KR20210142670A - 바이러스 불활성화를 위한 대체 세제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이오제조 작업에서 사용될 수 있는, 친환경적인 것으로 간주되는 세제를 비롯한 외피 보유 바이러스의 불활성화에 사용하기 위한 세제에 관한 것이다.

Description

바이러스 불활성화를 위한 대체 세제

본 출원은 2019년 3월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/820,330호의 유익을 주장하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 바이오제조 작업에서 트리톤(Triton) X100의 대안으로 사용될 수 있는, 친환경적인 것으로 간주되는 세제를 비롯한 외피 보유 바이러스의 불활성화에 사용하기 위한 세제에 관한 것이다.

바이러스 불활성화 공정 단계는 단백질 치료제의 안전성을 보장하는 데 중요하다(문헌[Aranha, BioProcess International 2005; 17-20]; 문헌[Remington, Bioprocess International 2015, 13 (5), 10-17]). 바이러스 오염물질은 배지, 제조 현장 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 외래 바이러스 오염물질을 비롯한 다양한 출처에서 발생할 수 있다(문헌[Aranha, Bioprocess International 2012, 10 (3), 12-17]). 환자의 안전을 보장하기 위해, 바이오제조업체는 불활성화 및 여과 공정을 비롯하여 직교(orthogonal) 바이러스 제거 단계를 포함하는 ICH-Q5A에 의해 확인되는 지침을 따른다(문헌[Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin. Harmonization, I. C. O., Ed. 1999; Vol. Q5A]). 트리톤 X-100(폴리옥시에틸렌 옥틸 페놀 에테르)은 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 불활성화 세제로 오랫동안 사용되어 왔다(문헌[Durno, and Tounekti, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2015, 69 (1), 163-172]; 문헌[Standard Practice for Process Step to Inactivate Rodent Retrovirus with Triton X-100 Treatment, ASTM International. In E3042-16, ASTM, Ed. West Conshohocken, PA, 2016]). 세제는 외측 외피층을 생성하는 막 지질을 가용화하며(문헌[Liumbruno and Franchini, Journal of Thrombosis and Thrombolysis 2015, 39 (1), 118-128]), 따라서, 세제는 외피 보유 바이러스만을 불활성화시키고 외피 비보유 바이러스는 불활성화시키지 않는다(문헌[Hellstern and Solheim, Transfusion medicine and hemotherapy, 2011, 38 (1), 65-70]). 트리톤 X-100은 바이러스를 강력하게 불활성화시키지만 이 세제는 환경 독소이기도 하다. 한 가지 영향으로는 어류의 내분비 시스템에 대한 그의 해로운 영향이 있다. 트리톤 X-100은 에스트라디올 호르몬을 모방하는 옥틸페놀로 분해되어 호르몬 시스템 내에서 변화를 초래한다(문헌[Laws et al., Toxicological Sciences, 2000, 54 (1), 154-167]). 유럽 연합은 화학 물질의 등록, 평가, 승인 및 제한('REACH')에 관한 협의회의 그리고 유럽 의회의 규정(EC) 번호 1907/2006에 대한 REACH, 위원회 규정(EU) 부가 조건 XIV의 57조 내에 기재된 바와 같이, 2020년까지 바이오 제약 회사의 트리톤 X-100 사용을 금지하기 시작할 것이며 (Union, E., Ed. 2017), 따라서 환경 친화적인 강력한 바이러스 불활성화 대체 세제를 확인하는 것이 적절하다. 콘레이(Conley) 등의 최근 연구에 의해 외피 보유 바이러스를 불활성시킬 수 있는 친환경 쯔비터이온성 세제인 라우릴디메틸아민 N-옥시드(LDAO)가 확인되었다. (문헌[Conley et al., Biotechnology and Bioengineering 2017, 114 (4), 813-820] 및 미국 특허 출원 공개 공보 제20150306223호). 미국 특허 출원 공개 공보 제20160333046호에서는 또한 강력한 바이러스 제거 및 생태학적 안전성을 나타내는 다수의 세제가 확인되었다.

이와 같이, 바이오제조에서의 바이러스 제거 공정 단계 내에서 사용하기 위한 외피 보유 바이러스의 불활성화에 효과적인 세제, 특히 친환경적인 것으로 간주되는 세제에 대한 요구가 있다. 본원에 기술된 본 발명은 다중 치료 양식을 위한 바이오제조 공정에 포함될 수 있는 효과적인 바이러스 불활성화 세제를 확인함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.

본 발명은 하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체에서 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체를 얻는 단계; 유체를 표 1의 세제에 노출시키는 단계(바이러스 불활성화를 야기하기에 충분한 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는다. 일 실시 형태에서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 또는 CAS 85618-20-8로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 30초 내지 적어도 60분 또는 그 이상 동안 세제에 노출된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 10분 동안 세제에 노출된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 30분 동안 세제에 노출된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 60분 이상 동안 세제에 노출된다. 일 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 임계 미셀 농도(CMC)의 적어도 2.5배 내지 적어도 10배 또는 그 이상이다. 일 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 5배이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 7.5배이다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 10배이다. 일 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃ 내지 22℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 15℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 20℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 불활성화는 TCID₅₀ 분석법을 사용하여 결정된다. 일 실시 형태에서, 유체는 관심 재조합 단백질을 포함한다. 일 실시 형태에서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이다. 일 실시 형태에서, 유체는 수확 단계, 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함하는 단위 조작으로부터의 유출 스트림, 용출액, 풀(pool), 저장물 또는 보유물 유래의 유체이다. 관련된 실시 형태에서, 유체는 심층 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 수집된 용출액이다. 하나의 관련 실시 형태에서, 유체는 수확된 세포 배양액, 심층 여과로부터의 용출액, 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액, 다중모드 크로마토그래피로부터의 용출액, 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용출액 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터의 용출액을 함유하는 풀이다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L 크로마토그래피이다. 일 실시 형태에서, 세제 농도는 그의 CMC의 5배이고 시간은 적어도 10분이다.

본 발명은 관심 재조합 단백질의 정제 동안 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 적어도 하나의 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 관심 재조합 단백질을 포함하는 유체를 얻는 단계; 상기 유체에 적어도 하나의 세제(여기서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 가짐)를, 유체 중 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 농도로 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계; 및 바이러스 불활성화 유체에 적어도 하나의 단위 조작(이는 적어도 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함함)을 적용하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 30초 내지 적어도 60분 또는 그 이상 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 10분 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 30분 동안 세제에 노출된다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 60분 이상 동안 세제에 노출된다. 또 다른 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 임계 미셀 농도(CMC)의 적어도 2.5배 내지 적어도 10배 또는 그 이상이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 5배이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 7.5배이다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 10배이다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃ 내지 22℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 15℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 20℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 불활성화는 TCID₅₀ 분석법을 사용하여 결정된다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 관심 재조합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 수확 단계, 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함하는 단위 조작으로부터의 유출 스트림, 용출액, 풀, 저장물 또는 보유물 유래의 유체이다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 심층 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 수집된 용출액이다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 수확된 세포 배양액, 심층 여과로부터의 용출액, 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액, 다중모드 크로마토그래피로부터의 용출액, 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용출액 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터의 용출액을 함유하는 풀이다. 관련 실시 형태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L 크로마토그래피이다. 또 다른 실시 형태에서, 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 또는 다중모드 크로마토그래피, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이고 단위 조작은 심층 여과를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이고 단위 조작은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 유체는 단백질 A 용출액이고 단위 조작은 심층 여과를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서 단위 조작은 심층 여과를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단위 조작은 정밀여과를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세제 농도는 그의 CMC의 5배이고 시간은 적어도 10분이다.

본 발명은 또한, 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 적어도 2개의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 유체를 프로세싱하는 단계(여기서, 적어도 하나의 단위 조작 동안 관심 재조합 단백질을 함유하는 유체를 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제와 조합하는 단계가 있음); 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 얻는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 30초 내지 적어도 60분 또는 그 이상 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 10분 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 30분 동안 세제에 노출된다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 60분 이상 동안 세제에 노출된다. 또 다른 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 임계 미셀 농도(CMC)의 적어도 2.5배 내지 적어도 10배 또는 그 이상이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 5배이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 7.5배이다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 10배이다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃ 내지 22℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 15℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 20℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 불활성화는 TCID₅₀ 분석법을 사용하여 결정된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 바이러스 여과, 심층 여과 및 UF/DF로부터 선택되는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작은 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 일 실시 형태에서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 심층 여과를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 일 실시 형태에서, 상기 기술된 방법에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질이 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 기술된 방법에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 세제 농도는 그의 CMC의 5배이고 시간은 적어도 10분이다.

본 발명은 또한, 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 수확된 유체에 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제를, 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도로 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계; 적어도 2개의 추가 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 바이러스 불활성화된 유체를 프로세싱하는 단계; 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 얻는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유체는 적어도 30초 내지 적어도 60분 또는 그 이상 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 10분 동안 세제에 노출된다. 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 30분 동안 세제에 노출된다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 유체는 적어도 60분 이상 동안 세제에 노출된다. 또 다른 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 임계 미셀 농도(CMC)의 적어도 2.5배 내지 적어도 10배 또는 그 이상이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 5배이다. 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 7.5배이다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제의 농도는 그의 CMC의 적어도 10배이다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃ 내지 22℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃의 온도에서 발생한다. 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 15℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 20℃의 온도에서 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 불활성화는 TCID₅₀ 분석법을 사용하여 결정된다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 단위 조작은 바이러스 여과, 심층 여과 및 UF/DF로부터 선택되는 단계를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 또 다른 실시 형태에서, 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작은 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 일 실시 형태에서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 심층 여과를 포함하는 단위 조작 전에 발생한다. 일 실시 형태에서, 상기 기술된 방법에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질이 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 기술된 방법에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 세제 농도는 그의 CMC의 5배이고 시간은 적어도 10분이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 방법에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

도 1: 바이러스 불활성화 특성을 갖는 것으로 확인된 구조적으로 상이한 세제 부류.
도 2: 다음에 대한 질량 분석 용출 피크: A: ProA 정제 후 mAb 용출. B: 검출기로부터의 세제의 제거의 검증을 위한 세제 주입 후 블랭크 런(run). C: 물에 스파이크된(spiked) C12E9 세제(0.03%).
도 3: 실온(25℃) 및 5℃에서의 세제와 HCCF의 혼합물에 대한 탁도 데이터. 트리톤 X, 삼각형; 아나포(Anapoe) C12E8(APO128), 다이아몬드; 아나포 C12E8(APO129), 정사각형; 무세제 대조군, 원.
도 4: 친화성 크로마토그래피 전후의 세제 스파이크 샘플에 대한 %HMW 및 %LMW. 트리톤 X, 삼각형; 아나포 C12E8(APO128), 다이아몬드; 아나포 C12E8(APO129), 정사각형; 무세제 대조군, 원; TDA-9 파선 및 스타(star); 두 번째 무세제 대조군, 파선, 백색 원.
도 5: 친화성 크로마토그래피 전후의 세제 스파이크 BiTE^® #1 샘플에 대한 %HMW 및 %LMW.
도 6: 2~8℃에서의 7일 인큐베이션 후 세제 스파이크 HCCF 샘플에서의 %HMW 및 %LMW. 트리톤 X, 삼각형; 아나포 C12E8(APO128), 다이아몬드; 아나포 C12E8(APO129), 정사각형; 무세제 대조군, 원; 무세제 대조군, 원; TDA-9 파선 및 스타; 두 번째 무세제 대조군, 파선, 백색 원.

