JP2023543167A - ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法 - Google Patents

ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023543167A
JP2023543167A JP2023517280A JP2023517280A JP2023543167A JP 2023543167 A JP2023543167 A JP 2023543167A JP 2023517280 A JP2023517280 A JP 2023517280A JP 2023517280 A JP2023517280 A JP 2023517280A JP 2023543167 A JP2023543167 A JP 2023543167A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
peptides
sample
digested sample
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023517280A
Other languages
English (en)
Inventor
シャオ，ガン
ボンダレンコ，パベル
シー，リウチン
ディロン，トーマス・エム
レン，ダー
リッチ，マーガレット・スピード
ツゥイ，ウェイドン
ハラヒー，ジョン・ジョーセフ
パウロフスキ，ジェイク
ダイクストラ，アンドリュー
リグス，ディラン
Original Assignee
アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アムジエン・インコーポレーテツド filed Critical アムジエン・インコーポレーテツド
Publication of JP2023543167A publication Critical patent/JP2023543167A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G01N33/6821—Sequencing of polypeptides involving C-terminal degradation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21001—Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/16—(de-)amidation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

分析、例えば質量分光測定法によるペプチドマッピング分析のためにポリペプチド又はタンパク質を処理する方法が本明細書に提供される。例示的な実施形態において、本方法は、弱酸性のｐＨで、及び／又はカオトロープの存在下で消化試料をインキュベートすることを含み、消化試料は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することによって生成される。例示的な実施形態において、本方法は、ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む。例示的な実施形態において、本方法は、約１：１～約１：１５の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）重量比でトリプシンにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む。例示的な態様において、消化試料は、各々がＣ末端にチロシンを含む少なくとも１種又は２種のペプチドを含む。

Description

関連出願の相互参照
２０２０年９月１８日に出願された米国仮出願第６３／０８０，４８９号及び２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３６，９９６号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益が本明細書により主張されており、これらそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる： ２０２１年８月２５日作成の「Ａ－２６５０－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名の２７２キロバイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。
ヒト様翻訳後修飾を行うための細胞機構を備えているため、哺乳類細胞は、多くのタンパク質生物医薬品の製造に適した宿主である。しかし、哺乳類細胞による翻訳後修飾タンパク質の製造は、バッチ間変動、プロセスドリフト、製造変更等により、高いばらつきの影響を受ける可能性がある。したがって、製造プロセス中のこのような修飾、特にタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ治療機能に重要な修飾、例えば重要品質特性（ＣＱＡ）を監視及び制御する必要性がある。タンパク質の製造中に行われる製品の品質分析は、そのような分析のための長い時間要件によって制限されてきたが、近年の取り組みでは、ほぼリアルタイムで関連するプロセス知識を提供するために多変量データ分析と組み合わせた自動化された高スループット技術の方向に業界を動かしている。例えば、Ｐａｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４，３０：１６１－１６７を参照のこと。
従来、タンパク質の品質分析には、製造プロセスから得られた試料（例えば、バイオリアクタから採取された細胞培養試料）からのタンパク質の単離、タンパク質のペプチド断片への酵素的消化、ペプチド断片のクロマトグラフ分離後の質量分光測定（ＭＳ）分析を含む。タンパク質分析物の三次元構造の複雑さに応じて、例えば、変性、還元、及びアルキル化を含む前消化処理ステップが、消化のためにタンパク質を開裂するために必要となることがある。一般に、消化を停止し、分離及びＭＳ分析用のペプチド断片の収量を準備するために、１つ以上の消化後ステップが含まれる。例えば、消化を停止するためにクエンチバッファが添加されてもよく、及び／又はクロマトグラフィーカラムに断片を添加する前にバッファ交換が行われてもよい。
タンパク質分析物の配列に応じて、消化によって溶解度の低い長鎖ペプチドが生じることがあり、したがって分析前の回収率が低くなり得る。最低量の長鎖ペプチドさえも回収されなければ、タンパク質分析物の大部分は分析されない可能性がある。１つ以上のＣＱＡが長鎖ペプチド内に存在する場合、タンパク質分析物全体の品質分析の有益さは低下する。タンパク質の消化により、溶解度及び回収率が低く、結果的に属性情報が得られないことがある数個、又はいくつかの長鎖ペプチドが生じる場合、問題はさらに複雑になる。
したがって、長鎖ペプチドの回収及びその後の分析の向上につながる、分析前のタンパク質又はポリペプチドの改善された処理方法が当技術分野で必要とされている。
Ｐａｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４，３０：１６１－１６７
本明細書では、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して消化試料を得、次いで消化試料を弱酸性のｐＨで、及び／又はカオトロープの存在下でインキュベートすることを含むポリペプチドを処理する方法が、ポリペプチドの長鎖ペプチドの回収率の増加をもたらすことを示すデータが記載されている。長鎖ペプチドの回収率の増加は、ポリペプチドの質量分光測定（ＭＳ）分析を可能にする。本明細書に記載のデータは、本明細書に開示されているポリペプチドを処理する方法が、修飾形態の長鎖ペプチド、例えば、長鎖ペプチドの脱アミド化生成物の回収率の増加ももたらし、その回収率により修飾ポリペプチドの質量分光測定分析を可能にすることをさらに立証している。本明細書に記載のデータは、さらに、修飾形態の長鎖ペプチドが非修飾形態の長鎖ペプチドからクロマトグラフィーにより分離でき、それによって修飾形態のポリペプチドの検出及び監視が可能になることをさらに裏付ける。分析のために質量分光測定計に直接注入される試料へのカオトロープの添加は、多くのカオトロープがＭＳ性能に悪影響を与えることが知られており、注入された試料には通常存在しないため、直感に反するものであった。さらに、例えば長鎖トリプシンペプチド内のＴｒｐ残基のＣ末端を切断するプロテアーゼにより特定のポリペプチドを消化すると、ポリペプチドの回収及び分析が容易になることを裏付けるデータも本明細書に示されている。
したがって、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることとを含む方法が本明細書に提供される。本明細書で使用する場合、「弱酸性」のｐＨとは、約４以上７未満の酸性のｐＨを意味する。弱酸性のｐＨの範囲の例としては、４～６、４～５、５超７未満、及び６超７未満が挙げられる。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下でインキュベートすることとを含む。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を弱酸性のｐＨでインキュベートすることとを含む。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を弱酸性のｐＨでカオトロープの存在下でインキュベートすることとを含む。例示的な例において、本方法は、消化試料をインキュベートした後の質量分光測定分析をさらに含む。様々な態様において、ポリペプチドを処理する方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることと、質量分光測定により消化試料を分析することとを含む。様々な態様において、消化試料は、インキュベート後に質量分光測定計に直接注入される。様々な例において、消化試料のインキュベート後にバッファ交換はしない。様々な態様において、ポリペプチドを処理する方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることと、インキュベート後に質量分光測定計に消化試料を直接注入することとを含む。例示的な例において、本方法は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートしない場合のかかるペプチドの溶解度及び／又は回収率と比較して、長鎖ペプチド、例えば、長鎖疎水性ペプチド、１個以上のＴｒｐ残基を含む長鎖ペプチドの溶解度の増加及び／又は回収率の増加をもたらす。したがって、本開示は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の長鎖ペプチドの溶解度を増加させる方法であって、消化試料は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法を提供する。様々な例において、消化試料のペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する。さらに、本開示は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の長鎖ペプチドの回収率を増加させる方法であって、消化試料は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法を提供する。様々な態様において、消化試料のペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する。本明細書で使用する場合、「長鎖」ペプチドは、約５０個のアミノ酸残基を超える長さを有するペプチドを意味する。例示的な態様において、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きい、６０アミノ酸長より大きい、７０アミノ酸長より大きい、又は８０アミノ酸長より大きい。任意選択で、ペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きく、５個以上の疎水性アミノ酸及び／又は少なくとも１個、少なくとも２個、若しくは少なくとも３個のＴｒｐ残基を含む。様々な態様において、ポリペプチドは、酸化されたＴｒｐ残基を含む。いくつかの態様において、消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する。様々な態様において、消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する。任意選択で、ペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率の少なくとも３倍又は４倍多い。様々な態様において、プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、弱酸性のｐＨで使用するためのＡｃｃｕＭＡＰ（商標） Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａからカタログ番号Ｖ５２８５として入手可能）、ペプシン、エラスターゼ、シュードトリプシン、又はそれらの組み合わせである。任意選択で、ポリペプチドは１種のみのプロテアーゼにより消化される。様々な態様において、１種のプロテアーゼは、Ｔｒｐ残基、任意選択で、トリプシン、又はそのプロテオフォーム若しくはアイソフォームのＣ末端を切断する。或いは、ポリペプチドは、少なくとも２種のプロテアーゼにより消化される。例えば、ポリペプチドは、トリプシン及びエラスターゼ、又はトリプシン及びキモトリプシンにより消化される。様々な態様において、本方法は、消化試料を機械的な振とうを用いてインキュベートすることを含む。例示的な態様において、本方法は、カオトロープの存在下でポリペプチドをプロテアーゼにより消化することを含む。様々な態様において、弱酸性のｐＨ、任意選択で約４～約６のｐＨでインキュベートする。いくつかの態様において、弱酸性のｐＨは５．５未満又は約４．８～約５．２である。様々な例において、本方法は、消化試料を約５．０±０．１のｐＨでインキュベートすることを含む。例示的な態様において、本方法は、高濃度のカオトロープを消化試料に添加することを含む。様々な例において、カオトロープは、尿素、ｎ－ブタノール、エタノール、グアニジン、又はそれらの塩、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、又はチオ尿素を含む。任意選択で、カオトロープは、グアニジン又はその塩である。例示的な例において、カオトロープは、塩酸グアニジン、硝酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、又は炭酸グアニジンである。任意選択で、塩酸グアニジンは消化試料に添加される。様々な態様において、本方法は、約２Ｍ超、任意選択で３Ｍ超のグアニジンの最終グアニジン濃度のグアニジンの存在下で消化試料をインキュベートすることを含む。特定の例において、最終グアニジン濃度は、５Ｍ未満のグアニジンである。様々な態様において、本方法は、４Ｍの最終グアニジン濃度を得られるように、消化試料を塩酸グアニジンの存在下でインキュベートすることを含む。様々な例において、本方法は、有機溶媒、アルコール、アセトニトリル、尿素、界面活性剤、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つ以上の存在下で消化試料をインキュベートすることをさらに含む。様々な例において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン又はグリコシド等の非イオン性界面活性剤である。ポリオキシエチレンは、いくつかの態様において、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊシリーズの界面活性剤、脂質、又は脂肪酸である。本方法は、任意選択で、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換をさらに含む。様々な態様において、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジ、任意選択でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジを使用することを含む。任意選択で、バッファ交換は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタを使用することを含む。一部の例において、ＭＷＣＯフィルタは、平底型ＭＷＣＯフィルタである。様々な態様において、本方法は、フィルタを全く使用することなく行われる。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタのみを用いて行われる。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタを用いて、又は全くフィルタを用いずに行われる。例として、ゲルフィルタはデキストランゲルを含んでいてもよい。様々な態様において、ポリペプチドは抗原結合性タンパク質であり、任意選択で、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子である。例示的な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、ＣＤ３結合ドメインを含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、５０アミノ酸長より大きい、６０アミノ酸長より大きい、７０アミノ酸長より大きい、又は８０アミノ酸長より大きい配列を含み、配列は少なくとも１個のＴｒｐ残基を含む。例示的な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、図１に示す配列番号８８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。例示的な例において、ポリペプチドは、配列番号８８（図１）と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、配列は少なくとも１個のトリプトファンを含む。
本開示は、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドを、例えば、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む方法をさらに提供する。任意選択で、プロテアーゼはトリプトファンのＣ末端を切断し、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つはＣ末端Ｔｒｐ残基を含む。様々な態様において、Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は、ポリペプチドを、ＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化せずに処理したペプチドの回収率よりも増加する。様々な例において、Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は、２０％以上である。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを１種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。例示的な態様において、プロテアーゼは、トリプシン、又はそのプロテオフォーム若しくはアイソフォームである。任意選択で、プロテオフォームはシュードトリプシンである。様々な態様において、ポリペプチドは、弱酸性のｐＨでプロテアーゼ（例えば、トリプシン）により消化される。いくつかの態様において、弱酸性のｐＨは５．５未満又は約４．８～約５．２である。様々な例において、本方法は、消化試料を約５．０±０．１のｐＨでインキュベートすることを含む。例示的な態様では、プロテアーゼは、キモトリプシンである。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを２種以上のプロテアーゼ、任意選択で２種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。任意選択で、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはトリプシンである。様々な態様において、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはキモトリプシンである。様々な例において、本方法は、ポリペプチドをトリプシン及びキモトリプシンで連続して消化することを含む。特定の例において、本方法は、ポリペプチドをトリプシンにより消化し、後にポリペプチドをキモトリプシンにより消化することを含む。任意選択で、消化は、中性のｐＨ、任意選択で、６．０超８．５未満のｐＨで行われる。様々な態様において、中性のｐＨは７．０又は７．５である。いくつかの態様において、中性のｐＨは約７．５±０．１である。様々な態様において、ポリペプチドは抗原結合性タンパク質であり、任意選択で、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子である。例示的な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、ＣＤ３結合ドメインを含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、５０アミノ酸長より大きい、６０アミノ酸長より大きい、７０アミノ酸長より大きい、又は８０アミノ酸長より大きい配列を含み、配列は少なくとも１個のＴｒｐ残基を含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、配列番号８８（図１）と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、配列は少なくとも１個のトリプトファンを含む。様々な態様において、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。本開示は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を処理する方法であって、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を、例えば、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含み、２種のペプチドは、ｐＨ７．５でトリプシンでＢｉＴＥ（登録商標）分子を消化することによって得られる消化試料に存在しない、方法をさらに提供する。本開示は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を処理する方法であって、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を、配列番号９１内の部位で、例えばトリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む方法をさらに提供する。例示的な例において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、１２時間未満、任意選択で、約６時間未満又は約４時間未満、分析のために処理される。任意選択で、本方法は、本明細書に記載されるように、消化試料を弱酸性のｐＨで、及び／又は消化試料に対するカオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換をさらに含む。様々な態様において、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジ、任意選択でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジを使用することを含む。任意選択で、バッファ交換は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタを使用することを含む。一部の例において、ＭＷＣＯフィルタは、平底型ＭＷＣＯフィルタである。様々な態様において、本方法は、フィルタを全く使用することなく行われる。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタのみを用いて行われる。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタを用いて、又は全くフィルタを用いずに行われる。例として、ゲルフィルタはデキストランゲルを含んでいてもよい。例示的な態様において、ＭＷＣＯフィルタは、本方法において使用されない。例示的な例において、本方法は、消化試料の質量分光測定分析をさらに含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を質量分光測定計に注入することとを含む。任意選択で、本方法は、消化後のバッファ交換を含まない。
本明細書に開示されている方法によって処理されたポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）又は属性は、例示的な態様において、分析を通して同定される。例示的な例において、本明細書に開示されている方法によって処理されたポリペプチドのＰＴＭ又は属性の同定は、プロテアーゼ（ＴｒｐのＣ末端を切断する）なしで消化が行われる場合、並びに／又は消化試料をカオトロープの存在下で、且つ／若しくは弱酸性のｐＨでインキュベートせずに行われる場合のＰＴＭ又は属性の同定と比較して、向上している。本開示は、ポリペプチドの属性を監視する方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）本開示の方法のいずれか１つに従って、第１の時点で得られた第１の試料中のポリペプチドを処理することと、（ｂ）第１の試料のポリペプチドのＰＴＭ又は属性を同定するために、（ａ）で得られた消化試料を質量分光測定計に注入することと、（ｃ）本開示の方法のいずれか１つに従って、第２の時点で得られた第２の試料中のポリペプチドを処理すること、（ｄ）（ｃ）で得られた消化試料を質量分光測定計に注入して、第２の試料のポリペプチドのＰＴＭ又は属性を同定することと、（ｅ）第１の試料のＰＴＭ又は属性を第２の試料のＰＴＭ又は属性と比較することとを含む。例示的な態様において、第１の試料及び第２の試料の各々は、ポリペプチドを発現する細胞を含む細胞培養物から採取され、第１の時点は第２の時点とは異なる。
