KR20190099269A - 포유류 세포 배양에서 항체 생산성을 증강시키고 하류 제제화 프로세스 동안 응집을 최소화하기 위한 개선된 방법, 및 그로부터 수득된 안정한 항체 제제 - Google Patents

포유류 세포 배양에서 항체 생산성을 증강시키고 하류 제제화 프로세스 동안 응집을 최소화하기 위한 개선된 방법, 및 그로부터 수득된 안정한 항체 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 i) 2 gm/L 내지 5 gm/L의 높은 항체 역가를 유도하는 개선된 피딩 전략을 수반한 세포 배양 프로세스를 제공하고; ii) 최적의 백분율 회수, 고 순도 단량체 함량, 최소 응집/미립자 형성, 최소 불순물 수준을 나타내는 개선된 정제 프로세스를 제공하며; iii) 상이한 온도 편차 전체에 걸쳐 최적의 오스몰랄농도 및 낮은 점도를 수반하고 응집이 없는 고 농도의 안정한 액상 제제를 제공하는, 항체 제조 및 제제화를 위한 효율적인 플랫폼을 기재한다. 바람직한 항체는 E 단백질의 도메인 III 내의 뎅기열 바이러스 에피토프에 특이적인 IgG1 모노클로날 항체; 및 광견병 바이러스 표면 G 당단백질에 특이적인 IgG1 모노클로날 항체를 포함한다.

Description

포유류 세포 배양에서 항체 생산성을 증강시키고 하류 제제화 프로세스 동안 응집을 최소화하기 위한 개선된 방법, 및 그로부터 수득된 안정한 항체 제제
상류, 하류 및 제제화 개발은 종종, 바이오 의약품을 임상 시험에 초기 도입하는데 있어서 속도 제한 단계일 수 있다. 예를 들어, 뎅기열(Dengue)은 인간에게 영향을 미치는 가장 중요한 모기 매개 바이러스성 질환이다. 세계 인구의 절반이 뎅기열 위험에 처한 지역에 살고 있어, 전 세계적으로 매년 3억 9천만 건의 감염이 발생하는 것으로 추정된다. 현재 뎅기열 치료제로 승인된 항바이러스제는 없으며 최근의 백신 임상 시험은 기대에 미치지 못했다. 선도적인 백신 후보는 최근, 30% 내지 60%인 것으로 추정되는 제한된 효능을 명확하게 보여주었는데, DENV-2에 대항해서는 상당한 보호를 제공하지 못하는 것으로 제한된다. 최근에 E 단백질의 도메인 III 내의 비-면역우성이지만 기능적으로 관련있는 에피토프가 확인되었고, 이어서 4가지 모두의 혈청형 내의 다수의 유전자형과 고 친화성 결합을 보이고, 이러한 다수의 유전자형을 광범위하게 중화시키는 조작된 항체 Ab513이 개발 중에 있다 (문헌 [Ram Sasisekharan et al. Cell 162, 1-12, July 30, 2015; Samir Bhatt et al., Nature, 2013 April 25; 496 7446: 504-507] 참조). 따라서 본 발명자들이 뎅기열 모노클로날 항체에 대한 전 세계적 의료 수요를 고려한 경우, 최근 추정에 따르면 전 세계적으로 매년 3억 9천만 건 이하의 뎅기열 감염이 발생하며, 9천만 건 이상이 DENV를 주요 글로벌 위협이 되게 하는 질환을 동반하는 것으로 나타난다. 본 발명자들은 1천 6백만 건의 진단된 뎅기열 환자의 30%가 병원에 간다고 가정하면, 약 5백만 명이 상기 뎅기열 모노클로날 항체를 필요로 할 것이며, 이는 4 gm/L 이상의 "정제된 항체"가 그러한 생명을 구하는 항체의 글로벌 요구를 충족시키는 전제 조건이 된다는 것을 의미한다. 추가로, 개발 도상국에서는 뎅기열 질환 부담이 높은데, 이러한 국가에서는 전력 및 냉동의 이용 가능성이 종종 불충분하므로, 온도 편차에 따른 항체 안정성이 이들 지역에 더 큰 관련성이 있다고 짐작된다.
실제로, 모든 모노클로날 항체 (mAb) 후보 물질을 제조하고 제제화하기 위해이용될 수 있었던 플랫폼 프로세스가 가능한 경우, 프로세스 개발에 필요한 시간과 자원을 크게 줄일 수 있을 것이다. 이것은 임상 시험에 도입될 수 있는 임상 후보의 수에 상당한 영향을 줄 수 있다. 또한, 플랫폼을 사용하여 개발된 것을 포함하여 조기 임상 시험용으로 개발된 프로세스는 프로세스 경제성, 산출량, 풀 용적, 처리량과 관련하여 최적이 아닐 수 있으며, 후기 단계 또는 상업적 캠페인에 필요한 양을 생산하는 데 적합하지 않을 수 있다. 또 다른 중요한 고려 사항은 치료용 후보 물질을 임상 시험에 도입하기 전에 프로세스 개발이 필요하다는 것을 고려해 볼 때 프로세스 개발 속도이다 [문헌 [Abhinav A. Shukla et al. Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39] 참조).
전형적으로 포유류 세포 배양 배지는, 예를 들어, DMEM 또는 햄스 F12를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 배지 제제에 근거한다. 종종 배지 제제는 세포 성장과 생물학적 단백질 발현 둘 다의 증가를 뒷받침할 정도로 충분히 강화되지 않는다. 개선된 단백질 생산을 위한 개선된 세포 배양 배지, 보충제 및 세포 배양 방법에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 세포 배양 항체 역가가 >2 g/L로 증가한 것은 이전에 보고되었다 (문헌 [F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393] 참조). 추가로, 관류 반응기에서, 세포는 통상적인 배치식 또는 공급-배치식 반응기에서보다 훨씬 더 높은 세포 밀도에 도달할 수 있다 (문헌 [Sven Sommerfeld et al. Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137] 참조). 그러나 관류 기반의 프로세스는 복잡하고 비용이 많이 들며, 멸균 문제 및 글리코실화 패턴에서 원하지 않는 이질성을 초래할 수도 있다. 화학적으로 규정된 배지에 동물성 성분이 없는 가수분해물 (박토 TC 이스톨레이트, 피톤 펩톤)을 부가하는 것은 세포 밀도, 배양 생육력 및 생산성을 시의 적절한 방식으로 증가시키는 통상적인 접근법이다. 가수분해물은 아미노산, 작은 펩티드, 탄수화물, 비타민 및 미네랄로 구성된 단백질 소화물이며, 배지에 영양 보충제를 제공한다. 콩, 밀 및 효모로부터의 비-동물 유래 가수분해물은 항체 역가를 개선시키기 위해 세포 배양 배지 및 피드(feed)에 흔히 사용되고 있다 (US9284371 참조). 그러나, 그의 조성의 복잡성, 로트 대 로트 변이, 점성이 있는 배양물의 바람직하지 않은 속성 때문에, 효모 추출물 및 가수분해물은 배지 가변성의 중요한 공급원이 될 수 있다. 이소형 및 미세 이질성을 포함하는 항체 산물의 복잡성으로 인하여, 세포 배양 프로세스의 성능은, 특히 글리코실화, 전사 후 변형 및 불순물 프로파일과 관련하여 산물 품질 및 효능에 상당한 영향을 줄 수 있다.
더 높은 농도에서는, 단백질, 특히 항체가 종종, 응집, 침전, 겔화, 안정성 저하 및/또는 증가된 점도를 포함하는 특징 문제를 나타낸다.
항체는 분해 또는 응집 또는 변성 또는 화학적 변형을 겪으면서 용액 내에 응집체 및 미립자를 형성하는 경향이 있어 제조 프로세스 동안 및/또는 시간에 따른 저장 동안 생물학적 활성의 상실을 유도하는 특징을 보유하는 것으로 인식된다. 항체 응집체는 세포 배양 발현, 하류 정제, 제제화 및 저장 중에 형성될 수 있었다. 세포 배양 수거물은 통상적으로, 프로세스에서 가장 높은 수준의 응집체를 함유한다 (문헌 [Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75] 참조). 단백질에 대한 분해 경로는 화학적 불안정성 (예를 들어, 결합 형성 또는 절단에 의한 새로운 화학 물질을 생성하는 단백질의 변형을 포함하는 임의의 프로세스) 또는 물리적 불안정성 (예를 들어, 단백질의 고차 구조 상의 변화)을 포함할 수 있다. 가장 통상적인 3가지 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다 [Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)]. 추가로, 단백질은 또한, 예를 들어, pH, 이온 강도, 열 응력, 전단 및 계면 응력에 대해 감수성이며, 이들 모두가 응집을 유발시켜 불안정성을 초래할 수 있다. 단백질이 생물학적으로 활성을 유지하기 위해서는, 제제는 적어도 단백질의 아미노산의 핵심 서열의 입체 형태적 무결성을 그대로 보존해야만 하며, 동시에 단백질의 다중 작용기가 분해되지 못하게 해야 한다.
응집체 형성으로 야기되는 주요 문제점은 투여 중에 제제가 주사기 또는 펌프를 막아 환자에게 위험할 수 있다는 것이다. 이러한 단백질 변형은 또한, 면역원성을 만들어 환자에 의한 항-약물 항체의 생성을 초래하여 후속 주사 동안 약물 가용성을 감소시키거나 또는 자가 면역 반응을 더 악화시킬 수 있다. 항체 제제의 개발에 있어서 주요 목표는 단백질 용해도, 안정성 및 생체 활성을 유지하는 것이다.
단백질 치료제 제제의 불안정성 문제를 해결하는 방법에 대한 초기 제안은 약물 산물의 동결 건조, 이어서 즉시 또는 투여 직전에 재구성하는 것을 포함하였다. 그러나, 항체의 동결 건조된 제제는 동결 건조에 대한 장시간의 프로세스 및 제조를 위한 고 비용을 포함하는 다수의 제한이 있다. 또한, 동결 건조된 제제는 환자에게 투여하기 전에 의료 실무자에 의해 무균적으로 및 정확하게 재구성되어야 한다. 재구성 단계 자체는 특정의 구체적인 절차가 필요한데, 즉 (1) 멸균 희석제 (즉, 정맥내 투여용 물 및 근육내 투여를 위한 수중 5% 덱스트로스)를, 동결 건조된 항체를 함유하는 바이알에 서서히 무균적으로 부가하고, 이 바이알을 거품이 발생하지 않도록 30초 동안 매우 온화하게 와동시켜야만 하고; (2) 재구성된 항체는 용액이 정화될 때까지 실온에서 최소 20분 동안 방치시킬 필요가 있을 수 있으며; (3) 재구성된 제제는 재구성 후 6시간 이내에 투여되어야만 한다. 이러한 재구성 절차는 번거롭고 재구성 후의 시간 제한으로 인해 제제를 환자에게 투여하는 데 있어서 큰 불편을 겪을 수 있으며, 적절하게 재구성되지 않는 경우, 또는 재구성된 용량을 6시간 이내에 사용하지 않아 폐기해야만 하는 경우에는, 상당한 낭비가 야기된다. 따라서, 액상 제제는 임상적 및 환자 편의성뿐만 아니라 제조의 용이함으로 인해 바람직하다. 그러나 단백질 치료제, 즉 항체의 액상 제약 제제는 장기간 안정해야 하고, 안전하고 유효한 양의 제약 화합물을 함유해야 한다.
응집체의 제거는 응집체와 단량체 간의 생물 물리학적 유사성, 다수의 공급원 및 유형의 응집체, 및 응집 메커니즘에 대한 이해 부족으로 인해 프로세스 관련 불순물을 제거하는 것보다 더 어렵다.
고 농도 모노클로날 항체 투여 형태의 제제화 개발 중에 직면하게 되는 최근의 문제점 중 하나는 제조 및 장기간 저장 동안 단백질성의 육안으로 보이지 않는 미립자 및 가시적인 미립자의 형성이다. IgG 제제 내의 단백질성 및 비-단백질성 미립자의 수준은 정제 및 제제화 개발에서 점차적으로 중요한 부분이다 (문헌 [Klaus Wuchner et al. Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 99, no. 8, august 2010] 참조). 추가로 액상 제제는 2-8℃, 25℃, 40℃, 및 55℃의 상이한 온도 전체에 걸쳐 안정해야 한다.
인간용으로 의도된 많은 항체 제제는 이러한 제제를 사용하기 전에 단백질에 대한 변성, 응집 및 다른 변경을 방지하기 위해 안정화제를 필요로 한다. 이전에 보고된 항체 액상 항체 제제 [루센티스(Lucentis); 아바스틴(Avastin)]은 안정화제로서 만니톨, 트레할로스를 가졌다 (문헌 [Susumu Uchiyama et al. Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 2041-2052]; US20160137727; WO2009120684; US8568720 참조). 그러나, 트레할로스는 비용이 많이 들며 대규모 프로세스 경제로는 실현 가능하지 않다.
또한, 항체의 IV 투여는 통상적으로, 볼루스가 아닌 주입으로서 제공되며, 따라서 IV 투여에 적합한 적절한 유체 내로의 부형제를 포함하는 mAb 제제의 희석을 필요로 한다. 이로써 생성된 부형제, 특히 계면활성제의 희석은 교반 동안 응집 방지에 필요한 농도보다 낮아질 수 있어, 0.9% 식염수를 함유하는 PVC 및 PO IV 봉지 내로 희석한 후 완만하게 교반한 후에는 응집체 및 육안으로 보이지 않는 입자가 생성된다.
소수성 상호 작용 크로마토그래피, 세라믹 히드록시아파타이트 및 양이온 교환 수지는 모두 응집체 제거를 위해 사용되어 왔지만 이상적인 것은 없다. 이전에 보고된 대다수의 항체 정제 프로세스는 3 단계 또는 4 단계 프로세스로서 단백질 A 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피와 조합하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 사용에 크게 의존한다 (WO2010141039, WO 2014/207763, WO2013066707, WO2015099165, WO2014102814, WO2015038888, WO2004087761 참조). 그러나, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지는 값이 비싸고, 결합력이 낮고, 처분하기가 어려울 수 있으며, 완충액 및 제품 보유 탱크의 구축 재료와 양립할 수 없는 다량의 염을 필요로 한다. 더욱이, HIC 단계에 사용된 완충액 간의 밀도 차이는 베드 안정성 문제를 야기할 수 있다. 세라믹 히드록시아파타이트는 또한, 단량체로부터 응집체를 분리하는데 사용될 수 있지만, 세라믹 수지는 이러한 수지를 손상시키지 않고서 패킹을 풀기가 매우 어려울 수 있다. 따라서, 후속 제조 캠페인에서 재사용을 위해 컬럼 외부에 수지를 저장하는 것이 불가능할 수도 있다 (문헌 [Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78] 참조).
