TW201829777A - 用於增進哺乳類細胞培養中抗體生產率以及最小化下游配方製程期間聚集之改進的方法以及該方法獲得之穩定抗體配方 - Google Patents

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Abstract

本發明描述用於抗體製造及配製之有效平臺，其提供i)利用改進的進料策略之細胞培養製程，其產生在2 gm/L至5 gm/L之間的高抗體效價；ii)改進的純化製程，其展示最佳回收百分比、高純度單體含量、最小聚集/微粒形成、最小雜質水平；及iii)高濃度穩定的液體配方，其具有跨於不同溫度偏離額定值之最佳滲透壓度及低黏度且缺少聚集。較佳抗體包括對E蛋白質之結構域III中的登革熱病毒抗原決定基特異的IgG1單株抗體及對狂犬病病毒表面G糖蛋白特異的IgG1單株抗體。

Description

用於增進哺乳類細胞培養中抗體生產率以及最小化下游配方製程期間聚集之改進的方法以及該方法獲得之穩定抗體配方
本揭示內容係關於用於增進哺乳類細胞培養中抗體生產率以及最小化下游配方製程期間聚集之改進的方法以及該方法獲得之穩定抗體(登革熱抗體配方、狂犬病抗體配方)配方。
上游、下游及配方研發常常可為生物藥品向臨床試驗中之早期引入中的限速步驟。例如，登革熱為影響人類的最重要之蚊蟲傳播病毒性疾病。世界人口的一半都生活在冒有登革熱風險之區域，從而造成全球每年估計3億9千萬例感染。當前沒有抗病毒劑被批准用於治療登革熱且近來的疫苗試驗不符合預期。主導的疫苗候選者最近被證明功效有限，估計在30%-60%之間，受限於針對DENV-2無顯著的保護作用。最近已鑑別出E蛋白之結構域III中的非免疫優勢但功能上相關的抗原決定基，且隨後正在研發工程改造的抗體Ab513，其展現對所有四種血清型內的多種基因型的高親和力結合且廣泛地中和該等基因型(Refer Ram Sasisekharan等人 Cell 162, 1-12, 2015年7月30日；Samir Bhatt等人, Nature, 2013年4月25日; 496 7446: 504-507)。因此，若吾等考慮針對登革熱單株抗體的全球醫學需求，則最近的估計指示：全球每年發生多達3億9千萬例登革熱感染，其中＞9千萬表現出患有使得DENV成為主要全球威脅的疾病。若吾等假定1千6百萬經判斷登革熱病例中之30%前往醫院，則約5百萬將需要該登革熱單株抗體，從而暗示高於4 gm/L之「純化抗體」成為滿足此種救生抗體之全球需求的先決條件。另外，登革熱疾病負擔在發展中國家很高，其中電力及冷凍之可利用性常常不足，且因此跨於溫度偏離額定值之抗體穩定性對該些地區而言呈現較大相關性。
的確，若可能具有可用於製造及配製所有單株抗體(monoclonal antibody; mAb)侯選物之平臺製程，則將大大地減少製程研發所需的時間及資源。此可對可引入臨床試驗的臨床侯選物之數量具有重要影響。此外，針對早期臨床試驗開發的製程、包括使用平臺開發的彼等者可關於製程經濟學、產率、池體積、生產量而言為非最佳的，且可能不適合於生產針對晚期或商業活動所需的數量。倘若製程開發需要在將治療侯選物引入臨床試驗之前發生，則另一重要考量為製程開發之速度。(Refer Abhinav A. Shukla等人 Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39)。
典型地，哺乳類細胞培養基係基於可商購的培養基配方，包括例如DMEM或Ham氏F12。常常，培養基配方並不足夠富足來支援細胞生長及生物蛋白質表現兩者之增加。仍然需要改進的細胞培養基、補充物、及細胞培養方法以用於改進的蛋白質生產。已在早前報告細胞培養抗體效價增加至＞2 g/L。參考F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393。另外，在灌注反應器中，細胞可比在習知分批或饋料分批反應器中達到高得多的細胞密度。(參考Sven Sommerfeld等人 Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137)。然而，基於灌注之製程為複雜、成本高的且亦可導致無菌問題及醣苷化型式之非所欲異質性。將無動物組分水解產物(Bacto TC Yeastolate, Phytone Peptone)添加至化學性界定培養基為以及時方式增加細胞密度、培養生存力及生產率之一般方法。水解產物為由胺基酸、小肽、碳水化合物、維生素及礦物質構成的向培養基提供養分補充物之蛋白質消化物。來自大豆、小麥及酵母之非動物源水解產物常用於細胞培養基及物料以改進抗體效價(參考US9284371)。然而，由於其組成複雜性、批間變化、使得培養物黏稠的不合需要屬性，酵母萃取物及水解產物可為培養基變化性之重要來源。由於包括同功型之抗體產品之複雜性及微觀異質性，細胞培養製程之效能可對產品品質及效力具有重要影響，尤其關於醣苷化、轉錄後修飾及雜質分佈而言如此。
在較高濃度下，蛋白質、尤其是抗體常常展現包括聚集、沉澱、凝膠化、降低的穩定性、及/或增加的黏度之特性問題。
據認為抗體擁有趨向於在溶液中形成聚集體及微粒之特性，因為該等抗體經歷降解或聚集或變性或化學修飾，從而造成在製造製程期間及/或在儲存期間生物活性隨時間之損失。抗體聚集體可在細胞培養表現、下游純化、配製期間及在儲存時形成。細胞培養收穫物通常含有製程中最高水平之聚集(參考Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75)。蛋白質之降解路徑可涉及化學不穩定性(例如，涉及藉由鍵形成或分裂從而產生新化學實體來修飾蛋白質之任何製程)或物理不穩定性(例如，蛋白質之高階結構之改變)。三種最普通蛋白質降解路徑為蛋白質聚集、脫醯胺及氧化。Cleland等人 Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)。另外，蛋白質亦對例如pH、離子強度、熱應力、剪應力及界面應力敏感，其中所有可導致聚集且造成不穩定性。為使蛋白質保持為生物學上活性的，配方因此必須使蛋白質之胺基酸之至少核心序列的構形完整性保存完好而同時保護蛋白質之多個官能基免於降解。
由聚集體形成引起的主要問題在於在投與期間，配方可堵塞注射器或泵且使得其對患者為不安全。此等蛋白質修飾亦可使得其為免疫性的，從而造成藉由患者產生抗藥物抗體，進而可在後續注射期間減少藥物可利用性或更壞情況誘發自體免疫反應。抗體配方之開發中的主要目標係維持蛋白質可溶性、穩定性及生物活性。
關於如何解決蛋白質治療配方之不穩定性之問題的早期建議包括藥物產品之凍乾法，繼之以在投與之前立即或不久復水。然而，抗體之凍乾配方具有許多限制，包括用於凍乾法之延長製程及由此產生的高製造成本。另外，凍乾配方必須無菌地且精確地藉由保健開業者在投與至患者之前復水。復水步驟本身需要某些特定的程序，亦即，(1)將無菌稀釋劑(亦即，用於靜脈內投與之水及用於肌肉內投與之5%右旋糖水溶液)緩慢地及無菌地添加至含有凍乾抗體之小瓶，且必須將小瓶極輕柔地渦漩30秒以避免氣泡；(2)復水抗體可能需要在室溫下靜置最少20分鐘直至溶液澄清；且(3)復水製劑必須在復水之後六(6)小時內投與。此種復水程序為繁瑣的且復水之後的時間限制可引起在投與配方至患者中時的大的不便性，從而若未適當地復水，或若復水劑量未在六(6)小時內使用則會導致明顯的浪費，且必須丟棄。因此，由於臨床及患者便利性之因素以及易於製造性，液體配方為合乎需要的。然而，蛋白質治療劑，亦即，抗體之液體醫藥配方應為長期穩定的，含有安全及有效量之醫藥化合物。
聚集體之除去比製程相關雜質之除去更困難，此係歸因於聚集體與單體之間的生物物理學類似性、聚集體之多種來源及類型、及對聚集機制之較少瞭解。
在高濃度單株抗體劑型之配方開發期間遇到的較近期挑戰之一為在製造及長期儲存期間蛋白質亞可見及可見微粒之形成。IgG配方中蛋白質及非蛋白質微粒之水平係純化及配方開發之日漸增加的重要部分。(參考Klaus Wuchner等人 Journal of Pharmaceutical Sciences, 第99卷, 第8期, 2010年8月)。另外，液體配方應跨於不同溫度即2-8℃、25℃、40℃、及55℃之溫度為穩定的。
意欲用於人類用途的許多抗體製劑需要穩定劑來在製劑之使用之前防止變性、聚集及其他對蛋白質之改變。先前報告的抗體液體抗體配方(Lucentis, Avastin)具有作為穩定劑之甘露醇、海藻糖。(參考Susumu Uchiyama等人 Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 2041-2052；US20160137727；WO2009120684；US8568720)。然而，海藻糖成本高且自大規模製程經濟學而言不可行。
此外，抗體之IV投與通常以輸注方式而非推注方式給予，且因此需要mAb配方之稀釋，將賦形劑至適合於IV投與的適當流體中。賦形劑、尤其表面活性劑之所得稀釋液可減小至低於在攪動期間防止聚集所需的濃度以下，進而導致在稀釋至含有0.9%鹽水之PVC及PO IV袋中之後於輕柔攪動後產生聚集體及亞可見粒子。
疏水性相互作用層析法、陶瓷羥磷灰石及陽離子交換樹脂已全部用於聚集體移除但並不都理想。大多數先前報告的抗體純化製程已極大地依賴於疏水性相互作用層析法組合蛋白質A層析法、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法作為三或四步製程之使用(參考WO2010141039、WO 2014/207763、WO2013066707、WO2015099165、WO2014102814、WO2015038888、WO2004087761)。然而，疏水性相互作用層析樹脂需要大量的鹽，該等鹽係昂貴的，展示低的結合容量，可能難以處置，且可能不與緩衝液及產品保持槽之構造材料相容。此外，用於HIC步驟之緩衝液之間的密度差可引起床層穩定性問題。陶瓷羥磷灰石亦可用於自單體分離聚集體，但陶瓷樹脂可極難以在不破壞樹脂的情況下拆開。因此，在管柱外部儲存樹脂以供在後一製造活動中再次使用可能是不可能的(參考Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78)。
陽離子交換、陰離子交換流通法、疏水性相互作用層析法及混合模式陽離子交換層析法之三步組合據發現為CHO源單株抗體遞送對寄主細胞蛋白質污染物之足夠清除率。然而，此種純化方案總體上在商業下游操作中未推行，此係歸因於對每一mAb單獨地設計純化序列之需要。
因此，存在對用於抗體製造及配製的有效平臺製程之迫切而又尚未滿足的需要，該有效平臺製程滿足包括穩固性、可靠性及可擴縮性之多種準則，尤其為提供以下各項之平臺：i)至少2 gm/L之抗體效價；ii)跨於細胞培養、純化及配方製程之最小聚集/微粒形成；iii)展示最佳回收百分比、高單體含量及最低雜質水平之改進的純化；及iv)展示低黏度、缺少聚集及亞可見粒子，進而展示長期穩定性之高濃度抗體配方。
申請人已令人驚訝地發現 a) 進料組合物及進料策略，其考慮了養分消耗、副產物累積及促進生長相對體積生產率之間的平衡，其中詳言之，如特定基本培養基之使用、濃縮基本培養基作為進料溶液之使用、不同進料溶液連同明確進料策略之使用、維持乳酸鹽及氨之較低濃度的哺乳類細胞培養製程參數據發現增進細胞生長、細胞壽命及蛋白質表現；進而產生增加的抗體效價。 b) 在蛋白質A親和力及陽離子交換步驟期間作為緩衝液之部分的特定鹽濃度，其最小化聚集；進而達成大於99%之單體含量與大於80%之回收率。 c) 包含蔗糖與組胺酸、精胺酸、聚山梨醇酯-80、氯化鈉組合的無粒子液體抗體配方，其相較於缺少蔗糖之配方而言賦予較高效力及穩定性，在2-8℃下減少高濃縮抗體溶液之黏度達至少9個月，在25℃下減少該黏度達至少1個月，在40℃下減少該黏度達至少42天，在55℃下減少該黏度達至少2天。
本發明之治療性蛋白質包括但不限於抗原結合蛋白質、人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體、雙特異性抗體、多價抗體、多特異性抗體、抗原結合蛋白質片段、多株抗體、單株抗體、雙功能抗體、奈米抗體、一價異源共軛物、多特異性自體抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab)′2片段、藉由Fab表現文庫產生的片段、抗遺傳型(抗Id)抗體、抗原決定基結合片段及含CDR片段或其組合。
在本發明之一實施例中，治療性蛋白質為抗原結合蛋白質或免疫球蛋白；更佳地為IgG且最佳地為IgG1分子。在本發明實施例之第一態樣中，免疫球蛋白/抗體為人類IgG1 (G1m3異型)，其具有對E蛋白質之結構域III中之登革熱病毒抗原決定基特異的人類κ輕鏈。在本發明實施例之第二態樣中，抗體為對狂犬病病毒表面G醣蛋白特異的完全人類IgG1單株抗體。在本發明實施例之第三態樣中，治療性蛋白質可選自包含以下各項之群：CTP19、CR57、CR4098、RVFab8、MabJA、MabJB-1、Mab 57,17C7、2B10、Ab513/VIS513、N297Q-B3B9、Mab2E8、2D22、DMScHuMab、3CH5L1、HMB DV5、HMB DV6、HMB DV8、DB32-6、D88、F38、A48、C88、F108、B48、A68、A100、C58、C78、C68、D98、D188、C128、C98、A11、B11、R17D6、R14B3、R16C9、R14D6、R18G9、R16F7、R17G9、R16E5、來源於4E11A之修飾的抗體、阿巴西普、阿昔單抗、阿達木單抗、阿柏西普、阿法西普、阿來組單抗、曲妥珠單抗、巴利昔單抗、貝伐單抗、貝拉西普、貝妥莫單抗、賽妥珠單抗、西妥昔單抗、達利珠單抗、依庫珠單抗、依法珠單抗、依那西普、吉妥珠單抗、替伊莫單抗、英夫利昔單抗、莫羅單抗-CD3、奧馬珠單抗、帕利珠單抗；帕尼單抗、帕妥珠單抗、蘭尼單抗、列洛西普、利妥昔單抗、托西莫單抗、曲妥珠單抗、紮木單抗、納武單抗、派姆單抗、hA20、AME-I33、IMC-3G3、紮魯木單抗、尼妥珠單抗、馬妥珠單抗、ch*)^、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、莫羅單抗-CD3、OKT4A、替伊莫單抗、吉妥珠單抗、莫維珠單抗、英夫利昔單抗、培非格司亭、CDP-571、依那西普、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MAl培妥莫單抗、Therex、AS1405、那他珠單抗、HuBC-I、IDEC-131、VLA-I；CAT-152；J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B、TRAIL-RImAb、貝伐單抗、奧馬珠單抗、依法珠單抗、MLN-02、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、克立昔單抗、魯昔單抗、BEC2、IMC-ICl 1、DClOl、拉貝珠單抗、阿西莫單抗、依帕珠單抗、他珠單抗、西妥昔單抗、MyelomaCide、LkoCide、ProstaCide、依匹單抗、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、托珠單抗、CS-1008、IDM-I、戈利木單抗、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、美泊利單抗、MORlOl、MORI 02、MOR201、維西珠單抗、HuZAF、伏洛昔單抗、ING-I、MLN2201、達利珠單抗、HCD 122、CDP860、PRO542、C 14、奧戈伏單抗、依決洛單抗、伊瑞西珠單抗、阿特珠單抗、伊匹單抗、莫加利珠單抗、林妥珠單抗、HuIDlO、Lym-1、依法珠單抗、ICM3、加利昔單抗、依庫珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、培克珠單抗、LDP-Ol、huA33、WX-G250、羅珠單抗、奧法木單抗、嵌合KW-2871、hu3S193、huLK26；貝伐珠單抗、瑞希巴庫單抗、chl4.18、3F8、BC8、huHMFGl、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、地諾單抗、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、坎妥珠單抗、HuN901、8H9、chTNT-1/B、巴維昔單抗、huJ591、HeFi-I、Pentacea、阿巴伏單抗、托西莫單抗、優特克單抗、105AD7、GMAl 61、GMA321。
