TWI834623B - 使用n-甲基葡糖醯胺及其衍生物以使病毒去活化之方法 - Google Patents
使用n-甲基葡糖醯胺及其衍生物以使病毒去活化之方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI834623B TWI834623B TW107132077A TW107132077A TWI834623B TW I834623 B TWI834623 B TW I834623B TW 107132077 A TW107132077 A TW 107132077A TW 107132077 A TW107132077 A TW 107132077A TW I834623 B TWI834623 B TW I834623B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- mega
- virus
- methylglucamide
- solution
- viral
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 103
- GHPCICSQWQDZLM-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)sulfonyl-1-methyl-3-propylurea Chemical compound CCCNC(=O)N(C)S(=O)(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 GHPCICSQWQDZLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 title description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims abstract description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 98
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 claims description 28
- GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N 0.000 claims description 27
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 20
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 claims description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims description 4
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 claims description 3
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 claims description 3
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]undecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 108
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 17
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 abstract 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 24
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 23
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 22
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 22
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 10
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 9
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 9
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 7
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 4
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 4
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 3
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 3
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 244000078885 bloodborne pathogen Species 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 2
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- SGRHVVLXEBNBDV-UHFFFAOYSA-N 1,6-dibromohexane Chemical compound BrCCCCCCBr SGRHVVLXEBNBDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- VAWJAVOCYPGQMS-UHFFFAOYSA-N [N]=O.CN(CCCCCCCCCCCC)C Chemical compound [N]=O.CN(CCCCCCCCCCCC)C VAWJAVOCYPGQMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012592 cell culture supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 1
- 238000007905 drug manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010983 kinetics study Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950004053 octoxinol Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
- A01N37/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof containing the group, wherein Cn means a carbon skeleton not containing a ring; Thio analogues thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
- A61L2/0088—Liquid substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13061—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明是有關用於去活化病毒的方法。使用N-甲基葡糖醯胺去活化病毒的方法適用於生物活性藥物(諸如蛋白質次單位、蛋白質(酶、因子等)、重組蛋白質、抗體、疫苗或基因治療性產物)的純化過程。用於這個方法中的清潔劑是基於多種N-甲基葡糖醯胺同系物,其由親水性葡萄糖部份以及疏水性脂肪酸尾部透過醯胺鍵連結所組成。此外,這些糖類清潔劑本身為非離子性,其不會破壞藥物蛋白質、血漿生物劑、非包膜病毒疫苗或腺相關病毒顆粒。
本發明提供一種純化具有未經鑑定之包膜病毒汙染物之感興趣生物產物溶液的方法,其包括將感興趣生物產物溶液與標準溶液一起培育;去活化存在於步驟(a)之生物產物溶液中的任何潛在包膜病毒汙染物;測量存在於步驟(b)之最終溶液中的去活化病毒;(d)將個別感興趣生物產物溶液與N-甲基葡糖醯胺溶液一起培育;測量存在於步驟(d)之最終溶液中的去活化病毒;及比較步驟(c)與步驟(e)之最終溶液的結果。