本明細書に開示されている方法の例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをトリプシンで約１：１～約１：１５の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）重量比で消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含み、任意選択で、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。例示的な態様において、Ｅ：Ｓ比は、約１：１～約１：１０である。任意選択で、Ｅ：Ｓ比は、約１：２～約１：８である。様々な例において、Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である。例示的な態様において、消化は、約７．０～約８．０、任意選択で約７．５のｐＨで行われる。様々な態様において、消化は、約１２時間未満、約６時間未満、約４時間未満行われる。様々な例において、消化は、約２時間から約４時間行われる。様々な態様において、消化は、約２時間以下行われる。例示的な例において、消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択で、約３７℃の温度で行われる。任意選択で、消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる。或いは、消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる。例示的な例において、ポリペプチドは、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でトリプシンのみにより消化される。様々な態様において、他のプロテアーゼは、ポリペプチドを消化するために使用されない。様々な例において、ポリペプチドをこのＥ：Ｓ比でトリプシンにより消化すると、Ｃ末端にチロシンを含む１種以上のペプチドを含む消化試料が生成される。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含み、任意選択で、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジの使用を含む。例示的な態様において、サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである。例示的な態様において、本方法は、消化試料を弱酸性のｐＨで、カオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む。任意選択で、カオトロープは、塩酸グアニジンである。弱酸性のｐＨは、様々な態様において約５である。様々な例における方法は、消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む。
本開示は、ポリペプチドを処理して、各々がＣ末端にチロシンを含む少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成する方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、本方法は、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でポリペプチドをトリプシンにより消化することを含む。様々な例において、消化は、本明細書に開示されている方法に従って行われる。任意選択で、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。例示的な態様において、Ｅ：Ｓ比は、約１：１～約１：１０である。任意選択で、Ｅ：Ｓ比は、約１：２～約１：８である。様々な例において、Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である。例示的な態様において、消化は、約７．０～約８．０、任意選択で約７．５のｐＨで行われる。様々な態様において、消化は、約１２時間未満、約６時間未満、約４時間未満行われる。様々な例において、消化は、約２時間から約４時間行われる。様々な態様において、消化は、約２時間以下行われる。例示的な例において、消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択で、約３７℃の温度で行われる。任意選択で、消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる。或いは、消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる。例示的な例において、ポリペプチドは、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でトリプシンのみにより消化される。様々な態様において、他のプロテアーゼは、ポリペプチドを消化するために使用されない。様々な態様において、ポリペプチドをこのＥ：Ｓ比でトリプシンにより消化すると、Ｃ末端にチロシンを含む１種以上のペプチドを含む消化試料が生成される。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含み、任意選択で、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジの使用を含む。例示的な態様において、サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである。例示的な態様において、本方法は、消化試料を弱酸性のｐＨで、カオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む。任意選択で、カオトロープは、塩酸グアニジンである。弱酸性のｐＨは、様々な態様において約５である。様々な例における方法は、消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む。
多くのＢｉＴＥ（登録商標）分子（カノニカルなＢｉＴＥ（登録商標）分子及び半減期延長（ＨＬＥ）ＢｉＴＥ（登録商標）分子）に共通するＣＤ３ε結合ドメイン、又は抗ＣＤ３（α－ＣＤ３）ドメインを示す。トリプシン消化により、複数のアミノ酸が修飾されやすいため、ＣＱＡであり得る２個の相補性決定領域（ＣＤＲ；黄色でハイライトされている）を含む約８ｋＤａの長鎖ペプチドが得られる。トリプシン切断部位は水色で示されている。８０個超のアミノ酸を含む長鎖ペプチドには下線が引かれている。 ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１～＃３に共通するα－ＣＤ３ドメインの長鎖ペプチド配列のアライメントである。ＢｉＴＥ分子＃１～＃３のアミノ酸配列は、配列番号９４である。 図３Ａは、アミノ酸Ｄ１０４－Ｒ１５４、Ｖ１５５－Ｋ１７８、Ｖ１９８－Ｋ２３９、Ｈ３５０－Ｒ４３６、又はＡ４６２－Ｋ４８６を含むＢｉＴＥ（登録商標）分子の各種トリプシンペプチドの消化時間（分）の関数としてプロットされたペプチドシグナル（イオン数）のグラフである。α－ＣＤ３ドメインの長鎖ペプチドは、Ｈ３５０－Ｒ４３６である。図３Ｂは、５℃で４８時間貯蔵した後のＢｉＴＥ（登録商標）分子を含むＨＰＬＣバイアルの写真である。繊維状粒子を指す矢印が示されている。 図３Ａは、アミノ酸Ｄ１０４－Ｒ１５４、Ｖ１５５－Ｋ１７８、Ｖ１９８－Ｋ２３９、Ｈ３５０－Ｒ４３６、又はＡ４６２－Ｋ４８６を含むＢｉＴＥ（登録商標）分子の各種トリプシンペプチドの消化時間（分）の関数としてプロットされたペプチドシグナル（イオン数）のグラフである。α－ＣＤ３ドメインの長鎖ペプチドは、Ｈ３５０－Ｒ４３６である。図３Ｂは、５℃で４８時間貯蔵した後のＢｉＴＥ（登録商標）分子を含むＨＰＬＣバイアルの写真である。繊維状粒子を指す矢印が示されている。 ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液（バイアル１）、還元されアルキル化されたＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液（バイアル２及び３）、ゼロ時点（図４Ａ）及び１０分時点（図４Ｂ）で還元され、アルキル化され、トリプシンにより消化されたＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液（バイアル４及び５）のバイアルの画像である。バイアル３を２つのアリコートに分け、塩酸グアニジンあり又はなしで処理した（図４Ｃ）。バイアル５を２つのアリコートに分け、塩酸グアニジンあり又はなしで処理した（図４Ｃ）。ゼロ時点及び１０分時点におけるバイアル３及び５の拡大画像が、図４Ａ及び図４Ｂの右側に示されている。図４Ｂの右側のバイアル５の拡大画像の拡大図は、バイアル３の拡大画像の右側に示されている。 ＨＰＬＣ－ＭＳ分析につながるポリペプチド試料（例えば、製剤溶液中のｍＡｂ又はＢｉＴＥ（登録商標）分子）を処理するステップの概略を示す。図５Ａでは、ポリペプチドの変性、還元、及びアルキル化が、バッファを消化バッファに変更するためのバッファ交換の前に行われる。バッファ交換は、例えばＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過によって行われる。グアニジンから分離したタンパク質のゲルろ過溶出プロファイルが示されている。次に、１種以上の酵素が溶出したタンパク質に添加され、消化試料を得る。消化試料は、グアニジン、例えば４Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下又は不在下で、本明細書に記載のように特定のｐＨでインキュベートされる。その後、ペプチドは分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに注入される。図５Ｂでは、変性、還元、及びアルキル化が起こり、バッファはＭＷＣＯフィルタの上に置かれる。バッファを消化バッファに変更するためのバッファ交換は、ＭＷＣＯフィルタによりバッファを遠心分離し、ろ液に消化バッファを添加することによって行われる。消化はＭＷＣＯフィルタ上で行われ、消化試料は、グアニジン、例えば４Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下又は不在下で、本明細書に記載のように特定のｐＨでインキュベートされる。消化試料は、インキュベート後にフィルタにより遠心分離され、消化ペプチドを含むろ液は、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに注入される。 ＨＰＬＣ－ＭＳ分析につながるポリペプチド試料（例えば、製剤溶液中のｍＡｂ又はＢｉＴＥ（登録商標）分子）を処理するステップの概略を示す。図５Ａでは、ポリペプチドの変性、還元、及びアルキル化が、バッファを消化バッファに変更するためのバッファ交換の前に行われる。バッファ交換は、例えばＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過によって行われる。グアニジンから分離したタンパク質のゲルろ過溶出プロファイルが示されている。次に、１種以上の酵素が溶出したタンパク質に添加され、消化試料を得る。消化試料は、グアニジン、例えば４Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下又は不在下で、本明細書に記載のように特定のｐＨでインキュベートされる。その後、ペプチドは分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに注入される。図５Ｂでは、変性、還元、及びアルキル化が起こり、バッファはＭＷＣＯフィルタの上に置かれる。バッファを消化バッファに変更するためのバッファ交換は、ＭＷＣＯフィルタによりバッファを遠心分離し、ろ液に消化バッファを添加することによって行われる。消化はＭＷＣＯフィルタ上で行われ、消化試料は、グアニジン、例えば４Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下又は不在下で、本明細書に記載のように特定のｐＨでインキュベートされる。消化試料は、インキュベート後にフィルタにより遠心分離され、消化ペプチドを含むろ液は、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに注入される。 様々なｐＨ（２、５、７．５）で塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の存在下で消化試料をインキュベートする（＋）又はしない（－）、図５Ａ（ＮＡＰ５バッファ交換法；「Ｎａｐ５」）又は図５Ｂ（「３０ｋＤａ」又は「１０ｋＤａ」のＭＷＣＯフィルタを使用）に従って処理したペプチドの相対存在量のグラフである。「ＧｕＨＣｌなし」は、塩酸グアニジンを添加せずに消化試料をインキュベートすることを意味し、後に「なし」がない「ＧｕＨＣｌ」は、消化試料を塩酸グアニジンでインキュベートすることを意味する。 図７Ａは、４つの試料の消化ペプチドのピークを示すＬＣ－ＵＶクロマトグラムであり、そのうち３つの試料はストレスが負荷されている。長鎖ペプチドＨ３５５－Ｒ４４１のメインピークが指摘される。図７Ｂは、図７Ａのクロマトグラムの一部を拡大したものであり、４つの試料のメインピークの高さの違いを示している。長鎖ペプチドＨ３５５－Ｒ４４１の脱アミド化バージョンを表すピーク１、２、及び３が、メインピークの右側及び左側に示されている。 図７Ａは、４つの試料の消化ペプチドのピークを示すＬＣ－ＵＶクロマトグラムであり、そのうち３つの試料はストレスが負荷されている。長鎖ペプチドＨ３５５－Ｒ４４１のメインピークが指摘される。図７Ｂは、図７Ａのクロマトグラムの一部を拡大したものであり、４つの試料のメインピークの高さの違いを示している。長鎖ペプチドＨ３５５－Ｒ４４１の脱アミド化バージョンを表すピーク１、２、及び３が、メインピークの右側及び左側に示されている。 図８Ａは、無ストレス試料の長鎖ペプチド付近のＬＣ－ＭＳクロマトグラムのセクションを示す。図８Ｂは、ｐＨ７－ストレス負荷試料の長鎖ペプチド付近のＬＣ－ＭＳクロマトグラムのセクション、並びにｐＨ７－ストレス負荷試料に固有のピーク１～３を示す。図８Ｃ－８Ｆは、図８Ａのメインピーク、図８Ｂのピーク１、図８Ｂのピーク２、及び図８Ｂのピーク３の質量スペクトルである。 図８Ａは、無ストレス試料の長鎖ペプチド付近のＬＣ－ＭＳクロマトグラムのセクションを示す。図８Ｂは、ｐＨ７－ストレス負荷試料の長鎖ペプチド付近のＬＣ－ＭＳクロマトグラムのセクション、並びにｐＨ７－ストレス負荷試料に固有のピーク１～３を示す。図８Ｃ－８Ｆは、図８Ａのメインピーク、図８Ｂのピーク１、図８Ｂのピーク２、及び図８Ｂのピーク３の質量スペクトルである。 図９Ａは、上部の配列（配列番号９５）を有する長鎖ペプチドａａ３５５－４４１の配列を示し、図９Ｂは、長鎖ペプチドのメインピークのＭＳ／ＭＳピークを示す。Ｎ末端を含むｂ断片、及びＣ末端を含むｙ断片の質量により、長鎖ペプチドの配列及び同一性が確認された。 酵素及びその切断パターンを列挙した表である。配列ＫＲ、ＷＹＦＬ（配列番号９６）、ＦＩＭＹＷＶ（配列番号９７）、ＣＤＥＦＬＭＴＷＹ（配列番号９８）、及びＶＩＴＡＬＳ（配列番号９９）が示されている。 異なる酵素により同一配列（配列番号１００）の切断、及びペプチド回収率を示す図である。 異なる酵素により切断されたＮ３５２及びＮ３５５を含むペプチドの回収率のグラフである。 図１１の下部に描かれたトリプシン及びキモトリプシンにより連続して消化した後の、無ストレス試料のＮ３５２及びＮ３５５を含む
Figure 2023543167000002
 （配列番号１０１）ペプチド（図１３Ａ）及びストレス負荷試料のＮ３５２及びＮ３５５を含む
Figure 2023543167000003
 （配列番号１０１）ペプチド（図１３Ｂ）の相対存在量を示すＬＣ－ＭＳクロマトグラムである。メインピークは、各図に記されている。ピーク１～３は、ストレス負荷試料（図１３Ｂ）に固有のものであり、長鎖ペプチドの脱アミド化生成物として割り当てられる。
ストレス負荷分子（図１４Ａ）及び無ストレス分子（図１４Ｂ）の
Figure 2023543167000004
 （配列番号１０１）ペプチドの断片（ＭＳ／ＭＳ）ピークを示す。図１４Ｃは、図１４Ａの領域を拡大し、図１４Ｄは、図１４Ｂの領域を拡大している。図１４Ｃは、ピーク３として溶出するＮ３５２の脱アミド化に対応するピークのシフトを指摘している。断片ｂ４の質量はメイン及びピーク３で同じであるが、断片ｂ６の質量は１Ｄａシフトしており、ｂ４とｂ６との間の残基Ｎ３５２が脱アミド化されていることが１Ｄａの質量増加により示されている。
ストレス負荷分子（図１４Ａ）及び無ストレス分子（図１４Ｂ）の
Figure 2023543167000005
 （配列番号１０１）ペプチドの断片（ＭＳ／ＭＳ）ピークを示す。図１４Ｃは、図１４Ａの領域を拡大し、図１４Ｄは、図１４Ｂの領域を拡大している。図１４Ｃは、ピーク３として溶出するＮ３５２の脱アミド化に対応するピークのシフトを指摘している。断片ｂ４の質量はメイン及びピーク３で同じであるが、断片ｂ６の質量は１Ｄａシフトしており、ｂ４とｂ６との間の残基Ｎ３５２が脱アミド化されていることが１Ｄａの質量増加により示されている。
図１５Ａは、配列（上段の配列、配列番号１０２；中段の配列、配列番号１０３；下段の配列、配列番号１０４））の切断及びＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化したときに得られるペプチド回収率を示す図である。図１５Ｂは、切断されたペプチドの相対存在量を含むＬＣ－ＭＳクロマトグラムを示す。示されたペプチドのピークの質量スペクトルは、図１５Ｃ及び１５Ｄに提供される。図１５Ｂ、図１５Ｃ、及び図１５Ｃの配列は、それぞれ配列番号１０５、１０６及び１０７である。 図１５Ａは、配列（上段の配列、配列番号１０２；中段の配列、配列番号１０３；下段の配列、配列番号１０４））の切断及びＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化したときに得られるペプチド回収率を示す図である。図１５Ｂは、切断されたペプチドの相対存在量を含むＬＣ－ＭＳクロマトグラムを示す。示されたペプチドのピークの質量スペクトルは、図１５Ｃ及び１５Ｄに提供される。図１５Ｂ、図１５Ｃ、及び図１５Ｃの配列は、それぞれ配列番号１０５、１０６及び１０７である。 これらのＣ末端Ｔｙｒを含む非カノニカルなペプチド：Ｈ３５０－Ｙ３５７（配列番号１０８）、Ｈ３５０－Ｙ３６０（配列番号１０９）、及びＨ３５０－Ｙ３６３（配列番号１１０）の例示的な抽出イオンクロマトグラムである。 これらのＣ末端Ｔｙｒを含む非カノニカルなペプチド：Ｈ３５０－Ｙ３５７（配列番号１０８）、Ｈ３５０－Ｙ３６０（配列番号１０９）、及びＨ３５０－Ｙ３６３（配列番号１１０）の例示的な抽出イオンクロマトグラムである。 これらのＣ末端Ｔｙｒを含む非カノニカルなペプチド：Ｈ３５０－Ｙ３５７（配列番号１０８）、Ｈ３５０－Ｙ３６０（配列番号１０９）、及びＨ３５０－Ｙ３６３（配列番号１１０）の例示的な抽出イオンクロマトグラムである。 図１７Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３５７ペプチドの相対存在量のグラフである。図１７Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図１７Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３５７ペプチドの相対存在量のグラフである。図１７Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図１８Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３６０ペプチドの相対存在量のグラフである。図１８Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図１８Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３６０ペプチドの相対存在量のグラフである。図１８Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図１９Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３６３ペプチドの相対存在量のグラフである。図１９Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図１９Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３６３ペプチドの相対存在量のグラフである。図１９Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図２０Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のカノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６の相対存在量を示すグラフである。図２０Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 図２０Ａは、Ｅ：Ｓ比：１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、又は１：１００で消化した場合のカノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６の相対存在量を示すグラフである。図２０Ｂは、Ｅ：Ｓ比の関数として相対存在量をプロットしている線形グラフである。 示されている供給業者によるトリプシン製品で消化した場合のＨ３５０－Ｙ３６３ペプチドのクロマトグラムのピーク面積のグラフである。 ＥＤＴＡの存在下、指示されたｐＨで、又は４５℃で消化したときの非カノニカルなペプチドの相対存在量のグラフである。 ０、２、又は４週間のストレス負荷後のカノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６及び非カノニカルなペプチドＨ３５０－Ｙ３６３の脱アミド化種の定量化を示す。図２３Ａは、０、２、又は４週間のストレス負荷後のカノニカルなペプチドＨ３５０－Ｒ４３６の３つのクロマトグラムである。図２３Ｂは、０、２、又は４週間のストレス負荷後の非カノニカルなペプチドＨ３５０－Ｙ３６３の３つのクロマトグラムである。これらの各図において、％は、脱アミド化された種の％を示す。 ０、２、又は４週間のストレス負荷後のカノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６及び非カノニカルなペプチドＨ３５０－Ｙ３６３の脱アミド化種の定量化を示す。図２３Ａは、０、２、又は４週間のストレス負荷後のカノニカルなペプチドＨ３５０－Ｒ４３６の３つのクロマトグラムである。図２３Ｂは、０、２、又は４週間のストレス負荷後の非カノニカルなペプチドＨ３５０－Ｙ３６３の３つのクロマトグラムである。これらの各図において、％は、脱アミド化された種の％を示す。
マルチ属性法（ＭＡＭ）は、典型的には質量分光測定法（ＭＳ）に基づく重要な属性の特性解析及び定量が実施される、分子の酵素的消化を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）における修飾は、それらが分子の効力及び／又は安全性に影響を及ぼし得るために特に懸念される。リシン及びアルギニン残基のＣ末端として切断するトリプシンは、典型的には、リシン及びアルギニン残基の高い消化特異性及び発生頻度を含む多数の理由から、ペプチドマッピング及びＭＡＭのための最適な酵素として利用されている；トリプシンの消化は、さらに典型的には質量分光測定法に基づく分析のための最適長さを有するＣ末端上に塩基性残基を備えるペプチドを生じさせる。しかしながら、多くの二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子は、長鎖リンカー領域のすぐ側に２個のＣＤＲを備える保存されたα－ＣＤ３ドメインを含有する。これらのＣＤＲ（
Figure 2023543167000006
 ；配列番号１１０）のうちの１つは、脱アミド化に感受性がある２個のアスパラギン残基（下線及び太字）及び酸化に感受性があるトリプトファン残基（下線）を含む。分子のこの領域は、トリプシン消化に適用できる残基を含有していない（図１）。従って、ＣＤＲドメイン内の関心対象の属性は、このペプチドのサイズが大きい（約８ｋＤａ）こと、修飾されたバージョンのペプチドをクロマトグラフィーによって分離することの困難、ペプチドの不良な回収率及び／又はイオン化並びにこのサイズのペプチドに対応する質量分光測定法を解釈することに関連する一般的課題があるために、ＭＡＭによって監視することはできない。さらに、このリンカー領域には、Ａｓｐ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、及びＧｌｕ－Ｃのような一般的に使用される二次プロテアーゼに感受性がある残基がない。同様に、多くのＢｉＴＥ（登録商標）分子は、同様にトリプシン消化による監視が困難である標的特異的ＣＤＲのすぐ側に短鎖リンカーペプチド（約５～７ｋＤａ）も有している。例えば、潜在的ＣＤＲアスパラギン酸異性化部位は、５．７ｋＤａのリンカーペプチド内に所在する。これらをまとめると、これらの属性は、ＭＡＭをベースとする監視を必要とする標的及び／又はＣＤ３結合に大きな影響を及ぼし得る。
本明細書では、長鎖ペプチドの回収率の増加及び／又は長鎖ペプチドの切断の改善をもたらし、したがってポリペプチドの分析の強化を可能にする、ポリペプチドを処理する方法の開発が記載されている。本明細書では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のＣＤＲドメインの脱アミド化に感受性がある２個のアスパラギン残基及び／又は酸化に感受性があるトリプトファン残基を含有するペプチドの存在量を増加させる、ポリペプチドを処理する方法の開発が記載されている。このようなペプチドの存在量の増加により、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のＣＤＲドメイン内、又はその近傍の属性又はＰＴＭ（例えば、脱アミド化、酸化）を監視することができる。様々な態様において、本方法は、Ｃ末端トリプトファンを含むペプチド、例えば、配列番号９２又は９３の配列を含むペプチドの存在量の増加を提供する。代替的な態様において、本方法は、Ｃ末端チロシンを含むペプチド、例えば、配列番号１０８～１１０いずれか１つの配列を含むペプチドの存在量の増加を提供する。したがって、本明細書では、ポリペプチドを処理する方法が提供される。
本開示は、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む方法を提供する。任意選択で、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つはＣ末端Ｔｒｐ残基を含む。様々な態様において、Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は、ＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼの不在下で消化されるペプチドの回収率よりも増加する。様々な例において、Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は、２０％以上である。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを１種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。例示的な態様において、プロテアーゼは、トリプシン、又はそのプロテオフォーム若しくはアイソフォームである。任意選択で、プロテオフォームはシュードトリプシンである。様々な態様において、ポリペプチドは、弱酸性のｐＨ、任意選択で約４～約６のｐＨ、例えばｐＨ５でプロテアーゼ（例えば、トリプシン）により消化される。さまざまな態様において、プロテアーゼは、キモトリプシンである。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを２種以上のプロテアーゼ、任意選択で２種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。任意選択で、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはトリプシンである。任意選択で、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはキモトリプシンである。様々な態様において、本方法は、ポリペプチドをトリプシン及びキモトリプシンで連続して消化することを含む。特定の例において、本方法は、ポリペプチドをトリプシンにより消化し、後にポリペプチドをキモトリプシンにより消化することを含む。任意選択で、消化は、中性のｐＨ、任意選択で、ｐＨ７．５で行われる。任意選択で、消化は、少なくとも４、６、８、１０、又は１２時間である。
