TW202102518A - 用於病毒滅活之替代性清潔劑 - Google Patents

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Abstract

揭露了用於滅活有包膜病毒之清潔劑，包括可在生物製造操作中使用的被認為係生態友好之清潔劑。

Description

用於病毒滅活之替代性清潔劑
揭露了用於滅活有包膜病毒之清潔劑，其包括那些可在生物製造操作中作為Triton X100替代品使用的被認為係生態友好之清潔劑。
滅活病毒之方法步驟對確保蛋白治療劑的安全性係至關重要的（Aranha, BioProcess International [生物製藥製程國際期刊] 2005; 17-20; Remington, Bioprocess International [生物製藥製程國際期刊] 2015, 13 (5), 10-17）。病毒污染物可以產生自包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系中的培養基、製造場所或外來病毒污染物的多種來源（Aranha, Bioprocess International [生物製藥製程國際期刊] 2012, 10 (3), 12-17）。為了確保患者安全，生物製造商遵循藉由ICH-Q5A鑒定之指南，其包括正交的病毒清除步驟，該步驟包括滅活過程和過濾過程（Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin [衍生自人或動物來源的細胞系的生物技術產品的病毒安全性評估]. Harmonization, I. C. O. [國際協調會議]編輯. 1999; 第Q5A卷）。長期以來將Triton X-100（聚氧乙烯辛基苯酚醚）用作使有包膜病毒滅活的滅活清潔劑（Durno和Tounekti, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology [製藥科學和技術的PDA雜誌], 2015, 69 (1), 163-172; Standard Practice for Process Step to Inactivate Rodent Retrovirus with Triton X-100 Treatment [用於用Triton X-100處理滅活齧齒類逆轉錄病毒的製程步驟的標準規程], ASTM International [美國材料與試驗協會].在E3042-16中, ASTM,編輯. West Conshohocken [西康舍霍肯],賓夕法尼亞州, 2016）。清潔劑溶解創建外部包膜層之膜脂（Liumbruno和Franchini, Journal of Thrombosis and Thrombolysis [血栓形成與血栓溶解雜誌] 2015, 39 (1), 118-128），因此，清潔劑將僅滅活有包膜病毒且不滅活無包膜病毒（Hellstern和Solheim, Transfusion medicine and hemotherapy [輸血醫學與輸血治療], 2011, 38 (1), 65-70）。儘管Triton X-100可以強力滅活病毒，但該清潔劑亦為一種環境毒素。一個影響係其對魚的內分泌系統的有害影響。Triton X-100分解成辛苯酚，後者酷似雌二醇激素，導致該激素系統的改變（Laws等人, Toxicological Sciences [毒理科學], 2000, 54 (1), 154-167）。歐盟將從2020年開始禁止生物製藥公司使用Triton X-100，如REACH的第57條中該（歐洲議會和理事會關於化學品註冊、評估、授權及限制（「REACH」）的2006年頒發的(EC)第1907號法規的歐委會法規（EU）附錄XIV），歐盟編輯. 2017），因此，鑒定出生態友好的強健的病毒滅活之替代性清潔劑係切題的。Conley等人最近工作已經鑒定出月桂基二甲基N氧化胺（LDAO），這係一種生態友好的可以滅活有包膜病毒之兩性離子型清潔劑。（Conley等人, Biotechnology and Bioengineering [生物技術和生物工程] 2017, 114 (4), 813-820和已公開的美國專利申請案號20150306223。）已公開的美國專利申請案號20160333046也鑒定出一些顯示強健病毒清除以及生態安全性的清潔劑。
因而，需要有效滅活有包膜病毒的清潔劑，特別是被認為係生態友好之清潔劑，用於在生物製造中的病毒清除方法步驟內使用。在此描述的發明藉由鑒定有效的病毒滅活清潔劑滿足這種需求，該病毒滅活清潔劑可以併入用於多種治療劑形式的生物製造過程中。
本發明提供了用於在已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒的流體中滅活有包膜病毒之方法，該方法包括獲得已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒的流體；將該流體暴露於表1中之清潔劑中；暴露濃度和時間足以導致病毒滅活。在一個實施方式中，該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7。在一個實施方式中，該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5 或CAS 85618-20-8。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30秒至至少60分鐘或更久。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30分鐘。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少60分鐘或更久。在一個實施方式中，該清潔劑之濃度係其臨界微胞濃度（CMC）之至少2.5倍至至少10倍或更高。在一個實施方式中該清潔劑之濃度係其CMC的至少5倍。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少7.5倍。在另一個相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少10倍。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C至22°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少15°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少20°C之溫度下。在另一個實施方式中，滅活係使用TCID50 測定確定的。在一個實施方式中，該流體包含目的重組蛋白。在一個實施方式中，該流體係收穫的宿主細胞培養液。在一個實施方式中，該流體來自出自單元操作的流出物流、溶析液、彙集物、儲存或貯存容器，該單元操作包括收穫步驟、過濾步驟或層析步驟。在相關的實施方式中，該流體係從深層過濾、親和層析、離子交換、多模式層析、疏水交互作用層析或羥基磷灰石層析中收集的溶析液。在一個相關的實施方式中，該流體係含有收穫的細胞培養液、來自深層過濾的溶析液、來自親和層析的溶析液、來自離子交換層析的溶析液、來自多模式層析的溶析液、來自疏水交互作用層析的溶析液或來自羥基磷灰石層析的溶析液的彙集物。在另一個相關的實施方式中，該親和層析係蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L層析。在一個實施方式中，該清潔劑的濃度為其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
本發明提供了用於在純化目的重組蛋白期間滅活有包膜病毒之方法，該方法包括獲得包含該目的重組蛋白的已知或懷疑含有至少一種病毒之流體；使該流體以足以導致在該流體中的有包膜病毒滅活的濃度和時間經受至少一種清潔劑，其中該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；並且使經病毒滅活的流體經受至少一個單元操作，該單元操作包括至少過濾步驟或層析步驟。在一個實施方式中，該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5 和CAS 85618-20-8。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30秒至至少60分鐘或更久。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30分鐘。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少60分鐘或更久。在另一個實施方式中，該清潔劑之濃度係其臨界微胞濃度（CMC）之至少2.5倍至至少10倍或更高。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少5倍。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少7.5倍。在另一個相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少10倍。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C至22°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少15°C之溫度下。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少20°C之溫度下。在另一個實施方式中，滅活係使用TCID50 測定確定的。在另一個實施方式中，該流體包含目的重組蛋白。在另一個實施方式中，該流體係收穫的宿主細胞培養液。在另一個實施方式中，該流體來自出自單元操作的流出物流、溶析液、彙集物、儲存或貯存容器，該單元操作包括收穫步驟、過濾步驟或層析步驟。在另一個實施方式中，該流體係從深層過濾、親和層析、離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析或羥基磷灰石層析中收集的溶析液。在另一個實施方式中，該流體係含有收穫的細胞培養液、來自深層過濾的溶析液、來自親和層析的溶析液、來自離子交換層析的溶析液、來自多模式層析的溶析液、來自疏水交互作用層析的溶析液或來自羥基磷灰石層析的溶析液的彙集物。在相關的實施方式中，該親和層析係蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L層析。在另一個實施方式中，該層析選自親和層析、蛋白質A層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析；疏水交互作用層析；混合模式或多模式層析或羥基磷灰石層析。在另一個實施方式中，該流體係收穫的宿主細胞培養液並且該單元操作包括深層過濾。在另一個實施方式中，該流體係收穫的宿主細胞培養液並且該單元操作包括蛋白質A親和層析。在另一個實施方式中，該流體係蛋白質A溶析液並且該單元操作包括深層過濾。在另一個實施方式中，該單元操作包括深層過濾。在一個實施方式中，該單元操作包括微濾。在一個實施方式中，該清潔劑的濃度為其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
本發明還提供了用於產生分離的、純化的目的重組蛋白之方法，該方法包括用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白的細胞；收穫含有該目的重組蛋白之細胞培養液；藉由至少兩個單元操作處理含有該目的重組蛋白的流體，其中在至少一個單元操作期間存在如下步驟，在該步驟中含有該目的重組蛋白的流體與具有以下CAS登記號的清潔劑以足以導致有包膜病毒滅活的清潔劑濃度和時間組合：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；以及獲得分離的、純化的目的重組蛋白。 在一個實施方式中，該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5 和CAS 85618-20-8。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30秒至至少60分鐘或更久。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30分鐘。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少60分鐘或更久。在另一個實施方式中，該清潔劑之濃度係其臨界微胞濃度（CMC）之至少2.5倍至至少10倍或更高。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少5倍。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少7.5倍。在另一個相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少10倍。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C至22°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少15°C之溫度下。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少20°C之溫度下。在另一個實施方式中，滅活係使用TCID50 測定確定的。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自親和層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析及羥基磷灰石層析的捕獲層析步驟。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析及羥基磷灰石層析的精製層析步驟。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自病毒過濾、深層過濾和UF/DF之步驟。在另一個實施方式中，包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括親和層析的單元操作之前。在另一個實施方式中，包括親和層析的單元操作發生在包括病毒滅活步驟的單元操作之前。在一個實施方式中，包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括深層過濾的單元操作之前。在一個實施方式中提供了根據上述方法分離的、純化的目的重組蛋白。在一個實施方式中提供了包含根據上述方法分離的目的蛋白質的藥物組成物。在一個實施方式中，該清潔劑的濃度為其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