Description
本發明是有關用於去活化病毒的方法。使用N-甲基葡糖醯胺去活化病毒的方法適用於生物活性藥物(諸如蛋白質次單位、蛋白質(酶、因子等)、重組蛋白質、抗體、疫苗或基因治療性產物)的純化過程。用於這個方法中的清潔劑是基於多種N-甲基葡糖醯胺同系物,其由親水性葡萄糖部份以及疏水性脂肪酸尾部透過醯胺鍵連結所組成。此外,這些糖類清潔劑本身為非離子性,其不會破壞藥物蛋白質、血漿生物劑、非包膜病毒疫苗或腺相關病毒顆粒。
生物治療劑是由需要任一種生物來源之原料的過程所產生的分子,生物來源亦即細胞株、細胞培養液和組織或體液。製造生物衍生性治療劑是一個複雜的過程,它需要許多純化步驟以確保安全性。特別重要的是要考慮在這期間各個步驟或過程可能有微生物汙染。在重組蛋白質生產的情況下,生物治療劑主要是透過培養帶有含感興趣基因(GOI)的質體DNA之經工程改造人類或動物衍生細胞[即,中國倉鼠卵巢(CHO)或幼倉鼠腎(BHK)細胞],或融合瘤細胞[即NS0]以及一系列施行純化過程的單元操作來製作。已知CHO和BHK(Chan,S.Y.,1994,Wang G.et al 1999 & Suzuki A.et al 1982)細胞具有染色體整合的前病毒要素,其編碼內源性逆轉錄病毒樣顆粒 (ERVLP)。全血或血漿的生物治療劑製品面臨血源性病原體(即B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎(HCV)病毒等)原料汙染的挑戰。此外,可能會將附加因子引入製造中的中間體,從而對製造產生更多挑戰。因而到目前為止,有許多關於生物反應器病毒汙染事件的報導(Hsieh,W.T.et al 2008,Qiu Y.et al,2013)。特別是,去活化病毒及/或去除病毒多年來一直困擾著生物製劑產業。一些原因包括病毒來源的可變性以及尺寸小。
病毒分為包膜群和無包膜群。內源性逆轉錄病毒樣顆粒是包膜的,並在CHO和BHK細胞及其相關培養液中發現到,其對進一步的純化步驟、設備,儀器和環境產生汙染風險。儘管使用現有方法沒有觀察到感染性,但內源性逆轉錄病毒樣顆粒對患者和產業構成潛在風險。基於所有這些原因,快速且有效地使製造過程的這些汙染物去活化及/或將它們去除已經變得越來越重要。
清潔劑在各種陣列和分析中已被用作為一種使病毒去活化的重要工具。自1980年代開始,清潔劑增加了血液樣品池(用於需要輸血或血液組分的患者,諸如血漿衍生的治療產物)和處理樣品的實驗室人員的安全性。最近,清潔劑已被廣泛用在有病毒汙染潛在風險之生物治療劑及/或疫苗的製造過程中。在生物藥物製造時,用於使包膜病毒去活化的最充分特徵分析和高度有效的清潔劑是非離子性清潔劑,諸如聚山梨醇酯(Tween-20、Tween-80)、Triton X-100(也稱為Octoxinol-10)和磷酸第三正丁酯(TNBP,經常與聚山梨醇酯或Triton X-100一起用作溶劑)。聚山梨醇酯在環境條件下非常有效,但是在相對高濃度下,效力隨著溫度降低而降低。因此,這些清潔劑可能不是用來製造需要低溫條件之生物材料的最佳選擇,低溫條件對於穩定生物活性和分子結構來說是重要的。
Triton X-100(又稱為Octoxinol、Octoxinol-3、Preceptin)是去活化病毒的 典型、成熟的有效清潔劑。Triton X-100與其衍生物在非常低的溫度下是高度有效的。Triton-X100的辛基酚組分已經過特徵分析為與雌激素受體交互作用,在經暴露的動物體內產生生殖影響。若直接排放到環境中,含有Triton X-100的生物製程廢物會造成負面影響,特別是對於水生生物來說。處理或回收生物製程廢物中的Triton X-100將是非常昂貴且麻煩的。在不改變生物活性藥物的情況下,追求有效使病毒去活化之新穎環境友善清潔劑(或非生態毒性)已成為許多生物製藥產業的優先事項。因此,找出有效、穩健和更為環境安全的清潔劑一直是生物製藥產業中的首要優先事項。
本發明方法的具體例包含純化具有未經識別之包膜病毒汙染物之感興趣生物產物溶液,其包含將感興趣生物產物溶液與N-甲基葡糖醯胺溶液一起培育、使存在於生物產物溶液中的任何可能包膜病毒汙染物去活化,以及純化該生物產物溶液。
一種純化具有未經識別之包膜病毒汙染物的感興趣生物產物溶液的方法包含將感興趣之生物產物溶液與標準溶液一起培育、使存在於步驟(a)之生物產物溶液中的任何潛在包膜病毒汙染物去活化、測量步驟(b)的最終溶液中存在的經去活化病毒、將感興趣的個別生物產物溶液與N-甲基葡糖醯胺溶液一起培育、測量步驟(d)之最終溶液中存在的經去活化病毒,以及比較步驟(c)和步驟(e)的最終溶液的結果。