양이온 교환, 음이온 교환 관류, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 양이온 교환 크로마토그래피의 3 단계 조합이 CHO 유래 모노클로날 항체에 대한 숙주 세포 단백질 오염 물질의 적절한 제거를 전달하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이러한 정제 방식은 대체로, 각각의 mAb에 대해 별도로 정제 서열을 설계할 필요가 있기 때문에 상업적 하류 조작에서 발견되지 않았다.
따라서, 강건함, 신뢰성 및 확장성을 포함한 다중 기준을 충족하는 항체 제조 및 제제화를 위한 효율적인 플랫폼 프로세스, 특히 i) 적어도 2 gm/L의 항체 역가를 제공하고; ii) 세포 배양, 정제 및 제제화 프로세스 전체에 걸친 최소 응집/미립자 형성을 제공하며; iii) 최적의 백분율 회수, 높은 단량체 함량 및 최소 불순물 수준을 나타내는 개선된 정제를 제공하고; iv) 응집과 육안으로 보이지 않는 입자가 고갈된, 낮은 점도를 나타냄으로써, 장기간 안정성을 나타내는 고 농도 항체 제제를 제공하는 플랫폼이 시급히 요구된다.
본 출원인은 놀랍게도, 다음과 같은 사실을 밝혀내었다:
a) 영양분 소비, 부산물 누적 및 성장 촉진 대 용적 생산성 간의 균형을 고려한 피드 조성 및 피딩 전략으로, 여기서 특히 포유류 세포 배양 프로세스 파라미터, 예컨대 특별한 기초 배지의 사용, 피드 용액으로서의 농축된 기초 배지의 사용, 명확한 피딩 전략과 함께 상이한 피드 용액의 사용, 더 낮은 농도의 락테이트와 암모니아를 유지하는 것은 세포 성장, 세포 수명 및 단백질 발현을 증강시키는 것으로 밝혀졌고; 이로써 항체 역가가 증가하게 된다.
b) 단백질 A 친화성 및 양이온 교환 단계 동안 완충액의 일부로서 특이적 염 농도가 응집을 최소화하고; 이로써 80% 초과의 회수율로 99% 초과의 단량체 함량을 달성할 수 있다.
c) 더 높은 효력과 안정성을 부여해 주는, 히스티딘, 아르기닌, 폴리소르베이트-80, 염화나트륨과 조합하여 수크로스를 포함하는 무입자 액상 항체 제제는 2-8℃에서 적어도 9개월 동안, 25℃에서 적어도 1개월 동안, 40℃에서 적어도 42일 동안, 55℃에서 적어도 2일 동안, 수크로스가 고갈된 제제와 비교 시 고도로 농축된 항체 용액의 점도를 감소시킨다.
1. 도 1 : 플로 차트 - 모노클로날 항체의 정제를 위한 하류 프로세싱
2. 도 2 : 플로 차트 - 모노클로날 항체에 대한 제제화 프로세스
본 발명의 치료용 단백질은 항원 결합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체, 항원 결합 단백질 단편, 폴리클로날, 모노클로날, 디아바디, 나노바디, 1가, 헤테로-접합체, 다중특이적, 자가 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab)'2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 에피토프 결합 단편 및 CDR 함유 단편 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시양태에서, 치료용 단백질은 항원 결합 단백질 또는 이뮤노글로불린이고; 보다 바람직하게는 IgG이며, 가장 바람직하게는 IgG1 분자이다. 본 실시양태의 제1 측면에서, 이뮤노글로불린/항체는 E 단백질의 도메인 III 내의 뎅기열 바이러스 에피토프에 특이적인 인간 카파 경쇄를 수반한 인간 IgG1 (G1m3 동종이형)이다. 본 실시양태의 제2 측면에서, 항체는 광견병 바이러스 표면 G 당단백질에 특이적인 완전한 인간 IgG1 모노클로날 항체이다. 본 실시양태의 제3 측면에서, 치료용 단백질은 CTP19, CR57, CR4098, RVFab8, MabJA, MabJB-1, Mab 57, 17C7, 2B10, Ab513/VIS513, N297Q-B3B9, Mab2E8, 2D22, DMScHuMab, 3CH5L1, HMB DV5, HMB DV6, HMB DV8, DB32-6, D88, F38, A48, C88, F108, B48, A68, A100, C58, C78, C68, D98, D188, C128, C98, A11, B11, R17D6, R14B3, R16C9, R14D6, R18G9, R16F7, R17G9, R16E5, 4E11A의 변형으로부터 유래된 항체, 아다타셉트, 압식시맙, 아달리무맙, 아플리베르셉트, 알레파셉트, 알렘투주맙, 트라스투주맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨라타셉트, 벡투모맙, 세르톨리주맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 엔타네르셉트, 젬투주맙, 이브리투모맙, 인플릭시맙, 무로모납-CD3, 오말리주맙, 팔리비주맙; 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 릴로나셉트, 리툭시맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 자놀리맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, hA20, AME-I33, IMC-3G3, 잘루투무맙, 님모투주맙, 마투주맙, ch*)^, KSB-102, MR1-1, SC100, SC101, SC103, 무로모납-CD3, OKT4A, 이브리투모맙, 젬투주맙, 모타비주맙, 인플릭시맙, 페그필그라스틴, CDP-571, 에타네르셉트, ABX-CBL, ABX-IL8, ABX-MAl 펨투모맙, 테렉스, AS1405, 나탈리주맙, HuBC-I, IDEC-131, VLA-I; CAT-152; J695, CAT-192, CAT-213, BR3-Fc, 림포스타트-B, TRAIL-RImAb, 베바시주맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, MLN-02, HuMax-IL 15, HuMax-염증, HuMax-암, HuMax-림프종, HuMax-TAC, 클레놀릭시맙, 루밀릭시맙, BEC2, IMC-ICl 1, DClOl, 라베투주맙, 아르시투모맙, 엡라투주맙, 타카투주맙, 세툭시맙, 미엘로마시드, 엘코시드, 프로스타시드, 이필리무맙, MDX-060, MDX-070, MDX-018, MDX-1106, MDX-1103, MDX-1333, MDX-214, MDX-1100, MDX-CD4, MDX-1388, MDX-066, MDX-1307, HGS-TR2J, FG-3019, BMS-66513, SGN-30, SGN-40, 토실리주맙, CS-1008, IDM-I, 골리무맙, CNTO 1275, CNTO 95, CNTO 328, 메폴리주맙, MORlOl, MORI 02, MOR201, 비실리주맙, HuZAF, 볼로식맙, ING-I, MLN2201, 다클리주맙, HCD 122, CDP860, PRO542, C 14, 오레고보맙, 에드레콜로맙, 에타라시주맙, 아테졸리주맙, 이플리무맙, 모가물리주맙, 린투주맙, HuIDlO, Lym-1, 에팔리주맙, ICM3, 갈릭시맙, 에쿨리주맙, 오비누투주맙, 펙셀리주맙, LDP-Ol, huA33, WX-G250, 시브로투주맙, 오파투무맙, 키메라 KW-2871, hu3S193, huLK26; 비바투주맙, 락시바쿠맙, chl4.18, 3F8, BC8, huHMFGl, MORAb-003, MORAb-004, MORAb-009, 데노수맙, PRO-140, 1D09C3, hu믹베타-1, NI-0401, NI-501, 칸투주맙, HuN901, 8H9, chTNT-1/B, 바비툭시맙, huJ591, HeFi-I, 펜타세아, 아바고보맙, 토시투모맙, 우스테키누맙, 105AD7, GMAl 61, GMA321을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 실시양태의 다른 측면에서, 치료용 단백질은 뎅기열 바이러스, 광견병 바이러스, RSV, MPV, 인플루엔자 바이러스, 지카 바이러스, 서부 나일강 바이러스, 황열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, HSV, CMV, MERS, 에볼라 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오 바이러스, 리노 바이러스, 아데노바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 토가바이러스, 알파 바이러스, 풍진 바이러스, HIV 바이러스, 마르부르그(Marburg) 바이러스, 에볼라 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, VSV 및 VEE 상에 존재하는 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 항체이다.
본 실시양태의 또 다른 측면에서, 상기 항원 결합 단백질의 등전점 (pI)은 7.5 - 8.5, 보다 바람직하게 약 7.8 내지 약 8.2, 가장 바람직하게 8.12이다.
특히, 항원 결합 단백질은 WO2014025546, WO2015122995, WO2015123362, WO2006084006, WO2017027805 및 WO2017165736 (그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같은 치료용, 예방용 또는 진단용 항체이다. 보다 바람직하게, 치료용 단백질은 VIS513 (서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2)과 80% 유사성을 갖는 항체이다. 본 실시양태의 다른 바람직한 측면에서, 치료용 단백질은 광견병 모노클로날 항체 (서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4)와 80% 초과의 유사성을 갖는 항체이다.
임의의 숙주가 본원에 기재된 방법에서 치료용 단백질의 발현에 사용될 수 있다는 것은 매우 널리 이해된다. 세포는 야생형이거나 또는 재조합 핵산 서열, 예를 들어, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 유전자를 함유하도록 유전적으로 조작될 수 있다.
본 발명의 제2 실시양태에서, 치료용 단백질의 발현에 사용되는 세포주는 CHO, CHOK1SV GS-KO, GS-CHO, CHO DUX-B11, CHO-K1, BSC-1, NS0 골수종 세포, SV40을 수반하는 기원의 CV-1 (COS) 세포, COS-1, COS-7, P3X3Ag8.653, C127, 293 EBNA, MSR 293, Colo25, U937, SP2 세포, L 세포, 인간 배아 신장 (HEK 293) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK 21) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 VERO-76 세포, HELA 세포, VERO, BHK, MDCK, WI38 세포, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (임의의 이뮤노글로불린 쇄를 내생적으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Ag14, 골수종 세포주, 하이브리도마 세포주, 인간 폐 세포 (W138), 망막 세포, 인간 간암 세포주 (Hep G2), 및 하이브리도마 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된다.
제2 실시양태의 다른 측면에서, 동물 또는 포유류 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 예컨대 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (문헌 [Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; and Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36:10901-10909]), SH87 세포CHO-DXB11 (문헌 [G. Urlaub and L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220. L. H. Graf, and L. A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96]), CHO-K1 Tet-On 세포주 [클론테크(Clontech)], CHO 지정 ECACC 85050302 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), CHO 클론 13 (GEIMG; 이탈리아 제노바), CHO 클론 B (GEIMG; 이탈리아 제노바), CHO-K1/SF 지정 ECACC 93061607 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), RR-CHOK1 지정 ECACC 92052129 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), CHOK1sv (문헌 [Edmonds et al., Mol. Biotech. 34:179-190 (2006)]), CHO-S (문헌 [Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011)]), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR; 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]), 및 dp12.CHO 세포 (미국 특허 번호 5,721,121); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (예를 들어, 293 세포, 또는 현탁 배양액에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 세포; 문헌 [Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); CAP 세포, AGE1.HN 세포, 원숭이 신장 세포 (CV 1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포 (TM4; 문헌 [Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TR1 세포 (문헌 [Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; 및 FS4 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제2 실시양태의 제1 측면에서, 치료용 단백질의 발현을 위해 사용된 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포이고; 보다 특히 상기 세포주는 CHOK1SV GS-KO 또는 GS-CHO이다.
본 발명의 제3 실시양태에서, 세포는 배치식, 공급 배치식 또는 연속식 모드; 보다 특히 공급 배치식 모드로 배양된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이용 가능한 설비 및 개별 필요에 따라 본 발명에서 기재된 프로세스를 조정할 수 있다는 것이 매우 널리 이해되고 있다. 보다 특히, 세포 배양 프로세스는 증강된 세포 성장, 세포 수명 및 증가된 단백질 발현을 제공하는 공급 배치식 모드로 수행되는데, 즉 적어도 2 gm/L, 바람직하게 3 gm/L 내지 약 6 gm/L의 범위의 수거물 산출량을 제공한다.
제3 실시양태의 제1 측면에서, 세포 배양은 플라스크, 바이오 리액터, 탱크 바이오 리액터, 봉지 바이오 리액터 또는 일회용 바이오 리액터에서 시행된다. 바람직하게 상기 바이오 리액터는 교반 탱크 바이오 리액터, 버블 컬럼 바이오 리액터, 에어 리프트 바이오 리액터, 유동층 바이오 리액터 또는 충전층 바이오 리액터의 군으로부터 선택되고; 상기 바이오 리액터는 1L, 2L, 3L, 5L, 10L, 20L, 100L, 200L, 250L, 350L, 500L, 1000L, 1500L, 3000L, 5000L, 10000L, 20000L 및 30,000 리터로부터 선택된 용적을 갖는다.
제3 실시양태의 제2 측면에서, 본 세포 배양 배지 및 방법은 2주 과정에 걸쳐 측정된 바와 같이 항체 산출량을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 180%, 또는 200%, 가장 바람직하게 약 40% 내지 60% 만큼 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 공급 배치식 방법의 기간은 약 12 내지 20일; 약 15 내지 20일 또는 약 15 내지 18일일 수 있다.
본 발명의 제4 실시양태에서, 세포 배양 배지는 CD CHO, CD 옵티CHO™, CD 포르티CHO™ [라이프 테크놀로지(Life Technologies)]; 엑스-셀(Ex-Cell)™ CD CHO (시그마 알드리치); 프로CHO™5 (론자); 발란(Balan)CD™ CHO 성장 A [어빈 사이언티픽(Irvine Scientific)]; CDM4Mab [하이클론(Hyclone)]; 셀벤토(Cellvento)™ CHO-100 [EMD 밀리포어(Millipore)]; 셀 벤토 200 (머크 밀리포어); 셀 벤토 220 (머크 밀리포어); 악티프로 (하이클론); 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게 세포 배양 배지는 셀 벤토 220 (머크), 악티프로 (하이클론/GE), 또는 깁코(Gibco)™ 다이나미스(Dynamis)™ 배지 [써모 피셔(Thermo Fisher)]로부터 선택된다.
세포 배양 배지는 글루코스 및 다른 피드 용액으로 추가로 보충되어 세포 성장, 세포 수명, 단백질 발현 및 산출량을 증가시킨다. 이러한 피드 용액이 신속한 볼루스 또는 점진적인 드립 방식으로 보충될 수 있다는 것은 관련 기술분야에 매우 널리 이해되고 있다.