様々な例において、ポリペプチドは抗原結合性タンパク質であり、任意選択で、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子である。例示的な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、は超可変領域を含み、これはＣＤ３に結合する結合ドメインを含んでいてもよい。例示的な例において、ポリペプチドは、超可変領域又はその一部を含み、その一部は、５０連続アミノ酸長より大きい、６０連続アミノ酸長より大きい、７０連続アミノ酸長より大きい、又は８０連続アミノ酸長より大きい。例示的な例において、ポリペプチドは、５０連続アミノ酸長より大きい、６０連続アミノ酸長より大きい、７０連続アミノ酸長より大きい、又は８０連続アミノ酸長より大きい配列を含み、配列は少なくとも１個のＴｒｐ残基を含む。例示的な例において、ポリペプチドは、配列番号８８（図１）と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む結合ドメインを含み、少なくとも１個のＴｒｐを含む。様々な態様において、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷ（配列番号９２）の配列のペプチドを含む。様々な態様において、消化試料は、配列ＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＳＧＮＹＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲ（配列番号９３）のペプチドを含む。プロテアーゼは、超可変領域（又はその一部）内のトリプトファンのＣ末端を切断し、プロテアーゼによるこの領域の消化は、様々な態様において、プロテアーゼがない場合のこの領域の消化と比較して（例えば、異なるプロテアーゼによる消化と比較して）増加する。様々な例において、ポリペプチドは、１２時間未満、任意選択で、約６時間未満、例えば約４時間未満、ペプチドマッピング分析のために処理される。例示的な例において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、１２時間未満、任意選択で６時間未満又は約４時間未満、分析のために処理される。様々な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、約１～約６時間、約１～約５時間、約１～約４時間、約１～約３時間、約１～約２時間、約２～約６時間、約３～約６時間、約４～約６時間、又は約５～約６時間、分析のために処理される。
任意選択で、本方法は、消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることをさらに含む。例示的なカオトロープは、本明細書に記載されている。様々な態様において、消化試料は、約４Ｍの濃度のグアニジンの存在下で、約５．０のｐＨでインキュベートされる。任意選択で、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。このような前消化ステップは、本明細書にさらに記載される。例えば、「前消化」を参照のこと。任意選択で、本方法は、ポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後、且つポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前のバッファ交換をさらに含む。一部の例において、バッファ交換ステップは、サイズ排除カートリッジ、任意選択でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジを使用することを含む。任意選択で、バッファ交換は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタを使用することを含む。一部の例において、ＭＷＣＯフィルタは、平底型ＭＷＣＯフィルタである。様々な態様において、本方法は、フィルタを全く使用することなく行われる。様々な態様において、本方法は、ＭＷＣＯフィルタを全く使用することなく行われる。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタ、例えば、ＮＡＰ５カートリッジのようなデキストランゲルフィルタのみを用いて行われる。
任意選択で、本方法は、さらに消化後を含む。例えば、「消化後」を参照のこと。例えば、本方法は、消化試料のペプチドを分析することを含む。例示的な例において、本方法は、消化試料の質量分光測定分析をさらに含む。様々な態様において、本方法は、消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために質量分光測定計、任意選択で、液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することをさらに含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを、ＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することとを含む。ポリペプチドの属性は、例示的な態様において、ペプチドマッピング分析、例えばＭＡＭを通して同定される。例示的な例において、ポリペプチドのＰＴＭ又は属性の同定は、プロテアーゼ（ＴｒｐのＣ末端を切断する）なしで消化が行われる場合のＰＴＭの同定と比較して、向上している。
本開示は、ポリペプチドを処理する方法であって、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることとを含む方法をさらに提供する。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を弱酸性のｐＨでカオトロープの存在下でインキュベートすることとを含む。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料をカオトロープの存在下でインキュベートすることとを含む。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと、消化試料を弱酸性のｐＨでインキュベートすることとを含む。
例示的な例において、本方法は、長鎖ペプチド、例えば、少なくとも１個のＴｒｐ残基を含む長鎖ペプチドの溶解度の増加及び／又は回収率の増加をもたらす。この増加は、消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートしない場合のペプチドの溶解度及び／又は回収率と比較したものであることができる。
したがって、本開示は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の長鎖ペプチドの溶解度を増加させる方法であって、消化試料は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法を提供する。様々な例において、消化試料のペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する。
さらに、本開示は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の疎水性ペプチドの回収率を増加させる方法であって、消化試料は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成された、方法を提供する。様々な態様において、消化試料のペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する。
様々な態様において、溶解度及び／又は回収率の増加は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに、処理したペプチドの溶解度又は回収率に対して、少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）である。例示的な実施形態において、本開示の方法によって提供される溶解度又は回収率の増加は、約１０％～約１００％、任意選択で、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、又は約９５％～約１００％である。増加は、対照を基準としたものであることができる。例示的な実施形態において、本開示の方法によって提供される溶解度又は回収率の増加は、対照に対して１００％を超える、例えば、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は１０００％の増加である。例示的な実施形態では、溶解度又は回収率は、対照に対して、少なくとも約１．５倍増加する。好適な対照は、消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートせずに処理されたペプチドの溶解度又は回収率であることができる。任意選択で、ペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに回収されるペプチドの少なくとも３倍又は４倍である。
例示的な態様において、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きい、６０アミノ酸長より大きい、７０アミノ酸長より大きい、又は８０アミノ酸長より大きい。例示的な態様において、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きく、６０アミノ酸長より大きく、７０アミノ酸長より大きく、又は８０アミノ酸長より大きく、任意選択で、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に１つだけのトリプシン切断部位、例えば、Ａｒｇ又はＬｙｓを有する。例示的な態様において、消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きく、６０アミノ酸長より大きく、７０アミノ酸長より大きく、又は８０アミノ酸長より大きく、任意選択で、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に１つだけのトリプシン切断部位、例えば、Ａｒｇ又はＬｙｓを有し、さらに５個以上の疎水性アミノ酸を含む。疎水性は、当該技術分野で公知の疎水性尺度のうちのいずれか１つに従って測定又はスコア化されてもよい。一般に、スコアが正であればあるほど、そのアミノ酸の疎水性は高くなる。一部の例において、疎水性は、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性スケール（Ｋｙｔｅ Ｊ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ（Ｍａｙ １９８２）．「Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７（１）：１０５－３２）でスコア化されている。一部の態様において、疎水性アミノ酸は、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性スケールで約２．５を超えるスコアを有する。特定の態様における疎水性アミノ酸は、分枝若しくは直鎖のＣ２～Ｃ１２アルキル、又はＣ４～Ｃ８シクロアルキル、窒素ヘテロ原子を含み、任意選択で、複素環がイミダゾール、ピロール、又はインドールであるＣ４～Ｃ８複素環を含む側鎖を含む。本明細書の目的のために、「シクロアルキル」という用語は、炭素二環又は三環を含む任意の炭素環を包含する。例示的な態様において、疎水性アミノ酸は、Ｃ３～Ｃ８アルキルを含み、任意選択で、疎水性アミノ酸は、分枝Ｃ３アルキル又は分枝Ｃ４アルキルを含む。疎水性アミノ酸は、特定の態様において、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、又はＬ－イソロイシンである。様々な態様において、ポリペプチドは、酸化に感受性がある少なくとも１個、少なくとも２個、又は少なくとも３個のトリプトファン残基を含む。一部の態様において、消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する。様々な態様において、消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する。
本開示は、ポリペプチドを処理して、各々がＣ末端にチロシンを含む少なくとも１種又は２種のペプチドを含む消化試料を生成する方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、本方法は、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でポリペプチドをトリプシンにより消化することを含む。様々な例において、消化は、本明細書に開示されている方法に従って行われる。任意選択で、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。例示的な態様において、Ｅ：Ｓ比は、約１：１～約１：１０である。任意選択で、Ｅ：Ｓ比は、約１：２～約１：８である。様々な例において、Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である。例示的な態様において、消化は、約７．０～約８．０、任意選択で約７．５のｐＨで行われる。様々な態様において、消化は、約１２時間未満、約６時間未満、約４時間未満行われる。様々な態様において、消化は、約２時間から約４時間行われる。様々な態様において、消化は、約２時間以下行われる。例示的な例において、消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択で、約３７℃の温度で行われる。任意選択で、消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる。或いは、消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる。例示的な例において、ポリペプチドは、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でトリプシンのみにより消化される。様々な態様において、他のプロテアーゼは、ポリペプチドを消化するために使用されない。様々な例において、ポリペプチドをこのＥ：Ｓ比でトリプシンにより消化すると、Ｃ末端にチロシンを含む１種以上のペプチドを含む消化試料が生成される。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含み、任意選択で、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジの使用を含む。例示的な態様において、サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである。例示的な態様において、本方法は、消化試料を弱酸性のｐＨで、カオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む。任意選択で、カオトロープは、塩酸グアニジンである。弱酸性のｐＨは、様々な態様において約５である。様々な例において、本方法は、消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む。
消化
様々な態様において、本方法は、ポリペプチドを消化すること、又はポリペプチドを切断してポリペプチドの少なくとも２つのペプチド断片にすることを含む。消化（又は切断）は、ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成することができる。さらに、ポリペプチドを例えば単一アミノ酸に完全に分解することは、望ましくない。
有用なプロテアーゼ（しかし全部を含むわけではない）の例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ－Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ－Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ－Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシンが挙げられる。様々な態様において、プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、シュードトリプシン、又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、これらのプロテアーゼの組み合わせが使用される。様々な態様において、ポリペプチドは、少なくとも２種のプロテアーゼにより消化される。例えば、ポリペプチドは、トリプシン及びエラスターゼ、又はトリプシン及びキモトリプシンにより消化される。或いは、ポリペプチドは、１種のみのプロテアーゼにより消化される。一部の実施形態では、トリプシン単独が使用される。ペプチド結合選択性及びＥ．Ｃ．番号を含むこれら及び他のプロテアーゼは、表Ａに示す。各プロテアーゼについて示された供給業者は例示的なものであり、これらのプロテアーゼの多くは市販されている。
Figure 2023543167000007
一部の実施形態では、１０：１、２０：１、２５：１、５０：１又は１００：１のタンパク質：プロテアーゼ比（ｗ／ｗ）を使用できる。一部の実施形態では、比率は、２０：１である。一部の実施形態では、使用される好中球エラスターゼは、約１００ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、又は約１μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、又は約１μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌ、又は約１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｇ～１ｍｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｇ～５００μｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｇ～１００μｇ／ｍｌの濃度にある。一部の実施形態では、消化ステップは、１０分間～４８時間、又は３０分間～４８時間、又は３０分間～２４時間、又は３０分間～１６時間、又は１時間～４８時間、又は１時間～２４時間、又は１時間～１６時間、又は１～８時間、又は１～６時間、又は１～４時間である。一部の実施形態では、消化ステップは、２０℃～４５℃、又は２０℃～４０℃、又は２２℃～４０℃、又は２５℃～３７℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、消化ステップは、３７℃でインキュベートされる。当業者であれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼ消化が当該技術分野でよく理解されているように、適切な条件（バッファ、インキュベート時間、プロテアーゼ量、体積等）を選択することができる。
様々な態様において、本方法は、本明細書に記載されているように、ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼで消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む。例えば、本方法は、ポリペプチドを１種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。例示的な態様において、プロテアーゼは、トリプシン、又はそのプロテオフォーム若しくはアイソフォームである。任意選択で、プロテオフォームはシュードトリプシンである。様々な態様において、ポリペプチドは、弱酸性のｐＨ、任意選択で約４～約６のｐＨ、例えばｐＨ５でプロテアーゼ（例えば、トリプシン）により消化される。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドを２種以上のプロテアーゼ、任意選択で２種のみのプロテアーゼにより消化することを含む。任意選択で、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはトリプシンである。任意選択で、プロテアーゼのうちの少なくとも１つはキモトリプシンである。様々な態様において、本方法は、ポリペプチドをトリプシン及びキモトリプシンで連続して消化することを含む。特定の例において、本方法は、ポリペプチドをトリプシンにより消化し、後にポリペプチドをキモトリプシンにより消化することを含む。任意選択で、消化は、中性のｐＨ、任意選択で、ｐＨ７．５で行われる。
様々な態様において、ポリペプチドは、カオトロープの存在下で消化される。カオトロープは本明細書に記載されている。
様々な例において、本方法は、消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることを含む。特定の理論に束縛されることなく、カオトロープの存在下で消化試料をインキュベートすることは、ポリペプチドの消化を停止又は遅延させる。
様々な態様において、本方法は、消化試料を弱酸性のｐＨでインキュベートすることを含む。任意選択で、弱酸性のｐＨは約４以上７未満である。例示的な態様において、弱酸性のｐＨは約４～約６．９、約４～約６．８、約４～約６．７、約４～約６．６、約４～約６．５、約４～約６．４、約４～約６．３、約４～約６．２、又は約４～約６．１である。様々な態様において、弱酸性のｐＨは約４～約６、例えば、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、又は約６．０である。いくつかの態様において、弱酸性のｐＨは５．５未満及び／又は約４．８～約５．２である。様々な例において、弱酸性のｐＨは、約５．０±０．１である。任意選択で、消化試料のｐＨが中性から塩基性である場合、ｐＨは弱酸性のｐＨに調整される。様々な態様において、ギ酸、例えば２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加して、ｐＨを弱酸性のｐＨに調整する。ｐＨを調整する他の手段が公知である。様々な態様において、消化試料のｐＨが弱酸性である場合、消化試料のｐＨの調整は不要である。
例示的な態様において、本方法は、カオトロープ、例えば高濃度のカオトロープの存在下で消化試料をインキュベートすることを含む。様々な例において、本方法は、消化試料を、尿素、ｎ－ブタノール、エタノール、グアニジン、又はそれらの塩、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、又はチオ尿素の存在下でインキュベートすることを含む。任意選択で、カオトロープは、グアニジン又はその塩は含む。例示的な例において、本方法は、消化試料を、塩酸グアニジン、硝酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、又は炭酸グアニジンの存在下でインキュベートすることを含む。任意選択で、本方法は、塩酸グアニジンを消化試料に添加することを含む。いくつかの態様では、本方法は、約２Ｍ超、任意選択で３Ｍ超のグアニジンの最終グアニジン濃度が得られるようにグアニジンを消化試料に添加することを含む。特定の例において、グアニジンは、５Ｍ未満のグアニジンの最終グアニジン濃度が得られるように消化試料に添加される。様々な態様において、本方法は、約４Ｍの最終グアニジン濃度を得られるように、塩酸グアニジンを消化試料に添加することを含む。様々な態様において、本方法は、消化試料の最終グアニジン濃度が約４Ｍになるまでグアニジンを消化試料に添加することを含む。
様々な例において、本方法は、有機溶媒、アルコール、アセトニトリル、尿素、界面活性剤、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つ以上の存在下で消化試料をインキュベートすることを含む。様々な例において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン又はグリコシド等の非イオン性界面活性剤である。ポリオキシエチレンは、いくつかの態様において、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊシリーズの界面活性剤、脂質、又は脂肪酸である。
様々な態様において、インキュベートは、機械的な振とうを用いて行われる。様々な例において、インキュベートは、少なくとも３０秒間又は少なくとも６０秒間行われる。様々な例において、インキュベートは、約４℃超の温度で行われる。
本明細書に開示されている方法の例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドを約１：１～約１：１５の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）重量比でトリプシンにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む。様々な態様において、消化試料は、Ｃ末端チロシン残基を含むペプチドを含む。任意選択で、消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。様々な態様において、Ｅ：Ｓ重量比は、約１：１～約１：１４、約１：１～約１：１３、約１：１～約１：１２、約１：１～約１：１１、約１：１～約１：１０、約１：２～約１：１５、約１：３～約１：１５、約１：４～約１：１５、約１：５～約１：１５、約１：６～約１：１５、約１：７～約１：１５、約１：８～約１：１５、約１：９～約１：１５、約１：１０～約１：１５、約１：１１～約１：１５、約１：１２～約１：１５、約１：１３～約１：１５、又は約１：１４～約１：１５である。例示的な態様において、Ｅ：Ｓ比は、約１：１～約１：１０（例えば、約１：１～約１：９、約１：１～約１：８、約１：１～約１：７、約１：１～約１：６、約１：１～約１：５、約１：１～約１：４、約１：１～約１：３、約１：１～約１：２、約１：２～約１：１０、約１：３～約１：１０、約１：４～約１：１０、約１：５～約１：１０、約１：６～約１：１０、約１：７～約１：１０、約１：８～約１：１０、約１：９～約１：１０）である。任意選択で、Ｅ：Ｓ比は、約１：２～約１：８である。様々な例において、Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である。例示的な態様において、消化は、約７．０～約８．０、例えば、約７．１～約８．０、約７．２～約８．０、約７．３～約８．０、約７．４～約８．０、約７．５～約８．０、約７．６～約８．０、約７．７～約８．０、約７．８～約８．０、約７．９～約８．０、約７．０～約７．９、約７．０～約７．８、約７．０～約７．７、約７．０～約７．６、約７．０～約７．５、約７．０～約７．４、約７．０～約７．３、約７．０～約７．２、又は約７．０～約７．１のｐＨで行われる。様々な態様において、消化は、約７．３～約７．７、約７．４～約７．５、又は約７．５のｐＨで行われる。様々な態様において、消化は、約１２時間未満、約６時間未満、約４時間未満行われる。様々な態様において、消化は、約２時間から約４時間行われる。様々な態様において、消化は、約２時間以下行われる。例示的な例において、消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択で、約３７℃の温度で行われる。任意選択で、消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる。或いは、消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる。例示的な例において、ポリペプチドは、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ比でトリプシンのみにより消化される。様々な態様において、（トリプシン以外の）他のプロテアーゼは、ポリペプチドを消化するために使用されない。例示的な態様において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含む。例示的な例において、本方法は、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含み、任意選択で、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジの使用を含む。例示的な態様において、サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである。例示的な態様において、本方法は、消化試料を弱酸性のｐＨで、カオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む。様々な例において、トリプシン消化後、消化試料はカオトロープを用いてインキュベートされる。任意選択で、カオトロープは、塩酸グアニジンである。例示的な態様において、塩酸グアニジンの最終濃度は約３Ｍ又は約４Ｍである。弱酸性のｐＨは様々な態様において約５である。様々な例における本方法は、消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む。
