KR102238133B1 - 환경-친화적 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 환경적으로 적합한 상기 세제는 생성물 품질에 부정적인 영향은 주지 않으면서도, 공급스트림 중 바이러스를 효과적으로 불활성화한다.

Description

환경-친화적 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법{METHODS FOR VIRAL INACTIVATION USING ECO-FRIENDLY DETERGENTS}

[관련 출원의 상호-참조]

본 출원은 2013년 11월 15일자 U.S. 특허 가출원 제61/905,075호 및 2014년 2월 7일자 U.S. 특허 가출원 제61/937,284호의 우선권을 주장하는 바, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

[발명의 분야]

본 발명은 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법을 제공한다.

제약 활성 물질의 생물공학적 제조는 다양한 목적의 보조 물질들을 필요로 한다. 합성 단계 종료시에는, 제조용 세포를 용해시켜 정제용 합성 생성물을 방출하기 위하여, 그리고 바이러스 또는 세균 오염에 대한 보호물로서 세제가 사용된다. 원하는 생성물의 정제 후, 생성물 정제에 사용된 성장 배지 및 완충제는 불활성화되어 폐수로 배수된다. 세제에 대한 환경 위험 평가 (ERA)로 추정할 때, 이와 같은 방출물은 환경적인 우려를 야기할 수 있다.

제약 활성 물질의 생물공학적 제조에 있어서의 바이러스 불활성화에 대한 현행 프로토콜은 종종 트리톤(Triton) X-100의 사용에 의존하고 있다. 트리톤 X-100의 분해 생성물은 입증된 에스트로겐 효과를 가지는 생태독소(ecotoxin)인 옥틸페놀이다. 옥틸페놀 방출에 대하여 정해진 한계는 0.01 내지 0.1 ppb이다. 따라서, 생물공학 공정에서의 트리톤-X의 사용은 폐기스트림(wastestream)으로부터 옥틸페놀을 제거하기 위한 복잡하고 비용이 드는 수단의 사용을 필요로 할 수 있다. 필요한 것은 생물제제 제조에 사용하기 위한 환경적으로 적합한 세제이다.

특허 출원 및 공개를 포함한 본원에서 인용되는 모든 참고문헌들은 그 전체가 참조로써 개재된다.

[발명의 개요]

본 발명은 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림(feedstream)에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 공급스트림을 세제에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세제는 환경적으로 적합한 것이다. 상기 방법은 예를 들면 트리톤 X-100을 사용하는 방법 또는 세제가 없는 방법에 비해; 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질을 유지한다.

일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 생성물 공급스트림의 총 폴리펩티드 중 생성물 변종에 있어서의 5 % 이하의 변화를 초래한다. 일부 실시양태에서, 생성물 변종은 생성물 공급스트림의 총 폴리펩티드 중 5 %를 초과하여 증가하지 않는다. 일부 실시양태에서, 생성물 변종은 크기 변종, 하전 변종, 산화 변종, 탈아미드화 변종, 당화 변종, 또는 변경된 글리칸 프로파일을 가지는 변종이다. 일부 실시양태에서, 생성물 변종은 산성 및/또는 염기성 생성물 변종이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림을 세제에 적용하는 것은 폴리펩티드의 단편화를 약 5 %를 초과하여 증가시키지는 않는다. 일부 실시양태에서, 공급스트림을 세제에 적용하는 것은 공급스트림의 응집을 약 5 %를 초과하여 증가시키지는 않는다. 다른 실시양태에서, 공급스트림을 세제에 적용하는 것은 제조 공정에서의 폴리펩티드의 수율을 약 5 %를 초과하여 감소시키지 않는다.

본 발명은 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 공급스트림을 세제에 적용하는 단계를 포함하며, 환경적으로 적합한 세제가 약 0.01 % 내지 약 10 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 상기 세제는 약 0.3 % 내지 약 1 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 적어도 약 1분 내지 적어도 약 48시간 동안 세제에 적용된다. 다른 실시양태에서, 공급스트림은 적어도 약 15분 내지 적어도 약 3시간 동안 세제에 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 공급스트림은 적어도 약 1시간 동안 세제에 적용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃에서 세제에 적용된다. 다른 실시양태에서, 공급스트림은 약 15 ℃ 내지 약 20 ℃에서 세제에 적용된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 세제는 비-이온성 세제 또는 양쪽이온성 세제이다. 일부 실시양태에서, 세제는 약 12 내지 약 15의 친수성 친지성 균형(hydrophile lipophile balance) (HLB)을 가진다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 세제는 옥틸페놀을 포함하거나 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세제는 퍼옥시드를 포함하거나 형성하지 않는다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 세제를 포함하는 공급스트림은 낮은 혼탁도를 가진다. 일부 실시양태에서, 공급스트림에 대한 세제의 첨가는 공급스트림의 혼탁도를 증가시키지는 않는다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 폐기시 세제의 사용에 기인하는 수용 수체(receiving water body)에서의 세제의 예측 환경 농도 (Predicted Environmental Concentration)(PEC)는 세제의 예측 무-영향 농도(Predicted No-Effect Concentration)(PNEC) 미만이다. 다른 실시양태에서, PEC는 PNEC에 비해 더 낮다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알킬 글루코시드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 알킬 글루코시드는 데실 글루코시드이다. 다른 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알콜 에톡실레이트이다. 또 다른 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르이다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 CAS 9005-64-5, CAS 9005-65-6, CAS 126-43-8, 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 29836-26-8, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 25322-68-3, CAS 27252-75-1, CAS 4292-10-8, CAS 132778-08-6, CAS 110615-47-9, CAS 68515-73-1 또는 CAS 68439-46-3의 CAS 등록 번호를 가진다.

일부 실시양태에서, 세제는 1종 이상의 계면활성제를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세제는 1종 이상의 계면활성제, 보존제 및 킬레이팅제를 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 공급스트림은 수확된 세포 배양액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 수확된 세포 배양액에 첨가된다. 다른 실시양태에서, 공급스트림은 포획 풀(pool) 또는 회수 생성물 풀을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 친화성 크로마토그래피 풀이다. 또 다른 실시양태에서, 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 단백질 A 풀, 단백질 G 풀 또는 단백질 L 풀이다. 다른 실시양태에서, 상기 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 혼합 모드 크로마토그래피 풀이다. 다른 실시양태에서, 포획 풀은 캅토어드히어(CaptoAdhere) 풀이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 소포제와의 조합으로써 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 소포제는 시메티콘이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 상기 방법은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 바이러스는 외피보유(enveloped) 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 플라비바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 간염 바이러스, 오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 라브도바이러스 또는 토가바이러스이다. 일부 실시양태에서, 공급스트림에서의 세제의 바이러스 log 감소 값 (LRV)은 약 1을 초과한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 LRV는 약 4를 초과한다. 일부 실시양태에서, LRV는 감염성 검정을 바탕으로 계산된다. 다른 실시양태에서, 상기 감염성 검정은 플라크(plaque) 검정 또는 TCID⁵⁰ 검정이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세제를 첨가한 후에 공급스트림을 여과하는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 적어도 약 15분 내지 적어도 약 48시간 후에 여과된다. 다른 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 적어도 약 1시간 내지 적어도 약 3시간 후에 여과된다. 다른 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 약 1시간 후에 여과된다. 일부 실시양태에서, 필터는 한외필터 또는 심층 필터이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 후에 크로마토그래피에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피 또는 단백질 L 크로마토그래피이다. 다른 실시양태에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 다른 실시양태에서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피는 캅토어드히어 크로마토그래피이다.

일부 측면에서, 본 발명은 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 치료용 폴리펩티드는 항체, 면역부착소, 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, Fc 융합 폴리펩티드, 항원 또는 결합제이다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 뮤린 하이브리도마 세포 또는 뮤린 골수종 세포이다.

도 1은 다양한 혼합 방법을 사용한 세제가 없는 MAb1 HCCF 대조군의 세제 혼합 혼탁도 분석을 나타낸다; 혼합 없음 (다이아몬드), 교반 막대 (사각형) 및 오버헤드 교반기 (삼각형).
도 2는 1 % 폴리소르베이트 20 (상부 좌측), 0.3 % TnBP를 동반하는 1 % 폴리소르베이트 20 (상부 우측), 1 % 폴리소르베이트 80 (하부 좌측), 및 0.3 % TnBP를 동반하는 1 % 폴리소르베이트 80 (하부 우측)을 사용하여 처리된 MAb1 HCCF의 세제 혼합 혼탁도 분석을 나타낸다. 혼합 없음 (다이아몬드), 교반 막대 (사각형), 오버헤드 교반기 (삼각형), 짙은 막대 (HCCF 대조군-혼합 없음).
도 3은 1 % 세이프케어 (상부 좌측), 1 % 에코서프 EH9 (상부 우측), 0.1 M 카프릴산 (하부 좌측) 및 1 % 데실 폴리글루코시드 (하부 우측)을 사용하여 처리된 MAb1 HCCF의 세제 혼합 혼탁도 분석을 나타낸다. 혼합 없음 (다이아몬드), 교반 막대 (사각형), 오버헤드 교반기 (삼각형), 짙은 막대 (HCCF 대조군-혼합 없음).
도 4는 세제를 사용한 주변 온도에서의 밤새 인큐베이션 및 MAbSelect Sure 단백질 A에서의 정제 후 MAb3의 펩티드 맵을 나타낸다.
도 5는 40 ℃에서 59일까지의 다양한 시점 동안 유지되는 10 % 트리톤 CG-110 안정성 샘플의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 40 ℃에서 59일까지의 다양한 시점 동안 유지되는 10 % 에코서프 EH-9 모 용액 안정성 샘플의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 환경적으로 적합한 (환경-친화적인) 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 환경적으로 적합한 세제의 사용이 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질에 부정적인 영향을 주지는 않는다. 예를 들면, 환경적으로 적합한 세제의 상기 사용이 비제한적으로 생성물 단편 및 응집체를 포함한 크기 변종, 산성 및 염기성 변종을 포함한 하전 변종, 탈아미드화 변종 및 당화 변종과 같은 생성물 변종의 증가를 초래하지는 않는다. 일부 측면에서는, 환경적으로 적합한 세제의 사용이 CHOP, 핵산, 삼출된 단백질 A, 생성물 변종, 내독소, 바이러스 오염물, 세포 배양 배지 성분 등과 같은 공정 불순물의 청소에 부정적인 영향을 주지 않는다.

I. 일반적인 기술

본원에서 기술되거나 참조되는 기술 및 절차들은 일반적으로 잘 알려져 있는 것들로써, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 기술되어 있는 광범위하게 활용되고 있는 방법론들과 같은 통상적인 방법론을 이용하여 통상의 기술자에 의해 흔하게 사용되는 것들이다.

II. 정의

"세제"라는 용어는 장쇄 지방족 염기 또는 산의 염, 또는 당과 같은 친수성 잔기를 포함할 수 있으며, 친수성 및 소수성 특성 모두를 보유하는 작용제를 지칭한다. 친수성 및 소수성 특성 모두를 가짐으로써, 세제는 특별한 효과를 발휘할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 세제는 바이러스 외피를 붕괴시켜 바이러스를 불활성화하는 능력을 가진다. 일부 실시양태에서, 세제는 계면활성제 및 1종 이상의 다른 작용제 예컨대 킬레이팅제 및 보존제를 포함하는 조성물일 수 있다.

"계면활성제" 또는 "표면 활성 작용제"는 소수성 및 친수성 기 모두를 포함함으로써 유기 및 수성 용매 모두에서 반-가용성인 화합물, 통상적으로 (반드시는 아님) 유기 화합물이다. 계면활성제는 비-이온성, 양이온성 또는 음이온성일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "환경적으로 적합한" 물질은 환경에 대하여 최소한의 유해 효과를 야기하는 물질이다. 예를 들어, 환경적으로 적합한 물질은 본질적으로 동물 및/또는 식물 생명에 대하여 비독성일 것이다.

"PEC"인 "예측 환경 농도"는 환경 중 수용 수체로 방출되는 폐기물에서의 물질의 예측 농도이다. 예를 들면, 치료용 단백질의 제조에서 바이러스 불활성화에 사용되는 세제의 예측 환경 농도는 환경으로 방출되는 폐기 스트림 중 세제의 농도이다.

"예측 무-영향 농도" 또는 "PNEC"는 유해 효과 없이 환경, 예컨대 수용 담수 및/또는 해수의 생물상에 방출하기에 안전한 폐기물 중 물질의 예측 농도이다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개재; 예를 들면 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 역시 정의에 포함되는 것은 예를 들면 1종 이상의 아미노산 유사체 (예를 들면 비자연 아미노산 등 포함)는 물론 업계에 알려져 있는 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드이다. 본원에서 사용될 때의 "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 특히 항체를 포괄한다.

"단리된 폴리펩티드"는 그것이 발현되었던 세포 또는 세포 배양물로부터 회수된 폴리펩티드를 의미한다.

본원에서 사용될 때의 "폴리펩티드 하전 변종"이라는 용어는 폴리펩티드의 하전이 변경되도록 그의 자연 상태로부터 변형된 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 예에서, 하전 변종은 모 폴리펩티드에 비해 더 산성으로써; 다시 말하자면 모 폴리펩티드에 비해 더 낮은 pI를 가진다. 다른 예에서, 하전 변종은 모 폴리펩티드에 비해 더 염기성으로써; 다시 말하자면 모 폴리펩티드에 비해 더 높은 pI를 가진다. 이와 같은 변형은 조작될 수 있거나, 또는 산화, 탈아미드화, 리신 잔기의 C-말단 프로세싱, N-말단 피로글루타메이트 형성 및 당화와 같은 자연적 과정의 결과일 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩티드 하전 변종은 예를 들면 시알산 또는 그의 유도체 첨가에 의해 당단백질의 하전이 모 당단백질에 비해 변경되도록 단백질에 결합된 글리칸이 변형되어 있는 당단백질이다. 본원에서 사용될 때의 "항체 하전 변종"은 항체 또는 그의 단편의 하전이 변경되도록 항체 또는 그의 단편이 그의 자연 상태로부터 변형되어 있는 항체 또는 그의 단편이다.

본원에서 호환가능하게 사용될 때의 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하는데, 여기에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 합성 반응에 의해 중합체에 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다.

"단리된 핵산"은 그의 일반적인 상황에서 벗어나거나 그로부터 분리된 비-자연 발생 재조합체 또는 자연 발생 서열을 의미하여 포괄한다.

"정제된" 폴리펩티드는 폴리펩티드가 순도가 증가되었으며, 그에 따라 그것이 그의 자연 환경에서 존재하는 경우 및/또는 실험실 조건하에서 최초에 생성되고/거나 합성되고/거나 증폭되었을 때에 비해 더 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순도는 상대적인 용어로써, 반드시 절대 순도를 의미하는 것은 아니다.

"생성물 공급스트림", 또는 대안적으로 "공급스트림"은 해당 치료용 폴리펩티드를 함유하며 다양한 불순물들도 함유할 수 있는, 공정 정제 방법에 제공되는 재료 또는 용액이다. 비-제한적인 예에는 예를 들면 1회 이상 정제 공정 단계 후 해당 치료용 폴리펩티드를 함유하는 수확된 세포 배양액 (HCCF) 또는 수집된 풀이 포함될 수 있다.