세포 배양 공정을 사용하여 생물학적 치료약을 제조하는 것은 바이러스 오염물질을 전염시킬 내재된 위험을 수반한다. 이러한 오염물질은 GMP 공정 실패로 인한 제조 시스템의 오염을 통하여 그리고 제조 중 동물 기원 시약의 사용, 출발 물질을 포함한 많은 출처에서 발생할 수 있다. 따라서 규제 당국은 바이오제조 공정이 전용 바이러스 불활성화 단계 및 바이러스 제거 단계를 갖고 제조업체가 모든 생물학적 제품으로부터의 바이러스의 제거 및 불활성화를 검증하도록 요청할 것을 권장한다.

하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체에서 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체를 얻는 단계; 유체를 표 1의 세제에 노출시키는 단계(바이러스 불활성화를 야기하기에 충분한 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안)를 포함한다.

관심 재조합 단백질의 정제 동안 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 적어도 하나의 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 관심 재조합 단백질을 포함하는 유체를 얻는 단계; 상기 유체에 적어도 하나의 세제(여기서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 가짐)를, 유체 중 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 농도로 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계; 및 바이러스 불활성화 유체에 적어도 하나의 단위 조작(이는 적어도 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함함)을 적용하는 단계를 포함한다.

바이러스는 외피 보유 바이러스 및 외피 비보유 바이러스로 분류된다. 외피 보유 바이러스는 지단백질 막 또는 "외피"로 둘러싸인 캡시드를 갖는다. 이 외피는 숙주 세포 단백질 및 인지질과, 바이러스가 그의 숙주 세포에서 버딩(budding)될 때 바이러스를 코팅하는 바이러스 당단백질로 이루어진다. 이 외피는 바이러스가 표적 숙주 세포를 식별하고, 이와 결합하고, 이것에 진입하고, 이를 감염시킬 수 있도록 한다. 그러나 이 막 때문에 외피 보유 바이러스는 불활성화 방법에 취약한 반면, 외피 비보유 바이러스는 제조되는 단백질에 대한 위험 없이 불활성화가 더 어렵지만 여과 방법으로 제거될 수 있다.

외피 보유 바이러스는 헤르페스바이러스과 바이러스, 폭스바이러스과 바이러스, 헤파드나바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 코로나바이러스과 바이러스, 오르토믹소바이러스과 바이러스, 델타바이러스 바이러스, 파라믹소바이러스과 바이러스, 랍도바이러스과 바이러스, 분야바이러스과 바이러스, 필로바이러스과 바이러스, 레트로바이러스과 바이러스와 같은 바이러스 패밀리; 인간 면역 결핍 바이러스, 신드비스 바이러스, 단순 포진 바이러스, 가성광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 코로나 바이러스, 말 관절염 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스, 및 백시니아 바이러스와 같은 바이러스를 포함한다.

환자의 안전을 보장하기 위해, 바이러스 불활성화는 단백질 치료제를 제조할 때 정제 공정의 필수 구성 요소이다. 다양한 방법이 바이러스 불활성화를 위해 사용될 수 있으며, 이는 열 불활성화/저온살균, pH 불활성화, UV 및 감마선 조사, 고강도 광범위 스펙트럼 백색광 사용, 화학적 불활성화제 첨가, 계면활성제 및 용매/세제 처리를 포함한다. 세제와 같은 계면활성제는 막을 가용화하므로 외피 보유 바이러스를 특이적으로 불활성화하는 데 매우 효과적일 수 있다.

세제는 세제 미셀로 단백질 층을 파괴하여 외피 보유 바이러스의 외막을 가용화한다(문헌[Kragh-Hansen et al., Biophysical Journal 1998, 75 (6), 2932-2946]). 이종향성 쥣과 백혈병 바이러스(xenotropic murine leukemia virus; xMuLV) 및 가성광견병 헤르페스 바이러스(pseudorabies herpes virus; PRV)를 비롯한 외피 보유 바이러스의 외층은 임계 미셀 농도(CMC) 초과의 특정 세제에 의해 파괴될 수 있는 지질 막으로 구성된다. CMC를 넘으면 세제는 미셀을 형성하며, 이는 막 지질을 가용화하여 외피 층을 파괴한다(문헌[Edwards and Almgren, Journal of Colloid and Interface Science 1991, 147 (1), 1-21]).

세제는 그의 전하에 의해 다음의 3가지 군으로 분류될 수 있다: 이온성, 비이온성 및 쯔비터이온성. 비이온성 세제 및 쯔비터이온성 세제 둘 다는 순하고, 일반적으로, 제조되는 치료 단백질을 변성시키지 않는 반면, 더 가혹한 이온성 세제는 치료 단백질을 분해할 수 있다. 역사적으로, 일반적으로 사용되는 트리톤 X-100과 같은 비이온성 세제는 관심 치료 단백질에 영향을 미치지 않기 때문에 바이러스를 불활성화하는 데 사용되었다. 그러나 트리톤 X-100과 같은 특정 세제의 사용에 대한 생태학적 우려는 바이오제조 공정에서 외피 보유 바이러스를 불활성화하는 데 사용될 수 있는 더 "친환경적인" 세제를 확인하기 위한 탐색을 주도하였다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "바이러스 불활성화", "바이러스의 불활성화", "바이러스를 불활성화하다" 또는 이와 유사한 문구는 외피 보유 바이러스가 더 이상 세포를 감염시킬 수 없고/없거나, 복제할 수 없고/없거나 증식할 수 없도록 변형되는 과정을 지칭한다. 세제와 같은 계면활성제는 하나 이상의 바이러스를 포함하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체에서 외피 보유 바이러스를 불활성화하는 데 매우 효과적이다. 유체는 유출 스트림, 용출액, 풀, 보유 용기 또는 저장 용기로부터 얻어질 수 있다. 일 실시 형태에서, 유체는 풀로부터 얻어진다. 일 실시 형태에서 풀은 정밀여과를 포함하는 수확 단위 조작으로부터 얻어진다. 일 실시 형태에서, 유체는 유출 스트림으로부터 얻어진다.

세제는 0.01% 내지 10%의 농도(w/v)로 또는 세제 임계 미셀 농도(CMC) 값의 0.01배 내지 10배로 유체에 첨가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 세제 농도는 세제 CMC 값의 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 7.5배 또는 적어도 10배이다.

유체는 적어도 2℃ 내지 22℃ 또는 그 이상의 온도에서 세제에 노출될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 유체는 적어도 2℃ 이상, 적어도 5℃ 이상, 적어도 7℃ 이상, 적어도 10℃ 이상, 적어도 15℃ 이상, 적어도 20℃ 이상, 또는 적어도 22℃ 이상의 온도에서 세제에 노출된다. 특정 실시 형태에서 상기 온도는 2℃ 내지 22℃, 2℃ 내지 20℃, 2℃ 내지 15℃, 2℃ 내지 10℃, 2℃ 내지 7℃, 또는 2℃ 내지 5℃이다. 또 다른 실시 형태에서 상기 온도는 5℃ 내지 22℃, 5℃ 내지 20℃, 5℃ 내지 15℃, 5℃ 내지 10℃, 또는 5℃ 내지 7℃이다. 또 다른 실시 형태에서 상기 온도는 7℃ 내지 22℃, 7℃ 내지 20℃, 7℃ 내지 15℃, 또는 7℃ 내지 10℃이다. 또 다른 실시 형태에서 상기 온도는 10℃ 내지 22℃, 10℃ 내지 20℃, 또는 10℃ 내지 15℃이다. 또 다른 실시 형태에서 상기 온도는 10℃ 내지 22℃, 10℃ 내지 20℃, 또는 10℃ 내지 15℃이다. 또 다른 실시 형태에서 상기 온도는 15℃ 내지 22℃, 또는 15℃ 내지 20℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 온도는 20℃ 내지 22℃이다. 특정 실시 형태에서, 상기 온도는 2℃, 5℃, 7℃, 10℃, 15℃, 20℃, 또는 22℃이다. 유체는 30초 내지 48시간 또는 그 이상 동안 세제에 노출될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 유체는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 90분 동안 세제에 노출된다. 특정 실시 형태에서, 유체는 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 42, 또는 48시간 동안 세제에 노출된다. 특정 실시 형태에서, 유체는 적어도 30초, 적어도 10분, 적어도 30분, 적어도 60분, 또는 적어도 90분 동안 세제에 노출된다. 특정 실시 형태에서, 상기 농도는 그의 CMC의 2.5배이고 상기 시간은 적어도 10분이다. 특정 실시 형태에서, 상기 농도는 그의 CMC의 2.5배이고 상기 시간은 적어도 30분이다. 특정 실시 형태에서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 적어도 10분이다. 특정 실시 형태에서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 적어도 30분이다.

본원에 개시된 방법을 사용한 임의의 정도의 바이러스 불활성화가 바람직하다. 그러나 관련 규제 기관에서 확립한 바이오 의약품에 대한 임의의 안전 지침 또는 규정을 충족시키는 데 필요한 바이러스 불활성화 정도를 달성하는 것이 바람직하다.

바이러스를 불활성화시키기 위한 본원에 기술된 세제와 같은 제제의 정도 또는 효과를 결정하기 위한 하나의 방법으로는 세포병원성 효과(CPE)에 대한 영향을 모니터링하는 것이 있다. 세포변성 효과는 바이러스 감염으로 인한 숙주 세포의 구조적 변화, 예컨대 숙주 세포 용해, 또는 숙주 세포 분열에 영향을 미치는 바이러스 변경으로 인한 용해 없는 세포 사멸을 포함한다. 상기 제제에 노출된 후 숙주 세포에서 이러한 영향이 탐지될 수 없다면 바이러스는 불활성화된 것으로 간주된다. 이것은, 배양 중인 세포가 생존가능한 채로 남아 있는 동안 적절한 기간, 예를 들어 5 내지 20일에 걸쳐 세포 배양물에서 세포변성 효과를 야기할 수 있는 바이러스의 감염 역가를 결정하는 데 사용되는 TCID₅₀ 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 활성 바이러스가 존재하는 경우, 세포에 대한 세포병원성 효과는 현미경을 사용하여 관찰될 수 있다. 감염된 세포는 변형된 것처럼 보이며 비감염 세포와 다르다. 결과는 각각의 샘플에서 바이러스 역가를 제공하는 스피어만(Spearman)-카버(Karber) 방정식으로 분석되며, 이는 그 후 바이러스의 총 로그 감소를 계산하는 데 사용될 수 있다. 사용 중인 검출 방법의 한계, 전형적으로 약 4log10에서 이것이 검출되지 않으면 불활성화가 완료된 것으로 간주된다.