本發明還提供了用於產生分離的、純化的目的重組蛋白的方法，該方法包括用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白的細胞；收穫含有該目的重組蛋白的細胞培養液；使收穫的含有該目的重組蛋白的流體以足以導致有包膜病毒滅活的清潔劑濃度和時間經受清潔劑，該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；藉由至少兩個額外的單元操作處理含有該目的重組蛋白的經病毒滅活的流體；以及獲得分離的、純化的目的重組蛋白。 在一個實施方式中，該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5 和CAS 85618-20-8。在一個實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30秒至至少60分鐘或更久。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30分鐘。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少60分鐘或更久。在另一個實施方式中，該清潔劑之濃度係其臨界微胞濃度（CMC）之至少2.5倍至至少10倍或更高。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少5倍。在相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少7.5倍。在另一個相關的實施方式中，該清潔劑之濃度係其CMC的至少10倍。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C至22°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C之溫度下。在相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少15°C之溫度下。在另一個相關的實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑發生在至少20°C之溫度下。在另一個實施方式中，滅活係使用TCID50 測定確定的。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自親和層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析及羥基磷灰石層析的捕獲層析步驟。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析及羥基磷灰石層析的精製層析步驟。在另一個實施方式中，至少一個單元操作包括選自病毒過濾、深層過濾和UF/DF之步驟。在另一個實施方式中，包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括親和層析的單元操作之前。在另一個實施方式中，包括親和層析的單元操作發生在包括病毒滅活步驟的單元操作之前。在一個實施方式中，包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括深層過濾的單元操作之前。在一個實施方式中提供了根據上述方法分離的、純化的目的重組蛋白。在一個實施方式中提供了包含根據上述方法分離的目的蛋白質的藥物組成物。在一個實施方式中，該清潔劑的濃度為其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
本發明還提供了根據本文所述之方法分離的、純化的目的重組蛋白。本發明還提供了包含根據本文提供的方法分離的目的蛋白之藥物組成物。
使用細胞培養方法製造治療性生物學藥物具有傳播病毒污染物的固有風險。該等污染物可以來自多種來源，包括起始材料、在製造期間使用動物來源的試劑和藉由由於GMP過程中的故障對製造系統造成的污染。因而，監管機構推薦生物製造過程有專門的病毒滅活和病毒去除步驟，並要求製造商驗證所有生物產品中病毒的去除和滅活。
本文提供了用於在已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒的流體中滅活有包膜病毒之方法，該方法包括獲得已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒的流體；將該流體暴露於表1中的清潔劑中；暴露濃度和時間足以導致病毒滅活。
本文提供了用於在純化目的重組蛋白期間滅活有包膜病毒之方法，該方法包括獲得含有該目的重組蛋白的已知或懷疑含有至少一種病毒的流體；使該流體以足以導致在該流體中的有包膜病毒滅活的濃度和時間經受至少一種清潔劑，其中該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；並且使經病毒滅活的流體經受至少一個單元操作，該單元操作包括至少過濾步驟或層析步驟。
病毒分為有包膜病毒及無包膜病毒。有包膜病毒具有一個被脂蛋白膜或「包膜」封閉之衣殼。這種包膜由宿主細胞蛋白和磷脂以及當病毒從宿主細胞中出芽時覆蓋在病毒表面的病毒糖蛋白構成。這種包膜允許病毒識別、結合、進入和感染目標宿主細胞。然而，由於這種膜，有包膜病毒對滅活方法敏感，而無包膜病毒較難在對製造的蛋白質無風險的情況下滅活但它們可以藉由過濾方法除去。
有包膜病毒包括如下的病毒科，如皰疹病毒科病毒（herpesviridae virus）、痘病毒科病毒（poxviridae virus）、嗜肝DNA病毒科病毒（hepadnaviridae virus）、黃病毒科病毒（flaviviridae virus）、披膜病毒科病毒（togaviridae virus）、冠狀病毒科病毒（coronaviridae virus）、正黏病毒科病毒（orthomyxoviridae virus）、丁型肝炎病毒科病毒（deltavirus virus）、副黏液病毒科病毒（paramyxoviridae virus）、彈狀病毒科病毒（rhabdoviridae virus）、布尼亞病毒科病毒（bunyaviridae virus）、絲狀病毒科病毒（filoviridae virus）、逆轉錄病毒科病毒（retroviridae virus）；以及如下病毒，如人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus）、辛得比斯病毒（sindbis virus）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus）、假性狂犬病病毒（pseudorabies virus）、仙台病毒（sendai virus）、水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus）、西尼羅河病毒（West Nile virus）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus）、冠狀病毒、馬關節炎病毒（equine arthritis virus）、嚴重急性呼吸症候群病毒（severe acute respiratory syndrome virus）、莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）以及痘瘡病毒（vaccinia virus）。
為了確保患者安全，在製造蛋白治療劑時，病毒滅活係純化過程之必要組成部分。可以使用各種方法來滅活病毒並且該等方法包括熱滅活/巴氏消毒法，pH滅活，UV和γ射線照射，使用高強度廣譜白光，添加化學滅活劑、界面活性劑、及溶劑/清潔劑處理。界面活性劑（諸如清潔劑）能溶解多種膜，並且因此在特異性滅活有包膜病毒方面可能非常有效。
清潔劑藉由用清潔劑膠束破壞蛋白質層溶解有包膜病毒的外膜（Kragh-Hansen等人, Biophysical Journal [生物物理學雜誌] 1998, 75 (6), 2932-2946）。有包膜病毒（包括異嗜性鼠白血病病毒（xMuLV）和假性狂犬病皰疹病毒（PRV））的外層由脂質膜構成，該脂質膜可以被超過其臨界微胞濃度（CMC）的某些清潔劑破壞。超過CMC時，清潔劑形成膠束，該膠束藉由溶解膜脂破壞包膜層（Edwards和Almgren, Journal of Colloid and Interface Science [膠體與介面科學雜誌] 1991, 147 (1), 1-21）。
清潔劑按其電荷可分為三類：離子型、非離子型及兩性離子型。非離子型和兩性離子型清潔劑都是溫和的，並且通常不會使正在製造的治療性蛋白質變性，而更嚴苛的離子型清潔劑則會使它們降解。歷史上，諸如常用的Triton X-100等的非離子型清潔劑已經被用來滅活病毒，因為它們不影響治療性目的蛋白。然而，對某些清潔劑（諸如Triton X-100）的過度使用的生態擔憂已經驅使為鑒定更多可用於生物製造過程中滅活有包膜病毒的「生態友好」之清潔劑而進行的搜尋。
如本文所用，「病毒滅活」、「病毒的滅活」、「滅活病毒」或類似的此類短語係指對有包膜病毒進行修飾以使其不再感染細胞、不再複製和/或不再增殖之過程。界面活性劑（諸如清潔劑）在滅活已知含有或懷疑含有一或多種病毒的流體中的有包膜病毒中非常有效。該流體可以獲得自流出物流、溶析液、彙集物、貯存或儲存容器。在一個實施方式中，該流體獲得自彙集物。在一個實施方式中，該彙集物獲得自包括微濾的收穫單元操作。在一個實施方式中，該流體獲得自流出物流。
可以將濃度（w/v）在0.01%和10%之間的或在該清潔劑臨界微胞濃度（CMC）值的0.01倍至10倍之間之清潔劑添加到該流體中。在某些實施方式中，該清潔劑濃度係該清潔劑CMC值的至少2.5倍、至少5倍、至少7.5倍或至少10倍。
在至少2°C至22°C或更高的溫度下，可以將該流體暴露於該清潔劑。在某些實施方式中，在至少2°C或更高、至少5°C或更高、至少7°C或更高、至少10°C或更高、至少15°C或更高、至少20°C或更高，或至少22°C或更高的溫度下，將該流體暴露於該清潔劑。在某些實施方式中，該溫度係2°C至22°C、2°C至20°C、2°C至15°C、2°C至10°C、2°C至7°C或2°C至5°C。在另一個實施方式中，該溫度係5°C至22°C、5°C至20°C、5°C至15°C、5°C至10°C或5°C至7°C。在另一個實施方式中，該溫度係7°C至22°C、7°C至20°C、7°C至15°C或7°C至10°C。在另一個實施方式中，該溫度係10°C至22°C、10°C至20°C或10°C至15°C。在另一個實施方式中，該溫度係10°C至22°C、10°C至20°C或10°C至15°C。在另一個實施方式中，該溫度係15°C至22°C或15°C至20°C。在一個實施方式中，該溫度係20°C至22°C。在某些實施方式中，該溫度係2°C、5°C、7°C、10°C、15°C、20°C或22°C。 可將該流體暴露於該清潔劑少至30秒至48小時或更久。在某些實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、60分鐘或90分鐘。在某些實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、10小時、12小時、16小時、20小時、24小時、30小時、36小時、42小時或48小時。在某些實施方式中，將該流體暴露於該清潔劑至少30秒、至少10分鐘、至少30分鐘、至少60分鐘或至少90分鐘。在某些實施方式中，該濃度為其CMC的2.5倍且時間為至少10分鐘。在某些實施方式中，該濃度為其CMC的2.5倍且時間為至少30分鐘。在某些實施方式中，該濃度為其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。在某些實施方式中，該濃度為其CMC的5倍且時間為至少30分鐘。
