＲを含むＩ型サブファミリーの核受容体とともにヘテロ二量体化することができる。ＲＸＲヘテロ二量体は、リガンドがない場合に、阻害補体タンパク質と複合されたホルモン応答配列に結合される。アゴニストリガンドとＲＸＲとの結合は、阻害補体の解離とコアクチベータータンパク質の動員をもたらす。これは、ｍＲＮＡおよび最終的にタンパク質への下流標的遺伝子の転写を促進させる。ＲＸＲは、炎症性障害および代謝障害においてマクロファージを調節することができ、マクロファージ関連の病状の処置のためにＲＸＲシグナル伝達を直接変調させる可能性が存在する。ＲＸＲＢの細胞表面発現は、ＴＡＭに対して特異的であり、ＲＸＲＢは、ＣＲＶおよび他の考慮される分子と腫瘍マクロファージとの選択的結合に起因する。

ＴＡＭを標的する分子
ペプチドＣＲＶ（ＣＲＶＬＲＳＧＳＣ）は、末端システイン残基間のジスルフィド結合を有する環状マクロファージ標的化ペプチドである。ＣＲＶは、選択的に腫瘍へ移動定着され、前記腫瘍内のＴＡＭと結合する。ＣＲＶは、腫瘍内のＴＡＭの表面上でＲＸＲＢを認識してそれに結合する。ＣＲＶは、ＴＡＭのみを認識し、アテローム動脈硬化性プラーク内のマクロファージを認識しない。

ＣＲＶは治療剤に結合させることができる。治療剤は抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）を含む場合がある。

ＣＲＶは、ＴＡＭ分子としても作用するように考慮される関連ペプチドを生成するように修飾することができる。そのような修飾の例として、アミノ酸の１つ以上の置換、欠失または付加があげられる。保存置換は、所与のアミノ酸を同様の特徴を持つ別のアミノ酸で置換するアミノ酸置換を含み、さらにアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの脂肪族アミノ酸置換の中でもヒドロキシル残基セリンおよびトレオニンの置換、酸性残基アスパラテトおよびグルタメトの交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンの置換、塩基性残基リジンとアルギニンの交換、および芳香性残基フェニルアラニンとチロシンの間の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＶは１つ以上のアミノ酸保存置換によって修飾される。他の実施形態では、ＣＲＶは１つのアミノ保存置換によって修飾される。

選択的にＴＡＭに結合するために細胞表面のＲＸＲＢ結合分子として作用することができる他のＴＡＭ結合分子は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）、抗原結合フラグメント、ペプチド、リガンド、非ＩＧドメインまたは小分子を含む。前記ＴＡＭ結合分子は、ＲＸＲＢ分子上の異なる位置でＲＸＲＢに結合する場合がある。ＴＡＭ結合分子が抗体である場合、それは単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および／またはモノクローナル抗体であり得る。ＴＡＭ結合分子が抗原結合フラグメントである場合、それはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２または二重特異性抗体であり得る。ＴＡＭ結合分子がペプチドである場合、それは環状であり得る。ＴＡＭ結合分子が環状である場合、それはＣＲＶまたは別のペプチドであり得る。

ＴＡＭ結合分子への修飾が考慮される。これらの修飾は、補足部分との抱合を含む。この部分は、臨床的にまたは研究目的のために使用される治療剤または診断薬であり得る。

これらの修飾はさらに送達系を構成することができ、腫瘍または腫瘍微小環境に標的とするようにＴＡＭ結合分子を送達することができる。この送達系の利点は、患者への投与頻度の減少、薬物の均一な効果、薬物副作用の減少、および循環薬物濃度の変動の減少を含む場合がある。

前記部分、ＴＡＭ結合分子、またはその両方は、送達剤の中に保持することができる。前記送達剤は、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、ポリマーマトリクス、ヒドロゲルまたはウイルスベクターであり得る。

リポソームは、繰り返し注射した後でも無毒、非溶血性、非免疫原性であり；それらは生体適合性および生分解性であり、およびクリアランス機構（細網内皮系（ＲＥＳ）、腎クリアランス、化学的または酵素の不活性化、あるいは他の望ましくない効果）を回避するように設計することができる。脂質ベースの、リガンド被覆ナノキャリアーは、運ばれる薬剤の性質に応じて、それらの送達物を疎水性シェルまたは親水性内部に保管することができる。

ミクロスフェアは、小分子、タンパク質および核酸を含む多数の薬物類を包含することができ、注射針によって容易に投与される。ミクロスフェアは、全体的に生体適合性であり、高いバイオアベイラビリティーを提供することができ、長期間にわたり徐放可能である。ミクロスフェアのデメリットとしては、大規模製造の困難さ、製作中の薬物の不活性化、および薬物放出速度の不十分な調節が挙げられる。

ナノ粒子ベースの薬物送達系は、薬剤を送達するための有効な方法であると考慮される。ナノ粒子を使用することの利点の一部として、細胞質への送達物の調節可能な放出および腫瘍薬物耐性の回避を含む。