본원에 기술된 바와 같이, 광범위한 구조적 가변성, 소수성 및 전하를 갖는 세제가 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 효과에 대해 평가되었다. 강력한 바이러스 불활성화 능력을 갖는 세제가 확인되었다. 이것은 비이온성 세제, 예컨대 아나포-C12E9; 아나포-C12E8; 알포닉 TDA-6 에톡실레이트(TDA-6); 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(TDA-9); N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드; n-옥틸-β-D-티오말토피라노시드; 수크로스 모노라우레이트; n-데카노일수크로스; n-옥틸-β-D-티오글루코시드; 사이말(CYMAL)^®-3; n-트리데실-β-D-말토시드; 사이말^®-6; 헥사에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르; C-HEGA^®-10; n-운데실-b-D-말토시드; n-노닐-b-D-티오말토시드; HEGA^®-9; 아나포-X-405; 사이말^®-5; C-HEGA^®-11; 테싯(Thesit); n-노닐-b-D-말토시드; MEGA-8; n-노닐-b-D-글루코시드; HECAMEG^®; HEGA^®-10; n-옥틸-b-D-글루코시드; HEGA^®-8; MEGA-10; n-도데실-b-D-말토시드; C8E5; MEGA-9; n-헥실-b-D-글루코피라노시드; 사이말^®-7; 사이말^®-4; 2,6-디메틸-4-헵틸-b-D-말토-피라노시드; n-데실-b-D-말토시드; 및 C8E4를 포함한다. 쯔비터이온 세제는 NDSB-195; FOS-MEA^®-10; NDSB-201; CHAPS; NDSB-211; CHAPSO; NDSB-221; 포스-콜린(Fos-Choline)^®-10; NDSB-256; 쯔비터겐트(ZWITTERGENT)^® 3-08; 트리파오(Tripao) 및 DDMAB를 포함한다. 합성 지질 세제는 라이소포스(LysoFos)^TM 콜린 12, 라이소포스^TM 콜린 14, 알포닉 TDA-6 에톡실레이트(노벨(Novel)-TDA6, IsoC13E6), 및 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(노벨-TDA9, Iso-C13E9)를 포함한다.

여러 외피 보유 바이러스에 대한 바이러스 불활성화에 대해 양성인 세제 중에는 화학 물질 안전에 관한 유럽 연합 지침 67/548/EC에 따라 현재 위험하지 않은 것으로 간주되는 다음의 일부 세제가 있다; 아나포-C12E9 CAS 번호: 3055-99-0; 아나포-C12E8 CAS 번호: 3055-98-9; 알포닉 TDA-6 에톡실레이트(TDA-6) CAS 번호 9043-30-5; 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(TDA-9), CAS 번호 　9043-30-5; N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드 CAS 번호: 85618-20-8; 사이말^®-3 CAS 번호: 181135-58-0; 사이말^®-4 CAS 번호: 181135-57-9; 사이말^®-5 CAS 번호: 250692-65-0; 사이말^®-6 CAS 번호: 228579-27-9; 사이말^®-7 CAS 번호: 349477-49-2; 포스 콜린^®-10 CAS 번호: 70504-28-8; n-헥실-b-D-글루코피라노시드 CAS 번호: 59080-45-4; n-노닐-b-D-글루코시드 CAS 번호: 69984-73-2; n-옥틸-β-D-티오말토피라노시드 CAS 번호: 148616-91-5; n-노닐-b-D-티오말토시드 CAS 번호: 148565-55-3; n-도데실-b-D-말토시드 CAS 번호: 69227-93-6; n-데실-b-D-말토시드 CAS 번호: 82494-09-5; n-운데실-b-D-말토시드 CAS 번호: 253678-67-0; n-노닐-b-D-티오말토시드 CAS 번호: 106402-05-5; n-트리데실-β-D-말토시드 CAS 번호: 93911-12-7; 및 n-옥틸-b-D-글루코시드 CAS 번호: 29836-26-8.

이러한 "친환경" 세제의 4가지 군은 유사한 분자 구조를 기반으로 하여 선택되었으며, "사이말", "포스-콜린", "아나포", 및 "티오글루코시드"로 라벨링되었다(도 1). 이들 군 각각으로부터의 세제는 온도, 시간, 농도, 제품 양식, 및 바이러스 유형과, 세제의 독성 및 강력한 제거성을 포함한 파라미터를 기반으로 하여 바이러스 불활성화에 대해 추가로 분석되었다.

세제 바이러스 불활성화 데이터의 큰 세트를 기반으로 하여, 알킬 및 에톡실레이트 사슬 길이를 포함하여 불활성화에 영향을 미치는 경향이 확인되었다. 놀랍게도, 알킬 사슬 길이가 바이러스 불활성화 활성에 영향을 주었다. 1개 또는 2개의 탄소의 알킬 사슬을 갖는 사이말^®은 바이러스 불활성화에 영향을 미치지 않은 반면 3 내지 7개의 탄소의 알킬 사슬을 갖는 사이말^®은 바이러스를 불활성화시켰다. 유사한 관찰이 포스-콜린^®에 대해 이루어졌다. 8개 또는 9개 탄소 링커 사슬을 갖는 포스-콜린^®은 바이러스 불활성화에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 반면, 10개 탄소 링커를 갖는 포스-콜린^®은 바이러스를 불활성화시켰다. 아나포 세제는 알킬 사슬과 에톡실레이트 사슬로 구성되며, 여기서, 알킬 탄소(C)와 에톡실레이트 기(E)의 수는 명칭 내에 표시되고, 예를 들어, 아나포 C12E9는 12개의 알킬 탄소 및 9개의 에톡실레이트 기를 갖는다. 아나포 C12E9와 아나포 C12E8, 알포닉 TDA-6 에톡실레이트(TDA-6)와 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(TDA-9)는 바이러스를 강력하게 불활성화시키는 것으로 밝혀졌으며, 아나포 C10E9, 아나포 C10E6, 아나포 C12E10 및 C13E8은 그렇지 않았다.

아나포 C12E8, 아나포 C12E9, 알포닉 TDA-6 에톡실레이트(TDA-6) 및 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(TDA-9) 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드는 다음과 같은 몇 가지 중요한 치료 양식의 존재 하에서 바이러스 불활성화에 특히 강력했다: 단클론 항체, 이중특이성 T-세포 인게이저(engager)(BiTE^®) 및 융합 단백질. 이러한 세제는 5℃ 내지 15℃의 낮은 온도에서 30초와 30분 사이에 완전한 바이러스 불활성화를 나타냈다.

세제 바이러스 불활성화는 바이오제조 하류 공정의 하나 이상의 단계에서 발생할 수 있다. 세제 바이러스 불활성화는 수확물 청징 후, 친화성 크로마토그래피 단계 전에; 친화성 크로마토그래피 단계 후, 심층 여과 및/또는 폴리싱 크로마토그래피 단계 전에; 폴리싱 크로마토그래피 단계들 사이에; 바이러스 여과 단계 및/또는 UF/DF 단계 전에 발생할 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 명세서 전체에서 상호교환가능하게 사용되며, 단일 가닥 핵산 및 이중 가닥 핵산을 모두 포함하고, 게놈 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 또는 자연에서 일반적으로 발견되는 서열과 관련되지 않은 이들의 일부 조합 또는 합성 기원을 포함한다. 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 핵산 분자"는 구체적으로 합성 기원 서열 또는 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 서열을 지칭한다. 명시된 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자는 관심 단백질을 발현하는 서열 외에, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개의 다른 단백질에 대한 코딩 서열 또는 이들의 일부를 포함할 수 있거나, 언급된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자에 포함되는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 변형은 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다.

본원에서 사용되는 "단리된"이란 용어는 (i) 일반적으로는 함께 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 없거나, (ii) 동일한 공급원, 예컨대 동일한 종의 다른 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 본질적으로 없거나, (iii) 자연에서 관련이 있는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되거나, (iv) 자연에서 관련이 없는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동 가능하게 관련되거나, (v) 자연에서 발생되지 않음을 의미한다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 명세서 전체에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 천연 서열, 즉 자연 발생적 비재조합 세포에 의해 생산된 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 갖는 거대분자를 포함하거나; 유전자 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생적 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 폴리펩티드 및 단백질은 또한, 글리코실화, 지질 부착, 술페이트화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화, 및 ADP-리보실화를 포함하지만 이에 한정되지 않는 변형을 포함한다. 용어 "단리된 단백질", "단리된 재조합 단백질", 또는 "정제된 재조합 단백질"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며 치료, 진단, 예방, 연구, 또는 기타 사용을 방해하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 오염물질로부터 분리 정제된 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 특히, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명을 사용하여 프로세싱된 관심 재조합 단백질로부터 제조된 원료 의약품 및 완제 의약품은 "재조합 단백질 완제 의약품", "생물학적 재조합 치료제"로 지칭될 수 있다.

단백질 치료제를 포함하여 폴리펩티드 및 단백질은 과학적 또는 상업적 관심 대상일 수 있다. 관심 단백질은 특히 분비 단백질, 비분비 단백질, 세포내 단백질, 또는 막결합 단백질을 포함한다.　 관심 단백질은 본원에 기술된 방법을 사용하여 세포주에 의해 생산될 수 있고 "재조합 단백질", "관심 재조합 단백질" 또는 "재조합 단백질 치료제"로 상호교환가능하게 지칭될 수 있다. 발현 단백질(들)은 세포 내에서 생산되거나, 배양 배지 내로 분비되고 이로부터 회수 및/또는 수집될 수 있다. 관심 단백질은 예를 들어 표적, 특히 하기 열거된 것(이들로부터 유래된 표적, 이들과 관련된 표적, 및 이들의 변형을 포함함) 중의 표적에 결합하여 치료 효과를 발휘하는 단백질을 포함할 수 있다.

관심 단백질은 "항원-결합 단백질"을 포함할 수 있다. 항원-결합 단백질은, 이것이 결합하는 또 다른 분자(항원)에 대해 강한 친화성을 갖는 항원-결합 영역 또는 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 항원-결합 단백질은 항체, 펩티바디, 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체, 융합 단백질(단쇄 가변 단편(scFv) 및 이중-사슬(2가) scFv를 포함함), 뮤테인, xMAb, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE^®), 및 키메라 항원 수용체(CAR 또는 CAR-T) 및 T 세포 수용체(TCR)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

scFv는 함께 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 단쇄 항체 단편이다. 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호와, 문헌[Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136]을 참조한다. scFv는 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 모 항체의 능력을 보유한다.

용어 "항체"는 임의의 이소타입 또는 하위클래스의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 언급, 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합 영역에 대한 언급을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체는 인간, 인간화, 키메라, 다중특이성, 단클론, 다클론, 헤테로IgG, 이중특이성 항체, 및 이들의 올리고머 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 항체는 lgG1-, lgG2-, lgG3-, 또는 lgG4-타입을 포함한다. 또한, 표적 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단쇄 항체 분자, 단일 도메인 V_HH, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 폴리펩티드와 같은 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는 단백질이 포함된다.

