JP6041333B2 - 抗腫瘍剤 - Google Patents
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Description
[1]CD44のv9領域に特異的に結合し、CD44のv9領域を有するCD44vを発現する細胞に対する細胞障害活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
[2]CD44のv9領域に特異的に結合し、CD44のv9領域を有するCD44vとアミノ酸トランスポーターxCTとの相互作用を阻害する活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
[3](i)細胞内活性酸素種の低下を抑制するか、または、
(ii)薬剤の細胞外排出を阻害する、上記[1]または[2]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[4]CD44のv9領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
(i)配列番号12のアミノ酸配列、または
(ii)(i)のアミノ酸配列中に1個または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加を有するアミノ酸配列、
に対して特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
[5]配列番号10のアミノ酸配列に特異的に結合する、上記[4]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[6]配列番号10のアミノ酸配列に結合しない、上記[4]に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[7]CD44のv9領域に特異的に結合し、CD44のv9領域を有するCD44vを発現する細胞に対する細胞障害活性を有する、上記[4]〜[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[8]CD44のv9領域に特異的に結合し、CD44のv9領域を有するCD44vとアミノ酸トランスポーターxCTとの相互作用を阻害する活性を有する、上記[4]〜[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[9]上記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:1において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:2において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:3において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:4において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:5において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:6において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
(7)(i)配列番号:7のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:7において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異をに有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1'(CDRH1')、
(8)(i)配列番号:8のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:8において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2'(CDRH2')、および
(9)(i)配列番号:9のアミノ酸配列、または(ii)配列番号:9において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3'(CDRH3')、のうちの少なくとも1つを含む、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[10]上記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:1において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:2において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:3において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:4において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:5において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:6において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[11]上記抗体またはその抗原結合断片が、
(1)(i)配列番号:7のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:7において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1'(CDRH1')、
(2)(i)配列番号:8のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:8において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2'(CDRH2')および
(3)(i)配列番号:9のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:9において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3'(CDRH3')、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[12]モノクローナル抗体である、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[13]ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[14]キメラ抗体またはヒト化抗体である、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