マイクロエマルジョンは、油、水および界面活性剤の熱力学的に安定した等方性の透明（または半透明）なシステムであり、全体的に２０－２００ｎｍの範囲内のサイズの小滴を備えた共同界面活性剤と組み合わされることが多い。前記マイクロエマルジョンは、それらの構造に応じて、水中油型（ｏ／ｗ）、油中水型（ｗ／ｏ）または共連続システムとして分類することができ、油相と水相の間の界面張力が極めて低いことを特徴とする。前記システムは現在、親油性および親水性の両ドメインが存在することで、広範な薬物分子（親水性および疎水性）を組込む可能性があるため、研究者によって技術的かつ科学的な大きな関心が寄せられている。これらの適応可能な送達系は、酸化、酵素加水分解からの防御を提供し、親油性の薬物の可溶化を改善し、従ってそれらのバイオアベイラビリティーを向上させる。マイクロエマルジョンは、経口および静脈内の送達系、および（例えば、目、歯、肺、膣および局所の経法を介して）徐放および標的化送達に適している。マイクロエマルジョンは、様々な難溶性薬物の経口のバイオアベイラビリティーを改善するために使用される。いくつかの実例では、マイクロエマルジョンは、新生細胞への化学療法薬剤の送達およびインスリンの経口送達等の難問に使用される。マイクロカプセルは、精密な内部または外部の構造を問わず、１－１０００μｍの直径を有する粒子であり、薬剤送達に使用することができる。マイクロカプセルは、薬物送達系として様々な重要な利点を提供し（例えば、包含された活性薬剤の分解（例えば、酵素分解）に対する有効な防御、数時間から数か月までの期間にわたり組み込んだ薬物の放出速度の正確な調節の可能性、容易な投与（マクロサイズのインプラント等の代替の腸管外の制御放出投薬形式と比較して））、および患者の治療の必要性に合う、所望のあらかじめプログラムされた薬物放出プロファイルを提供することができる。

薬剤はポリマーマトリクスに埋め込む、またはポリマーテンプレートで共結晶化することができる。ポリマーは、長期間にわたる一定用量での治療剤の制御放出、循環投与、および親水性薬物と疎水性薬物の調整可能な放出を提供する薬物送達技術である。ポリマーマトリクスは、特定の積荷に対して調整され、別個の生体機能を発揮するように設計されてもよい。

ヒドロゲルは、水溶性ポリマーの三次元架橋ネットワークである。ヒドロゲルは、事実上任意の水溶性ポリマーから作ることができ、それによって広範囲の化学構成および大量の物理的性質を包含する。さらに、ヒドロゲルはスラブ、微粒子、ナノ粒子、コーティングおよびフィルムを含む様々な物理的な形態で製剤化することができる。その結果、ヒドロゲルは、組織工学および再生医療、診断、細胞固定、生体分子または細胞の分離、および生体接着を調節するためのバリア材を含む広範な用途目的として臨床診療および実験医学に一般的に使用される。

ウイルス送達ベクターは、薬物送達材料になり得るナノ資料の一種である。効果的なベクターは、特定の標的に薬物積荷を効果的に運び、その後に送達可能でなければならない。

上記抱合は、直接または間接的に、かつリンカー分子の有無に関わらず達成することができる。このリンカー分子は、ｐＨ感受性のリンカー、二硫化物リンカー、ペプチドリンカー、ベータ－グルロニードリンカー、レドックス反応性リンカー、ヒドラゾンリンカー、親水性リンカー、アゾリンカー、または別の種類のリンカーであっても良い。前記リンカーは、薬物放出を開始するための刺激に応答することができる。前記刺激は、内部または外部で行うことができる。前記刺激は、局所で行うことができる。前記刺激は、ｐＨ、酵素、光、熱または別の刺激であってもよい。

治療剤である部分にＴＡＭ結合分子が抱合する場合、前記治療剤は細胞毒性薬剤（例えば、リボソーム不活性化タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、チューブリン阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節剤、ＤＮＡ副溝結合剤、または放射性薬剤）、化学療法剤（例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、タキサン、エポチロン、Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチドアナログ、ペプチド系抗生物質、プラチナベースの薬剤、レチノイド、ビンカアルカロイドまたはその移動定着体、あるいは他の化学療法剤）、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害剤、核酸または抗ホルモン薬剤であってもよい。

診断薬である部分にＴＡＭ結合分子が抱合する場合、前記診断薬は標識であってもよく、前記標識は、蛍光標識、発色標識または放射性標識であってもよい。前記標識は、画像診断（例えば、ＰＥＴまたはＭＲＩの画像化、またはＰＥＴまたはＭＲＩを組込む画像化プロトコル）に使用されることを考慮されている。

実施例１：ＣＲＶは、インビトロでマクロファージに特異的に結合する
ＲＡＷ（腫瘍由来のマウスのマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７）、Ｊ７７４（腫瘍由来のマウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１）、ＴＨＰ－１分化マクロファージ（ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１から分化されたヒトマクロファージ）および４Ｔ１（マウスの乳癌細胞株）の各細胞は、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭにおいて培養された。１×１０^６の細胞は、エッペンドルフチューブの中の完全増殖培地の３００μＬにおいてＦＡＭ－ＣＲＶまたは対照ペプチドＦＡＭ－ＧＧＳ（１０μＭ）でインキュベートされた。４°Ｃで１時間インキュベション後に、ペプチド含有培地は遠心分離によって取り除かれて、細胞はＰＢＳによって２回洗浄された。その後、１００μＬ のＰＦＡ（４％緩衝液）が固定のために細胞に加えられ、フローサイトメトリーデータはＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホセ）にて得られた。実験は、別の日に３回繰り返された。

ＦＡＭ－ＣＲＶは、対照ペプチドＦＡＭ－ＧＧＳよりＲＡＷ、Ｊ７７４、およびＴＨＰ－１分化マクロファージとのはるかに高い結合を示した（図１Ａ）。これに反して、ＦＡＭ－ＣＲＶの４Ｔ１乳癌細胞株との結合は非常に制限されていた。これらの結果は、インビトロでＣＲＶがマクロファージに特異的に結合することを示した。