하기를 포함하는 피딩 전략을 이용하여 세포 배양 배지 내에 피드 용액을 보충시킨다:
제4일부터, 0.05% 내지 0.5% 반응기 용적, 바람직하게 0.1% 내지 0.2% 반응기 용적 하에, 피드 용액 A로 초기 피딩하고;
제6, 8, 10, 11 및 13일에 0.1% 내지 0.5% 반응기 용적 하에, 피드 용액 A로 피딩하며;
제2일 내지 제14일에, 격일로 또는 연속 방식으로, 8% 미만의 반응기 용적 하에 피드 용액 B를 피딩하고;
제2일 또는 제3일부터 시작하여 제12일 또는 제14일 또는 제15일 또는 제16일 또는 제18일까지 2일 연속의 간헐적 공백을 가지면서, 적어도 2일 연속해서 8% 미만의 반응기 용적하에 피드 용액 C를 피딩하며;
제4일 또는 제5일부터 시작하여 제12일 또는 제14일 또는 제15일 또는 제16일 또는 제18일까지 격일로 또는 연속 방식으로 또는 2일 연속의 간헐적 공백을 가지면서, 적어도 2일 연속해서 0.5% 미만의 반응기 용적 하에 피드 용액 D를 피딩한다. 임의로 이피시언트피드(EfficientFeed)™ A, 이피시언트피드™ B, 이피시언트피드™ C, 및 다우 코닝(Dow corning) 소포제 C로부터 선택된 적어도 하나의 피드 용액을 피딩한다.
제4 실시양태의 바람직한 측면에서, 상기 피드 용액 A, 피드 용액 B, 피드 용액 C, 피드 용액 D는 글루코스, 셀 부스트(Cell Boost)™ 5 보충제 (하이클론), 엑스-셀 293 (시그마 알드리치), 셀 부스트 7a 및 7b 보충제 (하이클론), 3X 악티프로 (하이클론/GE), 셀 벤토 220 (1X 배지), 엑스-셀® 어드밴스드™ CHO 피드 1, 이피시언트피드™ A, 이피시언트피드™ B, 및 이피시언트피드™ C, 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제4 실시양태의 가장 바람직한 측면에서, 상기 피드 용액 A는 셀 부스트™ 5 보충제 (하이클론)이고; 피드 용액 B는 엑스-셀 293 (시그마 알드리치)이며, 피드 용액 C는 셀 부스트 7a 보충제 (하이클론)이고, 피드 용액 D는 셀 부스트 7b 보충제 (하이클론)이다. 추가로, 세포 배양 배지는 세포 배양의 제3일에 10% "3X 악티프로" (하이클론)로 보충되고, 제7일에 8% 셀 벤토 220 (1X 배지)로 보충된다. 모든 피딩 부가는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 ± 1% 및 ± 1일 만큼 변할 수 있다는 것이 매우 널리 이해된다.
제4 실시양태의 또 다른 측면은 세포 성장 및 수명 및 단백질 발현을 증가시키기 위해 이용된 세포 배양 조건을 포함한다. 본 프로세스 동안 이용된 하기 세포 배양 조건은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
세포 배양 배지의 pH는 6.5 내지 7.5의 범위이고;
배양 배지의 오스몰랄농도는 250 - 500 mOsm/kg; 보다 바람직하게 400 - 500 mOsm/kg의 범위이다.
용존 산소는 10 - 60%; 바람직하게 20-40%의 범위; 보다 바람직하게 30%이다.
세포 배양 온도는 30℃ 내지 38℃의 범위; 제1 온도 바람직하게 36 - 37℃ 및 임의로 제2 온도 바람직하게 30 - 35℃이다.
글루코스 농도는 7% 아래; 바람직하게 4% 내지 5%로 유지된다.
생육력이 80%로 감소될 때 세포 배양물을 수거하며;
여기서 세포 배양 조건은 이차 대사 산물, 예컨대 락테이트 농도가 5 g/L 이하이고; 암모니아 농도가 5 mMol/L 이하인 방식으로 유지된다.
본 발명의 제5 실시양태에서, 세포 배양 수거물로부터 수득된 상기 치료용 단백질을 대상으로, 하기 단계 i) 친화성 크로마토그래피, ii) 바이러스 불활성화, iii) 이온 교환 크로마토그래피, 및 iv) 여과를 포함하는 정제 프로세스를 수행하며; 여기서 전반적인 프로세스 회수율은 70% 초과이고, 최종 정제된 치료용 단백질은 적어도 90%, 바람직하게 98% 초과의 순도/단량체 함량을 갖는다. 최종 정제된 치료용 단백질 내의 잔여 세포 DNA, 잔여 세포 단백질, 및 잔여 단백질 A를 포함한 다른 불순물은 1% 미만이다.
제5 실시양태의 일반적 측면에서, 본 발명의 발명자는 i) 친화성 크로마토그래피 세척 단계에서의 염 및 ii) 이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 용출을 위한 염 용액의 선형 구배를 사용함으로써, 상기 단백질의 하류 프로세싱 동안 치료용 단백질의 응집 문제를 다루는 데 성공하였다. 상기 실시양태의 바람직한 측면에서, 정제에 사용된 완충액의 염 농도는 30 mM - 500 mM의 범위이고, 보다 바람직하게 정제에 사용된 완충액의 염 농도는 50 mM - 300 mM의 범위이다.
제5 실시양태의 제1 측면에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게 사용된 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다.
제5 실시양태의 제2 측면에서, 단백질 A 크로마토그래피에 사용된 수지는 에슈무노(Eshmuno) A, 칸캡(KanCap)A™, Mab셀렉트 슈어(Select Sure)™, Mab셀렉트 슈어 LX, Mab셀렉트 엑스트라(Select Xtra), r단백질 A 세파로즈 패스트 플로우, 포로스(Poros)® Mab캡처 A, 암스피어(Amsphere)™ 단백질 A JWT203, 프로셉(ProSep) HC, 프로셉 울트라, 및 프로셉 울트라 플러스 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지는 Mab셀렉트 슈어™, 에슈무노 A, 칸캡 A 또는 포로스 Mab캡처이며; 보다 바람직하게 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지는 Mab셀렉트 슈어™이다.
제5 실시양태의 제3 측면에서, 단백질 A 크로마토그래피를 위해 사용된 세척 완충액은 하기 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다:
10 - 30 mM 인산염 완충제, 바람직하게 20 mM 인산염 완충제; 100 - 150 mM NaCl, 바람직하게 150 mM NaCl; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
10 - 30 mM 인산염 완충제, 바람직하게 20 mM 인산염 완충제; 250 mM - 1 M NaCl, 바람직하게 1 M NaCl; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
1 - 30 mM 인산염 완충제, 바람직하게 10 mM 인산염 완충제; 100 - 150 mM NaCl, 바람직하게 125 mM NaCl; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
제5 실시양태의 제4 측면에서, 단백질 A 크로마토그래피를 위해 사용된 용출 완충액은 10 - 30 mM 시트레이트 완충제; pH 3.0 ± 0.5; 및 임의로 0.01 - 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하고; 바람직하게 용출 완충액은 20 mM 시트레이트 완충제; pH 3.0 ± 0.2; 및 임의로 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함한다.
제5 실시양태의 제5 측면에서, 친화성 크로마토그래피 단계로부터 수득된 용출액을 대상으로, 바이러스 불활성화 및 감소를 수행한다. 용출액의 바이러스 불활성화 및 감소는 pH 처리, 세제 처리, 열처리 및 바이러스 감소 여과를 포함하는 군으로부터 개별적으로 또는 조합하여 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다는 것이 관련 기술분야에 매우 널리 이해되고 있다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 바이러스 불활성화는 용출액을 50 내지 100분 동안 낮은 pH, 즉 3.3 - 3.5로 처리함으로써 수행된다. 추가로, 용출액을 중화 완충액, 즉 1 M 트리스/시트레이트 완충제 pH 7.0 ± 0.2로 처리함으로써 pH를 중화시켰다. 관련 기술분야에서는 용출액의 효과적인 pH 중화를 위해 임의의 다른 화합성 완충액을 대체적으로 사용할 수 있다는 것이 매우 널리 이해되고 있다.
제5 실시양태의 제6 측면에서, 바이러스 불활성화된 용출액은 이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 이러한 실시양태의 측면 중 하나에 따르면, 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 이들의 조합이고; 크로마토그래피는 "결합 및 용출" 모드 또는 "관류" 모드로 수행될 수 있다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피는 어떠한 순차적인 순서로도 수행된다. 제5 실시양태의 추가 측면은 상기 크로마토그래피 수지가 임의로, 캅토 MMC 수지 [GE 헬스케어(GE Healthcare)]와 같은 멀티모달 수지라는 것이다.
제5 실시양태의 제7 측면에서, 바이러스 불활성화된 용출액은 양이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 크로마토그래피 수지 및 완충액 조건을 포함한 크로마토그래피 파라미터는, 음전하를 띤 분자가 관류에 들어오는 동안 양전하를 띤 치료용 단백질이 크로마토그래피 수지와 결합하는 방식으로 선택되고, 추가의 치료용 단백질은 염 구배를 사용하여 용출된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 술포네이트 기반 군 [예를 들어, GE 헬스케어로부터의 모노S, 미니S, 소스 15S 및 30S, SP SEPHAROSE® 패스트 플로우, SP SEPHAROSE® 고 성능, 토소(Tosoh)로부터의 TOYOPEARL® SP-650S 및 SP-650M, 바이오래드(BioRad)로부터의 MACRO-PREP® 하이 S, 펄 테크놀로지(Pall Technologies)로부터의 세라믹 하이퍼D S, TRISACRYL® M 및 LS SP 및 스페로덱스 LS SP]; 술포에틸 기반 군 [예를 들어, EMD로부터의 FRACTOGEL® SE, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 포로스® S-10 및 S-20]; 술포프로필 기반 군 (예를 들어, 토소로부터의 TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR, 라이프 테크놀로지로부터의 포로스® HS-20, HS 50, 및 포로스® XS); 술포이소부틸 기반 군 (예를 들어, EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD S03"); 술폭시 에틸 기반 군 [예를 들어, 와트만(Whatman)으로부터의 SE52, SE53 및 엑스프레스-이온(Express-Ion) S], 카르복시메틸 기반 군 [예를 들어, GE 헬스케어로부터의 CM SEPHAROSE® 패스트 플로우, 바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)로부터의 히드로셀 CM, 바이오래드로부터의 MACRO-PREP® CM, 펄 테크놀로지로부터의 세라믹 하이퍼D CM, TRISACRYL® M CM, TRISACRYL® LS CM, 밀리포어로부터의 매트렉스 CELLUFINE® C500 및 C200, 와트만으로부터의 CM52, CM32, CM23 및 엑스프레스-이온 C, 토소로부터의 TOYOPEARL® CM-650S, CM-650M 및 CM-650C]; 술폰산 및 카르복실산 기반 군 [예를 들어, J.T. 베이커(Baker)로부터의 BAKERBOND® 카르복시-술폰]; 카르복실산 기반 군 [예를 들어, J.T. 베이커로부터의 WP CBX, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈(Dow Liquid Separations)로부터의 DOWEX® MAC-3, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 약 양이온 교환기, DOWEX® 약 양이온 교환기, 및 DIAION® 약 양이온 교환기 및 EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD COO-]; 술폰산 기반 군 [예를 들어, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 SP, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈로부터의 DOWEX® 미세 메쉬 강산 양이온 수지, J.T. 베이커로부터의 UNOsphere S, WP 술폰산, 사르토리우스(Sartorius)로부터의 SARTOBIND® S 막, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 강 양이온 교환기, DOWEX® 강 양이온 및 DIAION® 강 양이온 교환기]; 및 오르토포스페이트 기반 군 (예를 들어, 와트만으로부터의 PI 1) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 실시양태의 가장 바람직한 측면에서, 양이온 교환 크로마토그래피를 위해 사용된 수지는 프락토겔(Fractogel)® EMD SO3 -, 프락토겔® EMD SE 하이캡 (머크), CMM 하이퍼셀™ [펄 코포레이션(Pall Corporation)], 캅토 S ImpAct이다. 제5 실시양태의 또 다른 측면에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 대한 프로세스 파라미터는 사전 평형 완충액 [200 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2]; 평형 완충액 [10 mM 시트레이트 완충제; 폴리소르베이트 80 (0.025% (w/v)); pH 6.0 ± 0.2]; 중화를 위한 낮은 pH 유지; 세척 완충액 A [10 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2]; 세척 완충액 B [20 mM 시트레이트 완충제; 300 - 500 mM NaCl; pH 6.0 ± 0.2]; CIP 완충액 [0.5 M NaOH]; 체류 시간 [4.00 - 7.00분]; 사용된 컬럼 [XK26]을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
제5 실시양태의 제8 측면에서, 바이러스 불활성화된 용출액은 음이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 크로마토그래피 수지 및 완충액 조건을 포함한 크로마토그래피 파라미터는, 치료용 단백질이 관류에서 용출되는 동안 모든 음전하를 띤 불순물이 막과 결합되는 방식으로 선택된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 DEAE 셀룰로스, 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50, 사르토리우스로부터의 SARTOBIND® Q, 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX SEPHAROSE® 패스트 플로우, Q SEPHAROSE, Q SEPHAROSE® 고 성능, QAE SEPHADEX® 및 FAST Q SEPHAROSE® (GE 헬스케어), J.T. 베이커로부터의 WP PEI, WP DEAM, WP QUAT, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA, 바이오래드로부터의 U Osphere Q, MACRO-PREP® DEAE 및 MACRO-PREP® 하이 Q, 펄 테크놀로지로부터의 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, TRISACRYL® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA SPHEROSIL® LS, QMA SPHEROSIL® M 및 MUSTANG® Q, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈로부터의 DOWEX® 미세 메쉬 강 염기 유형 I 및 유형 II 음이온 수지 및 DOWEX® MONOSPHER E 77, 약 염기 음이온, 밀리포어로부터의 INTERCEPT® Q 막, 매트렉스 CELLUFINE® A200, A500, Q500, 및 Q800, EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD DEAE 및 FRACTOGEL® EMD DMAE, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DOWEX® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DIAION® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DUOLITE®, 토소로부터의 TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, TOYOPEARL® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C, 와트만으로부터의 QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 엑스프레스-이온 D 및 엑스프레스-이온 Q 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되며; 보다 바람직하게 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 사르토빈드 Q (사르토리우스), 에슈무노 Q (머크), MUSTANG® Q (펄 코포레이션) 및 포로스 X (써모)로부터 선택된다. 제5 실시양태의 또 다른 측면에서, 음이온 교환 크로마토그래피에 대한 프로세스 파라미터는 세정 완충액 [0.5M NaOH]; 사전 평형 완충액 [200 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2]; 평형 완충액 [20 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2; 및 임의로 0.025% 폴리소르베이트 80]; 저장 완충액 [0.1 M NaOH]; 선형 유속 [10 - 500 cm/hr, 보다 특히 100-150 cm/hr]; 사용된 컬럼 [XK26]을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
전술한 실시양태의 정제 프로세스는 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 소수성 전하 유도 크로마토그래피, 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 멀티모달 크로마토그래피 (캅토 MMC 및 캅토 어드히어), 막 크로마토그래피 [인터셉트™ (밀리포어), 무스탕® (펄 코포레이션) 및 사르토빈드™ (사르토리우스))를 포함한 Q 막] 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부가의 크로마토그래피 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제5 실시양태의 제9 측면에서, 바이러스 입자는 20 nm 필터를 사용함으로써 제거되었다. 바이러스 입자의 제거를 위하여 사용된 필터는 바이레솔브(Viresolve) PRO (머크), 플라노바(Planova) 20N [아사히 카세이(Asahi Kasei)], 바이오 EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 [펄 라이프 사이언스(Pall Life Sciences)], 및 바이로사르트 (사르토리우스), 사르토리우스로부터의 바이로사르트 CPV 필터, 밀리포어로부터의 바이로솔브(Virosolve), 펄(Pall)로부터의 울티포르(Ultipor) DV20 또는 DV50, 아사히로부터의 플라노바 20N 및 50N 또는 바이오엑스의 군으로부터 선택된 바이러스 유지 필터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에서는, 바이러스에 대한 유지 용량을 갖는 임의의 다른 필터가 이러한 단계에서 사용될 수 있다는 것이 매우 널리 이해되며; 바람직하게 바이러스 입자의 제거를 위해 사용된 필터는 바이레솔브 PRO (머크), 바이오 EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (펄 라이프 사이언스), 및 바이로사르트 (사르토리우스)로부터 선택된다.