[15]以下の(i)または(ii) のいずれかである、上記[1]〜[14]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
(i)受託番号FERMP-21821で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または
(ii)受託番号FERMP-21822で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[16]上記[1]〜[15]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
[17]上記[16]に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
[18]上記[16]に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
[19]上記[1]〜[15]のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
[20]受託番号FERMP-21821または受託番号FERMP-21822で特定されるハイブリドーマ細胞。
[21]上記[18]〜[20]のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養液からCD44のv9領域に特異的に結合する抗体を採取することを含む、CD44のv9領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
[22]上記[19]または[20]に記載のハイブリドーマ細胞から抗v9モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からCD44のv9領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、CD44のv9領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
[23]上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、またはヒト又はヒト以外の哺乳動物である、上記[22]に記載の製造方法。
[24]上記[1]〜[15]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、CD44のv9領域を有するCD44vを発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
[25]上記[1]〜[15]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
[26]上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、平滑筋肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも1つである、上記[25]に記載の医薬。
[27]上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、または前立腺癌である、上記[25]に記載の医薬。
[28]上記腫瘍が、トリプルネガティブ乳癌(HER2陰性、ER陰性、PR陰性)である、上記[25]に記載の医薬。
[29]細胞増殖抑制剤と同時、個別、又は逐次投与するための、上記[25]〜[28]のいずれかに記載の医薬。
[30]上記細胞増殖抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分子標的薬、植物アルカロイド、抗癌性抗生物質、およびプラチナ製剤からなる群から選択される少なくとも1つである、上記[29]に記載の医薬。
[31]上記アルキル化剤が、イホスファミド、シクロフォスファミド、ダカルバシン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、およびラニムスチンからなる群から選択され、上記代謝拮抗剤が、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリピン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクボスファート、テガフール、テガフールウラシル、TS-1、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、およびメトトレキサートからなる群から選択され、
上記分子標的薬が、ゼヴァリン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブおよびリツキシマブからなる群から選択され、
植物アルカロイドが、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンからなる群から選択され、上記抗癌性抗生物質が、アクチノマイシンD、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、スマンクス、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、およびドキシルからなる群から選択され、上記プラチナ製剤が、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、およびネダプラチンからなる群から選択される少なくとも1つである、上記[30]に記載の医薬。
[32]以下の(1)〜(9)からなる群から選択される単離された相補性決定領域(CDR)
(1)配列番号:1のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)配列番号:3のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)配列番号:4のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)配列番号:5のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、
(6)配列番号:6のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
(7)配列番号:7のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1'(CDRH1')、
(8)配列番号:8のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2'(CDRH2')、および
(9)配列番号:9のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3'(CDRH3')。
[34]第2の抗腫瘍剤と共投与されることを特徴とする、[33]に記載の抗腫瘍剤。
[35]さらに第2の抗腫瘍剤を含有することを特徴とする、[33]に記載の抗腫瘍剤。