実施例２：インビボでマクロファージへのＣＲＶ結合
ＣＲＶがマクロファージにインビボで結合することができるかを調査するために、ＦＡＭ－ＣＲＶは、担癌のマウスに静脈注射された。この目的のために、４Ｔ１およびＭＣＦ１０ＣＡ１ａのヒト乳癌細胞、およびＫＲＡＳインクのマウスＰＤＡＣ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養された。Ｐｙ８１１９細胞は、５％ＦＣＳ、アンフォテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬおよびＭＩＴＯ＋を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地において培養された。ヒト細胞株はＳａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって認証され、ＫＲＡＳインク細胞株はＤＤＣ Ｍｅｄｉｃａｌ（フェアフィールド、オハイオ州）によって認証された。試験した全ての細胞では、マイコプラズマ汚染は陰性であった。４Ｔ１腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ腫瘍を生成するために、２×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢ中に懸濁された）が、メスのＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。Ｐｙ８１１９腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、Ｃ５７ＢＬ６マウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。ＫＲＡＳインクＰＤＡＣ腫瘍を生成するために、１×１０^６の細胞が、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。Ｈ１９７５腫瘍を生成するために、１×１０^６の細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、注入された。（マウスの種類は？ 注入した場所は？）動物実験の全ては、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得た。

フルオレセイン抱合ペプチド（ＦＡＭ－ＣＲＶ、ＦＡＭ－ＧＧＳまたはＦＡＭ－ＡＲＡ）の体内分布は、マウスの尾静脈へのペプチド溶液１００μＬ（ＰＢＳ１ｍｇ／ｍＬ）の静脈注射後に検査された。ペプチドを１時間にわたり循環させ、経心腔的かん流がＰＢＳによって実行された。組織は収集され、４％ホルムアルデヒド緩衝液で固定され、後にＰＢＳ中の３０％スクロースに一晩浸された。

本研究において試験された腫瘍モデルは、表１に要約された。ＦＡＭ－ＣＲＶ移動定着では、同所性４Ｔ１乳癌、同所性ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ乳癌、皮下ｋｒａｓ－ＩＮＫ膵臓癌、皮下ＫＰＣ膵臓癌、および皮下Ｈ１９７５肺癌は陽性であった。他の器官と比較して、腫瘍は、ＵＶ照明の下で強い蛍光シグナルを表示した。

４Ｔ１乳癌マウスモデルにおいてＦＡＭ－ＣＲＶ の１時間移動定着の代表的な画像は、図１Ｂに示される。ＦＡＭ－ＣＲＶは、腫瘍および腎臓において主として観察され、中程度から低い集積が、単球／マクロファージの高い容積を有する肝臓および脾臓において観察された。同様の生体分布は、他のＣＲＶ陽性のモデルにおいて観察された。これらの結果は、ＦＡＭ－ＣＲＶが、他のマクロファージが豊富な器官より、腫瘍へ優先的に移動定着することを示唆した。

実施例３：腫瘍内の移動定着ＣＲＶ
ＦＡＭ－ＣＲＶは、担癌のマウスに静脈注射された。この目的のために、４Ｔ１ヒト乳癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養された。ヒト細胞株は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって認証され、その細胞株ではマイコプラズマ汚染は陰性であった。４Ｔ１腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。動物実験の全ては、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得た。

フルオレセイン抱合ペプチド（ＦＡＭ－ＣＲＶ、ＦＡＭ－ＧＧＳまたはＦＡＭ－ＡＲＡ）の体内分布は、マウスの尾静脈へのペプチド溶液１００μＬ（ＰＢＳ１ｍｇ／ｍＬ）の静脈注射後に検査された。ペプチドは１時間にわたり循環し、経心腔的かん流がＰＢＳによって実行された。組織は収集され、４％ホルムアルデヒド緩衝液で固定され、後にＰＢＳ中の３０％スクロースに一晩浸された。組織は、最終的にＯＣＴ包埋媒質（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）内に冷凍され、免疫蛍光染色のためにスライスされた。

組織切片は、０．１％トリトンＸ－１００を備えた１％ウシ血清アルブミンに１時間ブロックされ、適切な一次抗体および二次抗体でインキュベートされた。血管は、ＣＤ－３１に対するモノクローナル抗体によって組織切片の染色により視覚化された。一次抗体はラット抗マウス（ｒａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＣＤ３１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。二次抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの５９４ロバ抗ラット（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｔ ）ＩｇＧであった。ＰＢＳで洗浄された後、切片はＤＡＰＩ含有封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に埋め込まれ、ツァイスＬＳＭ ７１０ ＮＬＯ共焦点顕微鏡で検査された。

免疫蛍光染色は、全ての組織切片上のＦＡＭ－ＣＲＶおよびＣＤ３１に対して実行された。４Ｔ１乳癌モデルからの代表的な画像は図２に示される。ＣＲＶは、腫瘍へ移動定着され、腫瘍内で拡散した。腫瘍内では、ＣＤ３１染色によって非常に小さいＦＡＭ－ＣＲＶシグナルが共局在化されるため、ペプチドは、投与後に５分以内に血管から去ることができる（図２Ａ）。異なる移動定着時点（５分、１５分および６０分）では、ＦＡＭ－ＣＲＶのシグナルは、腫瘍内に徐々に増加した。これは、ペプチドが血管を介して間質内に浸透することを示した。比較すると、ＦＡＭ標識された対照ペプチドＧＧＳ（ＧＧＳＧＧＳＫＧ）は、全時点では腫瘍内に蛍光シグナルを起こさなかった。興味深く、ＦＡＭ－ＣＲＶは５分の循環後に肝臓、脾臓およびリンパ節等の他器官に蓄積したが、１時間後に迅速に消失された（ｗａｓｈｅｄ ｏｕｔ）ことが判明された。