"항체" 또는 "항체들"이라는 용어는 광범위한 의미로 사용되는데, 구체적으로는 예를 들면 그것이 원하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타낸다는 전제하에, 단일의 단일클론 항체 (작용제, 길항제 및 중화 항체 포함), 다중항원결정인자 특이성을 가지는 항체 조성물, 다클론 항체, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체), 면역부착소, 및 항체의 단편을 포괄한다. "이뮤노글로불린" (Ig)라는 용어는 본원에서 항체와 호환가능하게 사용된다.

"항체 단편"은 전체 길이 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 단일-사슬 항체 분자; 2분절체; 선형 항체; 및 항체 단편들로부터 형성되는 다중특이적 항체가 포함된다.

본원에서 사용될 때의 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득되는 항체를 지칭하는 것으로써, 다시 말하자면 미량으로 존재할 수 있는 있을 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 군집을 구성하는 개별 항체들이 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대하여 유도되기 때문에, 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (항원결정인자)에 대하여 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체 조제물과 달리, 각 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대하여 유도된다. 그의 특이성 이외에, 단일클론 항체는 그것이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"이 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 간주되어서는 아니 된다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 또는 세균, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA법을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대 U.S. 특허 제4,816,567호 참조). "단일클론 항체"는 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]에 기술되어 있는 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원의 단일클론 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래하거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체는 물론, 그것이 원하는 생물학적 활성을 나타낸다는 전제하에, 그와 같은 항체의 단편도 포함된다 (U.S. 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원의 해당 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예컨대 구세계 원숭이(Old World Monkey), 유인원 등)로부터 유래하는 가변 도메인 항원-결합 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체가 포함된다.

"인간화된" 항체는 비-인간 항체로부터 유래하는 최소한의 서열을 포함하는 키메라 항체인 비-인간 (예컨대 설치류) 항체의 형태이다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역에 속하는 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역에 속하는 잔기로 대체되어 있는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 이뮤노글로불린 서열의 것인 실질적으로 모든, 또는 하나 이상, 통상적으로는 2개인 가변 도메인을 포함하게 된다. 인간화 항체는 임의적으로는 또한 통상적으로 인간 이뮤노글로불린의 것인 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부 이상을 포함하게 된다. 추가적인 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조하라.

"불순물"은 원하는 폴리펩티드 생성물과 다른 물질을 지칭한다. 불순물에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 삼출된 단백질 A; 핵산; 원하는 폴리펩티드의 변종, 크기 변종, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등.

"한외여과"는 정수압이 반투과성 막에 대하여 액체를 가압하는 막 여과의 형태이다. 고분자량의 현탁된 고체 및 용질은 보류되는 반면, 물 및 저분자량 용질은 막을 통과한다. 일부 예에서, 한외여과 막은 1 내지 100 nm 범위의 세공 크기를 가진다. "한외여과 막" 및 "한외여과 필터"라는 용어는 호환가능하게 사용될 수 있다.

"바이러스 보류 필터", "바이러스 필터", "바이러스 막" 또는 "바이러스 보류 막"은 바이러스 입자를 함유하는 수용액으로부터의 바이러스의 크기-기반 제거에 사용되는 유형의 한외여과 필터/막이다. 구체적으로, 바이러스 보류 막은 바이러스를 보류하기에는 충분하면서도 원하는 폴리펩티드 생성물은 통과하는 것을 가능케 하는 세공 크기를 가진다.

본원에서 사용될 때, "오염물부착(fouling)"이라는 용어는 공정 장비 표면상에서의 원치 않는 물질의 축적 및 형성을 지칭한다. 오염물부착은 화학, 용해, 부식 및 생물학적 과정도 이루어지는 조합된 불안정 상태, 모멘텀, 물질 및 열 전달상의 문제를 특징으로 할 수 있다. 오염물 부착은 침전, 즉 칼슘 포스페이트 침전에 기인할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "우발성 인자(adventitious agent)"는 바이러스 및 세균 (멸균 등급 필터를 통과할 수 있는 세균 포함)을 포괄한다. "감염 인자"가 일종의 "우발성 인자"이다.

본원에서 기술되는 본 발명의 측면 및 실시양태들은 측면 및 실시양태들을 "포함"하며, 그것으로 "구성"되고, 그것으로 "본질적으로 구성"되는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용함에 있어서, 분명하게 달리 표시되지 않는 한, "a", "an" 등 용어의 사용은 하나 이상을 지칭한다.

본원에서 값 또는 파라미터에 대한 "약"의 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 것인 실시양태도 포함 (및 기술)하는 것이다. 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기술은 "X"에 대한 기술도 포함한다. 숫자 범위는 범위를 한정하는 숫자들을 포괄한다.

III. 본 발명의 방법

본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 환경적으로 적합한 세제의 상기 사용은 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질에는 부정적인 영향을 주지 않으면서도, 공급스트림 중 바이러스 오염물을 효과적으로 불활성화한다. 예를 들면, 환경적으로 적합한 세제의 사용이 비제한적으로 생성물 단편 및 응집체를 포함한 크기 변종, 산성 및 염기성 변종을 포함한 하전 변종, 탈아미드화 변종 및 당화 변종과 같은 생성물 변종의 증가를 초래하지는 않는다.

통상적으로, 치료용 폴리펩티드의 제조 공정은 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 발현을 포함한다. 일부 예에서, 상기 숙주 세포는 폴리펩티드를 방출시키기 위하여 용해된다. 다른 예에서는, 폴리펩티드가 배지 중으로 분비된다. 원하는 폴리펩티드를 포함하는 수확된 세포 배양액은 정화된 후, 불순물로부터 원하는 폴리펩티드를 정제하기 위하여 1종 이상의 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 크로마토그래피에는 원하는 생성물은 크로마토그래피로 유통되고 불순물은 크로마토그래피에 의해 보류되는 유통 크로마토그래피, 및/또는 원하는 생성물은 크로마토그래피에 의해 보류되고 불순물은 크로마토그래피로 유통되는 결합 및 용리 크로마토그래피가 포함될 수 있다. 공정의 일부 지점에서, 공급스트림은 바이러스를 제거하기 위하여 여과될 수 있다. 공급스트림은 원하는 폴리펩티드를 농축하고 원하는 폴리펩티드를 제약 제제로 제제화하기 위하여, 한외여과 및/또는 투석여과 단계에 적용될 수 있다. 본 발명의 환경적으로 적합한 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법은 제조 공정 동안의 어떠한 단계에서도 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이러스는 HCCF를 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것에 의해 불활성화된다. 본 발명의 다른 방법에서, 바이러스는 포획 풀 또는 회수 생성물 풀을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것에 의해 불활성화된다. 포획 풀 및/또는 회수 생성물 풀은 크로마토그래피, 원심분리, 여과 등과 같은 생성물 정제의 분리 단계에서의 원하는 생성물을 포함하는 공급스트림의 분획이다. 본 발명의 다른 방법에서, 바이러스는 공급스트림을 바이러스 여과 단계에 적용하기 전에 생성물 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것에 의해 불활성화된다. 본 발명의 다른 방법에서, 바이러스는 공급스트림을 바이러스 여과 단계에 적용한 후에 생성물 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것에 의해 불활성화된다.

본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공정 동안 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 유지되면서도, 바이러스 오염물은 효과적으로 불활성화된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 제조 공정 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 변종의 양을 증가시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물 변종은 크기 변종, 하전 변종, 산화 변종, 탈아미드화 변종, 당화 변종, 또는 변경된 글리칸 프로파일을 가지는 변종 중 임의의 1종 이상이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생성물 변종은 크기 변종이다. 크기 변종에는 예를 들면 생성물 분해의 결과로서; 생성물이 원하는 생성물에 비해 더 작은 변종이 포함된다. 다른 예에서, 크기 변종은 예를 들면 원하는 생성물의 응집의 결과로서; 원하는 생성물에 비해 더 크다. 일부 실시양태에서, 생성물 응집은 공급스트림 중 생성물 폴리펩티드 2개 이상의 응집이다. 일부 실시양태에서, 생성물 응집은 생성물 폴리펩티드의 다른 공급스트림 중 폴리펩티드와의 응집이다. 통상의 기술자라면, 크기 변종의 형성을 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들면, 공급스트림 중 생성물 폴리펩티드 크기 변종의 존재는 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 또는 폴리펩티드의 크기가 용이하게 측정되는 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 크기 변종에 있어서의 약 5 %를 초과하는 변화를 초래한다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 크기 변종의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 증가를 초래한다.

본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공정 동안 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 유지되면서도, 바이러스 오염물은 효과적으로 불활성화된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 제조 공정에서의 생성물 변종의 양을 증가시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 변종은 하전 변종이다. 폴리펩티드의 하전 변종에는 폴리펩티드의 산성 변종 및 모 폴리펩티드의 염기성 변종이 포함될 수 있다. 산성 변종, 즉 모 폴리펩티드의 pI 미만인 pI를 가지는 변종의 예에는 하나 이상의 글루타민 및/또는 아스파라긴 잔기가 탈아미드화된 폴리펩티드가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 염기성 폴리펩티드 변종, 즉 모 폴리펩티드의 pI를 초과하는 pI를 가지는 변종의 예에는 아스파르트산 잔기가 숙신이미드 잔기로의 변형을 겪은 변종이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하전 변종에 대하여 폴리펩티드를 분석하기 위한 방법들은 업계에 알져져 있는데; 예를 들면 pH-매개 이온 교환 크로마토그래피 또는 하전 비균질성에 대한 등전 포커싱(isoelectric focusing) (예컨대 icIEF)에 의한다. 일부 예에서, 생성물 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 하전 변종 분석 전의 세제의 첨가 후에, 1종 이상의 크로마토그래피에 적용된다. 예를 들면, 항체는 세제의 처리 후, 하전 변종 분석 (예컨대 pH-매개 이온 교환 크로마토그래피) 전에, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 변종에 있어서의 약 5 %를 초과하는 변화를 초래한다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 변종의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 증가를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 변종은 탈아미드화 변종이다. 상기에서 논의된 바와 같이, 탈아미드화 변종에는 하나 이상의 글루타민 및/또는 아스파라긴 잔기가 탈아미드화된 폴리펩티드가 포함된다. 일부 실시양태에서, 생성물 폴리펩티드의 탈아미드화는 폴리펩티드 하전의 변화를 초래한다. 탈아미드화된 변종에 대하여 폴리펩티드를 분석하기 위한 방법들은 업계에 알려져 있고, 예를 들면 pH-매개 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전 포커싱에 의한다. 일부 예에서, 생성물인 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 탈아미드화 변종 분석 전의 세제의 첨가 후에, 1종 이상의 크로마토그래피에 적용된다. 예를 들면, 항체는 세제의 처리 후, 탈아미드화 변종 분석 (예컨대 pH-매개 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전 포커싱) 전에, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 탈아미드화 변종에 있어서의 약 5 %를 초과하는 변화를 초래한다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 탈아미드화 변종의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만의 증가를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 변종은 산화 변종이다. 산화 변종에는 하나 이상의 산소-반응성 아미노산 잔기, 예컨대 메티오닌, 시스테인 및 티로신이 산화된 폴리펩티드가 포함된다. 일부 실시양태에서, 생성물 폴리펩티드의 산화는 폴리펩티드 하전의 변화를 초래한다. 산화된 변종에 대하여 폴리펩티드를 분석하기 위한 방법들은 업계에 알려져 있다. 예를 들면, LC-질량 분광법에 의해 주어진 폴리펩티드의 산화 수준이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성물인 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 산화 변종 분석 전의 세제의 첨가 후에, 1종 이상의 크로마토그래피에 적용된다. 예를 들면, 항체는 세제의 처리 후, 산화 변종 분석 전에, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 산화 변종에 있어서의 약 5 %를 초과하는 변화를 초래한다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 공급스트림의 총 단백질 중 생성물 산화 변종의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 증가를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 치료용 폴리펩티드 생성물의 당화를 변화시키지 않는다. 당화는 다양한 유형의 공유 부가물 형성, 예를 들면 글루코스-풍부 배양 배지에서 제조하는 동안 또는 저장 동안 배합물 중에 환원당이 존재하는 경우 글루코스 또는 락토스가 리신 잔기의 일차 아민과 반응할 수 있는 당화에 의해 산성 변종을 생성시키기 위한 기작이다 (문헌 [Lyubarskay Y, et al., (2006) Anal Biochem . 348:24-39]; [Huang L, et al., (2005) Anal Chem . 77: 1432-1439]). 당화된 물질의 특성화는 펩티드 맵핑(mapping) 분석, 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 및 직렬 질량 분광법 (MS/MS) 서열분석 기술에 의해 수행될 수 있다. 일부 예에서, 생성물인 치료용 폴리펩티드는 당화된 물질의 특성화 전의 세제의 첨가 후에, 1종 이상의 크로마토그래피에 적용된다. 예를 들면, 당화된 항체는 세제의 처리 후, 당화 분석 (예컨대 LC-MS 또는 MS/MS) 전에, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림 중 바이러스의 불활성화를 위한 환경적으로 적합한 세제의 사용은 치료용 폴리펩티드의 당화를 변경시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 모 폴리펩티드의 상기 당화는 트리톤 X-100을 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 약 5 %를 초과하여 변경되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 당화의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 변화를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100을 사용하는 제조 공정에 비해; 치료용 폴리펩티드 생성물 당화 패턴의 변화를 초래하지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생성물 변종은 당화 변종이다. 글리코실화는 하나 이상의 단당류 단위체가 폴리펩티드에 결합되는 빈번하게 관찰되는 번역-후 변형이다. 세 가지 주요 유형의 글리칸은 N-결합, O-결합 및 글리코실포스파티딜이노시톨이다. 글리코실화된 치료용 폴리펩티드의 예에는 Fc 사슬의 Asn-297에서 단일의 보존된 N-결합 글리코실화 부위가 발견되는 단일클론 항체가 포함된다. 이 부위의 글리칸 구조는 보체 활성화 및 수용체 친화성에서 역할을 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림 중 바이러스의 불활성화를 위한 환경적으로 적합한 세제의 사용은 치료용 폴리펩티드의 당화 패턴을 변경시키지 않는다. 예를 들면, 항체와 같은 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 측정하기 위한 방법들은 업계에 알려져 있는 바; 예를 들면 chem.agilent.com/Library/applications/5990-9774EN.pdf의 월드 와이드 웹을 참조하라. 일부 실시양태에서, 생성물인 치료용 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 당화 패턴 특성화 전의 세제의 첨가 후에, 1종 이상의 크로마토그래피에 적용된다. 예를 들면, 당화된 항체는 세제의 처리 후, 당화 분석 (예컨대 LC-MS 또는 MS/MS) 전에, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 (예컨대 항체)의 상기 당화는 트리톤 X-100을 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 약 5 %를 초과하여 변경되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 당화 패턴의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 변화를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 제조 공정 동안 생성물 수율을 감소시키지 않는다. 예를 들면, 환경적으로 적합한 세제를 사용한 공급스트림의 처리는 바이러스를 불활성화하기 위하여 트리톤 X-100을 사용하는 치료용 폴리펩티드 제조 공정 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 제조 공정에서의 치료용 폴리펩티드의 생성물 수율을 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 (예컨대 항체)의 생성물 수율은 트리톤 X-100을 사용하는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 약 5 %를 초과하여 감소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 생성물 수율의 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만인 감소를 초래한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 바이러스를 불활성화하기 위한 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정 공급스트림의 처리는 제조 공정 동안 공정 불순물 청소를 변경시키지 않는다. 예를 들면, 환경적으로 적합한 세제를 사용한 공급스트림의 처리는 바이러스를 불활성화하기 위하여 트리톤 X-100을 사용하는 치료용 폴리펩티드 제조 공정 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 제조 공정에서의 불순물 청소를 변경시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제의 사용은 제조 공정의 특정 단계, 예컨대 크로마토그래피 단계, 여과 단계, 농축 단계 등에서의 공정 불순물 청소를 변경시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제의 사용은 치료용 폴리펩티드 제조 공정 전체에서의 공정 불순물 청소를 변경시키지 않는다. 공정 불순물에는 CHOP, 핵산, 삼출된 단백질 A, 원하는 폴리펩티드가 아닌 다른 폴리펩티드, 내독소, 바이러스 오염물, 세포 배양 배지 성분, 및 원하는 폴리펩티드의 변종, 단편, 응집체 또는 유도체가 포함된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 여기서 상기 세제는 약 0.01 % 내지 약 10 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 세제는 약 0.3 % 내지 약 1 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 세제는 약 0.3 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 세제는 약 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, 1 %, 2 %, 03 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 또는 10 %를 초과하는 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 유지된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 오염물은 상기 환경적으로 적합한 세제에 의해 효과적으로 불활성화된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공급스트림은 약 1분 내지 약 48시간 동안 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 15분 내지 약 3시간 동안 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상기 세제는 약 0.3 % 내지 약 1 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 1시간 동안 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 중 어느 것을 초과하는 동안 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 1분 내지 5분, 5분 내지 15분, 15분 내지 30분, 30분 내지 45분, 45분 내지 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 9시간, 9시간 내지 12시간, 12시간 내지 16시간, 16시간 내지 20시간, 20시간 내지 24시간, 24시간 내지 30시간, 30시간 내지 36시간, 36시간 내지 42시간 또는 42시간 내지 48시간 중 어느 것 사이 동안 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 유지된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 오염물은 상기 환경적으로 적합한 세제에 의해 효과적으로 불활성화된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공급스트림은 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 10 ℃ 내지 약 25 ℃에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 15 ℃ 내지 약 20 ℃에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 20 ℃에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 대략 주변 온도에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 약 4 ℃, 5 ℃, 10 ℃, 15 ℃, 20 ℃, 25 ℃ 또는 30 ℃에서 세제에 적용된다. 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질은 유지된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 오염물은 상기 환경적으로 적합한 세제에 의해 효과적으로 불활성화된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 환경적으로 적합한 세제를 포함하는 공급스트림은 낮은 혼탁도를 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 세제의 첨가는 예를 들면 세제가 없는 제조 공정 또는 바이러스를 불활성화하기 위하여 트리톤 X-100이 사용되는 제조 공정에 비해; 공급스트림의 혼탁도에 영향을 주지 않는다. 공급스트림의 혼탁도를 측정하는 방법들은 업계에 알려져 있는데; 예를 들면 1-cm 경로 길이 큐벳이 구비된 HP 분광측정기를 사용한다. 혼탁도는 340-360 nm에서의 평균 흡광도로 계산된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림의 혼탁도는 트리톤 X-100을 사용하는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 또는 세제를 사용하지 않는 치료용 폴리펩티드 제조 공정에 비해, 약 5 %를 초과하여 증가되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 예를 들면 세제가 없거나 트리톤 X-100인; 환경적으로 적합한 세제가 없는 제조 공정에 비해, 약 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.1 % 중 어느 것 미만으로 증가된 공급스트림의 혼탁도를 초래한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공급스트림은 수확된 세포 배양액이다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 포획 풀 또는 회수 생성물 풀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 친화성 크로마토그래피 풀이다. 일부 실시양태에서, 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 단백질 A 풀, 단백질 G 풀 또는 단백질 L 풀이다. 일부 실시양태에서, 포획 풀 또는 회수 생성물 풀은 혼합 모드 크로마토그래피 풀이다. 일부 실시양태에서, 포획 풀은 캅토어드히어 풀이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공급스트림은 환경적으로 적합한 세제의 첨가 후, 여과된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 적어도 약 15분 내지 적어도 약 48시간 후에 여과된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 적어도 약 1시간 내지 적어도 약 3시간 후에 여과된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 약 1시간 후에 여과된다. 일부 실시양태에서, 공급스트림은 세제의 첨가 약 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 18시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 후 중 어느 하나에 여과된다. 일부 실시양태에서, 필터는 한외필터 또는 심층 필터이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 공급스트림은 세제의 첨가 후, 크로마토그래피에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (예컨대 양이온 교환 및/또는 음이온 교환), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 중 1종 이상이다. 친화성 크로마토그래피 재료의 예에는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 유도체화된 크로마토그래피 재료가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피 재료의 예에는 프로세프(Prosep)-VA, 프로세프-VA 울트라 플러스(Ultra Plus), 단백질 A 세파로스 패스트 플로우(sepharose fast flow), 티요펄(Tyopearl) 단백질 A, MAbSelect, MAbSelect SuRe 및 MAbSelect SuRe LX가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 재료는 친화성 크로마토그래피 컬럼이다. 상기 중 일부 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 재료는 친화성 크로마토그래피 막이다. 음이온 교환 크로마토그래피 재료의 예에는 포로스(Poros) HQ 50, 포로스 PI 50, 포로스 D, 무스탕(Mustang) Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 양이온 교환 재료의 예에는 무스탕 S, 사르토바인드(Sartobind) S, SO3 모노리스(Monolith), S 세라믹(Ceramic) 하이퍼(Hyper)D, 포로스 XS, 포로스 HS50, 포로스 HS20, SPSFF, SP-세파로스 XL (SPXL), CM 세파로스 패스트 플로우, 캅토(Capto) S, 프락토겔(Fractogel) Se HiCap, 프락토겔 SO3 또는 프락토겔 COO가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. HIC 크로마토그래피 재료의 예에는 토요펄(Toyopearl) 헥실 650, 토요펄 부틸 650, 토요펄 페닐 650, 토요펄 에테르 650, 소스(Source), 리소스(Resource), 세파로스 Hi-트랩(Trap), 옥틸 세파로스, 페닐 세파로스가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 재료의 예에는 HA 울트로겔(Ultrogel) 및 CHT 히드록시아파타이트가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼합 모드 크로마토그래피 재료의 예에는 캅토어드히어, QMA, MEP 하이퍼셀(Hypercel), HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀, 캅토 MMC가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