前消化
様々な態様における本開示のポリペプチドを処理する方法は、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含むが、これらに限定されない、１つ以上の前消化処理をさらに含む。本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することをさらに含む。
様々な態様において、本方法は、ポリペプチドを変性させることを含む。ポリペプチドは、様々な当技術分野で認められた技術及び変性剤を使用して変性させることができる。一部の実施形態では、多数の変性剤が同時又は順々の何れかで一緒に使用される。例えば、ＳＤＳの変性剤及び熱は、ポリペプチドを変性させるために組み合わされ得る。
タンパク質の変性は、四次、三次又は二次ポリペプチド構造を破壊する任意の手段によって実施することができる。例えば、尿素等のカオトロープ剤及び変性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、熱、還元剤及びジスルフィド再形成を遮断するために反応性チオール基を不活性化する作用物質の使用。ポリペプチド含有試料のｐＨは、さらに変性を促進するために操作することができる。これらの成分は、ポリペプチドの鎖を解くために一緒に使用されることが多い。
カオトロープ剤の追加の例としては、尿素に加えて、ｎ－ブタノール、エタノール、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール及びチオ尿素が挙げられる。尿素は、殆どの場合に好ましい。
界面活性剤は、親水性基：アニオン性、カチオン性、非イオン性及び両性イオン性の形態に分類される。アニオン性及びカチオン性界面活性剤は、変性する可能性がより高く、それらの例としては：ＳＤＳ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム（アニオン性）及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウム（ＴＴＡＢ）（カチオン性）が挙げられる。一部の場合には、両性イオン性界面活性剤は有用であり得るが、例としては、アミドスルホベタイン－１４（ＡＳＢ－１４）、アミドスルホベタイン－１６（ＡＳＢ－１６）、Ｃ７Ｂｚ０、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３－８）、ｄ（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３－１０）等が挙げられる。アニオン性界面活性剤が好ましく、特に好ましいのはＳＤＳである。
変性剤は、（大多数のポリペプチドに対して）熱、例えば３０℃以上の高温であり得る。変性剤には撹拌が含まれる。一部の実施形態では、本質的若しくは実質的を含む低塩又は無塩がポリペプチドを変性させ得る。
変性剤は、エタノール又は他のアルコール等の溶媒であり得る。
ポリペプチドの変性は、広範に試験されて報告されている；例えば、詳細については（Ｔａｎｆｏｒｄ，１９６８）を参照されたい。当業者であれば、ポリペプチド及び選択すべき多数の変性剤の性質を前提に、ポリペプチドを変性させる方法を理解している。
様々な態様において、本方法は、ポリペプチドを還元することを含む。還元ポリペプチドは、システイン等のポリペプチド構造において還元可能残基を還元させるために十分な還元条件に曝露させられているポリペプチドである。還元ポリペプチドがチオール基又は硫黄含有残基を含有する場合、還元ポリペプチド内のチオール基が還元させられる。システイン残基を含む還元ポリペプチドは、「－ＳＨ」と表示され得る、還元させられたシステイン残基の硫黄原子を有する。還元ポリペプチドは、ジスルフィド結合含有ポリペプチドであり得る。ジスルフィド結合含有ポリペプチドは、ジスルフィド結合含有ポリペプチド内の１つ以上のジスルフィド結合（ジスルフィド架橋）が破断するのを誘発する還元条件に曝露させることによって還元ポリペプチドになり得る。
「還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」、「還元剤（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）」又は「還元剤（ｒｅｄｕｃｅｒ）」は、酸化還元化学反応において別の化学種へ電子を失う（又は付与する）要素又は化合物である。還元剤は、ジスルフィド基がチオール（－ＳＨ）基を生成することによって反応性になることを許容する。一般的ポリペプチド還元試薬は、表Ｂに示す。
Figure 2023543167000008
一部の実施形態では、ポリペプチドの変性及び還元は、同時に実施される。他の実施形態では、ポリペプチドの変性及び還元は、別個のステップで実施される。
当業者であれば、ポリペプチド及び選択すべき還元試薬の性質を前提に、ポリペプチドを還元させる方法を理解している。
様々な態様において、本方法は、ポリペプチドをアルキル化することを含む。「反応性チオール基を不活性化するステップ」は、望ましくないチオール－ジスルフィドの交換反応を防止するためにポリペプチド内の遊離チオール基を遮断することを意味する。アルキル化剤は、アルキル基による水素の置換を誘発する物質である。
それらの還元後に頻回に生じる遊離システインのアルキル化は、さもなければシステイン残基の遊離チオール間で形成し得るジスルフィド結合の形成及び再形成を防止する。一般に使用されるアルキル化剤としては、ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）及びヨード酢酸が挙げられる。その他の適切なアルキル化剤の例としては、ジチオビス（２－ニトロ）安息香酸；アクリルアミド；４－ビニルピリジン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル及びシクロホスファミド；シスプラチン；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、ロムスチン及びセムスチン；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；エチレンイミン、例えばチオテパ；並びにトリアジン、例えばデカルバジンが挙げられる。当業者であれば、スルフヒドリル基を保護するために使用され得る試薬並びにそのような試薬を使用する方法を承知している。
本方法は、任意選択で、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、バッファ交換をさらに含む。様々な態様において、バッファ交換は、サイズ排除カートリッジ、任意選択でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジを使用することを含む。任意選択で、バッファ交換ステップは、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタを使用することを含む。一部の例において、ＭＷＣＯフィルタは、平底型ＭＷＣＯフィルタである。様々な態様において、本方法は、ゲルフィルタ、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジのみの使用を含む。
代替的な例において、本方法は、いかなるフィルタの使用も含まない。
消化後
様々な態様において、本方法は、１つ以上の消化後処理又は分析を含む。様々な例において、本方法は、消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることを含む。インキュベートは、本明細書に記載されるように行われてもよい。例えば、表Ａの後の「消化」セクションの教示を参照のこと。例示的な態様において、本方法は、約４～６のｐＨ、任意選択でｐＨ５で、４Ｍのグアニジンの存在下で消化試料をインキュベートすることを含む。様々な態様において、インキュベートは、機械的な振とうを用いて行われる。様々な例において、インキュベートは、少なくとも３０秒間又は少なくとも６０秒間行われる。様々な例において、インキュベートは、約４℃超の温度で行われる。
例示的な態様において、本方法は、消化試料を分析することを含む。一般に、好適な分析方法は、クロマトグラフィー、電気泳動法及び分光測定法であり得る。これらの分析方法の一部は、組み合わせることができる。当業者であれば、例えば、適切な分析方法、並びに、例えばそれらの方法を実施するために適切な条件の選択を容易にする、例えば（Ｇｕｎｚｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００１）を含むハンドブックを利用できる。
クロマトグラフィー法は、その相が固定相を保持する構造を通して処理される移動相内のポリペプチド断片を分離する方法である。ポリペプチド断片はサイズ及び組成が異なるために、各断片は、固有の分配係数を有する。分配係数が異なるために、ポリペプチドは、固定相上に示差的に維持される。当技術分野において公知のそのような方法の例としては、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、拡張吸着流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。
公知のクロマトグラフィー法の一部の概要は、表Ｃに示す。
Figure 2023543167000009
処理されたポリペプチドは、さらに、電気泳動法－ゲル電気泳動法、フリー・フロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、親和性電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法、キャピラリー電気泳動法及びキャピラリーゾーン電気泳動法を使用して分析することができる。概要及びハンドブックは、当業者が入手可能であり、例えば、（Ｋｕｒｉｅｎ ａｎｄ Ｓｃｏｆｉｅｌｄ， ２０１２； Ｌｏｒｄ， ２００４）である。
電気泳動法は、電場によって溶媒を通して輸送される、それらの等電点には存在しないポリペプチド等の荷電分子を分析するために使用することができる。ポリペプチドは、それらの荷電密度に比例する速度で移動する。電場を通してのポリペプチドの移動度は：電場の強度、ポリペプチド上の正味電荷、ポリペプチドのサイズ及び形状、イオン強度並びにポリペプチドがそれを通って移動するマトリックスの特性（例えば、粘度、孔径）に左右される。ポリアクリルアミド及びアガロースは、２種の一般的な支持マトリックスである。これらのマトリックスは、多孔質媒体として機能し、分子ふるいのように挙動する。ポリアクリルアミドは、より小さな孔径を備える支持体を形成し、本明細書に開示した方法において特に有用であり、大多数のポリペプチド断片を分離するために理想的である。
表Ｄは、ポリペプチドの電気泳動技術の例を提示している。
Figure 2023543167000010
処理されたポリペプチドは、さらに、分光測定法－質量分光測定法（Ｒｕｂａｋｈｉｎ ａｎｄ Ｓｗｅｅｄｌｅｒ，２０１０）、紫外分光測定法、可視分光測定法、蛍光分光測定法、及び紫外－可視分光測定法（Ｎｏｒｗｉｃｋａ－Ｊａｎｏｋｏｗｓｋａ，１９８６）を使用して分析することができる。
表Ｅは、ポリペプチドの電気泳動技術の例を提示している。
Figure 2023543167000011
質量分光測定法（ＭＳ）を可能にする原理は、化学的化合物をイオン化して荷電分子又は分子断片を生成するステップ、及び次に質量電荷比を測定するステップから成る。例示的なＭＳ手順では、試料がＭＳ機器に装填されて気化させられ、試料の成分は、正電荷粒子の形成を生じさせる様々な方法（例えば、それらに電子ビームで衝撃を与えることによる）の１つによってイオン化され、陽イオンは次に磁場によって加速され、電磁場を通してそれらが通過するのでイオンの運動の詳細に基づいて粒子の質量電荷比（ｍ／ｚ）についての計算、及びそれらのｍ／ｚ比に従って分類されるイオンの検出が実施される。
実例となるＭＳ機器は、３つのモジュール：気相試料分子をイオンに変換する（又は、エレクトロスプレーイオン化の場合、溶液中に存在するイオンを気相内に移動させる）イオン源；電磁場を適用することによってそれらの質量電荷比によってイオンを分類する質量分析器；及びインジケーター量の数値を測定するので、従って存在する各イオンの存在度を計算するためのデータを提供する検出器を有する。
ＭＳ技術は、未知の化合物を同定すること、分子内の要素の同位体組成を決定すること、及びその断片化を観察することによって化合物の構造を決定することを含む定性的及び定量的両方の使用を有する。含まれるのは、ガスクロマトグラフィー－質量分光測定法（ＧＣ／ＭＳ又はＧＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分光測定法（ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ－ＭＳ）及びイオン移動度分光測定／質量分光測定法（ＩＭＳ／ＭＳ又はＩＭＭＳ）である。
分析方法（クロマトグラフィー法、電気泳動法及び分光測定法）は、結合することができる。例えば、液体クロマトグラフィー－質量分光測定法、質量分光測定法に結合されたキャピラリーゾーン電気泳動法及びイオン移動度分光測定法－質量分光測定法等の組み合わせ。
例示的な例において、本方法は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートした後の消化試料を、質量分光測定計、例えば液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することをさらに含む。
属性、監視方法、及びポリペプチドの製造方法
例示的な態様において、ポリペプチドはアミノ酸のポリマーを含み、様々な態様において、ポリペプチドは、翻訳後修飾された１つ以上のアミノ酸、例えば翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む１つ以上のアミノ酸、又はその他の構造的に修飾されている１つ以上のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基を含むことが理解されよう。簡潔にするために、ポリペプチドのアミノ酸残基は、本明細書では単に「アミノ酸」と呼ぶことができる。
様々な例において、１つ以上のアミノ酸へのＰＴＭ又は修飾は、ポリペプチドの機能に影響を与える。様々な例において、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、用語「治療用ポリペプチド」は、疾患又は病状の処置のために対象に投与された場合に治療効果を達成することが意図される、少なくとも１本のポリペプチド鎖を含む、天然に存在するか、又は操作されたか若しくは合成であり得る任意の分子を指す。様々な例において、１つ以上のアミノ酸へのＰＴＭ又は修飾は、ポリペプチドの治療機能に影響を与える。
例示的な例において、ポリペプチド、特に修飾されているアミノ酸は、例えば、ポリペプチドの機能、例えば、治療機能に影響を与え得るポリペプチド構造の起こり得る変化を監視するために監視される。任意選択で、ポリペプチドのアミノ酸の全て又は一部の構造が監視される。例示的な態様では、アミノ酸の構造は、「属性」と呼ばれ、その化学的同一性又は属性型及びポリペプチドのアミノ酸配列内の位置（例えば、その属性が存在するアミノ酸の位置）に関して特徴付けられ得る。例えば、アスパラギン及びグルタミン残基は、脱アミド化に感受性がある。ポリペプチドアミノ酸配列の１０位の脱アミド化アスパラギンは、属性の一例である。特定のアミノ酸の例示的な属性型の一覧を表Ｆに示す。したがって、本明細書で使用される「構造」は、表Ｆに列挙した属性型又は表Ｆに列挙した２つ以上の属性型の組み合わせを含み得るか、実質的にそれから構成され得るか又はそれから構成され得る。属性は、構造の例であり、特に明記しない限り、本明細書で「構造」に言及する場合には常に、構造の例として属性が企図されることが理解されるであろう。
Figure 2023543167000012
したがって、本開示は、ポリペプチドの属性を監視する方法をさらに提供する。特定の理論に束縛されることなく、本明細書で提供される属性を監視する方法は、有利には、より少ない時間しか必要とせず、及び／又は消化ペプチドの優れた回収率及び分析を達成し、したがって、ポリペプチドの製造に対してリアルタイムでのポリペプチドの監視に向けた進歩を可能にする。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）本開示の方法に従って、第１の時点で得られた第１の試料中のポリペプチドをペプチドマッピング分析のために処理することと、（ｂ）第１の試料のポリペプチドの属性を同定するために、（ａ）で得られた消化試料のペプチドをペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することとを含む。様々な態様において、本方法は、第１の試料の属性を標準物質又は対照と比較することとを含む。代替的な、又は追加の態様において、本方法は、（ｃ）本開示の方法に従って、第２の時点で得られた第２の試料中に存在するポリペプチドをペプチドマッピング分析のために処理することと、（ｄ）第２の試料のポリペプチドの属性を同定するために、（ｃ）で得られた消化試料のペプチドをペプチドマッピング分析のためにＬＣ－ＭＳシステムに注入することと、（ｅ）第１の試料の属性を第２の試料の属性と比較することとを含む。例示的な態様において、第１の試料及び／又は第２の試料は、ポリペプチドを発現する細胞を含む細胞培養物から採取される。
治療用ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含むため、治療用ポリペプチドは、複数の属性（例えば、変化した構造を有する２つ以上のアミノ酸）を有し得、その属性プロファイルに関して記載することができる。本明細書で使用される場合、用語「属性プロファイル」は、治療用ポリペプチドの属性の一覧を指す。様々な例において、属性プロファイルは、任意選択で、治療用ポリペプチドの天然構造に対して化学的同一性又は属性型、例えば脱アミド化を提供する。様々な例において、属性プロファイルは、属性の位置、例えば属性が存在するアミノ酸の位置を提供する。いくつかの態様における属性プロファイルは、治療用ポリペプチドに存在する全ての属性の説明を提供する。他の態様では、属性プロファイルは、治療用ポリペプチドに存在する一部の属性の説明を提供する。例えば、属性プロファイルは、治療用ポリペプチドの特定の部分、例えば細胞外ドメイン、可変領域、超可変領域、ＣＤＲに存在する属性のみを提供し得る。治療用ポリペプチドの種は、治療用ポリペプチドに存在する属性によって特徴付けられる。治療用ポリペプチドの種は、異なる属性プロファイルを有することにより、同じ治療用ポリペプチドの別の種と異なり得る。２つの治療用ポリペプチドが異なる属性プロファイルを有する場合、これらの治療用ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの２つの異なる種を表す。２つの治療用ポリペプチドが同一の属性プロファイルを有する場合、これらの治療用ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの同じ種と見なされる。様々な態様において、本開示の方法はポリペプチドの属性プロファイルを作成することを含む。例示的な態様において、本方法は、属性プロファイルを標準属性プロファイル又は対照属性プロファイルと比較することを含む。代替的な、又は追加の態様において、本方法は、第１の試料のポリペプチドの属性プロファイルを作成することと、第２の試料のポリペプチドの属性プロファイルを作成することとを含む。任意選択で、本方法は、第１の試料の属性プロファイルを第２の試料の属性プロファイルと比較することをさらに含む。
様々な態様において、属性は、ポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基への部分、例えば、脂質、糖、ペプチド、リン酸基、ユビキチンタグ、メチル、アセチル基の結合を触媒する１つ以上の細胞内酵素を含む。例えば、細胞内酵素は、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸に作用して、脂質化（例えば、パルミトイル化、ミリストイル化）、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び／又はタンパク質分解を起こし得る。例示的な態様において、属性は、ポリペプチドの環境の変化によるものであってよい。様々な例において、属性は、例えば、ｐＨの変化、塩分濃度、浸透圧、圧力、温度、光、ＵＶ光等への曝露、空気若しくは酸素への曝露、撹拌／振とう、化学物質若しくは材料（例えば、金属、プラスチック）への曝露又は長期貯蔵等の環境的変化によって引き起こされ得、このような環境変化は、１つ以上のアミノ酸の構造の変化を引き起こす。環境の変化は、例えば、培養培地の変化、又は製剤成分の変化、貯蔵条件の変化等であり得る。一部の態様では、環境の変化は、患者への投与に至るまでの任意の１つ以上のプロセス工程（例えば、１つ以上のタンパク質の生産（例えば、組換え生産）、収集、精製、製剤化、充填、包装、貯蔵、送達及び患者への投与の直前の最終調製）のの間に生じる。製造中に起こり得る例示的な修飾としては、例えば、治療用ポリペプチドのポリペプチドからの残基の除去及び／又はプロテアーゼによって媒介される切断が挙げられる。治療用ポリペプチドの生産後であるが、投与前（例えば、包装及び／又は充填、貯蔵及び／又は輸送／搬送中）に起こり得る例示的な変化としては、例えば、酸化、還元、脱アミド化、脱アミノ化、凝集、変性、沈殿、加水分解、アスパラギン酸塩異性化、Ｎ末端及びＣ末端修飾が挙げられる。したがって、種々の態様において、属性の変化は、細胞内酵素が関与しない非酵素的修飾（例えば、化学修飾）によって引き起こされ得、したがって、治療用ポリペプチドの構造の変化は、非酵素的修飾（例えば、化学修飾）によって引き起こされ得る。種々の実施形態では、修飾は、治療用ポリペプチドの投与後に起こり、（治療用ポリペプチドが投与された対象に対して）ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。
したがって、本開示は、ポリペプチドを製造する方法であって、ポリペプチドを産生する細胞を含む細胞培養物を維持することと、細胞によって産生されるポリペプチドの属性を監視することと、１つ以上の条件を修正してポリペプチドの１つ以上の属性を変化させることとを含む、方法を提供する。修正は、本明細書に記載の方法によって検出された属性又は属性プロファイル（属性又は属性プロファイルの存在、不在、又は変化等）に応じたものであることができる。例示的な態様において、細胞培養のタイプは、流加培養法又は連続灌流培養法である。しかし、本開示の方法は、有利に、いずれの特定のタイプの細胞培養にも限定されない。細胞培養で維持される細胞は、グリコシル化コンピテント細胞であり得る。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は真核細胞であり、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例示的な態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。例示的な態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば，ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えばＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えば，ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば，ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば，ＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ，又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。グリコシル化にコンピテントではない細胞はまた、例えば、グリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに導入することによって、グリコシル化コンピテント細胞に形質転換され得る。例示的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例示的な実施形態において、グリコシル化コンピテント細胞は、フコシル－トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ－フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ（ＦＸ）のいずれか１つ以上の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例示的な実施形態において、グリコシル化コンピテント細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝的に改変されない。例示的な実施形態において、グリコシル化コンピテント細胞は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）又はＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の活性を変えるように遺伝的に改変されない。例示的な態様において、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＮＴＩＩＩ又はＲＭＤを過剰発現するように遺伝的に改変されない。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。細胞培養物は、組換えグリコシル化タンパク質の産生に好適な任意の一連の条件に従って維持され得る。例えば、いくつかの態様では、細胞培養物は、特定のｐＨ、温度、細胞密度、培養体積、溶存酸素レベル、圧力、浸透圧等で維持される。例示的な態様において、ＣＯ２インキュベーター中、標準的な加湿条件下にて５％ＣＯ２で接種前の細胞培養物を振とうする（例えば７０ｒｐｍ）。例示的な態様において、１．５Ｌ培地中約１０６個細胞／ｍＬの播種密度で細胞培養物が播種される。本明細書に記載されるように、クローンは、選択された不対糖鎖含有量（例えば、対照よりも少ない又は多い不対糖鎖含有量）を生成するように選択され得る。クローンに由来する細胞は、本明細書に記載のタンパク質又は抗体組成物の産生のために培養され得ることが理解されるであろう。
例示的な態様において、本開示の方法は、約６．８５～約７．０５、例えば、様々な態様では、約６．８５、約６．８６、約６．８７、約６．８８、約６．８９、約６．９０、約６．９１、約６．９２、約６．９３、約６．９４、約６．９５、約６．９６、約６．９７、約６．９８、約６．９９、約７．００、約７．０１、約７．０２、約７．０３、約７．０４、又は約７．０５のｐＨで細胞培養培地中においてグリコシル化コンピテント細胞を維持することを含む。
例示的な態様において、方法は、３０℃と４０℃の間の温度で細胞培養物を維持することを含む。例示的な実施形態において、温度は、約３２℃～約３８℃又は約３５℃～約３８℃である。