在此實施例之其他態樣中，治療性蛋白質為具有針對以下各者上呈現的抗原決定基之結合親和力的抗體：登革熱病毒、狂犬病病毒、RSV、MPV、流感病毒、茲卡病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、HSV、CMV、MERS、伊波拉病毒、艾司坦-巴爾病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、小兒麻痺病毒、鼻病毒、腺病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、諾瓦克病毒、披衣病毒、α病毒、德國麻疹病毒、HIV病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、人類乳突病毒、多瘤性病毒、間質肺炎病毒、冠狀病毒、VSV及VEE。
在此實施例之另一態樣中，該抗原結合蛋白質之等電點(pI)為7.5-8.5、更佳地約7.8至約8.2、最佳地8.12。
詳言之，抗原結合蛋白質為治療性、預防性或診斷性抗體，如WO2014025546、WO2015122995、WO2015123362、WO2006084006、WO2017027805及WO2017165736中所述，該等參考之內容以全文引用方式併入本文中。更佳地，治療性蛋白質為具有與VIS513 之彼者(Seq ID 1或Seq ID 2) 80%相似性之抗體。在本發明實施例之其他較佳態樣中，治療性蛋白質為具有與狂犬病單株抗體之彼者(Seq ID 3及Seq ID 4)大於80%相似性之抗體。
應極好地理解，任何寄主可用於在本文描述的方法中治療性蛋白質之表現。細胞可為野生型或經基因工程改造以含有重組核酸序列，例如，編碼所關注多肽(例如，抗體)之基因。
在本發明之第二實施例中，用於治療性蛋白質之表現的細胞系係選自包括但不限於以下各項之群：CHO、CHOK1SV GS-KO、GS-CHO、CHO DUX-B11、CHO-K1、BSC-1、NS0骨髓瘤細胞、帶有SV40 (COS)細胞之起源的CV-1、COS-1、COS-7、P3X3Ag8.653、C127、293 EBNA、MSR 293、Colo25、U937、SP2細胞、L細胞、人類胚腎(human embryonic kidney; HEK 293)細胞、嬰兒倉鼠腎(baby hamster kidney; BHK 21)細胞、非洲綠猴腎VERO-76細胞、HELA細胞、VERO、BHK、MDCK、WI38細胞、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0 不內源地產生任何免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓瘤細胞系)、CRL7O3O、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Ag14、骨髓瘤細胞系、融合瘤細胞系、人類肺細胞(W138)、視網膜細胞、人類肝腫瘤系(Hep G2)、及融合瘤細胞。
在第二實施例之其他態樣中，動物或哺乳類寄主細胞包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell; CHO)，諸如CHO-K1 (ATCC CCL-61)、DG44 (Chasin等人., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556；及Kolkekar等人., 1997, Biochem., 36:10901-10909)、SH87細胞CHO-DXB11 (G. Urlaub及L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220。L. H. Graf及L. A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96)、CHO-K1 Tet-On細胞系(Clontech)、命名為ECACC 85050302之CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHO純系13 (GEIMG, Genova, IT)、CHO純系B (GEIMG, Genova, IT)、命名為ECACC 93061607之CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、命名為ECACC 92052129之RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHOK1sv (Edmonds等人., Mol. Biotech. 34:179-190 (2006))、CHO-S (Pichler等人., Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011))、二氫葉酸還原酶陰性CHO細胞(CHO/-DHFR, Urlaub及Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)、及dp12.CHO細胞(美國專利第5,721,121號)；藉由SV40轉形的猴腎CV1細胞(COS細胞，COS-7，ATCC CRL-1651)；人類胚腎細胞(例如，293細胞，或次選殖用於在懸浮液培養中生長的293細胞，Graham等人., 1977, J. Gen. Virol., 36:59)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL-10)；CAP細胞、AGE1.HN細胞、猴腎細胞(CV 1, ATCC CCL-70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587；VERO, ATCC CCL-81)；小鼠塞氏細胞(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251)；人類子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL-2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL-34)；人類肺細胞(W138, ATCC CCL-75)；人類肝腫瘤細胞(HEP-G2, HB 8065)；小鼠乳房瘤細胞(MMT 060562, ATCC CCL-51)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL-1442)；TR1細胞(Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383:44-68)；MCR 5細胞；及FS4細胞。
在第二實施例之第一態樣中，用於治療性蛋白質之表現的細胞系為中國倉鼠卵巢細胞；更特地而言，細胞系為CHOK1SV GS-KO或GS-CHO。
在本發明之第三實施例中，細胞係以分批、進料批式或連續模式；更特地而言，以進料批式模式來培養。應極好地理解，熟習此項技術者可根據可用設施及個體需要來調節本發明中描述的製程。更特地而言，細胞培養製程係以進料批式模式進行，從而提供增進的細胞生長、細胞壽命及增加的蛋白質表現，亦即，提供至少2 gm/L、較佳地在3 gm/L至約6 gm/L範圍內之收穫產率。
在第三實施例之第一態樣中，細胞培養係於燒瓶、生物反應器、槽式生物反應器、袋式生物反應器或拋棄式生物反應器中進行。較佳地，該生物反應器係選自以下各項之群：攪拌槽式生物反應器、氣泡塔生物反應器、氣升生物反應器、流體化床生物反應器或填充床生物反應器；且該生物反應器具有選自以下各項之體積：1L、2L、3L、5L、10L、20L、100L、200L、250L、350L、500L、1000L、1500L、3000L、5000L、10000L、20000L及30,000公升。
在第三實施例之第二態樣中，本發明之細胞培養基及方法可用以增加抗體產率約5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、180%、或200%，最佳地約40%至60%，如歷經半月之時程所量測的。進料批式方法之時間段可為約12至20天；約15至20天或約15至18天。
在本發明之第四實施例中，細胞培養基係選自包含以下一或多者之群：CD CHO、CD OptiCHO™、CD FortiCHO™ (Life Technologies)；Ex-Cell™ CD CHO (Sigma Aldrich)；ProCHO™5 (Lonza)；BalanCD™ CHO Growth A (Irvine Scientific)；CDM4Mab(Hyclone)；Cellvento™ CHO-100 (EMD Millipore)；Cell vento 200 (Merck Millipore)；Cell vento 220 (Merck Millipore)；Actipro (Hyclone)；及其組合。較佳地，細胞培養基係選自Cell Vento 220 (Merck)、ACTIPRO (HyClone/GE)、或Gibco™ Dynamis™培養基(Thermo Fisher)。
細胞培養基進一步補充有葡萄糖及其他進料溶液以便增加細胞生長、細胞壽命、蛋白質表現及產率。在此項技術中應極好地理解，進料溶液可以快速推注或逐漸滴注方式來補充。
利用進料策略在細胞培養基中補充進料溶液包含： 自第4天，以0.05%至0.5%反應器體積、較佳地以0.1%至0.2%反應器體積，利用進料溶液A進行初始進料； 在第6天、第8天、第10天、第11天及第13天，以0.1%至0.5%反應器體積，利用進料溶液A進料； 自第2天至第14天，隔天地或以連續方式以小於8%反應器體積的進料溶液B； 自第2天或第3天開始，以2個連續日為間斷性間隙，以小於8%反應器體積利用進料溶液C進料至少2個連續日，直至第12天或第14天或第15天或第16天或第18天。
自第4天或第5天開始，隔天地或以連續方式或以2個連續日為間斷性間隙，以小於0.5%反應器體積利用進料溶液D進料至少2個連續日，直至第12天或第14天或第15天或第16天或第18天。視情況，進料選自EfficientFeed™ A、EfficientFeed™ B、EfficientFeed™ C、及Dow corning Antifoam C之至少一種進料溶液。
在第四實施例之一較佳態樣中，該進料溶液A、進料溶液B、進料溶液C、進料溶液D係選自包含以下各項之群之一或多者：葡萄糖、Cell Boost™ 5補充物(Hyclone)、EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)、Cell Boost 7a及7b補充物(Hyclone)、3X Actipro (Hyclone/GE)、Cell Vento 220 (1X培養基)、EX-CELL® AdvancedTM CHO進料1、EfficientFeed™ A、EfficientFeed™ B、及EfficientFeed™ C、及其組合。
在第四實施例之一最佳態樣中，該進料溶液A為Cell Boost™ 5補充物(Hyclone)；進料溶液B為EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)；進料溶液C為Cell Boost 7a補充物(Hyclone)；進料溶液D為Cell Boost 7b補充物(Hyclone)。另外，細胞培養基在細胞培養之第3天利用10%「3X Actipro」(Hyclone)補充且在細胞培養之第7天利用8% Cell Vento 220 (1X培養基)補充。應極好地理解，所有進料添加可由熟習此項技術者變化±1%及±1天。
第四實施例之另一態樣包括用於增加細胞生長及壽命以及蛋白質表現之細胞培養條件。在製程期間使用的以下細胞培養條件包括但不限於： 細胞培養基之pH在6.5及7.5範圍內； 培養基之滲透壓度在250-500範圍內；更佳地為400-500 mOsm/kg。 溶解氧在10-60%範圍內；較佳地為20-40%；更佳地為30%。 細胞培養溫度在30℃至38℃範圍內；第一溫度較佳地為36-37℃且視情況，第二溫度較佳地為30-35℃。 葡萄糖濃度維持低於7%；較佳地在4%與5%之間。 在生存力減少至80%時收穫細胞培養物； 其中該等細胞培養條件係以次級代謝物諸如乳酸鹽濃度不大於5 g/L；及氨濃度不大於5 mMol/L之方式維持。
在本發明之第五實施例中，自細胞培養收穫物獲得之治療性蛋白質經受包含以下步驟之純化製程：i)親和力層析、ii)病毒鈍化、iii)離子交換層析、及iv)過濾；其中總體製程回收率大於70%且最終純化治療性蛋白質具有至少90%、較佳地大於98%之純度/單體含量。在最終純化的治療性蛋白質中包括殘餘細胞DNA、殘餘細胞蛋白質、及殘餘蛋白質A之其他雜質係小於1%。
在第五實施例之一般態樣中，本發明之發明人已藉由i)在親和力層析洗滌步驟中使用鹽及ii)在離子交換層析步驟中使用用於溶離的鹽溶液之線性梯度而成功地處理在該蛋白質之下游處理期間治療性蛋白質之聚集問題。在該實施例之較佳態樣中，用於純化之緩衝液之鹽濃度在30 mM-500 mM範圍內，更佳地用於純化之緩衝液之鹽濃度在50 mM-300 mM範圍內。