제5 실시양태의 제10 측면에서, 치료용 단백질은 원하는 농도로 농축되고, 완충액은 제제 완충액에서 교환되었다. 완충액은 접선 유동 여과 시스템 또는 한외 유동 여과 시스템에서 교환된다. 접선 유동 여과의 다른 파라미터는 정용 여과 완충액 [25 mM 히스티딘 완충제; 75 mM 아르기닌 완충제; 50 - 150 mM NaCl; pH 6.50 ± 0.5]; 세정 완충액 [0.5 M NaOH]; 저장 완충액 [0.1 M NaOH]을 이용하는 정용 여과; 5 - 10 X 막 용적을 이용하는 평형; 10 - 20 정용 여과 용적을 이용하는 농축 및 정용 여과; 3 - 5 막 용적을 이용하는 WFI 세척; 0.5 - 1.0 M NaOH를 이용하는 세정; 저장 [0.1M NaOH]으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 접선 유동 여과는 센트라메이트(Centramate) T 시리즈 PES 막 (펄 코포레이션), 히드로사르트(Hydrosart) (사르토리우스), 및 펠리콘(Pelicon) 3 (머크) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 30 kDa MWCO 막을 사용하여 수행된다.
본 발명의 제6 실시양태에서, 상기 정제된 치료용 단백질은 제약 부형제와 함께 제제화되며, 여기서 제제의 오스몰랄농도는 300 mOsm/Kg 내지 500 mOsm/Kg의 범위이고, 제제의 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제6 실시양태의 제1 측면에서, 치료용 단백질 제제는 적어도 하나의 항원 결합 단백질, 적어도 하나의 안정화제, 적어도 하나의 완충제, 적어도 하나의 장성 작용제, 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 임의로, 제제는 보존제를 포함한다.
제6 실시양태의 제2 측면에서, 안정화제는 탄수화물이다. 안정화제는 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 만니톨, 덱스트란, 이노시톨, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 크실로스, 만노스, 말토스, 라피노스 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되며; 보다 바람직하게 안정화제는 수크로스이다. 이러한 실시양태의 또한 또 다른 측면에서, 안정화제는 약 0.1% 내지 약 2.5% w/v의 농도 하의 수크로스, 바람직하게 <1% 수크로스 w/v를 포함한다.
제6 실시양태의 제3 측면에서, 완충제는 히스티딘, 아르기닌, 글리신, 시트르산 나트륨, 인산 나트륨, 시트르산, HEPES, 아세트산 칼륨, 시트르산 칼륨, 인산 칼륨, 아세트산 나트륨, 중탄산 나트륨, 트리스 염기, 또는 트리스-HCl, 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 완충제는 약 5.5 내지 7.5, 약 6.0 내지 7.0, 약 6.3 내지 약 6.8, 또는 약 6.5의 pH를 제공한다.
제6 실시양태의 제4 측면에서, 완충제는 히스티딘이다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도 하의 히스티딘을 포함한다. 이러한 실시양태의 가장 바람직한 측면에서, 완충제는 약 25 mM의 농도 하의 히스티딘을 포함한다.
제6 실시양태의 제5 측면에서, 완충제는 아르기닌이다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 50 mM 내지 약 150 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM의 농도 하의 아르기닌을 포함한다. 이러한 실시양태의 가장 바람직한 측면에서, 완충제는 약 70 내지 80 mM의 농도 하의 아르기닌을 포함한다.
제6 실시양태의 제6 측면에서, 장성 작용제는 염화나트륨, 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 및 염화칼륨 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 장성 작용제는 염화나트륨을 포함하고, 이는 약 10 mM 내지 약 500 mM의 농도 하에; 바람직하게 약 50 mM 내지 약 250 mM의 농도 하에; 가장 바람직하게 약 100 - 145 mM의 농도 하에 존재한다.
제6 실시양태의 제7 측면에서, 계면활성제는 약 0.001 내지 약 0.2%(w/v)의 농도 하에 존재하고; 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트-20 또는 폴리소르베이트-80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT® 시리즈 [모나 인더스트리즈, 인크. (Mona Industries, Inc.; 미국 뉴저지주 패터슨)], 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스, PF68 등) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함하고, 이는 약 0.001% 내지 약 0.2% w/v의 농도 하; 바람직하게 약 0.002% 내지 약 0.02%; 약 0.005% 내지 약 0.02%의 농도 하, 가장 바람직하게 약 0.02%의 농도 하에 존재한다.
제6 실시양태의 제8 측면에서, 상기 제제는 약 1 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 50 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 40 mg/L의 농도 하의 치료용 단백질을 포함한다. 바람직하게 상기 제제는 약 1 mg/L 내지 약 50 mg/L의 농도 하의 치료용 단백질을 포함한다.
제6 실시양태의 제9 측면에서, 상기 제제는 보존제를 추가로 포함하고, 이러한 보존제는 벤질 알콜, m-크레솔, 및 페놀을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제7 실시양태에서, 치료용 단백질 제제는 적어도 하나의 치료용 단백질, 수크로스, 아르기닌, 히스티딘, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80을 포함한다. 바람직하게 치료용 단백질 제제는 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 치료용 단백질; 약 20 mM 내지 약 mM mg/ml의 히스티딘; 약 50 mM 내지 약 100 mM의 아르기닌; 약 0.002% 내지 약 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 약 50 mM 내지 약 150 mM NaCl; 및 <2.5% 수크로스 w/v를 포함한다. 이러한 제제의 pH는 6.0 내지 약 7.0의 범위이고, 제제의 오스몰랄농도는 300 mOsm/Kg 내지 약 450 mOsm/Kg의 범위이다.
제7 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 제약 제제는 2 - 80 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; 여기서 상기 제제의 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제7 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 제약 제제는 25 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; 여기서 상기 제제의 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제7 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 제약 제제는 50 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스를 포함하며; 여기서 상기 제제의 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제7 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 제약 제제는 2 - 80 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; 여기서 상기 제제 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제7 실시양태의 바람직한 측면 중 하나에서, 제약 제제는 25 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; 여기서 상기 제제의 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제약 제제는 50 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; 여기서 상기 제제의 pH는 6.5 ± 0.5이고, 오스몰랄농도는 380 mOsm/Kg이며, 점도는 2.5 mPa-S 미만이다.
제7 실시양태의 또 다른 측면에 따라서, 항체의 상기 제약 제제는 동결 건조된 제제일 수 있었다.
본 발명의 제8 실시양태에서, 치료용 단백질의 친화성 및 효력은 ELISA 또는 유동 세포계수법 중 하나 이상에 의해 측정된다. 제8 실시양태의 바람직한 측면에서, 간접 ELISA 기반 방법은 특이적 항원에 대한 치료용 단백질의 결합을 정량화하기 위해 사용된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 뎅기열 Mab 제제는 뎅기열 바이러스의 모든 혈청형에 대항하여 시험되고, 뎅기열 mAb의 양이 결정된다. 치료용 단백질은 효력은 참조 표준과 비교하여 % 활성으로서 보고된다. 임의의 다른 유사한 방법이 치료용 단백질의 효력 및 친화성을 입증하는데 사용될 수 있다는 것은 매우 널리 이해되고 있다.
본 발명의 제9 실시양태에서, 초점 감소 중화 시험 (PRNT / FRNT) 또는 관련 시험이 치료용 단백질에 의한 바이러스 활성의 중화를 평가하기 위해 수행된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 뎅기열 mAb 제제는 뎅기열 바이러스의 모든 혈청형에 대항하여 시험되고, EC50 값은 뎅기열 바이러스의 중화에 관하여 계산된다. 임의의 다른 유사한 방법이 치료용 단백질의 중화 활성을 입증하기 위해 사용될 수 있다는 것은 매우 널리 이해되고 있다.
본 발명의 제10 실시양태에서, HPLC 기반 크기 배제 크로마토그래피는 치료용 단백질 제제에서 응집체의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 페노메넥스(Phenomenex) Bio-Sec-S 3000 컬럼을 사용하여 뎅기열 mab 제제의 응집체 및 단량체 백분율을 입증한다. 임의의 다른 유사한 방법이 치료용 단백질 제제에서의 응집체의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다는 것은 매우 널리 이해되고 있다.
본 발명의 제11 실시양태에서, 상기 제제는 적합한 용기에 저장될 수 있다. 이러한 용기는 병, 바이알, IV 봉지, 착용형 주사기, 볼루스 주사기, 주사기, 펜, 펌프, 복수회 투여 바늘 주사기, 복수회 투여 펜, 주사기, 시레트, 자기 주사기, 미리 채워진 주사기 또는 그의 조합으로부터 선택될 수 있다.
적어도 하나의 1차 패키징 성분은 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PETG), 고 점도 폴리에틸렌 (HDPE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리펜타플루오로스티렌 (PFS), 폴리카르보네이트, 폴리비닐 클로라이드 (PVC), 폴리올레핀, 폴리시클로펜탄 (CZ.RTM.), 환상 올레핀 공중합체 (COC), 및 그의 조합 또는 공중합체로부터 선택된 용기 마개를 포함한다.
본원에 개시된 항-뎅기열 항체 또는 항-광견병 항체 제제는 뎅기열 또는 광견병 바이러스를 치료, 예방 및/또는 진단하기 위해 사용될 수 있다 (단독으로 사용되거나 또는 다른 작용제 또는 치료 방법과 조합하여 사용된다). 예를 들어, 조합 요법은 하나 이상의 부가의 치료제, 예를 들어, 항바이러스제 (다른 항-뎅기열 항체 포함), 백신 (뎅기열 바이러스 백신 포함), 또는 면역 반응을 증강시키는 작용제와 공동 제제화되고/되거나 상기 부가의 치료제와 공동 투여되는 항-뎅기열 항체 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 항체 분자는 다른 치료적 처치 방법, 예컨대 정맥내 수화, 해열제 (예컨대 아세트아미노펜) 또는 수혈과 조합하여 투여된다. 이러한 조합 요법은 유리하게, 투여된 치료제의 더 낮은 투여량을 활용하므로, 다양한 단독 요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
실시예:
실시예 1: 치료용 단백질, 즉 뎅기열 (VIS513) 모노클로날 항체의 세포 배양 및 발현을 위한 상류 프로세스
프로토콜:
발효/상류 프로세스 동안 하기 언급된 파라미터를 사용하여 공급 배치식 방식으로 10 L 규모의 세포 배양을 수행하였다.
뎅기열 모노클로날 항체는 비스테라 인크.(Visterra Inc.) USA로부터 수득된 세포주 "CHO - K1 SV GS-KO"에서 발현되었다.
· 치료용 단백질, 즉 뎅기열 모노클로날 항체의 세포 성장 및 발현을 위해 사용된 세포 배양 배지는 1X 셀벤토™ CHO-220 액상 배지였다.
· 글루코스, 셀 부스트™ 5 보충제 (하이클론), 엑스-셀 293 (시그마 알드리치), 셀 부스트 7a 및 7b 보충제 (하이클론), 3X 악티프로 (하이클론), 셀 벤토 220 (3X 배지), 엑스-셀® 어드밴스드™ CHO 피드 1을 포함하는 군으로부터 선택된 피드 용액 A, 피드 용액 B, 피드 용액 C, 피드 용액 D를, 보충 피드용으로 사용하였다.
· 발효 배지의 pH를 6.7 내지 7.5 하로 유지시켰다.
· 발효 배지의 오스몰랄농도를 <490 mOsm/Kg 하에 유지시켰다.
· 발효 배지의 용존 산소를 약 20% 내지 약 40% 하에 유지시켰다.
· 발효 배지의 온도를 36.5 ± 0.5 하에 유지시켰다.
· 세포 계수치가 60%로 떨어지면 배양물을 수거하였다.
피드 보충은 하기 표 1에 따라 점진적인 점적 방식으로 행해졌다:
<표 1>
Figure pct00001
결과 & 결론:
발효 프로세스 동안 수득된 생육성 콜로니 계수치 및 산출량은 하기과 같다:
<표 2>
발효 프로세스 동안 수득된 생육성 콜로니 계수치 및 산출량
Figure pct00002
본 출원인은 기초 배지, 농축된 기초 배지를 피드 용액으로서 포함하는 세포 배양 프로세스를 사용함으로써, 명확한 피딩 전략과 함께 피드 용액을 사용하고, 증강된 세포 성장과 보다 낮은 농도의 락테이트와 암모니아가 수득될 수 있으며, 이로써 세포 계수치를 효과적으로 유지시킬 수 있고 세포 수명과 높은 산출량을 증가시킬 수 있다는 사실을 밝혀냈다. 발효 프로세스에서 4 gm/L 초과의 산출량이 수득되었다. 수득된 수거물을 추가로 정제/하류 프로세싱하였다.