例示的な態様において、方法は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。例示的な態様では、方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ又は約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。様々な態様において、浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、約２００、２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、又は約５００で維持される。
例示的な態様において、方法は、初期細胞培養期間中、約２０％～約６０％酸素飽和度で細胞培養物の溶解酸素（ＤＯ）レベルを維持することを含む。例示的な例では、方法は、初期細胞培養期間中、約３０％～約５０％（例えば、約３５％～約４５％）の酸素飽和度に細胞培養物のＤＯレベルを維持することを含む。例示的な例において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、又は約６０％酸素飽和度で細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。例示的な態様において、ＤＯレベルは、約３５ｍｍＨｇ～約８５ｍｍＨｇ又は約４０ｍｍＨｇ～約８０ｍｍＨｇ又は約４５ｍｍＨｇ～約７５ｍｍＨｇである。
細胞培養は、任意の１つ以上の培養培地中で維持される。例示的な態様において、細胞培養は、細胞増殖に適切な培地中で維持され、及び／又は任意の適切な供給スケジュールに従って１つ以上のフィード培地とともにもたらされる。例示的な態様では、方法は、グルコース、フコース、乳酸塩、アンモニア、グルタミン及び／又はグルタメートを含む培地中で細胞培養物を維持することを含む。例示的な態様において、方法は、初期細胞培養期間中、約１μＭ以下の濃度のマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、約０．２５μＭ～約１μＭマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、無視できる量のマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約５０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約４０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約３０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。例示的な態様において、培地は、約５ｐｐｂ以上又は約１０ｐｐｂ以上の濃度の銅を含む。例示的な態様において、細胞培養培地は、マンノースを含む。例示的な態様において、細胞培養培地は、マンノースを含まない。
治療用ポリペプチド
以下の１つ以上に結合するものを含むポリペプチドは、本明細書で開示する方法において処理及び分析することができる。これらには、受容体結合を妨害するものを含む、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０及びＣＤ３４を含むＣＤタンパク質が含まれる。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びＥＧＦ受容体を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質。細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－Ｉ、ＭｏＩ、ｐｌ５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＶＣＡＭ、及びα ｖ／β ３インテグリン。成長因子、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管阻害物質、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ－Ｉ－α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ－β等の神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦを含む線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、特に、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βを含む、例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４又はＴＧＦ－β５を含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、並びに骨誘導因子。インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様成長因子結合タンパク質を含むインスリン及びインスリン関連タンパク質。とりわけ第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、α－１－アンチトリプシン等の凝固及び凝固関連タンパク質、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ－ＰＡ」）等のプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）、トロンビン及びトロンボポエチン；（ｖｉｉ）アルブミン、ＩｇＥ及び血液型抗原を含むがそれらに限定されない他の血液タンパク質及び血清タンパク質。コロニー刺激因子及びその受容体、特に、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ、並びにこれらの受容体、例えばＣＳＦ－１受容体（ｃ－ｆｍｓ）。受容体及び受容体関連タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ＬＤＬ受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ－Ｒ」、「ｃ－ｍｐｌ」）、グルカゴン受容体、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、Ｔ細胞受容体、幹細胞因子受容体、例えばｃ－Ｋｉｔ、及び他の受容体。受容体リガンド、例えば、ＯＸ４０受容体のリガンドであるＯＸ４０Ｌ。骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン－３、－４、－５又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５又はＮＴ－６）を含む、神経栄養因子。リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン；インターフェロン及びインターフェロン受容体、例えば、インターフェロン－α、－β、及び－γ、並びにこれらの受容体。数ある中でもＩＬ－１～ＩＬ－３３及びＩＬ－１～ＩＬ－３３受容体（例えばＩＬ－８受容体）が挙げられるインターロイキン及びインターロイキン受容体。ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原が挙げられるウイルス抗原。リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、及びアクチビン。インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体。ミオスタチン、ＴＡＬＬ－Ｉ、アミロイドタンパク質、例えば、以下に限定されないが、アミロイドβタンパク質、胸腺間質性リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ」）、ＲＡＮＫリガンド（「ＲＡＮＫＬ」又は「ＯＰＧＬ」）、ｃ－ｋｉｔを含むＴＡＬＬタンパク質、ＴＮＦ受容体１型を含むＴＮＦ受容体、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、アンジオポエチン及び前述のいずれかの生物活性フラグメント又はアナログ又は変異体。
例示的なポリペプチド及び抗体としては、Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）；アリロクマブ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン－アルファ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ若しくはエリスロポエチン）；Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ－１ａ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロンβ）；ボコシズマブ（Ｌ１Ｌ３と指定された抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体、米国特許第８０８０２４３号明細書を参照されたい）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）；Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）；ＭＬＮ０００２（抗α４β７ ｍＡｂ）；ＭＬＮ１２０２（抗ＣＣＲ２ケモカイン受容体ｍＡｂ）；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；Ｅｐｒｅｘ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）；エボロクマブ；Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（ソマトロピン）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ソマトロピン［ｒＤＮＡ由来］注射液）；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（インターフェロンアルファコン－１）；Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド）；Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルガモスチム）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）（ベリムマブ）；Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標）（テネクテプラーゼ）；Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）；Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（セルトリズマブペゴル）；Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）；ペキセリズマブ（抗Ｃ５補体）；ＭＥＤＩ－５２４（Ｎｕｍａｘ（登録商標））；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））；Ｔｒａｂｉｏ（登録商標）（レルデリムマブ）；ＴｈｅｒａＣｉｍ ｈＲ３（ニモツズマブ）；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（ペルツズマブ、２Ｃ４）；Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ－１）；ＯｖａＲｅｘ（登録商標）（Ｂ４３．１３）；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビジリズマブ）；カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２－ＤＭｌ）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ＰＥＧ化フィルガストリム、ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ、ＰＥＧ化ｈｕ－Ｍｅｔ－Ｇ－ＣＳＦ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ－ＣＤ３）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）（抗ＩＬ６受容体ｍＡｂ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４（ザノリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）；Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）；Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ－２ａ）；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）；Ｓｔｅｌａｒａ（商標）（ウステキヌマブ）；Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）；Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）；１４６Ｂ７－ＣＨＯ（抗ＩＬ１５抗体、米国特許第７１５３５０７号明細書を参照されたい）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）；Ｖａｌｏｒｔｉｍ（登録商標）（ＭＤＸ－１３０３、抗炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原ｍＡｂ）；ＡＢｔｈｒａｘ（商標）；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＥＴＩ２１１（抗ＭＲＳＡ ｍＡｂ）、ＩＬ－１ Ｔｒａｐ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及び両ＩＬ－Ｉ受容体成分（１型受容体及び受容体補助タンパク質）の細胞外ドメイン）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃと融合したＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｅｔｉａ（エゼチマイブ）、アタシセプト（ＴＡＣＩ－Ｉｇ）、抗α４β７ ｍＡｂ（ベドリズマブ）；ガリキシマブ（抗ＣＤ８０モノクローナル抗体）、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ（ルミリキシマブ）；ＢＲ２－Ｆｃ（ｈｕＢＲ３／ｈｕＦｃ融合タンパク質、可溶性ＢＡＦＦ拮抗薬）；Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；マパツズマブ（ヒト抗ＴＲＡＩＬ受容体－１ ｍＡｂ）；オクレリズマブ（抗ＣＤ２０ヒトｍＡｂ）；ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ザルツムマブ）；Ｍ２００（ボロシキシマブ、抗α５β１インテグリンｍＡｂ）；ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ及びＶＥＧＦＲ－１（ＩＭＣ－１８Ｆ１）；抗ＢＲ３ ｍＡｂ；抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及び毒素Ｂ Ｃ ｍＡｂｓ ＭＤＸ－０６６（ＣＤＡ－１）及びＭＤＸ－１３８８）；抗ＣＤ２２ ｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－３８８８及びＣＡＴ－８０１５）；抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＴＳＬＰ抗体；抗ＴＳＬＰ受容体抗体（米国特許第８１０１１８２号明細書）；Ａ５と指定された抗ＴＳＬＰ抗体（米国特許第７９８２０１６号明細書）；（抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＮＩ－０４０１））；アデカツムマブ（ＭＴ２０１、抗ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３２６ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－０６０、ＳＧＮ－３０、ＳＧＮ－３５（抗ＣＤ３０ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－１３３３（抗ＩＦＮＡＲ）；ＨｕＭａｘ ＣＤ３８（抗ＣＤ３８ ｍＡｂ）；抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ；抗Ｃｒｉｐｔｏ ｍＡｂ；抗ＣＴＧＦ特発性肺線維症第１期フィブロゲン（ＦＧ－３０１９）；抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ；抗エオタキシン１ ｍＡｂ（ＣＡＴ－２１３）；抗ＦＧＦ８ ｍＡｂ；抗ガングリオシドＧＤ２ ｍＡｂ；抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書を参照されたい）、Ａｂ－５と指定された抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書）；抗ガングリオシドＧＭ２ ｍＡｂ；抗ＧＤＦ－８ヒトｍＡｂ（ＭＹＯ－０２９）；抗ＧＭ－ＣＳＦ受容体ｍＡｂ（ＣＡＭ－３００１）；抗ＨｅｐＣ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ ＨｅｐＣ）；ＭＥＤＩ－５４５、ＭＤＸ－１１０３（抗ＩＦＮα ｍＡｂ）；抗ＩＧＦ１Ｒ ｍＡｂ；抗ＩＧＦ－１Ｒ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０ ｍＡｂ（ブリアキヌマブ）；抗ＩＬ－２３ｐ１９ ｍＡｂ（ＬＹ２５２５６２３）；抗ＩＬ１３ ｍＡｂ（ＣＡＴ－３５４）；抗ＩＬ－１７ ｍＡｂ（ＡＩＮ４５７）；抗ＩＬ２Ｒａ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＩＬ５受容体ｍＡｂ；抗インテグリン受容体ｍＡｂ（ＭＤＸ－Ｏｌ８、ＣＮＴＯ９５）；抗ＩＰＩＯ潰瘍性大腸炎ｍＡｂ（ＭＤＸ－１１００）；抗ＬＬＹ抗体；ＢＭＳ－６６５１３；抗マンノース受容体／ｈＣＧβ ｍＡｂ（ＭＤＸ－１３０７）；抗メソテリンｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－５００１）；抗ＰＤｌｍＡｂ（ＭＤＸ－１ １０６（ＯＮＯ－４５３８））；抗ＰＤＧＦＲα抗体（ＩＭＣ－３Ｇ３）；抗ＴＧＦβ ｍＡｂ（ＧＣ－１００８）；抗ＴＲＡＩＬ受容体－２ヒトｍＡｂ（ＨＧＳ－ＥＴＲ２）；抗ＴＷＥＡＫ ｍＡｂ；抗ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ－１ ｍＡｂ；抗ＺＰ３ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＺＰ３）；ＮＶＳ抗体＃１；ＮＶＳ抗体＃２、及びアミロイドベータモノクローナル抗体が挙げられる。
本方法及び医薬製剤に好適な抗体の例としては、表Ｇに示す抗体が挙げられる。好適な抗体のその他の例として、下記が挙げられる：インフリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デミシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ １４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクス。
抗体としては、さらにアダリムマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エレヌマブ、エボロクマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、テゼペルマブ及びトラスツズマブ並びに表Ｇから選択される抗体も挙げられる。
Figure 2023543167000013
Figure 2023543167000014
一部の実施形態では、治療用ポリペプチドは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子である。ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、癌細胞に対してＴ細胞の細胞傷害活性を指示する遺伝子組換え二重特異性モノクローナル抗体である。それらは、約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上の様々な抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は４個の異なる遺伝子由来のアミノ酸配列の融合である。ｓｃＦｖの一方は、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は、腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する。ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標））は、ＣＤ１９に対して特異的であるＢｉＴＥ（登録商標）分子の一例である。改変されているＢｉＴＥ（登録商標）分子（例えば、半減期を延長するように改変されているもの）も本開示の方法で使用され得る。様々な態様において、ポリペプチドは抗原結合性タンパク質、例えば、ＢｉＴＥ（登録商標）分子である。例示的な態様において、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、配列番号８８（図１）と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むドメインを含む。
例示的な実施形態
本発明の例示的な実施形態は次のことを含むが限定されない：
Ｅ１．ポリペプチドを処理する方法であって、
ａ．ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと；
ｂ．消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすることとを含む、方法。
Ｅ２．任意選択で、質量分光測定により消化試料を分析することをさらに含み、消化試料は、インキュベート後に質量分光測定計に直接注入される、実施形態１に記載の方法。
Ｅ３．カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の長鎖ペプチドの回収率を増加させる方法であって、消化試料は、少なくとも２種のペプチドを含み、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法。
Ｅ４．消化試料のペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する、実施形態３に記載の方法。
Ｅ５．カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料のペプチドの溶解度を増加させる方法であって、消化試料は、少なくとも２種のペプチドを含み、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法。
Ｅ６．消化試料のペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する、実施形態５に記載の方法。
Ｅ７．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きい、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、６０アミノ酸長より大きい、実施形態７に記載の方法。
Ｅ９．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、７０アミノ酸長より大きい、実施形態８に記載の方法。
Ｅ１０．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、８０アミノ酸長より大きい、実施形態９に記載の方法。
Ｅ１１．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きく、５個を超える疎水性アミノ酸、任意選択で１０個を超える疎水性アミノ酸を含む、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２．消化試料のペプチドのうちの少なくとも１つは、５０アミノ酸長より大きく、１個以上のトリプトファン残基、任意選択で２個又は３個のトリプトファン残基を含む、実施形態７～１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１３．消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの溶解度は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの溶解度と比較して増加する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４．消化試料の５０アミノ酸長より大きいペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して増加する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．消化試料のペプチドの回収率は、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートせずに処理したペプチドの回収率と比較して少なくとも３倍又は４倍増加する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６．プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、シュードトリプシン、又はそれらの組み合わせである、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．ポリペプチドは、１種のみのプロテアーゼにより消化される、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８．ポリペプチドは、少なくとも２種のプロテアーゼにより消化され、任意選択で、ポリペプチドは、２種のみのプロテアーゼにより消化される、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９．ポリペプチドは、トリプシン及びエラスターゼ、又はトリプシン及びキモトリプシンにより消化される、実施形態１８に記載の方法。
Ｅ２０．ポリペプチドは、カオトロープの存在下で消化される、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２１．消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで機械的な振とうを用いてインキュベートすることを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２．消化試料を、弱酸性のｐＨ、任意選択で約４～約６のｐＨでインキュベートすることを含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．弱酸性のｐＨは５．５未満である、実施形態２２の方法。
Ｅ２４．弱酸性のｐＨは約４．８～約５．２である、実施形態２３に記載の方法。
Ｅ２５．弱酸性のｐＨは約５．０である、実施形態２４に記載の方法。