在第五實施例之第一態樣中，親和力層析係選自包含蛋白質A層析法、蛋白質G層析法、蛋白質L層析法、及其組合中一或多者之群；較佳地，所使用的親和力層析為蛋白質A層析法。
在第五實施例之第二態樣中，用於蛋白質A層析法之樹脂係選自包含以下一或多者之群：Eshmuno A、KanCapATM、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe LX、MabSelect Xtra、rProtein A Sepharose Fast Flow、Poros® MabCapture A、Amsphere™ Protein A JWT203、ProSep HC、ProSep Ultra、及ProSep Ultra Plus；較佳地，蛋白質A親和力層析樹脂為MabSelect SuRe™、Eshmuno A、Kancap A或Poros MabCapture；更佳地，蛋白質A親和力層析樹脂為MabSelect SuRe™。
在第五實施例之第三態樣中，用於蛋白質A層析法之洗滌緩衝液係選自包含以下一或多者之群： 10-30 mM磷酸鹽緩衝液、較佳地20 mM磷酸鹽緩衝液；100-150 mM NaCl、較佳地150 mM NaCl；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2。 10-30 mM磷酸鹽緩衝液、較佳地20 mM磷酸鹽緩衝液；250 mM-1 M NaCl、較佳地1M NaCl；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2。 1-30 mM磷酸鹽緩衝液、較佳地10 mM磷酸鹽緩衝液；100-150 mM NaCl、較佳地125 mM NaCl；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2。
在第五實施例之第四態樣中，用於蛋白質A層析法之溶離緩衝液包含10-30 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 3.0±0.5；及視情況，0.01-0.05% (w/v)聚山梨醇酯80；較佳地，溶離緩衝液包含20 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 3.0±0.2；及視情況，0.025% (w/v)聚山梨醇酯80。
在第五實施例之第五態樣中，自親和力層析步驟獲得之析出液經受病毒鈍化及減少。此項技術中應極好地理解，析出液之病毒鈍化及減少可藉由個別地或組合地選自包含pH處理、清潔劑處理、熱處理、及病毒減少過濾之群的方法實現。在此實施例之較佳態樣中，病毒鈍化係藉由使析出液經受低pH亦即3.3-3.5達50-100分鐘來實現。另外，析出液藉由使其經受中和緩衝液亦即1 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液pH 7.0±0.2來pH中和。此項技術中應極好地理解，任何其他相容的緩衝液可替代地用於析出液之有效pH中和。
在第五實施例之第六態樣中，使病毒鈍化之析出液經受離子交換層析。根據此實施例之態樣之一，離子交換層析為陽離子交換層析法或陰離子交換層析法或其組合；且層析法可以「結合並溶離」模式或「流通」模式來進行。在此實施例之較佳態樣中，陽離子交換層析法及陰離子交換層析法係以任何連續順序來進行。第五實施例之另一態樣在於該層析樹脂視情況為多模態樹脂，如Capto MMC樹脂(GE Healthcare)。
在第五實施例之第七態樣中，使病毒鈍化之析出液經受陽離子交換層析法。在此實施例之較佳態樣中，包括層析樹脂及緩衝液條件之層析參數係以帶正電治療性蛋白質結合至層析樹脂而帶負電分子以流通方式進入之方式選擇，使用鹽梯度使其他治療性蛋白質經受溶離。在此實施例之較佳態樣中，陽離子交換層析樹脂係選自包含以下一或多者之群：基於磺酸酯之群(例如，來自GE Healthcare之MonoS、MiniS、Source 15S及30S、SP SEPHAROSE® Fast Flow、SP SEPHAROSE® High Performance；來自Tosoh之TOYOPEARL® SP-650S及SP-650M；來自BioRad之MACRO-PREP® High S；來自Pall Technologies之Ceramic HyperD S、TRISACRYL® M及LS SP以及Spherodex LS SP)；基於磺乙基之群(例如，來自EMD之FRACTOGEL® SE、來自Applied Biosystems之POROS® S-10及S-20)；基於磺丙基之群(例如，來自Tosoh之TSK Gel SP 5PW及SP-5PW-HR；來自Life Technologies之POROS® HS-20、HS 50、及POROS® XS)；基於磺異丁基之群(例如，來自EMD之FRACTOGEL® EMD S03")；基於硫氧基乙基之群(例如，來自Whatman之SE52、SE53及Express-Ion S)；基於羧甲基之群(例如，來自GE Healthcare之CM SEPHAROSE® Fast Flow；來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell CM；來自BioRad之MACRO-PREP® CM；來自Pall Technologies之Ceramic HyperD CM、TRISACRYL® M CM、TRISACRYL® LS CM；來自Millipore之Matrex CELLUFINE® C500及C200；來自Whatman之CM52、CM32、CM23及Express-Ion C；來自Tosoh之TOYOPEARL® CM-650S、CM-650M及CM-650C)；基於磺酸及羧酸之群(例如，來自J.T. Baker之BAKERBOND® Carboxy-Sulfon)；基於羧酸之群(例如，來自J.T Baker之WP CBX；來自Dow Liquid Separations之DOWEX® MAC-3；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®弱陽離子交換劑、DOWEX®弱陽離子交換劑、及DIAION®弱陽離子交換劑以及來自EMD之FRACTOGEL® EMD COO-)；基於磺酸之群(例如，來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell SP；來自Dow Liquid Separations之DOWEX®細網目強酸陽離子樹脂；來自J.T. Baker之UNOsphere S、WP Sulfonic；來自Sartorius之SARTOBIND® S膜；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®強陽離子交換劑、DOWEX®強陽離子交換劑及DIAION®強陽離子交換劑)；及基於正磷酸鹽之群(例如，來自Whatman之PI 1)。在此實施例之最佳態樣中，用於陽離子交換層析法之樹脂為Fractogel® EMD SO₃⁻、Fractogel® EMD SE Hicap (Merck)、CMM HyperCel™ (Pall Corporation)、Capto S ImpAct。在第五實施例之另一態樣中，用於陽離子交換層析法之製程參數包括但不限於預平衡緩衝液[200 mM 檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0 ± 0.2]；平衡緩衝液[10 mM檸檬酸鹽緩衝液；聚山梨醇酯80(0.025 % (w/v))；pH 6.0 ± 0.2]；適用於中和之低pH；洗滌緩衝液A[10 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0 ± 0.2]；洗滌緩衝液B[20 mM檸檬酸鹽緩衝液；300-500 mM NaCl；pH 6.0 ± 0.2]；CIP緩衝液[0.5M NaOH]；滯留時間[4.00-7.00分鐘]；所使用管柱[XK26]。
在第五實施例之第八態樣中，使病毒鈍化之析出液經受陰離子交換層析法。在此實施例之較佳態樣中，包括層析樹脂及緩衝液條件之層析參數係以所有帶負電雜質與膜結合而治療性蛋白質以流通方式溶離之方式選擇。在此實施例之較佳態樣中，陰離子交換層析樹脂係選自包含以下一或多者之群：DEAE纖維素；來自Applied Biosystems之POROS® PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50；來自Sartorius之SARTOBIND® Q；MonoQ、MiniQ、Source 15Q及30Q、Q、DEAE及ANX SEPHAROSE® Fast Flow；Q SEPHAROSE、Q SEPHAROSE® High Performance、QAE SEPHADEX®及FAST Q SEPHAROSE® (GE Healthcare)；來自J.T. Baker之WP PEI、WP DEAM、WP QUAT；來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell DEAE及Hydrocell QA；來自Biorad之U Osphere Q、MACRO-PREP® DEAE及MACRO-PREP® High Q；Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、TRISACRYL® M及LS DEAE；來自Pall Technologies之Spherodex LS DEAE、QMA SPHEROSIL® LS、QMA SPHEROSIL® M及MUSTANG® Q；DOWEX®細網目強鹼I型及II型陰離子樹脂以及DOWEX® MONOSPHER E 77；來自Dow Liquid Separations之弱鹼陰離子；INTERCEPT® Q膜；來自Millipore之Matrex CELLUFINE® A200、A500、Q500、及Q800；來自EMD之FRACTOGEL® EMD TMAE、FRACTOGEL® EMD DEAE及FRACTOGEL® EMD DMAE；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®弱強陰離子交換劑I型及II型、DOWEX®弱及強陰離子交換劑I型及II型、DIAION®弱及強陰離子交換劑I型及II型、DUOLITE®；來自Tosoh之TSK凝膠Q及DEAE 5PW及5PW-HR、TOYOPEARL® SuperQ-650S、650M及650C、QAE-550C及650S、DEAE-650M及650C；來自Whatman之QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D及Express-Ion Q；更佳地，陰離子交換層析樹脂係選自Sartobind Q (Sartorius)、Eshmuno Q (Merck)、MUSTANG® Q (Pall Corporation)及Poros X (Thermo)。在第五實施例之另一態樣中，用於陰離子交換層析法之製程參數包括但不限於清潔緩衝液[0.5M NaOH]；預平衡緩衝液[200 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0 ± 0.2]；平衡緩衝液[20 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0 ± 0.2；及視情況，0.025%聚山梨醇酯80]；儲存緩衝液[0.1M NaOH]；線性流率[10-500 cm/hr，更特地而言100-150 cm/hr]；所使用管柱[XK26]。
上述實施例之純化製程可進一步包括至少一個另外的層析步驟，其選自包含以下一或多者之群：疏水性相互作用層析法、疏水性電荷誘導層析法、陶瓷羥磷灰石層析法、多模態層析法(Capto MMC及Capto Adhere)、膜層析法(包括InterceptTM (Millipore)、Mustang® (Pall Corporation)及SartobindTM (Sartorius)之Q膜)。
在第五實施例之第九態樣中，藉由使用20 nm過濾器移除病毒粒子。用於病毒粒子之移除的過濾器包括但不限於選自以下各項之群的病毒滯留過濾器：Viresolve PRO (Merck)、Planova 20N (Asahi Kasei)、Bio EXL PALL PEGASUS PRIME、PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences)、及Virosart (Sartorius)、來自Sartorius之Virosart CPV過濾器、來自Millipore之Virosolve、來自Pall之Ultipor DV20或DV50、Planova 20N及50N或來自Asahi之BioEx。此項技術中應極好地理解，具有用於病毒之滯留容量的任何其他過濾器可用於此步驟；較佳地，用於病毒粒子之移除的過濾器係選自Viresolve PRO (Merck)、Bio EXL PALL PEGASUS PRIME、PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences)、及Virosart (Sartorius)。
在第五實施例之第十態樣中，治療性蛋白質經濃縮至所要濃度且緩衝液以配方緩衝液交換。緩衝液係在切向流過濾系統或超流量過濾系統中交換。切向流過濾之其他參數包含選自以下各項之一或多者：使用滲濾緩衝液[25 mM組胺酸緩衝液；75 mM精胺酸緩衝液；50-150 mM NaCl；pH 6.50 ± 0.5]之滲濾；清潔緩衝液[0.5M NaOH]；儲存緩衝液[0.1M NaOH]；使用5-10倍膜體積之平衡；使用10-20個滲濾體積之濃縮及滲濾；使用3-5個膜體積之WFI洗滌；使用0.5-1.0 M NaOH之清潔；儲存[0.1M NaOH]。在此實施例之較佳態樣之一中，切向流過濾係使用30 kDa MWCO膜來進行，該膜選自包含以下一或多者之群：Centramate T系列PES膜(Pall Corporation)、Hydrosart (Sartorius)、及Pelicon 3 (Merck)。
在本發明之第六實施例中，該純化治療性蛋白質係利用醫藥賦形劑配製，其中該配方之滲透壓度在300 mOsm/kg至500 mOsm/kg範圍內且該配方之黏度為小於2.5 mPa-S。
在第六實施例之第一態樣中，治療性蛋白質配方包含至少一種抗原結合蛋白質、至少一種穩定劑、至少一種緩衝劑、至少一種張力劑、及至少一種表面活性劑。視情況，配方包含防腐劑。