習於技藝者將理解,下面描述的圖式是用於說明。圖式不希望以任何方式限制本發明教示或申請專利範圍的範疇。
圖1顯示清潔劑破壞包膜病毒的理論通用機制。包膜病毒(諸如逆轉錄病毒)具有二十面體形狀的核鞘,受到來自宿主細胞和病毒的病毒包膜所保 護。每種清潔劑分子具有親水性頭部和疏水性尾部,從而賦予其兩親結構。這兩個部分決定臨界微胞濃度(CMC),CMC為各清潔劑的特定特性。清潔劑單體可以插入指定CMC以下的病毒包膜內,並且可以或可以不干擾病毒附接至宿主。相反,在CMC或以上的濃度下,更多的清潔劑單體可以插入包膜中並導致包膜破壞,從而使病毒不能與宿主細胞表面上的受體結合。
圖2顯示N-甲基葡糖醯胺清潔劑的疏水性(非極性)和親水性(極性)區域。
圖3顯示N-甲基葡糖醯胺清潔劑同系物的二維(2D)和三維(3D)結構。同樣地,每種化合物由透過醯胺鍵連接至非環狀親水性葡萄糖部分的具有8-10或12個碳的疏水性脂肪酸鏈所組成。
圖4顯示當重組FVIII(rFVIII)分別與0.5x、1x、2x CMC的Mega 8、Mega 9、Mega10和Mega12一起培育時,X-MuLV在室溫下於30分鐘內完全去活化。
圖5顯示當重組FVIII(rFVIII)分別與1x及2x CMC的各種清潔劑(Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12)一起培育時,X-MuLV在2.0℃下於30分鐘內完全去活化。
圖6顯示當在重組FVIII(rFVIII)中於2.0℃下培育30分鐘時,0.3%(w/v)Mega 10和0.3%(w/v)Triton X-100達到完全X-MuLV去活化,證明兩種清潔劑有相似的效力。
圖7顯示重組FVIII(rFVIII)即使與水或Mega 10在2.0℃下一起培育2小時之後仍維持其活性。
圖8顯示重組FVIII(rFVIII)與X-MuLV或濃度增加之Mega 10在2.0℃下一起培育歷時30分鐘的劑量-反應。劑量反應曲線顯示,隨著糖清潔劑的濃度增加,X-MuLV的力價反向降低至偵測限值(LOD),其中沒有病毒可偵測到。rFVIII對照(Ctrl)虛線對應於與僅只X-MuLV一起培育之rFVIII的力價。
圖9顯示重組FVIII(rFVIII)與X-MuLV和0.3%(w/v)Mega 10在2.0℃下 一起培育歷時0、5、15、30、60和120分鐘的動力學。Mega 10處理導致病毒力價立即降低(完全去活化),達到偵測限值(LOD),其中沒有病毒可偵測到,這與僅rFVIII和僅培養基對照相反。
圖10顯示重組FVIII(rFVIII)與高力價X-MuLV原液和0.02%、0.10%或0.20%(w/v)Mega 10在2.0℃下一起培育歷時0、5、30、60和120分鐘的動力學。在5分鐘內,0.10%(w/v)Mega 10導致病毒力價降低,而0.20%(w/v)導致病毒力價立即降低(完全去活化),達到偵測限值(LOD),其中沒有病毒可偵測到,與0.02%(w/v)Mega 10、rFVIII和僅培養基的對照樣品觀察到沒有病毒去活化相反。
圖11顯示不同的製造Mega 10分子產生類似且可再現的劑量反應結果。
圖12顯示豬偽狂犬病病毒(PRV)與重組FVIII(rFVIII)一起培育時,受到0.2和0.3(w/v)Mega 10在2.0℃下於15分鐘內去活化達偵測限值。
圖13顯示牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)與重組FVIII(rFVIII)在2.0℃下一起培育歷時30分鐘時,受到0.2、0.3和0.4(w/v)Mega10和受到1.0%(w/v)Mega 9完全去活化達偵測限值。
圖14顯示X-MuLV與0.2、0.3和0.4%(w/v)Mega 10在人類免疫球蛋白G(IgG)與人類血漿蛋白質溶液中於2.0℃下一起培育歷時30分鐘時,完全去活化達偵測限值。製備兩種蛋白質溶液,使得各者的最終濃度為30mg/mL。
圖15顯示使用單獨Mega 10(M10)、單獨Tween 20(Tw20),以及濃度為0.05%(w/v)、0.10%(w/v)或0.30%(w/v)Mega10和有或沒有0.01%(w/v)、0.02%(w/v)或0.06%(w/v)Tw20之Mega 10加Tw20混合物的X-MuLV去活化。在濃度為0.30%(w/v)單獨M10或0.30%(w/v)M10+0.06%(w/v)Tw20混合物時,X-MuLV在30分鐘內完全去活化。