実施例４：ＣＲＶは、腫瘍内にマクロファージを標的とする
ＣＲＶが、腫瘍内にマクロファージまたは他の細胞種を標的としたかどうかを判定するために、４Ｔ１担癌のマウスの組織切片はＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０およびＣＤ６８を含むマクロファージマーカーにも染色された。この目的のために、４Ｔ１のヒト乳癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養された。ヒト細胞株は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって認証され、その細胞株ではマイコプラズマ汚染は陰性であった。４Ｔ１腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。動物実験の全ては、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得た。

フルオレセイン抱合ペプチド（ＦＡＭ－ＣＲＶ、ＦＡＭ－ＧＧＳまたはＦＡＭ－ＡＲＡ）の体内分布は、マウスの尾静脈へのペプチド溶液１００μＬ（ＰＢＳ１ｍｇ／ｍＬ）の静脈注射後に検査された。ペプチドは１時間にわたり循環し、経心腔的かん流がＰＢＳによって実行された。組織は収集され、４％ホルムアルデヒド緩衝液で固定され、後にＰＢＳ中の３０％スクロースに一晩浸かった。組織は、最終的にＯＣＴ包埋媒質（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）内に冷凍され、免疫蛍光染色のためにスライスされた。

組織切片は、０．１％トリトンＸ－１００を備えた１％ウシ血清アルブミンに１時間ブロックされ、適切な一次抗体および二次抗体でインキュベートされた。一次抗体は、ラット抗マウス（ｒａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ラット抗マウス（ｒａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）Ｆ４／８０モノクローナル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびウサギ抗フルオレスセイン（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）／Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ポリクローナル抗体であった。二次抗体、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧおよび５９４ロバ抗マウス（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｔ）ＩｇＧはであった。ＰＢＳで洗浄された後、切片はＤＡＰＩ含有封入剤（ベクター ラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に埋め込まれ、ツァイスＬＳＭ ７１０ ＮＬＯ共焦点顕微鏡で検査された。

約８ｍｍの腫瘍サイズを有するマウスは、深い麻酔下（アベルチン、つま先ピンチに対して無反応）で頸椎脱臼によって安楽死させられた。標的（腫瘍）および対照（例えば肝臓、脾臓）組織は収集され、さらに単細胞に分離された。腫瘍細胞は、ＭＡＣＳ腫瘍解離キットを使用して分離された。その後、細胞は、蛍光標識ＣＲＶまたは他の細胞マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０、ＦＡＢ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３１）で４°Ｃで１時間インキュベートされた。陽性細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡにて定量化され、データはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析された。

図３Ａに示されるように、ＦＡＭ－ＣＲＶシグナルは、それらのマクロファージマーカーで強く重複した。これは、腫瘍内のＦＡＭ－ＣＲＶの蓄積が主に腫瘍マクロファージとの関連に起因したと示唆した。免疫蛍光染色は、他の動物モデルにも実行され、同じ結果が得られた。さらに検証するために、細胞は、４Ｔ１腫瘍マウスの腫瘍、脾臓、肝臓および血液からも単離され、エクスビボの結合の研究のためにＦＡＭ－ＣＲＶでインキュベートされた。４Ｔ１モデルでは、腫瘍細胞は、脾臓と血球と比較して、はるかに高いＦＡＭ－ＣＲＶ結合を明示し、それにより腫瘍へのＦＡＭ－ＣＲＶの優先的な移動定着が確認された（図３Ｂ）。比較すると、対照ＦＡＭ－ＧＧＳペプチドは、腫瘍内のマクロファージを特異的に標識することができなかった（図３Ｃ）。他の腫瘍細胞と比較して、非常に高いＦＡＭ－ＣＲＶシグナルを示した単一の腫瘍細胞の約１５％があり、それらはＦＡＭ－ＣＲＶ陽性として指定された。５０％を超えるＦＡＭ－ＣＲＶ陽性の細胞は、ＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０の両方に陽性染色された（図３Ｄ）。血液及び脾細胞への低いＣＲＶ結合はさらに、ＦＡＭ－ＣＲＶが循環する単球／マクロファージに結合して腫瘍へ移動定着することなく、腫瘍血管を認識して浸出し、腫瘍組織内のマクロファージに結合したと示唆した。

実施例５：ＦＡＭ－ＣＲＶは、腫瘍関連マクロファージに優先的に結合する
ＦＡＭ－ＣＲＶのインビボの移動定着後（静脈内投与後の１５分、または６０分）に、分離された４Ｔ１腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析がさらに実行された。この目的のために、ＦＡＭ－ＣＲＶは、担癌のマウスに静脈注射された。この目的のために、４Ｔ１のヒト乳癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養された。ヒト細胞株は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって認証され、その細胞株ではマイコプラズマ汚染は陰性であった。４Ｔ１腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。動物実験の全ては、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得た。

フルオレセイン抱合ペプチド（１００μＬ、１ｍｇ／ｍＬＰＢＳ）は、担癌のマウスの尾静脈に静脈注射された。ペプチドは、１時間にわたって循環した。その後マウスは、深い麻酔下（アベルチン、つま先ピンチに対して無反応）で頸椎脱臼によって安楽死させられた。腫瘍は、収集されて単細胞にさらに分離され、異なる細胞マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０、ＦＡＢ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３１）で４°Ｃで１時間インキュベートされた。陽性細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡにて定量化され、データはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析された。