[36]前記第2の抗腫瘍剤は、細胞内活性酸素種(ROS)を増加させることを特徴とする、[34]または[35]に記載の抗腫瘍剤。
[37]前記xCT阻害剤がスルファサラジンであることを特徴とする、[33]〜[36]のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
[38]前記第2の抗腫瘍剤がシスプラチンであることを特徴とする、[33]〜[37]のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
[39]腫瘍の転移を抑制することを特徴とする、[33]〜[38]のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
[40]治療後の腫瘍の再発を防止することを特徴とする、[33]〜[38]のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
[41]前記CD44vがCD44R1であることを特徴とする、[33]〜[40]のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
本発明は、1つの実施形態において、CD44R1の機能を特異的に阻害する阻害物質、例えば、CD44R1の発現を特異的に抑制する発現抑制剤(例えば、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、siRNA、miRNAなど)、CD44R1、特にCD44のv9領域に特異的に結合する抗体、およびその抗原結合断片を提供する。これらの阻害物質は、CD44sに結合しないか、CD44sの機能を阻害しないことが好ましい。
(i)配列番号12のアミノ酸配列、または
(ii)(i)のアミノ酸配列中に1個または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加を有するアミノ酸配列、
に対して特異的に結合する。数個とは、2〜9個、好ましくは2〜7個、さらに好ましくは2〜5個、最も好ましくは2〜3個を意味する。
すなわち、本発明は、上記(i)または(ii)のアミノ酸配列をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。上記(ii)のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号10のアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、CD44のv9領域に結合し、CD44のv9領域を有するCD44vの活性を阻害するかまたは細胞障害性因子を誘導して、その細胞を、アポトーシスによる細胞死に至らしめることができる。細胞は、腫瘍細胞であることが好ましい。
本明細書中、「v9領域を有するCD44v」とは、v9領域を有しているCD44vであればよく、例えば、CD44v8-10、CD44v9-10、CD44v9などを含むものとする。
なお、他のCD44vに関しても、以上の記載方法に従うものとする。
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:1において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:2において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:3において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:4において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:5において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:6において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
(7)(i)配列番号:7のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:7において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1'(CDRH1')、
(8)(i)配列番号:8のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:8において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2'(CDRH2')、および
(9)(i)配列番号:9のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:9において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3'(CDRH3')、
のうちの少なくとも1つを含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
(1)(i)配列番号:1のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:1において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、
(2)(i)配列番号:2のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:2において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および
(3)(i)配列番号:3のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:3において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む少なくとも1つの軽鎖、ならびに
(4)(i)配列番号:4のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:4において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、
(5)(i)配列番号:5のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:5において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および
(6)(i)配列番号:6のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:6において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
(1)(i)配列番号:7のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:7において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域1'(CDRH1')、