또한, 인간에게 투여되었을 때 크게 해로운 면역 반응을 일으키지 않는 인간, 인간화, 및 기타 항원 결합 단백질, 예컨대 인간 항체 및 인간화 항체가 포함된다.

또한, 비공유 결합, 공유 결합, 또는 공유 및 비공유 결합에 의해 화학적으로 변형된 단백질과 같은 변형된 단백질이 포함된다. 또한, 세포 변형 시스템에 의해 이루어질 수 있는 하나 이상의 번역후 변형 또는 효소적 및/또는 화학적 방법에 의해 생체외 도입되거나 다른 방식으로 도입된 변형을 추가로 포함하는 단백질이 포함된다.

관심 단백질은 또한, 예를 들어 류신 지퍼, 코일드 코일(coiled coil), 면역글로불린의 Fc 부분 등과 같은 다량체화 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 분화 항원(CD 단백질이라고 함) 또는 이의 리간드 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 유사한 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질이 포함된다.　

일부 실시 형태에서, 관심 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자를 포함할 수 있다. 이러한 G-CSF 제제는 뉴포겐(Neupogen)^®(필그라스팀) 및 뉴라스타(Neulasta)^®(페그필그라스팀)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 적혈구생성 자극제(ESA), 예컨대 에포겐(Epogen)^®(에포에틴 알파), 아라네스프(Aranesp)^®(다르베포에틴 알파), 다이네포(Dynepo)^®(에포에틴 델타), 미르세라(Mircera)^®(메티옥시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타), 헤마티드(Hematide)^®, MRK-2578, INS-22, 레타크릿(Retacrit)^®(에포에틴 제타), 네오레코르몬(Neorecormon)^®(에포에틴 베타), 실라포(Silapo)^®(에포에틴 제타), 비노크릿(Binocrit)^®(에포에틴 알파), 에포에틴 알파 헥살, 압세아메드(Abseamed)^®(에포에틴 알파), 라티오에포(Ratioepo)^®(에포에틴 세타), 에포라티오(Eporatio)^®(에포에틴 세타), 바이오포인(Biopoin)^®(에포에틴 세타), 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 에포에틴 제타, 에포에틴 세타, 및 에포에틴 델타, 에포에틴 오메가, 에포에틴 이오타, 조직 플라스미노겐 활성제, GLP-1 수용체 작용제와, 이들의 분자 또는 변이체 또는 유사체, 및 이들 중 임의의 것의 바이오시밀러가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 관심 단백질은 하나 이상의 CD 단백질, HER 수용체 패밀리 단백질, 세포 부착 분자, 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자, 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질, 응고 및 응고 관련 단백질, 콜로니 자극 인자(CSF), 기타 혈액 및 혈청 단백질 혈액형 항원, 수용체, 수용체 관련 단백질, 성장 호르몬, 성장 호르몬 수용체, T-세포 수용체, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 릴렉신, 인터페론, 인터류킨, 바이러스 항원, 지단백질, 인테그린, 류마티스 인자, 면역독소, 표면 막단백질, 수송 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 및 면역어드헤신에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 관심 단백질은 단독의 또는 임의의 조합의 다음 중 하나 이상에 결합한다: CD 단백질(CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD40, CD70, CD123, CD133, CD138, CD171, 및 CD174를 포함하지만 이에 한정되지 않음), HER 수용체 패밀리 단백질(예를 들어 HER2, HER3, HER4 포함), 및 EGF 수용체, EGFRvIII, 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 알파 v/베타 3 인테그린, 성장 인자(예를 들어 혈관 내피 성장 인자("VEGF")를 포함하지만 이에 한정되지 않음); VEGFR2, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 뮬러관-억제 물질, 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파), 에리트로포이에틴(EPO), 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들어 aFGF 및 bFGF 포함), 표피 성장 인자(EGF), 크립토, 전환 성장 인자(TGF)(특히 TGF-α 및 TGF-β(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함)를 포함함), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 및 골유도 인자, 인슐린 및 인슐린 관련 단백질(인슐린, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 프로인슐린, 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않음); 응고 및 응고 관련 단백질, 예를 들어 특히, 인자 VIII, 조직 인자, 폰빌레브란트(von Willebrand) 인자, 단백질 C, 알파-1-항트립신, 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 유로키나아제 및 조직 플라스미노겐 활성제("t-PA"), 봄바진, 트롬빈, 트롬보포이에틴, 및 트롬보포이에틴 수용체, 콜로니 자극 인자(CSF)(특히 하기 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF 포함), 기타 혈액 및 혈청 단백질(알부민, IgE, 및 혈액형 항원을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 수용체 및 수용체 관련 단백질(예를 들어 flk2/flt3 수용체, 비만(OB) 수용체, 성장 호르몬 수용체, 및 T-세포 수용체 포함); (x) 신경영양 인자(골-유래 신경영양 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)을 포함하지만 이에 한정되지 않음); (xi) 릴렉신 A-사슬, 릴렉신 B-사슬, 및 프로릴렉신, 인터페론(예를 들어 인터페론-알파, -베타, 및 -감마 포함), 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23, IL-12/IL-23, IL-2Ra, IL1-R1, IL-6 수용체, IL-4 수용체 및/또는 수용체에 대한 IL-13, IL-13RA2, 또는 IL-17 수용체, IL-1RAP; (xiv) 바이러스 항원(AIDS 외피 바이러스 항원을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 지단백질, 칼시토닌, 글루카곤, 심방나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, 엔케팔리나아제, BCMA, Ig카파, ROR-1, ERBB2, 메소텔린, RANTES(Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted), 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드, Dnase, FR-알파, 인히빈, 및 액티빈, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스 인자, 면역독소, 골형성 단백질(BMP), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 표면 막단백질, 분해 가속 인자(DAF), AIDS 외피, 수송 단백질, 호밍 수용체, MIC(MIC-a, MIC-B), ULBP 1-6, EPCAM, 어드레신, 조절 단백질, 면역어드헤신, 항원 결합 단백질, 소마트로핀, CTGF, CTLA4, 에오탁신-1, MUC1, CEA, c-MET, Claudin-18, GPC-3, EPHA2, FPA, LMP1, MG7, NY-ESO-1, PSCA, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GM2, BAFF, OPGL(RANKL), 마이오스타틴, Dickkopf-1(DKK-1), Ang2, NGF, IGF-1 수용체, 간세포 성장 인자(HGF), TRAIL-R2, c-Kit, B7RP-1, PSMA, NKG2D-1, 세포예정사 단백질 1 및 리간드, PD1 및 PDL1, 만노스 수용체/hCGβ, C형 간염 바이러스, 메소텔린 dsFv-PE38 콘쥬게이트, 레지오넬라-뉴모필라(lly), IFN 감마, 인터페론 감마 유도 단백질 10(IP10), IFNAR, TALL-1, 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP), 프로단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9), 줄기 세포 인자, Flt-3, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), OX40L, α4β7, 혈소판 특이적(혈소판) 당단백질 Iib/IIIb(PAC-1), 전환 성장 인자 베타(TFGβ), 투명대 정자-결합 단백질 3(ZP-3), TWEAK, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRα), 스클레로스틴, 및 이들 중 임의의 것의 생물학적 활성 단편 또는 변이체.

또 다른 실시 형태에서, 관심 단백질은 압식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 애플리버셉트, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아나킨라, 아타시셉트, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 비오소주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 칸투주맙 메르탄신, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 코나투무맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에타너셉트, 에볼로쿠맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 젬투주맙, 골리무맙, 이브리투모맙 튜세탄, 인플릭시맙, 이필리무맙, 익세키주맙, 레르델리무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 모테사닙 디포스페이트, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네시리티드, 니모투주맙, 니볼루맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오프렐베킨, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 라니비주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로미플로스팀, 로모소주맙, 사그라모스팀, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 자놀리무맙, 잘루투무맙, 및 이들 중 임의의 것의 바이오시밀러를 포함한다.

본 발명에 따른 관심 단백질은 전술한 모든 것을 포함하며, 전술한 항체 중 임의의 것의 상보성 결정 영역(CDR) 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하는 항체를 추가로 포함한다. 또한, 아미노산 서열이 관심 단백질의 기준 아미노산 서열과 70% 이상, 특별히 80% 이상, 더 특별히 90% 이상, 훨씬 더 특별히 95% 이상, 구체적으로는 97% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 훨씬 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 영역을 포함하는 변이체가 포함된다. 이와 관련하여 동일성은 쉽게 입수가능하고 잘 알려진 다양한 아미노산 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 선호되는 소프트웨어는 서열 검색 및 정렬 문제에 대한 만족스러운 해결책으로 간주되는 스미스(Smith)-워터맨(Waterman) 알고리즘을 구현하는 소프트웨어를 포함한다. 특히 속도가 중요한 고려 사항인 경우 다른 알고리즘도 사용될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 DNA, RNA, 및 폴리펩티드의 정렬 및 상동성 매칭을 위해 일반적으로 사용되는 프로그램은 FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN, PROSRCH, BLAZE, 및 MPSRCH를 포함하며, 후자는 MasPar에서 만든 대규모 병렬 프로세서에서 실행하기 위한 스미스-워터맨 알고리즘의 구현이다.

전술한 바와 같은 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 발현 시스템 및 구축물이 또한 본원에 제공되며, 이러한 발현 시스템 또는 구축물을 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 내의 특정 위치 및/또는 구획으로 전달 및/또는 수송하는 데 사용하기에 적합한 임의의 분자 또는 엔티티(entity)(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 바이러스 캡시드, 비리온, 네이키드(naked) DNA, 복합 DNA 등)를 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 및 비에피솜 포유류 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 종종 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터 및 클로닝 벡터로 지칭된다. 벡터는 벡터 자체의 복제가 가능하도록 숙주 세포에 도입되어, 벡터 안에 포함된 폴리뉴클레오티드의 카피를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 원점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선발가능 마커를 제한 없이 일반적으로 포함하는 서열 구성요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

"세포" 또는 "세포들"은 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 세포는 별개로 또는 조직 또는 기관과 같은 고차 구조의 일부로서, 생체 외, 시험관 내, 또는 생체 내에 존재할 수 있다. 세포는 상업적 또는 과학적 관심 대상인 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 조작되는 "세포주"라고도 하는 "숙주 세포"를 포함한다. 일반적으로 숙주 세포는 무한한 시간 동안 배양으로 유지될 수 있는 1차 배양물에서 발생하는 계통으로부터 유래된다. 숙주 세포의 유전자 조작은 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 이용한 세포의 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입, 및/또는 달리 숙주 세포가 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하게 하는 (예를 들어, 상동 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포와 비재조합 세포의 융합에 의한) 변경을 포함한다. 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 세포 및/또는 세포주를 유전자 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며; 예를 들어 다양한 기술이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1990, 및 3개월마다 업데이트)]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989)]; 문헌[Kaufman, R. J.,　Large Scale Mammalian Cell Culture,1990, pp. 15-69]에 예시되어 있다.