실시예 2:
실시예 1에서 수득된 세포 배양물을 수거하고, 나중에 이를 대상으로 도 1에 따라 뎅기열 (VIS513) 모노클로날 항체의 정제를 위한 프로토콜을 수행하였다.
사용된 상세한 프로세스는 하기와 같다:
단백질-A 친화성 크로마토그래피:
이러한 단계에서는 표적화된 모노클로날 항체를 상기 수거된 상등액 내의 배지 성분으로부터 분리하였다. 정화된 상등액을 크로마토그래피 컬럼 내로 통과시킨 다음 화합성인 용출 완충액을 사용하여 용출시켰다.
사용된 재료:
수지 (매트릭스): Mab 셀렉트 슈어/에슈무노 A (단백질-A 친화성))
체류 시간: 4.0-8.0분
사용된 컬럼: XK 26
평형 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 150 mM NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 I 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 150 mM NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 II 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 1 M NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 III 완충액: 10 mM 인산염 완충제 + 125 mM NaCl + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0±0.2.
용출 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제 + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 3.0±0.2.
CIP 완충액: 0.1 M NaOH
사용된 프로세스 파라미터:
<표 3>
Figure pct00003
1. 낮은 pH 바이러스 불활성화
i. 단백질-A 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액을 낮은 pH, 즉 3.5±0.1로 60±10분 동안 처리하여 바이러스 입자를 불활성화시켰다.
ii. 낮은 pH 유지 후, 용출액을 중화 완충액, 즉 pH 7.0±0.2를 갖는 1 M 트리스/시트레이트 완충제를 사용하여 중화시켰다.
iii. 중화된 용출액의 전도도는 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80을 수반한 WFI를 사용하여 조정하였다.
2. 양이온 교환 크로마토그래피
음전하를 띤 항체 분자가 관류에 들어오는 동안 양전하를 띤 항체 분자는 컬럼과 결합되었다. 컬럼 결합된 항체 분자는 염 구배를 이용하여 용출된다.
사용된 재료:
사용된 수지: 프락토겔 SO3-/ 프락토겔 SE 하이캡 (머크)
체류 시간: 4.00-7.00분
사용된 컬럼: XK 26
사전 평형: 200 mM 시트레이트 완충제 pH 6.0±0.2.
평형: 10 mM 시트레이트 완충제 + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0±0.2.
부하: 중화된 낮은 pH 유지
세척 완충액 A: 10 mM 시트레이트 완충제, pH 6.0±0.2.
세척 완충액 B: 20 mM 시트레이트 완충제 + 300 mM NaCl, pH 6.0±0.2.
CIP 완충액: 0.5 M NaOH
저장 완충액: 0.1 M NaOH
프로세스 파라미터:
<표 4>
Figure pct00004
구배 동안 분획 수집
<표 5>
Figure pct00005
음이온 교환 크로마토그래피:
항체가 관류에 들어오는 동안 모든 음전하를 띤 불순물이 막과 결합된다.
사용된 재료:
사용된 막/수지: 사르토빈드 Q 단일 Sep 미니 (사르토리우스)/에슈무노 Q
부하 컬럼: 150 mg/mL-1000 mg/mL
사용된 컬럼: XK 26
세정 완충액: 0.5 M NaOH
사전 평형 완충액: 200 mM 시트레이트 완충제, pH 6.0 ±0.2.
평형 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제 pH 6.0±0.2 ; 및 임의로 0.025% PS-80 pH 6.0±0.2
저장 완충액: 0.1 M NaOH
프로세스 파라미터:
<표 6>
Figure pct00006
3. 나노 여과:
20 nm 나노 필터, 즉 바이레솔브 PRO (머크)를 사용하여, 치료용 단백질 내에 이용 가능한 어떠한 바이러스 입자도 제거하였다.
4. 접선 유동 여과 / 한외 유동 여과:
항체를 원하는 농도로 농축시키고, 완충액을 3가지 제제 완충액 중 하나에서 교환시켰다.
사용된 재료:
제제 완충액:
· 완충액 1: 25 mM 히스티딘 완충제 + 75 mM 아르기닌 완충제 + 75 mM NaCl, pH 6.50 ± 0.25;
· 완충액 2: 25 mM 히스티딘, 75 mM 아르기닌, 101 mM NaCl;
· 완충액 3: 25 mM 히스티딘, 75 mM 아르기닌, 75 mM 내지 101 mM NaCl, 폴리소르베이트-80 0.002% w/v
· 세정 완충액: 0.5 M NaOH
저장 완충액: 0.1 M NaOH
사용된 막: PALL 센트라메이트 T 시리즈, PES 막 MWCO: 30 kDa
프로세스 파라미터:
<표 7>
Figure pct00007
멸균 여과
안정화제를 항체 용액에 부가하고, 0.2 μ 필터를 통해 멸균 여과시켰다.
결과:
정제 프로세스에서 사용되는 다양한 단계의 단계별 회수율.
<표 8>
Figure pct00008
전반적인 프로세스 회수율은 약 80%인 것으로 밝혀졌고, 전반적인 순도는 >99%인 것으로 밝혀졌다.
<표 9>
불순물 데이터
Figure pct00009
<표 10>
배치별 회수율 & 순도
Figure pct00010
실시예 3:
정제된 뎅기열 (VIS513) 모노클로날 항체가 하기와 같이 제제화되었다:
부형제, 즉 아르기닌, 히스티딘, NaCl, 수크로스, 및 폴리소르베이트-80을 부가하고, 50-60 RPM 하에 자기 교반기를 사용하여 철저하게 혼합하여 부형제의 혼합물을 형성시켰다. 이어서, 이러한 혼합물을 교반 속도 50-60 RPM으로 점진적으로 뎅기열 mAb TFF 수거물 내로 부가하였다. pH를 검사하고 (pH 6.5), 필요한 경우 히스티딘-아르기닌 완충제에 의해 조정하였다. 최종 제제를 0.2 μM 필터를 통해 여과하고 최종 용기 내로 충전하였다.
최종 제제 내의 각각의 성분의 농도는 하기와 같다:
<표 11>
Figure pct00011
이들 제제를 9개월 동안 순도, 안정성, 효능 및 효력에 관하여 추가로 시험하였다.
실시예 4:
VIS513 뎅기열 항체 제제 내에서의 수크로스의 존재의 효과는 DV1의 EDIII 단백질에 대한 ELISA 검정에 의해 효력을 시험하기 위해 연구되었다. 제제 연구는 온도 2 - 8℃, 25℃, 및 40℃에 대하여 행해졌다.
결과 :
1. 수크로스를 수반하지 않은 VIS513 뎅기열 항체 제제
<표 12>
Figure pct00012
2. 수크로스를 수반한 VIS513 뎅기열 항체 제제
<표 13>
Figure pct00013
참조 표준 제제 조성:
Figure pct00014
결론: 0.5% w/v의 부가가 수크로스를 수반하지 않은 상응하는 샘플링 포인트와 비교 시 안정성을 개선시킨다.
실시예 5:
VIS513 항체 제제를 40℃ 하에 20일 동안 저장하고, 나중에 VIS513의 효력을 ELISA 시험에 의해 평가하였다. 증가하는 수크로스 강도의 효과를 40℃ 하에 VIS513 항체 제제 상에서 연구하였으며, 여기서 0.1, 0.2 및 0.5%의 수크로스 농도를 평가하였다.
결과:
<표 14>
Figure pct00015
<표 15>
Figure pct00016
<표 16>
Figure pct00017
<표 17>
Figure pct00018
참조 표준 제제 조성:
Figure pct00019
결론: 0.5% 수크로스를 포함하는 제제에서 가장 높은 안정성이 관찰되었다.
실시예 6:
하기 하에서의 저장을 이용한 뎅기열 (VIS513) Mab 제제의 순도, 안정성, 효능 및 효력에 관한 분석적 시험
· 0개월, 3개월, 6개월, 및 9개월의 기간 동안 2-8℃
· 0일 및 30일의 기간 동안 25℃
· 0일, 7일, 14일, 28일, 35일, 및 42일의 기간 동안 40℃.
6.1 : VIS513 항체 제제의 효력은 간접 ELISA에 의해 시험되었다.
DV1 항원의 EDIII 단백질에 대한 뎅기열 Mab (VIS513)의 결합을 정량화하기 위해 간접 ELISA 기반 방법을 사용하였다. EDIII 단백질을 플레이트에 고정화시켰다. 결합되지 않은 항원은 세척에 의해 제거되었다. 그 다음, 단계 표준 및 시험 샘플을 부가하여 항원에 결합시켰다. 결합된 Dv-Mab의 양을 결정하기 위해, Dv-Mab (인간 이뮤노글로불린 Fc 단편)에 특이적인 마우스 항-인간 IgG Fc-HRP를 사용하여 Dv-Mab의 존재를 인식하였다. 검정은 450 nm에서 형성된 색상의 양에 따라 결합 정도를 정량화하는 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 시스템으로 전개되었다. 데이터 분석 소프트웨어는 4개의 파라미터 곡선 피팅 모델을 사용하여 각각의 샘플에 대한 결합 곡선을 생성하였고, 상대적 효력을 계산함으로써 시험 샘플의 결합 곡선을 표준 곡선과 비교하였다. 시험 샘플의 효력은 참조 표준과 비교한 % 활성 (상대적 효력 100)으로서 보고된다.
결과:
<표 18>
2 - 8℃ 하에 저장된 제제에 대한 간접 ELISA에 의한 뎅기열 (VIS513) Mab 효력 (%)
Figure pct00020
<표 19>
25℃ 하에 저장된 제제에 대한 간접 ELISA에 의한 뎅기열 (VIS513) Mab 효력 (%)
Figure pct00021
<표 20>
40℃ 하에 저장된 제제에 대한 간접 ELISA에 의한 뎅기열 (VIS513) Mab 효력 (%)
Figure pct00022
뎅기열 (VIS513) mab 제제는 결합 친화성의 어떠한 시간 의존적 상실도 나타내지 않았다.
6.2 : EC50을 결정하는 PRNT 검정
본 검정은 일련으로 희석된 항체를 바이러스와 미리 혼합하여 항체 결합을 허용하고, 중화 후 혼합물을 Vero 세포 단층으로 옮기고, 점성 배지로 덮고, 인큐베이션 (바이러스 혈청형에 따라 약 3-7일)하여 제한된 바이러스 복제 및 확산에 이어 플라크의 검출을 허용한다. 중화는 플라크 형성의 감소에 의해 포착되었다. 강력한 검출은 마우스 4G2 항-뎅기열 항체 및 HRP 표지된 염소 항-마우스 항체를 퍼옥시다제 기질과 함께 사용하여, 면역 염색 방법을 이용하여 달성되었다.
뎅기열 (VIS513) Mab 제제 샘플은 뎅기열 바이러스의 4가지 혈청형 모두, 즉 DV1, DV2, DV3 및 DV4에 대항하여 시험되었다. EC50 값은 뎅기열 바이러스의 중화를 위해 계산되었다. EC50 값은 뎅기열 바이러스의 유효한 중화에 필요한 50% 유효 농도를 나타내고, EC50 값은 바이러스 대조군 웰에 존재하는 플라크의 수 및 mab-바이러스 인큐베이션된 샘플이 부가된 웰 내의 플라크의 수로부터 계산되었다.
결과:
<표 21>
2 - 8℃ 하에 저장된 제제에 대한 PRNT 검정에 의한 뎅기열 (VIS513) mAb EC50 (ng/ml) 값.
Figure pct00023
<표 22>
25℃ 하에 저장된 제제에 대한 PRNT 검정에 의한 뎅기열 (VIS513) Mab EC50 (ng/ml) 값.
Figure pct00024
<표 23>
40℃ 하에 저장된 제제에 대한 PRNT 검정에 의한 뎅기열 (VIS513) Mab EC50 (ng/ml) 값.
Figure pct00025
뎅기열 (VIS513) mab 제제는 2-8℃ & 25℃ 하에 바이러스 중화 효능의 어떠한 시간 의존적 상실도 나타내지 않았다. 40℃ 하에 유지시킨 경우에도 VIS513 제제는 뎅기열 바이러스를 중화시킬 수 있는 능력을 상실하지 않는다.
6.3 : 응집 및 순도 분석
HPLC 기반 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC-SEC)를 사용하여 DV Mab의 벌크 및 최종 제제 내의 응집체를 평가하였다. 이러한 방법에서는, 페노메넥스 Bio-Sec-S 3000 컬럼을 사용하여, 약 50 ug의 전체 항체를 주사함으로써 뎅기열 (VIS513) Mab의 응집체 및 단량체 백분율을 명확하게 보여주었고 35분 동안 1 ml/분의 유속으로 실행하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 6.5를 이동 상으로서 사용하였다.
결과: SEC-HPLC (허용 범위는 NLT 90%이다)
<표 24>
2 - 8℃ 하에 저장된 제제의 SEC-HPLC 분석
Figure pct00026
<표 25>
25℃ 하에 저장된 제제의 SEC-HPLC 분석
Figure pct00027
<표 26>
40℃ 하에 저장된 제제의 SEC-HPLC 분석
Figure pct00028
뎅기열 (VIS513) mab 제제는 어떠한 유의적인 시간 의존적 응집도 나타내지 않았고; 순도/단량체 함량은 >98%인 것으로 밝혀졌다.
실시예 7:
제제의 계면활성제 농도의 효과:
계면활성제 농도의 효과는 육안으로 보이지 않는 입자 분석에 의해 평가되었다. 폴리소르베이트-80 강도가 다양한 제제를 제조하고, 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 위해 분석하였다.
<표 27>
Figure pct00029
결론:
0.005% w/v 폴리소르베이트-80을 함유하는 제제에서는 최소한의 육안으로 보이지 않는 입자가 관찰되었다. 용량에 따라서, 상기 제제가 희석을 요하는 경우, 폴리소르베이트 80 강도는 0.02% w/V로 4배 차이로 확정되었다.
실시예 8: 사용된 안정화제의 최소 농도의 결정 연구
요구되는 최소 완충액 강도 (10-30 mM)는 이용 가능한 문헌에서 언급되었다. 최소 아르기닌 (가용화제 및 점도 감소제로서 사용됨)을 확인하기 위해, Mab 샘플을 정상 식염수로 완충제 교환하고 아르기닌 원액 (300 mM)을 점진적으로 부가하였다. 용액의 응집은 OD@ 350 nm를 측정함으로써 모니터링하였다. 75 mM 아르기닌을 수반한 식염수는 가장 낮은 OD를 나타내므로, 75 mM 아르기닌이 확정되었다.