(2)(i)配列番号:8のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:8において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域2'(CDRH2')、および
(3)(i)配列番号:9のアミノ酸配列、または(ii) 配列番号:9において1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域3'(CDRH3')、
を含む少なくとも1つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本発明は、別の実施形態において、CD44vのv9領域に特異的に結合する抗v9抗体およびその抗原結合断片をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。
したがって、本発明の別の実施形態では、抗v9モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗v9モノクローナル抗体をコードする免疫グロブリン遺伝子を単離し、その遺伝子を含む発現ベクターを構築し、その発現ベクターを宿主に導入して抗v9抗体を発現させて宿主の培養上清または宿主の分泌物を得、それらから抗v9抗体を得るという、v9領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
単離した免疫グロブリン遺伝子は、宿主に導入する際、相同的なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列で置換することによってヒト化したり(Morrisonら,Proc.Nat.cad.sci.,usA,81:6851[1984])、または免疫グロブリンをコードしない塩基配列を結合したり挿入したりしてもよい。宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、ヒトHEK293胎児腎由来細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞のような哺乳類培養細胞などが例示できる。
本発明はさらに別の実施形態において、CD44vのv9領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマを提供する。本発明はまた、v9領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。最も好ましい本発明のハイブリドーマとしては、茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2009年6月23日付で寄託された、受託番号FERMP-21821で特定されるハイブリドーマが挙げられる。別の最も好ましい本発明のハイブリドーマとしては、茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2009年6月23日付で寄託された、受託番号FERMP-21822で特定されるハイブリドーマが挙げられる。
さらに、本発明の別の実施形態では、抗v9抗体を産生するハイブリドーマから、抗v9抗体を採取することを含む、v9領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。具体的に抗体を単離する方法は特に限定されず、例えば、ハイブリドーマを培養し、培養上清などの得られる培養物からv9領域に特異的に結合する抗体を採取したり、ハイブリドーマをマウスの腹腔に移植して得られる腹水から抗体を採取したりしても良い。目的によっては、培養上清や腹水をそのまま利用することも可能である。
本発明は、さらに別の実施形態において、抗v9抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬組成物を提供する。本明細書で、腫瘍の予防とは、腫瘍の転移や再発を防ぐことを含む。腫瘍の再発は、例えば、化学的治療や外科的治療によって、一旦、腫瘍が検出されなくなった後で、再度、生き残った腫瘍細胞が増殖することにより生じる。
本発明者らは、CD44R1がxCTを安定化させることによって、生体内の主要な抗酸化物質のひとつであるGSHの合成を促進し、細胞内のROSを還元するのに貢献しているという新たな知見を得た。そこで、本発明の抗腫瘍剤は、xCT阻害剤を含有し、抗CD44v抗体と同様に、特にCD44vを発現している腫瘍に対して顕著な抗腫瘍効果を有する。腫瘍細胞が発現しているCD44vは、v9を有することが好ましく、CD44vR1であることが最も好ましい。
上述したように、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤は、CD44vを発現している腫瘍に対して顕著な抗腫瘍効果を有する。従って、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤を投与する前に、治療対象の腫瘍細胞がCD44vを発現しているかどうか、調べることが好ましい。すなわち、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤の投与方法は、
1)患者の腫瘍細胞がCD44vを発現しているかどうか、調べる工程と、
2)当該腫瘍細胞がCD44vを発現している場合に、当該患者に、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤を投与する工程を含む。
患者の腫瘍細胞は、生検でも外科手術でも取得することもできる。
1)患者の腫瘍を外科手術によって除去する工程と、
2)除去した腫瘍細胞がCD44vを発現しているかどうか、調べる工程と、
3)当該腫瘍細胞がCD44vを発現している場合に、当該患者に、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤を投与する工程、を含む。あるいは、
1)患者の腫瘍細胞がCD44vを発現しているかどうか、調べる工程と、
2)患者の腫瘍を化学的に治療する工程と、
3)当該腫瘍細胞がCD44vを発現している場合に、当該患者に、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤を投与する工程、を含む。
なお、xCT阻害剤を含有する抗腫瘍剤を投与する際、xCT阻害剤を含有しない抗腫瘍剤を共投与してもよい。これらの抗腫瘍剤の詳細は、(5)で記載した通りである。
(1)免疫原の調製
抗v9モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として、GFP融合CD44R1発現ラット肝癌細胞株RH7777細胞株を樹立した。CD44R1をコードするcDNAの全長を公知の方法を用いて組換え融合蛋白として発現させ、発現が強いものを薬剤選択性および限界希釈法にて単一クローン化し安定発現株とした。