환경적으로 적합한 세제

본 발명은 환경적으로 적합한 (환경-친화적인) 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 환경적으로 적합한 세제의 사용이 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질에 부정적인 영향을 주지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 세제는 비-이온성 세제 또는 양쪽이온성 세제이다.

일부 실시양태에서, 세제는 약 12 내지 약 15의 친수성 친지성 균형 (HLB)을 가진다. 일부 실시양태에서, HLB는 약 12 내지 약 14, 약 12 내지 약 13, 약 13 내지 약 14, 약 14 내지 약 15, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15 중 어느 하나이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 소포제와의 조합으로써의 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 소포제에 대해서는 업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 상기 소포제는 시메티콘이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알킬 글루코시드이다. 다른 실시양태에서, 상기 알킬 글루코시드는 데실 글루코시드이다. 다른 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알콜 에톡실레이트이다. 또 다른 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 여기서 상기 환경적으로 적합한 세제는 트윈(Tween) 20 (CAS 등록 번호 CAS 9005-64-5), 트윈 80 (CAS 등록 번호 9005-65-6), TBP (CAS 등록 번호 126-43-8), 데실 폴리글루코시드 (CAS 등록 번호 68515-73-1), 데실 β-D 글루코피라노시드 (CAS 등록 번호 58846-77-8), n-데실 β-D 글루코피라노시드 (CAS 등록 번호 59122-55-3), 라우릴 글루코시드 (CAS 등록 번호 110615-47-9), n-옥틸 β-D 글루코피라노시드 (CAS 등록 번호 29836-26-8), 에코서프(EcoSurf) EH-6 (CAS 등록 번호 64366-70-7), 에코서프 EH-9 (CAS 등록 번호 64366-70-7), 에코서프 SA-7 또는 에코서프 SA-9 (CAS 등록 번호 68937-66-6, CAS 등록 번호 69227-22-1, CAS 등록 번호 25322-68-3), 나트서프(Natsurf) 265 (CAS 등록 번호 27252-75-1), 루브리졸(Lubrizol) (CAS 등록 번호 4292-10-8), APG 325N (CAS 등록 번호 132778-08-6), 마콜(Mackol) DG (CAS 등록 번호 110615-47-9), 트리톤(Triton) CG 110 (CAS 등록 번호 68515-73-1) 또는 토모돌(Tomodol) 900 (CAS 등록 번호 68439-46-3)이다.

본 발명 제조 공정의 조건하에서 세제가 환경적으로 적합한지 여부를 결정하는 방법들은 업계에 알려져 있다. 예를 들면, 경제 협력 개발 기구(Organisation for Economic Co-operation and Development)가 화학적 안전성을 시험하는 것에 관한 지침을 제공하고 있다. 이러한 지침은 예를 들면 월드 와이드 웹상의 oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm에서 찾아볼 수 있다. 이러한 지침의 예들을 하기에 개괄한다.

물벼룩 생식 시험-OECD 211

본 시험의 일차적인 목적은 물벼룩(Daphnia magna)의 생식 산출에 대한 화학물질의 효과를 평가하는 것이다. 이를 위하여, 시험 개시시에 24시간령 미만인 젊은 암컷 물벼룩 (모체 동물)을 일련의 농도로 물에 첨가된 시험 물질에 노출시킨다. 시험 기간은 21일이다. 시험 종료시, 살아있는 생성 자손의 총 수를 평가한다. 다른 방식 (예컨대 1일차 자손으로부터의 일 당 동물 당 살아있는 생성 자손의 수가 관찰되었음)으로 모체 동물의 생식 산출이 표현될 수 있기는 하지만, 이는 시험 종료시의 살아있는 생성 자손의 총수에 부가적으로 보고되어야 한다. 다른 OECD 무척추동물 생식 시험 지침에 비해 구체적인 반-정적 시험의 설계로 인하여, 각 개별 모체 동물에 의해 생성되는 살아있는 자손의 수를 계수하는 것도 가능하다. 이는 다른 OECD 무척추동물 생식 시험과 달리, 시험 기간 동안 모체 동물이 갑작스럽게 및/또는 부주의로 사망하는 경우, 그의 자손 생식이 데이터 평가로부터 배제될 수 있도록 한다. 따라서, 노출 반복에서 모체 사망이 발생하는 경우, 사망률이 농도-반응 패턴에 따르는지, 예를 들면 양의 기울기를 가지는 반응 대 시험 물질 농도의 유의성 있는 회귀가 존재하는지 (이를 위해서는 코크란-아미티지(Cochran-Armitage) 추세 검정과 같은 통계 검정이 사용될 수 있음) 여부가 고려되어야 한다. 사망률이 농도-반응 패턴을 따르지 않는 경우라면, 모체 사망을 동반하는 해당 반복은 시험 결과의 분석으로부터 배제되어야 한다. 사망률이 농도-반응 패턴을 따르는 경우, 모체 사망은 시험 물질의 효과로 할당되어야 하며, 그 반복은 분석에서 배제되지 말아야 한다. 즉 잘못된 취급 또는 사고로 갑작스럽게, 또는 시험 물질의 효과와 무관한 설명되지 않는 사건으로 인한 부주의로 모체 동물이 시험 동안 사망하거나, 수컷으로 밝혀진 경우라면, 그 반복은 분석에서 배제된다. 생식 산출에 대한 시험 물질의 독성 효과는 데이터를 비-선형 회귀에 의해 적절한 모델에 피팅함으로써 각각 생식 산출의 x % 감소를 야기하게 되는 농도를 추정하는 ECx로, 또는 대안적으로는 NOEC/LOEC 값 (문헌 [OECD 2006, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris])으로 표현된다. 시험 농도는 바람직하게는 사용된 유효 농도 중 최저치 (예컨대 EC₁₀)를 제외해야 하는데, 이와 같은 값이 외삽이 아닌 내삽에 의해 계산된다는 것을 의미한다.

담수 조류 및 시아노박테리아, 성장 억제 시험-OECD 201

본 시험의 목적은 담수 미세조류 및/또는 시아노박테리아의 성장에 대한 물질의 효과를 측정하는 것이다. 지수적으로 성장하는 시험 생물을 배치 배양으로써 보통 72시간의 기간에 걸쳐 시험 물질에 노출시킨다. 상대적으로 짧은 시험 기간에도 불구하고, 몇 세대에 걸친 효과가 평가될 수 있다.

시스템 반응은 다양한 농도의 시험 물질에 노출된 일련의 조류 배양물 (시험 단위)에서의 성장의 감소이다. 반응은 비노출 대조군 배양물인 반복의 평균 성장과 비교되어 노출 농도의 함수로 평가된다. 독성 효과에 대한 시스템 반응의 완전 발현 (최적 민감도)을 위하여, 배양물은 비성장률의 감소를 측정할 충분한 시간 기간 동안 영양 충분 조건 및 연속 광하에서 제한이 없는 지수 성장에 적용된다.

성장 및 성장 억제는 시간의 함수로서의 조류 바이오매스의 측정으로부터 정량된다. 조류 바이오매스는 부피 당 건조 중량, 예컨대 조류 mg/시험 용액 리터로 정의된다. 그러나, 건조 중량은 측정하기가 어려우므로, 대용 파라미터가 사용된다. 이러한 대용물 중, 세포 계수가 가장 빈번하게 사용된다. 다른 대용 파라미터로는 세포 부피, 형광, 광학 밀도 등이 포함된다. 측정되는 대용 파라미터와 바이오매스 사이의 전환 계수를 알고 있어야 한다.

시험 종료점은 노출 기간 동안의 바이오매스의 대수 증가 (평균 비성장률)로 표현되는 성장의 억제이다. 일련의 시험 용액에서 기록되는 평균 비성장률로부터, 특정 x % 성장률 억제 (예컨대 50 %)를 초래하는 농도가 측정되며, E_rC_x (예컨대 E_rC₅₀)로 표현된다.

이와 같은 지침에서 사용되는 추가적인 반응 변수는 일부 국가에서 구체적인 규제 요건을 충족시키는 데에 필요할 수 있는 수율이다. 그것은 노출 기간 종료시의 바이오매스 빼기 노출 기간 개시시의 바이오매스로 정의된다. 일련의 시험 용액에서 기록되는 수율로부터, 특정 x % 수율 억제 (예컨대 50 %)를 초래하는 농도가 계산되며, E_yC_x (예컨대 E_yC₅₀)로 표현된다.

또한, 최저 관찰 효과 농도 (LOEC) 및 무관찰 효과 농도 (NOEC)가 통계적으로 결정될 수 있다.

물벼룩 종, 급성 부동화 검정-OECD 202

시험 개시시에 24시간령 미만인 젊은 물벼룩을 48시간의 기간 동안 일련 농도의 시험 물질에 노출시킨다. 24시간 및 48시간에 부동화(immobilisation)를 기록하고, 대조군 값과 비교한다. 48시간에서의 EC₅₀을 계산하기 위하여, 결과를 분석한다. 24시간에서의 EC₅₀의 측정은 선택사항이다.

어류, 급성 독성 시험-OECD 203

어류를 바람직하게는 96시간의 기간 동안 시험 물질에 노출시킨다. 24, 48, 72 및 96시간에 사망률을 기록한다.