숙주 세포는 임의의 원핵 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충, 또는 동물 세포(예를 들어, CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다.

일 실시 형태에서, 세포는 숙주 세포이다. 숙주 세포는 적절한 조건 하에 배양되는 경우 관심 단백질을 발현하며, 상기 관심 단백질은 후속적으로 배양 배지로부터(숙주 세포가 이를 배지 내로 분비한다면) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접적으로(이것이 분비되지 않는다면) 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩티드 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화), 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩의 용이성과 같은 다양한 요인에 따라 달라진다.

"배양"은 다세포 유기체 또는 조직 외부에서의 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 알려져 있다. 세포 배양 배지 및 조직 배양 배지는 시험관 내 세포 배양 중에 숙주 세포의 성장에 적합한 배지를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 일반적으로, 세포 배양 배지는 완충제, 염, 에너지원, 아미노산, 비타민, 및 미량 필수 원소를 함유한다. 배양 중 적절한 숙주 세포의 성장을 지원할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다. 특정 배양 숙주 세포에서 세포 성장, 세포 생존력, 및/또는 재조합 단백질 생산을 최대화하기 위해 다른 성분이 추가로 보충될 수 있는 세포 배양 배지는 구매가능하며, 특히 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 또는 SAFC Biosciences, 및 다른 공급업체로부터 입수할 수 있는 RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), 최소 필수 배지 이글(Eagle), F-12K 배지, 햄(Ham) F12 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), 맥코이(McCoy) 5A 배지, 레이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 및 무혈청 배지, 예컨대 EX-CELL™ 300 시리즈를 포함한다. 세포 배양 배지는 무혈청, 무단백질, 무성장인자, 및/또는 무펩톤 배지일 수 있다. 세포 배양물은 또한 영양소의 첨가에 의해 풍부화될 수 있고, 보통의 권장 농도보다 높은 농도로 사용될 수 있다.

예를 들어, 한 단계(예: 성장 단계 또는 성장기)에서 다른 단계(예: 생산 단계 또는 생산기)로의 전환을 용이하게 하고/하거나 세포 배양 중 조건(예: 관류 배양 중에 제공되는 농축된 배지)을 최적화하기 위해 배양물의 수명 동안 다양한 배지 제형이 사용될 수 있다. 세포 성장을 촉진하고 단백질 발현을 최소화하기 위해 성장 배지 제형이 사용될 수 있다. 관심 단백질의 생산 및 세포의 유지(이때 새로운 세포 성장은 최소임)를 촉진하기 위해 생산 배지 제형이 사용될 수 있다. 활성 배양물, 특히 유가식, 반관류식, 또는 관류식으로 조작되는 배양물을 보충하고 유지하기 위해 피드(feed) 배지, 전형적으로 보다 농축된 성분, 예컨대 영양소 및 아미노산(이는 세포 배양물의 생산기 과정 중에 소비됨)을 함유하는 배지가 사용될 수 있다. 이러한 농축된 피드 배지는 세포 배양 배지의 대부분의 성분을, 예를 들어 정상량의 약 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 400배, 600배, 800배, 또는 심지어 약 1000배로 함유할 수 있다.

성장기는 생산기보다 더 높은 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 성장기는 약 35℃ 내지 약 38℃의 제1 온도에서 발생할 수 있고, 생산기는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도에서 발생할 수 있다. 또한, 단백질 생산의 화학적 유도제, 예컨대 카페인, 부티레이트, 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)가 온도 변화와 동시에, 온도 변화 전에, 및/또는 온도 변화 후에 첨가될 수 있다. 유도제가 온도 변화 후에 첨가되는 경우, 유도제는 온도 변화 1시간 내지 5일 후, 선택적으로 온도 변화 1일 내지 2일 후에 첨가될 수 있다.

숙주 세포는 현탁 배양되거나, 고체 기재에 부착된 부착 형태로 배양될 수 있다. 세포 배양물은 마이크로캐리어를 이용하거나 이용하지 않고서 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러병, 진탕 플라스크, 또는 교반 탱크 생물반응기에서 확립될 수 있다.

세포 배양은 회분식, 유가식, 연속식, 반연속식, 또는 관류식으로 조작될 수 있다. CHO 세포와 같은 포유류 세포는 생물반응기에서 100 ml~1000 ml 미만보다 더 적은 소규모로 배양될 수 있다. 대안적으로, 1000 ml에서 20,000 리터가 넘는 배지를 포함하는 대규모 생물반응기가 사용될 수 있다. 단백질 치료제의 임상적 및/또는 상업적 규모의 바이오제조와 같은 대규모의 세포 배양은 세포가 목적 단백질(들)을 생산하는 동안 수 주 및 심지어 수 개월 동안 유지될 수 있다.

단리되고 정제된 관심 재조합 단백질의 제조 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 수확된 유체에 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제를, 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도로 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계; 적어도 2개의 추가 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 바이러스 불활성화된 유체를 프로세싱하는 단계; 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 얻는 단계를 포함한다.

단리되고 정제된 관심 재조합 단백질의 제조 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계; 관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계; 적어도 2개의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 수확된 유체를 프로세싱하는 단계(여기서, 적어도 하나의 단위 조작 동안 관심 재조합 단백질을 함유하는 유체를 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제와 조합함); 및 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 얻는 단계를 포함한다.

그 후, 발현된 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액이 생물반응기 내의 세포 배양물로부터 수확될 수 있다. 현탁 세포로부터 발현된 단백질을 수확하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 산 침전, 응집과 같은 가속 침강, 중력을 이용한 분리, 원심분리, 음파 분리, 여과(한외여과기, 마이크로필터, 접선 유동 필터, 심층 필터, 및 충적 여과 필터를 이용한 막여과 포함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 원핵 세포에 의해 발현된 재조합 단백질은 당업계에 알려진 산화환원 폴딩 공정에 의해 세포질 내 봉입체로부터 회수될 수 있다.

그 후, 청징된 수확 세포 배양액 중 관심 재조합 단백질은 하나 이상의 단위 조작을 이용하여 임의의 불순물, 예컨대 잔존 세포 배양 배지, 세포 추출물, 원치 않는 성분, 숙주 세포 단백질, 부적절하게 발현된 단백질, 오염물질, 미생물, 예컨대 박테리아 및 바이러스, 응집물 등으로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. "단위 조작"이라는 용어는 재조합 단백질, 예컨대 액체 배양 배지로부터의 재조합 단백질을 정제하는 공정에서 수행되는 기능적 단계를 지칭한다. 예를 들어, 조작 단위는 재조합 단백질을 포함하는 유체의 여과(예를 들어, 재조합 단백질을 포함하는 유체로부터의 오염 박테리아, 효모, 바이러스, 마이코박테리아, 불순물 및/또는 미립자 물질의 제거), 포획, 에피토프 태그 제거, 정제, 수집, 보유, 저장, 폴리싱, 수확, 바이러스 불활성화(세제 바이러스 불활성화를 포함), 바이러스 여과, 이온 농도 및/또는 pH의 조정, 및 원치 않는 염의 제거를 포함할 수 있다.　 본원에 기술된 본 발명은 원료의약품의 수확에서 제형화까지의 하류 공정의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다.

예를 들어, 단위 조작은 수확, 포획, 정제, 폴리싱, 바이러스 불활성화, 바이러스 여과, 및/또는 농도 및 제형의 조정(관심 재조합 단백질을 포함)과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 단계를 포함할 수 있다. 또한 단위 조작은 수확, 크로마토그래피 또는 여과 후 포획 풀과 같이 유체를 풀링하고/하거나, 보유하고/하거나 저장하는 단계, 및 수확 후와 같이 유체를 보유 또는 저장 용기 내에 넣는 것을 포함할 수 있다. 단일 단위 조작은 수확 및 바이러스 불활성화 또는 포획 및 바이러스 불활성화와 같이, 동일한 조작에서 여러 목표를 달성하도록 설계될 수 있다.

포획 단위 조작은 관심 재조합 단백질에 결합할 제제를 함유한 수지 및/또는 막을 사용하는 포획 크로마토그래피, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 등을 포함한다. 이러한 물질은 당업계에 알려져 있으며 구매가능하다. 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 기질-결합 포획 메커니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메커니즘, 압타머-결합 포획 메커니즘, 및 보조인자-결합 포획 메커니즘을 포함할 수 있다. 예시적인 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L을 포함한다. 관심 재조합 단백질은 폴리히스티딘 태그로 태그되고 후속적으로 이미다졸 또는 에피토프, 예컨대 FLAG^®를 사용하여 IMAC로부터 정제되고, 후속적으로, 그러한 에피토프에 대한 특이적 항체를 사용하여 정제될 수 있다.

상기 하나 이상의 포획 단위 조작은 바이러스 불활성화 및 바이러스 여과를 포함할 수 있다. 그외에도, 본원에 제공된 본 발명의 바이러스 불활성화 방법에 더하여, 열 불활성화/저온살균, pH 불활성화, UV 및 감마선 조사, 고강도 광범위 스펙트럼 백색광의 사용 및 화학적 불활성화제, 예컨대 B-프로피오락톤의 첨가와 같은 다른 바이러스 불활성화 방법이 또한 사용될 수 있다.

유체에 포함된 것으로 알려져 있거나 의심되는 바이러스의 불활성화는 임의의 시점에 수행될 수 있다. 생물학적 원료의약품 제조 동안 관심 재조합 단백질을 포함하는 유체 중 바이러스의 불활성화는 하나 이상의 독립적인 바이러스 불활성화 단위 조작에서; 수확 단위 조작의 일부로서; 하나 이상의 포획 크로마토그래피 단위 조작 전에, 이의 일부로서, 또는 상기 단위 조작 후에; 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 단위 조작 전에, 이의 일부로서, 또는 상기 단위 조작 후에; 하나 이상의 폴리싱 크로마토그래피 단위 조작 전에, 이의 일부로서, 또는 상기 단위 조작 후에; 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피; 혼합 모드 또는 다중 모드 크로마토그래피, 및/또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단위 조작 전에, 이의 일부로서, 또는 상기 단위 조작 후에; 하나 이상의 바이러스 여과 단위 조작 전에, 이의 일부로서, 또는 상기 단위 조작 후에; 및/또는 하나 이상의 한외여과/정용여과 단위 조작 전에 또는 그 후에 발생할 수 있다. 일 실시 형태에서 바이러스 불활성화는 수확 후에 발생한다. 일 실시 형태에서 바이러스 불활성화는 정밀여과를 포함하는 수확 단위 조작 후에 발생한다. 일 실시 형태에서 바이러스 불활성화는 포획 크로마토그래피 단위 조작 전에 발생한다. 일 실시 형태에서 바이러스 불활성화는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 전에 발생한다. 바이러스 불활성화 후에는 여과(예컨대 심층 여과) 또는 크로마토그래피(예컨대 단백질 A 크로마토그래피)에 의해 불활성화 바이러스, 계면활성제 및 세제와 같은 불활성화제, 탁도 및/또는 침전을 제거할 수 있다.