ラット(F344/N、雌)3匹に、(1)に示した細胞株から作製した抗原を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下に抗原としてGFP-CD44R1発現RH7777細胞3×106個を投与することにより行った。抗原の投与は、1回目の投与の3週間後および6週間後に2回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後3日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で裁断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で3〜5分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。
実施例1(2)で得られたマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞株X63とを4:1の比率で混合し、遠心分離(1,200rpm、5分)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、擁搾しながら、37℃で、ポリエチレングリコール-1500(PEG-1500)2g、DMEM培地2mlおよびジメチルスルポキシド0.7mlの混液を0.2〜1ml/108個マウス脾細胞の割合で加え、さらに1〜2分間毎にDMEM培地1〜2mlを数回加えた後、DMEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離(900rpm、5分)後、上清を捨てHAT培地100ml中に細胞をゆるやかに懸濁した。
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μ1/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した
(4)抗体スクリーニング
GFP融合CD44R1発現ベクター(GFP-sCD44R1)をトランスフェクトしたHEK293F細胞の培養上清から得られた、1μg/mlのCD44R1細胞外領域断片蛋白質をELISA用96穴プレート(住友べ一クライト)に40μ1加え、4℃にて一晩インキュベートした。3%脱脂粉乳溶液を100μ1加えて37℃で1時間プロッキングしたのち、実施例1(3)で得られたハイブリドーマ培養上清を40μ1加え37℃で2時間インキュベートした。PBSで1回、0.05%Tween20-PBS(T-PBS)で5回、さらにPBSで1回洗浄後、HRP標識抗体(Dako)を800〜3000倍希釈し40μ1ずつ加え、37℃で45分間反応させた。PBSで1回、0.05%T-PBSで5回、さらにPBSで1回洗浄後、基質溶液S5ureBlue珊TMBMicrQwellPeroxidaseSubstrate(1-Component)(KPL)を各穴に50μ1加えて発色させた。適度に発色した時点で0.5N硫酸を70mlずつ加えて反応を停止し、MicroplateReaderModel550(BIO-RAD)にて各穴の吸光度(OD4105D)を測定した。吸光度が0.3以上の陽性反応を示したハイブリドーマを1次スクリーニングとして選択した。
プリスタン処理した8週令ヌード雄マウス(KSN)に実施例1(4)で得られたハイブリドーマ株を1×107細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、遠心分離(2000rpm、5分、4℃)した後50%飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして10000g、4℃で10分間遠心した。プレフィルター、メンブランフィルター(0.22μm)を通過させた後、ProteinG(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて液体クロマトグラフィーシステムAKTAにより精製し、抗v9モノクローナル抗体とした。
(1)FACSによるモノクローナル抗体の結合部位の確認
CD44v8、CD44v9、CD44v10、CD44v8-10、CD44v9-10を強制発現させたHEK293細胞をPBSにて2.5×105〜1×106cells/wellになるように調整し、50μLずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマ上清または濃度調整した精製抗体50μLを加え、氷冷下で60分反応させた。0.2%BSA-PBS200〜500μLを加え、9,100g、4℃でフラッシュする洗浄を3回行い、細胞ペレットにFITC標識またはPE標識の二次抗体(1%BSA-PBSで200倍希釈)を50μL加え、遮光氷冷下45分間反応させた。遠心洗浄後、0.2%BSA-PBS500μLにサスペンドし、40μmのナイロンメッシュ(BDFalcon#35-2340)を通した後、死細胞を除くため測定直前にDAPIを0.5μg/mLの濃度になるように添加し、BD-LSR(BectonDickinson)にて測定した。図3のヒストグラムにて矢印で示すように、LGadhO1-01モノクローナル抗体及びLGadhO1-02モノクローナル抗体は、細胞がv9領域を有している時のみ結合し、こうしてCD44のv9領域に特異的に結合することが認められた。
10μg/mLに調整した精製抗体を50μ1/wellでELISAプレート(MS-7296F)に固相化した。BiQLabsのPhD-7ランダムペプチドライブラリーを用い、結合ファージを得た。
このバイオパニング操作を3回繰り返し、回収ファージの塩基配列をDNAシーケンスで解読、アミノ酸配列に変換した。LGadhO1-01モノクローナル抗体が最も頻度高く結合した配列としてTPLEEDK(配列番号10)が得られ、ヒトCD44のv9領域と比較したところ、LEEDK(配列番号11)が共通であった。配列番号10のアミノ酸配列の両端にヒトCD44のv9領域由来の2アミノ酸を加えた合成ペプチドEGLEEDKDH(配列番号12)との反応をELISAで調べた結果、LGadhO1-01モノクローナル抗体及びLGadhO1-02モノクローナル抗体が結合することが認められた。ただし、LGadhO1-02モノクローナル抗体は配列番号10をもつファージと反応しなかったため、LGadhO1-01モノクローナル抗体とLGadhO1-02モノクローナル抗体のエピトープは異なることが認められた。