期望使用本文揭露的方法進行任何程度的病毒滅活。然而，較佳地達到必要的病毒滅活的程度，以滿足相關監管機構製定的任何生物製藥安全指南或法規。
為了確定諸如本文所述清潔劑的試劑滅活病毒之程度或效果，一種方法係監測其對致細胞病變效應（CPE）的影響。致細胞病變效應包括由於病毒感染導致的宿主細胞內結構變化，諸如宿主細胞裂解，或由於影響了宿主細胞分裂的病毒改變導致細胞無裂解死亡。如果在暴露於該試劑後，在宿主細胞中不能檢測到這種效應，則認為該病毒被滅活。這可以使用TCID50 測定來測量，該TCID50 測定用於確定在合理的時間段（例如5至20天），在細胞培養物中可引起致細胞病變效應同時培養物中的細胞依然存活的病毒的感染滴定量。如果存在活性病毒，可以使用顯微鏡觀察對細胞的致細胞病變效應。被感染的細胞出現變形，並且與未感染的細胞不同。用斯皮爾曼-卡爾伯（Spearman-Karber）方程分析結果，該方程提供每個樣本中的病毒滴定量，然後該等滴定量可用於計算病毒的總對數減小。如果在所用檢測方法的限度內未檢測到，通常約為4log10，則認為滅活已完成。
如本文所述，對具有廣泛結構可變性、疏水性和電荷的清潔劑的滅活有包膜病毒的有效性進行了評估。鑒定了具有強健病毒滅活能力的清潔劑。該等包括非離子型清潔劑，如ANAPOE-C12E9；ANAPOE-C12E8；Alfonic TDA-6乙氧基化物（TDA-6）；Alfonic TDA-9乙氧基化物（TDA-9）；正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷；正辛基-β-D-硫代哌喃麥芽糖苷；蔗糖單月桂酸酯；正癸醯基蔗糖；正辛基-β-D-硫代葡萄糖苷；CYMAL® -3；正十三烷基-β-D-麥芽糖苷；CYMAL® -6；六乙二醇單辛基醚；C-HEGA® -10；正十一烷基-b-D-麥芽糖苷；正壬基-b-D-硫代麥芽糖苷；HEGA® -9；ANAPOE-X-405；CYMAL® -5；C-HEGA® -11；Thesit；正壬基-b-D-麥芽糖苷；MEGA-8；正壬基-b-D-葡萄糖苷；HECAMEG® ；HEGA® -10；正辛基-b-D-葡萄糖苷；HEGA® -8；MEGA-10；正十二烷基-b-D-麥芽糖苷；C8E5；MEGA-9；正己基-b-D-哌喃葡萄糖苷；CYMAL® -7；CYMAL® -4；2,6-二甲基-4-庚基-b-D-哌喃麥芽糖苷；正癸基-b-D-麥芽糖苷；及C8E4。兩性離子型清潔劑，包括NDSB-195；FOS-MEA® -10；NDSB-201；CHAPS；NDSB-211；CHAPSO；NDSB-221；Fos-Choline® -10；NDSB-256；ZWITTERGENT® 3-08；Tripao及DDMAB。合成脂質清潔劑包括LysoFosTM 膽鹼12，LysoFosTM 膽鹼14，Alfonic TDA-6乙氧基化物（Novel-TDA6，IsoC13E6）和Alfonic TDA-9乙氧基化物（Novel-TDA9，Iso-C13E9）。
根據歐盟關於化學安全的指令67/548/EC，在對幾種有包膜病毒的病毒滅活呈陽性的那些清潔劑中，有一些目前被認為不危險；ANAPOE-C12E9 CAS號：3055-99-0；ANAPOE-C12E8 CAS號：3055-98-9；Alfonic TDA-6乙氧基化物（TDA-6） CAS號：9043-30-5；Alfonic TDA-9乙氧基化物（TDA-9），CAS號9043-30-5；N-庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷 CAS號：85618-20-8；CYMAL® -3 CAS號：181135-58-0；CYMAL® -4 CAS號：181135-57-9；CYMAL® -5 CAS號：250692-65-0；CYMAL® -6 CAS號：228579-27-9；CYMAL® -7 CAS號：349477-49-2；Fos Choline® -10 CAS號：70504-28-8；正己基-b-D-哌喃葡萄糖苷 CAS號：59080-45-4；正壬基-b-D-葡萄糖苷 CAS號：69984-73-2；正辛基-β-D-硫代哌喃麥芽糖苷 CAS號：148616-91-5；正壬基-b-D-硫代麥芽糖苷 CAS號：148565-55-3；正十二烷基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：69227-93-6；正癸基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：82494-09-5；正十一烷基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：253678-67-0；正壬基-b-D-硫代麥芽糖苷 CAS號：106402-05-5；正十三烷基-β-D-麥芽糖苷 CAS號：93911-12-7；和正辛基-b-D-葡萄糖苷 CAS號：29836-26-8。
基於相似的分子結構，選擇了該等「生態友好」的清潔劑中的四組並標記為「CYMAL」、「Fos-Choline」、「Anapoe」及「硫代葡萄糖苷」，圖1。基於包括溫度、時間、濃度、產品形式、和病毒類型以及清潔劑之毒性和強健清除率在內的參數，進一步分析了該等組中的每組的清潔劑的病毒滅活情況。
基於大量清潔劑病毒滅活數據，鑒定了影響滅活的傾向，該等傾向包括烷基和乙氧基化物鏈長。出乎意料地，烷基鏈長影響病毒滅活活性。具有一或兩個碳的烷基鏈的CYMAL® 對病毒滅活沒有影響，而具有3-7個碳的烷基鏈的CYMAL® 可以滅活病毒。對於Fos-Cholines® 也得到了類似的觀察結果。發現具有8個或9個碳連接子（linker）鏈的Fos-Cholines® 對病毒滅活沒有影響，而具有10個碳連接子的Fos-Choline® 使病毒滅活。Anapoe清潔劑由烷基鏈和乙氧基化物鏈構成，其中烷基碳（C）數和乙氧基化物基團（E）數在名稱中表示出，例如Anapoe C12E9具有12個烷基碳和9個乙氧基團。雖然發現Anapoe C12E9和Anapoe C12E8、Alfonic TDA-6乙氧基化物（TDA-6）和Alfonic TDA-9乙氧基化物（TDA-9）強健地滅活該病毒，但是Anapoe C10E9、Anapoe C10E6、Anapoe C12E10和C13E8沒有滅活該病毒。
在存在幾種重要的治療劑形式：單株抗體、雙特異性T細胞募召劑（bispecific T cell engager）（BiTEs® ）和融合蛋白的情況下，Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、Alfonic TDA-6乙氧基化物（TDA-6）和Alfonic TDA-9乙氧基化物（TDA-9）和N-庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷在病毒滅活中特別強健。在低至5°C至15°C的溫度下，在30秒和30分鐘之間，該等清潔劑顯示出完全的病毒滅活。
清潔劑病毒滅活可以發生在生物製造下游過程的一或多個步驟中。清潔劑病毒滅活可以發生在收穫澄清液之後及親和層析步驟之前；親和層析步驟之後和深層過濾和/或精製層析步驟之前；精製層析步驟之間；病毒過濾步驟和/或UF/DF步驟之前。
術語「多核苷酸」或「核酸分子」在全文中可互換使用，並且包括單股和雙股核酸，並且包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成來源的或與通常在自然界中發現的序列無關的一些其組合。術語「分離的多核苷酸」或「分離的核酸分子」具體是指合成來源的序列或自然界中通常不存在的序列。包含規定序列的分離的核酸分子除表現目的蛋白的序列以外還可以包括針對高達十種或甚至高達二十種其他蛋白或其部分之編碼序列，或可以包括控制所敘述核酸序列的編碼區的表現的可操作地連接的調節序列，和/或可以包括載體序列。包含核酸分子的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或者任一類型核苷酸的經修飾形式。該修飾包括鹼基修飾，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵修飾，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯及胺基磷酸酯。
如本文所用，術語「分離的」意指 (i) 不含至少一些通常與其一起被發現的其他蛋白或多核苷酸，(ii) 基本上不含來自相同來源的其他蛋白或多核苷酸，例如來自相同物種，(iii) 與至少約50%的在自然界與其相關的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(iv) 可操作地與在自然界與其不相關的多肽或多核苷酸相關（藉由共價或非共價相互作用），或 (v) 在自然界中不存在。
術語「多肽」或「蛋白」在全文中可互換使用，並且是指包含藉由肽鍵彼此連結的兩個或更多個胺基酸殘基的分子。多肽和蛋白還包括具有天然序列的胺基酸殘基的一或多個缺失、插入和/或取代的大分子，即包括由天然存在細胞和非重組細胞產生的多肽或蛋白；或藉由基因工程化細胞或重組細胞產生，並且包括具有天然蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基的一或多個缺失、插入和/或取代的分子。多肽和蛋白還包括如下胺基酸聚合物，其中一或多種胺基酸為相應天然存在的胺基酸和聚合物之化學類似物。多肽和蛋白還包括修飾，該修飾包括但不限於糖基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP核糖基化。術語「分離的蛋白」、「分離的重組蛋白」或「純化的重組蛋白」可以互換使用，並且是指從會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白或多肽或其他污染物中純化出來的目的多肽或蛋白。特別地，由使用如本文描述的本發明處理的目的重組蛋白製成的藥物物質和藥物產品可以被稱為「重組蛋白藥物產品」、「重組生物治療劑」。
多肽和蛋白可能具有科學意義或商業意義，包括蛋白治療劑。目的蛋白尤其包括分泌型蛋白、非分泌型蛋白、胞內蛋白或膜結合蛋白。目的蛋白可以使用本文描述的方法藉由細胞系生產，並且可以被可互換地稱為「重組蛋白」、「目的重組蛋白」或「重組蛋白治療劑」。所表現的一或多種蛋白可以在細胞內產生或被分泌到培養基中，從培養基中可以回收和/或收集該蛋白。目的蛋白可以包括例如藉由結合靶、特別是下面列出的那些中的靶而發揮治療作用的蛋白，包括從其衍生的靶、與其相關的靶及其修飾。
目的蛋白可以包括「抗原結合蛋白」。「抗原結合蛋白」係指包括抗原結合區或抗原結合部分的蛋白或多肽，該抗原結合區或抗原結合部分對與其結合的另一分子（抗原）具有強親和力。抗原結合蛋白質包括但不限於抗體、多肽（peptibody）、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物、融合蛋白（包括單鏈可變片段（scFv）和雙鏈（二價）scFv、突變蛋白、xMAb、雙特異性T細胞募召劑（BiTE® ）、及嵌合抗原受體（CAR或CAR-T）和T細胞受體（TCR）。
scFv係單鏈抗體片段，它具有連接在一起之抗體重鏈及輕鏈之可變區。參見美國專利號7,741,465和6,319,494以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy [癌症免疫學免疫療法](1997) 45: 131-136。scFv保留了親本抗體與靶抗原特異性相互作用的能力。
術語「抗體」包括任何同型或亞類的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白，或者其與完整抗體競爭特異性結合的抗原結合區。除非另外說明，否則抗體包括人的、人源化的、嵌合的、多特異性的、單株、多株、特異性IgG（heteroIgG）、雙特異性的抗體、及其寡聚物或抗原結合片段。抗體包括lgG1型、lgG2型、lgG3型或lgG4型。還包括具有抗原結合片段或抗原結合區的蛋白，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、雙抗體、Fd、dAb、最大抗體（maxibody）、單鏈抗體分子、單結構域VH H、互補決定區（CDR）片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體和至少包含足以使特異性抗原與靶多肽結合的免疫球蛋白的一部分的多肽。
還包括人的、人源化的和其他抗原結合蛋白，如人抗體和人源化抗體，該抗原結合蛋白當投與於人時不會產生明顯有害的免疫反應。
還包括經修飾的蛋白，如經非共價鍵、共價鍵或者共價鍵和非共價鍵兩者化學修飾的蛋白質。還包括進一步包含一或多種譯後修飾的蛋白質，其可以藉由細胞修飾系統或由酶和/或化學方法離體引入或以其他方式引入的修飾製得。
目的蛋白還可以包括重組融合蛋白，該重組融合蛋白包括例如多聚化結構域，如白胺酸拉鍊、捲曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分等。還包括包含分化抗原的全部或部分胺基酸序列的蛋白質（稱為CD蛋白）或其配位基或與該等中的任一個實質上相似的蛋白質。