Ｅ２６．消化試料を、カオトロープの存在下でインキュベートすることを含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２７．消化試料を、尿素、ｎ－ブタノール、エタノール、グアニジン、又はそれらの塩、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、及び／又はチオ尿素の存在下でインキュベートすることを含む、実施形態２６に記載の方法。
Ｅ２８．消化試料を、グアニジン又はその塩の存在下でインキュベートすることを含む、実施形態２６又は２７に記載の方法。
Ｅ２９．グアニジンの塩は、塩酸グアニジン、硝酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、又は炭酸グアニジンである、実施形態２８に記載の方法。
Ｅ３０．塩は塩酸グアニジンである、実施形態２９に記載の方法。
Ｅ３１．消化試料を、２Ｍのグアニジンの存在下でインキュベートすることを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３２．消化試料を、３Ｍのグアニジンの存在下でインキュベートすることを含む、実施形態３１に記載の方法。
Ｅ３３．消化試料を、５Ｍ未満のグアニジンの存在下でインキュベートすることを含む、実施形態３１又は３２に記載の方法。
Ｅ３４．消化試料を、約４Ｍのグアニジンの存在下でインキュベートすることを含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３５．消化試料を、有機溶媒、アルコール、アセトニトリル、尿素、界面活性剤、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つ以上の存在下でインキュベートすることを含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３６．界面活性剤は非イオン性界面活性剤である、実施形態３５に記載の方法。
Ｅ３７．非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン又はグリコシドである、実施形態３６に記載の方法。
Ｅ３８．ポリオキシエチレンは、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊシリーズの界面活性剤、脂質、又は脂肪酸である、実施形態３７に記載の方法。
Ｅ３９．ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを任意選択で含む、ポリペプチドを処理する方法であって、少なくとも１種のペプチドはＣ末端トリプトファンを含む、方法。
Ｅ４０．Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は、ポリペプチドを、ＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化せずに処理したペプチドの回収率よりも増加する、実施形態３９に記載の方法。
Ｅ４１．Ｃ末端Ｔｒｐを含むペプチドの回収率は２０％超である、実施形態４０に記載の方法。
Ｅ４２．方法は、ポリペプチドを、１種のみのプロテアーゼにより消化することを含む、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４３．プロテアーゼは、トリプシン、又はそのプロテオフォーム若しくはアイソフォームである、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４４．プロテオフォームはシュードトリプシンである、実施形態４３に記載の方法。
Ｅ４５．ポリペプチドを酸性のｐＨ、任意選択で約４～約６のｐＨでトリプシンにより消化することを含む、実施形態４３に記載の方法。
Ｅ４６．ｐＨは約５である、実施形態４５に記載の方法。
Ｅ４７．方法は、ポリペプチドを、少なくとも２種のプロテアーゼ、任意選択で２種のプロテアーゼのみにより消化することを含む、実施形態３９～４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４８．プロテアーゼのうちの少なくとも１つはトリプシンである、実施形態４７に記載の方法。
Ｅ４９．プロテアーゼのうちの少なくとも１つはキモトリプシンである、実施形態４７又は４８に記載の方法。
Ｅ５０．ポリペプチドをトリプシン及びキモトリプシンで連続して消化することを含む、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５１．ポリペプチドをトリプシンにより消化し、後にポリペプチドをキモトリプシンにより消化することを含む、実施形態５０に記載の方法。
Ｅ５２．消化は、中性のｐＨ、任意選択で、ｐＨ７．５で行われる、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５３．ポリペプチドは抗原結合性タンパク質であり、任意選択で、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子である、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５４．ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、ＣＤ３結合ドメインを含む、実施形態５３に記載の方法。
Ｅ５５．ポリペプチドは、５０アミノ酸より大きい配列を含み、配列は、少なくとも１個のＴｒｐ残基、任意選択で、少なくとも２個又は３個のＴｒｐ残基を含む、実施形態３９～５４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５６．ポリペプチドは、６０アミノ酸より大きい、７０アミノ酸より大きい、又は８０アミノ酸より大きい配列を含み、配列は、少なくとも１個のＴｒｐ残基を含む、実施形態５５に記載の方法。
Ｅ５７．ペプチドは、配列番号８８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、少なくとも１個のＴｒｐを含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５８．消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５９．ポリペプチドは、１２時間未満、ペプチドマッピング分析のために処理される、実施形態１～５８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６０．ポリペプチドは、６時間未満、ペプチドマッピング分析のために処理される、実施形態５９に記載の方法。
Ｅ６１．ポリペプチドは、４時間未満、ペプチドマッピング分析のために処理される、実施形態６０に記載の方法。
Ｅ６２．方法は、ゲルフィルタのみを用いて、又は全くフィルタを用いずに行われる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６３．方法は、全くフィルタを用いずに行われる、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６４．方法は、ゲルフィルタのみを用いて行われる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６５．ゲルフィルタを用いたバッファ交換を含む、又はバッファ交換を全く含まない、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６６．ポリペプチドの属性を監視する方法であって、
ａ）実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法に従って、第１の時点で得られた第１の試料中の第１のポリペプチドを処理することと、
ｂ）消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入し、第１の試料のポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定することと、
ｃ）実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法に従って、第２の時点で得られた、第１のポリペプチドと同じ又は異なる、第２の試料中の第２のポリペプチドを処理することと、
ｄ）消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入し、第２の試料のポリペプチドのＰＴＭを同定することと、
ｅ）第１の試料のＰＴＭを第２の試料のＰＴＭと比較することとを含む、方法。
Ｅ６７．試料は、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドを発現する細胞を含む細胞培養物から採取される、実施形態６６に記載の方法。
Ｅ６８．ポリペプチドを、約１：１～約１：１５の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）重量比でトリプシンにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを含む、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６９．Ｅ：Ｓ重量比は約１：１～約１：１０である、実施形態６８に記載の方法。
Ｅ７０．Ｅ：Ｓ重量比は約１：２～約１：８である、実施形態６９に記載の方法。
Ｅ７１．Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である、実施形態７０に記載の方法。
Ｅ７２．消化は約７．０～約８．０のｐＨで行われる、実施形態６８～７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７３．消化は約７．５のｐＨで行われる、実施形態７２に記載の方法。
Ｅ７４．消化は約１２時間未満行われる、実施形態６８～７３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７５．消化は約６時間未満行われる、実施形態７４に記載の方法。
Ｅ７６．消化は約４時間未満行われる、実施形態７５に記載の方法。
Ｅ７７．消化は約２時間～約４時間未満行われる、実施形態７６に記載の方法。
Ｅ７８．消化は、約３０℃～約４５℃の温度で行われる、実施形態６８～７７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７９．消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択で約３７℃の温度で行われる、実施形態７８に記載の方法。
Ｅ８０．消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる、実施形態６８～７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８１．消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる、実施形態６８～７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８２．ポリペプチドを消化するためにトリプシンのみが使用される、実施形態６８～８１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８３．ポリペプチドは、約１：１～約１：１５のＥ：Ｓ重量比でトリプシンのみにより消化される、実施形態６８～８２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８４．ポリペプチドを、当該Ｅ：Ｓ重量比でトリプシンにより消化すると、Ｃ末端にチロシンを含む１種以上のペプチドを含む前記消化試料が生成される、実施形態６８～８３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８５．ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前に、ポリペプチドを変性させること、ポリペプチドを還元すること、及び／又はポリペプチドをアルキル化することを含む、実施形態１～８４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８６．ポリペプチドをプロテアーゼにより消化する前、且つポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含む、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８７．バッファ交換はサイズ排除カートリッジの使用を含む、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８８．サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである、実施形態８７に記載の方法。
Ｅ８９．消化試料を、弱酸性のｐＨでカオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む、実施形態６８～８８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９０．カオトロープは塩酸グアニジンである、実施形態８９に記載の方法。
Ｅ９１．弱酸性のｐＨは約５である、実施形態８９又は９０に記載の方法。
Ｅ９２．消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む、実施形態１～９１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９３．各々がＣ末端にチロシンを含む少なくとも１種又は２種のペプチドを含む消化試料を生成するように、ポリペプチドを処理する方法であって、前記方法は、約１：１～約１：１５のトリプシン：ポリペプチド比でポリペプチドをトリプシンにより消化することを含む、方法。
Ｅ９４．消化は、実施形態６９～９２のいずれか１つの方法に従って行われる、実施形態９３に記載の方法。
Ｅ９５．消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、実施形態９３又は９４に記載の方法。
Ｅ９６．ポリペプチドを消化するためにトリプシンのみが使用される、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９７．Ｅ：Ｓ重量比は約１：１～約１：１０である、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９８．Ｅ：Ｓ重量比は約１：２～約１：８である、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９９．Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択で、約１：５である、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１００．消化は約７．０～約８．０のｐＨで行われる、実施形態９３～９９のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は本発明を単に説明するために示され、その範囲を決して限定するものではない。
以下の実施例では、第１の抗原に結合する第１の結合ドメインとＴ細胞受容体のＣＤ３εに結合する第２の結合ドメインを各々が有する、異なる二特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））分子を分析した。これらのＢｉＴＥ（登録商標）分子は、第１の結合ドメインが異なっていた。ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１及びＢｉＴＥ（登録商標）分子＃２の各々はＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する第１の結合ドメインを含んでいたが、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃３はＣＤ１９に結合する第１の結合ドメインを含んでいた。第２結合ドメインはＢｉＴＥ（登録商標）分子間で共通であった。図１は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子に共通するＣＤ３結合ドメインの配列を示す。この図に示すように、ＣＤ３結合ドメインは、長鎖リンカー領域のすぐ側に２個のＣＤＲを備える。この２個のＣＤＲは、図１において黄色でハイライトした文字で示されている。配列
Figure 2023543167000015
 （配列番号８９）を含む１個のＣＤＲは、脱アミド化に感受性がある２個のアスパラギン残基、及び酸化に感受性があるトリプトファン残基を含む。これらの残基を製造中に監視することには利点があるが、２個のＣＤＲを含むＣＤ３結合ドメインの長い伸び（図１の下線部）にはトリプシン消化部位がないため、分子のこの領域を分析及び監視することが困難になる。トリプシン消化部位がないため、８０アミノ酸超のこのペプチドは無傷のままで、溶解度が低く、そのため分析のための回収がうまくいかない。したがって、これらのＣＤＲ内の関心対象の属性は、このペプチドのサイズが大きい（約８ｋＤａ）こと、修飾されたバージョンのペプチドをクロマトグラフィーによって分離することの困難、ペプチドの不良な回収率及び／又はイオン化並びにこのサイズのペプチドに対応する質量分光測定法を解釈することに関連する一般的課題があるために、監視できない。
分析したＢｉＴＥ（登録商標）分子のトリプシン消化時に生じた大きなペプチド（図１の下線部の配列及び配列番号９１の配列を有する）は、このペプチドの最初のアミノ酸（Ｈｉｓ）は分析したＢｉＴＥ（登録商標）分子のうちの１つ（以下ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１）の３５０番目のアミノ酸であり、Ａｒｇはその４３６番目のアミノ酸であるため、本明細書では「Ｈ３５０－Ｒ４３６」ペプチドと呼ぶ。このアミノ酸配列は、本明細書で分析した他のＢｉＴＥ（登録商標）分子にも存在するが、この配列は、これらの他のＢｉＴＥ（登録商標）分子のアミノ酸３５０－４３６を表す場合もあれば、表さない場合もある。この配列のアミノ酸番号は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１のアミノ酸番号に対して、これらの他のＢｉＴＥ（登録商標）分子では異なっている場合がある。例えば、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃３では、アミノ酸Ｈ３５５－Ｒ４４１はＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１のＨ３５０－Ｒ４３６に相当する。ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１～＃３のこの領域のアライメントを図２に示す。この図では、Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドは「Ｈ３５７－Ｒ４４３」と記される。還元対象となるＣｙｓ残基は黄色でハイライトされている。図２に示すように、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のこの領域は、ＣＤ３結合ドメインの２個のＣＤＲを包含している。
このペプチドは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のペプチドマッピングが難しい唯一の領域ではない。多くのＢｉＴＥ（登録商標）分子は、第１の結合ドメインのＣＤＲのすぐ側の短鎖リンカーペプチド（約５～７ｋＤａ）も有しており、トリプシン消化による監視が同様に困難であり得る。例えば、５．７ｋＤａのリンカーペプチドのうち、ＣＤＲの一部であるアスパラギン酸は異性化の可能性があり、したがって、とりわけ、この部位がＢｉＴＥ（登録商標）分子の結合に影響を与える可能性があるため、監視を必要とする。このように、本明細書で示される研究は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の長鎖ペプチドの溶解度及び回収率を増加させることを目的としていた。
実施例１
本実施例は、従来のペプチドマッピング法を用いたＢｉＴＥ（登録商標）分子の長鎖ペプチドの不十分な回収率を実証する。
最初の研究では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１をトリプシン消化に供した。トリプシンペプチドは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）バイアル内のトリプシン消化液（ｐＨ７．５）中で、５℃又は３７℃で最長４３０分貯蔵した。トリプシン消化液は０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５であり、カオトロープを含んでいなかった。トリプシンペプチドのシグナルを測定するために、液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに、１００分間隔で４回の注入を行った。消化時間の関数としてプロットしたペプチド回収率を表すトリプシンペプチドの相対存在量を、図３Ａのクロマトグラムに示す。この図に示すように、Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドのシグナルは、３７℃で貯蔵すると時間の経過とともに減少しており、このペプチドの存在量が低く、回収率が低いことを示唆している。このペプチドは凝集した（そのためＬＣ－ＭＳで分離及び分析できなかった）か、ＬＣバイアルの壁に吸着した（ＬＣ－ＭＳシステムに注入されなかった）かのいずれかであると考えられる。
貯蔵した消化試料の目視検査を実施した。繊維状粒子が、ＨＰＬＣバイアルに５℃で４８時間貯蔵した消化試料内で観察された（図３Ｂ）。理論によって制限されることなく、この観察から、長鎖ペプチドＨ３５０－Ｒ４３６のようなトリプシンペプチドの集団が繊維状粒子の中で凝集しており、溶解度が低いことが示唆された。
実施例２
本実施例では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のトリプシンペプチドの溶解度にカオトロープが与える影響を示す。
初期の一連の実験では、抗体をペプチドマッピング分析のために、変性、アルキル化、還元、消化、及びクエンチ等によって処理した。しかし、抗体の１個以上のＣＤＲにまたがるペプチドが、ペプチドマッピングには不十分な量で回収されたため、抗体の調製には問題があった。この回収率の低いペプチドにはトリプトファン残基を含有していた。（１）ＮａＣｌ、（２）アルコール、（３）非イオン性界面活性剤のオクチルβ－Ｄ－グルコシド（ＯＢＧ）、（４）尿素、及び（５）グアニジンという異なるカオトロピック試薬について、ペプチドの溶解度及び回収率を増加させることができるかどうか試験した。これらの初期実験から、グアニジンの存在下で消化試料をインキュベートすることで、ＣＤＲ含有トリプシンペプチドがバイアルから最もよく回収されることが実証された。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１の長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドはＴｒｐ残基を含有し（図１）、抗体の回収率が低いＴｒｐ含有ペプチドと同様に回収率が低い（実施例１）ため、カオトロープの存在下で消化試料をインキュベートすることを含む、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含む試料を処理する方法は、長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドの溶解度を改善できるかどうかを確かめるために評価した。長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドの溶解度を増加することができれば、回収率も増加するはずである。要約すると、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含む消化後溶液を、塩酸グアニジンの存在下又は不在下でペプチドマッピングのために処理した。ペプチドマッピング分析のためのＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１の調製の各ステップを、ライトチャンバで詳細に観察した。バイアルの代表的な画像を図４Ａ～図４Ｄに示す。これらの図に示すように、溶液は、（ａ）還元し、アルキル化したもの（バイアル２及び３）、（ｂ）還元し、アルキル化し、その後トリプシンにより消化したもの（バイアル４及び５）、又は（ｃ）未処理のもの（バイアル１）であった。
図４Ａに示すように、還元され、アルキル化された（バイアル２及び３）か、又は還元され、アルキル化され、消化された（バイアル４及び５）溶液は、未処理溶液（バイアル１）と比較していくらかの濁りを示した。バイアル２～５の濁りは、ペプチドの溶解度の低さを示唆した。図４Ｂに示すように、１０分後、バイアル２及び３では濁りが残っていたが、還元され、アルキル化され、消化された溶液（バイアル４及び５）では、目に見える粒子が観察されたものの溶液は透明になった。図４Ａ及び図４Ｂの右側の画像に、溶液の拡大画像を示す。拡大画像に示すように、バイアル５の濁りはトリプシン消化によりなくなったが、繊維状粒子が形成されている。繊維状粒子を含むバイアル５のさらなる拡大画像を示す（図４Ｃの下）。
バイアル３及び５のそれぞれの内容物を２つに分けた。バイアル３の一方のアリコート及びバイアル５の一方のアリコートには、塩酸グアニジンを最終濃度４Ｍになるように添加し、他方のアリコートには塩酸グアニジンを添加しなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。図４Ｃ及び図４Ｄに示すように、塩酸グアニジンを添加したバイアルのみで濁り及び目に見える粒子が全て消失した。この作用は、カオトロープを加えたほぼ直後のものであった。対照的に、グアニジンＨＣｌで処理されなかったバイアル（「ＧｕＨＣｌなし」と記される）は濁ったままであり、及び／又は繊維状粒子を含んでいた（図４Ｃ及び図４Ｄのそれぞれの左側のバイアル）。
これらの結果は、塩酸グアニジンが、濁っている又は繊維状の粒子を可溶化することを示唆しており、分析前のトリプシンペプチドの可溶性を高めるために、消化後にカオトロープを含めることを示唆している。
実施例３
本実施例では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のトリプシンペプチドの回収率にカオトロープが与える影響を示す。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子（ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１又はＢｉＴＥ（登録商標）分子＃２）を含む溶液を、液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）ペプチドマッピングのために異なるように処理し、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドの相対存在量（回収率を表す）を比較した。各調製方法は、変性、アルキル化、還元、バッファ交換、消化、及びＨＰＬＣ－ＭＳ分析を含んでいた。インキュベート後の消化された物質の試料は、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに直接注入された。変性は、６Ｍのグアニジン、ｐＨ７．５で行われた。アルキル化のためにヨード酢酸（ＩＡＡ）を、還元のためにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を変性された物質にそれぞれ添加した。消化は、本質的に実施例１に記載したように、ｐＨ７．５でトリプシンを用いて行った。調製方法は以下に述べるように異なっていた。