在第六實施例之第二態樣中，穩定劑為碳水化合物。穩定劑係選自包含以下一或多者之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露醇、聚葡萄醣、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、棉子糖及其組合；更佳地，穩定劑為蔗糖。在此實施例之又一態樣中，穩定劑包含在約0.1%至約2.5% w/v、較佳地＜1%蔗糖w/v之濃度下的蔗糖。
在第六實施例之第三態樣中，緩衝劑係選自包含以下一或多者之群：組胺酸、精胺酸、甘胺酸、檸檬酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸、HEPES、乙酸鉀、檸檬酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、碳酸氫鈉、Tris鹼、或Tris-HCl、及其組合。較佳地，緩衝劑提供約5.5至7.5、約6.0至7.0、約6.3至約6.8、或約6.5之pH。
在第六實施例之第四態樣中，緩衝劑為組胺酸。在此實施例之較佳態樣中，緩衝劑包含在約5 mM至約150 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約40 mM之濃度下的組胺酸。在此實施例之最佳態樣中，緩衝劑包含在約25 mM之濃度下的組胺酸。
在第六實施例之第五態樣中，緩衝劑為精胺酸。在此實施例之較佳態樣中，緩衝劑包含在約5 mM至約200 mM、約50 mM至約150 mM、約50 mM至約100 mM之濃度下的精胺酸。在此實施例之最佳態樣中，緩衝劑包含在約70 至80 mM之濃度下的精胺酸。
在第六實施例之第六態樣中，張力劑係選自包含以下一或多者之群：氯化鈉、右旋糖、甘油、甘露醇、及氯化鉀。在此實施例之較佳態樣中，張力劑包含氯化鈉且係以約10 mM至約500 mM之濃度；較佳地以約50 mM至約250 mM之濃度；最佳地以約100-145 mM之濃度存在。
在第六實施例之第七態樣中，表面活性劑係以約0.001至約0.2% (w/v)之濃度存在；且係選自包含以下一或多者之群：聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate; SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-、或硬脂醯基-硫代甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-、或硬脂醯基-肌胺酸；亞麻基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂基醯胺基丙基-、椰油基醯胺基丙基-、亞麻基醯胺基丙基-、肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-( palmidopropyl-)、或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如月桂基醯胺基丙基)；肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-、或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰子油脂基-牛磺酸鈉、或甲基油烯基-牛磺酸二鈉；及MONAQUAT®系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，Pluronics、PF68等等)。在此實施例之較佳態樣中，表面活性劑包含聚山梨醇酯80且係以約0.001%至約0.2% w/v之濃度；較佳地以約0.002%至約0.02%；約0.005%至約0.02%之濃度；最佳地以約0.02%之濃度存在。
在第六實施例之第八態樣中，配方包含在約1 mg/L至約150 mg/L、約1 mg/L至約50 mg/L、約20 mg/L至約40 mg/L之濃度下的治療性蛋白質。較佳地，配方包含在約1 mg/L至約50 mg/L之濃度下的治療性蛋白質。
在第六實施例之第九態樣中，配方進一步包含防腐劑，該防腐劑可選自包含苄醇、間甲酚、及苯酚之群。
在本發明之第七實施例中，治療性蛋白質配方包含至少一種治療性蛋白質、蔗糖、精胺酸、組胺酸、氯化鈉、聚山梨醇酯80。較佳地，治療性蛋白質配方包含約1 mg/ml至約50 mg/ml之治療性蛋白質；約20 mM至約mM mg/ml之組胺酸；約50 mM至約100 mM之精胺酸；約0.002%至約0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；約50 mM至約150 mM NaCl；及＜2.5%蔗糖w/v。配方之pH在6.0至約7.0範圍內且配方之滲透壓度在300 mOsm/kg至約450 mOsm/kg範圍內。
在第七實施例之較佳態樣之一中，醫藥配方包含2-80 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
在第七實施例之較佳態樣之一中，醫藥配方包含25 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
在第七實施例之較佳態樣之一中，醫藥配方包含50 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
在第七實施例之較佳態樣之一中，醫藥配方包含2-80 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
在第七實施例之較佳態樣之一中，醫藥配方包含25 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
醫藥配方包含50 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
根據第七實施例之另一態樣，抗體之該醫藥配方可為凍乾配方。
在本發明之第八實施例中，治療性蛋白質之親和力及效力係藉由ELISA或流式細胞術中之一或多者來量測。在第八實施例之較佳態樣中，基於間接ELISA之方法係用於定量治療性蛋白質與特定抗原之結合。在此實施例之較佳態樣中，針對登革熱病毒之所有血清型測試登革熱Mab配方，且測定登革熱mAb之量。將治療性蛋白質之效力作為相對於參考標準之活性%來報告。應極好地理解，任何其他的類似方法可用以證明治療性蛋白質之效力及親和力。
在本發明之第九實施例中，灶點減少中和測試(focus reduction neutralization test; PRNT/FRNT)或有關測試係進行來評價病毒活性藉由治療性蛋白質之中和。在此實施例之較佳態樣中，針對登革熱病毒之所有血清型測試登革熱mAb配方，且EC50值係針對登革熱病毒之計算登革熱病毒之中和的EC50值。應極好地理解，任何其他的類似方法可用以證明治療性蛋白質之中和活性。
在本發明之第十實施例中，基於HPLC之粒徑排阻層析法係用於評定治療性蛋白質配方中聚集體之存在。在此實施例之較佳態樣中，Phenomenex Bio-Sec-S 3000管柱係用於證明登革熱mab配方之聚集體及單體百分比。應極好地理解，任何其他的類似方法可用以評定治療性蛋白質配方中聚集體之存在。
在本發明之第十一實施例中，配方可儲存在適合的容器中。容器可選自瓶子、小瓶、IV袋、可穿戴注射器、推注注射器、注射器、筆、泵、多劑量針注射器、多劑量筆、注射器、西雷特皮下注射器、自動注射器、預填充注射器、或其組合。
構成容器封閉體之至少一種主要包裝組分係選自聚丙烯(polypropylene; PP)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate; PETG)、高密度聚乙烯(high-density polyethylene; HDPE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate; PET)、聚五氟苯乙烯(polypentafluorostyrene; PFS)、聚碳酸酯、聚氯乙烯(polyvinyl chloride; PVC)、聚烯烴、聚環戊烷(CZ.RTM.)、環烯烴共聚物(cyclic olefin copolymer; COC)、及其組合或共聚物。
本文揭示的抗登革熱抗體或抗狂犬病抗體配方可用於(單獨地或與其他藥劑或治療模態組合)治療、防止及或診斷登革熱或狂犬病病毒。例如，組合療法可包括將抗登革熱抗體分子與一或多種另外的治療劑共同配製及/或共同投與，該等另外的治療劑例如抗病毒劑(包括其他抗登革熱抗體)、疫苗(包括登革熱病毒疫苗)、或增進免疫反應之藥劑。在其他實施例中，抗體分子係與其他治療性治療模態組合投與，該等模態諸如靜脈內水合、退燒劑(諸如乙醯胺酚)、或輸血。此等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，因此避免與各種單一療法相關聯的可能的毒性或併發症。
實例：
實例 1 ： 用於治療性蛋白質亦即登革熱(VIS513)單株抗體之細胞培養及表現的上游製程
方案：
以進料批式方式使用下文提及的參數在發酵/上游製程期間進行10 L規模之細胞培養。
登革熱單株抗體係在自Visterra Inc. USA獲得之細胞系「CHO-K1 SV GS-KO」中表現。 · 用於細胞生長及治療性蛋白質亦即登革熱單株抗體之表現的細胞培養基為1X Cellvento™ CHO-220液體培養基。 · 選自包含葡萄糖、Cell Boost™ 5補充物(Hyclone)、EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)、Cell Boost 7a及7b補充物(Hyclone)、3X Actipro (Hyclone)、Cell Vento 220 (3X培養基)、EX-CELL® AdvancedTM CHO進料1之群的進料溶液A、進料溶液B、進料溶液C、進料溶液D係用於補充進料。 · 發酵培養基之pH係維持在6.7至7.5。 · 發酵培養基之滲透壓度係維持在＜490 mOsm/kg。 · 發酵培養基之溶解氧係維持在約20%至約40%。 · 發酵培養基之溫度係維持在36.5±0.5。 · 培養物係在細胞計數降至60%時進行收穫
進料補充係以逐漸滴注方式根據表1來進行：
表1
結果及結論：
在發酵製程期間獲得之活菌落計數及產率如下：
表 2 ：在發酵製程期間獲得之活菌落計數及產率
申請人已發現，藉由使用包含基本培養基、作為進料溶液之濃縮基本培養基、使用進料溶液連同明確進料策略之細胞培養製程，可獲得增進的細胞生長、較低濃度之乳酸鹽及氨，進而有效地維持細胞計數並增加細胞壽命及高產率。在發酵製程中獲得大於4 gm/L之產率。所獲得的收穫物進一步經受純化/下游處理。
實例 2 ：
實例1獲得之細胞培養經收穫且稍後經受根據第1圖的用於登革熱(VIS513)單株抗體之純化的方案
所使用的詳細製程如下：
蛋白質A親和力層析法：
在此步驟中，將目標單株抗體與所收穫上清液中之培養基組分分離。使澄清的上清液透過層析管柱且隨後使用相容溶離緩衝液溶離。
所使用的材料：樹脂 ( 基質 ) ： Mab Select Sure/Eshmuno A (蛋白質A親和力)滯留時間： 4.0-8.0分鐘所使用管柱： XK 26平衡緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 150 mM NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 I 緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 150mM NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 II 緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 1M NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 III 緩衝液： 10 mM磷酸鹽緩衝液+ 125 mM NaCl + 0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.0±0.2。溶離緩衝液： 20 mM檸檬酸鹽緩衝液+ 0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 3.0±0.2。CIP 緩衝液： 0.1 M NaOH
所使用的製程參數：
表 3 ：
1. 低 pH 病毒鈍化 i. 來自蛋白質A親和力層析之析出液經受低pH亦即3.5±0.1達60±10分鐘以鈍化病毒粒子。 ii. 在低pH保持之後，析出液係使用中和緩衝液亦即具有pH 7.0±0.2之1 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中和。 iii. 中和析出液之傳導率係使用具有0.025% (w/v)聚山梨醇酯80之WFI來調整。
2. 陽離子交換層析法
帶正電抗體分子與管柱結合而帶負電分子以流通方式進入。管柱結合之抗體分子係使用鹽梯度來溶離。
所使用的材料： 所使用的樹脂： Fractogel SO3¯/Fractogel SE Hicap (Merck)滯留時間： 4.00-7.00分鐘所使用的管柱： XK 26預平衡： 200 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 6.0±0.2。平衡： 10 mM檸檬酸鹽緩衝液+0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.0±0.2。裝載： 低pH保持中和。洗滌緩衝液 A ： 10 mM檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0±0.2。洗滌緩衝液 B ： 20 mM檸檬酸鹽緩衝液+ 300 mM NaCl，pH 6.0±0.2。CIP 緩衝液： 0.5 M NaOH儲存緩衝液： 0.1 M NaOH
製程參數：
表 4 ：
在梯度期間之餾分收集
表 5 ：
陰離子交換層析法：
所有帶負電雜質與膜結合，而抗體以流通方式進入。
所使用的材料：所使用的膜 / 樹脂： Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q 裝載體積：150mg/mL-1000 mg/mL 所使用的管柱：XK 26 清潔緩衝液：0.5 M NaOH 預平衡緩衝液：200毫米檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0±0.2。 平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 6.0±0.2；及視情況，0.025% PS-80 pH 6.0±0.2 儲存緩衝液：0.1 M NaOH