注入されていない対照動物に比較して、両方の循環長さの動物からの腫瘍細胞は、より高いＦＡＭ－ＣＲＶシグナルを示した（図３Ｅ）。ＦＡＭ－ＣＲＶ陽性の細胞の約２０％は、マクロファージであると同定され、それはインビトロの結合の研究における割合よりはるかに少なかった。弱く結合したＦＡＭ－ＣＲＶの多くが分離した原因は、一次抗体および二次抗体に対する大量の染色および洗浄工程であろう。これらの結合の結果の全ては、ＦＡＭ－ＣＲＶが腫瘍関連マクロファージに優先的に結合することができることを示した。

実施例６：ＦＡＭ－ＣＲＶは、アテローム動脈硬化性プラーク内のマクロファージに特異的に結合しない
マクロファージがアテローム動脈硬化性プラーク等の他の疾患の部位に存在するため、ＣＲＶがマクロファージを含む他の病理組織を認識するかどうかを知ることが興味深い。したがって、ＦＡＭ－ＣＲＶのインビボの移動定着は、大動脈内にアテローム動脈硬化性プラークを有するＡｐｏＥ－／－マウスにおいて試験された。ｐ３２受容体を介して腫瘍とプラークの両方に移動定着し、マクロファージに結合するＬｙＰ１と異なり、ＦＡＭ－ＣＲＶは全身投与後に大動脈のプラークに移動定着せず（図４Ａ）、このことはＣＲＶがインビボでアテローム動脈硬化性プラーク内のマクロファージとＴＡＭを識別することができると示唆した。大動脈の免疫蛍光染色では、さらにプラーク内のＦＡＭ－ＣＲＶ蓄積が観察されなかった。単個細胞浮遊液もアテローム動脈硬化性プラークを有するマウス大動脈から得られ、インビトロの結合の研究は、ＦＡＭ－ＣＲＶが、ＦＡＭ－ＧＧＳと比較して、プラーク内のマクロファージに特異的に結合しないことを確認した（図４Ｂ）。この特徴は、ＣＲＶを疾患特異的な用途のためにマクロファージを標的とするために望ましいペプチドにする。

実施例７：ＲＸＲＢはマクロファージとのＣＲＶ結合の原因である
ＣＲＶとＬｙＰ－１の間の相違は、ＣＲＶがＴＡＭ認識のためにおそらく異なる受容体に結合することを示唆する。したがって、マクロファージ上のＣＲＶ受容体が同定された。複雑さを低減させるため、ＲＡＷ細胞の細胞膜画分は単離され、実行されたアフィニティークロマトグラフィーは推定ＣＲＶ受容体を単離するために実行された。この目的のために、ＣＲＶはカラム上で固定された。４Ｔ１腫瘍組織の溶解物およびＲＡＷ細胞の膜タンパク質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＭｅｍＰＥＲＰｌｕｓキットで単離された）は、２つの推定受容体の独立源として利用された。緩衝液および対照ペプチドＧＧＳでの洗浄後に、推定受容体は過剰のフリーＣＲＶペプチドで溶出された。その後、質量分析はレチノイドＸ受容体ベータ（ＲＸＲＢ）を受容体候補として同定した。

ＲＸＲＢがＣＲＶと結合することを確認するために、プレート上で固定されたヒト組み換えＲＸＲＢタンパク質とのＦＡＭ－ＣＲＶ結合が試験された。ヒトＲＸＲＢ組み換えタンパク質（５０μＬ、５μｇ／ｍＬ）は、高結合の９６ウェルプレートにおいて４°Ｃで一晩固定された。ウシ血清アルブミンは対照タンパク質として使用された。タンパク質溶液は、取り除かれ、ＰＢＳで１回洗浄された。その後、ＰＢＳ溶液内の１％ＢＳＡはウェルに加えられ、残りの利用可能な結合部位をブロックするために室温で１時間インキュベートされた。ＰＢＳでの１回の洗浄後、ＲＸＲＢとＢＳＡは室温でＦＡＭ－ＣＲＶ（１００μＬ、１μＭ）で１時間インキュベートされた。ウェルは、ＰＢＳで３回洗浄され、蛍光はマルチプレートリーダを使用して測定された。

対照ペプチドＦＡＭ－ＧＧＳと比較して、ＲＸＲＢとのＣＲＶペプチドの著しく高い結合があった（図５Ａ）。一方、対照タンパク質のＢＳＡといずれのペプチドも結合しなかった。Ｊ７７４およびＲＡＷ細胞の両方は、ＲＸＲＢの高い表面発現とともに高いＦＡＭ－ＣＲＶ結合を示した一方、４Ｔ１とＰＰＣ１等の腫瘍細胞株は非常に限られたＲＸＲＢの表面発現および低いＦＡＭ－ＣＲＶ結合を有する。ＣＲＩＳＰＲは、ＲＡＷ細胞のＲＸＲＢの発現を停止させるために使用され、それらの設計された細胞とのＣＲＶペプチドの結合を評価した。図５Ｂで示されるように、ＲＸＲＢの発現の停止は、野生型ＲＡＷ細胞とのＦＡＭ－ＣＲＶ結合の約７０％を減少させ、それは１時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって定量化された。これらのインビトロの結果は、ＲＸＲＢがマクロファージとのＣＲＶ結合の原因であることを示した。