圖16顯示使用單獨Mega 10(M10)、單獨磷酸三(正丁基)酯(TnBP),以 及濃度為0.05%(w/v)或0.30%(w/v)的Mega 10加TnBP混合物(1:1)的X-MuLV去活化。在濃度為0.30%(w/v)單獨M10或0.30%(w/v)M10+0.30%(w/v)TnBP混合物時,X-MuLV在30分鐘內完全去活化。有趣的是,0.05%(w/v)M10+0.05%(w/v)TnBP有病毒力價降低(但未完全去活化),指出Mega 10和TnBP之間可能有協同效應。其餘的清潔劑處理沒有產生病毒去活化,因為病毒力價與rFVIII對照(無清潔劑)相當。
圖17顯示在有或沒有550mM NaCl的情況下,使用0.06%(w/v)、0.10%(w/v)或0.20%(w/v)Mega 10或0.30%(w/v)、0.51%(w/v),或0.71%(w/v)Mega 9的X-MuLV去活化。在濃度為0.20%(w/v)單獨Mega 10、0.20%(w/v)Mega 10+NaCl和0.71%(w/v)Mega 9(有和沒有500mM NaCl)時,X-MuLV顯著去活化。0.10%(w/v)Mega 10+550mM NaCl和0.51%(w/v)Mega 9+500mM NaCl的病毒力價降低,指出Mega 10或Mega 9與NaCl之間可能有一些協同效應。其餘的清潔劑處理沒有產生病毒去活化,因為病毒力價與rFVIII對照(無清潔劑)和NaCl對照(無清潔劑)相當。
本說明書提供與病毒去活化相關的方法以及組合物。
為了解釋本說明書,採用以下定義。在下文所列舉之任何定義與任何其他文件(包括以參考資料併入本文的任何文件)中使用的詞語相衝突時,下文所列舉的定義將基於解釋本說明書及其相關申請專利範圍之目的勝出,除非明確指出為相反的含意(例如術語原先使用的文件中)。
若適當的話,以單數使用的術語也將包括複數且反之亦然。除非另有說明或使用「一或多」明顯不適合,否則本文中使用「一」表示「一或多」。除非另有說明,否則使用「或」表示「及/或」。使用「包含(comprise、comprises、 comprising)」、「包括(include、includes與including)」是可互換的並且不具限制性。術語「諸如」、「例如(for example)」以及「例如(e.g.)」也不希望具限制性。舉例而言,術語「包括」應表示「包括,但不限於」。
如本文所用,術語「約」是指所提供之單位值的+/-10%。
如本文所用,術語「基本上」意指表現出感興趣的特徵或性質的總程度或近似程度的定性條件。生物學技藝中具有通常技術者將理解到,生物和化學現象很少(如果有的話)得到或避免絕對結果,因為有影響生物和化學組合物和材料的測試,生產和儲存的許多變因,並且因為用於生物和化學組合物和材料的測試,生產和儲存的儀器和設備有內在誤差。因此,術語「基本上」用於獲得許多生物和化學現象中內在的潛在缺乏完整性。
自1980年代以來,清潔劑已被用作使從血液供體收集之混合血液中的病毒去活化的重要工具。這個過程對於接受血液、血漿或血液/血漿衍生組份(諸如血漿衍生因子VIII(pdFVIII))的患者的安全性來說至為重要。另外,這個純化措施增加了直接參與在臨床實驗室的血液處理或在血漿衍生生物產物(PDBP)的製造人員的安全性。最近,這個操作也已經成為包含動物衍生材料的生物治療劑或疫苗的生物製藥藥品製造過程不可或缺的部分。動物來源的材料(亦即血液、血漿、組織和哺乳動物細胞中產生的蛋白質)可能帶有內源性病毒,或者很容易被外來病毒汙染。因此,藥物製造過程包括一系列有效的病毒去活化(即溶劑-清潔劑、低pH和熱處理)和去除技術(亦即病毒過濾),以確保患者接受無病毒治療。這些過程對於生物衍生的治療性或疫苗產物的安全公開釋出至關重要。非常需要新方法來提高這些產物的效率,穩健性以及最重要的是整體安全性。為了滿足這些需求,在本發明中特徵分析一種使用生態友善的N-甲基葡糖醯胺類清潔劑的新穎方法。
清潔劑是兩親分子,其由親水性(極性)頭基和疏水性(非極性)尾基組 成。這個通用結構允許清潔劑與其他分子交互作用,最明顯的是在水溶液中的蛋白質或包膜病毒。在基礎科學和應用技術中,清潔劑可被用作一種助溶劑或作為穩定劑,以防止生物分子從聚集或使來自細胞培養物或組織懸浮物的膜蛋白溶解。當用於溶解蛋白質時,以下特性使某些清潔劑比其他清潔劑更理想:1)缺乏電荷的清潔劑(非離子性清潔劑)有助於保留感興趣蛋白質的結構和活性、2)具有低臨界微胞濃度(CMC))的清潔劑允許經由透析容易去除清潔劑、3)明確的且因此不影響蛋白質吸收讀數的清潔劑,以及4)高純度的,減少實驗間變異性的清潔劑。同樣地,大多數這些性質在選擇用於病毒去活化的清潔劑候選物時是適用的,因為必須不破壞蛋白質藥物、檢測蛋白質濃度而不受清潔劑干擾,並確保清潔劑是高純度的,因此病毒去活化始終發生。