在一些實施方式中，目的蛋白可以包括群落刺激因子，如粒細胞群落刺激因子（G-CSF）。此類G-CSF試劑包括但不限於Neupogen® （非格司亭）及Neulasta® （培非格司亭）。還包括紅血球生成刺激劑（ESA），如Epogen® （依伯汀（epoetin）α）、Aranesp® （達貝泊汀α）、Dynepo® （依伯汀δ）、Mircera® （甲氧基聚乙二醇-依伯汀β）、Hematide® 、MRK-2578、INS-22、Retacrit® （依伯汀ζ）、Neorecormon® （依伯汀β）、Silapo® （依伯汀ζ）、Binocrit® （依伯汀α）、依伯汀αHexal、Abseamed® （依伯汀α）、Ratioepo® （依伯汀θ）、Eporatio® （依伯汀θ）、Biopoin® （依伯汀θ）、依伯汀α、依伯汀β、依伯汀ζ、依伯汀θ和依伯汀δ、依伯汀ω、依伯汀ι、組織纖維蛋白溶酶原活化物、GLP-1受體促效劑、以及前述任何內容的分子或其變異體或類似物和生物仿製藥。
在一些實施方式中，目的蛋白可以包括與一或多種CD蛋白、HER受體家族蛋白、細胞黏附分子、生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）、似胰島素生長因子、骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白、凝血和凝血相關蛋白、群落刺激因子（CSF）、其他血液和血清蛋白血型抗原特異性結合的蛋白；受體、受體相關蛋白、生長激素、生長激素受體、T細胞受體；神經營養因子、神經營養蛋白、鬆弛素（relaxin）、干擾素、介白素、病毒抗原、脂蛋白、整合素、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、轉運蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白及免疫黏附素。
在一些實施方式中，目的蛋白單獨或以任何組合結合以下一或多種蛋白質的蛋白質：CD蛋白（包括但不限於CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174）、HER受體家族蛋白（包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受體）、EGFRvIII、細胞黏附分子（例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和α v/β 3整合素）、生長因子（包括但不限於例如血管內皮生長因子（「VEGF」））；VEGFR2、生長激素、甲狀腺促素、促濾泡素、黃體促素、生長激素釋放因子、副甲狀腺素、米勒管抑制物質（mullerian-inhibiting substance）、人類巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1-α）、紅血球生成素（EPO）、神經生長因子（諸如NGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、纖維母細胞生長因子（包括例如aFGF和bFGF）、表皮生長因子（EGF）、Cripto、轉變生長因子（TGF）（其中包括TGF-α和TGF-β（包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5））、似胰島素生長因子-I和似胰島素生長因子-II（IGF-I和IGF-II）、des(1-3)-IGF-I（腦IGF-I）和骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白（包括但不限於胰島素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素原和似胰島素生長因子結合蛋白）；（凝血蛋白和凝血相關蛋白，尤其如，VIII因子、組織因子、維勒布蘭德（von Willebrand）因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原活化物（如尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原活化物（「t-PA」））、邦巴辛（bombazine）、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受體、群落刺激因子（CSF）（尤其包括以下物質：M-CSF、GM-CSF和G-CSF）、其他血液和血清蛋白（包括但不限於白蛋白、IgE和血型抗原）、受體和受體相關蛋白（包括例如flk2/flt3受體、肥胖（OB）受體、生長激素受體和T細胞受體）；(x) 神經營養因子，包括但不限於骨源性神經營養因子（BDNF）和神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6（NT-3、NT-4、NT-5或NT-6）；(xi) 鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈和鬆弛素原、干擾素（包括例如干擾素α、干擾素β和干擾素γ）、介白素（IL）（例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受體、IL-4受體和/或IL-13受體、IL-13RA2或IL-17受體、IL-1RAP；(xiv) 病毒抗原，包括但不限於AIDS有包膜病毒抗原、脂蛋白、降血鈣素、升糖素、心房利尿鈉因子、肺界面活性劑、腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β、腦啡肽酶、BCMA、IgKappa、ROR-1、ERBB2、間皮素、RANTES（受激活調節的正常T細胞表現與分泌因子）、小鼠促性腺激素相關肽、DNA酶、FR-α、抑制素和活化素、整合素、蛋白A或D、類風濕因子、免疫毒素、骨成形性蛋白蛋白（BMP）、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰退加速因子（DAF）、AIDS包膜、轉運蛋白、歸巢受體、MIC（MIC-a、MIC-B）、ULBP 1-6、EPCAM、位址素、調節蛋白、免疫黏附素、抗原結合蛋白、生長激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白（Claudin）-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GM2、BAFF、OPGL（RANKL）、肌生成抑制素、Dickkopf-1（DKK-1）、Ang2、NGF、IGF-1受體、肝細胞生長因子（HGF）、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、計劃性細胞死亡蛋白1和配位基、PD1和PDL1、甘露糖受體/hCGβ、丙型肝炎病毒、間皮素dsFv[PE38軛合物（conjugate）、嗜肺軍團菌（lly）、IFN γ、γ干擾素誘導蛋白10（IP10）、IFNAR、TALL-1、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型（PCSK9）、幹細胞因子、Flt-3、降血鈣素基因相關肽（CGRP）、OX40L、α4β7、血小板特異性（血小板糖蛋白Iib/IIIb（PAC-1）、轉化生長因子β（TFGβ）、透明帶精子結合蛋白3（ZP-3）、TWEAK、血小板衍生的生長因子受體α（PDGFRα）、硬化蛋白（sclerostin）、以及任何前述內容的生物活性片段或變異體。
在另一個實施方式中，目的蛋白質包括阿昔單抗（abciximab）、阿達木單抗（adalimumab）、阿德木單抗（adecatumumab）、阿柏西普（aflibercept）、阿侖單抗（alemtuzumab）、阿利庫單抗（alirocumab）、阿那白滯素（anakinra）、阿塞西普（atacicept）、巴厘昔單抗（basiliximab）、貝利木單抗（belimumab）、貝伐單抗（bevacizumab）、生物素單抗（biosozumab）、博納吐單抗（blinatumomab）、本妥昔單抗（brentuximab vedotin）、布羅達單抗（brodalumab）、莫坎妥珠單抗（cantuzumab mertansine）、康納單抗（canakinumab）、西妥昔單抗（cetuximab）、賽妥珠單抗（certolizumab pegol）、可那木單抗（conatumumab）、達利珠單抗（daclizumab）、迪諾舒單抗（denosumab）、依庫麗單抗（eculizumab）、依決洛單抗（edrecolomab）、依法利珠單抗（efalizumab）、依帕珠單抗（epratuzumab）、依那西普（etanercept）、依伏庫單抗（evolocumab）、加利昔單抗（galiximab）、蓋尼塔單抗（ganitumab）、吉妥珠單抗（gemtuzumab）、戈利木單抗（golimumab）、替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan）、英夫利昔單抗（infliximab）、易普利姆瑪（ipilimumab）、依克珠單抗（ixekizumab）、樂地單抗（lerdelimumab）、魯昔單抗（lumiliximab）、馬帕木單抗（mapatumumab）、磷酸莫特沙尼（motesanib diphosphate）、莫羅單抗-CD3（muromonab-CD3）、那他珠單抗（natalizumab）、奈西立肽（nesiritide）、尼妥珠單抗（nimotuzumab）、納武單抗（nivolumab）、奧瑞珠單抗（ocrelizumab）、奧法木單抗（ofatumumab）、奧馬珠單抗（omalizumab）、奧普瑞介白素（oprelvekin）、帕利珠單抗（palivizumab）、帕尼單抗（panitumumab）、派姆單抗（pembrolizumab）、帕妥珠單抗（pertuzumab）、培克珠單抗（pexelizumab）、蘭尼單抗（ranibizumab）、利妥木單抗（rilotumumab）、利妥昔單抗（rituximab）、羅米司亭（romiplostim）、洛莫索珠單抗（romosozumab）、沙格司亭（sargamostim）、托珠單抗（tocilizumab）、托西莫單抗（tositumomab）、曲妥單抗（trastuzumab）、優特克單抗（ustekinumab）、維多珠單抗（vedolizumab）、維西珠單抗（visilizumab）、伏洛昔單抗（volociximab）、紮木單抗（zanolimumab）、紮魯木單抗（zalutumumab）以及前述任何內容的生物仿製藥。
根據本發明所述之目的蛋白涵蓋所有前述內容，並且進一步包括包含上述任何抗體的1、2、3、4、5或6個互補決定區（CDR）的抗體。還包括這樣的變異體，其包括與目的蛋白的參考胺基酸序列具有70%或更高、特別是80%或更高、更特別是90%或更高、再更特別是95%或更高、具體是97%或更高、更具體是98%或更高、再更具體是99%或更高同一性的胺基酸序列的區。在這方面的同一性可以使用多種熟知的且容易獲得的胺基酸序列分析軟體來確定。較佳的軟體包括實施史密斯-沃特曼（Smith-Waterman）演算法的那些軟體，該軟體被認為係搜索和比對序列問題的令人滿意的解決方案。還可以採用其他演算法，特別是在速度係重要考慮因素的情況下。可以用於此方面的用於DNA、RNA和多肽的比對和同源性匹配的常用程式包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE及MPSRCH，後者係用於在MasPar製造的大規模並行處理器上執行的史密斯-沃特曼演算法的實施方式。
本文中還提供包含如上文所述之至少一種核酸分子的呈質體、表現載體、轉錄盒或表現盒形式的表現系統和構建體，及包含此類表現系統或構建體的宿主細胞。如本文所用，「載體」意指適合用於將資訊編碼蛋白轉移和/或轉運至宿主細胞和/或特定位置和/或宿主細胞內的區室的任何分子或實體（例如，核酸、質體、噬菌體、轉座子、黏粒、染色體、病毒、病毒衣殼、病毒體、裸DNA、複合DNA等）。載體可以包括病毒和非病毒載體、非附加型哺乳動物載體。載體通常被稱為表現載體，例如，重組表現載體及選殖載體。可以將載體引入宿主細胞以允許載體自身的複製，並從而擴增其中包含的多核苷酸的拷貝。選殖載體可含有序列組分，該序列組分通常包括但不限於複製起點、啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列和可篩選標記。該等元件可以由熟悉該項技術者適當選擇。
一或多種「細胞」包括任何原核或真核細胞。細胞可以是離體細胞、體外細胞或體內細胞，可以是單獨的或作為高級結構（如組織或器官）的一部分。細胞包括「宿主細胞」，也稱為「細胞系」，它們經基因工程化以表現具有商業或科學意義的多肽。宿主細胞典型地源自來自原代培養物的譜系，其可在培養中維持無限時間。基因工程化宿主細胞涉及用重組多核苷酸分子轉染、轉化或轉導細胞，和/或以其他方式改變（例如，藉由同源重組和基因激活或重組細胞與非重組細胞的融合）以引起宿主細胞表現所需的重組多肽。用於遺傳工程化細胞和/或細胞系以表現目的多肽的方法和載體係熟悉該項技術者熟知的；例如，各種技術在Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學現代方法]，Ausubel等人編輯（Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 紐約, 1990，每季度更新）；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊]（Cold Spring Laboratory Press [冷泉實驗室出版社], 1989）；Kaufman, R. J.，Large Scale Mammalian Cell Culture [大規模哺乳動物細胞培養], 1990, 第15-69頁。