実施例８：ＲＸＲＢ表面結合はＣＲＶ結合に重要である
さらに、ＲＸＲＢの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色が、４Ｔ１腫瘍組織上で実行された。この目的のために、４Ｔ１ヒト乳癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地において培養された。ヒト細胞株は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）のＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって認証され、その細胞株ではマイコプラズマ汚染は陰性であった。４Ｔ１腫瘍を生成するために、１×１０^６の腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁された）が、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪体に同所的に注入された。動物実験の全ては、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｂｕｒｎｈａｍ Ｐｒｅｂｙｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得た。

組織切片は、０．１％トリトンＸ－１００を備えた１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックされ、適切な一次抗体および二次抗体でインキュベートされた。一次抗体は、ラット抗マウス（ｒａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ラット抗マウス（ｒａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）Ｆ４／８０モノクローナル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびウサギ抗フルオレスセイン（ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）／Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ポリクローナル抗体であった。二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧおよび５９４ロバ抗マウス（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｔ）ＩｇＧはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものであった。ＰＢＳで洗浄された後、切片はＤＡＰＩ含の封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に埋め込まれ、ツァイスＬＳＭ ７１０ＮＬＯ共焦点顕微鏡で検査された。

この実験は、ＲＸＲＢがマクロファージマーカー（ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０およびＣＤ６８）と同様にＦＡＭ－ＣＲＶと共局在化したことを示した（図５Ｃ）。さらに、ＲＸＲＢ染色（茶色）が核上のみならず細胞全体上で示され、ＲＸＲＢの表面発現がＣＲＶ結合に重要であることを支持していることにも注目すべきある。

実施例９：ＲＸＲＢ陽性の細胞がＣＲＶ結合を増強した
マクロファージとのＣＲＶ結合とＲＸＲＢ表面発現との間の相関性をさらに調査するために、４Ｔ１腫瘍モデルから分離された腫瘍細胞に対するＣＲＶおよびＲＸＲＢ抗体のエクスビボの結合が実行された。約８ｍｍの腫物サイズを備えたマウスは、深い麻酔下（アベルチン、つま先ピンチに対して無反応）で頸椎脱臼によって安楽死させられた。標的（腫瘍）および対照（例えば肝臓、脾臓）組織は収集され、さらに単細胞に分離された。腫瘍細胞は、ＭＡＣＳ腫瘍分離キットを使用して分離された。その後、細胞は、蛍光標識ＣＲＶまたは他の細胞マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、Ｆ４／８０）で４°Ｃで１時間インキュベートされた。陽性細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡにて定量化され、データはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析された。

フローサイトメトリー分析は、腫瘍からの約１５％の細胞がＲＸＲＢ陽性であり、およびＦＡＭ－ＣＲＶが高いＲＸＲＢ表面発現を有する細胞に最初に結合したことを示した（図５Ｄ）。大多数のＲＸＲＢ陽性の細胞（約７３％）は、ＣＤ１１ｂ陽性およびＦ４／８０陽性であり（図５Ｅ）、それらは主にＴＡＭによって発現されたことを示した。ＦＡＭ－ＣＲＶ陽性の腫瘍細胞の７３％は、ＣＤ１１ｂ陽性およびＲＸＲＢ陽性であった。ＦＡＭ－ＣＲＶの１時間のインビボの移動定着後の腫瘍細胞の染色は、さらにＲＸＲＢ陽性の細胞がより高いＣＲＶ結合を有したことを示した。しかしながら、多数の洗浄工程におけるＦＡＭ－ＣＲＶ損失のため、エクスビボ結合の結果（図５Ｄ）と比較して、その差が減少した。

実施例１０：主な器官は、ＲＸＲＢ発現の異なるレベルを有する
ＲＸＲＢとＣＲＶの間のよい相関性は、インビボのＣＲＶ体内分布を説明する可能性がある、異なる組織内のＲＸＲＢ表面発現を調査する関心の高まりにつながる。ＲＸＲＢ抗体（または対照としてのウサギＩｇＧ）およびＦＡＭ－ＣＲＶの両方は、同じマウスに静脈注射され（ＲＸＲＢ抗体：４時間の循環； ＦＡＭ－ＣＲＶ：１時間の循環）、ＲＸＲＢの提示は、経心腔的かん流後に評価された。組織切片は、０．１％トリトンＸ－１００を備えた１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックされ、適切な一次抗体および二次抗体とインキュベートされた。血管は、ＣＤ－３１に対するモノクローナル抗体によって組織切片の染色により視覚化された。一次抗体は、ネズミ抗マウスＣＤ３１ＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ネズミ抗マウスＣＤ１１ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ネズミ抗マウスＦ４／８０モノクローナル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびウサギ抗フルオレスセイン／オレゴン・グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ポリクローナル抗体であった。二次抗体、アレクサ・フルーアー４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび５９４ロバ抗ネズミＩｇＧは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからであった。ＰＢＳで洗浄された後、切片はＤＡＰＩ含の封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）に埋め込まれ、ツァイスＬＳＭ ７１０ ＮＬＯ共焦点顕微鏡で検査された。