실시예 8
뎅기열 (VIS513) 항체 제제의 점도 연구
DV mab 샘플의 점도는 기기 매뉴얼에 언급된 절차에 따라 마이크로칩 기반 점도계, 모델: 마이크로VISCTM [제조사: 레오센스 (RheoSense; 미국 캘리포니아주)] 상에서 측정되었다.
<표 28>
Figure pct00030
결론:
점도에 있어서의 시간 의존적 증가는 2-8℃ 하에 90일 동안 저장된 mab 제제에서 관찰되지 않았고, 또한 25℃ 하에 1개월 동안 유지된 샘플에서도 관찰되지 않았는데, 이는 주로 부형제인 아르기닌 75 mM에 기인한다. 본 발명자들의 제제의 점도는 1.1 내지 1.2 mPa-S/cP인 것으로 밝혀졌으며, 이는 점도가 11-50 mPa-S/cP인 다른 시판 제제보다 더 낮다.
실시예 9: 뎅기열 (VIS513) mAb 정제 프로세스에 대한 바이러스 스파이킹 연구
모노클로날 항체의 제조 프로세스에서 바이러스 여과에 의한 바이러스 제거의 유효성을 시험하기 위해, 실제 제조 프로세스에 대하여 바이러스 검증을 수행하였다.
뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV) 및 마우스의 미세 바이러스 (MMV/MVM)를 모델 유기체로서 사용하였다. 본 발명의 발명자들은 자신의 발명적 정제 프로세스의 능력을, 모노클로날 항체 정제의 일반적 및 널리 확립된 방법의 능력과 비교하였다.
모노클로날 항체 정제의 일반적 및 널리 확립된 방법은 단백질-A 친화성 크로마토그래피 (GE 수지); 낮은 pH 처리; 사르토빈드 Q 크로마토그래피 (음이온 교환 막, 사르토리우스, 1회용); 사르토빈드 페닐 크로마토그래피 (막 크로마토그래피, 사르토리우스, 1회용); 바이레솔브 프로 여과 (나노 여과, 머크)를 포함하였다.
<표 29>
Figure pct00031
결과: SIIPL 정제 프로세스는 바이러스 제거에서 매우 효율적이었으며, 달성 된 총 LRV는 ICH 가이드라인에 따른다 (표준 프로세스 LRV 12.64, SIIPL 발명적 프로세스 23.74). 본 발명의 프로세스를 사용하여 정제된 뎅기열 항체는 어떠한 바이러스 위험도 없이 인간 임상 시험에 적합한 것으로 밝혀졌다.
실시예 10: 치료용 단백질, 즉 광견병 모노클로날 항체의 세포 배양 및 발현을 위한 상류 프로세스
프로토콜:
발효/상류 프로세스 동안 하기 언급된 파라미터를 사용하여 공급 배치식 방식으로 2 L 규모의 세포 배양을 수행하였다.
· 광견병 모노클로날 항체는 세포주 "GS - CHO"에서 발현되었다.
· 치료용 단백질, 즉 광견병 모노클로날 항체의 세포 성장 및 발현을 위해 사용된 세포 배양 배지는 "1X 셀벤토™ CHO-220 액상 배지" 또는 "악티프로 1x (하이클론)"였다.
· 글루코스, 셀 부스트™ 5 보충제 (하이클론), 엑스-셀 293 (시그마 알드리치), 셀 부스트 7a 및 7b 보충제 (하이클론), 3X 악티프로 (하이클론), 셀 벤토 220 (1X 배지), 엑스-셀® 어드밴스드™ CHO 피드를 포함하는 군으로부터 선택된 피드 용액 A, 피드 용액 B, 피드 용액 C, 피드 용액 D를, 보충 피드용으로 사용하였다.
· 발효 배지의 pH를 6.5 내지 7.5 하로 유지시켰다.
· 발효 배지의 오스몰랄농도를 270 내지 450 mOsm/Kg로 유지시켰다.
· 발효 배지의 용존 산소를 약 20% 내지 약 60% 하에 유지시켰다.
· 발효 배지의 온도를 36.5 ± 1 하에 유지시켰다.
피드 보충은 하기 표에 따라 점진적인 점적 방식으로 행해졌다:
<표 30>
Figure pct00032
주: 모든 피딩 용액은 ± 1% 만큼 및 ± 1일 만큼 다양할 수 있다.
세포 배양물은 OD가 60% 이하로 떨어질 때 수거하였다.
결과 & 결론:
발효 프로세스에 대하여 3 - 5 gm/L의 산출량이 수득되었다. 수득된 수거물을 대상으로 추가로 정제/하류 프로세싱하였다.
실시예 11:
실시예 9에 따라서 수득된 세포 배양물을 수거하고, 나중에 이를 대상으로 도 1에 따라 광견병 모노클로날 항체의 정제를 위한 프로토콜을 수행하였다.
사용된 상세한 프로세스는 하기와 같다:
단백질-A 친화성 크로마토그래피:
이러한 단계에서는 표적화된 모노클로날 항체를 상기 수거된 상등액 내의 배지 성분으로부터 분리하였다. 정화된 상등액을 크로마토그래피 컬럼 내로 통과시킨 다음 화합성인 용출 완충액을 사용하여 용출시켰다.
사용된 재료:
수지 (매트릭스): Mab 셀렉트 슈어/에슈무노 A (단백질-A 친화성))
체류 시간: 4.0-8.0분
사용된 컬럼: XK 26
평형 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 150 mM NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 I 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 150 mM NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 II 완충액: 20 mM 인산염 완충제 + 1 M NaCl + 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 7.0±0.2.
세척 III 완충액: 10 mM 인산염 완충제 + 125 mM NaCl + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0±0.2.
용출 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제 + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 3.0±0.2.
CIP 완충액: 0.1 M NaOH
사용된 프로세스 파라미터:
<표 31>
Figure pct00033
1. 낮은 pH 바이러스 불활성화
i. 단백질-A 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액을 낮은 pH, 즉 3.5±0.1로 60±10분 동안 처리하여 바이러스 입자를 불활성화시켰다.
ii. 낮은 pH 유지 후, 용출액을 중화 완충액, 즉 pH 7.0±0.2를 갖는 1 M 트리스/시트레이트 완충제를 사용하여 중화시켰다. 연속해서 중화된 용액을, 0.8/0.45 μ 또는 0.8/0.2 μ를 사용하여 여과시켰다.
iii. 중화된 용출액의 전도도는 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80을 수반한 WFI를 사용하여 조정하였다.
2. 양이온 교환 크로마토그래피
음전하를 띤 분자가 관류에 들어오는 동안 양전하를 띤 항체 분자는 컬럼과 결합되었다. 컬럼 결합된 항체 분자는 염 구배를 이용하여 용출된다.
사용된 재료:
사용된 수지: 프락토겔 SO3-/ 프락토겔 SE 하이캡 (머크)
체류 시간: 4.00-7.00분
사용된 컬럼: XK 26
사전 평형: 200 mM 시트레이트 완충제 pH 6.0±0.2.
평형: 10 mM 시트레이트 완충제 + 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.0±0.2.
부하: 중화된 낮은 pH 유지.
세척 완충액 A: 10 mM 시트레이트 완충제, pH 6.0±0.2.
세척 완충액 B: 20 mM 시트레이트 완충제 + 300 mM NaCl, pH 6.0±0.2.
CIP 완충액: 0.5 M NaOH
저장 완충액: 20% 에탄올 + 150 mM NaCl
<표 32>
프로세스 파라미터:
Figure pct00034
<표 33>
구배 동안 분획 수집
Figure pct00035
음이온 교환 크로마토그래피:
항체가 관류에 들어오는 동안 모든 음전하를 띤 불순물이 막과 결합된다.
사용된 재료:
사용된 막/수지: 사르토빈드 Q 단일 Sep 미니 (사르토리우스)/에슈무노 Q
부하 컬럼: 150 mg/mL-1000 mg/mL
사용된 컬럼: XK 26
세정 완충액: 0.5 M NaOH
사전 평형 완충액: 200 mM 시트레이트 완충제, pH 6.0 ±0.2.
평형 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제 pH 6.0±0.2 ; 및 임의로 0.025% PS-80 pH 6.0±0.2
저장 완충액: 20% 에탄올 + 150 mM NaCl 또는 0.1 M NaOH
<표 34>
프로세스 파라미터:
Figure pct00036
3. 나노 여과:
20 nm 나노 필터, 즉 바이레솔브 PRO (머크)를 사용하여, 치료용 단백질 내에 이용 가능한 어떠한 바이러스 입자도 제거하였다.
4. 접선 유동 여과 / 한외 유동 여과:
항체를 원하는 농도로 농축시키고, 완충액을 3가지 제제 완충액 중 하나에서 교환시켰다.
사용된 재료:
제제 완충액:
· 완충액 1: 25 mM 히스티딘 완충제 + 75 mM 아르기닌 완충제 + 75 mM NaCl, pH 6.50 ± 0.25;
· 완충액 2: 25 mM 히스티딘, 75 mM 아르기닌, 101 mM NaCl;
· 완충액 3: 25 mM 히스티딘, 75 mM 아르기닌, 75 mM 내지 101 mM NaCl, 폴리소르베이트-80 0.002% w/v
· 세정 완충액: 0.5 M NaOH
저장 완충액: 20% 에탄올 + 150 mM NaCl 또는 0.1 M NaOH
사용된 막: PALL 센트라메이트 T 시리즈, PES 막 MWCO: 30 kDa
<표 35>
프로세스 파라미터:
Figure pct00037
멸균 여과
안정화제를 항체 용액에 부가하고, 0.2 μ 필터를 통해 멸균 여과시켰다.
결과:
<표 36>
정제 프로세스에서 사용되는 다양한 단계의 단계별 회수율.
Figure pct00038
전반적인 프로세스 회수율은 >80%인 것으로 밝혀졌다.
<표 37>
불순물 데이터
Figure pct00039
<표 38>
배치별 회수율 & 순도
Figure pct00040
정제 후 광견병 mab의 전반적인 순도는 >99%인 것으로 밝혀졌고, 전반적인 회수율은 >80%인 것으로 밝혀졌다.
실시예 12:
정제된 광견병 모노클로날 항체는 도 2에 제공된 플로 차트에 따라 제제화되었다.
부형제, 즉 아르기닌, 히스티딘, NaCl, 수크로스, 및 폴리소르베이트-80을 부가하고, 50-60 RPM 하에 자기 교반기를 사용하여 철저하게 혼합하여 부형제의 혼합물을 형성시켰다. 이어서, 이러한 혼합물을 교반 속도 50-60 RPM으로 점진적으로 뎅기열 mAb TFF 수거물 내로 부가하였다. pH를 검사하고 (pH 6.5), 필요한 경우 히스티딘-아르기닌 완충제에 의해 조정하였다. 최종 제제를 0.2 μM 필터를 통해 여과하고 최종 용기 내로 충전하였다.
최종 제제 내의 각각의 성분의 농도는 하기와 같다:
<표 39>
Figure pct00041
이들 제제를 9개월 동안 순도, 안정성, 효능 및 효력에 관하여 추가로 시험하였다.
실시예 13: 0개월, 1개월, 3개월, & 6개월의 기간 동안 2-8, 25 및 40℃ 하에서의 저장을 이용한 광견병 Mab 제제의 순도 & 안정성에 관한 분석적 시험.
13.1 응집 및 순도 분석
HPLC 기반 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC-SEC)를 사용하여 DV Mab의 벌크 및 최종 제제 내의 응집체를 평가하였다. 이러한 방법에서는, 페노메넥스 Bio-Sec-S 3000 컬럼을 사용하여, 약 50 ug의 전체 항체를 주사함으로써 광견병 Mab의 응집체 및 단량체 백분율을 명확하게 보여주었고 35분 동안 1 ml/분의 유속으로 실행하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 6.5를 이동 상으로서 사용하였다.
결과:
<표 40>
SEC-HPLC (%) 결과
Figure pct00042
광견병 mab 제제는 어떠한 시간 의존적 응집도 나타내지 않았고 순도/단량체 함량은 >99%인 것으로 밝혀졌다.
13.2 SDS Page 분석 배치 1 - 2-8℃ 하에서의 시험 샘플
<표 41>
Figure pct00043
25℃ 하에서의 시험 샘플
Figure pct00044
결론: 광견병 mAb 제제는 응집에 있어서 어떠한 유의적인 시간 의존적 변화도 나타내지 않았고 분자량에 있어서의 변화도 나타내지 않았다. 따라서 상기 제제는 2 - 8℃, 25℃, 및 40℃ 하에 안정적인 것으로 밝혀졌다.