바이러스 여과는 Asahi Kasei(플라보나(Plavona)^®) 및 EDM Millipore(VPro^®)와 같은 상업적 공급처에서 입수가능한 마이크로필터 및/또는 나노필터를 사용하여 수행될 수 있다.

"폴리싱"이라는 용어는, 원하는 최종 순도에 가까운 재조합 단백질을 포함하는 유체로부터 잔존 오염물질 및 불순물, 예컨대 DNA, 숙주 세포 단백질; 생성물-특이적 불순물, 변이체 생성물 및 응집체 및 바이러스 흡착을 제거하기 위해 수행되는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 폴리싱은 재조합 단백질을 포함하는 유체에 존재하는 오염물질 또는 불순물 또는 표적 재조합 단백질에 선택적으로 결합하는 크로마토그래피 컬럼(들) 또는 막 흡수체(들)에 재조합 단백질을 포함하는 유체를 통과시킴으로써 결합 및 용출 모드로 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 크로마토그래피 컬럼(들) 또는 막 흡수체(들)의 용출액/여과액은 재조합 단백질을 포함한다.

폴리싱 크로마토그래피 단위 조작은 "유통 방식(flow-through mode)"(관심 단백질은 크로마토그래피 매질을 유통하는 용출액에 포함되며 오염물질 및 불순물은 크로마토그래피 매질에 결합됨) 또는 "결합 및 용출 방식"(관심 단백질은 크로마토그래피 매질에 결합되고, 오염물질 및 불순물이 크로마토그래피 매질을 유통한 후 또는 크로마토그래피 매질에서 세척 제거된 후 용출됨)으로 사용될 수 있는 제제를 함유하는 크로마토그래피 수지 및/또는 막을 사용한다. 이러한 크로마토그래피 방법의 예는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)와 같은 이온 교환 크로마토그래피(IEX); 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 혼합모드 또는 다중모드 크로마토그래피(MM), 히드록시아파타이트 크로마토그래피(HA); 역상 크로마토그래피 및 겔 여과를 포함한다.

본 출원에서 사용된 용어는 당업계의 표준이지만, 청구범위의 의미에 대한 명료성과 명확성을 보장하기 위해 특정 용어의 정의가 본원에서 제공된다. 단위, 접두어, 및 기호는 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 본원에서 언급된 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함하며, 한정된 범위 내의 각각의 정수를 포함하고 뒷받침한다. 일반적으로, 본원에 기술된 방법 및 기법은 달리 지시되지 않는 한, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 문헌[Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조한다. 특허, 특허 출원, 소논문, 서적, 및 논문을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본 출원에서 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 명백히 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 소정 실시 형태에 기술된 것은 본 발명의 다른 실시 형태와 조합될 수 있다.

본 발명의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 본원에 기술된 특정 실시 형태에 의해 본 발명의 범주가 제한되지는 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범주에 속한다. 실제로, 본원에 나타내고 설명된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형예가 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형예는 첨부된 청구범위의 범주에 속하는 것이다.

실시예

실시예 1.

바이러스 스톡

xMuLV, PRV 및 MMV의 바이러스 스톡을 문헌[Romanowski et al., Bioprocess Int 2008, 6 (2), 44-52]에 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다. 세포변성 효과(CPE)를 확인하기 위해 바이러스와 양립가능한 지표 세포주를 사용하였다. xMuLV의 경우, 세포주 PG4(고양이 성상세포 세포주)를 사용하였다. 접종 7일 후에 CPE를 결정하였다. 세포주 324K를 사용하여 접종 10일 후 MMV의 CPE를 결정하고, PRV의 경우 Vero 세포주를 3일 분석에 사용하였다.

세제 스크리닝

바이러스 제거 연구에 일반적으로 사용되는 쥣과 레트로바이러스인 xMuLV를 사용하여 96가지 세제의 초기 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝은 미국 캘리포니아주 알리소 비에호 소재의 Hampton Research의 96-딥 웰 플레이트에서 수행하였다. 테스트한 세제는 비이온성, 쯔비터이온성 및 이온성 특성을 포함하는 다양한 양쪽성 특성을 가졌다. 스크리닝에서 평가한 모든 세제는 Hampton Kit에 표시된 바와 같이 CMC(임계 미셀 농도) 값의 10배 또는 10%(w/v)였다. 각각의 세제의 중복 런을 15℃에서 30분의 5% 바이러스 스파이크 후에 평가하였다. 5%(v/v) 물 스파이크가 있는 대조군도 동시에 실행하여 희석물이 세제 불활성화를 중지하는 데 효과적임을 보여주었다. 각각의 반복 런 및 대조 런을 배지로 1:300으로 희석하여 세포독성 및 간섭을 감소시키고, 25% 컨플루언트 PG4 부착 세포와 함께 인큐베이션하였다. 소정 인큐베이션 기간 후, 접종된 PG4 세포에서 임의의 CPE에 대해 웰을 분석하였다.

TCID50 분석은 10⁰~10^-7로부터 8회 반복하여 1:10 연속 희석물을 이용하여 실행하였다. 단백질에 스파이크된 10% xMuLV의 유지 대조 용액은 세제 없이 실행 기간 동안 유지되었고, 이외에도 시드(seed) 배지의 음성 대조군도 유지되었다. 모든 샘플을 25% 컨플루언트 PG4 세포로 적정하고 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 CPE에 대해 제7일에 판독하고, 이전에 기술된 바와 같이(상기 문헌[Romanowski et al.]) 총 바이러스 역가 및 대수 감소 값(LRV)에 대한 스피어만-카버 방정식으로 평가하였다.

확장된 바이러스 연구

xMuLV를 불활성화시킨 세제 중 19개는 현재 화학 물질 안전에 관한 유럽 연합 지침 67/548/EC에 따르면 위험하지 않은 것으로 간주된다. 이 세제들을 2가지 추가 바이러스, 즉 또 다른 외피 보유 바이러스 PRV 및 외피 비보유 바이러스 MMV에 대해 CMC 값의 5배에서 추가 테스트하였다. 두 바이러스 모두 5%(v/v)에서 테스트하였으며, 그렇지 않으면 위에서 설명한 초기 세제 스크리닝에 대해 설명한 것과 동일한 조건 및 분석을 사용하였다.

농도 연구

바이러스를 여전히 불활성화시키는 최저 농도에 대해 아나포 C12E8(CAS 번호 3055-98-9), 아나포 C12E9(CAS 번호 3055-99-90), 사이말®-5 (CAS 번호250692-65-0), 포스-콜린^®-10(CAS 번호 70504-28-8)(미국 오하이오주 모미 소재의 Anatrace에 의해 공급됨), 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드(CAS 번호 85618-20-8)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)를 평가하였다. 임계 미셀 농도의 2.5배, 5배 및 7.5배의 농도를 15℃에서 xMuLV에 대해 평가하였으며, 이때 세제는 바이러스와 함께 30분의 기간 동안 인큐베이션하였고, 이는 위에 설명된 바와 같았다.

온도-의존성 연구

아나포 C12E8, 아나포 C12E9, 사이말^®-5, 포스-콜린^®-10, 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드는 5℃ 내지 22℃의 온도에서 xMuLV에 대해 그리고 3가지 상이한 단백질 양식인 단클론 항체(mAb #1), 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE^® #1), 및 XmAb 융합 단백질(융합 단백질 #1)을 함유하는 매트릭스(숙주 세포 배양액)에서 평가하였다. 30초, 10분, 30분의 시점을 취하고, 이전에 기술된 바와 같이(상기 문헌[Romanowski et al.]), 스피어만-카버 방법을 사용하는 경우 완충제 매트릭스가 독성 및 간섭을 야기하지 않는 희석률인 1:300으로 희석시켰다. 트리톤 X100 대조군(미국 캘리포니아주 테마쿨라 소재의 Millipore Sigma)을 18℃에서 이중으로 실행하였다.

세제의 동역학 연구

아나포 C12E8, 아나포 C12E9, 사이말^®-5, 포스-콜린^®-10, 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드를 30초, 10분, 및 30분의 3개의 시점에서 xMuLV에 대해 그리고 3가지 상이한 단백질 양식인 단클론 항체(mAb #1), 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE^® #1), 및 XmAb 융합 단백질(융합 단백질 #1)을 함유하는 매트릭스(숙주 세포 배양액)에서 평가하였다. 30초, 10분, 30분의 시점을 취하고, 스피어만-카버 방법을 사용하는 경우 완충제 매트릭스가 독성 및 간섭을 야기하지 않는 희석률인 1:300으로 희석시켰다.

세제 제거

세제 아나포 C12E9의 제거는 단클론 항체를 함유하는 샘플에 대하여 단백질 A 크로마토그래피 동안 평가하였다. 단백질 샘플(단클론 항체를 함유하는 숙주 세포 배양액)에 0.03% 세제를 스파이크하고, 이를 단백질 A 컬럼에 통과시켰다. 용출 피크 및 세제가 스파이크된 완충액을 Waters BioResolve^TM Polyphenol(미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재) 450

, 2.1 x 50 mm 컬럼에서 제거에 대해 평가하였다. 유량은 65℃에서 0.5 mL/분이었다. 0.1% TFA/0.1% 포름산이 포함된 물의 고정상 A와 이동상 B로서 90% n-프로판올을 사용하여 5분의 구배를 사용하여 샘플을 러닝시켰다.

확장된 범주의 연구

연구의 범주를 확장하여 2가지의 추가 알킬 에톡실레이트 유도체를 평가하였다. 알킬 에톡실레이트 세제인 IsoC13E6(CMC: 29.91 mg/L) 및 Iso-C13E9(CMC: 57.97 mg/L)(알포닉 TDA-6 에톡실레이트, 노벨-TDA6 및 알포닉 TDA-9 에톡실레이트, 노벨-TDA9(Avantor(미국 펜실베이니아주 래드너 소재); Sasol(사우스 아프리카 요하네스버그 소재), CAS 9043-30-5로도 입수가능함)를 다음의 3가지 농도, 즉 그의 CMC 값의 2.5배, 5배, 및 7.5배의 농도에서 테스트하였다. 샘플을 5% XMuLV 스파이크를 이용하여 5℃에서 mAb #1 또는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE®#1)를 함유하는 숙주 세포 배양액과 함께 인큐베이션하였다. 다음의 3가지 시점에서 세포독성 및 간섭을 감소시키도록 샘플을 1:300으로 희석하였다: 30초, 10분, 및 30분.

TCID50 분석은 10⁰~10^-7로부터 8회 반복하여 1:10 연속 희석물을 이용하여 실행하였다. 단백질에 스파이크된 5% XMuLV의 유지 대조 용액은 세제 없이 실행 기간 동안 유지되었고, 이외에도 시드 배지의 음성 대조군도 유지되었다. 모든 샘플을 25% 컨플루언트 PG4 세포로 적정하고 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 CPE에 대해 제7일에 판독하고, 이전에 기술된 바와 같이(상기 문헌[Romanowski et al.]) 총 바이러스 역가 및 대수 감소 값(LRV)에 대한 스피어만-카버 방정식으로 평가하였다.