宿主細胞可以是任何原核細胞（例如大腸桿菌）或真核細胞（例如酵母、昆蟲或動物細胞（例如CHO細胞））。可經由常規轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。
在一個實施方式中，該細胞係宿主細胞。宿主細胞當在適當條件下培養時表現目的蛋白，該目的蛋白隨後可以自培養基收集（若宿主細胞將其分泌至培養基中）或直接由產生它的宿主細胞收集（若其並非分泌的）。適當的宿主細胞的選擇將取決於各種因素，例如所希望的表現水平、活性所希望的或所需的多肽修飾（例如糖基化或磷酸化）和易於折疊成生物活性分子。
「培養」或「進行培養」係指細胞在多細胞生物體或組織外部的生長和繁殖。哺乳動物細胞的合適培養條件係本領域已知的。細胞培養基和組織培養基可互換地用於指在體外細胞培養期間適合宿主細胞生長的培養基。典型地，細胞培養基含有緩衝液、鹽、能量來源、胺基酸、維生素和痕量必需元素。可以使用能夠支持適當宿主細胞在培養中生長的任何培養基。可以將細胞培養基進一步補充其他組分以最大化特定培養的宿主細胞中的細胞生長、細胞活力和/或重組蛋白生產，該細胞培養基係可商購的，並且包括RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、杜爾貝科改良伊格爾培養基（DMEM）、伊格爾最低必需培養基、F-12K培養基、哈姆F12培養基、伊思考夫改良的杜爾貝科培養基、麥考伊5A培養基、Leibovitz L-15培養基和無血清培養基如EX-CELL™300系列等，該培養基可以從美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）或SAFC生物科學公司（SAFC Biosciences）和其他供應商處獲得。細胞培養基可以是無血清、無蛋白質、無生長因子和/或無蛋白質腖的培養基。還可以藉由添加營養來富集細胞培養物，並以高於其通常的、推薦的濃度使用。
在培養過程中可以使用各種培養基配製物，例如，以促進從一個階段（例如，生長階段或生長期）過渡到另一階段（例如，生產階段或生產期）和/或優化細胞培養期間的條件（例如在灌注培養過程中提供的濃縮培養基）。生長培養基配製物可用於促進細胞生長並使蛋白質表現最小化。生產培養基配製物可用於促進目的蛋白質的生產和細胞的維持，同時使新細胞的生長減至最少。飼料培養基，典型地是包含在細胞培養物生產期過程中消耗的較高濃度組分（如營養素和胺基酸）的培養基，可用於補充和維持活性培養物，特別是分批加料、半灌注或灌注模式的培養物。這種濃縮的飼料培養基可以包含大多數細胞培養基組分，例如，其正常量的約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至約1000倍。
生長期可以在比生產期更高的溫度下進行。例如，生長期可以在從約35°C至約38°C的第一溫度下進行，並且生產期可以於從約29°C至約37°C，視需要從約30°C至約36°C或從約30°C至約34°C的第二溫度下進行。此外，可以在溫度變化之前和/或之後的同時添加蛋白質產生的化學誘導劑，如像咖啡因、丁酸酯和六亞甲基雙乙醯胺（HMBA）。如果在溫度變化後添加誘導劑，則可以在溫度變化後1小時至5天，視需要在溫度變化後1至2天添加誘導劑。
宿主細胞可以懸浮或以附著在固體基質上的黏附形式培養。可以在帶有或不帶有微載體的流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌罐生物反應器中建立細胞培養。
細胞培養能以分批、分批加料、連續、半連續或灌注模式進行。哺乳動物細胞（如CHO細胞）可以在生物反應器中以小於100 ml至小於1000 ml之小規模培養。可替代地，可以使用含有1000 ml至20,000升以上培養基之大規模生物反應器。大規模細胞培養，如用於蛋白治療劑的臨床和/或商業規模生物製造的細胞培養，可維持數週甚至數月，在此期間細胞產生所需的一或多種蛋白。
本文提供了用於產生分離的、純化的目的重組蛋白之方法，該方法包括用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白之細胞；收穫含有該目的重組蛋白之細胞培養液；使收穫的含有該目的重組蛋白的流體以足以導致有包膜病毒滅活之清潔劑濃度和時間經受清潔劑，該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；藉由至少兩個額外的單元操作處理含有該目的重組蛋白的經病毒滅活的流體；以及獲得分離的、純化的目的重組蛋白。
本文提供了用於產生分離的、純化的目的重組蛋白之方法，該方法包括用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白之細胞；收穫含有該目的重組蛋白的細胞培養液；藉由至少兩個單元操作處理收穫的含有該目的重組蛋白的流體，其中在至少一個單元操作期間存在如下步驟，在該步驟中含有該目的重組蛋白的流體與具有以下CAS登記號的清潔劑以足以導致有包膜病毒滅活的清潔劑濃度和時間組合：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；以及獲得分離的、純化的目的重組蛋白。
然後可以從生物反應器中的細胞培養物中收穫含有表現的重組蛋白的細胞培養液。從懸浮細胞中收穫表現的蛋白質的方法係本領域已知的，並且包括但不限於酸沈澱、加速沈降（如絮凝）、使用重力分離、離心、聲波分離、過濾（包括使用超濾器、微濾器、切向流過濾器、深度過濾器和沖積過濾器的膜過濾）。藉由本領域已知的氧化還原折疊過程之方法，可以從細胞質中的包涵體中回收由原核生物表現的重組蛋白。
然後，可以使用一或多個單元操作從任何雜質，諸如剩餘的細胞培養基、細胞萃取物、不需要的組分、宿主細胞蛋白、表現不正確的蛋白、污染物、微生物（諸如細菌和病毒）、聚集物等中純化出或部分純化在澄清的收穫的細胞培養液中的目的重組蛋白。術語「單元操作」係指純化重組蛋白（諸如從液體培養基中）的過程中進行的功能步驟。例如，一個單元的操作可以涉及過濾（例如，從包括重組蛋白的流體中去除污染物細菌、酵母、病毒、分枝桿菌、雜質和/或顆粒物質）、捕獲、表位標籤去除、純化、收集、貯存、儲存、精製、收穫、病毒滅活（包括清潔劑病毒滅活）、病毒過濾、包含重組蛋白的流體的離子濃度和/或pH調節（以及去除不需要的鹽）。 本文描述的發明可用於從藥物物質的收穫到配製的下游過程中的一或多個步驟。
例如，單元操作可以包括，諸如但不限於收穫、捕獲、純化、精製、病毒滅活、病毒過濾和/或調節含有該目的重組蛋白的濃度和配製物的步驟。單元操作還可以包括其中彙集、貯存和/或儲存流體（諸如收穫、層析或過濾後的捕獲彙集物）以及貯存或儲存容器中的流體（諸如收穫後）的步驟。可以將單一單元操作設計為在同一操作中完成多個目標，諸如收穫和病毒滅活或捕獲和病毒滅活。
捕獲單元操作包括利用樹脂和/或含有與目的重組蛋白結合的試劑的膜進行捕獲層析，例如親和層析、尺寸排阻層析、離子交換層析、疏水交互作用層析（HIC）、固相金屬親和層析（IMAC）等。此類材料係本領域已知的並且可以是可商購的。親和層析可以包括，例如底物結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、適配子結合捕獲機制、和輔助因子結合捕獲機制。示例性親和層析包括蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L。目的重組蛋白可以用聚組胺酸標籤標記隨後使用咪唑藉由IMAC純化，或者使用表位（諸如FLAG® ）標記隨後使用針對該表位的特異性抗體進行純化。
一或多個捕獲單元操作可以包括病毒滅活和病毒過濾。除了本文提供的本發明之病毒滅活方法外，亦可以使用用於病毒滅活的其他方法，諸如熱滅活/巴氏消毒、pH滅活、UV和γ射線照射、使用高強度廣譜白光以及添加化學滅活劑（諸如B-丙內酯）。
可以在任何時候對已知或懷疑在流體中含有的病毒進行滅活。在生物藥物物質製造期間，在含有目的重組蛋白的流體中的病毒滅活的發生可以是在一或多個獨立的病毒滅活單元操作中；作為收穫單元操作的一部分；在一或多個捕獲層析單元操作之前、或作為其一部分、或在其之後；在一或多個親和層析單元操作之前、或作為其一部分、或在其之後；在一或多個精製層析單元操作之前、或作為其一部分、或在其之後；在一或多個離子交換層析、疏水交互作用層析、混合模式或多模式層析和/或羥基磷灰石層析單元操作之前、或作為上述的一部分、或在上述之後；在一或多個病毒過濾單元操作之前、或作為其一部分、或在其之後；和/或在一或多個超濾/滲濾單元操作之前或在其之後。在一個實施方式中，該病毒滅活發生在收穫之後。在一個實施方式中，該病毒滅活發生在包括微濾的收穫單元操作之後。在一個實施方式中，該病毒滅活發生在捕獲層析單元操作之前。在一個實施方式中，該病毒滅活發生在蛋白質A親和層析步驟之前。病毒滅活後可以藉由過濾（諸如深層過濾）或層析（諸如蛋白質A層析）以去除滅活的病毒、滅活劑（諸如界面活性劑和清潔劑）、濁度和/或沈澱。
可以使用微濾器和/或納濾器進行病毒過濾，該微濾器和/或納濾器係可商購來源（諸如旭化成株式會社（Asahi Kasei）（Plavona® ）及EDM密理博公司（Millipore）（VPro® ））的。
「精製」在本文用於指進行一或多個層析步驟以從包括接近最終所需純度的重組蛋白的流體中去除殘留的污染物和雜質，如DNA、宿主細胞蛋白；產物特異性雜質、變異體產物和聚集體和病毒吸附。例如，可以藉由使包括重組蛋白的流體流過一或多種層析管柱或一種或多種膜吸收劑，使其選擇性結合目標重組蛋白或存在於包括重組蛋白的流體中的污染物或雜質，以結合和溶析模式進行精製。在此實例中，一或多種層析管柱或膜吸收劑的溶析液/濾液包括重組蛋白。
精製層析單元操作使用的層析樹脂和/或膜含有能以流通模式（其中目的蛋白包含在流經層析介質的溶析液中並且污染物和雜質結合到層析介質上）或結合並溶析模式（其中目的蛋白結合到層析介質上並且在污染物和雜質流經層析介質或從層析介質上洗掉後從層析介質上溶析）使用的試劑。此類層析方法的實例包括離子交換層析（IEX），諸如陰離子交換層析（AEX）和陽離子交換層析（CEX）；疏水交互作用層析（HIC）；混合模式或多模式層析（MM）、羥基磷灰石層析（HA）；反相層析和凝膠過濾。
儘管在本申請中使用的術語係本領域中的標準術語，但是本文提供了某些術語的定義以確保申請專利範圍之含義的清楚性及確定性。單位、前綴和符號可能會用它們的SI接受形式表示。本文列舉之數字範圍包括定義範圍的數字，並且包括並支持所定義範圍內的每個整數。除非另外指示，否則本文所述之方法及技術可根據本領域中熟知的常規方法且如貫穿本說明書所引用及論述的各種通用及更特定參考文獻中所描述來進行。參見，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y.[紐約州冷泉港] (2001) 和 Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學實驗指南], Greene Publishing Associates [格林出版公司] (1992)，以及 Harlow 和 Lane Antibodies: A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊] Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y [紐約州冷泉港] (1990)。在本申請中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不局限於專利、專利申請、論文、書籍、及專著，都藉由引用清楚地併入本文。在本發明的一個實施方式中描述的內容可以與本發明的其他實施方式組合。
本發明在範圍上不受本文所述之特定實施方式的限制，該等特定實施方式旨在作為本發明各個方面的單個說明，並且功能上等效的方法和組分也在本發明的範圍內。實際上，除了本文中顯示和描述的那些之外，根據前述描述及附圖，本發明的各種修改對於熟悉該項技術者將變得顯而易見。這類改變旨在落入所附申請專利範圍的範圍內。實例 實例 1 病毒儲備液
按照先前在Romanowski等人, Bioprocess Int[國際生物製程] 2008, 6 (2), 44-52中的描述產生xMuLV、PRV和MMV的病毒儲備液。為了鑒定致細胞病變效應（CPE），使用了與病毒相容的指示細胞系。對於xMuLV，使用了PG4細胞系（貓星形膠質細胞系）。接種後七天確定CPE。接種後10天後，用324K細胞系確定MMV的CPE，並且對於PRV在3天的測定中使用了Vero細胞系。清潔劑篩選