서열_ST25. txt
서열식별번호 1: VIS513 (뎅기열 모노클로날 항체)의 VH 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIKDVYMSWVRQAPEQGLEWMGRIDPENGDTKYD
60
PKLQGRVTMTADTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGWEGFAYWGQGTLVTVSSASTKG
120
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180
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240
FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
300
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
360
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420
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
445
서열식별번호: 2: VIS513 (뎅기열 모노클로날 항체)의 VL 아미노산 서열
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218
서열식별번호: 3: SII RmAb (RAB1) (17c7) 중쇄 아미노산 서열
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서열식별번호: 4: SII RMAb (RAB1) (17C7) 경쇄 아미노산 서열
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LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
219
SEQUENCE LISTING <110> Serum Institute of India Private Limited <120> IMPROVED METHODS FOR ENHANCING ANTIBODY PRODUCTIVITY IN MAMMALIAN CELL CULTURE AND MINIMIZING AGGREGATION DURING DOWNSTREAM, FORMULATION PROCESSES AND STABLE ANTIBODY FORMULATIONS OBTAINED THEREOF <130> 15509-P63PCT <150> 201621044139 <151> 2016-12-23 <150> PCT/IB2017/058194 <151> 2017-12-20 Seq ID 1: VH amino acid sequence of VIS513 (Dengue Monoclonal Antibody) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIKDVYMSWVRQAPEQGLEWMGRIDPENGDTKYD 60 PKLQGRVTMTADTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGWEGFAYWGQGTLVTVSSASTKG 120 PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL 180 SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL 240 FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV 300 VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ 360 VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV 420 FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 445 Seq ID 2: VL amino acid sequence of VIS513 (Dengue Monoclonal Antibody) DIVMTQSPASLAVSLGERATISCRASENVDKYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASELQW 60 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQRSNEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVF 120 IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS 180 STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 218 Seq ID 3: SII RmAb (RAB1)(17C7) Heavy Chain Amino Acid Sequence QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGRTKDY 60 ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVYFCARERFSGAYFDYWGQGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG 180 LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP 240 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS 300 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM 360 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 420 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 449 Seq ID 4: SII RMAb (RAB1)(17C7) Light Chain Amino Acid Sequence EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA 60 RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYSCQQRNNWPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVSVFIF 120 PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST 180 LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219

Claims (89)

  1. a) 세포 배양 생산 배지에서 항원 결합 단백질을 발현하는 포유류 세포를 대규모로 배양하는 단계로, 여기서 이러한 프로세스가 세포 계수치를 효과적으로 유지시키고 적어도 2 gm/L의 산출량을 생성하는 것인 단계;
    b) 단계 (a)에서 수득된 수거된 상등액으로부터 항원 결합 단백질을 정제하는 단계로, 여기서 이러한 프로세스가 적어도 80%의 회수율, 적어도 99%의 순도를 생성하는 것인 단계;
    c) 안정한 제제화 단계로, 여기서 오스몰랄농도가 300 - 400 mOsm/Kg의 범위이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 단계
    를 포함하는, 제약 항원 결합 단백질을 고 산출량 및 최소 응집으로 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 배양 생산 배지에서 항체를 발현하는 포유류 세포를 대규모로 배양하는 것을 포함하며; 여기서 세포 배양 프로세스가 기초 배지의 사용, 피드 용액으로서의 농축된 기초 배지의 사용, 명확한 피딩 전략과 함께 피드 용액의 사용을 포함하고, 증강된 세포 성장을 초래하여, 더 낮은 농도의 락테이트와 암모니아를 유지시키며, 세포 계수치를 효과적으로 유지시킴으로써 세포 수명 및 고 산출량을 증가시키는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세포 배양 배지가 셀 벤토 220 (머크), 악티프로 (하이클론/GE), 깁코™ 다이나미스™ 배지 (써모 피셔)를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 배지를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가, 프로세스 동안 하나 이상의 다른 영양분으로 적어도 1회 보충되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 세포 배양 생산 배지가 연속식, 매일, 격일, 2일마다 및 그의 조합으로 보충되는 것을 포함하는 일정에 따라 보충되는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 세포 배양 생산 배지가 글루코스, 셀 부스트™ 5 보충제 (하이클론), 엑스-셀 293 (시그마 알드리치), 셀 부스트 7a 및 7b 보충제 (하이클론), 3X 악티프로 배지, 셀 벤토 220 (3X 배지), 엑스-셀® 어드밴스드™ CHO 피드 1, 이피시언트피드™ A, 이피시언트피드™ B, 및 이피시언트피드™ C, 및 그의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 배지를 포함하는 피드 용액으로 보충되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포 계수치가 10 x 106 - 20 x 106개 세포/ml의 범위인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 250 - 500 mOsm/Kg의 범위의 오스몰랄농도; 6.5 - 7.5의 범위의 pH를 갖고; 용존 산소가 10 - 60%의 범위로 유지되며; 세포 배양 온도가 30℃ 내지 38℃의 범위이고; 제1 온도가 바람직하게 36 - 37℃ 및 임의로 제2 온도가 바람직하게 30 - 35℃이며; 글루코스 농도가 7% 미만; 바람직하게 4% 내지 5%로 유지되고; 생육력이 80%로 감소될 때 세포 배양물을 수거하며; 여기서 세포 배양 조건이 이차 대사 산물, 예컨대 락테이트 농도가 5 g/L 이하이고; 암모니아 농도가 5 mMol/L 이하인 방식으로 유지되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 발효 배지의 오스몰랄농도가 400 - 500 mOsm/kg인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 발효 배지의 용존 산소가 20 - 40%의 범위에서 유지되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체, 항원 결합 단백질 단편, 폴리클로날, 모노클로날, 디아바디, 나노바디, 1가, 이중특이적, 이종 접합체, 다중특이적, 자기 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab)'2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 에피토프 결합 단편 및 CDR 함유 단편 및 그의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 세포주가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, GS - CHO, CHOK1SV GS-KO, CHO DUX-B11, CHO-K1, BSC-1, NS0 골수종 세포, SV40을 수반하는 기원의 CV-1 (COS) 세포, COS-1, COS-7, P3X3Ag8.653, SP2 세포, 인간 배아 신장 (HEK 293) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK 21) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 VERO-76 세포, HELA 세포, 인간 폐 세포 (W138), 망막 세포, 및 인간 간암 세포주 (Hep G2), VERO, BHK, MDCK, WI38 세포, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (임의의 이뮤노글로불린 쇄를 내생적으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Ag14, 골수종 세포주, 하이브리도마 세포주, 인간 폐 세포 (W138), 망막 세포, 인간 간암 세포주 (Hep G2), CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (문헌 [Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; and Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36:10901-10909]), SH87 세포CHO-DXB11 (문헌 [G. Urlaub and L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220. L. H. Graf, and L. A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96]), CHO-K1 Tet-On 세포주 (클론테크), CHO 지정 ECACC 85050302 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), CHO 클론 13 (GEIMG; 이탈리아 제노바), CHO 클론 B (GEIMG; 이탈리아 제노바), CHO-K1/SF 지정 ECACC 93061607 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), RR-CHOK1 지정 ECACC 92052129 (CAMR; 영국 월트셔 솔즈베리), CHOK1sv (문헌 [Edmonds et al., Mol. Biotech. 34:179-190 (2006)]), CHO-S (문헌 [Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011)]), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR; 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]), 및 dp12.CHO 세포 (미국 특허 번호 5,721,121); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (예를 들어, 293 세포, 또는 현탁 배양액에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 세포; 문헌 [Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); CAP 세포, AGE1.HN 세포, 원숭이 신장 세포 (CV 1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세르톨리 세포 (TM4; 문헌 [Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TR1 세포 (문헌 [Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; 및 FS4 세포 및 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 세포주가 CHO-K1 SV GS-KO인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 세포주가 GS - CHO인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 세포가 배치식, 공급 배치식, 연속식 모드, 관류 모드; 보다 특히 공급 배치식 모드로 배양되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 정제에 사용된 완충액의 염 농도가 30 mM - 500 mM의 범위인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 정제에 사용된 완충액의 염 농도가 50 mM - 300 mM의 범위인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 정제 단계가 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 정제 단계가 친화성 크로마토그래피, 낮은 pH 바이러스 불활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 나노 여과, 접선 유동 여과/한외 여과를 순차적 방식으로 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 정제 단계가 친화성 크로마토그래피, 낮은 pH 바이러스 불활성화, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 나노 여과, 접선 유동 여과/한외 여과를 순차적 방식으로 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 매트릭스가 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L, 바람직하게 단백질 A로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 소수성 전하 유도 크로마토그래피, 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 멀티모달 크로마토그래피 (캅토 MMC 및 캅토 어드히어), 막 크로마토그래피 [인터셉트™ (밀리포어), 무스탕® (펄 코포레이션) 및 사르토빈드™ (사르토리우스)를 포함한 Q 막] 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 부가의 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피가 에슈무노 A, 칸캡A™, Mab셀렉트 슈어™, Mab셀렉트 슈어 LX, Mab셀렉트 엑스트라, r단백질 A 세파로즈 패스트 플로우, 포로스® Mab캡처 A, 암스피어™ 단백질 A JWT203, 프로셉 HC, 프로셉 울트라, 및 프로셉 울트라 플러스를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 수지를 포함하고; 바람직하게 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지가 Mab셀렉트 슈어™, 에슈무노 A, 칸캡 A 또는 포로스 Mab캡처인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피가 하기를 포함하는 것인 방법:
    a) 평형 완충액: 20 mM 인산염 완충제; 100 - 150 mM NaCl; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
    b) 부하: 정화된 수거물
    c) 세척 I 완충액: 20 mM 인산염 완충제; 100 - 150 mM NaCl, 보다 특히 150 mM; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
    d) 세척 II 완충액: 20 mM 인산염 완충제; 250 mM - 1 M NaCl, 보다 특히 1 M; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
    e) 세척 III 완충액: 10 mM 인산염 완충제; 100 - 150 mM NaCl, 보다 특히 125 mM; 0.05% 폴리소르베이트 80; pH 7.0 ± 0.2.
    f) 용출 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제; pH 3.0 ± 0.2; 및 임의로 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80.
    g) CIP 완충액: 0.1 M NaOH.
    h) 체류 시간: 4.00 - 8.00분
    i) 사용된 컬럼: XK26
    j) 선형 유속 10 - 500 cm/hr, 보다 특히 100-150 cm/hr.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출액의 바이러스 불활성화가, 이러한 용출액을 50 - 100분의 기간 동안 pH 3.3 - 3.5 하에 유지시킴으로써 달성되는 것인 방법.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피가 술포네이트 기반 군 (예를 들어, GE 헬스케어로부터의 모노S, 미니S, 소스 15S 및 30S, SP SEPHAROSE® 패스트 플로우, SP SEPHAROSE® 고 성능, 토소로부터의 TOYOPEARL® SP-650S 및 SP-650M, 바이오래드로부터의 MACRO-PREP® 하이 S, 펄 테크놀로지로부터의 세라믹 하이퍼D S, TRISACRYL® M 및 LS SP 및 스페로덱스 LS SP); 술포에틸 기반 군 (예를 들어, EMD로부터의 FRACTOGEL® SE, 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 포로스® S-10 및 S-20); 술포프로필 기반 군 (예를 들어, 토소로부터의 TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR, 라이프 테크놀로지로부터의 포로스® HS-20, HS 50, 및 포로스® XS); 술포이소부틸 기반 군 (예를 들어, EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD S03"); 술폭시 에틸 기반 군 (예를 들어, 와트만으로부터의 SE52, SE53 및 엑스프레스-이온 S), 카르복시메틸 기반 군 (예를 들어, GE 헬스케어로부터의 CM SEPHAROSE® 패스트 플로우, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 CM, 바이오래드로부터의 MACRO-PREP® CM, 펄 테크놀로지로부터의 세라믹 하이퍼D CM, TRISACRYL® M CM, TRISACRYL® LS CM, 밀리포어로부터의 매트렉스 CELLUFINE® C500 및 C200, 와트만으로부터의 CM52, CM32, CM23 및 엑스프레스-이온 C, 토소로부터의 TOYOPEARL® CM-650S, CM-650M 및 CM-650C); 술폰산 및 카르복실산 기반 군 (예를 들어, J.T. 베이커로부터의 BAKERBOND® 카르복시-술폰); 카르복실산 기반 군 (예를 들어, J.T. 베이커로부터의 WP CBX, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈로부터의 DOWEX® MAC-3, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 약 양이온 교환기, DOWEX® 약 양이온 교환기, 및 DIAION® 약 양이온 교환기 및 EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD COO-); 술폰산 기반 군 (예를 들어, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 SP, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈로부터의 DOWEX® 미세 메쉬 강산 양이온 수지, J.T. 베이커로부터의 UNOsphere S, WP 술폰산, 사르토리우스로부터의 SARTOBIND® S 막, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 강 양이온 교환기, DOWEX® 강 양이온 및 DIAION® 강 양이온 교환기); 및 오르토포스페이트 기반 군 (예를 들어, 와트만으로부터의 PI 1) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 수지를 포함하고; 본 발명에 대한 바람직한 양이온 교환 크로마토그래피수지가 프락토겔® EMD SO3 -, 프락토겔® EMD SE 하이캡 (머크), CMM 하이퍼셀™ (펄 코포레이션), 캅토 S ImpAct(GE)인 방법.
  27. 제19항 또는 제20항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피가 하기를 포함하는 것인 방법:
    a) 사전 평형 완충액: 200 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2
    b) 평형 완충액: 10 mM 시트레이트 완충제; 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 80; pH 6.0 ± 0.2
    c) 세척 완충액 A: 10 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2
    d) 세척 완충액 B: 20 mM 시트레이트 완충제; 300 - 500 mM NaCl; pH 6.0 ± 0.2
    e) CIP 완충액: 0.5 M NaOH
    f) 체류 시간: 4.00 - 7.00분
    g) 사용된 컬럼: XK26.
  28. 제19항 또는 제20항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 DEAE 셀룰로스, 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50, 사르토리우스로부터의 SARTOBIND® Q, 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX SEPHAROSE® 패스트 플로우, Q SEPHAROSE (GE), Q SEPHAROSE® 고 성능, QAE SEPHADEX® 및 FAST Q SEPHAROSE® (GE 헬스케어), J.T. 베이커로부터의 WP PEI, WP DEAM, WP QUAT, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA, 바이오래드로부터의 U Osphere Q, MACRO-PREP® DEAE 및 MACRO-PREP® 하이 Q, 펄 테크놀로지로부터의 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, TRISACRYL® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA SPHEROSIL® LS, QMA SPHEROSIL® M 및 MUSTANG® Q, 다우 리퀴드 세퍼레이션즈로부터의 DOWEX® 미세 메쉬 강 염기 유형 I 및 유형 II 음이온 수지 및 DOWEX® MONOSPHER E 77, 약 염기 음이온, 밀리포어로부터의 INTERCEPT® Q 막, 매트렉스 CELLUFINE® A200, A500, Q500, 및 Q800, EMD로부터의 FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD DEAE 및 FRACTOGEL® EMD DMAE, 시그마-알드리치로부터의 AMBERLITE® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DOWEX® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DIAION® 약 및 강 음이온 교환기 유형 I 및 II, DUOLITE®, 토소로부터의 TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, TOYOPEARL® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C, 와트만으로부터의 QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 엑스프레스-이온 D 및 엑스프레스-이온 Q 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되며; 보다 바람직하게 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 사르토빈드 Q (사르토리우스)인 방법.
  29. 제19항 또는 제20항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 하기를 포함하는 것인 방법:
    a) 세정 완충액: 0.5 M NaOH
    b) 사전 평형 완충액: 200 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2
    c) 평형 완충액: 20 mM 시트레이트 완충제; pH 6.0 ± 0.2; 및 임의로 0.025% 폴리소르베이트 80
    d) 저장 완충액: 0.1 M NaOH
    e) 선형 유속 10 - 500 cm/hr, 보다 특히 100-150 cm/hr
    f) 사용된 컬럼: XK26.
  30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 "관류 및 세척 모드" 또는 "결합 및 용출 모드"인 방법.