ホルマリン固定後パラフィン包埋された検体組織切片のアレイスライドを、60℃で1時間加熱した後、コプリンジャー内でキシレンに30分間浸し、さらに新しいキシレンで2回洗浄することで脱パラフィン化した。一連の段階的濃度(100%〜75%)のエタノールで処理した後、切片を純水で再水和した。スライドを10nMクエン酸緩衝液(pH6.0)に浸し、続いて電子レンジ(700W)に7分間かけ、30分間室温で放冷した。スライドをTBST (25mMTris-HClpH7.4, 130mMNaCI, 2.5mMKC1, 0.1%Tween20)で5分間3回洗浄した後、メタノールで3%に希釈した過酸化水素水に15分間浸した。TBSTで5分間3回洗浄した後、TBSTで10%に希釈した正常ウサギ血清とともにインキュベートした。正常ウサギ血清を除いた後、TBSTで1.5%に希釈した正常ウサギ血清を用い0.2μg/mlになるよう希釈したLGadhO1-01モノクローナル抗体をスライドに滴下し、室温で1時間インキュベートした。スライドをTBSTで5分間3回洗浄した後、二次抗体として、TBSTで1.5%に希釈した正常ウサギ血清で200倍に希釈したビオチン標識抗ラットイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体(DAKO#EO468)とともに室温で1時間インキュベートした。
FACS法によりLGadhO1-01モノクローナル抗体を用いてヒト乳癌細胞株7種および非癌細胞2種におけるv9領域を有するCD44vの発現量を測定した。図5に示すように、v9領域を有するCD44vは非癌細胞に比べ、乳癌細胞で優位に高発現していることが認められた。また、大腸癌、肺癌、膵癌、皮膚癌、子宮頸癌、舌癌細胞においても高発現が認められ、v9領域を有するCD44vが癌細胞で特異的に発現していることが示唆された。
CD44vの機能としてROSの抵抗性への関与が示された。ROSの制御においては、生体内の主要な抗酸化物質のひとつであるGSHの合成を促進し細胞内の活性酸素種の還元へ関与しているxCTが知られていることから、CD44vとxCTの相互作用について検討を行った。
ヒト大腸癌細胞HcT116に対して、cD44siRNA(v9領域を有するCD44vを標的とするsiRNA)あるいはコントロールとしてヒトの配列に相同性を持たないsiRNA(luciferase由来)を、RNAiMAX(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。37℃で3日間培養後、4%パラフォルムアルデヒドにより固定した。抗v9ラットモノクローナル抗体あるいは抗xCTラットモノクローナル抗体を室温で60分間反応させ、その後PBSで3回洗浄した。AlexaFluor488-conjugated2次抗体(Invitrogen)あるいはTexasred-conjugated2次抗体(Invitrogen)を、室温で60分間反応させ、その後PBSで3回洗浄した。さらに対比染色として、Hoechst33342(Invitrogen)により核染色を行い、BiorevoBZ-9000蛍光顕微鏡(Keyence)を用いて、観察を行った。
さらに、免疫沈降法によるCD44R1とxCTの相互作用の検討を行った。CD44R1を発現するpRc-CMVベクター、CD44sを発現するpRc-CMVベクター、および空のベクターをFuGene(RocheDiagnostics)を用いてトランスフェクトした。37℃で24時間培養後、プロテアーゼ阻害剤入りのRIPAbufferで溶解し、蛋白質抽出液を取得した。抗xCTラットモノクローナル抗体を加え、氷上で1時間作用させた。その後G-Sepharosebeads(GEHealthcare)を加え、1時間反応させた。遠心後上清を除去し、RIPAbufferにより3回洗浄を行った。その後、抗CD44ウサギポリクローナル抗体および抗xCTウサギポリクローナル抗体によるWesternblot法で、CD44とxCTの複合体形成状態を解析した。検出はChemiluminescence Reagent Plus(Perkin-Elmer)を用いて行った。図7に示すように、CD44R1を発現するpRc-CMVベクター、CD44sを発現するpRc-CMVベクターをトランスフェクトした細胞において、それぞれ標的蛋白質が強制発現されていることが確認された。それらの細胞に対し、抗xCT抗体を用いて免疫沈降した結果、CD44R1を強制発現させた細胞において、バンドが検出されたことから、xCTはCD44R1と複合体を形成していることが認められ、一方CD44sを強制発現させた細胞においては、バンドが検出されず、xCTとの相互作用はCD44R1特異的な現象であることが明らかになった。
ヒト大腸癌細胞HcTll6に対して、cD44siRNA(v9領域を有するCD44vを標的とするsiRNA)あるいはコントロールとしてヒトの配列に相同性を持たないsiRNA(1uciferase由来)を、RNAiMAX(Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。37℃で3日間培養後、0.5mM過酸化水素水(H2O2)を20分作用させ、その後10μM DCFH-DA(MolecularProbes, Invitrogen)試薬を37℃で15分間作用させた。FACSを用いてDCFの蛍光を測定し、細胞内のROS蓄積量を解析した。図8に示すように、Control siRNA処理群に過酸化水素水を加えてもDCF蛍光値は低くROSは蓄積していないのに対し、cD44siRNA処理によりCD44vをノックダウンした細胞に過酸化水素水を加えるとROSが蓄積していることが確認され、CD44vがROS抵抗性へ関与していることが認められた。
5種の臓器の癌細胞株を標的抗原とし、乳癌細胞株、肺癌細胞株、大腸癌細胞株、膵臓癌細胞株、および子宮頸癌細胞株を、96 well plateに播種した。37℃で24時間培養後、培地を取り除き、LGadhO1-01モノクローナル抗体10μg/mlおよび本発明において好ましい各細胞増殖抑制剤(代謝拮抗剤の5FUおよびゲムシタビン、微小管脱重合阻害薬のタキソテール、アルキル化剤のオキサリプラチン、トポイソメラーゼ阻害薬のドキソルビシン)を0〜300μMの範囲の用量で調整した培地を150μ1/wellで加えた。37℃で3日間培養後、培地を取り除き、アラマーブルー試薬(Invitrogen)を10倍に希釈した培地を150μ1/wellで加えた。
37℃で2時間培養後、Infinite M200(TECAN)を用いて590nmにおける蛍光強度を測定した。図9に示すように細胞増殖抑制剤の単剤の効果に比べ、LGadhO1-01モノクローナル抗体の併用による抗腫瘍効果の強化が検出された。評価に使用したいずれの細胞増殖抑制剤においても増強効果が見られ、LGadhO1-01モノクローナル抗体の作用により、xCTの薬剤排出能が抑えられたことが示唆された。