製程參數：
表6：
3. 奈米過濾：
20 nm奈米過濾器亦即Viresolve PRO (Merck)係用於移除可在治療性蛋白質中獲得的任何病毒粒子。
4. 切向流過濾 / 超流量過濾：
將抗體濃縮至所要濃度，且在三種配方緩衝液之一中交換緩衝液。
所使用的材料：配方緩衝液： · 緩衝液1：25 mM組胺酸緩衝液+ 75 mM精胺酸緩衝液+ 75 mM NaCl，pH 6.50±0.25； · 緩衝液2：25 mM組胺酸、75 mM精胺酸、101 mM NaCl； · 緩衝液3：25 mm組胺酸、75 mM精胺酸、75 mM至101 mM NaCl、聚山梨醇酯-80 0.002% w/v ·清潔緩衝液： 0.5 M NaOH 儲存緩衝液： 0.1 M NaOH 所使用的膜： PALL Centramate T 系列， PES 膜 MWCO ： 30 kDa
製程參數：
表 7
無菌過濾
穩定劑係添加至抗體溶液且經由0.2 µ過濾器無菌過濾。
結果：
各種步驟之逐階段回收係用於純化製程。
表8：
總體製程回收率實驗測得約80%且總體純度實驗測得＞99%。
表9：雜質資料
表 10 ：逐批回收率及純度
實例3：
純化登革熱(VIS513)單株抗體係如下配製：
添加賦形劑，亦即精胺酸、組胺酸、NaCl、蔗糖、及聚山梨醇酯-80，且使用磁性攪拌器在50-60 RPM下充分混合以形成賦形劑之混合物。此混合物隨後逐漸地利用攪拌速度50-60 RPM添加至登革熱mAb TFF收穫物。檢查pH (pH 6.5)且若需要則藉由組胺酸-精胺酸緩衝液調整。最終配方經由0.2 µM過濾器過濾且填充至最終容器中。
最終配方中每一組分之濃度如下：
表11：
進一步測試該些配方之純度、穩定性、功效及效力歷時9個月。
實例4：
研究VIS513登革熱抗體配方中蔗糖之存在的效應以用於藉由對DV1之EDIII蛋白質之ELISA檢定來測試效力。針對溫度2-8℃、25℃、及40℃進行配方研究。
結果：
1. 不具有蔗糖之VIS513登革熱抗體配方
表12：
2. 具有蔗糖之VIS513登革熱抗體配方
表13：
參考標準配方組合物：
結論：添加0.5% w/v相較於不具有蔗糖之對應取樣點而言改進穩定性。
實例 5 ：
VIS513抗體配方在40℃下儲存20天且稍後藉由ELISA測試評估VIS513之效力。在40℃下研究增加的蔗糖強度對VIS513抗體配方之效應，其中評估0.1、0.2及0.5%之蔗糖濃度。
結果：
表14：
表15：
表16：
表17
參考標準配方組合物：
結論：對包含0.5%蔗糖之配方觀察到最高穩定性。
實例 6 ：
對在以下條件下儲存的登革熱(VIS513) Mab配方之純度、穩定性、功效及效力之分析測試 · 2-8℃下達0個月、3個月、6個月、及9個月之時期。 · 25℃下達0天及30天 · 40℃下達0天、7天、14天、28天、35天、及42天之時期。
6.1：藉由間接ELISA測試VIS513抗體配方之效力。
基於間接ELISA方法用於定量登革熱Mab (VIS513)與DV1抗原之EDIII蛋白質之結合。將EDIII蛋白質固定至板。藉由洗滌移除未結合抗原。接著，添加步驟標準及測試樣本，使其結合至抗原。為測定結合Dv-Mab之量，對Dv-Mab (人免疫球蛋白Fc片段)特異的小鼠抗人類IgG Fc-HRP係用於識別Dv-Mab之存在。該檢定係利用TMB Microwell過氧化物酶基質系統來研發，該系統以在450 nm下形成的顏色之量來定量結合之程度。資料分析軟體使用四參數曲線擬合模型針對每一樣本產生結合曲線，且藉由計算相對效力將測試樣本之結合曲線與標準曲線進行比較。測試樣本之效力係報告為相對於參考標準之活性% (相對效力乘以100)。
結果：
表18：藉由間接ELISA對在2-8℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) Mab效力(%)
表19：藉由間接ELISA對在25℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) Mab效力(%)
表20：藉由間接ELISA對在40℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) Mab效力(%)
登革熱(VIS513) mAb配方不展示結合親和力之任何時間依賴性損失。
6.2：測定EC50之PRNT檢定
該檢定涉及將連續地稀釋抗體與病毒預混合以允許抗體結合，抗體中和，隨後將混合物轉移至Vero細胞單層，上覆以黏性培養基，孵化(約3-7天，取決於病毒血清型)以允許有限的病毒複製及傳播，繼之以斑塊之偵測。中和係藉由斑塊形成之減少來俘獲。穩固偵測係利用免疫染色方法，使用小鼠4G2抗登革熱抗體及HRP標記的山羊抗小鼠抗體與過氧化物酶基質來達成。
針對登革熱病毒之所有四種血清型亦即DV1、DV2、DV3及DV4來測試登革熱(VIS513) Mab配方樣本。計算針對登革熱病毒之中和的EC50值。EC50值表示登革熱病毒之有效中和所需的50%有效濃度，且EC50值係由存在於病毒對照孔中的斑塊數量及添加mab-病毒孵化樣本之孔中之斑塊數量來計算。
結果：
表21：藉由PRNT檢定對在2-8℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) mAb EC50 (ng/ml)值。
表22：藉由PRNT檢定對在25℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) Mab EC50 (ng/ml)值。
表23：藉由PRNT檢定對在40℃下儲存的配方測定登革熱(VIS513) Mab EC50 (ng/ml)值。
登革熱(VIS513) mab配方在2-80℃及25℃下不展示病毒中和功效之任何時間依賴性損失。即使保持在40℃下VIS513配方不丟失其中和登革熱病毒之能力。
6.3：聚集及純度分析
基於HPLC之粒徑排阻層析法(HPLC-based size exclusion chromatography; HPLC-SEC)係用於評定DV Mab之整體及最終配方中之聚集體。在此方法中，phenomenex Bio-Sec-S 3000管柱係用於藉由注射約50 ug之總抗體且在1 ml/分鐘之流速下運行35分鐘來證明登革熱(VIS513) Mab之聚集體及單體百分比。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 6.5係用作移動相。
結果：SEC-HPLC (接受範圍為NLT 90%)
表24：在2-8℃下儲存的配方之SEC-HPLC分析
表25：在25℃下儲存的配方之SEC-HPLC分析
表26：在40℃下儲存的配方之SEC-HPLC分析
登革熱(VIS513) mAb配方不展示任何顯著的時間依賴性聚集；且純度/單體含量實驗測得為＞98%。
實例 7 ：
配方之表面活性劑濃度之效應：
藉由亞可見粒子分析評估表面活性劑濃度之效應。製備改變聚山梨醇酯-80強度之配方且針對亞可見粒子分析來分析該等配方。
表27
結論：
在含有0.005% w/v聚山梨醇酯-80之配方中，觀察最少亞可見粒子。取決於劑量，若配方需要稀釋，則聚山梨醇酯80強度最終為0.02% w/V，其中邊限為4倍。
實例8：對所使用的穩定劑之最小濃度之測定的研究
所需要的最小緩衝液強度(10-30 mM)參考自可獲得文獻。為得出最小精胺酸值(用作助溶劑及降黏度劑)，將Mab樣本在生理鹽水中緩衝液交換且逐漸地添加精胺酸儲備溶液(300 mM)。溶液之聚集係藉由量測350 nm處之OD來監視。具有75 mM精胺酸之鹽水得到最低OD，因此75 mM精胺酸為最終值。
實例 8
登革熱(VIS513)抗體配方之黏度研究
在基於微晶片之黏度計型號：microVISCTM (製造商：RheoSense, CA USA)上按照儀器手冊中提及的程序量測DV mAb樣本之黏度。
表28
結論：
在2-8℃下儲存90天之mAb配方中以及在樣本保持在25℃下達1個月時未觀察到黏度之時間依賴性增加，此主要係歸因於賦形劑-精胺酸75 mM。實驗測得吾等配方之黏度為1.1至1.2 mPa-S/cP，其低於具有在11-50 mPa-S/cP之間的黏度之其他市售配方
實例 9 ： 對登革熱(VIS513) mAb純化製程之病毒尖峰研究
針對實際製造製程執行病毒驗證，以測試在單株抗體之製造製程中藉由病毒過濾進行病毒移除之有效性。
鼠類白血病毒(MuLV)及小鼠之小病毒(MMV/MVM)係用作模型生物體。本發明之發明人將其發明的純化製程之能力與一般的已充分確立的單株抗體純化方法之彼能力進行比較。
一般的已充分確立的單株抗體純化方法由以下各項組成：蛋白質A親和力層析法(GE Resin)；低pH處理；Sartobind Q層析法(陰離子交換膜，Sartorius，單一用途)；Sartobind苯基層析法(膜層析法，Sartorius，單一用途)；Viresolve Pro過濾(奈米過濾，Merck)。
表29：
結果： SIIPL純化製程在病毒清除率方面為高效的，根據ICH指導達成總LRV。(標準製程LRV為12.64，而SIIPL發明製程為23.74)發現使用吾等之發明製程的登革熱抗體純化適合於人類臨床試驗而無任何病毒風險。
實例10：用於治療性蛋白質亦即狂犬病單株抗體之細胞培養及表現的上游製程
方案：
以進料批式方式使用下文提及的參數在發酵/上游製程期間進行2 L規模之細胞培養。 · 狂犬病單株抗體係在細胞系「GS-CHO」中表現。 · 用於治療性蛋白質亦即狂犬病單株抗體之細胞生長及表現之細胞培養基為「1X Cellvento™ CHO-220液體培養基」或「Actipro 1x (Hyclone)」 · 選自包含葡萄糖、Cell Boost™ 5補充物(Hyclone)、EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)、Cell Boost 7a及7b補充物(Hyclone)、3X Actipro (Hyclone)、Cell Vento 220 (1X medium)、EX-CELL® AdvancedTM CHO進料之群的進料溶液A、進料溶液B、進料溶液C、進料溶液D係用於補充進料。 · 發酵培養基之pH係維持在6.5至7.5。 · 發酵培養基之滲透壓度係維持在270-450 mOsm/kg之間。 · 發酵培養基之溶解氧係維持在約20%至約60%。 · 發酵培養基之溫度係維持在36.5±1。
進料補充係以逐漸滴注方式根據下表來進行：
表30：
注意：所有進料溶液可變化±1%及±1天。
細胞培養物係在OD降至60%時進行收穫
結果及結論：
發酵製程獲得3-5 gm/L之產率。所獲得的收穫物進一步經受純化/下游處理。
實例 11 ：
根據實例9獲得之細胞培養經收穫且稍後經受根據第1圖的用於狂犬病單株抗體之純化的方案。
所使用的詳細製程如下：
蛋白質A親和力層析法：
在此步驟中，將目標單株抗體與所收穫上清液中之培養基組分分離。使澄清的上清液透過層析管柱且隨後使用相容溶離緩衝液溶離。
所使用的材料：樹脂 ( 基質 ) ： Mab Select Sure/Eshmuno A (蛋白質A親和力)滯留時間： 4.0-8.0分鐘所使用的管柱： XK 26平衡緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 150 mM NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 I 緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 150mM NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 II 緩衝液： 20 mM磷酸鹽緩衝液+ 1M NaCl + 0.05% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 7.0±0.2。洗滌 III 緩衝液： 10 mM磷酸鹽緩衝液+ 125 mM NaCl + 0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.0±0.2。溶離緩衝液： 20 mM檸檬酸鹽緩衝液+ 0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 3.0±0.2。CIP 緩衝液： 0.1 M NaOH
所使用的製程參數：
表 31
1. 低 pH 病毒鈍化 i. 來自蛋白質A親和力層析之析出液經受低pH亦即3.5±0.1達60±10分鐘以鈍化病毒粒子。 ii. 在低pH保持之後，析出液係使用中和緩衝液亦即具有pH 7.0±0.2之1 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中和。隨後，中和溶液係使用0.8/0.45 µ或0.8/0.2 µ過濾。 iii. 中和析出液之傳導率係使用具有0.025% (w/v)聚山梨醇酯80之WFI來調整。
2. 陽離子交換層析法
帶正電抗體分子與管柱結合而帶負電分子以流通方式進入。管柱結合之抗體分子係使用鹽梯度來溶離。
所使用的材料： 所使用的樹脂： Fractogel SO3¯/Fractogel SE Hicap (Merck)滯留時間： 4.00-7.00分鐘所使用的管柱： XK 26預平衡： 200 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 6.0±0.2。平衡： 10 mM檸檬酸鹽緩衝液+0.025% (w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.0±0.2。裝載： 低pH保持中和。洗滌緩衝液 A ： 10 mM檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0±0.2。洗滌緩衝液 B ： 20 mM檸檬酸鹽緩衝液+ 300 mM NaCl，pH 6.0±0.2。CIP 緩衝液： 0.5 M NaOH儲存緩衝液： 20%乙醇+150 mM NaCl
表 32 ：製程參數：
表 33 ：在梯度期間之餾分收集
陰離子交換層析法：
所有帶負電雜質與膜結合，而抗體以流通方式進入。
所使用的材料：所使用的膜 / 樹脂： Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q 裝載體積：150mg/mL-1000 mg/mL 所使用的管柱：XK 26 清潔緩衝液：0.5 M NaOH 預平衡緩衝液：200毫米檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0±0.2。 平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 6.0±0.2；及視情況，0.025% PS-80 pH 6.0±0.2儲存緩衝液： 20%乙醇+150 mM NaCl或0.1 M NaOH