使用xMuLV（一種常用於病毒清除研究的小鼠逆轉錄病毒）對96種清潔劑進行了初步篩選。該篩選係在96深孔板（來自漢普頓研究公司（Hampton Research）（HR2-406），亞裡索維耶荷，加利福尼亞州）上進行的。測試的清潔劑具有一系列的兩性性能，該兩性性能包括非離子、兩性離子和離子特性。如漢普頓（Hampton）套組（kit）所示，在篩選中評估的所有清潔劑均為其臨界微胞濃度（CMC）值的10倍或10% w/v。15°C下加入5%病毒30分鐘後，評估每種清潔劑的重複運行。還同時運行了加入5% v/v水的對照，以展示稀釋液對終止清潔劑的滅活有效。用培養基以1 : 300稀釋每個重複運行和對照運行，以減少細胞毒性和干擾，並用25%匯合（confluent）的PG4黏附細胞孵育。孵育期後，分析孔中所接種的PG4細胞中的任何CPE。
用從100 至10-7 的1 : 10連續系列稀釋液在8個重複中進行TCID50測定。 在運行期間保持在蛋白質中加入10% xMuLV的無清潔劑的同步對照溶液（hold control solution）以及種子培養基的陰性對照。將所有樣本用25%匯合的PG4細胞滴定並在37°C下孵育7天。如前該（Romanowski等人, 同上），在第七天讀取平板CPE並用總病毒滴定量和對數減小值（LRV）的斯皮爾曼-卡爾伯方程進行評估。擴展的病毒研究
根據歐盟關於化學安全的指令67/548/EC，目前將19種滅活xMuLV的清潔劑視為不危險。該等清潔劑在5倍CMC值下進行針對另外兩種病毒（另一種有包膜病毒PRV和一種無包膜病毒MMV）的進一步測試。兩種病毒均在5% v/v下測試，否則按照如上述清潔劑初步篩選所述之使用相同的條件及測定。濃度研究
評估了Anapoe C12E8（CAS號 3055-98-9）、Anapoe C12E9（CAS號 3055-99-90）、CYMAL®-5（CAS號250692-65-0）、Fos-Choline® -10（CAS號 70504-28-8）（由俄亥俄州莫米市Anatrace提供）和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷（CAS號 85618-20-8）（西格瑪/奧德里奇公司（Sigma-Aldrich），聖路易斯，密蘇里州）仍能滅活病毒的最低濃度。如上該，在15°C下，使清潔劑與病毒孵育30分鐘時期，針對xMuLV評估了2.5倍、5倍和7.5倍臨界微胞濃度之濃度。溫度依賴性研究
針對xMuLV，在5°C至22°C的溫度下，在含有三種不同蛋白質形式（單株抗體（mAb #1）、雙特異性T細胞募召劑（BiTE® #1）和XmAb融合蛋白（融合蛋白 #1））的基質（宿主細胞培養液）中評估了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、CYMAL® -5、Fos-Choline® -10和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷。如前該（Romanowski等人, 同上），取30秒、10分鐘及30分鐘之時間點，並且按1 : 300稀釋（在該稀釋度下使用皮爾曼-卡爾伯法，緩衝基質不會引起毒性和干擾）。 在18°C下重複運行Triton X100對照（密理博西格瑪公司（Millipore Sigma），特曼庫拉，加利福尼亞州）。清潔劑之動力學研究
針對xMuLV，在含有三種不同蛋白質形式（單株抗體（mAb #1）、雙特異性T細胞募召劑（BiTE® #1）和XmAb融合蛋白（融合蛋白 #1））的基質（宿主細胞培養液）中，在三個時間點評估了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、CYMAL® -5、Fos-Choline® -10和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷：30秒、10分鐘及30分鐘。取30秒、10分鐘及30分鐘之時間點，並且按1 : 300稀釋（在該稀釋度下使用皮爾曼-卡爾伯法，緩衝基質不會引起毒性和干擾）。清潔劑清除率
在蛋白質A層析期間針對含有單株抗體的樣本評估了清潔劑Anapoe C12E9的清除率。將蛋白質樣本（含有單株抗體的宿主細胞培養液）加有0.03%清潔劑並運行通過蛋白質A管柱。在沃特世（Waters）BioResolveTM 多酚（米爾福德（Milford），麻塞諸塞州）450 Å, 2.1 x 50 mm管柱上評估了溶析峰和加有清潔劑的緩衝液之清除率。在65°C之流速為0.5 mL/min。使用固定相A（含有0.1%TFA/0.1%甲酸的水）及流動相B（90%正丙醇），以5分鐘的梯度運行樣本。擴展範圍之研究
擴展本研究之範圍以評估另外兩種烷基乙氧基化物衍生物。測試了在三個濃度下（其CMC值的2.5倍、5倍和7.5倍）的烷基乙氧基清潔劑IsoC13E6（CMC: 29.91 mg/L）和Iso-C13E9（CMC: 57.97 mg/L）（亦可作為Alfonic TDA-6乙氧基化物Novel-TDA6和Alfonic TDA-9乙氧基化物Novel-TDA9（Avantor,拉德諾市, 賓夕法尼亞州; Sasol, 約翰尼斯堡, 南非） CAS 9043-30-5）獲得）。將樣本與加有5% XMuLV的含有mAb #1或雙特異性T細胞募召劑（BiTE® #1）的宿主細胞培養液在5°C下孵育。將樣本按1 : 300稀釋以減少在三個時間點（30秒、10分鐘和30分鐘）的細胞毒性和干擾。
用從100 至10-7 的1 : 10連續系列稀釋液在8個重複中進行TCID50測定。在運行期間保持在蛋白質中加入5% XMuLV的無清潔劑的同步對照溶液（hold control solution）以及種子培養基之陰性對照。將所有樣本用25%匯合的PG4細胞滴定並在37°C下孵育7天。如前該（Romanowski等人, 同上），在第七天讀取平板CPE並用總病毒滴定量和對數減小值（LRV）的斯皮爾曼-卡爾伯方程進行評估。結果與討論 清潔劑篩選
利用具有不同離子、疏水性及結構特徵的96種可商購的清潔劑的選擇，針對包膜模型病毒xMuLV進行了初步篩選。如表1所示，在該等清潔劑中的五十一種中，在重複和清潔劑對照中均未鑒定出CPE。這個組包括非離子型、兩性離子型及合成脂質清潔劑，而測試的離子型清潔劑均未顯示病毒滅活。 [表1]. 96種樣本清潔劑之初步篩選中顯示出對xMuLV病毒滅活的清潔劑。SL = 合成脂質；Z = 兩性離子型；N = 非離子型。
清潔劑 CMC （ mM ） 濃度 （ mM 或 % w/v ） cLogP 類型
ANAPOE-C12E9 0.05 0.5 3.6678 N
ANAPOE-C12E8 0.11 1.1 3.8434 N
正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷 29 290 2.01455 N
正辛基-β-D-硫代哌喃麥芽糖苷 8.8 85 0.3578 N
NDSB-195 n/a 0.5 -8.136 Z
FOS-MEA® -10 5.25 52.5 -0.169 Z
蔗糖單月桂酸酯 0.3 3 2.44925 N
正癸醯基蔗糖 2.5 25 1.39125 N
正辛基-β-D-硫代葡萄糖苷 9 90 2.54355 N
CYMAL® -3 34.5 345 -0.2037 N
NDSB-201 n/a 0.5 -8.8248 Z
CHAPS 8 80 -5.265 Z
正十三烷基-β-D-麥芽糖苷 0.033 0.33 2.4363 N
CYMAL® -6 0.56 5.6 1.3833 N
六乙二醇單辛基醚 10 100 2.0786 N
C-HEGA® -10 35 350 2.1348 N
NDSB-211 n/a 0.5 -7.7726 Z
CHAPSO 8 80 -5.7552 Z
正十一烷基-b-D-麥芽糖苷 0.59 5.9 1.3783 N
正壬基-b-D-硫代麥芽糖苷 3.2 32 0.886797 N
HEGA® -9 39 390 2.1298 N
NDSB-221 n/a 0.5 -7.072 Z
FOS-Choline® -10 11 110 -5.557 Z
ANAPOE-X-405 0.81 10% -2.2674 N
CYMAL® -5 5 50 0.8543 N
C-HEGA® -11 11.5 115 2.6638 N
NDSB-256 n/a 0.5 -6.257 Z
Thesit 0.09 0.9 N
正壬基-b-D-麥芽糖苷 6 60 0.3203 N
MEGA-8 79 790 1.803 N
正壬基-b-D-葡萄糖苷 6.5 65 2.50605 N
HECAMEG® 19.5 195 1.57255 N
C-HEGA® -9 108 1080 1.6058 N
HEGA® -10 7 70 2.6588 N
正辛基-b-D-葡萄糖苷 20 200 1.97705 N
HEGA® -8 109 1090 1.6008 N
MEGA -10 7 70 2.861 N
正十二烷基-b-D-麥芽糖苷 0.17 1.7 1.9073 N
C8E5 7.1 71 2.2542 N
MEGA-9 25 250 2.332 N
正己基-b-D-哌喃葡萄糖苷 250 2500 0.919 N
ZWITTERGENT® 3-08 330 10% -4.962 Z
CYMAL® -7 0.19 1.9 1.9123 N
CYMAL® -4 7.6 76 0.3253 N
2,6-二甲基-4-庚基-b-D-哌喃麥芽糖苷 27.5 275 -0.1597 N
Tripao 4.5 45 5.9888 Z
LysoFosTM 膽鹼 12 0.7 7 -6.4146 SL
正癸基-b-D-麥芽糖苷 1.8 18 0.8493 N
C8E4 8 80 1.9008 N
DDMAB 4.3 43 -1.831 Z
LysoFosTM 膽鹼 14 0.036 0.36 -5.3566 SL
在發現病毒滅活陽性的51種清潔劑中，有些在結構上相似，只是烷基鏈連接子的長度不同。藉由基於清潔劑結構的評估結果，觀察到結構類別內的趨勢。根據歐盟關於化學安全的指令67/548/EC，目前將19種鑒定的清潔劑視為不危險（表2）。基於分子結構將該等「生態友好」的清潔劑分成四種類型的組並標記為CYMAL、Fos-Choline、Anapoe和硫代葡萄糖苷，圖1。 [表 2 ]. 根據歐盟關於化學安全的指令67/548/EC，病毒滅活呈陽性的清潔劑被視為不危險。
Anapoe C12E9    聚氧乙烯(9)十二烷基醚    聚多卡醇（Polydocanol）    α-十二烷基-w-羥基-聚(氧-1,2-乙二基)    CAS號：3055-99-0 正壬基-b-D-葡萄糖苷    CAS號：69984-73-2
Anapoe C12E8    聚氧乙烯(8)十二烷基醚    3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜三十六烷-1-醇    CAS號：3055-98-9    正辛基-β-D-硫代哌喃麥芽糖苷， CAS號：148616-91-5
正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷 庚基硫代葡萄糖苷 庚基-β-D-1-硫代哌喃葡萄糖苷 CAS號：85618-20-8 正壬基-b-D-硫代麥芽糖苷 CAS號：148565-55-3
CYMAL® -3 3-環己基-1-丙基-β-D-麥芽糖苷    3-環己基丙基-4-O-(a-D-哌喃葡萄糖基)-b-D-哌喃葡萄糖苷    3-環己基丙基-4-O-α-D-哌喃葡萄糖基-β-D-哌喃葡萄糖苷    (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-(3-環己基丙氧基)-4,5-二羥基-2-(羥甲基)㗁-3-基]氧基-6-(羥甲基)㗁-3,4,5-三醇    CAS號：181135-58-0       正十二烷基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：69227-93-6
CYMAL® -4    4-環己基-1-丁基-β-D-麥芽糖苷    4-環己基丁基-4-O-(a-D-哌喃葡萄糖基)-b-D-哌喃葡萄糖苷    4-環己基丁基-4-O-α-D-哌喃葡萄糖基-β-D-哌喃葡萄糖苷    CAS號：181135-57-9 正癸基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：82494-09-5   
CYMAL® -5 5-環己基戊基-β-D-麥芽糖苷 CAS號：250692-65-0       正十一烷基-b-D-麥芽糖苷 CAS號：253678-67-0
CYMAL® -6 6-環己基-1-己基-β-D-麥芽糖苷 CAS號：228579-27-9       正壬基-b-D-麥芽糖苷    CAS號：106402-05-5   
CYMAL® -7 7-環己基-1-庚基-β-D-麥芽糖苷 CAS號：349477-49-2 正十三烷基-β-D-麥芽糖苷 CAS號：93911-12-7
Fos-Choline® -10    正癸基磷酸膽鹼    CAS號：70504-28-8    正辛基-b-D-葡萄糖苷    CAS號：29836-26-8   
正己基-b-D-哌喃葡萄糖苷    CAS號：59080-45-4   