활성화 슬러지 , 호흡 억제 시험 (탄소 및 암모늄 산화)-OECD 209

산소 전극을 포함하는 봉입 셀 내에서 3시간의 접촉 시간 후 합성 오수가 공급된 활성화된 슬러지 샘플의 호흡률을 측정한다. 실제 노출 시나리오를 고려하면, 더 긴 접촉 시간이 적절할 수 있다. 시험 물질이 예컨대 가수분해를 통하여 비생물적으로 빠르게 분해되거나 휘발성인 경우, 그리고 농도가 적정하게 유지될 수 없는 경우에는 또한 더 짧은 노출 기간, 예컨대 30분이 사용될 수 있다. 노출일에는 적합한 참조 물질을 사용하여 각 활성화 슬러지 배치의 민감성을 점검해야 한다. 본 시험은 통상적으로 시험 물질의 EC_x (예컨대 EC₅₀) 및/또는 무-관찰 효과 농도 (NOEC)를 측정하는 데에 사용된다.

1-단계 질화 세균에 의한 암모늄의 니트라이트로의 산화의 특이적 억제제인 N-알릴티오우레아의 부재 및 존재하에서의 산소 흡수율의 측정에 의해, 유기 탄소를 산화시키는 미생물에 의한 산소 흡수의 억제는 암모늄을 산화시키는 미생물에 의한 것과 별도로 표현될 수 있다. 이와 같은 경우, 산소 흡수율의 백분율 억제는 특이적 억제제 N-알릴티오우레아의 존재 및 부재 양자하에서의 시험 물질 존재하 산소 흡수율의 시험 물질을 함유하지 않는 상응 대조군의 평균 산소 흡수율과의 비교에 의해 계산된다.

비생물적 과정으로부터 야기되는 임의의 산소 흡수는 활성화 슬러지를 뺀, 시험 물질, 합성 오수 매체 및 물의 혼합물에서 비율을 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다.

즉석 생분해성-OECD 301

무기 매체 중 시험 물질의 용액 또는 현탁액을 접종하고, 암흑 또는 산란광(diffuse light)하에서 호기성 조건으로 인큐베이팅한다. 접종물로 인한 시험 용액 중 DOC의 양은 시험 물질로 인한 유기 탄소의 양에 비해 가능한 한 낮게 유지되어야 한다. 화학물질 존재하에서의 세포의 내인성 활성이 내인성 대조군에서의 것과 정확하게 일치하지는 않을 것이나, 접종물은 포함하나 시험 물질은 없는 병행 바탕을 전개함으로써 접종물의 내인성 활성에 대한 공제가 이루어진다. 절차의 운용을 점검하기 위하여, 참조 화합물을 병행 전개한다.

일반적으로, 분해 후 DOC, CO₂ 생성 및 산소 흡수율과 같은 파라미터들의 측정이 이어지는데, 측정은 생분해 개시 및 종료의 확인을 가능케 하기에 충분히 빈번한 간격으로 수행된다. 자동 호흡측정기를 사용하므로, 측정은 연속적이다. 때로는 DOC가 또 다른 파라미터에 부가적으로 측정되지만, 시험 개시 및 종료시에는 보통 이것만이 수행된다. 시험 물질의 일차적 분해를 평가하고 형성되는 임의 중간 물질의 농도를 측정하기 위하여, 특정 화학물질 분석이 사용될 수도 있다.

보통, 시험은 28일 동안 지속된다. 그러나, 28일 전에, 즉 생분해 곡선이 3회 이상 측정 동안 편평상태에 도달하자 마자 시험이 종료될 수도 있다. 곡선이 생분해는 개시되었으나 28일까지 편평상태는 도달되지 않았음을 나타내는 경우에는 28일을 지나 시험이 연장될 수도 있지만, 이와 같은 경우 화학물질은 용이하게 생분해성인 것으로 분류되지 않게 된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 여기서 상기 세제는 퍼옥시드를 포함하거나 형성하지 않는다. 세제의 퍼옥시드 함량을 측정하는 방법들은 업계에 알려져 있다. 예를 들면, EMD 밀리포어(Millipore) 비색 퍼옥시드 시험이 세제의 퍼옥시드 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세제 중 퍼옥시드의 농도가 약 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm 또는 0.1 ppm 중 어느 것 미만인 경우, 세제에 퍼옥시드는 없는 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 환경적으로 적합한 세제를 사용한 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공하는 바, 여기서 상기 세제는 옥틸페놀을 포함하거나 형성하지 않는다. 옥틸페놀은 트리톤 X-100의 분해 생성물일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 폐수 시스템으로 방출될 공급스트림은 약 0.1 ㎍/L, 0.09 ㎍/L, 0.08 ㎍/L, 0.07 ㎍/L, 0.06 ㎍/L, 0.05 ㎍/L, 0.04 ㎍/L, 0.03 ㎍/L, 0.02 ㎍/L 및 0.01 ㎍/L 중 어느 것 미만인 농도로 옥틸페놀을 포함한다. 통상의 기술자라면, 폐기물이 담수 아니면 해수로 방출되는지 여부에 따라 폐수 시스템에 대한 세제의 환경적 영향이 다를 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 폐수 시스템으로 방출될 공급스트림은 담수 방출의 경우 약 0.1 ㎍/L 미만, 그리고 해수 방출의 경우 약 0.01 ㎍/L 미만인 농도로 옥틸페놀을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 치료용 폴리펩티드 제조 공정 후 폐기스트림 중 세제의 예측 환경 농도 (PEC)는 환경 중 수용 수체로 방출되는 폐기물 중 세제의 예측 농도이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 예측 무-영향 농도 (PNEC)는 예를 들면 수용 담수 및/또는 해수의 생물상에 대한; 유해 효과 없이 환경에 방출되기에 안전한 폐기물 중 세제의 예측 농도이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, PEC는 PNEC 미만이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, PEC는 PNEC의 약 0.5-배, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배 또는 100-배 중 어느 하나를 초과한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 환경적으로 적합한 세제는 계면활성제 및 1종 이상의 추가적인 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 계면활성제 및 1종 이상의 킬레이팅제 및/또는 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.

바이러스의 불활성화

본 발명은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것을 포함하는, 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법을 제공한다. 상기 바이러스는 본원에서 상술되는 임의의 바이러스 (예컨대 외피보유 바이러스)일 수 있으며, 상기 공급스트림은 본원에서 상술되는 임의의 공급스트림, 예컨대 수확된 세포 배양액 (HCCF), 포획 풀 또는 회수 생성물 풀일 수 있다. 공급스트림에서 불활성화되는 바이러스는 생성물 (예컨대 폴리펩티드, 세포, 조직)의 제조와 산업적으로 관련되어 있는 임의의 바이러스일 수 있다. 산업적으로 관련되어 있는 바이러스에 대해서는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 산업적으로 관련된 바이러스의 비-제한적인 예에는 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 플라비바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 간염 바이러스, 오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 라브도바이러스 또는 토가바이러스가 포함된다. 본 발명의 임의 변형에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아프리카 돼지 열병-주 바이러스, 아레나바이러스, 아르테리바이러스, 아스트로바이러스, 바큘로바이러스, 바드나바이러스, 바르나바이러스, 비르나바이러스, 브로모바이러스, 부니야바이러스, 칼리시바이러스, 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카울리모바이러스, 시르코바이러스, 클로스테로바이러스, 코모바이러스, 코로나바이러스, 코트리코바이러스, 시스토바이러스, 델타바이러스, 디안토바이러스, 에나모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 푸로바이러스, 푸셀로바이러스, 제미니바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 호르데이바이러스, 히포바이러스, 이데아오바이러스, 이노바이러스, 이리도바이러스, 레비바이러스, 리포트릭스바이러스, 루테오바이러스, 마클로모바이러스, 마라피보바이러스, 마이크로바이러스, 미오바이러스, 네크로바이러스, 노다바이러스, 오르소믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르티티바이러스, 파르보바이러스, 피코드나바이러스, 피코르나바이러스, 플라마바이러스, 포도바이러스, 폴리드나바이러스, 포텍스바이러스, 포티바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 라브도바이러스, 리지디오바이러스, 세퀘바이러스, 시포바이러스, 소베모바이러스, 텍티바이러스, 테누이바이러스, 테트라바이러스, 토바마바이러스, 토브라바이러스, 토가바이러스, 톰부스바이러스, 토티바이러스, 트리코바이러스, 티모바이러스 및 움브라바이러스로 구성되는 군에서 선택된다. 변형에서, 본 발명은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것을 포함하는, 공급스트림에서의 바이러스성분 인자(subviral agent) 불활성화 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 바이러스성분 인자는 바이로이드 또는 위성체(satellite)이다. 또 다른 변형에서, 본 발명은 공급스트림을 환경적으로 적합한 세제에 적용하는 것을 포함하는, 공급스트림에서의 바이러스-유사 인자 불활성화 방법을 제공한다.

공급스트림에서의 바이러스의 불활성화는 업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화는 log 감소 값 (LRV)로 표현된다. LRV는 하기와 같이 계산하였다:

LRV = log₁₀ × (세제를 사용한 처리 후 공급스트림 중 총 바이러스 / 세제를 사용한 처리 전 공급스트림 중 총 바이러스).

본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 환경적으로 적합한 세제의 LRV는 약 1을 초과한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 환경적으로 적합한 세제의 LRV는 약 4를 초과한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 환경적으로 적합한 세제의 LRV는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 어느 하나를 초과한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 공급스트림 중 환경적으로 적합한 세제의 LRV는 약 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 또는 5 내지 6 중 어느 하나 사이이다.

바이러스 활성을 측정하는 방법들은 업계에 알려져 있다. 예로는 TCID50 검정 (즉 접종된 세포 배양물 중 50 %에서 병리학적 변화를 생성시키게 되는 조직 배양 감염 투여량 중앙값의 측정) 및 플라크 검정이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 알려져 있는 방법으로는 예를 들면 세포 성장 전환을 야기하는 능력을 가지는 비-플라크 형성 바이러스의 생물학적 활성의 역가를 측정하는 데에 사용될 수 있는 전환 검정; 또는 항체 염색법의 사용에 의존하여 단층의 감염된 세포 내에서 바이러스 항원을 검출하는 형광-초점 검정; 또는 단층 세포는 감염시키지 않는 바이러스를 포함한 많은 바이러스의 역가를 측정하는 데에 사용될 수 있는 종료점 희석 검정 (플라크 검정에 대한 대안으로서); 또는 리버스 트랜스크립타제 또는 바이러스 프로테아제와 같은 바이러스-코딩 효소가 측정되는 바이러스 효소 검정이 포함될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드

본원에서 상술되는 제조 공정 및 방법에 의해 생성되며 본원에서 제공되는 조성물 중에 존재하는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 생성시키는 데에 사용되는 숙주 세포에 대하여 동종유래일 수 있거나, 또는 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포에 의해 생성되는 인간 단백질 또는 포유동물 세포에 의해 생성되는 효모 폴리펩티드와 같이 이용되는 숙주 세포에 대하여 그것이 이종유래, 즉 외래성임을 의미하는 외인성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 뮤린 하이브리도마 세포 또는 뮤린 골수종 세포이다. 일 변형에서, 상기 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 바로 배지로 분비되는 포유동물 폴리펩티드 (예컨대 항체)이다. 또 다른 변형에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 배지로 방출된다.

숙주 세포에서 발현가능한 어떠한 폴리펩티드도 본 개시에 따라 생성될 수 있으며, 제공되는 조성물 중에 존재할 수 있다. 폴리펩티드는 숙주 세포에 대하여 내인성인 유전자로부터, 또는 유전자 조작을 통하여 숙주 세포에 도입된 유전자로부터 발현될 수 있다. 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 것일 수 있거나, 또는 대안적으로 사람의 손에 의해 조작되거나 선택된 서열을 가질 수 있다. 조작된 폴리펩티드는 자연에서 개별적으로 발생하는 다른 폴리펩티드 분절들로부터 조립될 수 있거나, 또는 자연적으로 발생하지는 않는 하나 이상의 분절을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩티드는 종종 유익한 생물학적 또는 화학적 활성을 기준으로 선택되게 된다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 제약 또는 상업적으로 관련되어 있는 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제, 시토카인, Fc 융합 폴리펩티드, 항원, 면역부착소 등을 발현시키는 데에 사용될 수 있다.

다양한 폴리펩티드들이 본원에서 제공되는 방법에 따라 생성될 수 있으며, 본원에서 제공되는 조성물 중에 존재할 수 있다. 세균 폴리펩티드의 예로는 예를 들면 알칼리성 포스파타제 및 β-락타마제가 포함된다. 포유동물 폴리펩티드의 예로는 레닌, 인간 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화인자, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; 란테스(RANTES) (보통 T-세포가 발현 및 분비되는 조절하 활성화); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러관-억제 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자의 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 향신경 인자 예컨대 골-유래 향신경 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-베타; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파, 및 TGF-.베타.1, TGF-.베타.2, TGF-.베타.3, TGF-.베타.4 또는 TGF-.베타.5를 포함한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 예를 들면 AIDS 외피의 단백질과 같은 바이러스 항원; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레싱; 조절 단백질; 항체; 및 상기-열거된 폴리펩티드들 중 어느 것의 단편과 같은 분자들이 포함된다.

공급재료는 1종 이상의 단백질을 함유하게 되는데, 일 실시양태에서는 항체이다. 기본적인 4-사슬 항체 단위는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 지칭되는 추가적인 폴리펩티드와 함께 기본적 이종사량체 단위 5개로 구성되며 그에 따라 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 분비되는 IgA 항체는 중합되어 J 사슬과 함께 기본 4-사슬 단위 2-5개를 포함하는 다가의 조립체를 형성할 수 있음). IgG의 경우, 4-사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L 사슬은 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 동형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술피드 가교를 가지고 있다. 각 H 사슬은 N-말단의 가변 도메인 (VH)에 이어지는 α 및 γ 사슬의 경우 3개의 불변 도메인 (CH), 그리고 μ 및 ε 동형의 경우 4개의 CH 도메인을 가진다. 각 L 사슬은 N-말단의 가변 도메인 (VL)에 이어지는 그의 타 말단의 불변 도메인 (CL)을 가진다. VL은 VH와 함께 정렬되며, CL는 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 정렬된다. 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에서는 특정 아미노산 잔기들이 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍형성은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 여러 종류 항체들의 구조 및 특성에 대해서는 예를 들면 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조하라.

임의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 및 람다로 지칭되는 2종의 분명하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다. 그의 중쇄 (CH) 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 여러 종류 또는 동형으로 할당될 수 있다. 하기 5가지 종류의 이뮤노글로불린이 존재한다: 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지명된 중쇄를 가지는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 상기 γ 및 α 종류는 추가적으로 CH 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 미미한 차이를 기준으로 아류로 나누어지는데, 예를 들면 인간은 하기의 아류들을 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.

항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편들 및 잔류 "Fc" 단편을 생성시키는데, 상기 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 H 사슬 (VH)의 가변 영역 도메인 및 일 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께인 전체 L 사슬로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가로써, 다시 말하자면 그것이 단일의 항원-결합 부위를 가진다. 항체의 펩신 처리는 약 2가의 항원-결합 활성을 가지며 아직 항원과 가교-결합할 수 있는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편들에 해당하는 단일의 커다란 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상 시스테인을 포함한 추가적인 수개의 잔기들을 가지는 것만큼 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유로운 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래는 그 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편들의 쌍으로 생성되었었다. 항체 단편들의 다른 화학적 연계에 대해서도 알려져 있다.

Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 양 H 사슬의 카르복시-말단 부분들을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되는데, 이 영역은 소정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이기도 하다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이와 같은 단편은 밀접한 비-공유 결합 상태에 있는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 2개 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화성이기는 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.

"sFv" 또는 "scFv"로 축약되기도 하는 "단일-사슬 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 추가적으로 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하는 것을 가능케 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다. sFv의 고찰을 위해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press), 1995]을 참조하라.

"이분절체"라는 용어는 V 도메인들의 사슬간 쌍형성은 달성되나 사슬내 쌍형성은 달성되지 않음으로써 2가의 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 가지는 단편을 초래하도록, VH 및 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 사용하여 sFv 단편 (선행 단락 참조)을 구성하는 것에 의해 제조되는 소형 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 이분절체는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬상에 존재하는 2개 "교차형" sFv 단편의 이종이량체이다. 이분절체에 대해서는 예를 들면 EP 404,097호; WO 93/11161호; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더 상세하게 기술되어 있다.

비-인간 (예컨대 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유래하는 최소한의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분에 경우, 인간화된 항체는 수용자 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 유래 잔기에 의해 대체되어 있는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가적으로 개선하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 이뮤노글로불린 서열의 것인 하나 이상, 통상적으로는 2개 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하게 된다. 인간화된 항체는 임의적으로는 또한 통상적으로 인간 이뮤노글로불린의 것인 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부 이상을 포함하게 된다. 추가적인 세부사항에 대해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992).Abs, etc.]을 참조하라.

폴리펩티드의 생성 방법

세포

제공되는 방법 및 조성물은 동물, 효모 또는 곤충 세포를 포함하여, 본원에서 기술되는 배지 중에서의 폴리펩티드 (예컨대 항체)의 성장 및/또는 생성에 적합한 어떠한 세포도 사용할 수 있다. 일 측면에서, 상기 방법 및 조성물의 세포는 세포 배양 및 폴리펩티드 발현에 적합한 임의의 포유동물 세포 또는 세포 유형이다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법 (예컨대 세포 배양 배지에서의 바이러스 불활성화 방법) 및 조성물은 동물 세포를 포함한 어떠한 적합한 유형의 세포도 사용할 수 있다. 일 측면에서, 상기 방법 및 조성물은 포유동물 세포를 사용한다. 상기 방법 및 조성물은 하이브리도마 세포를 사용할 수도 있다. 일 변형에서, 상기 포유동물 세포는 항체, 항체 단편 (리간드-결합 단편 포함) 및 키메라 항체와 같은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성의 단리된 핵산에 의해 형질전환된 비-하이브리도마 포유동물 세포이다. 일 변형에서, 상기 방법 및 조성물은 인간 망막모세포 (PER.C6 (크루셀(CruCell) 사, 네덜란드 레이덴 소재); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 주 (현탁액 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버펄로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 주 (Hep G2)로 구성되는 군에서 선택되는 포유동물 세포를 사용한다. 특정 변형에서, 상기 방법 및 조성물은 CHO 세포를 사용한다. 특정 변형에서는, CHO 세포주의 배양, 및 CHO 세포주로부터의 폴리펩티드 (예컨대 항체)의 발현이 사용된다. 상기 폴리펩티드 (예컨대 항체)는 폴리펩티드가 단리 및/또는 정제될 수 있는 본원에서 개시되는 배지로 분비될 수 있거나, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 본원에서 개시되는 배지로 폴리펩티드가 방출될 수 있다.

재조합 척추동물 세포 배양에서의 해당 폴리펩티드 합성에 준용하기에 적합한 방법, 벡터 및 숙주 세포에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 예를 들면 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; [Levinson et al.]; EP 117,060호; 및 EP 117,058호에 기술되어 있다. 폴리펩티드의 포유동물 세포 배양 발현에 특히 유용한 플라스미드는 pRK5 (EP 공개 제307,247호) 또는 pSVI6B (1991년 6월 13일자 PCT 공개 제WO 91/08291호)이다.

숙주 세포는 발현 또는 클로닝 벡터에 의해 형질전환된 후, 경우에 따라 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하고 있는 유전자를 증폭하기 위하여 변형된 영양 배지 중에서 배양된다. 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 칼슘 포스페이트 침전법 또는 문헌 [Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193)]의 리포펙타민.TM. (기브코(Gibco) BRL)법이 바람직하다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면에 대해서는 업계에 알려져 있으며, 예를 들면 악셀(Axel)의 1983년 8월 16일자 공고 U.S. 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키기 위한 다양한 기술들의 경우, 예를 들면 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology (1989)], [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조하라.

상기 방법 및 조성물은 또한 세포 배양물에서 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마의 사용도 포괄한다. 단일클론 항체는 면역화된 동물로부터 면역 세포 (통상적으로 지라 세포 또는 림프절 조직 유래 림프구)를 회수한 후, 통상적인 방식, 예컨대 골수종 세포와의 융합에 의해, 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) (EB)-바이러스 형질전환에 의해 세포를 고정하고, 원하는 항체를 발현하는 클론을 스크리닝하는 것으로써 제조된다. 원래 문헌 [Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976)]에 의해 기술되었으며 문헌 [Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)]에서도 기술된 하이브리도마 기술이 많은 특이적 항원들에 대하여 고농도의 단일클론 항체를 분비하는 혼성 세포주를 생성시키는 데에 광범위하게 적용되고 있다.

폴리펩티드

본원에서 상술되는 조성물 (예컨대 세포) 및 방법에 의해 생성되며 본원에서 제공되는 조성물 중에 존재하는 폴리펩티드는 숙주 세포에 대하여 동종유래일 수 있거나, 또는 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포에 의해 생성되는 인간 단백질 또는 포유동물 세포에 의해 생성되는 효모 폴리펩티드와 같이 이용되는 숙주 세포에 대하여 그것이 이종유래, 즉 외래성임을 의미하는 외인성일 수 있다. 일 변형에서, 상기 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 바로 배지로 분비되는 포유동물 폴리펩티드 (예컨대 항체)이다. 또 다른 변형에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 배지로 방출된다.

일 변형에서, 폴리펩티드는 사슬 길이가 더 높은 수준의 삼차 및/또는 사차 구조를 생성시키기에 충분한 아미노산 서열이다. 일 측면에서, 폴리펩티드는 약 5-20 kD 이상, 대안적으로는 적어도 약 15-20 kD, 바람직하게는 약 20 kD이상의 분자량을 가지게 된다.

숙주 세포에서 발현가능한 어떠한 폴리펩티드도 본 개시에 따라 생성될 수 있으며, 제공되는 조성물 중에 존재할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 숙주 세포에 대하여 내인성인 유전자로부터, 또는 유전자 조작을 통하여 숙주 세포에 도입된 유전자로부터 발현될 수 있다. 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 것일 수 있거나, 또는 대안적으로 사람의 손에 의해 조작되거나 선택된 서열을 가질 수 있다. 조작된 폴리펩티드는 자연에서 개별적으로 발생하는 다른 폴리펩티드 분절들로부터 조립될 수 있거나, 또는 자연적으로 발생하지는 않는 하나 이상의 분절을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩티드는 종종 유익한 생물학적 또는 화학적 활성을 기준으로 선택되게 된다. 본 발명 폴리펩티드의 예는 상기에 기술되어 있다.

예를 들어, 본 발명은 임의의 제약 또는 상업적으로 관련되어 있는 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현시키는 데에 사용될 수 있다.

세포 성장 및 폴리펩티드 생성

일반적으로, 세포는 세포 성장, 유지 및/또는 폴리펩티드 생성 중 어느 것을 촉진하는 1종 이상의 조건하에서, 본원에서 기술되는 세포 배양 배지 중 어느 것과 조합 (접촉)된다. 세포를 성장시키고 폴리펩티드를 생성시키는 방법은 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 용기 (생물반응기)를 배양하는 것을 필요로 한다. 배양 용기는 유리, 플라스틱 또는 금속을 포함하여, 세포를 배양하는 데에 적합한 어떠한 재료로도 구성될 수 있다. 통상적으로, 배양 용기는 1 리터 이상이게 되며, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000 리터 또는 그 이상일 수 있다. 배양 과정 동안 조정될 수 있는 배양 조건에는 pH 및 온도가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

세포 배양은 일반적으로 세포 배양물의 생존, 성장 및 생육성 (유지)에 도움이 되는 조건하에서 개시 성장 단계(initial growth phase)로 유지된다. 정확한 조건은 세포 유형, 세포가 유래하였던 생물체, 그리고 발현되는 폴리펩티드의 특성 및 특징에 따라 달라지게 된다.

개시 성장 단계에서의 세포 배양의 온도는 일차적으로는 세포 배양물이 생존가능하게 유지되는 온도 범위를 기준으로 선택되게 된다. 예를 들면, 개시 성장 단계 동안, CHO 세포는 37 ℃에서 잘 성장한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25 ℃ 내지 42 ℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 약 35 ℃ 내지 40 ℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 통상의 기술자라면, 세포의 요구 및 생성 요건에 따라 세포를 성장시키기 위한 적절한 온도 또는 온도들을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시양태에서, 개시 성장 단계의 온도는 단일의 일정한 온도로 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 개시 성장 단계의 온도는 일정한 온도 범위 내에서 유지된다. 예를 들면, 온도는 개시 성장 단계 동안 꾸준히 증가 또는 감소될 수 있다. 대안적으로, 온도는 개시 성장 단계 동안 다양한 시점에 별개의 양만큼 증가 또는 감소될 수 있다. 통상의 기술자라면, 단일 온도가 사용되어야 하는지 또는 다중 온도가 사용되어야 하는지 여부, 그리고 온도가 꾸준하게 또는 별개의 양만큼 조정되어야 하는지 여부를 결정할 수 있을 것이다.

세포는 더 크거나 더 적은 양의 시간 동안 개시 성장 단계로 성장될 수 있다. 일 변형에서, 세포는 교란되지 않고 성장하는 것이 가능할 경우 세포가 결국 도달하게 되는 주어진 최대 생존가능 세포 밀도의 백분율인 생존가능 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 기간 동안 성장된다. 예를 들면, 세포는 최대 생존가능 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 %인 원하는 생존가능 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 기간 동안 성장될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 정해진 시간 기간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들면, 세포 배양물의 개시 농도, 세포가 성장되는 온도, 및 세포의 고유 성장 속도에 따라, 세포는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 이상 동안 성장될 수 있다. 일부 경우, 세포는 1개월 이상 동안 성장하도록 허용될 수도 있다.

세포 배양물은 산소화 및 세포에 대한 영양소의 분산을 증가시키기 위하여, 개시 배양 단계 동안 교반 또는 진탕될 수 있다. 본 발명에 따라, 통상의 기술자라면, 비제한적으로 pH, 온도, 산소화 등을 포함하여, 개시 성장 단계 동안 소정의 생물반응기 내부 조건을 제어하거나 조절하는 것이 유익할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, pH는 적절한 양의 산 또는 염기를 공급하는 것에 의해 조절될 수 있으며, 산소화는 업계에 잘 알려져 있는 살포 장치를 사용하여 조절될 수 있다.

개시 배양 단계는 성장 단계로써, 재조합 세포의 성장을 강화하여 시드 트레인(seed train)을 생성하도록 배치 세포 배양 조건이 변형된다. 성장 단계는 일반적으로 세포가 대체적으로 빠르게 분할되는, 예컨대 성장하는 지수 성장의 기간을 지칭한다. 이와 같은 단계에는, 보통 1 내지 4일, 예컨대 1, 2, 3 또는 4일의 시간 기간 동안, 그리고 세포 성장이 최적이 되는 조건하에서 세포가 배양된다. 숙주 세포 성장 주기의 측정은 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 의해 특정 숙주 세포에 대하여 측정될 수 있다.

성장 단계에서는, 기본 배양 배지 및 세포가 배치의 배양 용기에 공급될 수 있다. 일 측면에서, 배양 배지는 약 5 % 미만 또는 1 % 미만 또는 0.1 % 미만의 혈청 및 다른 동물-유래 단백질을 함유한다. 그러나, 혈청 및 동물-유래 단백질은 원할 경우 사용될 수 있다. 특정 변형에서, 기본 배지는 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9 사이의 pH를 가진다. 일 측면에서는, 기본 배지의 pH가 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 전에 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9 사이로 낮추어진다. 다른 측면에서, 배지의 pH는 이후 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계를 위하여 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2 사이로 조절된다. 다른 측면에서, 배지의 pH는 이후 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계를 위하여 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2 사이로 조절된다. 또 다른 특정 변형에서, 기본 배지는 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 배지 중 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 전에 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 다른 측면에서, 배지 중 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이후 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 동안 폴리펩티드 생성에 충분한 수준으로 상승된다. 또 다른 변형에서, 기본 배지는 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9 사이의 pH, 및 약 10 mM 미만의 포스페이트 및 칼슘 총량을 가진다. 일 측면에서는, 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 전에 바이러스를 불활성화하기 위하여 HTST 처리 동안 기본 배지의 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9 사이로 낮추어지며, 약 10 mM 미만으로 포스페이트 및 칼슘 총량을 포함한다. 다른 측면에서, 이후 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 동안 기본 배지의 pH는 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2 사이로 조절되며, 배지 중 포스페이트 및 칼슘의 총량은 폴리펩티드 생성에 충분한 수준으로 상승된다. 임의의 측면에서, 기본 배지는 화학적으로 한정된 배지이다. 임의의 측면에서, 기본 배지는 화학적으로 한정되지 않는 배지이다. 아미노산, 비타민, 미량 원소 및 기타 배지 성분들이 유럽 특허 EP 307,247호 또는 U.S. 특허 제6,180,401호에 열거되어 있는 범위의 1 또는 2배로 사용될 수 있는 바, 이들 문헌은 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.

대안적으로, Ham's F10 (시그마(Sigma) 사), 최소 필수 배지 ([MEM], 시그마 사), RPMI-1640 (시그마 사) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ([DMEM], 시그마 사)와 같은 시중에서 구입가능한 배지들이 동물 세포를 배양하는 데에 적합하며, 본원에서 상술되는 바와 같은 화학적으로 한정된 배지 성분들이 (예컨대 제공되는 바와 같은 키트의 사용에 의해) 보충될 수 있다. 또한, 모두의 개시내용이 전체적으로 본원에 참조로써 개재되는 문헌 [Ham and Wallace, Meth . Enz ., 58:44 (1979)], [Barnes and Sato, Anal. Biochem ., 102:255 (1980)], U.S. 특허 제4,767,704호; 4,657,866호; 4,927,762호; 또는 4,560,655호; WO 90/03430호; WO 87/00195호; U.S. 특허 제Re.30,985호; 또는 U.S. 특허 제5,122,469호에 기술되어 있는 배지들 중 어느 것이 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있으며, 각각 본원에서 상술되는 바와 같은 화학적으로 한정된 배지 성분들이 (예컨대 제공되는 바와 같은 키트의 사용에 의해) 보충될 수 있다.

본원에서 제공되는 임의의 배지에는 또한 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 미량 금속 (예컨대 철 및 구리), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물들이 통상의 기술자에게 알려져 있을 적절한 농도로 포함될 수도 있다.