組織切片の免疫蛍光染色は、主な器官がＲＸＲＢ発現の異なるレベルを有することを示した。ＲＸＲＢは、心臓および肺に観察されないが、腫瘍、肝臓、脾臓および腎臓において検出することができる一方、ＩｇＧ対照染色はどんな器官においても観測されなかった。ＦＡＭ－ＣＲＶシグナルは、その１時間の循環後に腫瘍と腎臓のみにおいて確認することができる。全ての器官の中でＲＸＲＢ染色が最も高かった腫瘍において、ＲＸＲＢはＦＡＭ－ＣＲＶおよびマクロファージマーカーと優れた共局在化を示し、それはＣＤ１１ｂとは最もよく、続いてＣＤ６８およびＦ４／８０であった（図６）。肝臓において、ＲＸＲＢ発現はより低く、主にＣＤ３１と共局在化され、ＣＤ６８とほとんど共局在化されなかった。脾臓については、ＲＸＲＢ抗体が赤髄領域の一部にあり、ＣＤ６８との共局在化が少なく、ＣＤ３１との共局在化が全くなかった。ＲＸＲＢ発現は、非常に低く、主にリンパ節と腎臓におけるＣＤ３１と共局在化された。これにより、なぜこれらの２つの器官においてＦＡＭ－ＣＲＶが時間経過に応じて迅速に消失された（ｗａｓｈｅｄ ｏｕｔ）のかを説明することができる。明白に、ＲＸＲＢ抗体染色の結果は、細胞透過用のトリトンＸ－１００の試薬の有無に関わらず同様であった。

実施例１１：ＲＸＲＢは腫瘍マクロファージに関する高い特定の表現を備えた表面マーカーである
５０μｇのウサギ抗マウスＲＸＲＢ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、ＰＢＳで希釈され、全容積は１００μＬであった）は、各々のマウス（ｎ＝３）に静脈注射された。マウス当たり５０μｇのウサギＩｇＧは、対照群（ｎ＝３）に注入された。３時間後に、ＦＡＭ－ＣＲＶ（１００μＬ内の１００μｇ）は全ての動物に注入された。ＦＡＭ－ＣＲＶの１時間の循環後、動物は経心臓的かん流によって殺された。組織は、上記の通りに収集され、固定されてスライスされた。

ＲＸＲＢ抗体が４Ｔ１マウスに単独で静脈注射された（さらに４時間の循環）時、ＲＸＲＢの明瞭な分布は、ＦＡＭ－ＣＲＶ同時注入との分布と同様であり、ＦＡＭ－ＣＲＶ存在が抗体によるＲＸＲＢ認識に影響しなかったことを示した。言いかえれば、ＲＸＲＢ抗体は、ＲＸＲＢとのインビボのＣＲＶ結合をブロックすることなく、その逆も同様であった。これは、ＦＡＭ－ＣＲＶがＲＸＲＢ抗体として異なる結合部位と結合したことを示し、それは、インビトロの結合の研究において観察されたものとして一致していた。これらのインビボの移動定着の結果は、ＲＸＲＢが、腫瘍マクロファージ上で高い特異的発現を有するよい表面マーカーであることを示した。さらに、それは、ＲＸＲＢ抗体が、静脈注射によって腫瘍へ優先的に移動定着し、血管を通貫し、血管外の領域においてマクロファージと結合することができ、および標的剤としての機能することができることを示した。

実施例１２：ナノ粒子のＣＲＶを介した腫物への移動定着
ＣＲＶを標的とするアプローチの翻訳の可能性を調査するために、ナノ粒子のＣＲＶを介した腫瘍への移動定着は評価された。様々な種類の薬物の制御された負荷および放出を備えた治療キャリアーとして多孔質シリコンナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）を示す広範囲な研究があった（２４、２５）。それらの薬物負荷の高い効率および時間ゲート画像化の特性は、それらを薬物キャリアーとして特に望ましくする。

概念研究の実証のため、ＣＲＶ抱合多孔質シリコンナノ粒子（ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰ）に赤い蛍光プローブ、ＳＲ１０１が負荷され、ナノ粒子が４Ｔ１の担癌のマウスにおいて腫瘍への移動定着効果を示した。ＣＲＶペプチド、ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰまたは対照非特異性のペプチドを含む溶液の１００－２００ｕＬは、約８ｍｍの腫瘍サイズを有する腫瘍マウスの尾静脈に注入された。５分後、循環の２４時間以内に、マウスは麻酔され、画像処理設備（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ、Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓのライトテーブル、多光子のＬＳＭ）によって画像化される。Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳのように利用可能な場合、マウスは、画像処理中にイソフルランで麻酔される（移動定着：流量０．８～１．５ｌ／分、イソフルラン気化器２～３％、メンテナンス：流量０．４～０．８ｌ／分、イソフルラン気化器２～３％）。その後、マウスはＰＢＳでかん流される。腫瘍および対照器官は収集され、組織学の特性評価および免疫組織化学の評価に使用される。

エクスビボのＩＶＩＳ画像化は、対照ＮＰと比較して、ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰを受けた動物の腫瘍においてより高いＳＲ１０１強度があったことを示した（図７Ａ）。フローサイトメトリー分析を備えた腫瘍から分離された細胞も分析された。ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰ群において、ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰ陽性の細胞の７４％は、ＣＤ１１ｂ陽性およびＣＤ６８陽性であった一方、対照のｐＳｉＮＰ陽性の細胞の５２．５％だけがＣＤ１１ｂ陽性およびＣＤ６８陽性のマクロファージであった。これは、ＣＲＶ標的化ＮＰがフリーペプチドの移動定着能力を模倣し、およびＣＲＶ－ｐＳｉＮＰシステムが腫瘍関連マクロファージに薬物を送達する可能性があり、ゆえに臨床の結果を改善すると示唆した。それ故に、ＣＲＶ－ｐＳｉＮＰは、マクロファージの極性を調整し、かつ腫瘍治療の治療効果を評価するために薬物が負荷されることができる。