결과 및 토론

세제 스크리닝

이온성, 소수성 및 구조적 특성이 다양한 구매가능한 96가지 세제의 셀렉션을 사용하여 외피 보유 모델 바이러스 xMuLV에 대해 초기 스크리닝을 수행하였다. 이러한 세제 중 51개는 표 1에 나타낸 바와 같이 중복 및 세제 대조군 모두에서 CPE가 확인되지 않았다. 이 군은 비이온성, 쯔비터이온성 및 합성 지질 세제를 포함하였으며, 반면에 테스트한 이온성 세제는 바이러스 불활성화를 나타내지 않았다.

[표 1]

바이러스 불활성화에 대해 양성으로 밝혀진 51가지의 세제 중 일부는 구조가 유사하고 알킬 사슬 링커 길이만 다를 뿐이다. 세제 구조를 기반으로 결과를 평가하여 구조적 클래스 내의 경향을 관찰하였다. 확인된 세제 중 19개는 현재 화학 물질 안전에 관한 유럽 연합 지침 67/548/EC에 따르면 위험하지 않은 것으로 간주된다(표 2). 이러한 "친환경" 세제는 분자 구조를 기반으로 하여 4가지 클래스로 분류되었으며, 사이말, 포스-콜린, 아나포, 및 티오글루코시드로 라벨링되었다(도 1).

[표 2]

사이말^® 세제는 다양한 길이의 알킬 사슬에 의해 시클로헥산에 연결된 말토시드 당을 함유한다. 사이말^® 1~7은 초기 스크리닝에서 96가지 세제 중 하나였다. 놀랍게도, 1개 또는 2개의 탄소의 알킬 사슬을 갖는 사이말^®은 xMuLV 바이러스를 불활성화시키는 데 영향을 미치지 않았지만, 3~7개의 탄소의 알킬 사슬을 갖는 사이말^®은 바이러스를 불활성화시켰다. 포스-콜린 및 아나포 유도체에 영향을 미치는 알킬 사슬 길이와 관련된 유사한 놀라운 결과도 나타났다. 8개 또는 9개 탄소 링커 사슬을 갖는 포스-콜린은 바이러스 불활성화에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀진 반면, 10개 탄소 링커를 갖는 포스-콜린은 바이러스를 불활성화시켰다. 아나포 세제는 알킬 사슬과 에톡실레이트 사슬로 구성되며, 여기서, 알킬 탄소(C)와 에톡실레이트 기(E)의 수는 명칭 내에 표시되고, 예를 들어, 아나포 C12E9는 12개의 알킬 탄소 및 9개의 에톡실레이트 기를 갖는다. 아나포 C12E9 및 아나포 C12E8은 바이러스를 강력하게 불활성화시키는 것으로 밝혀졌으며, 아나포 C10E9, 아나포 C10E6, 아나포 C12E10 및 C13E8은 그렇지 않았다(표 3). 알킬 사슬 길이는 분자의 전반적인 소수성의 원인이 되며, 궁극적으로 바이러스 외피 분할에 영향을 미칠 수 있다. 특정 범위의 친유성은 지질 외피층의 파열을 유도하는 데 필요할 수 있다.

[표 3]

바이러스 불활성화의 확장된 바이러스 연구 범주

다른 외피 보유 바이러스인 PRV와 외피 비보유 바이러스인 MMV(mouse minute virus)를 이용하여 19가지 "친환경" 세제를 추가 테스트하였다. 모든 19가지 세제는 xMuLV와 마찬가지로 PRV를 비활성화시켰지만 MMV에는 영향을 미치지 않았으며, 이는 상기 세제들이 외피 보유 바이러스에는 영향을 미치지만 외피 비보유 바이러스에는 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 트리톤 X-100은 또한 외피 보유 바이러스에만 영향을 미치며, 이는 이러한 세제가 유사한 방식으로 지질 외피를 파괴할 가능성이 있음을 나타낸다.

농도 연구

xMuLV의 불활성화에 필요한 최저 농도를 결정하기 위하여, 사이말®-5, 아나포 C12E8, 아나포 C12E9, Fos콜린^®-10, 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드를 xMuLV, PRV 및 MMV에 대하여, 그의 CMC 값의 2.5배, 5배, 및 7.5배로 이중으로 테스트하였다. 테스트한 모든 바이러스에 있어서, CMC의 2.5배는 세포변성 효과(CPE)를 나타냈으며, 따라서 후속 연구는 세제 CMC 값의 5배에서 평가되었다.

온도-의존성 연구

아나포 C12E8, 아나포 C12E9, N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드, 사이말^®-5, 및 포스-콜린^®-10을 다양한 온도에서, 3가지의 단백질 치료 양식, 단클론 항체(mAb), 이중특이성 T 세포 인핸서(BiTE^®) 및 융합 단백질(XmAb)의 존재 하에 분석하였다(표 2). 아나포 세제 둘 모두 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드는 5℃ 및 15℃ 둘 다에서 30분에 완전한 불활성화를 나타냈으며, 이는 제조 환경에 대한 "최악의 시나리오"의 온도를 나타낸다. 이 3가지 세제는 BiTE® 및 mAb 양식 둘 다에 있어서 트리톤 X-100에 비견되는 LRV 값을 가지며 융합 단백질에 있어서 훨씬 더 양호한 제거성을 갖는다.

세제 포스콜린-10 및 사이말^®-5는 테스트된 임의의 온도에서 xMuLV에 대해 유의한 불활성화를 생성하지는 않았다. 이러한 세제를 사용한 바이러스 불활성화가 초기 세제 스크리닝 및 기타 실험 동안 관찰되었기 때문에, 생성물이 존재하지 않는 경우 샘플 매트릭스와의 부정적인 상호작용이 있을 수 있다. 15℃의 공정 온도에서 포스-콜린^®-10 및 사이말^®-5의 평균 LRV는 각각 3.8 및 0.39였다. 온도가 세제에 미치는 영향을 분석하기 위해 사이말^®-5를 더 높은 온도(22℃)에서 테스트하였으며, 이는 LRV의 대략 1 log 증가를 초래하였다. 심지어 이러한 온도 증가에 의해서도 LRV는 여전히 낮았다.

[표 4]

세제의 동역학 연구

바이러스 불활성화가 발생하는 속도를 평가하기 위해 다음의 3가지 시점을 테스트하였다: 30초, 10분, 및 30분. 30초 이내에 xMuLV의 완전한 불활성화가 테스트된 3가지 치료 양식 모두에 대해 아나포 C12E8 및 N-헵틸-β-D-티오글루코피라노시드에 대해 관찰되었다. 아나포 C12E9는 mAb #1에 대해 30초에 완전한 불활성화를 나타내고, 융합 단백질 #1 및 BiTE^® #1에 대해 10분 이내에 완전한 불활성화를 나타냈다(표 5 참조). 아나포 C12E9는 테스트한 3가지 치료 양식 모두에 대해 10분 이내에 완전한 제거를 나타냈다. 아나포 C12E9의 CMC 값은 아나포 C12E8의 절반이며, 이는 동일한 LRV를 달성하는 데 유의하게 더 적은 세제가 필요함을 의미한다. 상업적 제조 수량까지의 스케일업에 있어서, 이 속성이 상당한 이점이 될 것이다.

포스-콜린^®-10과 사이말^®-5 둘 다는 30분 이내에 강력한 제거로 이어지지 않았다.

[표 5]

아나포 C12E8의 제거

바이러스 불활성화 과정 후에 세제가 완전히 제거될 수 있도록 하기 위해 mAb를 포함하는 숙주 세포 배양액을 0.03% 아나포 C12E8 세제로 스파이크하고, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 친화성 정제하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 크로마토그래피 실행 후 남은 세제의 양을 분석하였다. 결과는 단백질 A 크로마토그래피 단계 동안 세제가 제거됨을 나타낸다(도 2).

알킬 에톡실레이트 세제의 확장된 범주

강력한 바이러스 제거에 필요한 세제의 특이성을 더 이해하기 위해 분지형 이소프로필 기를 포함하는 2개의 추가 알킬 에톡실레이트를 평가하였다. 두 세제 모두 CMC 값의 5배 이상의 농도에서 xMuLV의 강력한 제거성을 가졌다. 높은 LRV가 2가지 치료 양식인 mAb #1 및 BiTE^® #1에서 관찰되었다(표 6). 이러한 결과는 광범위한 범주의 아나포 유도체의 강력한 바이러스 불활성화 능력을 나타낸다.

[표 6]

실시예 2 탁도

탁도, 용해도 및 고분자량 화학종(HMW)으로 측정되는 바와 같이, 3가지 세제가 4가지 다른 단백질 양식의 안정성에 부정적인 영향을 미치는지를 결정하기 위해 3가지 세제를 추가로 테스트하였다. 또한, 생성물 품질은 HMW의 경우 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 측정된 바와 같았고 저분자량 화학종(LMW)의 경우 환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트(rCE-SDS)로 측정된 바와 같았다.

아나포 C12E8(APO128), 아나포 C12E9(APO129) 및 트리톤 X-100은 단클론 항체(mAb #2), 2가지 융합 단백질(융합물 #2 및 융합물 #3), 이중특이성(이중특이성 #1), 및 2가지 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE^® #1 및 BiTE^® #2)를 사용하여 테스트하였다.

탁도 결정을 이용하여 세제 스파이크 샘플의 안정성을 측정하였다. 샘플의 탁도 증가는 단백질 분자의 침전을 반영한다.

각각의 분자의 배양물로부터 수집된 100 mL의 수확된 세포 배양액(HCCF)에 다음의 4가지 조건을 적용하였다: 세제를 함유하지 않는 HCCF(대조군), APO128, APO129 및 트리톤 X-100. 세제는 세제의 임계 미셀 농도(CMC) 값의 5배로 스파이크하였다: 트리톤-X: 트리톤-X: 1.1 mM, APO128: 0.55 mM, APO 129: 0.25 mM, TDA-9: 0.48 mM.

각각의 분자에 대해 2개의 샘플 세트를 생성하였으며; 한 세트는 실온에서 5일 동안 유지하였다. 두 번째 세트를 2~8℃에서 7일 동안 유지하였다. 각각의 샘플의 탁도는 제0일, 제1일, 제2일, 제5일 및 제7일에 탁도계(Hach Turbidimeter 2100P 46500-00, 미국 콜로라도주 러브랜드 소재)를 사용하여 측정하였다.

도 3은 실온 및 2~8℃에서 세제와 HCCF의 혼합물에 대한 각각의 시점에서의 탁도 데이터를 나타낸다. 제5일에서의 실온에 대한 데이터 포인트는 가장 큰 변동성을 나타내며, 이는 샘플의 박테리아 오염으로 인한 것일 수 있다. APO128 및 APO129가 스파이크된 샘플의 데이터 포인트는 트리톤 X-100이 스파이크된 샘플의 데이터 포인트와 매우 유사한 경향을 보이거나 대조군보다 덜 탁하였다. 이것은 테스트된 세제 중 어느 것도 다른 단백질 양식의 침전을 야기하지 않았음을 나타낸다.