그의 성장의 특정 시점에서, 세포는 생성 단계에서의 배양 개시시에 배양 배지를 접종하기 위한 접종물을 형성할 수 있다. 대안적으로, 생성 단계는 성장 단계로 계속될 수 있다. 세포 성장 단계 후에는 일반적으로 폴리펩티드 생성 단계가 이어진다.

폴리펩티드 생성 단계 동안, 세포 배양은 세포 배양물의 생존 및 생육성에 도움이되며 원하는 폴리펩티드의 발현에 적절한 제2의 배양 조건 세트 (성장 단계와 비교하였을 때의 것)하에서 유지될 수 있다. 예를 들면, 이후의 생성 단계 동안, CHO 세포는 25 ℃ 내지 35 ℃ 범위 이내에서 재조합 폴리펩티드 및 단백질을 잘 발현한다. 세포 밀도 또는 생육성을 증가시키거나 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위하여, 다중의 별개 온도 이동이 사용될 수도 있다. 본원에서 사용될 때, "폴리펩티드 생성 단계" 또는 "단백질 발현 단계"라는 용어는 세포 배양물이 생물학적 약물 생성물 (예컨대 폴리펩티드)를 생성하는 세포 배양 단계를 지칭할 수 있다.

세포는 이후의 생성 단계에서 원하는 세포 밀도 또는 생성 역가에 도달할 때까지 유지될 수 있다. 일 실시양태에서, 세포는 재조합 폴리펩티드의 역가가 최대에 도달할 때까지 이후의 생성 단계에서 유지된다. 다른 실시양태에서는, 이 시점 전에 배양물이 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포는 최대 생존가능 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 %인 생존가능 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 기간 동안 유지될 수 있다. 일부 경우, 생존가능 세포 밀도를 최대에 도달하도록 한 다음 배양물을 수확하기 전에 소정 수준까지 생존가능 세포 밀도를 저하시키는 것이 바람직할 수도 있다.

소정의 경우에는, 이후의 폴리펩티드 생성 단계 동안 고갈되었거나 세포에 의해 대사된 영양소 또는 기타 배지 성분들을 세포 배양물에 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 예를 들면, 세포 배양의 모니터링 동안 고갈된 것으로 관찰되는 영양소 또는 기타 배지 성분들을 세포 배양물에 보충하는 것이 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 이후의 생성 단계 전의 1종 이상의 고갈되는 성분에는 칼슘, 포스페이트, 철 및 구리가 포함된다. 일부 측면에서, 보충되는 배지 성분에는 칼슘, 포스페이트, 철 및 구리가 포함된다. 대안적으로 또는 더하여, 이후의 폴리펩티드 생성 단계 전에 세포 배양물을 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 일부 측면에서, 세포 배양물에는 이후의 생성 단계 전에 칼슘, 포스페이트, 철 및 구리를 포함한 1종 이상의 배지 성분이 보충된다. 비-제한적인 예로써, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 미량 금속 (예컨대 철 및 구리), 아미노산, 지질, 또는 글루코스 또는 기타 에너지원을 세포 배양물에 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "공급 배지" 또는 "생성 배지"라는 용어는 세포 배양의 폴리펩티드 생성 단계 동안 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다.

IV. 대표적인 실시양태

1. 공급스트림을 세제에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세제는 환경적으로 적합한 것인, 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서의 바이러스 불활성화 방법.

2. 트리톤 X-100을 사용하는 방법 또는 세제가 없는 방법과 비교하여 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질을 유지하는, 실시양태 1의 방법.

3. 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질이 생성물 공급스트림에서의 총 폴리펩티드 중 생성물 변종에 있어서의 5 % 이하의 변화를 결과하는, 실시양태 2의 방법.

4. 생성물 변종이 생성물 공급스트림에서의 총 폴리펩티드 중에서 5 %를 초과하여 증가하지는 않는, 실시양태 3의 방법.

5. 생성물 변종이 크기 변종, 하전 변종, 산화 변종, 탈아미드화 변종, 당화 변종, 또는 변경된 글리칸 프로파일을 가지는 변종인, 실시양태 3 또는 4의 방법.

6. 생성물 변종이 산성 및/또는 염기성 생성물 변종인, 실시양태 3 내지 5 중 어느 하나의 방법.

7. 공급스트림을 세제에 적용하는 것이 폴리펩티드의 단편화를 약 5 %를 초과하여 증가시키지는 않는, 실시양태 1-6 중 어느 하나의 방법. 이는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 측정될 수 있다.

8. 공급스트림을 세제에 적용하는 것이 공급스트림의 응집을 약 5 %를 초과하여 증가시키지는 않는, 실시양태 1-7 중 어느 하나의 방법. 이는 SEC에 의해 측정될 수 있다.

9. 공급스트림을 세제에 적용하는 것이 제조 공정에서의 폴리펩티드의 수율을 약 5 %를 초과하여 감소시키지는 않는, 실시양태 1-8 중 어느 하나의 방법. 이는 SEC에 의해 측정될 수 있다.

10. 세제가 약 0.01 % 내지 약 10 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가되는, 실시양태 1-9 중 어느 하나의 방법.

11. 세제가 약 0.3 % 내지 약 1 %의 최종 농도로 공급스트림에 첨가되는, 실시양태 1-10 중 어느 하나의 방법.

12. 공급스트림이 적어도 약 1분 내지 적어도 약 48시간 동안 세제에 적용되는, 실시양태 1-11 중 어느 하나의 방법.

13. 공급스트림이 적어도 약 15분 내지 적어도 약 3시간 동안 세제에 적용되는, 실시양태 1-12 중 어느 하나의 방법.

14. 공급스트림이 적어도 약 1시간 동안 세제에 적용되는, 실시양태 1-13 중 어느 하나의 방법.

15. 공급스트림이 약 4 ℃ 내지 약 30 ℃에서 세제에 적용되는, 실시양태 1-14 중 어느 하나의 방법.

16. 공급스트림이 약 15 ℃ 내지 약 20 ℃에서 세제에 적용되는, 실시양태 1-15 중 어느 하나의 방법.

17. 세제가 비-이온성 세제 또는 양쪽이온성 세제인, 실시양태 1-16 중 어느 하나의 방법.

18. 세제가 약 12 내지 약 15의 친수성 친지성 균형 (HLB)을 가지는, 실시양태 1-17 중 어느 하나의 방법.

19. 세제가 옥틸페놀을 포함하거나 형성하지 않는, 실시양태 1-18 중 어느 하나의 방법.

20. 세제가 퍼옥시드를 포함하거나 형성하지 않는, 실시양태 1-19 중 어느 하나의 방법.

21. 세제를 포함하는 공급스트림이 낮은 혼탁도를 가지는, 실시양태 1-20 중 어느 하나의 방법. 이는 340-360 nm에서의 평균 흡광도에 의해 측정될 수 있다.

22. 공급스트림에 대한 세제의 첨가가 공급스트림의 혼탁도를 증가시키지 않는, 실시양태 1-21 중 어느 하나의 방법. 이는 340-360 nm에서의 평균 흡광도에 의해 측정될 수 있다.

23. 폐기시 세제의 사용에 기인하는 수용 수체에서의 세제의 예측 환경 농도 (PEC)가 세제의 예측 무-영향 농도 (PNEC) 미만인, 실시양태 1-22 중 어느 하나의 방법.

24. PEC가 PNEC에 비해 더 낮은, 실시양태 23의 방법.

25. 환경적으로 적합한 세제가 알킬 글루코시드를 포함하는, 실시양태 1-24 중 어느 하나의 방법.

26. 알킬 글루코시드가 데실 글루코시드인, 실시양태 25의 방법.

27. 환경적으로 적합한 세제가 알콜 에톡실레이트인, 실시양태 1-24 중 어느 하나의 방법.

28. 환경적으로 적합한 세제가 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르인, 실시양태 1-24 중 어느 하나의 방법.

29. 환경적으로 적합한 세제가 CAS 9005-64-5, CAS 9005-65-6, CAS 126-43-8, 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 29836-26-8, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 25322-68-3, CAS 27252-75-1, CAS 4292-10-8, CAS 132778-08-6, CAS 110615-47-9, CAS 68515-73-1 또는 CAS 68439-46-3의 CAS 등록 번호를 가지는, 실시양태 1-24 중 어느 하나의 방법.

30. 세제가 1종 이상의 계면활성제를 포함하는, 실시양태 1-29 중 어느 하나의 방법.

31. 세제가 1종 이상의 계면활성제, 보존제 및 킬레이팅제를 포함하는, 실시양태 1-30 중 어느 하나의 방법.

32. 공급스트림이 수확된 세포 배양액을 포함하는, 실시양태 1-31 중 어느 하나의 방법.

33. 세제가 수확된 세포 배양액에 첨가되는, 실시양태 32의 방법.

34. 공급스트림이 포획 풀 또는 회수 생성물 풀을 포함하는, 실시양태 1-33 중 어느 하나의 방법.

35. 포획 풀 또는 회수 생성물 풀이 친화성 크로마토그래피 풀인, 실시양태 34의 방법.

36. 포획 풀 또는 회수 생성물 풀이 단백질 A 풀, 단백질 G 풀 또는 단백질 L 풀인, 실시양태 34 또는 35의 방법.

37. 포획 풀 또는 회수 생성물 풀이 혼합 모드 크로마토그래피 풀인, 실시양태 34의 방법.

38. 포획 풀이 캅토어드히어 풀인, 실시양태 34 또는 37의 방법.

39. 세제가 소포제와의 조합으로써 사용되는, 실시양태 1-38 중 어느 하나의 방법.

40. 소포제가 시메티콘인, 실시양태 39의 방법.

41. 바이러스가 외피보유 바이러스인, 실시양태 1-40 중 어느 하나의 방법.

42. 바이러스가 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 플라비바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 간염 바이러스, 오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 라브도바이러스 또는 토가바이러스인, 실시양태 1-41 중 어느 하나의 방법.

43. 공급스트림에서의 세제의 바이러스 log 감소 값 (LRV)이 약 1을 초과하는, 실시양태 1-42 중 어느 하나의 방법.

44. 바이러스 LRV가 약 4를 초과하는, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 방법.

45. LRV가 감염성 검정을 바탕으로 계산되는, 실시양태 43 또는 44의 방법.

46. 감염성 검정이 플라크 검정 또는 TCID50 검정인, 실시양태 45의 방법.

47. 세제를 첨가한 후에 공급스트림을 여과하는 단계를 추가적으로 포함하는, 실시양태 1-46 중 어느 하나의 방법.

48. 공급스트림이 세제의 첨가 적어도 약 15분 내지 적어도 약 48시간 후에 여과되는, 실시양태 47의 방법.

49. 공급스트림이 세제의 첨가 적어도 약 1시간 내지 적어도 약 3시간 후에 여과되는, 실시양태 47 또는 48의 방법.

50. 공급스트림이 세제의 첨가 약 1시간 후에 여과되는, 실시양태 47-49 중 어느 하나의 방법.

51. 필터가 한외필터 또는 심층 필터인, 실시양태 47-50 중 어느 하나의 방법.

52. 공급스트림이 세제의 첨가 후에 크로마토그래피에 적용되는, 실시양태 1-51 중 어느 하나의 방법.

53. 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 중 1종 이상인, 실시양태 52의 방법.

54. 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피 또는 단백질 L 크로마토그래피인, 실시양태 53의 방법.

55. 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피인, 실시양태 53의 방법.

56. 혼합 모드 크로마토그래피가 캅토어드히어 크로마토그래피인, 실시양태 53의 방법.

57. 치료용 폴리펩티드가 항체, 면역부착소, 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, Fc 융합 폴리펩티드, 항원 또는 결합제인, 실시양태 1-56 중 어느 하나의 방법.

57. 항체가 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인, 실시양태 56의 방법.

58. 치료용 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 생성되는, 실시양태 1-57 중 어느 하나의 방법.

59. 포유동물 세포주가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 뮤린 하이브리도마 세포 또는 뮤린 골수종 세포인, 실시양태 58의 방법.

본 명세서에서 개시되는 각 특징은 동일하거나, 등가이거나 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 개시되는 각 특징은 일반적인 일련의 등가이거나 유사한 특징들 중의 예일 뿐이다.

본원에서 개시되는 모든 참고문헌들은 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.

[ 실시예 ]

하기의 실시예를 제공하는 바, 본 발명을 제한하는 것이 아니라, 예시하기 위한 것이다.

실시예 1: 세제의 평가

치료용 폴리펩티드를 정제하고 외피보유 바이러스와 같은 우발성 인자들을 불활성화하는 공정에서 트리톤 X-100을 대체하기 위하여, 수많은 세제들을 스크리닝하였다. 대안적인 세제의 기준에는 세제의 비-이온성 또는 양쪽이온성 특성, 일회성, 강력한 바이러스 불활성화, 비용, 안전성/OSHA, 용해도, 점도, ~12-15의 친수성/친지성 균형, 재료 가용성 및 공급원, 공정 및 생성물 품질에 대한 영향, 및 ≥ 24개월인 원료의 안정성 중 어느 것이 포함되었으나, 이제 제한된 것은 아니다. 평가된 세제들의 예를 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1> 평가된 세제들의 예

수라운드의 스크리닝을 사용하여 세제들을 평가하였다.

라운드 1: 후보 세제들을 주변 온도에서 3시간 동안 1 % (v/v) 이하의 최종 농도로 단일클론 항체 (MAb)의 수용액에 첨가하였다. 본 연구에는 3종의 폴리펩티드 용액을 사용하였다. MAb1 HCCF는 MAb1의 생성에서 수득된 수확된 세포 배양액이었으며; Mab3 HCCF는 MAb3의 생성에서 수득된 수확된 세포 배양액이었고; MAb3 MSS는 MAb3 조제물의 단백질 A 크로마토그래피 후 조정된 풀 분획이었다. 혼합, 혼탁도, 생성물 수율 및 생성물 품질에 대한 그의 효과에 대하여 세제들을 평가하였다.

혼합 연구: 시험된 세제들은 하기였다: 1 % 폴리소르베이트 20 ± TnBP, 1 % 폴리소르베이트 80 ± TnBP, 1 % 세이프케어 1000, 1 % 에코서프 EH-9, 1 % 에코서프 EH-6, 1 % 에코서프 EH-3, 1 % 에코서프 SA9, 1 % 에코서프 SA7, 0.1 M 카프릴레이트, 0.5 % 또는 1 % 폴리글루코시드 및 1 % 트리톤 X-100. 세제가 첨가되지 않은 대조군과 결과를 비교하였다.

혼탁도 샘플은 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 여과 후, 여과 1시간 후 및 밤새 유지 후의 고정된 시점에 채취하였다. 최종 혼합 시간 후에는 0.2 ㎛ 필터를 통하여 용액을 여과하였다.

PhyTip 단백질 A상에서의 정제 후 이어지는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 하전 비균질성에 대한 영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF), 및 글리칸 함량에 대한 모세관 전기영동에 의해 샘플을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 저분자량 종 (예컨대 분해 생성물) 및 고분자량 종 (예컨대 응집물)의 존재를 밝힌다. iCIEF는 하전 변종 (예컨대 산성 하전 변종 및 염기성 하전 변종)을 밝힌다. 모세관 전기영동은 글리칸 구조를 밝힌다. 실내 다-생성물 ELISA를 사용하여 중국 햄스터 난소 세포 단백질 (CHOP) 농도를 시험하였다. Mab1 또는 Mab3 농도는 HCCF에서 단백질 A HPLC 검정을 사용하여, 그리고 조정된 단백질 A 풀에 대한 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 측정하였다.