図５Ａに示す第１の方法では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液を６Ｍのグアニジン（ｐＨ７．５）中で変性させ、ＩＡＡ及びＤＴＴをそれぞれアルキル化及び還元のために添加した。変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチドを消化バッファに入れるバッファ交換を、ＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過によって行い、これにより変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチド（タンパク質）をグアニジンから分離した。変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチドを含む溶出物質をｐＨ７．５でトリプシンにより消化した。消化試料に、（１）２、５、若しくは７．５の最終ｐＨを得られるように適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加し、４Ｍの最終グアニジン濃度を得られるように塩酸グアニジンのストック溶液（ｐＨ４）を添加するか、又は（２）塩酸グアニジンは添加せずに２、５、若しくは７．５の最終ｐＨを得られるように適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加した。消化試料を含む溶液の試料は、バッファ交換はせず、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに直接注入した。
図５Ｂに示す第２の方法では、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液を６Ｍのグアニジン（ｐＨ７．５）中で変性させ、ＩＡＡ及びＤＴＴをそれぞれアルキル化及び還元のために添加した。変性、アルキル化、及び還元は、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタ上で行った。１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタは陰性対照として使用した。変性、アルキル化、及び還元の後、ＭＷＣＯフィルタより上の内容物をフィルタに通して遠心分離した。変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチドを含むろ液に消化バッファを添加し、この混合物をＭＷＣＯフィルタの上に置いた。消化は、２つの異なるブランドのトリプシンのうちの１つを用いて、ｐＨ７．５で行った。消化試料に、（１）２、５、若しくは７．５の最終ｐＨを得られるように適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加し、４Ｍの最終グアニジン濃度を得られるように塩酸グアニジンのストック溶液（ｐＨ４）を添加するか、又は（２）塩酸グアニジンは添加せずに２、５、若しくは７．５の最終ｐＨを得られるように適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加した。インキュベート後、消化試料をＭＷＣＯフィルタに通して遠心分離し、ろ液を分析のために直接ＨＰＬＣ－ＭＳシステムに注入した。
異なる方法によって処理された長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドの相対存在量（相対回収率）を、図６のグラフに示す。この図に示すように、図５Ａの方法論（ゲルろ過バッファ交換を含む）は、図５Ｂの方法論（ＭＷＣＯフィルタバッファ交換を含む）と比較して、全体としてより良好なペプチド回収率をもたらした。図６に示すように、消化後に塩酸グアニジンの存在下でインキュベートした試料はすべて、同じｐＨでグアニジンの不在下でインキュベートした試料と比較して、回収率の向上をもたらした。これらの結果は、グアニジン添加の存在下で消化試料をインキュベートすることによって達成された回収率の向上が、ｐＨ及びバッファ交換方法（ゲルろ過対ＭＷＣＯフィルタ）に依存しないことも実証している。予想通り、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを使用した試料では、検出可能なペプチドは回収されなかった。図６に示すように、消化試料をｐＨ５で塩酸グアニジンとともにインキュベートすると、他の試験したｐＨ（ｐＨ２又はｐＨ７．５）で塩酸グアニジンを用いた場合の回収率よりも著しく良好であった。ゲルフィルタで処理した試料に関してはｐＨ５で消化試料をインキュベートすると、塩酸グアニジンなしでも、かなりのペプチド回収率がもたらされた。これらの結果は、４Ｍのグアニジンの存在下で消化試料をｐＨ５でインキュベートすることにより、長鎖ペプチドの回収率の顕著な増加をもたらすことを示唆している。ＭＷＣＯフィルタバッファ交換を用いた長鎖ペプチドの全体的な回収率は低かったが（図５Ｂ）、この方法論を用いて得られた結果によって、４Ｍのグアニジンの存在下で消化試料をｐＨ５でインキュベートすると、グアニジンの不在下で消化試料をインキュベートした場合と比較して長鎖ペプチドの回収率が向上するという観測結果が確認された。
カオトロープが質量分光測定計内に存在し、多くのカオトロープがＭＳの性能に悪影響を与えることが知られているため、その結果、質量分光測定計に注入される溶液には通常含まれないことを考えると、グアニジンの存在下でインキュベートした場合の長鎖ペプチドの回収率の向上は驚くべきことであった。
理論によって制限されることなく、ｐＨ２では、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕが電気的に中性で疎水性になり、長鎖ペプチドがさらに疎水性になり（これにより長鎖ペプチドをバイアルの表面に吸着させ得る）、ｐＨ７．５では、このｐＨ（７．５）が長鎖ペプチドのｐＩ（ｐＩ＝９）に近いことから、ペプチドは凝集及び／又は沈殿しやすいため、弱酸性のｐＨでのインキュベートは最良の回収率をもたらした。一般に、ｍＡｂｓ及びＳｃＦｃ－ＢＩＴＥタンパク質のｐＩ値はｐＩ７．５～９の範囲にあり、平均的なペプチドは同じ領域のｐＩを有することを示している。これは、ペプチドは、平均して７超のｐＨでは可溶性が低下することを示唆している。ｐＨが高くなればなるほど、トリプシンペプチドは、望ましくないキモトリプシンによるタンパク質分解及びアスパラギン残基の脱アミド化に晒され得る。
これらの結果は、グアニジンの存在下、消化試料を弱酸性のｐＨでインキュベートすることにより、分析用のタンパク質試料の調製中に長鎖ペプチドの回収率が向上することを示唆している。
実施例４
本実施例は、本明細書で開示されているポリペプチドを処理する方法が、長鎖ペプチド及びその脱アミド化生成物のクロマトグラフィーによる分離に十分であることを実証する。
２ｍｇ／ｍｌのＢｉＴＥ（登録商標）分子＃３を含むＢｉＴＥ（登録商標）分子製剤の第１の試料を、ＮＡＰ５サイズ排除カートリッジを使用して消化バッファにバッファ交換し、消化試料を塩酸グアニジンの存在下でｐＨ最大５でインキュベートする図５Ａの方法論に従ってペプチドマッピングのために処理した。ギ酸（２０％（ｖ／ｖ））を消化試料に添加してｐＨ５．０を得、塩酸グアニジンのストック溶液を消化試料に添加して４Ｍの最終グアニジン濃度を得た。第１の試料と同じＢｉＴＥ（登録商標）分子製剤を含む第２の試料は、ポリペプチドの処理前にｐＨジャンプによりストレスが与えられた。特に、製剤をＰＢＳで希釈し、３７℃で２週間インキュベートすると、製剤のｐＨは４．２から７にシフトした。第１の試料と同じＢｉＴＥ（登録商標）分子製剤を含む第３の試料は、紫外線に曝露することによって光ストレスが与えられた。第１の試料と同じＢｉＴＥ（登録商標）分子製剤を含む第４の試料は、４０℃で１ヶ月間貯蔵することにより熱ストレスが与えられた。このようなストレスは、ポリペプチドの修飾、例えば、脱アミド化ポリペプチド、酸化ポリペプチドを誘導することができる。第２の試料、第３の試料、及び第４の試料をそれぞれ第１の試料と同様に処理し、ここでＮＡＰ５サイズ排除カートリッジを使用して消化バッファにバッファ交換し、消化試料を塩酸グアニジンの存在下でｐＨ最大５でインキュベートした。その後、消化試料をペプチドマッピングによって分析した。
試料の紫外線（ＵＶ）クロマトグラムを図７Ａに示す。長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドのメインピークが示されている。青線は第１の試料、赤線は第２の試料、緑線は第３の試料、マゼンタ線は第４の試料を表す。メインピークの拡大図を図７Ｂに示す。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、第１の試料の長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチド（青線）の回収率は良好であった。図７Ｂに示されるように、第２の試料のメインピークの高さは、第１の試料の高さよりも低かった。第２の試料のメインピークの左右に追加のピークが観察され、これらのピークは、最初に、脱アミド化（アスパラギンがアスパラギン酸残基及びイソアスパラギン酸残基に変換される過程）が１Ｄａの質量変化をもたらすことに基づいて、長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドの脱アミド生成物として割り当てられた。最初の脱アミド化の割り当てを確認するために、質量分光測定を行った。図８Ａ～図８Ｆは、質量分光測定クロマトグラムである。図８Ａは、第１の試料の長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドのメインピークを示す。図８Ｂは、第２の試料に関する長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドのメインピークと、脱アミド化生成物に割り当てられたピーク（番号１～３）とを示す。図８Ｃ～図８Ｆは、図７Ｂ及び図８Ｂにおいてメイン、１、２、３と記されたピークの質量スペクトルである。Ｘ軸はｍ／ｚスケールであり、ｍは質量、ｚは結合したプロトンによってペプチドに与えられる電荷である。図８Ｃ～図８Ｆは、５個の結合したプロトンによって与えられる、電荷５＋（ｚ＝５）のペプチドイオン周辺の質量スペクトルのセクションを示す。Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓの同位体が多いため、質量は複数のピークによって表される。最も高い同位体ピークが平均分子量を表す。平均分子質量はｍ／ｚ＊ｚ－ｚとして計算され、後半の減算は結合したプロトンを除くためのものである。図８Ｃは図８Ａの質量スペクトル、図８Ｄは図８Ｂのピーク１の質量スペクトル、図８Ｅは図８Ｂのピーク２の質量スペクトル、図８Ｆは図８Ｂのピーク３の質量スペクトルである。長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドは、その実測平均質量８５６９Ｄａ（１７１４．８＊５－５＝８５６９Ｄａ、図８Ｃ）及び理論平均質量８５６９Ｄａとが厳密に一致したことによって同定された。また、第２の試料のプレピーク及びポストピークは、その質量がメインピークより約１Ｄａ多いため、脱アミド化生成物として確認された（図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ）。
これまでの実験から、特定のストレス条件下で長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドがＮ３５７及びＮ３６０で脱アミド化され、Ｗ４３１で酸化されることが分かっていた。プレピーク及びポストピークは、Ｎ３５７及びＮ３６０で脱アミド化された生成物として仮に同定した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング中、ペプチドは、質量分光測定計でのフラグメンテーションによって配列決定も行われた（図９）。長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドは、その正確な質量（図８Ａ～図８Ｆ）だけでなく、配列及び予測されるフラグメンテーションパターンとよく一致する多数の断片によっても同定された（図９）。
これらの結果は、ポリペプチドを、ＮＡＰ５サイズ排除カートリッジを使用して消化バッファにバッファ交換し、消化試料をｐＨ最大５で塩酸グアニジンの存在下でインキュベートする図５Ａの方法論によって処理した場合、属性を有するペプチド（長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドの脱アミド化生成物）がプレピーク及びポストピークとしてメインピークからクロマトグラフィーにより分離され得ることを実証する。これらの部位での脱アミド化生成物を観察できることは、それらが分子のＣＤＲの一部であり、ＢｉＴＥ（登録商標）分子のＣＤ３への結合能に影響を与え得ることを考えると重要である。これらのデータは、本明細書に開示されているポリペプチドを処理する方法によって、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の属性監視が可能であることを示唆している。
実施例５
本実施例は、様々な酵素又は酵素の組み合わせ、及びｐＨ５でグアニジンの存在下における消化試料のインキュベートの評価を示す。
前の実施例では、消化はｐＨ７．５でトリプシンを用いて行った。他の酵素は、ペプチドマッピング及びＭＡＭのためのペプチドの回収可能性を向上させる目的で評価した。酵素及びその切断部位のまとめは、図１０の表に記載されている。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含む第１の試料を、ＮＡＰ５サイズ排除カートリッジを使用して消化バッファにバッファ交換し、消化試料をｐＨ５で塩酸グアニジン（４Ｍの最終グアニジン濃度）の存在下でインキュベートする図５Ａの方法論に従って処理した。ＢｉＴＥ（登録商標）分子はグアニジン中で展開（変性）され、ＩＡＡ及びＤＴＴによりアルキル化され還元された。この研究では、消化酵素は、長鎖ペプチドの回収率に与える影響を調べるために変化させた。トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンを用いた消化は、ｐＨ４で行った。一部の例において、トリプシンとエラスターゼ、又はトリプシンとキモトリプシンの組み合わせを用いた連続消化を用いた。それぞれの組み合わせの場合、トリプシンは、２回の消化のうちの第１回目のプロテアーゼとして使用した。キモトリプシンを第２のプロテアーゼとして使用した場合、キモトリプシンはトリプシン消化に直接添加された。しかし、エラスターゼを第２のプロテアーゼとして使用した場合、小さなトリプシンペプチドを除去してから、２回目の消化のためにエラスターゼを添加した。各消化条件は３回行った。
これまでの実験から、長鎖Ｈ３５５－Ｒ４４１ペプチドＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１が、特定のストレス条件下でＮ３５２及びＮ３５５で脱アミド化されるＡｓｎ残基を含有していることが分かった。ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１の長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドと、各消化により長鎖ペプチドがどのように切断されるかを図１１に示す。消化ペプチドの回収率は色分けされている。赤色で囲んだのは、脱アミド化の可能性があるＡｓｎ残基を含むペプチドである。図１１に示すように、トリプシン及びキモトリプシンを用いた連続消化により、脱アミド化された可能性のある残基を含有するペプチドの回収率は５０％超となった。図１２は、各タイプの消化に対して目的のＡｓｎ残基を含むペプチドの回収率をグラフで示す。図１２に示すように、トリプシン及びキモトリプシンを用いて連続して消化することにより、脱アミド化された可能性のあるペプチドの最良の回収率が達成された。
第１の試料の脱アミド化された可能性のあるペプチドの相対存在量を、第１の試料と同じＢｉＴＥ（登録商標）分子製剤を含む第２の試料の相対存在量と比較したが、第２の試料は実施例４に記載したようにｐＨジャンプによってストレスが与えられた。各試料を、ＮＡＰ５サイズ排除カートリッジを使用して消化バッファにバッファ交換し、消化試料をｐＨ５で４Ｍの塩酸グアニジンの存在下でインキュベートする図５Ａの方法論に従って分析のために処理した。各試料は、トリプシン及びキモトリプシンを用いて連続して消化した。図１３Ａは、第１の（無ストレス）試料のＮ３５２及びＮ３５５を含むペプチドの相対存在量を示し、図１３Ｂは、第２の（ストレス負荷）試料のＮ３５２及びＮ３５５を含むペプチドの相対存在量を示す。図１３Ｂに示すように、メインピークの左右に３つの追加ピーク（番号１～３）が観察された。これらの追加のピークは、第２の試料の分子に与えられたｐＨジャンプにより誘発されたストレスによるものであり、Ｎ３５２及びＮ３５５を含むペプチドの脱アミド化生成物を表していた。
ピーク１及び２のＮ３５５で脱アミド化されたペプチドへの割り当て、及びピーク３のＮ３５２で脱アミド化されたペプチドへの割り当ては、ペプチドを質量分光測定計でフラグメンテーションすることによって配列決定により行った。フラグメンテーションして配列決定することによって得られた例示的なＭＳピークを図１４Ａ～図１４Ｄに示す。図１４Ａは、脱アミド化生成物を含む第２の試料のピークを示し、図１４Ｂは、脱アミド化生成物を含まない第１の試料のピークを示す。図１４Ｃは図１４Ａの一部の拡大図であり、図１４Ｄは図１４Ｂの一部の拡大図である。脱アミド化したＮ３５２を表す１Ｄａシフトしたピークが図１４Ｃに示されており、このピークは図１４Ｄでは消失している。
総合すれば、ストレスが与えられた試料のさらなるピークを、脱アミド化生成物として脱アミド化された特定のアミノ酸に最終的に割り当てることができた。これは、トリプシン及びキモトリプシンによる連続消化時に生成されたより短いペプチドが、より良いシーケンスカバレッジを可能にし、フラグメンテーションＭＳ／ＭＳ情報を用いて１Ｄａの増加に関連付けられた脱アミド化部位を正確に検出することができたため可能であった。キモトリプシン消化も、ポリペプチドをＴｒｐのＣ末端で切断するため、キモトリプシン消化でも、より短いペプチドが得られ、より良いシーケンスカバレッジを可能にし、脱アミド化部位の正確な検出を可能にすることができると予想される。ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃３（Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９）及びＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）に関して最近の研究が示した（データはここでは示さず）ように、Ｎ３５５よりもＮ３５２の方がＣＤ３ｅへの結合に大きく影響するため、残基３個分だけ離れた２個のアスパラギン残基における脱アミド化の正確な評価が重要であった。
本実施例では、ＮＡＰ５サイズ排除カートリッジの消化バッファへのバッファ交換と、消化試料を弱酸性のｐＨにおける塩酸グアニジンの存在下でのインキュベートとを含むポリペプチドを処理する方法によって、残基数個分しか離れていないアミノ酸の属性の検出が可能になることが実証された。
実施例６
本実施例は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む例示的な試料を処理する方法を記載しており、消化に異なる酵素を使用する。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子に共通する長鎖ペプチドを、長鎖ペプチド内のＴｒｐのＣ末端を切断するプロテアーゼを用いて消化すると、シーケンスカバレッジの改善をもたらし、脱アミド部位を正確に検出できることが本明細書に示されるデータにより実証された（実施例５）。長鎖ペプチド内の同じ部位で切断するさらなるプロテアーゼを評価した。ある実験では、トリプシンのプロテオフォームであるシュードトリプシンが、プロテアーゼの中でもとりわけ評価された。
シュードトリプシンは、本質的にＰｅｒｕｔｋａ ａｎｄ Ｓｅｂｅｌａ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：２３６７（２０１８）に記載されているように調製する。要約すると、中圧タンパク質液体クロマトグラフィー（ｐＨ７．１、２ｍＬ毎分の流量）内のＨＥＭＡ－ＢＩＯ１０００ ＳＢカラム（０．７５×２５ｃｍ）を試用して、トリプシン自己消化成分を分離する。或いは、ＨＥＭＡ－ＢＩＯカラムの代わりに、勾配溶離（１Ｍ ＮａＣＬを含むバッファＢ）で使用するＵｎｏ Ｓ１２カラム（１５×６８ｍｍ）を使用してもよい。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含む試料は、本質的に実施例３に記載されているように処理される。要約すると、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む試料は変性され、アルキル化され、還元され、ＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過により消化バッファへのバッファ交換が行われる。一連の実験では、消化バッファは、上記の手順及び上述のＰｅｒｕｔｋａ ａｎｄ Ｓｅｂｅｌａ，２０１８に従って精製されたシュードトリプシン（Ψ－トリプシン又はｐｓｉ－トリプシンとしても知られている）を単独で、又はトリプシンと組み合わせて含む。キモトリプシン単独で、又はトリプシン単独での消化も評価される。トリプシン－１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｖ５２８０）、トリプシン－２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）、トリプシン－３（Ｐｉｅｒｃｅ、９００５７）、及びトリプシン－４（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）キット）を含む様々なトリプシン酵素もこの試験で評価される。上記のプロテアーゼを用いた消化は、ｐＨ２、ｐＨ５、及びｐＨ７．５という様々なｐＨで行われる。ペプチドを含む消化試料は、クロマトグラフィー分離及びペプチドマッピングのために、ＬＣ－ＭＳシステムに注入される。
結果は、シュードトリプシンが長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドをＴｒｐのＣ末端で切断し、より小さな２つペプチド Ｈ３５０－Ｗ３６１及びＡ３６２－Ｒ４３６を生成することを裏付けると予想される。この結果は、ｐＨ５でトリプシン－４が長鎖Ｈ３５０－Ｒ４３６ペプチドをＴｒｐのＣ末端で切断することを裏付けることも予想される。ペプチドを小さくすることにより、分子の属性のより優れたマッピング及び監視が可能になる。
本実施例は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の消化にシュードトリプシン及び他の酵素の使用を支持する。シュードトリプシンは、トリプシン及びキモトリプシンによる連続消化時に切断される部位と同じ部位（Ｔｒｐ３６１のＣ末端）で切断すると予想されるため、本実施例は、このシュードトリプシン消化法により、実施例５で記載したものと同じペプチド分析及び属性監視が可能になることを裏付けている。
実施例７
本実施例は、ポリペプチド試料を消化する例示的な方法を示す。
ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１溶液を以下のように処理し、分析した： １．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含む溶液（１００μＬ）は、８Ｍの塩酸グアニジン及び２５０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．７）を含む溶液で予め濡らした１０ｋＤａ ＡＭＣＯフィルタ（１４ｋｘｇ）で溶液をろ過することによって濃縮した。このステップを２０分間行った。得られたろ液（２５μＬ）は、４．２ｍｇ／ｍＬの濃度のＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１を含んでいた。ろ液の約半分（１２μＬ）を、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）変性溶液（４０μＬ）、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）１０Ｘ低ｐＨ反応バッファ（７μＬ）、１００ｍＭのＴＣＥＰ（２μＬ）を用いて３０分間変性させて還元した。変性及び還元は３０分間行った。次に、３００ｍＭ ＩＡＭ（４μＬ）中で３０分間溶液のアルキル化を行った。前消化は、アルキル化した物質に対して、水（１２μＬ）、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標） １０Ｘ低ｐＨ反応バッファ（５μＬ）、及びＡｃｃｕＭＡＰ（商標）１０Ｘ低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃ溶液（２５μＬ）中で１時間行った。前消化の後、前消化した物質に、水（１３２μＬ）、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標） １０Ｘ低ｐＨ反応バッファ（２０μＬ）、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）１０Ｘ低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃ溶液（２５μＬ）、及びＡｃｃｕＭＡＰ（商標）変性トリプシン溶液（２０μＬ）を添加し、消化はｐＨ５．０で４時間又は一晩行った。消化をクエンチするために、２０％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを添加し、分析のために試料をＬＣ－ＵＶ－ＭＳに注入した。
図１５Ａ～図１５Ｄは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１の長鎖ペプチドＨ３５０－Ｒ４３６の切断、及び各ペプチドの回収％を示す。図１５Ａは、ペプチドの切断及びペプチドの回収％を示す図である。図１５Ａに示すように、ＢｉＴＥ（登録商標）分子＃１の長鎖ペプチドＨ３５０－Ｒ４３６は、Ｔｒｐ３６１の後に切断された。意外にも、切断時に得られる２種のペプチドＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷ（配列番号９２）及びＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷ（配列番号９３）の比較的高い回収率（２０％超の回収率）が得られた。この切断部位（Ｔｒｐ３６１のＣ末端）は、トリプシン及びキモトリプシンによる連続消化で得られたものと同じであり、この消化法により、実施例５で記載したものと同じペプチド分析及び属性監視が可能になることを裏付けている。
実施例８
本実施例は、チロシンを末端とするトリプシンペプチドが得られるトリプシン消化を示す。
実施例７に記載されたＣ末端のトリプトファン残基を含む予想外のトリプシンペプチドは、さらなる分析を促した。トリプシンは貯蔵中に自己消化し、損傷したトリプシン生成物が予想外の観測結果につながったという仮説が立てられた。自己消化につながる貯蔵条件を模倣するため、トリプシン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０３ ７０８ ９６９ ００１）は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を消化するための消化バッファに加える前に、室温で長時間放置した。予想されるトリプシン活性の低下（トリプシン自己消化によって引き起こされる）を補うため、トリプシンの製造業者が推奨する量よりも多い量のトリプシンを消化バッファに添加した。