本発明の好ましい実施形態がここに示されて記載された一方、そのような実施形態が例示のみとして提供されることは当業者に明白であろう。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更および代替が、見出されるであろう。ここに記載されている本発明を実施において、本発明の実施形態の様々な代替案が活用されてもよいことが理解されるであろう。以下の請求項は、本発明の範囲を確定し、本請求項の範囲内の方法、および構造、またそれらの等価物がそれによって包含されることが意図的である。

Claims (54)

1. 腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）結合分子を含む医薬組成物を含む被検体に投与する工程を含む、被検体の癌を処置するまたは診断する方法。
2. 前記ＴＡＭ結合分子は、ＴＡＭ上のレチノイドＸ受容体ベータと結合する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＡＭ結合分子は、ペプチド、リガンド、抗体、非ＩＧドメインまたは小分子実体である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＴＡＭ結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項４に記載の方法。
7. 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項４に記載の方法。
8. 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
9. 前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２または二重特異性抗体である、請求項４に記載の方法。
10. 前記ＴＡＭ結合分子は、ペプチドである、請求項１に記載の方法。
11. 前記ペプチドは、環状である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ペプチドは、ａ）ＣＲＶＬＲＳＧＳＣ、またはｂ）少なくとも１つの保存アミノ酸置換を備えたＣＲＶＬＲＳＧＳＣを含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＴＡＭ結合分子は、ある部分にさらに抱合する、請求項１に記載の方法。
14. 前記部分は、治療剤または診断薬である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記治療剤は、細胞毒性剤、化学療法剤、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害剤、核酸または抗ホルモン剤である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞毒性剤は、リボソーム不活性化タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、チューブリン阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節剤、ＤＮＡ副溝結合剤、または放射性剤である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記診断薬は、標識である、請求項１４に記載の方法。
18. 前記標識は、蛍光標識、発色標識または放射性標識である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＴＡＭ結合分子は、前記部分に直接に抱合する、請求項１３に記載の方法。
20. 前記ＴＡＭ結合分子は、リンカーを介して間接的に前記部分に抱合する、請求項１３に記載の方法。
21. 前記組成物は、さらに送達剤を含む、請求項１に記載の方法。
22. 前記送達剤は、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、またはウイルスベクターを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＴＡＭ結合分子は、腫瘍細胞に対して細胞溶解性である、請求項１に記載の方法。
24. 前記ＴＡＭ結合分子は、腫瘍成長を阻害する、請求項１に記載の方法。
25. 前記癌は、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、頭部および頸部の扁平上皮癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
26. 前記医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内または頭蓋内に投与される、請求項１に記載の方法。
27. 前記医薬組成物は、第２の治療剤との組み合わせで投与される、請求項１に記載の方法。
28. 前記第２の治療剤は、癌化学療法剤、放射線治療、細胞毒性剤、別の抗体、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、抗酸化剤等の栄養補助食品またはそれらの組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
29. ある部分に抱合する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）結合分子と、送達剤とを含む、医薬組成物。
30. 前記ＴＡＭ結合分子は、ＴＡＭ上のレチノイドＸ受容体ベータと結合する、請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 前記ＴＡＭ結合分子は、ペプチド、リガンド、抗体、非ＩＧドメインまたは小分子実体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
32. 前記ＴＡＭ結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２９に記載の医薬組成物。
33. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
35. 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
36. 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
37. 前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２または二重特異性抗体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
38. 前記ＴＡＭ結合分子は、ペプチドである、請求項２９に記載の医薬組成物。
39. 前記ペプチドは、環状である、請求項３８に記載の医薬組成物。
40. 前記ペプチドは、ａ）ＣＲＶＬＲＳＧＳＣ、またはｂ）少なくとも１つの保存アミノ酸置換を備えたＣＲＶＬＲＳＧＳＣを含む、請求項３８または請求項３９に記載の医薬組成物。
41. 前記部分は、治療剤または診断薬である、請求項２９に記載の医薬組成物。
42. 前記治療剤は、細胞毒性剤、化学療法剤、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害剤、核酸または抗ホルモン剤である、請求項４１に記載の医薬組成物。
43. 前記細胞毒性剤は、リボソーム不活化性タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、チューブリン阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節剤、ＤＮＡ副溝結合剤、または放射性剤である、請求項４２に記載の医薬組成物。
44. 前記診断薬は、標識である、請求項４１に記載の医薬組成物。
45. 前記標識は、蛍光標識、発色標識または放射性標識である、請求項４４に記載の医薬組成物。
46. 前記ＴＡＭ結合分子は、前記部分に直接に抱合する、請求項２９に記載の医薬組成物。
47. 前記ＴＡＭ結合分子は、リンカーを介して前記部分に間接的に抱合する、請求項２９に記載の医薬組成物。
48. 前記送達剤は、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、またはウイルスベクターを含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
49. 癌がある主体の腫瘍微小環境内のＴＡＭ数を減少させる方法であって、その主体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を含む投与を含む、ここでは医薬組成物はＴＡＭに対して細胞傷害である、方法。
50. 癌を抱える被検体の腫瘍微小環境内の免疫抑制を排除する方法であって、前記被検体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を投与工程を含み、ここで医薬組成物はＴＡＭを取り除き、減少させるおよび／または中和する、方法。
51. 癌を抱える被検体においてＴＡＭをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極する方法であって、前記被検体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、ここで医薬組成物はＴＡＭをＭ２表現型からＭ１表現型に再分極する、方法。
52. 被検体の癌を検出する方法であって、前記被検体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
53. 被検体の腫瘍関連マクロファージを検出する方法であって、前記被検体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
54. 癌を抱える被検体の腫瘍微小環境を検出する方法であって、前記被検体に請求項２９～４８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。

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