ベノジェクトH真空採血管(テルモ#VP-H100K)に採血したヒト末梢血6mLを、リンフォセパールI(IBL#23010)4mLに対し静かに重層し、1800rpmで30分遠心して分離した単核球の層を回収した。PBSで倍量に希釈し、200gで10分間遠心した。ペレットにPBSを加え、200gで10分間遠心して洗浄し、適切な細胞密度になるよう培地で懸濁した細胞をエフェクター細胞とした。一方、標的細胞としてBT20細胞を2×105cells/mLとなるように培地で調整した。丸底96 well plateに予めLGadhO1-01ヒトキメラ抗体50μLずつ分注し、標的細胞液を50μL加えた。4℃で15分インキュベート後、1500rpmで3分遠心して、上清を捨てた。エフェクター細胞液100μLを加え、1200rpmで1分遠心して37℃で4時間インキュベートした。インキュベート後、1200rpmで3分遠心し、上清50μLを平底96 well plateに移した。Substratemix (Cytotox96 Non-Radioactivecytotoxicityassay(Promega #G1780))を50μL/wellで加え、30分静置した。Stop solutionを50μ1/well加え、InfiniteM200(TECAN)を用いて490nmにおける吸光度を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。
細胞障害率(%)=[(sample release - spontaneous release)/(total release - spontaneous release)]×100
図10に示すようにLGadhO1-01モノクローナル抗体のADCC活性が検出された。エフェクター/ターゲット比依存的な活性および抗体濃度依存的な活性が認められた。
ヒト舌癌細胞HSC-3をKSNヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。腹腔内にプリスタン500μl/匹を投与後、マウスを156匹と15匹の群に分けた。16匹の群の腹腔内にハイブリドーマLGadhO1-01を投与し、15匹の群の腹腔内に陰性コントロールとして、HSC-3に結合しない抗マウスCD44抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水が貯留した時点で各マウスの腫瘍容量を測定した。図11に示すように、陰性コントロール群に比べ、ハイブリドーマLGadhO1-01投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
4×106cellsのヒト大腸癌細胞HT29を100μLのMatrigelで懸濁し、Balb/cヌード雌マウスに皮下投与した。
その4日後にLGadhO1-01ラットモノクローナル抗体の投与を開始し、抗体は1mg/mouseで週2回投与を2週間続け、投与毎に腫瘍容量を測定した。図12に示すように、陰性コントロールのPBS投与群に比べ、LGadhO1-01投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
(1)スルファサラジンの抗腫瘍効果
CD44v依存的に増殖するヒト大腸がん細胞HCT116を用い、実施例2(9)と同様に、KSNヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。10匹のマウスに細胞を移植し、5匹は、250mg/kgのスルファサラジン、5匹は100マイクロリットルの生理食塩水を毎日一回腹腔内注射した。移植14日後と28日後に腫瘍径を計測し、腫瘍径に基づき重量を計算し、各群で比較した。
図13に示すように、スルファサラジンを投与した群では、対照群に比べて腫瘍増殖が有意に遅かった。このように、スルファサラジンは、腫瘍増殖抑制効果を有し、抗腫瘍剤として有用である。
(1)と同様に、CD44vを高く発現しているHCT116細胞をKSNヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。15匹のマウスに細胞を移植し、5匹は2mg/kgのシスプラチン、5匹は、2mg/kgのシスプラチン+250mg/kgのスルファサラジン、5匹は100マイクロリットルの生理食塩水を毎日一回腹腔内注射した。移植28日後に腫瘍径計測し、腫瘍径に基づき重量を計算し、各群で比較した。
図14に示すように、スルファサラジン単独より、シスプラチンとスルファサラジンシスプラチンを投与した方が、腫瘍増殖抑制効果は有意に大きかった。この腫瘍増殖抑制効果の増強は、スルファサラジン単独の抗腫瘍効果から予測されるよりも大きく、スルファサラジンは、それ自体で抗腫瘍効果を示す以外に、シスプラチンの効果を増強していると考えられた。このように、スルファサラジンは、シスプラチンの抗腫瘍効果を増強する効果を有し、シスプラチンの抗腫瘍効果増強剤として有用である。
マウス乳癌細胞4T1は転移能が高く、マウスの乳腺に移植すると3〜4週間で肺を含めた全身の組織に転移する。この細胞株と、他の転移能の低い乳癌細胞(4Y07、168FARN、67NR)に対し、RT-PCTを用いて、CD44s及びCD44vの発現を調べた。なお、マウス乳癌細胞株4T1、CD44v+、CD44v-は、10%FBS含有RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO)を用いて、37°C、5%CO2 の条件下で培養した。また、PCRに用いたプライマーは、以下の通りである。
CD44v-1:5’-GGAGATCAGGATGACTCCTTCT-3’
CD44v-2:5’-AGTCCTTGGATGAGTCTCGATC-3’
その結果、図15に示すように、4T1細胞では、他の乳癌細胞に比べ、CD44vが高発現しており、細胞の転移能とCD44vの発現には、相関関係があった。
その結果、図16に示すように、CD44v+細胞は肺定着が検出されたが、CD44v-細胞は、ほとんど肺定着は検出されなかった。このように、CD44vは、腫瘍の転移に重要な役割を有している。
さらに、in vivoにおいて、スルファサラジンの腫瘍転移に対する効果を調べた。まず、同様に、1x105 個の4T1細胞を12匹のマウスの尾静脈より注入した。そして、各6匹のマウスに対し、生理食塩水または8mg/匹のスルファサラジンを、1日に2度腹腔投与した。2週間後、蛍光イメージングによって、肺に定着し増殖した腫瘍の重量を測定した。
その結果、図18に示すように、スルファサラジンを投与した群では、肺での腫瘍細胞の定着率が低かった。このように、スルファサラジンは、腫瘍細胞の転移を抑制することができる。
Claims (7)
- CD44vを発現している腫瘍に対する抗腫瘍剤であって、
スルファサラジンを含有する抗腫瘍剤。 - 細胞内ROSを増加させる第2の抗腫瘍剤と共投与されることを特徴とする、請求項1に記載の抗腫瘍剤。
- さらに細胞内ROSを増加させる第2の抗腫瘍剤を含有することを特徴とする、請求項1に記載の抗腫瘍剤。
- 前記第2の抗腫瘍剤がシスプラチンであることを特徴とする、請求項2または3に記載の抗腫瘍剤。
- 腫瘍の転移を抑制することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
- 治療後の腫瘍の再発を防止することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
- 前記CD44vがCD44R1であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗腫瘍剤。
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