驚くべきことに、また意外なことに、消化により、それぞれがＣ末端チロシンを有する３種のトリプシンペプチド：（１）配列ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）を含むＨ３５０－Ｙ３５７、（２）配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）を含むＨ３５０－Ｙ３６０、及び（３）配列ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）を含むＨ３５０－Ｙ３６３が得られた。これら３種のペプチドの例示的な抽出イオンクロマトグラムを、図１６Ａ～図１６Ｃに示す。これらの図に示すように、３種のペプチドはそれぞれ、良好な存在量にて高い分解能で分離された。トリプシンはＬｙｓ及びＡｒｇのＣ末端を切断し、Ｔｙｒでは切断しないことが知られているため、これらのペプチドは非カノニカルであると考えられた。非カノニカルなトリプシンペプチドは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の抗原結合ドメイン、又はその近くに、脱アミド化の可能性があるアスパラギン残基を含むため、特に興味深いものであった。したがって、これらのペプチドを監視することにより、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の製造中のＱＣ監視が可能になる。
実施例９
本実施例は、ペプチド消化のためのトリプシン量の評価を示す。
実施例８に記載されたＣ末端チロシン残基を含む３種のペプチドの予想外のトリプシン消化収率は、さらなる分析を促した。実施例８の研究で使用したトリプシン量の増加を調査するために、この研究では種々の量のトリプシンを使用した。要約すると、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む試料を溶液中で調製した。ＢｉＴＥ（登録商標）分子の変性、アルキル化、及び還元は、実施例３に記載され、図５Ａに示されるように行った。要約すると、ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液を６Ｍグアニジン（ｐＨ７．５）中で変性させ、ＩＡＡ及びＤＴＴをそれぞれアルキル化及び還元のために添加した。変性され、アルキル化され、還元されたＢｉＴＥ（登録商標）分子を消化バッファに入れるバッファ交換を、ＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過によって行い、これにより変性され、アルキル化され、還元されたＢｉＴＥ（登録商標）分子をグアニジンＨＣｌから分離した。ある量のトリプシン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０３ ７０８ ９６９ ００１）を、特定の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）比が得られるように消化バッファに添加した。表１は、示されたＥ：Ｓ比が得られるように消化バッファに添加したトリプシンの量をまとめたものである。対照比は表１において＊により記され、トリプシン製造業者により推奨するＥ：Ｓ比の範囲の最小値及び最大値を示す。各消化は、ｐＨ７．５で３７℃で２時間行った。
Figure 2023543167000016
消化後、４超の最終ｐＨを得られるように適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸を各消化試料に添加し、３Ｍの最終グアニジン濃度を得られるように塩酸グアニジンのストック溶液（ｐＨ５）を添加した。消化試料を含む溶液をバッファ交換せずに、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに直接注入した。
例示的な結果は、図１７Ａ～図１９Ｂに提供される。図１７Ａ、図１８Ａ及び図１９Ａの各々は、示されたＥ：Ｓ比で消化したときに得られたＨ３５０－Ｙ３５７ペプチド（図１７Ａ）、Ｈ３５０－Ｙ３６０ペプチド（図１８Ａ）、及びＨ３５０－Ｙ３６３ペプチド（図１９Ａ）の相対存在量のグラフである。図１７Ｂ、図１８Ｂ、及び図１９Ｂの各々は、Ｅ：Ｓ比の関数としてプロットされた相対存在量の線グラフである。１：１（１）の比率で行われた消化の相対存在量を１００％で設定した。図１７Ａ、図１８Ａ、及び図１９Ａに示すように、１：５のＥ：Ｓ比により、結果としてチロシンを末端とするペプチドの相対存在量が少なくとも２０％になった。驚くべきことに、最長ペプチド（Ｈ３５０－Ｙ３６３）の相対存在量は４０％超であった。図１７Ｂ、図１８Ｂ、及び図１９Ｂに示すように、非カノニカルなペプチドの高い相対存在量は、高いＥ：Ｓ比と相関していた。線形回帰Ｒ２が０．９９超であったため、この相関は強いものであった。
同じＥ：Ｓ比を用いたカノニカルなペプチド（Ｈ３５０－Ｒ４３６）の相対存在量を図２０Ａ及び図２０Ｂに示す。これらの図に示すように、チロシンを末端とする非カノニカルなペプチドの相対存在量とＥ：Ｓ比との間に観察される強い相関関係とは異なり、カノニカルなトリプシンペプチドの相対存在量はＥ：Ｓ比に逆相関していた（図２０Ｂ）。
実施例１０
本実施例は、異なるトリプシン源の評価を示す。
実施例９に記載された結果が消化バッファに使用された特定のトリプシンに特有のものであるかどうかを試験するために、異なる供給業者のトリプシンを含む一連の消化バッファを使用して、変性され、アルキル化され、還元されたＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む試料を消化した。ＢｉＴＥ（登録商標）分子の変性、アルキル化、及び還元は、実施例９に記載されているように行われ、消化は消化バッファ中で１．５のＥ：Ｓ比を用いて３７℃で２時間行った。表２は、使用したトリプシン供給業者及びトリプシン製品のカタログ番号を列挙する。
Figure 2023543167000017
消化後、実施例９に記載したように、ギ酸及び塩酸グアニジン（ｐＨ５）を添加した。消化試料を含む溶液の試料は、バッファ交換はせず、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに直接注入した。
各トリプシン製品は、相対ペプチド存在量の点で独自の挙動を示したが、５つの製品すべてが一貫して望ましい非カノニカルなペプチドであるＨ３５０－Ｙ３５７、Ｈ３５０－Ｙ３６０、Ｈ３５０－Ｙ３６３を生成した（図２１）。これらの結果に基づき、各トリプシン製品は、１：５のＥ：Ｓ比でこれらの非カノニカルなペプチドの生成に適しているとみなされた。しかし、Ｒｏｃｈｅのトリプシン製品は、組換えタンパク質製品であるため、トリプシン以外の酵素による汚染の可能性が最も低く、したがってトリプシン自体の挙動について最も情報が得られると考えられることから、後の研究に選択された。
実施例１１
本実施例は、非カノニカルなトリプシンペプチドの製造に対するカルシウムの影響の評価を示す。
トリプシンは、ＰＤＢ構造１ＳＧＴで分かるように、最大で２つのカルシウム結合部位を有することが知られている。カルシウムの存在は、トリプシンの活性、構造、及び安定性に影響を与えることが実証されている（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ． ａｎｄ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．（１９７０），Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；及びＳｉｐｏｓ Ｔ，Ｍｅｒｋｅｌ ＪＲ．Ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｈｅａｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９７０ Ｊｕｌ ７；９（１４）：２７６６－７５． ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ００８１６ａ００３．ＰＭＩＤ：５４６６６１５）。
非カノニカルなペプチドの生成に対するカルシウム結合の影響を評価するために、消化バッファに塩化カルシウム及びＥＤＴＡを添加して、又は添加せずに消化を行った。試料は、０～１２５ｍＭの塩化カルシウムの補充、又は１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して、又はせずに、実施例９に記載のように調製した。
ＥＤＴＡの含有により、非カノニカルなペプチドの全体的なレベルが約６０％低下したことから（図２２）、供給業者が提供するトリプシン中に存在する塩化カルシウムのレベルが非カノニカルなペプチドの生成に有益であることが示唆されている。さらなる塩化カルシウムの補充（０～１２５ｍＭの添加）は、非カノニカルなペプチドの生成は顕著に増加しなかった（データは示さず）。
実施例１２
本実施例は、消化ｐＨ、消化時間、及び消化温度の評価を示す。
試料は、以下の点を除外して、実施例９に記載したように調製した。消化ｐＨの影響を評価するために、消化バッファをｐＨ７．５からｐＨ７．０、８．０、８．５又は９．０に調整した。消化時間の影響を評価するために、消化は２時間ではなく、４時間進行させた。消化温度の影響を評価するために、消化は３７℃ではなく４５℃で行った。
個々のペプチドの相対レベルは異なるが、非カノニカルなペプチドの製造は、１：５のＥ：Ｓ比で非常に強固であることが分かった（図２２）。図２２に示すように、非カノニカルなペプチドは、７．０、７．５、８．０、８．５、及び９．０を含むｐＨ値の全範囲にわたって一貫して高い存在量で製造されている。消化温度を３７℃から４５℃に上昇させると、非カノニカルなペプチドのレベルは約５０％増加した（３７℃のｐＨ７．５に対して）（図２２）。最後に、消化時間を増加させると、非カノニカルなトリプシンペプチドのレベルが全体的に増加することが分かり、４時間の消化は２時間の消化よりもわずかに高い存在量となった。
実施例１３
本実施例は、製造中のＰＴＭ形成について治療用ポリペプチドを監視する例示的方法を示す。
ＨＬＥ－ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む溶液を６ＭのグアニジンＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で変性させ、ＩＡＡ及びＤＴＴをそれぞれアルキル化及び還元のために添加した。変性され、アルキル化され、還元されたタンパク質を消化バッファに入れるバッファ交換を、ＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過によって行い、これにより変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチド（タンパク質）をグアニジンＨＣｌから分離した。変性され、アルキル化され、還元されたポリペプチドを含む溶出物質を１：５のＥ：Ｓ比を用いてｐＨ７．５で０．１Ｍトリス中でトリプシンにより消化した。消化を３７℃で２時間進行させた後、適量の２０％（ｖ／ｖ）ギ酸及び塩酸グアニジン（ｐＨ５）でクエンチし、３Ｍの最終グアニジン濃度、及び４超の最終ｐＨを得た。消化試料を含む溶液の試料は、バッファ交換はせず、分析のためにＨＰＬＣ－ＭＳシステムに直接注入した。
慣例的なＬＣ－ＭＳ分析後、観察されたトリプシンペプチドはＨＬＥ－ＢｉＴＥ（登録商標）分子配列の９７～１００％を占める。その後、脱アミド化の分析は、抽出イオンクロマトグラムを作成し、天然型及び脱アミド化形態の両方におけるＨ３５０－Ｙ３５７、Ｈ３５０－Ｙ３６０、及びＨ３５０－Ｙ３６３の相対レベルを決定することにより実行する。脱アミド化種の相対レベルは、天然ペプチドと比較して脱アミド化のレベルを決定する。例として、
Figure 2023543167000018
 （配列番号１１０）の相対存在量を
Figure 2023543167000019
 （配列番号１１１）の存在量と比較し、Ｎ３５５における脱アミド化のレベルを決定する。
治験製品で上記方法の性能を評価するため、ＨＬＥ－ＢｉＴＥ（登録商標）分子を含む試料に４週間ストレスを与えた。０週間、２週間、及び４週間のストレス負荷後に試料を分析した。カノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６及び非カノニカルなペプチドＨ３５０－Ｙ３６３を評価することによって、脱アミド化の定量化を試みた。図２３Ａは、示された時点におけるカノニカルなペプチドのクロマトグラフィー結果を提供し、図２３Ｂは、示す時点における非カノニカルなペプチドのクロマトグラフィー結果を提供する。これらの各図において、％は、脱アミド化種の％を示す。予想されるように、脱アミド化種の％は、ストレスの持続時間が長くなるにつれて増加する。図２３Ａに示すように、カノニカルなペプチドでは、クロマトグラフィー性能が低下し、クロマトグラフィーピークがテーリングし、結果的に不正確で信頼性の低い定量化となった。対照的に、非カノニカルなペプチドは、クロマトグラフィーにより、また質量解析されて、潜在的な脱アミド化部位Ｎ３５２及びＮ３５５を正確に同定及び定量化することができる（図２３Ｂ）。
これらのデータは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の脱アミド化を製造中にリアルタイムで監視できることを裏付けている。このような手順は、脱アミド化が患者の安全性、免疫原性、及び治療効果に影響を与え得る重要な品質属性であるため、重要である。カノニカルなトリプシンペプチドＨ３５０－Ｒ４３６はいつになく大きいため（ＨＬＥ－ＢｉＴＥ（登録商標）分子の平均１２個のアミノ酸に対して８７個のアミノ酸）、結果としてクロマトグラフィー挙動が良くなく、天然種及び脱アミド化種の質量スペクトルを干渉する。しかし、顕著に小さい非カノニカルなペプチドにより、クロマトグラフィーのピークが明確になり、質量スペクトルも容易に解析される。あわせて、非カノニカルなトリプシンペプチドのＬＣ及びＭＳの特性改善により、脱アミド化の正確な定量化が可能になる。これにより、トリプシンペプチドマップ解析は、製品の安定性、ロット比較、並びに製品及びプロセスの特性の評価に活用することができる。
本明細書に出版物、特許出願、及び特許等の全ての参考文献は、それぞれの参考文献があたかも、個々に及び具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されているかのごとく、且つ本明細書においてその全体が記載されているかのごとく同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の指定がない限り、指定の成分を含むが他の要素を排除しないことを含む、制約のない用語として解釈される（即ち「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する）。
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書中で別段の指定がない限り、範囲内にあるそれぞれ別々の値及びそれぞれの終点を個々に言及する速記法としての役割を果たすことが単に意図され、本明細書中であたかも個々に記載されるように、それぞれ別々の値及び終点が本明細書に組み込まれる。
本明細書中で説明されている方法は全て、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中で提供されるありとあらゆる例又は代表的な言語（例えば、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の如何なる言語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。
本明細書中で、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読めば当業者にとって明らかになろう。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、発明者らは、本明細書中で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用される法により認められる通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。

Claims (25)

  1. ポリペプチドを処理して、各々がＣ末端にチロシンを含む少なくとも１種又は２種のペプチドを含む消化試料を生成する方法であって、前記ポリペプチドを約１：１～約１：１５の酵素：基質（Ｅ：Ｓ）重量比でトリプシンにより消化することを含む、方法。
  2. 前記Ｅ：Ｓ重量比は約１：１～約１：１０である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｅ：Ｓ重量比は約１：２～約１：８である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｅ：Ｓ比は、約１：４～約１：６、任意選択により、約１：５である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記消化は約７．０～約８．０、任意選択により約７．５のｐＨで行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記消化は約１２時間未満、任意選択により６時間未満行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記消化は約４時間未満、任意選択により約２時間～約４時間未満行われる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記消化は、約３５℃～約４０℃、任意選択により約３７℃の温度で行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記消化は、塩化カルシウムの存在下で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記消化は、塩化カルシウムの不在下で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドを消化するためにトリプシンのみが使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ポリペプチドを、前記Ｅ：Ｓ重量比で前記トリプシンにより消化すると、Ｃ末端にチロシンを含む１種以上のペプチドを含む前記消化試料が生成される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記消化試料は、ＨＧＮＦＧＮＳＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むペプチド、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むペプチド、及び／又はＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ポリペプチドを前記プロテアーゼにより消化する前に、前記ポリペプチドを変性させること、前記ポリペプチドを還元すること、及び／又は前記ポリペプチドをアルキル化することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ポリペプチドを前記プロテアーゼにより消化する前、且つ前記ポリペプチドを変性、還元、及び／又はアルキル化した後に、バッファ交換を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記バッファ交換は、サイズ排除カートリッジの使用を含み、前記サイズ排除カートリッジは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ゲルろ過材料を有するＮＡＰ５カートリッジである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記消化試料を、弱酸性のｐＨでカオトロープの存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記カオトロープは、塩酸グアニジンである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記弱酸性のｐＨは約５である、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入することを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ポリペプチドを処理する方法であって、
    ａ．前記ポリペプチドをプロテアーゼにより消化して、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することと；
    ｂ．前記消化試料を、カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨでインキュベートすること
    とを含む、方法。
  22. カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料の長鎖ペプチドの回収率を増加させる方法であって、前記消化試料は、少なくとも２種のペプチドを含み、ポリペプチドを前記プロテアーゼにより消化することにより生成される、方法。
  23. カオトロープの存在下で、及び／又は弱酸性のｐＨで消化試料をインキュベートすることを含む、消化試料のペプチドの溶解度を増加させる方法であって、前記消化試料は、少なくとも２種のペプチドを含み、ポリペプチドをプロテアーゼにより消化することにより生成される、方法。
  24. ポリペプチドを、トリプトファンのＣ末端を切断するプロテアーゼにより消化し、少なくとも２種のペプチドを含む消化試料を生成することを任意選択で含む、ポリペプチドを処理する方法であって、少なくとも１種のペプチドはＣ末端トリプトファンを含む、方法。
  25. ポリペプチドの属性を監視する方法であって、
    ａ．請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法に従って、第１の時点で得られた第１の試料中の第１のポリペプチドを処理することと、
    ｂ．前記消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入し、前記第１の試料の前記ポリペプチドのＰＴＭを同定することと、
    ｃ．請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法に従って、第２の時点で得られた第２の試料中の第２のポリペプチドを処理することと、ここで、前記第２のポリペプチドは、前記第１のポリペプチドと同じものである又は異なるものである、
    ｄ．前記消化試料のペプチドを、ペプチドマッピング分析のために液体クロマトグラフィー質量分光測定（ＬＣ－ＭＳ）システムに注入し、前記第２の試料の前記ポリペプチドのＰＴＭを同定することと、
    ｅ．前記第１の試料の前記ＰＴＭを前記第２の試料の前記ＰＴＭと比較すること
    と含む、方法。
JP2023517280A 2020-09-18 2021-09-17 ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法 Pending JP2023543167A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063080489P 2020-09-18 2020-09-18
US63/080,489 2020-09-18
US202163236996P 2021-08-25 2021-08-25
US63/236,996 2021-08-25
PCT/US2021/050842 WO2022061092A1 (en) 2020-09-18 2021-09-17 Methods of processing a sample for peptide mapping analysis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023543167A true JP2023543167A (ja) 2023-10-13

Family

ID=78294061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023517280A Pending JP2023543167A (ja) 2020-09-18 2021-09-17 ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230349912A1 (ja)
EP (1) EP4214226A1 (ja)
JP (1) JP2023543167A (ja)
AU (1) AU2021343495A1 (ja)
CA (1) CA3195365A1 (ja)
MX (1) MX2023003164A (ja)
TW (1) TW202227470A (ja)
WO (1) WO2022061092A1 (ja)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL217752B1 (pl) 2001-08-23 2014-08-29 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wobec IL-15 lub jego fragment wiążący antygen i związane z nimi hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowania medyczne
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EA201000006A1 (ru) 2007-06-20 2010-10-29 Айрм Ллк Способы и композиции для лечения аллергических заболеваний
US7982016B2 (en) 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
TWI445716B (zh) 2008-09-12 2014-07-21 Rinat Neuroscience Corp Ｐｃｓｋ９拮抗劑類

Also Published As

Publication number Publication date
CA3195365A1 (en) 2022-03-24
AU2021343495A1 (en) 2023-04-27
EP4214226A1 (en) 2023-07-26
WO2022061092A1 (en) 2022-03-24
TW202227470A (zh) 2022-07-16
US20230349912A1 (en) 2023-11-02
MX2023003164A (es) 2023-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3765856B1 (en) Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
JP7411560B2 (ja) 質量分光測定法による分析のためのポリペプチドの連続消化
US20220260584A1 (en) Methods of identifying attributes of therapeutic proteins
JP7237022B2 (ja) 質量分析法による分析用ポリペプチド試料のリアルタイム調製のためのシステム及び方法
US20200309768A1 (en) System and Method for Characterizing Protein Dimerization
US20220404370A1 (en) Methods of protein clips recovery
JP2023543167A (ja) ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法
EA043377B1 (ru) Системы и способы для подготовки в режиме реального времени образца полипептида для анализа с помощью масс-спектрометрии
JP2023549113A (ja) タンパク質を処理するための材料及び方法