  31. 제19항 또는 제20항에 있어서, 바이러스 입자의 제거가 바이레솔브 PRO (머크), 플라노바 20N (아사히 카세이), 바이오 EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (펄 라이프 사이언스), 및 바이로사르트 (사르토리우스), 사르토리우스로부터의 바이로사르트 CPV 필터, 밀리포어로부터의 바이로솔브, 펄로부터의 울티포르 DV20 또는 DV50, 아사히로부터의 플라노바 20N 및 50N 또는 바이오엑스 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 바이러스 유지 필터를 사용하여 나노 여과함으로써 달성되는 것인 방법.
  32. 제19항 또는 제20항에 있어서, 항원 결합 단백질이 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 농축되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, TFF가 센트라메이트 T 시리즈 PES 막 (펄 코포레이션), 히드로사르트 (사르토리우스), 및 펠리콘 3 (머크) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 30 kDa 막을 사용하고, 바람직하게 센트라메이트 T 시리즈 PES 막 (펄 코포레이션)을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 접선 유동 여과 프로세스가 하기를 포함하는 것인 방법:
    a) 정용 여과 완충액: 25 mM 히스티딘 완충제; 75 mM 아르기닌 완충제; 50 - 150 mM NaCl; pH 6.50 ± 0.5를 사용하는 정용 여과
    b) 세정 완충액: 0.5 M NaOH
    c) 저장 완충액: 0.1 M NaOH
    d) 5 - 10 X 막 용적을 사용하는 평형
    e) 10 - 20 정용 여과 용적을 사용하는 농축 및 정용 여과
    f) 3 - 5 막 용적을 사용하는 WFI 세척
    g) 0.5 - 1.0 M NaOH를 사용하는 세정
    h) 저장 0.1 M NaOH.
  35. 제1항에 있어서, 정제된 치료용 단백질 제제가 2% 이하의 응집체, 바람직하게 1% 미만의 응집체를 함유하는 것인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 안정한 항원 결합 단백질 제제가 적어도 하나의 항원 결합 단백질, 적어도 하나의 안정화제, 적어도 하나의 완충제, 적어도 하나의 장성 작용제, 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 안정화제가 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 만니톨, 덱스트란, 이노시톨, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 크실로스, 만노스, 말토스, 또는 라피노스 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 탄수화물이고; 보다 바람직하게 안정화제가 수크로스인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 안정한 항원 결합 단백질 제제가 <2.5% 수크로스, 보다 바람직하게 <1% 수크로스, 및 가장 바람직하게 0.5% 수크로스를 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글리신, 시트르산 나트륨, 인산 나트륨, 아르기닌, 시트르산, HEPES, 아세트산 칼륨, 시트르산 칼륨, 인산 칼륨, 아세트산 나트륨, 중탄산 나트륨, 트리스 염기, 및 트리스-HCl 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 완충제가 히스티딘 또는 아르기닌 또는 그의 조합인 방법.
  41. 제36항 또는 제39항에 있어서, 완충제가 히스티딘인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 히스티딘의 농도가 10 - 50 mM의 범위; 바람직하게 25 mM인 방법.
  43. 제36항 또는 제39항에 있어서, 완충제가 아르기닌인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 아르기닌의 농도가 10 - 150 mM의 범위; 바람직하게 75 mM인 방법.
  45. 제36항에 있어서, 장성 작용제가 염화나트륨, 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 및 염화칼륨 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 장성 작용제가 염화나트륨인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 염화나트륨의 농도가 50 - 250 mM; 바람직하게 100 - 145 mM의 범위인 방법.
  48. 제36항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트-20 또는 폴리소르베이트-80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT® 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.; 미국 뉴저지주 패터슨), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스, PF68 등) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 폴리소르베이트 80의 농도가 0.002 - 0.2% (w/v)의 범위; 바람직하게 0.02%( w/v)인 방법.
  50. 제1항 및 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 항원 결합 단백질 제제가 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 항원 결합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 안정한 항원 결합 단백질 제제가 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml의 항원 결합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질 제제가 3% 이하의 응집, 최소 량의 육안으로 보이지 않는 입자 및 개선된 효력을 포함하는 것인 방법.
  53. 제1항에 있어서, 항원 결합 단백질 단량체의 농도가 99% 초과이고; 잔여 CHO DNA가 2 pg/mg 이하의 항원 결합 단백질, 보다 특히 0.1 pg/mg 이하의 항원 결합 단백질이며; 잔여 CHO 단백질이 100 ng/mg 이하의 항원 결합 단백질, 보다 특히 10 ng/mg 이하의 항원 결합 단백질이고; 잔여 단백질-A가 10 ng/mg 이하의 항원 결합 단백질, 보다 특히 1.5 ng/mg 이하의 항원 결합 단백질이며; 내독소가 0.1 EU/mg 이하의 단백질이고, MuLV에 대한 바이러스 제거 LRV가 적어도 20배이고 MMV에 대한 바이러스 제거 LRV가 적어도 10배인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따라서 제조된 제약 조성물.
  55. 항원 결합 단백질, 완충제, 장성 작용제, 계면활성제 및 안정화제를 포함하는 제약 제제.
  56. 제55항에 있어서, 안정화제가 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 만니톨, 덱스트란, 이노시톨, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 크실로스, 만노스, 말토스, 또는 라피노스 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 탄수화물이고; 보다 바람직하게 안정화제가 수크로스인 제약 제제.
  57. 제56항에 있어서, 안정한 항원 결합 단백질 제제가 <2.5% 수크로스 w/v, 보다 바람직하게 <1% 수크로스 w/v를 포함하는 것인 제약 제제.
  58. 제55항에 있어서, 완충제가 히스티딘, 글리신, 시트르산 나트륨, 인산 나트륨, 아르기닌, 시트르산, HEPES, 아세트산 칼륨, 시트르산 칼륨, 인산 칼륨, 아세트산 나트륨, 중탄산 나트륨, 트리스 염기, 및 트리스-HCl 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 제약 제제.
  59. 제58항에 있어서, 완충제가 히스티딘 또는 아르기닌 또는 그의 조합인 제약 제제.
  60. 제55항에 있어서, 완충제가 히스티딘인 제약 제제.
  61. 제60항에 있어서, 히스티딘의 농도가 10 - 50 mM의 범위; 바람직하게 25 mM인 제약 제제.
  62. 제55항에 있어서, 완충제가 아르기닌인 제약 제제.
  63. 제62항에 있어서, 아르기닌의 농도가 10 - 150 mM의 범위; 바람직하게 75 mM인 제약 제제.
  64. 제55항에 있어서, 장성 작용제가 염화나트륨, 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 및 염화칼륨 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 제약 제제.
  65. 제64항에 있어서, 장성 작용제가 염화나트륨인 제약 제제.
  66. 제65항에 있어서, 염화나트륨의 농도가 50 - 250 mM; 바람직하게 100 - 145 mM의 범위인 제약 제제.
  67. 제55항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트-20 또는 폴리소르베이트-80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT® 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.; 미국 뉴저지주 패터슨), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스, PF68 등) 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 제약 제제.
  68. 제67항에 있어서, 폴리소르베이트 80의 농도가 0.002 - 0.2% (w/v)의 범위; 바람직하게 0.02% (w/v)인 제약 제제.
  69. a) 1 - 100 mg/ml의 적어도 하나의 항원 결합 단백질;
    b) 20 - 40 mM의 히스티딘;
    c) 50 - 100 mM의 아르기닌;
    d) 0.002 - 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v);
    e) 50 - 150 mM NaCl;
    f) 2.5% 이하의 수크로스 w/v
    를 포함하는 제약 제제이며; 여기서 제제의 pH가 6.5 ± 0.5이고, 제제의 오스몰랄농도가 300 - 450 mOsmol/kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만이고, 제제가 2-8℃에서 적어도 9개월 동안, 25℃에서 적어도 1개월 동안, 40℃에서 적어도 40일 동안, 50℃에서 적어도 2일 동안 안정한 것인 제약 제제.
  70. 2 - 80 mg/ml의 적어도 하나의 항원 결합 단백질; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하며; pH가 6.5 ± 0.5인 제약 제제.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 등전점 (pI)이 7.5 - 8.5, 보다 바람직하게 8.12인 제약 제제.
  72. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 오스몰랄농도가 약 380 mOsmol/kg인 제약 제제.
  73. 제55항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체, 항원 결합 단백질 단편, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 디아바디, 나노바디, 1가, 헤테로-접합체, 다중특이적, 자가 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab)'2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 에피토프 결합 단편 및 CDR 함유 단편 또는 그의 조합인 제약 제제.
  74. 제73항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 모노클로날 항체인 제약 제제.
  75. 제73항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 뎅기열 바이러스와 결합하는 것인 제약 제제.
  76. 제73항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 광견병 바이러스와 결합하는 것인 제약 제제.
  77. 2 - 80 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  78. 25 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  79. 50 mg/ml의 뎅기열 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  80. 2 - 80 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  81. 25 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  82. 50 mg/ml의 광견병 모노클로날 항체; 25 mM의 히스티딘; 75 mM의 아르기닌; 101 mM NaCl; 0.02% 폴리소르베이트 80 (w/v); 및 0.5% 수크로스 w/v를 포함하고; pH가 6.5 ± 0.5이며, 오스몰랄농도가 380 mOsm/Kg이고, 점도가 2.5 mPa-S 미만인 제약 제제.
  83. 제55항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 액상 제제인 제약 제제.
  84. 제55항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 건조된 제제인 제약 제제.
  85. 제70항에 있어서, 항원 결합 단백질이 뎅기열 바이러스, 광견병 바이러스, RSV, MPV, 인플루엔자 바이러스, 지카 바이러스, 서부 나일강 바이러스, 황열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, HSV, CMV, MERS, 엡스타인 바 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오 바이러스, 리노 바이러스, 아데노바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 토가바이러스, 알파 바이러스, 풍진 바이러스, HIV 바이러스, 마르부르그 바이러스, 에볼라 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 에볼라 바이러스, VSV 및 VEE 상에 존재하는 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 항체인 제약 조성물.
  86. 제70항에 있어서, 항원 결합 단백질이 CTP19, CR57, CR4098, RVFab8, MabJA, MabJB-1, Mab 57, 17C7, 2B10, Ab513/VIS513, N297Q-B3B9, Mab2E8, 2D22, DMScHuMab, 3CH5L1, HMB DV5, HMB DV6, HMB DV8, DB32-6, D88, F38, A48, C88, F108, B48, A68, A100, C58, C78, C68, D98, D188, C128, C98, A11, B11, R17D6, R14B3, R16C9, R14D6, R18G9, R16F7, R17G9, R16E5, 4E11A의 변형으로부터 유래된 항체, 아다타셉트, 압식시맙, 아달리무맙, 아플리베르셉트, 알레파셉트, 알렘투주맙, 트라스투주맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨라타셉트, 벡투모맙, 세르톨리주맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 엔타네르셉트, 젬투주맙, 이브리투모맙, 인플릭시맙, 무로모납-CD3, 오말리주맙, 팔리비주맙; 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 릴로나셉트, 리툭시맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 자놀리맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, hA20, AME-I33, IMC-3G3, 잘루투무맙, 님모투주맙, 마투주맙, ch*)^, KSB-102, MR1-1, SC100, SC101, SC103, 무로모납-CD3, OKT4A, 이브리투모맙, 젬투주맙, 모타비주맙, 인플릭시맙, 페그필그라스틴, CDP-571, 에타네르셉트, ABX-CBL, ABX-IL8, ABX-MAl 펨투모맙, 테렉스, AS1405, 나탈리주맙, HuBC-I, IDEC-131, VLA-I; CAT-152; J695, CAT-192, CAT-213, BR3-Fc, 림포스타트-B, TRAIL-RImAb, 베바시주맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, MLN-02, HuMax-IL 15, HuMax-염증, HuMax-암, HuMax-림프종, HuMax-TAC, 클레놀릭시맙, 루밀릭시맙, BEC2, IMC-ICl 1, DClOl, 라베투주맙, 아르시투모맙, 엡라투주맙, 타카투주맙, 세툭시맙, 미엘로마시드, 엘코시드, 프로스타시드, 이필리무맙, MDX-060, MDX-070, MDX-018, MDX-1106, MDX-1103, MDX-1333, MDX-214, MDX-1100, MDX-CD4, MDX-1388, MDX-066, MDX-1307, HGS-TR2J, FG-3019, BMS-66513, SGN-30, SGN-40, 토실리주맙, CS-1008, IDM-I, 골리무맙, CNTO 1275, CNTO 95, CNTO 328, 메폴리주맙, MORlOl, MORI 02, MOR201, 비실리주맙, HuZAF, 볼로식맙, ING-I, MLN2201, 다클리주맙, HCD 122, CDP860, PRO542, C 14, 오레고보맙, 에드레콜로맙, 에타라시주맙, 아테졸리주맙, 이플리무맙, 모가물리주맙, 린투주맙, HuIDlO, Lym-1, 에팔리주맙, ICM3, 갈릭시맙, 에쿨리주맙, 오비누투주맙, 펙셀리주맙, LDP-Ol, huA33, WX-G250, 시브로투주맙, 오파투무맙, 키메라 KW-2871, hu3S193, huLK26; 비바투주맙, 락시바쿠맙, chl4.18, 3F8, BC8, huHMFGl, MORAb-003, MORAb-004, MORAb-009, 데노수맙, PRO-140, 1D09C3, hu믹베타-1, NI-0401, NI-501, 칸투주맙, HuN901, 8H9, chTNT-1/B, 바비툭시맙, huJ591, HeFi-I, 펜타세아, 아바고보맙, 토시투모맙, 우스테키누맙, 105AD7, GMAl 61, GMA321 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  87. 제55항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이, 단독으로 투여될 수 있거나 또는 다른 작용제, 다른 예방 또는 치료 방법과 조합하여 투여될 수 있는 항-뎅기열 항체 또는 항-광견병 항체인 제약 제제.
  88. 병, 바이알, 앰풀, IV 봉지, 착용형 주사기, 볼루스 주사기, 주사기, 펜, 펌프, 복수회 투여 바늘 주사기, 복수회 투여 펜, 주사기, 시레트, 자기 주사기, 미리 채워진 주사기 또는 그의 조합으로부터 선택되는, 제55항 내지 제87항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는 용기.
  89. 제88항에 있어서, 적어도 하나의 1차 패키징 성분이 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PETG), 고 점도 폴리에틸렌 (HDPE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리펜타플루오로스티렌 (PFS), 폴리카르보네이트, 폴리비닐 클로라이드 (PVC), 폴리시클로펜탄 (CZ.RTM.), 환상 올레핀 공중합체 (COC), 폴리올레핀, 및 그의 조합 또는 공중합체로부터 선택된 용기 마개를 포함하는 것인 용기.
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