表34：製程參數
3. 奈米過濾：
20 nm奈米過濾器亦即Viresolve PRO (Merck)係用於移除可在治療性蛋白質中獲得的任何病毒粒子。
4. 切向流過濾 / 超流量過濾：
將抗體濃縮至所要濃度，且在三種配方緩衝液之一中交換緩衝液。
所使用的材料：配方緩衝液： · 緩衝液1：25 mM組胺酸緩衝液+ 75 mM精胺酸緩衝液+ 75 mM NaCl，pH 6.50±0.25； · 緩衝液2：25 mM組胺酸、75 mM精胺酸、101 mM NaCl； · 緩衝液3：25 mm組胺酸、75 mM精胺酸、75 mM至101 mM NaCl、聚山梨醇酯-80 0.002% w/v · 清潔緩衝液：0.5 M NaOH儲存緩衝液： 20%乙醇+150 mM NaCl或0.1 M NaOH所使用的膜： PALL Centramate T系列，PES膜MWCO：30 kDa
表 35 ：製程參數
無菌過濾
穩定劑係添加至抗體溶液且經由0.2 µ過濾器無菌過濾。
結果：
表36：各種步驟之逐階段回收係用於純化製程。
總體製程回收率實驗測得為＞ 80%。
表37：雜質資料
表 38 ：逐批回收率及純度
純化之後狂犬病mab之總體純度實驗測得為＞99%且總回收率實驗測得為＞80%。
實例12：
根據第2圖中給出的流程圖來配製純化狂犬病單株抗體。
添加賦形劑，亦即精胺酸、組胺酸、NaCl、蔗糖、及聚山梨醇酯-80，且使用磁性攪拌器在50-60 RPM下充分混合以形成賦形劑之混合物。此混合物隨後逐漸地利用攪拌速度50-60 RPM添加至登革熱mAb TFF收穫物。檢查pH (pH 6.5)且若需要則藉由組胺酸-精胺酸緩衝液調整。最終配方經由0.2 µM過濾器過濾且填充至最終容器中。
最終配方中每一組分之濃度如下：
表39：
進一步測試該些配方之純度、穩定性、功效及效力歷時9個月。
實例13：在2-8、25及40℃下儲存達0個月、1個月、3個月、及6個月之時期的情況下對狂犬病Mab配方之純度及穩定性之分析測試。
13.1 聚集及純度分析
基於HPLC之粒徑排阻層析法(HPLC-based size exclusion chromatography; HPLC-SEC)係用於評定DV Mab之整體及最終配方中之聚集體。在此方法中，phenomenex Bio-Sec-S 3000管柱係用於藉由注射約50 ug之總抗體且在1 ml/分鐘之流速下運行35分鐘來證明狂犬病Mab之聚集體及單體百分比。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 6.5係用作移動相。
結果：
表40：SE-HPLC (%)結果
狂犬病mAb配方不展示任何時間依賴性聚集且純度/單體含量實驗測得為＞99%。
13.2 SDS Page分析第1批——在2-8℃下之測試樣本
表41：
在25℃下之測試樣本
結論： 狂犬病mAb配方不展示聚集之任何顯著的時間依賴性改變及分子量之改變。因此，發現配方在2-8℃、25℃、及40℃下為穩定的。
無
1. 第1圖：流程圖——用於單株抗體之純化的下游處理
2. 第2圖：流程圖——用於單株抗體之配方製程
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (89)

  1. 一種以高產率及最少聚集來製造醫藥抗原結合蛋白質之方法，其包含以下步驟： a) 以大規模培養哺乳類細胞，該等哺乳類細胞在一細胞培養生產培養基中表現抗原結合蛋白質，其中該製程有效地維持細胞計數且產生至少2 gm/L之產率；b) 純化來自步驟(a)中獲得之所收穫上清液之抗原結合蛋白質，其中該製程產生至少80%之回收率、至少99%之純度；c) 穩定配製，其中滲透壓度在300-400 mOsm/kg範圍內且黏度小於2.5 mPa-S。
  2. 如請求項1所述之方法，其包含以下步驟：以大規模培養哺乳類細胞，該等哺乳類細胞在一細胞培養生產培養基中表現抗體；其中該細胞培養製程包括使用基本培養基、使用濃縮基本培養基作為進料溶液、使用進料溶液連同一明確進料策略，產生增進的細胞生長、維持較低濃度之乳酸鹽及氨，從而有效地維持細胞計數進而增加細胞壽命及高產率。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該細胞培養基包含至少一種選自包含以下各項之群的培養基：Cell Vento 220 (Merck)、ACTIPRO (HyClone/GE)、Gibco™ Dynamis™培養基(Thermo Fisher)。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之方法，其中該細胞培養基在該製程期間至少補充一次一或多種其他養分。
  5. 如請求項1-3中任一項所述之方法，其中該細胞培養生產培養基係以一包含補充之時程來補充，該補充為連續的、每日地、每隔一天地、每隔兩天地及其組合。
  6. 如請求項4所述之方法，其中該細胞培養生產培養基係以進料溶液來補充，該進料溶液包含至少一種選自包含以下各項之群的培養基：葡萄糖(Glucose)、Cell Boost™ 5補充物(Hyclone)、EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)、Cell Boost 7a及7b補充物(Hyclone)、3X Actipro培養基、Cell Vento 220 (3X培養基)、EX-CELL® AdvancedTM CHO進料1、EfficientFeed™ A、EfficientFeed™ B、及EfficientFeed™ C、及其組合。
  7. 如請求項1所述之方法，其中該細胞計數在10 x 106 -20 x 106 個細胞/ml範圍內。
  8. 如請求項1所述之方法，其中該細胞培養基具有在250-500 mOsm/kg範圍內之滲透壓度；在6.5-7.5範圍內之pH；溶解氧係維持在10-60%之範圍內；細胞培養溫度在30℃至38℃範圍內；第一溫度較佳地為36-37℃，且視情況，第二溫度較佳地為30-35℃；葡萄糖濃度係維持低於7%，較佳地在4%與5%之間；在生存力降低至80%時收穫該細胞培養物；其中該等細胞培養條件係以次級代謝物諸如乳酸鹽濃度不大於5 g/L，且氨濃度不大於5 mmol/L之一方式來維持。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該發酵培養基之該滲透壓度為400-500 mOsm/kg。
  10. 如請求項1所述之方法，其中該發酵培養基之該溶解氧係維持在20-40%之範圍內。
  11. 如請求項1所述之方法，其中抗原結合蛋白質係選自包含以下各項之群：人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體、雙特異性抗體、多價抗體、多特異性抗體、抗原結合蛋白質片段、多株抗體、單株抗體、雙功能抗體、奈米抗體、一價雙特異性異源共軛物(monovalent, bispecific, heteroconjugate)、多特異性自體抗體(multispecific, autoantibodies)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab)′2片段、藉由一Fab表現文庫產生的片段、抗遺傳型(抗Id)抗體、抗原決定基結合片段及含CDR片段及其組合。
  12. 如請求項1所述之方法，其中該細胞系係選自由以下各項組成之群：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、GS-CHO、CHOK1SV GS-KO、CHO DUX-B11、CHO-K1、BSC-1、NS0骨髓瘤細胞、帶有SV40 (COS)細胞之起源的CV-1、COS-1、COS-7、P3X3Ag8.653、SP2細胞、L細胞、人類胚腎(HEK 293)細胞、嬰兒倉鼠腎(BHK 21)細胞、非洲綠猴腎VERO-76細胞、HELA細胞、人類肺細胞(W138)、視網膜細胞、及人類肝腫瘤系(Hep G2)、VERO、BHK、MDCK、WI38細胞、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0不內源地產生任何免疫球蛋白鏈之一鼠類骨髓瘤細胞系)、CRL7O3O、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Ag14、一骨髓瘤細胞系、一融合瘤細胞系、人類肺細胞(W138)、視網膜細胞、人類肝腫瘤系(Hep G2)、CHO—K1 (ATCC CCL-61)、DG44 (Chasin等人, 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556；及Kolkekar等人, 1997, Biochem., 36:10901-10909)、SH87細胞CHO-DXB11 (G. Urlaub及L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220；L. H. Graf, and L. A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96)、CHO—K1 Tet-On細胞系(Clontech)、命名為ECACC 85050302之CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHO純系13 (GEIMG, Genova, IT)、CHO純系B (GEIMG, Genova, IT)、命名為ECACC 93061607之CHO—K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、命名為ECACC 92052129之RR—CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHOK1sv (Edmonds等人, Mol. Biotech. 34:179-190 (2006))、CHO—S (Pichler等人, Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011))、二氫葉酸還原酶陰性CHO細胞(CHO/-DHFR, Urlaub及Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)、及dp12.CHO細胞(美國專利第5,721,121號)；藉由SV40轉形的猴腎CV1細胞(COS細胞，COS-7，ATCC CRL-1651)；人類胚腎細胞(例如，293細胞，或次選殖用於在懸浮液培養中生長的293細胞，Graham等人, 1977, J. Gen. Virol., 36:59)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL-10)；CAP細胞、AGE1.HN細胞、猴腎細胞(CV 1, ATCC CCL-70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587；VERO, ATCC CCL-81)；小鼠塞氏細胞(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251)；人類子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL-2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL-34)；人類肺細胞(W138, ATCC CCL-75)；人類肝腫瘤細胞(HEP-G2, HB 8065)；小鼠乳房瘤細胞(MMT 060562, ATCC CCL-51)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL-1442)；TR1細胞(Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383:44-68)；MCR 5細胞；及FS4細胞及融合瘤細胞。
  13. 如請求項1所述之方法，其中該細胞系為CHO-K1 SV GS-KO。
  14. 如請求項1所述之方法，其中該細胞系為GS-CHO。
  15. 如請求項1所述之方法，該細胞係以一分批、進料批式、連續模式、灌注模式；更特地而言，以一進料批式模式來培養。
  16. 如請求項1所述之方法，其中用於純化的該等緩衝液之鹽濃度在30 mM-500 mM範圍內。
  17. 如請求項16所述之方法，其中用於純化的該等緩衝液之鹽濃度在50 mM-300 mM範圍內。
  18. 如請求項1所述之方法，其中該等純化步驟包含蛋白質A親和力層析法、陽離子交換層析法及陰離子交換層析法。
  19. 如請求項1所述之方法，其中該等純化步驟包含親和力層析法、低pH病毒鈍化、陽離子交換層析法、陰離子交換層析法、奈米過濾、切向流過濾/超濾；以一連續方式進行。
  20. 如請求項1所述之方法，其中該等純化步驟包含親和力層析法、低pH病毒鈍化、陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、奈米過濾、切向流過濾/超濾；以一連續方式進行。
  21. 如請求項1所述之方法，其中該親和力層析基質係選自蛋白質A、蛋白質G及蛋白質L，較佳為蛋白質A。
  22. 如請求項1所述之方法，其進一步包含選自包含以下一或多者之群的另外的層析法步驟：疏水性相互作用層析法、疏水性電荷誘導層析法、陶瓷羥磷灰石層析法、多模態層析法(Capto MMC及Capto Adhere)、膜層析法(Q膜，包括InterceptTM (Millipore)、Mustang® (Pall Corporation)及SartobindTM (Sartorius))。
  23. 如請求項21所述之方法，其中該蛋白質A層析法包含一或多種選自包含以下各項之群的樹脂：Eshmuno A、KanCapATM 、MabSelect SuRe™、MabSelect SuRe LX、MabSelect Xtra、rProtein A Sepharose Fast Flow、Poros® MabCapture A、Amsphere™ Protein A JWT203、ProSep HC、ProSep Ultra、及ProSep Ultra Plus；較佳地，該蛋白質A親和力層析樹脂為MabSelect SuRe™. Eshmuno A, Kancap A或Poros MabCapture。