CYMAL® 清潔劑含有麥芽糖苷糖，該麥芽糖苷糖藉由不同長度的烷基鏈與環己烷連接。CYMAL® 1-7存在於初步篩選的96種清潔劑中。出人意料地，具有一或兩個碳的烷基鏈的CYMAL® 對滅活xMuLV病毒沒有影響，然而具有3-7個碳的烷基鏈的CYMAL® 可以滅活該病毒。與影響Fos-Choline和Anapoe衍生物的烷基鏈長相關的類似的出人意料的結果似乎一樣。發現具有8個或9個碳連接子鏈的Fos-Choline對病毒滅活沒有影響，而具有10個碳連接子的Fos-Choline使病毒滅活。Anapoe清潔劑由烷基鏈和乙氧基化物鏈構成，其中烷基碳（C）數和乙氧基化物基團（E）數在名稱中表示出，例如Anapoe C12E9具有12個烷基碳和9個乙氧基團。雖然發現Anapoe C12E9和Anapoe C12E8強健地滅活該病毒，但是Anapoe C10E9、Anapoe C10E6、Anapoe C12E10及C13E8沒有滅活該病毒，表3。烷基鏈長影響分子的整體疏水性，並可能最終影響病毒包膜的分割。特定範圍的親脂性可能是誘導脂質包膜層破裂所必需的。 [表 3 ]. 影響xMuLV病毒滅活的烷基鏈長
病毒滅活 無病毒滅活
CYMAL® -3 CYMAL®-1
CYMAL® -4 CYMAL®-2
CYMAL® -5 Fos-Choline 8
CYMAL® -6 Fos-Choline 9
CYMAL® -7 氟化的Fos-Choline 8
Fos-Choline® -10 Anapoe C10E9
Anapoe C12E8 Anapoe C10E6
Anapoe C12E9 Anapoe C13E8
   Anapoe C12E10
病毒滅活的擴展的病毒研究範圍
用不同的有包膜病毒（PRV）和無包膜病毒（小鼠微小病毒（MMV））對這19種「生態友好」的清潔劑進行了進一步測試。所有19種清潔劑都能像滅活xMuLV一樣滅活PRV，但對MMV沒有影響，這表明清潔劑對有包膜病毒有影響，但對無包膜的病毒沒有影響。Triton X-100也只影響有包膜病毒，表明該等清潔劑可能以類似的方式破壞脂質包膜。濃度研究
為確定滅活xMuLV所需的最低濃度；針對xMuLV、PRV和MMV，以一式兩份對2.5倍、5倍和7.5倍的CMC值的CYMAL®-5、Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、FosCholine® -10和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷進行了測試。對於所有測試的病毒，2.5倍CMC顯示出致細胞病變效應（CPE）；因此，隨後的研究係在5倍CMC值的該清潔劑下評估的。溫度依賴性研究
在各種溫度，在存在三種蛋白質治療劑形式（單株抗體（mAb）、雙特異性T細胞增強子（BiTE® ）及融合蛋白（XmAb）的情況下，分析了Anapoe C12E8、Anapoe C12E9、正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷、CYMAL® -5和Fos-Choline® -10（表2）。Anapoe清潔劑和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷在5°C和15°C（這代表了製造環境的「最壞情況情景」溫度）下均顯示在30分鐘內完全滅活。這三種清潔劑在BiTE®和mAb形式下的LRV值與Triton X-100相當，甚至對融合蛋白的清除率更好。
在測試的任何溫度下，清潔劑FosCholine-10和CYMAL® -5都不會對xMuLV產生顯著的滅活。因為在初步清潔劑篩選和其他實驗期間觀察到了該等清潔劑對病毒的滅活，所以當不存在產品時，可能存在與樣本基質的陰性相互作用。在15°C的過程溫度下，Fos-Choline® -10和CYMAL® -5的平均LRV分別為3.8和0.39。為了分析溫度對清潔劑的影響，在更高溫度（22°C）下測試了CYMAL® -5，這確實導致LRV增加了約1 log。即使採用這樣的溫度升高，LRV仍然很低。 [表 4 ]. 在兩個溫度（5°C和15°C）下，針對3種不同的形式測試了五種清潔劑的對數減小值。將LRV與具有強健的xMuLV清除率的Triton X-100相比較。
產品 溫度 （ °C ） LRV
BiTE® mAb 融合蛋白
FosCholine ® -10 5 2.09 ± 0.31 2.54 ± 0.34 1.76 ± 0.41
15 3.92 ± 0.67 3.97 ± 0.90 3.51 ± 0.43
CYMAL ® -5 15 -0.06 ± 0.69 0.62 ± 0.50 0.62 ± 0.48
22 1.19 ± 0.29 1.94 ± 0.52 1.01 ± 0.45
Anapoe C12E8 5 ≥ 4.03 ± 0.18 ≥ 4.41 ± 0.37 ≥ 4.23 ± 0.33
15 ≥ 4.32 ± 0.35 ≥ 3.28 ± 0.34 ≥ 4.99 ± 0.42
Anapoe C12E9 5 ≥ 3.84 ± 0.33 ≥ 3.91 ± 0.30 ≥ 4.19 ± 0.25
15 ≥ 3.91 ± 0.43 ≥ 4.23 ± 0.38 ≥ 4.32 ± 0.36
正庚基 -β-D- 硫代哌喃葡萄糖苷 5 ≥ 4.23 ± 0.33 ≥ 4.09 ± 0.25 ≥ 4.07 ± 0.30
15 ≥ 4.03 ± 0.18 ≥ 4.22 ± 0.41 ≥ 4.16 ± 0.42
Triton X-100 運行 1 2-18* 5.85 ± 0.92** ≥ 4.49 ± 0.37** 5.03 ± 0.58**
Triton X-100 運行 2 2-18* ≥ 5.62 ± 0.40** ≥ 4.82 ± 0.44** 5.04 ± 0.57**
*在18°C下測試BiTE® 蛋白質，在2°C下測試mAb並在7°C下測試融合蛋白。 **LRV值基於800個樣本的大容量板，這導致自測試替代性清潔劑的80個孔增加了1個LRV。清潔劑之動力學研究
為了評估發生病毒滅活時的比率，測試了三個時間點：30秒、10分鐘及30分鐘。在30秒內，對Anapoe C12E8和正庚基-β-D-硫代哌喃葡萄糖苷針對測試的所有三種治療劑形式，觀察到xMuLV的完全滅活。Anapoe C12E9在30秒時展示出對mAb #1完全滅活，並且在10分鐘內展示出對融合蛋白#1和BiTE® #1完全滅活，參見表5。Anapoe C12E9在10分鐘內對測試的所有三種治療劑形式顯示完全清除。Anapoe C12E9的CMC值係Anapoe C12E8的一半，這意味著要達到相同的LRV，它需要顯著更少的清潔劑。對於擴大到商業製造數量，此屬性將具有顯著的益處。
在30分鐘內，Fos-Choline® -10和CYMAL® -5均沒有導致強健的清除率。 [表5]. 取三個時間點（30秒、10分鐘及30分鐘）針對三種產品測試了清潔劑的對數減小值（LRV）。
在 15°C 下的清潔劑 產品 LRV
30 s 10 min 30 min
FosCholine ® -10 BiTE® #1 0.69 ± 0.44 1.57 ± 0.47 3.92 ± 0.67
mAb #1 0.69 ± 0.31 1.61 ± 0.56 3.97 ± 0.90
融合蛋白#1 0.82 ± 0.57 1.82 ± 0.51 3.51 ± 0.43
CYMAL ® -5 BiTE® #1 0.19 ± 0.69 0.06 ± 0.58 -0.06 ± 0.69
mAb #1 0.25 ± 0.58 0.12 ± 0.58 0.62 ± 0.50
融合蛋白#1 -0.06 ± 0.69 0.31 ± 0.52 0.62 ± 0.48
Anapoe C12E8 BiTE® #1 ≥ 3.32 ± 0.35 ≥ 3.32 ± 0.35 ≥ 3.32 ± 0.35
mAb #1 ≥ 3.28 ± 0.34 ≥ 3.28 ± 0.34 ≥ 3.28 ± 0.34
融合蛋白#1 ≥ 3.99 ± 0.42 ≥ 3.99 ± 0.42 ≥ 3.99 ± 0.42
Anapoe C12E9 BiTE® #1 2.61 ± 0.68 ≥ 2.91 ± 0.43 ≥ 2.91 ± 0.43
mAb #1 ≥ 3.23 ± 0.00 ≥ 3.23 ± 0.00 ≥ 3.23 ± 0.00
融合蛋白#1 2.56 ± 0.60 ≥ 3.32 ± 0.36 ≥ 3.32 ± 0.36
正庚基 -β-D- 硫代哌喃葡萄糖苷 BiTE® #1 ≥ 3.03 ± 0.18 ≥ 3.03 ± 0.18 ≥ 3.03 ± 0.18
mAb #1 ≥ 3.22 ± 0.41 ≥ 3.22 ± 0.41 ≥ 3.22 ± 0.41
融合蛋白#1 ≥ 3.16 ± 0.42 ≥ 3.16 ± 0.42 ≥ 3.16 ± 0.42
Anapoe C12E8 之清除率
為了確保在病毒滅活過程後能完全清除清潔劑，使用蛋白質A層析法將加有0.03% Anapoe C12E8清潔劑的含有mAb的宿主細胞培養液進行親和純化。使用液相層析-質譜法（LC-MS）分析層析運行後殘留的清潔劑的量。該結果表明該清潔劑在蛋白質A層析步驟期間被清除，圖2。烷基乙氧基化物清潔劑的擴展範圍
為了進一步理解強健的病毒清除率所需的清潔劑的特異性，評估了另外兩種結合有支鏈異丙基基團的烷基乙氧基化物。在濃度等於或高於5倍CMC值時，兩種清潔劑都還具有強健的xMuLV清除率。用兩種治療劑形式（mAb #1和BiTE® #1）觀察到高LRV，表6。該等結果表明範圍廣泛的Anapoe衍生物的強健的病毒滅活能力。 [表6]. 將樣本與產品一起在5°C下以3種濃度孵育30分鐘。用5倍CMC值的Iso-C13E6（Alfonic TDA-6乙氧基化物，Novel-TDA6）和Iso-C13E9（Alfonic TDA-9乙氧基化物，Novel-TDA9），觀察到XMuLV完全滅活。
清潔劑 CMC 值（ mg/L ） 濃度（ CMC 值倍數） 濃度（ mg/L ） LRV 產品
Iso-C13E6 ， Alfonic TDA-6 乙氧基化物， Novel-TDA6 29.91 2.5 74.8 4.9 ± 0.33 mAb #1
5 149.6 ≥ 4.37 ± 0.31
7.5 224.4 ≥ 4.37 ± 0.40
Iso-C13E9 ， Alfonic TDA-9 乙氧基化物， Novel-TDA9 57.97 2.5 145 3.64 ± 0.54 BiTE® #1
5 290 ≥ 4.12 ± 0.35
7.5 435 ≥ 4.37 ± 0.37
實例2 濁度
進一步測試了三種清潔劑以確定他們是否負面影響了四種不同的蛋白質形式的穩定性，如藉由濁度、溶解度和高分子量種類（HMW）測量的。此外，對於HMW藉由尺寸排阻層析法（SEC-HPLC）而對於低分子量種類（LMW）藉由降低的毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉法（rCE-SDS），來測量產品品質。
使用一種單株抗體（mAb #2）、兩種融合蛋白（融合蛋白#2和融合蛋白#3）、一種雙特異性抗體（雙特異性抗體#1）和兩種雙特異性T細胞募召劑（BiTE® #1和BiTE® #2）測試了Anapoe C12E8（APO128）、Anapoe C12E9（APO129）和Triton X-100。
用濁度的測定測量加有清潔劑的樣本的穩定性。增加的樣本濁度將反映蛋白質分子的沈澱。
使從每種分子的培養物中收集的100 mL收穫的細胞培養液（HCCF）經受以下四種條件：不含清潔劑（對照）、含APO128、含APO129和含Triton X-100的HCCF。以該清潔劑的臨界微胞濃度（CMC）值之五倍加入該清潔劑，Triton-X：Triton-X：1.1 mM，APO128：0.55 mM，APO 129：0.25 mM，TDA-9：0.48 mM。
每個分子產生兩組樣本；一組在室溫下保持5天。第二組在2°C-8°C下保持7天。在第0、1、2、5和7天，使用濁度計（Hach濁度計2100P 46500-00，洛夫蘭，科羅拉多州）測量每個樣本的濁度。
圖3顯示了在室溫和2°C-8°C下，清潔劑和HCCF的混合物在每個時間點的濁度數據。第5天的室溫數據點顯示了最大可變性，這可能是由於樣本的細菌污染導致的。加有APO128和APO129的樣本的數據點與加有Triton X-100的樣本的數據點趨勢非常接近，或者混濁程度低於對照。這表明所測試的清潔劑均未引起不同蛋白質形式的沈澱。 實驗4 產品品質
高分子量百分比（%HMW）和低分子量百分比（%LMW）被用於測量加有清潔劑的樣本的穩定性。%HMW測量樣本中蛋白質的聚集，而%LMW測量蛋白質的剪切。在親和管柱純化前後測量該等產品品質屬性，以確定清潔劑的存在是否影響了親和純化過程或親和純化材料的產品品質。
測試了收穫的細胞培養液和來自一種單株抗體（mAb #2）、兩種融合蛋白（融合蛋白#2和融合蛋白#3）、一種雙特異性抗體（雙特異性抗體#1）和兩種雙特異性T細胞募召劑（BiTE® #1和BiTE® #2）的親和層析後的樣本。
將五倍臨界微胞濃度（CMC）的Anapoe C12E8（APO128）（0.11 mM）、Anapoe C12E9（APO129）（0.05 mM）、Alfonic TDA-9乙氧基化物（TDA-9）（0.1 mM）和Triton X-100（0.22 mM）加入100 mL HCCF親和層析前上樣的材料和親和層析後彙集的材料的樣本。使用無清潔劑的樣本作為對照。 在室溫下將樣本與去污劑一起攪拌約1小時。然後，在提交產品品質分析之前，將它們保存在2°C-8°C中7天，或者藉由親和管柱純化，然後提交產品品質分析。