도 1은 다양한 혼합 방법을 사용한 세제가 없는 MAb1 HCCF 대조군의 세제 혼합 혼탁도 분석을 나타낸다. 미처리 혼합 HCCF의 혼탁도는 혼합, 여과 및 밤새 인큐베이션 동안 변화없이 유지되는 낮은 혼탁도 수준을 가졌다. 1 % 폴리소르베이트 20 (상부 좌측), 0.3 % TnBP를 동반하는 1 % 폴리소르베이트 20 (상부 우측), 1 % 폴리소르베이트 80 (하부 좌측), 및 0.3 % TnBP를 동반하는 1 % 폴리소르베이트 80 (하부 우측)을 사용하여 처리된 MAb1 HCCF의 세제 혼합 혼탁도 분석은 도 2에 나타내었다. 폴리소르베이트 20 ± TNBP 또는 폴리소르베이트 80 ± TNBP를 사용하여 처리된 HCCF의 경우, 여과-후에 혼탁도가 증가하여 재형성되었다. 1 % 세이프케어 (상부 좌측), 1 % 에코서프 EH-9 (상부 우측), 0.1 M 카프릴레이트 (하부 좌측) 및 1 % 폴리글루코시드 (하부 우측)을 사용하여 처리된 MAb1 HCCF의 세제 혼합 혼탁도 분석은 도 3에 나타내었다. 세이프케어 또는 카프릴레이트의 첨가 및 혼합에 의해 혼탁도가 증가하기는 하였지만, 여과 및 밤새 인큐베이션 후 혼탁도가 재형성되지는 않았다. 에코서프 EH-9 또는 폴리글루코시드 시험 조건에서는 혼탁도의 증가가 관찰되지 않았다.

MAb1 HCCF의 생성물 품질에 대한 세제 혼합의 결과를 하기 표 2에 나타내었다. TnBP를 동반하는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80에서 고분자량 종의 증가가 관찰되었다. 카프릴레이트에서는 수율 손실 및 CHOP 감소가 관찰되었다. 다른 세제들에서는 글리칸 또는 CHOP의 변화가 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 2> MAb1 HCCF 생성물 품질에 의한 세제 혼합 연구

MAb3 HCCF 및 MAb3 MSS 풀의 혼탁도에 대한 3시간 세제 노출의 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 에코서프 EH-3 및 카프릴레이트 조건에서는 상당한 혼탁도가 관찰되었으며, TnBP를 동반하는 폴리소르베이트 20 또는 80 및 세이프케어에서는 미미한 혼탁도가 관찰되었다.

<표 3> MAb3:HCCF 또는 조정된 단백질 A 풀 (MSS)을 사용한 세제 스크리닝

하기 표 4는 MAb3 HCCF 및 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝에서의 CHOP 및 DNA 결과를 나타낸다. 40 %의 생성물 수율 손실로 이어진 카프릴레이트의 HCCF 및 단백질 A 풀에서의 CHOP 및 DNA 침전 이외에는 영향이 관찰되지 않았다. 다른 시험 세제들의 경우 수율 손실이 나타나지 않았다 (데이터 미도시).

<표 4> MAb3 HCCF 및 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝

표 5는 MAb3:HCCF 또는 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝에서의 SEC의 결과를 나타낸다. 세제를 사용한 처리는 주변 온도에서 3시간 동안이었다. 0.8 %로의 HMWS의 감소를 초래한 카프릴산-처리된 HCCF 이외에, HMW 또는 LMW 종에 있어서의 상당한 변화는 관찰되지 않았다.

<표 5> MAb3:HCCF 및 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝

하기 표 6은 MAb3 HCCF 또는 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝에서의 iCIEF의 결과를 나타낸다. 세제를 사용한 처리는 주변 온도에서 3시간 동안이었다. 에코서프 SA-9 처리된 단백질 A 풀에서의 산성 피크의 감소, 메인 피크의 증가 이외에, 하전 변종의 차이는 나타나지 않았다. 이는 샘플 취급에 기인할 수 있었기 때문에, 이 세제 조건은 MAb3를 사용한 차후의 실험에서 재시험하였는데, 하전 프로파일의 변화는 나타나지 않았다.

<표 6> MAb3:HCCF 및 조정된 단백질 A 풀을 사용한 세제 스크리닝

침전 및 수율 손실로 인하여, 추가적인 스크리닝에서 카프릴레이트 및 에코서프 EH-3은 배제하였다.

라운드 2: 후보 세제들을 주변 온도에서 밤새 1 % (v/v)의 최종 농도로 단일클론 항체 (MAb)의 수용액에 첨가하였다. MAb3에서의 크로마토그래피 성능, 단계 수율 및 생성물 품질 영향에 대한 그의 효과에 대하여 세제들을 평가하였다. 생성물 품질은 크기 변종 (HMW 및 LMW)을 측정하기 위한 SEC HPLC 및 하전 변종을 측정하기 위한 IEC (카르복시펩티다제 처리 사용)를 사용하여 시험하였다. 당화는 문헌 [Zhang et. Al. (Analytical Chem. 2008, 80: 2379-2390)]에 기술되어 있는 바와 같이 보로네이트 친화성 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다. 단백질에 대한 다른 변화, 예컨대 산화 또는 탈아미드화를 밝히기 위하여, 트립신분해 펩티드 매핑(tryptic peptide mapping)도 사용하였다. 공정 불순물 청소는 다중-생성물 CHOP ELISA, 삼출된 단백질 A (LpA) ELISA, 및 DNA 정량을 위한 TaqMan PCR 검정을 사용하여 측정하였다.

하기 표 7은 세제를 사용한 밤새 처리 후 이어지는 MabSelect SuRe 단백질 A 크로마토그래피를 사용한 정제에 의한 MAb3 HCCF를 사용한 세제 평가를 나타낸다. 에코서프 SA7-처리된 샘플의 경우, MabSelect SuRe에서 비정형적인 크로마토그램 및 낮은 단계 수율이 관찰되었다. CHOP 또는 DNA 청소에 대한 상당한 영향은 관찰되지 않았다. 세제-처리된 HCCF에서의 DNA의 농도는 가변적이었는데, 이는 DNA 검정에서의 샘플 중 세제의 일부 방해를 표시할 수 있다. 여기에 대해서는 최종 세제 후보들을 사용하여 추가적으로 조사될 것이다. 시험된 세제 조건 각각에서 삼출된 단백질 A의 농도는 유사하였다. 시험된 어떠한 세제에서도 당화 프로파일의 변화는 나타나지 않았다.

<표 7> MAb3 HCCF를 사용한 세제 평가

도 4는 세제를 사용한 주변 온도에서의 밤새 인큐베이션 및 MabSelect SuRe에서의 정제 후 MAb3 중화된 단백질 A 풀의 펩티드 맵을 나타낸다. 트립신분해 펩티드 매핑에서 평가되었던 바와 같이, 어떠한 세제에서도 생성물 품질의 차이는 관찰되지 않았다.

하기 표 8은 후보 세제들에 대한 밤새 노출 후 MAb3 HCCF의 SEC 및 IEC 분석 결과를 나타낸다. IEC 샘플은 분석 전에 카르복시펩티다제 B (CpB)로 처리하였다. 어떠한 시험 세제에서도 생성물 품질에 대한 영향은 관찰되지 않았다.

<표 8> MAb3 HCCF의 세제 평가

비정형적인 크로마토그램 및 낮은 수율로 인하여, 추가적인 스크리닝에서 에코서프 SA-7은 배제하였다. 폴리글루코시드는 알킬 글루코시드들의 혼합물이었는데, 추가 연구에서는 개별 알킬 글루코시드로 대체되었다.

라운드 3: 후보 세제들을 주변 온도에서 밤새 1 % (v/v)의 최종 농도로 단일클론 항체 (MAb)의 수용액에 첨가하였다. 본 연구에는 하기의 폴리펩티드 용액들을 사용하였다: MAb1 HCCF, MAb1 MSS, Mab3 및 MAb2 HCCF. 단백질 A 크로마토그래피 후 혼탁도, 생성물 품질 영향 및 세제 청소에 대한 그의 효과에 대하여 세제들을 평가하였다.

MAb1, MAb2 및 MAb3 HCCF를 1 % (v/v) 세제와 함께 주변 온도에서 밤새 인큐베이팅하였다. MAb1은 이후 MabSelect SuRe 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 수집혼합된(pooled) 분획들을 SEC, iCIEF, 그리고 세제 청소 시험을 위한 NMR에 의해 분석하였다. 혼탁도, MabSelect SuRe에서의 수율, 및 조정된 단백질 A 풀의 생성물 품질에 대한 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 1 % 폴리소르베이트 + 0.3 % TnBP를 사용하여 처리된 HCCF는 MabSelect SuRe 단백질 A 크로마토그래피에서 높은 혼탁도 및 낮은 수율을 가졌다. 이와 같은 조건은 또한 다량의 HMW 형성을 초래하였다. 루텐솔 XP90-처리된 샘플은 대조군에 비해 약 4 % 더 높은 산성 변종 농도를 가졌다.

<표 9> MAb1 1.3 HCCF의 세제 평가

중화된 단백질 A 풀의 NMR에 의해 단백질 A 크로마토그래피 동안의 세제 청소를 평가하고, 하기 표 10에 나타내었다. 단백질 A 크로마토그래피 동안 모든 세제가 매우 낮은 수준까지 청소되었다.

<표 10> MAb1 HCCF를 사용한 세제 평가, NMR 분석

MAb3 HCCF (표 11) 및 MAb2 HCCF (표 12)를 사용한 PhyTip 단백질 A 정제 후 이어지는 SEC-HPLC, iCIEF 및 글리칸용 CE에 의해, 유사한 분석을 수행하였다.

<표 11> MAb3 HCCF를 사용한 세제 평가

어떠한 시험된 세제에서도 MAb3에 대해 대조군에 비해 혼탁도 또는 생성물 품질의 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 글리칸 분포의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 12> MAb2 HCCF를 사용한 세제 평가

어떠한 시험된 세제에서도 MAb2에 대해 대조군에 비해 혼탁도 또는 생성물 품질의 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 루텐솔 XP90 및 테르기톨 L64에서 약간 더 높은 %산성 종이 관찰되었다. 글리칸 분포의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

본 시험 라운드에서는, 혼탁도 및 MAb1에 대한 생성물 품질 영향으로 인하여, 폴리소르베이트 80 + TnBP를 배제하였다.

MAb1 HCCF에서 20 ℃로, 바이러스 불활성화 (xMuLV)에 대해서도 세제를 평가하였다. 0.3 %의 최종 농도로 세제를 MAb1 HCCF에 첨가하였다. 세제 함유 재료에 5 % v/v로 XMuLV를 혼합하였다. 샘플을 20 ℃에서 30분 내지 6시간 동안 인큐베이팅하고, 모델 레트로바이러스인 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (XMuLV)의 존재에 대하여 검정하였다. XMuLV의 존재는 PG-4 지표 세포를 이용하는 TCID50 검정에 의해 측정하였다. 바이러스 불활성화 결과는 LRV (Log 감소 값)으로 표시하였으며, 하기 표 13에 나타내었다.

<표 13> 20 ℃에서의 MAb1 HCCF^a를 사용한 xMuLV 불활성화

폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 TnBP 단독에서는 xMuLV 불활성화가 덜 효과적이었다. 카프릴레이트 샘플에서는 침전이 나타났다.

실온에서 r단백질1 캅토어드히어 풀을 사용하여 더 하류의 풀에서 용매 포함 및 비포함 폴리소르베이트 80을 바이러스 불활성화 (XMuLV)에 대하여 평가하였다. XMuLV 불활성화 결과는 하기 표 14에 나타내었다. 효과적인 XMuLV 불활성화는 폴리소르베이트 80 단독에서 1시간에 수득되었다. 완전한 바이러스 불활성화는 용매를 동반하는 폴리소르베이트 80에서 5분 이내에 관찰되었다.

<표 14> 실온의 r단백질1 캅토어드히어 풀에서의 용매 포함 및 비포함 폴리소르베이트 80을 사용한 XMuLV 불활성화

후보 세제들에 의한 MAb2 HCCF에서의 XMuLV 불활성화를 하기 표 15에 나타내었다. 완전하고 효과적인 바이러스 불활성화는 0.5 % 및 1 % 농도의 모든 시험된 세제에 대하여 20 ℃ 1시간에서 달성되었다.

<표 15> 20 ℃에서의 MAb3의 바이러스 불활성화

0.3 % 및 0.5 %의 농도 및 12 ℃의 더 낮은 온도에서의 후보 세제들에 의한 MAb2 HCCF 및 r단백질1 HCCF 중 XMuLV 불활성화를 하기 표 16에 나타내었다. 효과적인 바이러스 불활성화는 효과적이지 않았던 테르기톨 L64를 제외하고는, 0.3 % 및 0.5 % 농도의 모든 시험된 세제에 대하여 12 ℃ 1시간에서 달성되었다. 이에 따라, 테르기톨 L64는 추가적인 고려에서 배제하였다.

<표 16> 더 낮은 온도 및 세제 농도에서의 Mab2 및 r단백질1의 XMuLV 불활성화

가변 농도의 트리톤 CG-110을 사용한 r단백질2 HCCF에서의 XMuLV 불활성화를 하기 표 17에 나타내었다. 농도 의존성 바이러스 불활성화가 관찰되었다. 0.05 %의 트리톤 CG-110 농도에서는 1 LRV 미만이 수득됨으로써, 불활성화가 비효과적이었다.

<표 17> 12 ℃ 1시간의 r단백질2 HCCF XMuLV 불활성화

실시예 2. 발포 완화를 위한 시메티콘의 사용: 바이러스 불활성화의 영향

트리톤 CG110의 발포 문제를 완화하기 위한 시메티콘의 사용을 바이러스 불활성화에 대한 영향에 대하여 평가하였다.

0.1 %의 최종 농도로 소포제인 시메티콘 포함 또는 비포함의 세제 (0.3 %)를 r단백질3 HCCF에 첨가하였다. 바이러스 불활성화 (xMuLV)에 대하여 샘플을 평가하였다. 결과를 하기 표 18에 나타내었다. 0.1 %의 시메티콘은 트리톤 CG110에 의한 xMuLV의 불활성화에 대한 영향이 없었다.

<표 18> 발포 완화를 위한 시메티콘의 사용은 트리톤 CG110에 의한 바이러스 불활성화에 영향을 주지 않는다.

다른 외피보유 바이러스를 불활성화하는 세제의 능력도 평가하였다. 0.3 %의 최종 농도로 r단백질1 HCCF에 세제를 첨가하였다. 세제 함유 재료에 5 % v/v로 각 바이러스를 개별 혼합하였다. 샘플을 12 ℃에서 1 및/또는 3시간 동안 인큐베이팅하고, XMuLV, 슈도라비에스 바이러스 (PRV) 또는 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)의 존재에 대하여 검정하였다. 바이러스의 존재는 세포 기반 감염성 검정을 사용하여 측정하였다. XMuLV는 PG-4 지표 세포를 이용하는 TCID₅₀ 검정에 의해 측정하였다. PRV 및 BVDV의 존재는 각각 CV-1 및 BT 지표 세포를 이용하는 플라크 검정에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표 19에 나타내었다. APG325N 및 트리톤 CG110은 3종 바이러스 모두에 대하여 효과적인 불활성화를 제공하였다.