  24. 如請求項21所述之方法，其中該蛋白質A層析法包含 a) 平衡緩衝液：20 mM磷酸鹽緩衝液；100-150 mM NaCl；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2b) 裝載：澄清收穫物c) 洗滌I緩衝液：20 mM磷酸鹽緩衝液；100-150 mM NaCl，更特地而言150 mM；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2d) 洗滌II緩衝液：20 mM磷酸鹽緩衝液；250 mM-1 M NaCl，更特地而言1 M；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2e) 洗滌III緩衝液：10 mM磷酸鹽緩衝液；100-150 mM NaCl，更特地而言125 mM；0.05%聚山梨醇酯80；pH 7.0±0.2f) 溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 3.0±0.2；且視情況，0.025% (w/v)聚山梨醇酯80g) CIP緩衝液：0.1M NaOHh) 滯留時間：4.00-8.00分鐘 i) 所使用的管柱：XK26j) 線性流率為10-500 cm/hr，更特地而言100-150 cm/hr。
  25. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中來自蛋白質A層析法之析出液之病毒鈍化係藉由在pH 3.3-3.5下保持該析出液達50-100分鐘之一時期來完成。
  26. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中該陽離子交換層析法包含選自包含以下一或多者之群的樹脂：基於磺酸酯之群(例如，來自GE Healthcare之MonoS、MiniS、Source 15S及30S、SP SEPHAROSE® Fast Flow、SP SEPHAROSE® High Performance；來自Tosoh之TOYOPEARL® SP-650S及SP-650M；來自BioRad之MACRO-PREP® High S；來自Pall Technologies之Ceramic HyperD S、TRISACRYL® M及LS SP以及Spherodex LS SP)；基於磺乙基之群(例如，來自EMD之FRACTOGEL® SE、來自Applied Biosystems之POROS® S-10及S-20)；基於磺丙基之群(例如，來自Tosoh之TSK Gel SP 5PW及SP-5PW-HR；來自Life Technologies之POROS® HS-20、HS 50、及POROS® XS)；基於磺異丁基之群(例如，來自EMD之FRACTOGEL® EMD S03")；基於硫氧基乙基之群(例如，來自Whatman之SE52、SE53及Express-Ion S)；基於羧甲基之群(例如，來自GE Healthcare之CM SEPHAROSE® Fast Flow；來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell CM；來自BioRad之MACRO-PREP® CM；來自Pall Technologies之Ceramic HyperD CM、TRISACRYL® M CM、TRISACRYL® LS CM；來自Millipore之Matrex CELLUFINE® C500及C200；來自Whatman之CM52、CM32、CM23及Express-Ion C；來自Tosoh之TOYOPEARL® CM-650S、CM-650M及CM-650C)；基於磺酸及羧酸之群(例如，來自J.T. Baker之BAKERBOND® Carboxy-Sulfon)；基於羧酸之群(例如，來自J.T Baker之WP CBX；來自Dow Liquid Separations之DOWEX® MAC-3；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®弱陽離子交換劑、DOWEX®弱陽離子交換劑、及DIAION®弱陽離子交換劑以及來自EMD之FRACTOGEL® EMD COO-)；基於磺酸之群(例如，來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell SP；來自Dow Liquid Separations之DOWEX®細網目強酸陽離子樹脂；來自J.T. Baker之UNOsphere S、WP Sulfonic；來自Sartorius之SARTOBIND® S膜；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®強陽離子交換劑、DOWEX®強陽離子交換劑及DIAION®強陽離子交換劑)；及基於正磷酸鹽之群(例如，來自Whatman之PI 1)；用於本發明之較佳陽離子交換層析法樹脂為Fractogel® EMD SO3 - 、Fractogel® EMD SE Hicap (Merck)、CMM HyperCel™ (Pall Corporation)、Capto S ImpAct(GE)。
  27. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中該陽離子交換層析法包含 a) 預平衡緩衝液：200 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0±0.2 b) 平衡緩衝液：10 mM檸檬酸鹽緩衝液；0.025% (w/v)聚山梨醇酯80；pH 6.0±0.2c) 洗滌緩衝液A：10 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0±0.2 d) 洗滌緩衝液B：20 mM檸檬酸鹽緩衝液；300-500 mM NaCl；pH 6.0±0.2 e) CIP緩衝液：0.5 M NaOH f) 滯留時間：4.00-7.00分鐘 g) 所使用的管柱：XK26。
  28. 如請求項19及20中任一項所述之方法，該陰離子交換層析法包含選自包含以下一或多者之群的樹脂：DEAE纖維素；來自Applied Biosystems之POROS® PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50；來自Sartorius之SARTOBIND® Q；MonoQ、MiniQ、Source 15Q及30Q、Q、DEAE及ANX SEPHAROSE® Fast Flow；Q SEPHAROSE(GE)、Q SEPHAROSE® High Performance、QAE SEPHADEX®及FAST Q SEPHAROSE® (GE Healthcare)；來自J.T. Baker之WP PEI、WP DEAM、WP QUAT；來自Biochrom Labs Inc.之Hydrocell DEAE及Hydrocell QA；來自Biorad之U Osphere Q、MACRO-PREP® DEAE及MACRO-PREP® High Q；Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、TRISACRYL® M及LS DEAE；來自Pall Technologies之Spherodex LS DEAE、QMA SPHEROSIL® LS、QMA SPHEROSIL® M及MUSTANG® Q；DOWEX®細網目強鹼I型及II型陰離子樹脂以及DOWEX® MONOSPHER E 77；來自Dow Liquid Separations之弱鹼陰離子；INTERCEPT® Q膜；來自Millipore之Matrex CELLUFINE® A200、A500、Q500、及Q800；來自EMD之FRACTOGEL® EMD TMAE、FRACTOGEL® EMD DEAE及FRACTOGEL® EMD DMAE；來自Sigma-Aldrich之AMBERLITE®弱強陰離子交換劑I型及II型、DOWEX®弱及強陰離子交換劑I型及II型、DIAION®弱及強陰離子交換劑I型及II型、DUOLITE®；來自Tosoh之TSK凝膠Q及DEAE 5PW及5PW-HR、TOYOPEARL® SuperQ-650S、650M及650C、QAE-550C及650S、DEAE-650M及650C；來自Whatman之QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D及Express-Ion Q；更佳地，陰離子交換層析樹脂為Sartobind Q (Sartorius)。
  29. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中該陰離子交換層析法包含 a) 清潔緩衝液：0.5 M NaOH b) 預平衡緩衝液：200 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0±0.2 c) 平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鹽緩衝液；pH 6.0±0.2；及視情況，0.025%聚山梨醇酯80 d) 儲存緩衝液：0.1 M NaOH e) 線性流率為10-500 cm/hr，更特地而言100-150 cm/hrf) 所使用的管柱：XK26。
  30. 如請求項19及20中任一項所述之方法，該陰離子交換層析法為「流通及洗滌模式」或「結合及溶離模式」。
  31. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中病毒粒子之移除係藉由奈米過濾，使用選自包含以下一或多者之群的病毒滯留過濾器來完成：Viresolve PRO (Merck)、Planova 20N (Asahi Kasei)、Bio EXL PALL PEGASUS PRIME、PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences)、及Virosart (Sartorius)、來自Sartorius之Virosart CPV過濾器、來自Millipore之Virosolve、來自Pall之Ultipor DV20或DV50、Planova 20N及50N或來自Asahi之BioEx。
  32. 如請求項19及20中任一項所述之方法，其中該抗原結合蛋白質係使用切向流過濾(TFF)來濃縮。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該TFF係使用30 kDa膜來進行，該30 kDa膜係選自包含以下一或多者之群：Centramate T系列PES膜(Pall Corporation)、Hydrosart (Sartorius)、及Pelicon 3 (Merck)，較佳地使用Centramate T系列PES膜 (Pall Corporation)來進行。
  34. 如請求項32所述之方法，其中該切向流過濾製程包含 a) 使用滲濾緩衝液之滲濾：25 mM組胺酸緩衝液；75 mM精胺酸緩衝液；50-150 mM NaCl；pH 6.50±0.5b) 清潔緩衝液：0.5 M NaOH c) 儲存緩衝液：0.1 M NaOH d) 使用5-10 倍膜體積之平衡e) 使用10 – 20個滲濾體積之濃度及滲濾f) 使用3-5個膜體積之WFI洗滌 g) 使用0.5-1.0 M NaOH之清潔 h) 儲存 0.1M NaOH。
  35. 如請求項1所述之方法，其中該純化治療性蛋白質製劑包含不大於2%聚集體，較佳地小於1%聚集體。
  36. 如請求項1所述之方法，其中該穩定的抗原結合蛋白質配方包含至少一種抗原結合蛋白質、至少一種穩定劑、至少一種緩衝液、至少一種張力劑、及至少一種表面活性劑。
  37. 如請求項36所述之方法，其中穩定劑為選自包含以下一或多者之群的一碳水化合物：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露醇、聚葡萄醣、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、或棉子糖；更佳地，穩定劑為蔗糖。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該穩定的抗原結合蛋白質配方包含＜2.5%蔗糖，更佳地＜1%蔗糖，及最佳地0.5%蔗糖。
  39. 如請求項36所述之方法，其中該緩衝劑係選自包含以下一或多者之群：組胺酸、甘胺酸、檸檬酸鈉、磷酸鈉、精胺酸、檸檬酸、HEPES、乙酸鉀、檸檬酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、碳酸氫鈉、Tris鹼及Tris-HCl。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該緩衝劑為組胺酸或精胺酸或其組合。
  41. 如請求項36及39中任一項所述之方法，其中該緩衝劑為組胺酸。
  42. 如請求項41所述之方法，其中組胺酸之濃度在10-50 mM範圍內；較佳地為25 mM。
  43. 如請求項36及39中任一項所述之方法，其中該緩衝劑為精胺酸。
  44. 如請求項43所述之方法，其中精胺酸之濃度在10-150 mM範圍內；較佳地為75 mM。
  45. 如請求項36所述之方法，其中該張力劑係選自包含以下一或多者之群：氯化鈉、右旋糖、甘油、甘露醇、及氯化鉀。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該張力劑為氯化鈉。
  47. 如請求項45所述之方法，其中氯化鈉之濃度在50-250 mM範圍內；較佳地為100-145 mM。
  48. 如請求項36所述之方法，其中該表面活性劑係選自包含以下一或多者之群：聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-、或硬脂醯基-硫代甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-或硬脂醯基-肌胺酸；亞麻基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂基醯胺基丙基-、椰油基醯胺基丙基-、亞麻基醯胺基丙基-、肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-( palmidopropyl-)、或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如月桂基醯胺基丙基)；肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-、或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰子油脂基-牛磺酸鈉、或甲基油烯基-牛磺酸二鈉；及MONAQUAT®系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，Pluronics、PF68等等)；較佳地，該表面活性劑為聚山梨醇酯80。