藉由使收穫的細胞培養液經受使用用於BiTE #2的GE CaptoChelating樹脂（匹茲堡市，賓夕法尼亞州）和用於所有其他蛋白質形式的GE MabSelect Sure樹脂（匹茲堡市，賓夕法尼亞州）進行的蛋白質A親和層析產生親和管柱後樣本。
將清潔劑加入額外的100 mL來自每種蛋白質形式的HCCF親和層析前上樣的材料的樣本並在2°C-8°C下保持7天。
使用SEC-HPLC測定%HMW並且使用rCE-SDS測定%LMW，對產品品質進行評估。
由於材料可用性的時間限制，進行了兩組實驗。第一個實驗包括四種條件：無清潔劑對照、Triton X-100、APO128和APO129。第二個實驗包括兩種條件：無清潔劑對照和TDA-9。
圖4顯示了以%HMW和%LMW測量的分子在親和捕獲過程中的穩定性。藉由減去無清潔劑對照的值使數據標準化。對於大多數分子，%HMW和%LMW在親和捕獲步驟前後保持恒定。已知BiTE#2在親和層析後彙集階段不穩定，因此%HMW變化很大。
圖5顯示了親和後BiTE #1的產品品質數據。在親和層析之前，沒有提交BiTE #1 HCCF（上樣的材料）的產品品質。
圖6顯示了在2°C-8°C下培養7天後，由%HMW和%LMW測量的分子的穩定性保持相對恒定。藉由減去無清潔劑對照的值使數據標準化。
在親和層析期間，該清潔劑對產品品質沒有顯著影響。
無
[圖1]：被鑒定為具有病毒滅活特性的結構不同的清潔劑種類。
[圖2]：以下物質的質譜溶析峰：A：ProA純化後的mAb溶析物。B：清潔劑注入後進行空白運行，以驗證清潔劑從檢測器清空。C：將C12E9清潔劑（0.03%）加入水中。
[圖3]：清潔劑和HCCF的混合物在室溫（25°C）和在5°C下的濁度數據。Triton X，三角形；Anapoe C12E8（APO128），菱形；Anapoe C12E8（APO129），正方形；無清潔劑之對照，圓形。
[圖4]：親和層析前後加有清潔劑的樣本的%HMW和%LMW。Triton X，三角形；Anapoe C12E8（APO128），菱形；Anapoe C12E8（APO129），正方形；無清潔劑之對照，圓形；TDA-9，虛線和星形；第二無清潔劑的對照，虛線，空心圓形。
[圖5]：親和層析前後加有清潔劑的BiTE® #1樣本的%HMW和%LMW。
[圖6]：在2°C-8°C孵育7天後，加有清潔劑的HCCF樣本中的%HMW和%LMW。Triton X，三角形；Anapoe C12E8（APO128），菱形；Anapoe C12E8（APO129），正方形；無清潔劑之對照，圓形；無清潔劑之對照，圓形；TDA-9，虛線及星形；第二無清潔劑之對照，虛線，空心圓形。
無

Claims (55)

  1. 一種用於在已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒的流體中滅活有包膜病毒之方法，該方法包括 獲得已知或懷疑含有至少一種有包膜病毒之流體； 將該流體暴露於表1之清潔劑中； 暴露濃度及時間足以導致病毒滅活。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、或CAS 85618-20-8。
  4. 如請求項1所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑至少30秒到至少60分鐘或更久。
  5. 如請求項4所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑至少10分鐘。
  6. 如請求項4所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑至少30分鐘。
  7. 如請求項4所述之方法，其中將流體暴露於該該清潔劑至少60分鐘或更久。
  8. 如請求項1所述之方法，其中該之清潔劑濃度係其臨界微胞濃度（CMC）之至少2.5倍至至少10倍或更高。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該清潔劑之濃度係其CMC的至少5倍。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該清潔劑之濃度係其CMC的至少7.5倍。
  11. 如請求項8所述之方法，其中該清潔劑之濃度係其CMC的至少10倍。
  12. 如請求項1所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C至22°C之溫度下。
  13. 如請求項12所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑發生在至少5°C之溫度下。
  14. 如請求項12所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑發生在至少15°C之溫度下。
  15. 如請求項12所述之方法，其中將該流體暴露於該清潔劑發生在至少20°C之溫度下。
  16. 如請求項1所述之方法，其中該濃度係其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
  17. 如請求項1所述之方法，其中滅活係使用TCID50 測定確定的。
  18. 如請求項1所述之方法，其中該流體包含目的重組蛋白。
  19. 如請求項1所述之方法，其中該流體係收穫的宿主細胞培養液。
  20. 如請求項1所述之方法，其中該流體來自出自單元操作的流出物流、溶析液、彙集物、儲存或貯存容器，該單元操作包括收穫步驟、過濾步驟或層析步驟。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該流體係從深層過濾、微濾、親和層析、離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析或羥基磷灰石層析中收集的溶析液。
  22. 如請求項20所述之方法，其中該流體係含有收穫的細胞培養液、來自深層過濾的溶析液、來自微濾的溶析液、來自親和層析的溶析液、來自離子交換層析的溶析液、來自多模式層析的溶析液、來自疏水交互作用層析的溶析液或來自羥基磷灰石層析的溶析液之彙集物。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該親和層析係蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L層析。
  24. 一種用於在純化目的重組蛋白期間滅活有包膜病毒之方法，該方法包括 獲得包含該目的重組蛋白的流體，該流體已知或懷疑含有至少一種病毒； 使該流體以足以導致在該流體中的有包膜病毒滅活的濃度和時間經受至少一種清潔劑，其中該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；並且 使經病毒滅活的流體經受至少一個單元操作，該單元操作包括至少過濾步驟或層析步驟。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5和CAS 85618-20-8。
  26. 如請求項24所述之方法，其中該濃度係其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
  27. 如請求項24所述之方法，其中該流體包含目的重組蛋白。
  28. 如請求項24所述之方法，其中該流體係收穫的宿主細胞培養液。
  29. 如請求項24所述之方法，其中該流體來自出自單元操作的流出物流、溶析液、彙集物、儲存或貯存容器，該單元操作包括收穫步驟、過濾步驟或層析步驟。
  30. 如請求項24所述之方法，其中該流體係從深層過濾、微濾、親和層析、離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析或羥基磷灰石層析中收集之溶析液。
  31. 如請求項24所述之方法，其中該流體係含有收穫的細胞培養液、來自深層過濾的溶析液、來自微濾的溶析液、來自親和層析的溶析液、來自離子交換層析的溶析液、來自多模式層析的溶析液、來自疏水交互作用層析的溶析液或來自羥基磷灰石層析的溶析液的彙集物。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該親和層析係蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或蛋白質L層析。
  33. 如請求項24所述之方法，其中該層析選自親和層析、蛋白質A層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析；疏水交互作用層析；混合模式或多模式層析或羥基磷灰石層析。
  34. 如請求項24所述之方法，其中該流體係收穫的宿主細胞培養液並且該單元操作包括深層過濾。
  35. 如請求項24所述之方法，其中該流體係收穫的宿主細胞培養液並且該單元操作包括微濾。
  36. 如請求項24所述之方法，其中該流體係收穫的宿主細胞培養液並且該單元操作包括蛋白質A親和層析。
  37. 如請求項24所述之方法，其中該流體係蛋白質A溶析液並且該單元操作包括深層過濾。
  38. 如請求項24所述之方法，其中該單元操作包括深層過濾。
  39. 如請求項24所述之方法，其中該單元操作包括微濾。
  40. 一種用於生產分離的、純化的目的重組蛋白之方法，該方法包括 用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白的細胞； 收穫含有該目的重組蛋白的細胞培養液； 使收穫的含有該目的重組蛋白的流體以足以導致有包膜病毒滅活的清潔劑濃度及時間經受清潔劑，該清潔劑具有以下CAS登記號：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7； 藉由至少兩個額外的單元操作處理含有該目的重組蛋白的經病毒滅活的流體；並且 獲得分離的、純化的目的重組蛋白。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5和CAS 85618-20-8。
  42. 如請求項40所述之方法，其中該濃度係其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
  43. 一種如請求項40所述之分離、純化的目的重組蛋白。
  44. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項40所述之分離的目的蛋白質。
  45. 一種用於生產分離的、純化的目的重組蛋白之方法，該方法包括 用表現重組蛋白的宿主細胞在生物反應器中建立細胞培養以及培養表現該目的重組蛋白的細胞； 收穫含有該目的重組蛋白的細胞培養液； 藉由至少兩個單元操作處理含有所述目的重組蛋白的流體，其中在至少一個單元操作期間存在如下步驟，在該步驟中含有該目的重組蛋白的流體與具有以下CAS登記號的清潔劑以足以導致有包膜病毒滅活的清潔劑濃度和時間組合：CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5、CAS 85618-20-8、CAS 181135-58-0、CAS 181135-57-9、CAS 250692-65-0、CAS 228579-27-9、CAS 349477-49-2、CAS 70504-28-8、CAS 59080-45-4、CAS 69984-73-2、CAS 148616-91-5、CAS 148565-55-3、CAS 69227-93-6、CAS 82494-09-5、CAS 253678-67-0、CAS 106402-05-5或CAS 93911-12-7；並且 獲得分離的、純化的目的重組蛋白。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該清潔劑選自CAS 3055-99-0、CAS 3055-98-9、CAS 9043-30-5和CAS 85618-20-8。
  47. 如請求項45所述之方法，其中該濃度係其CMC的5倍且時間為至少10分鐘。
  48. 如請求項45所述之方法，其中至少一個單元操作包括選自親和層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析和羥基磷灰石層析的捕獲層析步驟。
  49. 如請求項45所述之方法，其中至少一個單元操作包括選自離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、多模式層析、疏水交互作用層析和羥基磷灰石層析的精製層析步驟。
  50. 如請求項45所述之方法，其中至少一個單元操作包括選自病毒過濾、深層過濾和UF/DF之步驟。
  51. 如請求項45所述之方法，其中包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括親和層析的單元操作之前。
  52. 如請求項45所述之方法，其中包括親和層析的單元操作發生在包括病毒滅活步驟的單元操作之前。
  53. 如請求項45所述之方法，其中包括病毒滅活步驟的單元操作發生在包括深層過濾的單元操作之前。
  54. 一種如請求項45所述分離、純化的目的重組蛋白。
  55. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項45所述之分離的目的蛋白質。
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