실험 4 생성물 품질

고분자량 백분율(%HMW) 및 저분자량 백분율(%LMW)을 사용하여 세제 스파이크 샘플의 안정성을 측정하였다. %HMW에 의해 샘플에서 단백질의 응집을 측정한 반면, %LMW에 의해 단백질의 클립핑(clipping)을 측정하였다. 이러한 생성물 품질 속성은 친화성 컬럼 정제 전후에 세제의 존재가 친화성 정제 공정 또는 친화성 정제 물질의 생성물 품질에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 측정하였다.

단클론 항체(mAb #2), 2가지 융합 단백질(융합물 #2 및 융합물 #3), 이중특이성(이중특이성 #1) 및 2가지 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE^® #1 및 BiTE^® #2)로부터의 수확된 세포 배양액 및 친화성 크로마토그래피 후 샘플을 테스트하였다.

HCCF 친화성 크로마토그래피 전 로드 물질 및 친화성 크로마토그래피 후 풀 물질의 100 mL 샘플에 아나포 C12E8(APO128)(0.11 mM), 아나포 C12E9(APO129)(0.05 mM), 알포닉 TDA-9 에톡실레이트(TDA-9)(0.1 mM) 및 트리톤 X-100(0.22 mM)을 임계 미셀 농도(CMC)의 5배로 스파이크하였다. 무세제 샘플을 대조군으로 사용하였다. 샘플을 세제와 함께 실온에서 대략 1시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 샘플을 2~8℃에서 7일 동안 유지한 후 생성물 품질 분석을 위해 제시하거나 친화성 컬럼을 통해 정제한 다음 생성물 품질 분석을 위해 제시하였다.

수확한 세포 배양액에 BiTE #2의 경우 GE CaptoChelating 수지(미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)를 사용하고 모든 다른 단백질 양식의 경우 GE MabSelect Sure 수지(미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 적용하여 친화성 컬럼 후 샘플을 생성하였다.

각각의 단백질 양식으로부터의 HCCF 친화성 크로마토그래피 전 로드 물질의 추가 100 mL 샘플은 세제를 스파이크하고 2~8℃에서 7일 동안 유지하였다.

SEC-HPLC를 사용하여 %HMW를 결정하고 rCE-SDS를 사용하여 %LMW를 결정하여 생성물 품질을 평가하였다.

재료 입수성의 타이밍으로 인해 두 세트의 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험은 다음의 4가지 조건을 포함하였다: 무세제 대조군, 트리톤 X-100, APO128 및 APO129. 두 번째 실험은 다음의 2가지 조건을 포함하였다: 무세제 대조군 및 TDA-9.

도 4는 %HMW 및 %LMW로 측정되는 바와 같이 친화성 포획 과정 전반에 걸친 분자의 안정성을 나타낸다. 데이터는 무세제 대조군의 값을 차감함으로써 정규화하였다. 대부분의 분자에 있어서, %HMW 및 %LMW는 친화성 포획 단계 전후에 일정하게 유지되었다. BiTE #2는 친화성 크로마토그래피 후 풀 단계에서 불안정한 것으로 알려져 있으며, 따라서 %HMW의 변동이 광범위하다.

도 5는 친화성 후 BiTE #1에 대한 생성물 품질 데이터를 나타낸다. BiTE #1 HCCF(로드 물질)는 친화성 크로마토그래피 전에는 생성물 품질에 대해 제시되지 않았다.

도 6은 %HMW 및 %LMW로 측정되는 바와 같이 2~8℃에서 7일 인큐베이션 후 분자의 안정성이 비교적 일정하게 유지되었음을 나타낸다. 데이터는 무세제 대조군의 값을 차감함으로써 정규화하였다.

세제는 친화성 크로마토그래피 동안 생성물 품질에 유의한 영향을 미치지 않았다.

Claims (55)

1. 하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체에서 외피 바이러스를 불활성화시키는 방법으로서,
   하나 이상의 외피 보유 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 유체를 얻는 단계;
   유체를 표 1의 세제에 노출시키는 단계
   (바이러스 불활성화를 야기하기에 충분한 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안)를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 또는 CAS 85618-20-8로부터 선택되는, 방법.
4. 제1항에 있어서, 유체를 적어도 30초 내지 적어도 60분 또는 그 이상 동안 세제에 노출시키는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 유체를 10분 이상 동안 세제에 노출시키는, 방법.
6. 제4항에 있어서, 유체를 30분 이상 동안 세제에 노출시키는, 방법.
7. 제4항에 있어서, 유체를 적어도 60분 이상 동안 세제에 노출시키는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 세제의 농도는 그의 임계 미셀 농도(CMC)의 적어도 2.5배 내지 적어도 10배 또는 그 이상인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 세제의 농도는 그의 CMC의 5배 이상인, 방법.
10. 제8항에 있어서, 세제의 농도는 그의 CMC의 7.5배 이상인, 방법.
11. 제8항에 있어서, 세제의 농도는 그의 CMC의 10배 이상인, 방법.
12. 제1항에 있어서, 세제에 대한 유체의 노출은 적어도 5℃ 내지 22℃의 온도에서 발생하는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 세제에 대한 유체의 노출은 5℃ 이상의 온도에서 발생하는, 방법.
14. 제12항에 있어서, 세제에 대한 유체의 노출은 15℃ 이상의 온도에서 발생하는, 방법.
15. 제12항에 있어서, 세제에 대한 유체의 노출은 20℃ 이상의 온도에서 발생하는, 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 10분 이상인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 불활성화는 TCID₅₀ 분석을 사용하여 결정되는, 방법.
18. 제1항에 있어서, 유체는 관심 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액인, 방법.
20. 제1항에 있어서, 유체는 수확 단계, 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함하는 단위 조작으로부터의 유출 스트림, 용출액, 풀(pool), 저장물 또는 보유물 유래의 유체인, 방법.
21. 제20항에 있어서, 유체는 심층 여과, 정밀여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 수집된 용출액인, 방법.
22. 제20항에 있어서, 유체는 수확된 세포 배양액, 심층 여과로부터의 용출액, 정밀여과로부터의 용출액, 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액, 다중모드 크로마토그래피로부터의 용출액, 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용출액 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터의 용출액을 함유하는 풀인, 방법.
23. 제22항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L 크로마토그래피인, 방법.
24. 관심 재조합 단백질의 정제 동안 외피 보유 바이러스를 불활성화시키는 방법으로서,
    하나 이상의 바이러스를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 관심 재조합 단백질을 포함하는 유체를 얻는 단계;
    상기 유체에 적어도 하나의 세제(여기서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 가짐)를, 유체 중 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 농도로 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계; 및
    바이러스 불활성화 유체에 하나 이상의 단위 조작(이는 적어도 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함함)을 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
25. 제24항에 있어서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택되는, 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 10분 이상인, 방법.
27. 제24항에 있어서, 유체는 관심 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
28. 제24항에 있어서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액인, 방법.
29. 제24항에 있어서, 유체는 수확 단계, 여과 단계 또는 크로마토그래피 단계를 포함하는 단위 조작으로부터의 유출 스트림, 용출액, 풀, 저장물 또는 보유물 유래의 유체인, 방법.
30. 제24항에 있어서, 유체는 심층 여과, 정밀여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 수집된 용출액인, 방법.
31. 제24항에 있어서, 유체는 수확된 세포 배양액, 심층 여과로부터의 용출액, 정밀여과로부터의 용출액, 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액, 다중모드 크로마토그래피로부터의 용출액, 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용출액 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터의 용출액을 함유하는 풀인, 방법.
32. 제31항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L 크로마토그래피인, 방법.
33. 제24항에 있어서, 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 또는 다중모드 크로마토그래피, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는, 방법.
34. 제24항에 있어서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이고 단위 조작은 심층 여과를 포함하는, 방법.
35. 제24항에 있어서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이고 단위 조작은 정밀여과를 포함하는, 방법.
36. 제24항에 있어서, 유체는 수확된 숙주 세포 배양액이고 단위 조작은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
37. 제24항에 있어서, 유체는 단백질 A 용출액이고 단위 조작은 심층 여과를 포함하는, 방법.
38. 제24항에 있어서, 단위 조작은 심층 여과를 포함하는, 방법.
39. 제24항에 있어서, 단위 조작은 정밀여과를 포함하는, 방법.
40. 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계;
    관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계;
    관심 재조합 단백질을 함유하는 상기 수확된 유체에 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제를, 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 적용하는 단계;
    2개 이상의 추가 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 바이러스 불활성화 유체를 프로세싱하는 단계; 및
    단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
41. 제40항에 있어서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택되는, 방법.
42. 제40항에 있어서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 10분 이상인, 방법.
43. 제40항에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질.
44. 제40항에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물.
45. 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 이용하여 생물반응기에서 세포 배양을 확립하고 관심 재조합 단백질을 발현하도록 세포를 배양하는 단계;
    관심 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액을 수확하는 단계;
    2개 이상의 단위 조작을 통해 관심 재조합 단백질을 함유하는 유체를, 외피 보유 바이러스의 불활성화를 야기하기에 충분한 세제 농도에서 및 상기 야기에 충분한 시간 동안 프로세싱하는 단계(여기서, 하나 이상의 단위 조작 동안, 관심 재조합 단백질을 함유하는 유체를 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, CAS 85618-20-8, CAS 181135-58-0, CAS 181135-57-9, CAS 250692-65-0, CAS 228579-27-9, CAS 349477-49-2, CAS 70504-28-8, CAS 59080-45-4, CAS 69984-73-2, CAS 148616-91-5, CAS 148565-55-3, CAS 69227-93-6, CAS 82494-09-5, CAS 253678-67-0, CAS 106402-05-5, 또는 CAS 93911-12-7의 CAS 등록 번호를 갖는 세제와 조합하는 단계가 있음); 및
    단리되고 정제된 관심 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
46. 제45항에 있어서, 세제는 CAS 3055-99-0, CAS 3055-98-9, CAS 9043-30-5, 및 CAS 85618-20-8로부터 선택되는, 방법.
47. 제45항에 있어서, 상기 농도는 그의 CMC의 5배이고 상기 시간은 10분 이상인, 방법.
48. 제45항에 있어서, 하나 이상의 단위 조작은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 포획 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
49. 제45항에 있어서, 하나 이상의 단위 조작은 이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 선택되는 폴리싱 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
50. 제45항에 있어서, 하나 이상의 단위 조작은 바이러스 여과, 심층 여과 및 UF/DF로부터 선택되는 단계를 포함하는, 방법.
51. 제45항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작 전에 발생하는, 방법.
52. 제45항에 있어서, 친화성 크로마토그래피를 포함하는 단위 조작은 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작 전에 발생하는, 방법.
53. 제45항에 있어서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 단위 조작은 심층 여과를 포함하는 단위 조작 전에 발생하는, 방법.
54. 제45항에 따른 단리되고 정제된 관심 재조합 단백질.
55. 제45항에 따른 단리된 관심 단백질을 포함하는 제약 조성물.
    

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