  49. 如請求項48所述之方法，其中聚山梨醇酯80之濃度在0.002-0.2% (w/v)範圍內；較佳地0.02% (w/v)。
  50. 如請求項1及36-40以及44-48中任一項所述之方法，其中該穩定的抗原結合蛋白質配方包含約1 mg/ml至約100 mg/ml之抗原結合蛋白質。
  51. 如請求項50所述之方法，其中該穩定的抗原結合蛋白質配方包含約1 mg/ml至約50 mg/ml之抗原結合蛋白質。
  52. 如請求項1-3、6-24、33-40、42、44-49及51中任一項所述之方法，其中抗原結合蛋白質配方包含不大於3%聚集、最低量之亞可見粒子及改進的效力。
  53. 如請求項1所述之方法，其中該抗原結合蛋白質單體之濃度大於99%；殘餘CHO DNA不大於2 pg/mg抗原結合蛋白質、更特地而言不大於0.1 pg/mg抗原結合蛋白質；殘餘CHO蛋白質不大於100 ng/mg抗原結合蛋白質、更特地而言不大於10 ng/mg抗原結合蛋白質；殘餘蛋白質A不大於10 ng/mg抗原結合蛋白質、更特地而言不大於1.5 ng/mg抗原結合蛋白質；內毒素不大於0.1 EU/mg蛋白質、MuLV之病毒清除LRV為至少20倍且MMV之病毒清除LRV至少為10倍。
  54. 一種根據先前請求項中任一項製備的醫藥組合物。
  55. 一種醫藥配方，其包含抗原結合蛋白質、一緩衝劑、一張力劑、一表面活性劑及一穩定劑。
  56. 如請求項55所述之醫藥配方，其中穩定劑為選自包含以下一或多者之群的一碳水化合物：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露醇、聚葡萄醣、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、或棉子糖；更佳地，穩定劑為蔗糖。
  57. 如請求項56所述之醫藥配方，其中該穩定的抗原結合蛋白質配方包含＜2.5%蔗糖w/v，更佳地＜1%蔗糖w/v。
  58. 如請求項55所述之醫藥配方，其中該緩衝劑係選自包含以下一或多者之群：組胺酸、甘胺酸、檸檬酸鈉、磷酸鈉、精胺酸、檸檬酸、HEPES、乙酸鉀、檸檬酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、碳酸氫鈉、Tris鹼及Tris-HCl。
  59. 如請求項58所述之醫藥配方，其中該緩衝劑為組胺酸或精胺酸或其組合。
  60. 如請求項55所述之醫藥配方，其中該緩衝劑為組胺酸。
  61. 如請求項60所述之醫藥配方，其中組胺酸之濃度在10-50 mM範圍內；較佳地為25 mM。
  62. 如請求項55所述之醫藥配方，其中該緩衝劑為精胺酸。
  63. 如請求項62所述之醫藥配方，其中精胺酸之濃度在10-150 mM範圍內；較佳地為75 mM。
  64. 如請求項55所述之醫藥配方，其中該張力劑係選自包含以下一或多者之群：氯化鈉、右旋糖、甘油、甘露醇、及氯化鉀。
  65. 如請求項64所述之醫藥配方，其中該張力劑為氯化鈉。
  66. 如請求項65所述之醫藥配方，其中氯化鈉係濃度在50-250 mM範圍內；較佳地為100-145 mM。
  67. 如請求項55所述之醫藥配方，其中該表面活性劑係選自包含以下一或多者之群：聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-、或硬脂醯基-硫代甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻基-或硬脂醯基-肌胺酸；亞麻基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂基醯胺基丙基-、椰油基醯胺基丙基-、亞麻基醯胺基丙基-、肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-、或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如月桂基醯胺基丙基)；肉豆蔻基醯胺基丙基-、棕櫚醯基丙基-、或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰子油脂基-牛磺酸鈉、或甲基油烯基-牛磺酸二鈉；及MONAQUAT®系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，Pluronics、PF68等等)；較佳地，該表面活性劑為聚山梨醇酯80。
  68. 如請求項67所述之醫藥配方，其中聚山梨醇酯80之濃度在0.002-0.2% (w/v)範圍內；較佳地0.02% (w/v)。
  69. 一種醫藥配方，其包含 a) 1-100 mg/ml之至少一種抗原結合蛋白質；b) 20-40 mM之組胺酸；c) 50-100 mM之精胺酸；d) 0.002-0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；e) 50-150 mM NaCl；f) 不大於2.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5其中該配方之滲透壓度為300-450 mOsmol/kg且黏度小於2.5 mPa-S，且該配方在2-8℃下穩定達至少9個月，在25℃下穩定達至少1個月，在40℃下穩定達至少40天，在50℃下穩定達至少2天。
  70. 一種醫藥配方，其包含2-80 mg/ml之至少一種抗原結合蛋白質；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5。
  71. 如請求項54-70中任一項所述之醫藥配方，其中該抗原結合蛋白質之等電點(pI)為7.5-8.5，更佳地8.12。
  72. 如請求項54-70中任一項所述之醫藥配方，其中該配方之滲透壓度為約380 mOsmol/kg。
  73. 如請求項54-70中任一項所述之醫藥配方，其中該抗原結合蛋白質為一人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體、雙特異性抗體、多價抗體、多特異性抗體、抗原結合蛋白質片段、多株抗體、單株抗體、雙功能抗體、奈米抗體、一價異源共軛物、多特異性自體抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab)′2片段、藉由一Fab表現文庫產生的片段、抗遺傳型(抗Id)抗體、抗原決定基結合片段及含CDR片段或其組合。
  74. 如請求項73所述之醫藥配方，其中該抗原結合蛋白質為一單株抗體。
  75. 如請求項73所述之醫藥配方，其中該單株結合至一登革熱病毒。
  76. 如請求項73所述之醫藥配方，其中該單株抗體結合至一狂犬病病毒。
  77. 一種醫藥配方，其包含2-80 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  78. 一種醫藥配方，其包含25 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  79. 一種醫藥配方，其包含50 mg/ml之登革熱單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  80. 一種醫藥配方，其包含2-80 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  81. 一種醫藥配方，其包含25 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  82. 一種醫藥配方，其包含50 mg/ml之狂犬病單株抗體；25 mM之組胺酸；75 mM之精胺酸；101 mM NaCl；0.02%聚山梨醇酯80 (w/v)；及0.5%蔗糖w/v；其中該配方之pH為6.5±0.5，滲透壓度為380 mOsm/kg，黏度小於2.5 mPa-S。
  83. 如請求項54-70及74-82中任一項所述之醫藥配方，其中該配方為一液體配方。
  84. 如請求項54-70及74-82中任一項所述之醫藥配方，其中該配方為一凍乾配方。
  85. 如請求項70所述之醫藥組合物，其中該抗原結合蛋白質為具有針對以下各者上呈現的抗原決定基之結合親和力的一抗體：登革熱病毒、狂犬病病毒、RSV、MPV、流感病毒、茲卡病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、基孔肯雅病毒、HSV、CMV、MERS、艾司坦-巴爾病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、小兒麻痺病毒、鼻病毒、腺病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、諾瓦克病毒、披衣病毒、α病毒、德國麻疹病毒、HIV病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、人類乳突病毒、多瘤性病毒、間質肺炎病毒、冠狀病毒、伊波拉病毒、VSV及VEE。
  86. 如請求項70所述之醫藥組合物，其中該抗原結合蛋白質係選自包含以下一或多者之群：CTP19、CR57、CR4098、RVFab8、MabJA、MabJB-1、Mab 57,17C7、2B10、Ab513/VIS513、N297Q-B3B9、Mab2E8、2D22、DMScHuMab、3CH5L1、HMB DV5、HMB DV6、HMB DV8、DB32-6、D88、F38、A48、C88、F108、B48、A68、A100、C58、C78、C68、D98、D188、C128、C98、A11、B11、R17D6、R14B3、R16C9、R14D6、R18G9、R16F7、R17G9、R16E5、來源於4E11A之修飾的抗體、阿巴西普、阿昔單抗、阿達木單抗、阿柏西普、阿法西普、阿來組單抗、曲妥珠單抗、巴利昔單抗、貝伐單抗、貝拉西普、貝妥莫單抗、賽妥珠單抗、西妥昔單抗、達利珠單抗、依庫珠單抗、依法珠單抗、依那西普、吉妥珠單抗、替伊莫單抗、英夫利昔單抗、莫羅單抗-CD3、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、蘭尼單抗、列洛西普、利妥昔單抗、托西莫單抗、曲妥珠單抗、紮木單抗、納武單抗、派姆單抗、hA20、AME-I33、IMC-3G3、紮魯木單抗、尼妥珠單抗、馬妥珠單抗、ch*)^、KSB-102、MR1-1、SC100、SC101、SC103、莫羅單抗-CD3、OKT4A、替伊莫單抗、吉妥珠單抗、莫維珠單抗、英夫利昔單抗、培非格司亭、CDP-571、依那西普、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MAl培妥莫單抗、Therex、AS1405、那他珠單抗、HuBC-I、IDEC-131、VLA-I；CAT-152；J695、CAT-192、CAT-213、BR3-Fc、LymphoStat-B、TRAIL-RImAb、貝伐單抗、奧馬珠單抗、依法珠單抗、MLN-02、HuMax-IL 15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、克立昔單抗、魯昔單抗、BEC2、IMC-ICl 1、DClOl、拉貝珠單抗、阿西莫單抗、依帕珠單抗、他珠單抗、西妥昔單抗、MyelomaCide、LkoCide、ProstaCide、依匹單抗、MDX-060、MDX-070、MDX-018、MDX-1106、MDX-1103、MDX-1333、MDX-214、MDX-1100、MDX-CD4、MDX-1388、MDX-066、MDX-1307、HGS-TR2J、FG-3019、BMS-66513、SGN-30、SGN-40、托珠單抗、CS-1008、IDM-I、戈利木單抗、CNTO 1275、CNTO 95、CNTO 328、美泊利單抗、MORlOl、MORI 02、MOR201、維西珠單抗、HuZAF、伏洛昔單抗、ING-I、MLN2201、達利珠單抗、HCD 122、CDP860、PRO542、C 14、奧戈伏單抗、依決洛單抗、伊瑞西珠單抗、阿特珠單抗、伊匹單抗、莫加利珠單抗、林妥珠單抗、HuIDlO、Lym-1、依法珠單抗、ICM3、加利昔單抗、依庫珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、培克珠單抗、LDP-Ol、huA33、WX-G250、羅珠單抗、奧法木單抗、嵌合KW-2871、hu3S193、huLK26；貝伐珠單抗、瑞希巴庫單抗、chl4.18、3F8、BC8、huHMFGl、MORAb-003、MORAb-004、MORAb-009、地諾單抗、PRO-140、1D09C3、huMikbeta-1、NI-0401、NI-501、坎妥珠單抗、HuN901、8H9、chTNT-1/B、巴維昔單抗、huJ591、HeFi-I、Pentacea、阿巴伏單抗、托西莫單抗、優特克單抗、105AD7、GMAl 61、GMA321。
  87. 如請求項54-70、74-82及85-86中任一項所述之醫藥配方，其中該抗原結合蛋白質為一抗登革熱抗體或抗狂犬病抗體，其可單獨或與其他藥劑、其他預防性或治療性模態組合投與。
  88. 一種容器，其包含如前述請求項中任一項所述之配方，其中該容器係選自一瓶子、一小瓶、一安瓿、一IV袋、一可穿戴注射器、一推注注射器、一注射器、一筆、一泵、一多劑量針注射器、一多劑量筆、一注射器、一西雷特皮下注射器、一自動注射器、一預填充注射器、或其組合。
  89. 如請求項88所述之包含該配方之容器，其中至少一種主要包裝組件包含一容器封閉體，其係選自聚丙烯(PP)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PETG)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚五氟苯乙烯(PFS)、聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚環戊烷(CZ.RTM.)、環烯烴共聚物(COC)、聚烯烴、及其組合或共聚物。
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