<표 19> 12 ℃ 1시간의 r단백질1에서의 외피보유 바이러스의 바이러스 불활성화

외피보유 바이러스를 불활성화하는 트리톤 CG110 및 에코서프 EH-9의 능력을 트리톤 X-100의 것과 비교하였다. 트리톤 CG110, 트리톤 X-100 또는 에코서프 EH-9를 0.3 %의 최종 농도로 r단백질2 HCCF에 첨가하였다. 세제 함유 재료에 5 % v/v로 PRV 및 BVDV를 개별 혼합하였다. 샘플을 20 ℃에서 30분 및 1시간 동안 인큐베이팅하고, 플라크 검정을 사용하여 슈도라비에스 바이러스 (PRV) 또는 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)의 존재에 대하여 검정하였다. 바이러스의 log 감소 값을 측정하였다. 결과는 하기 표 20에 나타내었다.

<표 20> r단백질2 HCCF 중 20 ℃ 0.3 % 세제에서의 트리톤 X-100, 트리톤 CG110 및 에코서프 EH-9를 사용한 바이러스 불활성화

에코서프 EH-9 및 트리톤 CG110이 트리톤 X-100과 유사한 효과적인 불활성화를 제공하였다.

실시예 3. 추가적인 분자들을 사용한 스크리닝

시메티콘이 포함 또는 비포함 세제들을 생성물 품질에 대하여 추가적으로 스크리닝하였다. 하기의 조건들을 시험하였다.

1. 대조군 HCCF (세제 없음)

2. HCCF + 0.1 % 시메티콘

3. HCCF + 에코서프 EH9

4. HCCF + 0.7 % 트리톤 CG110

5. HCCF + 0.7 % 트리톤 CG110 + 0.1 % 시메티콘.

샘플을 주변 온도에서 15시간 동안 인큐베이팅한 다음, 2-8 ℃에서 저장하였다. Phytip 단백질 A 정제에 따라, 그리고 SEC, iCIEF 및 글리칸 분석에 의해, 생성물 품질에 대하여 샘플을 분석하였다. HCCF에는 HCCF MAb4, MAb5, MAb6, MAb7, MAb3, MAb8 및 MAb9가 포함되었다. 결과를 하기 표 21-26에 나타내었다.

Mab4 HCCF의 세제 ± 시메티콘 처리 결과를 하기 표 21에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 영향은 나타나지 않았다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 21> 추가 분자들의 스크리닝: MAb4의 생성물 품질에 대한 영향

Mab5 HCCF의 세제 ± 시메티콘 처리 결과를 하기 표 22에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 영향은 나타나지 않았다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 22> 추가 분자들의 스크리닝: Mab5의 생성물 품질에 대한 영향

Mab6 HCCF의 세제 ± 시메티콘 처리 결과를 하기 표 23에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 영향은 나타나지 않았다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 23> 추가 분자들의 스크리닝: Mab6의 생성물 품질에 대한 영향

Mab7 HCCF의 세제 ± 시메티콘 처리 결과를 하기 표 24에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 상당한 영향은 나타나지 않았다. 트리톤 CG-110-처리된 샘플에서 약간 더 높은 %산성 및 더 낮은 %염기성 변종이 관찰되었다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 24> 추가 분자들의 스크리닝: Mab7의 생성물 품질에 대한 영향

Mab8 HCCF의 세제 시메티콘 처리 결과를 하기 표 25에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 영향은 나타나지 않았다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 25> 추가 분자들의 스크리닝: Mab8의 생성물 품질에 대한 영향

Mab9 HCCF의 세제 시메티콘 처리 결과를 하기 표 26에 나타내었다. 각 시험된 조건에서 생성물 품질에 대한 영향은 나타나지 않았다. 글리칸의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).

<표 26> 추가 분자들의 스크리닝: Mab9의 생성물 품질에 대한 영향

실시예 4. 살포 연구

고려중인 4종의 세제를 발포, 및 발포 완화에 대한 시메티콘의 효과성에 대하여 평가하였다.

평가된 세제에는 APG325, 트리톤 CG110, 에코서프 EH9 및 루텐솔 XP90이 포함되었다. 2 리터 발효기에서, 세제 (0.5 %)를 HCCF에 첨가하였다. 용액을 50 RPM의 속도로 혼합하였다. 발효기는 분 당 10 표준 세제곱 센티미터 (SSCM)의 속도로 실내 공기를 사용하여 살포하거나 살포하지 않았다. 소포제인 1 % 시메티콘을 2 mL/L 배양물로 첨가하였다.

알킬 글루코시드 세제에 비해, 에코서프 EH9가 덜 발포성인 것으로 나타났으며, 더 작은 기포를 포함하였다. 소포제의 첨가는 모든 거품을 제거하였으며, 72시간 동안 추가적인 거품이 재형성되지 않았다.

트리톤 CG110은 대형의 공기가 들어있는 기포를 나타내었다. 소포제의 첨가는 거품을 감소시키기는 하였으나, 완전히 제거하지는 못하였다. 추가적인 거품은 72시간 동안 형성되지 않았다.

APG325N은 용기 중에서 발포되는 대형의 공기가 들어있는 기포의 빠른 형성을 나타내었다. 소포제의 첨가는 거품 및 소포제의 첨가 후 형성되는 추가적인 거품에 대한 최소한의 효과를 나타내었다. 반면, 살포되지 않는 HCCF에 대한 APG325N의 첨가는 거품이 적거나 없었다.

실시예 5. 2종 세제의 안정성

NMR 분석에서 에코서프 EH9의 불안정성이 나타났다. 에코서프 EH9의 10 % 모용액을 실온 및 40 ℃에서 유지하면서, 0, 7, 15 및 36일차에 NMR에 의해 분석하였다. 결과를 하기 표 17에 나타내었다. 방향족물질의 분해 및 형성을 검출하였다.

NMR 분석에서 에코서프 EH-9의 불안정성이 나타났다. 에코서프 EH-9 및 트리톤 CG-110의 10 % 모용액을 실온 및 40 ℃에서 유지하면서, 0, 7, 15, 30 및 59일차에 NMR에 의해 분석하였다. 에코서프 EH-9 분해 생성물의 정량 결과를 하기 표 27에 나타내었다. 에코서프 EH-9에 대하여 방향족물질의 분해 및 형성을 검출하였다. 도 5 및 6은 각각 트리톤 CG-110 및 에코서프 EH-9 안정성 샘플의 NMR 스펙트럼을 나타낸다. 트리톤 CG-110은 안정해서, 59일까지 변화가 적었다. 반면, 에코서프 EH-9 용액의 저장 동안에는 분해 생성물의 형성을 볼 수 있었다.

<표 27> 에코서프 EH9의 불안정성

또한, 세제의 10 % (v/v) 수성 모액에서 8주의 과정에 걸쳐, 에코서프 EH9 및 트리톤 CG110을 퍼옥시드 형성에 대하여 분석하였다. EMD 밀리포어 열량측정 퍼옥시드 시험 1.10001.0001 시험을 사용하였다. ppm으로 나타낸 결과를 하기 표 28에 나타내었다. 원료 및 모용액은 주변 온도에서 저장하면서 호일 덮개를 사용하여 광으로부터 보호하였다. 에코서프 EH9 원료를 약 8개월 더 일찍 개봉 및 재밀봉하였다. 에코서프 EH9 원료 및 10 % 모용액에서 퍼옥시드가 검출되었다. 8주 동안, 트리톤 CG110의 모용액에서는 검출가능한 퍼옥시드 (< 0.5 ppm)가 검출되지 않았다.

<표 28> 퍼옥시드의 형성 (ppm 농도)

실시예 6. 세제의 EHS 평가

21종의 서로 다른 후보 물질들을 환경 보건 및 안전성에 대하여 고찰하였다. 각 물질을 조사하여 그의 기본적 물리 및 독성학적 특징들을 확인하였다. 제조자 및 정부 문헌으로부터 이와 같은 EHS 정보를 입수하여, 하기 표 29에 편집하였다.

<표 29> 분석된 세제들

추가적인 생태독성 연구를 위하여, 후보 물질 중 하기 5종을 선택하였다:

에코서프 EH-9

트리톤 CG-110

토마돌

APG325

루텐솔 XP-90

생태독성 연구의 목적은 각 후보 물질에 대하여 후보 물질이 수성 생물체에 대한 상당한 위험성을 나타내지 않게 되는 최고 농도를 확립하는 것이었다. 이와 같은 농도는 예측 무영향 농도 (PNEC)로 지칭되는데, 후보 물질을 위한 구체적인 PNEC를 개발하는 데에 사용되는 방법은 문헌 [European Union's Technical Guidance Document for Risk Assessment, 2003 (TGD)]에 상술되어 있다.

PNEC를 개발하기 위하여, 활성화 슬러지 호흡 억제 (OECD 209), 조류 성장 억제 (OECD 201), 물벼룩 급성 고정 (OECD 202), 물벼룩 만성 생식 (OECD 211) 및 어류 급성 독성 검정 (OECD 203)을 측정하기 위한 경제 협력 개발 기구(OECD) 시험 방법들을 사용하여 상기 5종 후보 물질들 각각을 평가하였다.

이러한 연구는 공정 폐수를 수용하는 폐수 처리 플랜트용 PNEC인 PNEC_STP, 그리고 수용 수체를 위한 PNEC인 PNEC_RW 양자를 산출하였다.

제조 장소에서의 후보 물질의 사용은 오수 처리 플랜트에서의 예측 환경 농도 (PEC_STP)로 지칭되는 페수 처리 플랜트, 및 수용 수체에서의 예측 환경 농도 (PEC_RW)로 지칭되는 수용 수체 양자에서의 후보 물질의 농도를 초래하게 된다. 폐수 처리 플랜트는 OECD의 즉석 생분해성 시험 (OECD 301F)을 사용하는 시험을 통하여 후보 물질 각각에 대하여 계산되는 양인 후보 물질의 일부를 폐수로부터 제거하기도 한다.

5종 후보 물질에 대한 PEC의 PNEC와의 이와 같은 비교는 유용한 환경 적합성 프로파일을 제공한다. 후보 물질은 그의 PEC가 PNEC보다 더 낮은 경우, 환경적으로 적합한 것으로 간주되었다.

Claims (60)

1. 세제를 공급스트림(feedstream)에 첨가하는 단계
   를 포함하며, 여기서 상기 세제는 CAS 68515-73-1, CAS 58846-77-8, CAS 59122-55-3, CAS 110615-47-9, CAS 64366-70-7, CAS 68937-66-6, CAS 69227-22-1, CAS 27252-75-1, CAS 132778-08-6 또는 CAS 110615-47-9의 CAS 등록 번호를 갖는 환경적으로 적합한 세제인, 치료용 폴리펩티드 제조 공정의 생성물 공급스트림에서 바이러스를 불활성화하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 트리톤 X-100을 사용하는 방법 또는 세제를 사용하지 않는 방법과 비교하여 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질이 유지되는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 치료용 폴리펩티드의 생성물 품질이, 생성물 공급스트림에서의 총 폴리펩티드 중 생성물 변종에 있어서 5 % 이하의 변화를 초래하는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 생성물 변종이
   a) 생성물 공급스트림에서의 총 폴리펩티드 중에서 5 %를 초과하여 증가하지는 않거나,
   b) 크기 변종, 하전 변종, 산화 변종, 탈아미드화 변종, 당화 변종, 또는 변경된 글리칸 프로파일을 갖는 변종이거나,
   c) 산성 또는 염기성 생성물 변종인
   방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제를 공급스트림에 첨가하는 것이
   a) 폴리펩티드의 단편화를 5 %를 초과하여 증가시키지는 않거나,
   b) 공급스트림에서의 응집을 5 %를 초과하여 증가시키지는 않거나,
   c) 제조 공정에서의 폴리펩티드의 수율을 5 %를 초과하여 감소시키지는 않는 것인
   방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제가
   a) 0.01 % 내지 10 %, 또는
   b) 0.3 % 내지 1 %
   의 최종 농도로 공급스트림에 첨가되는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제가
   a) 적어도 1분 내지 적어도 48시간 동안, 또는
   b) 적어도 15분 내지 적어도 3시간 동안, 또는
   c) 적어도 1시간 동안, 또는
   d) 4 ℃ 내지 30 ℃에서, 또는
   e) 15 ℃ 내지 20 ℃에서
   공급스트림에 첨가되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제가
   a) 비-이온성 세제 또는 양쪽이온성 세제이거나,
   b) 12 내지 15의 친수성 친지성 균형(hydrophile lipophile balance) (HLB)을 갖거나,
   c) 옥틸페놀을 포함하거나 형성하지는 않거나,
   d) 퍼옥시드를 포함하거나 형성하지는 않는 것인
   방법.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   공급스트림에 대한 세제의 첨가가 공급스트림의 혼탁도를 증가시키지는 않는 것인
   방법.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기시, 세제의 사용에 기인하는 수용 수체(receiving water body)에서의 세제의 예측 환경 농도(Predicted Environmental Concentration) (PEC)가 세제의 예측 무-영향 농도(Predicted No-Effect Concentration) (PNEC) 미만인 방법.
11. 제10항에 있어서, PEC가 PNEC보다 더 낮은 것인 방법.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제가
    a) 1종 이상의 계면활성제, 또는
    b) 1종 이상의 계면활성제, 보존제 및 킬레이팅제
    를 포함하는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공급스트림이
    a) 수확된 세포 배양액, 또는
    b) 포획 풀(capture pool) 또는 회수 생성물 풀(recovered product pool), 또는
    c) 상기 a)와 b) 모두
    를 포함하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 세제가 수확된 세포 배양액에 첨가되는 것인 방법.
15. 제13항에 있어서, 포획 풀 또는 회수 생성물 풀이
    친화성 크로마토그래피 풀
    인 방법.
16. 제13항에 있어서, 포획 풀 또는 회수 생성물 풀이
    혼합 모드 크로마토그래피 풀
    인 방법.
17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세제가 소포제와 조합하여 사용되는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 소포제가 시메티콘인 방법.
19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 외피보유(enveloped) 바이러스인 방법.
20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 플라비바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 간염 바이러스, 오르소믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 라브도바이러스 또는 토가바이러스인 방법.
21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공급스트림에서의 세제의 바이러스 log 감소 값 (LRV)이
    a) 1을 초과하거나, 또는
    b) 4를 초과하는 것인
    방법.
22. 제21항에 있어서, LRV가 감염성 검정을 바탕으로 계산되는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 감염성 검정이 플라크 검정 또는 TCID₅₀ 검정인 방법.
24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    세제를 첨가한 후에 공급스트림을 여과하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 공급스트림이
    a) 세제의 첨가 후 적어도 15분 내지 적어도 48시간에, 또는
    b) 세제의 첨가 후 적어도 1시간 내지 적어도 3시간에, 또는
    c) 세제의 첨가 후 1시간에
    여과되는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, 여과에 사용되는 필터가 한외필터 또는 심층 필터인 방법.
27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공급스트림이 세제의 첨가 후에 크로마토그래피에 적용되는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 중 1종 이상인 방법.
29. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 항체, 면역부착소, 효소, 성장 인자, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 시토카인, Fc 융합 폴리펩티드, 항원 또는 결합제인 방법.
30. 제29항에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 방법.
31. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 생성된 것인 방법.
32. 제31항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 뮤린(murine) 하이브리도마 세포 또는 뮤린 골수종 세포인 방법.
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