大體上,包膜病毒去活化取決於特定清潔劑的兩親結構和臨界微胞濃度(CMC)。CMC意指清潔劑單體聚集形成微胞結構的濃度。在水溶液中,隨著更多的清潔劑單體接觸,親水性頭部可以鄰接以保護疏水性尾部免受水溶液的影響,最終組織成微胞結構。CMC可能與特定條件下給定清潔劑發生病毒去活化的濃度有關。病毒去活化的理論機制是單體插入低於清潔劑CMC的病毒包膜中,這可能對病毒有害。一旦濃度等於或高於CMC,膜中存在的這些清潔劑單體形成微胞,其可破壞完整性或完全剝離病毒包膜。在沒有病毒包膜的情況下,病毒無法結合至其宿主細胞之細胞膜上的其受體並且促進其複製和擴散。
到目前為止,生物治療劑製造產業已經使用了許多清潔劑供去活化包膜病毒。一個廣用的非離子性清潔劑Triton X-100非常有效去活化包膜病毒而不會破壞蛋白質藥物。在生物製藥製造過程中使用Triton X-100後,其被安排進入廢水處理廠或被直接釋放到水性環境中(Madsen et al,1996, JAOCS,73:929-933)。不幸的是,Triton X-100副產物含有辛基酚,它可以模仿雌激素受體受質,並且可能不利地影響動物的生殖系統,特別是水生生物。因此,這個清潔劑被許多國家認為對環境是有毒化學品,它們開始禁止使用。許多生物製藥產業已致力於尋找效力與Triton X-100相當的更環境安全的清潔劑。例如Biogen,Inc.與Genentech,Inc.已分別探查月桂基二甲基胺氮氧化物(LDAO)和烷基葡糖苷(Conley et al.,2014,US專利#W02014025771A2;Conley et al.,2016,Biotechnol.Bioeng.,Epub ahead of print;Fisher et al.,2016,美國專利#20160333046A1)。儘管這些公司已經能夠識別不同類別的新清潔劑,本發明具體例在去活化包膜病毒中定義了嶄新且高度有效的一類非離子性清潔劑,N-甲基葡糖醯胺(也稱為脂肪酸糖)。
糖類為主的清潔劑具有優異的物理性質,高度生物可降解且無毒,這有助於其安全性概況,特別是對於水生環境來說(Bogdan,2007,Stalmans et al.,1993)。因此,所揭示的具體例著重在使用糖類清潔劑,N-甲基葡糖醯胺,在生物活性藥物製造時作為去活化病毒的新方法。
N-甲基葡糖醯胺是非離子性清潔劑,由透過醯胺鍵連接的高度親水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸鏈組成。這些清潔劑是生態友善的,因為它們是高度生物可降解,具有約95%可再生碳指數,並且尤其被認為對水生生物無毒(Stalmans et al.,1993,SOFW,119:794-808)。由於其安全性概況增加以及優異的物理性質,這些清潔劑已經獲得高度興趣用於基礎科學技術以及用於洗髮乳和洗碗皂中。同樣地,這些清潔劑可能是用於生物衍生藥物產物之病毒去活化的主要候選者。
大多數重組蛋白質是透過經遺傳工程改造的哺乳動物細胞(即CHO和BHK)的發酵所生產。這些細胞已知具有染色體整合之逆轉錄病毒前病毒基因或要素,其產生缺乏證實的感染性之包膜病毒顆粒的內源性逆轉錄病毒 樣顆粒(ERVLP)。為了證明ERVLP的去活化,X-MuLV用作為內源性逆轉錄病毒的特定模型,且目前用作實驗室工具,透過摻加經特定純化單元操作之去活化或去除的樣品來評估製造純化過程。因此,所揭示的具體例將使用這個新方法,其採用N-甲基葡糖醯胺使包膜病毒(諸如X-MuLV)去活化。基於X-MuLV模型,所有其他包膜病毒都應該對N-甲基葡糖醯胺去活化敏感,包括皰疹病毒、黃病毒、絲狀病毒等。此外,這個新方法適用於整個藥物純化過程中的任何步驟,其可能涉及清潔劑去除步驟,例如透析或管柱層析。
通常,使用這個新型清潔劑進行病毒去活化包括測試摻入N-甲基葡糖醯胺的蛋白質樣品(即重組因子VIII,人類IgG抗體和血漿組分)的X-MuLV實驗室病毒株、在2-8℃下培育樣品歷時30分鐘,且隨後對指示細胞株(即PG-4、Vero或EBTr細胞株)進行反應管實驗以觀察病毒感染。測試N-甲基葡糖醯胺的系統化方法始於在各種條件下進行初步篩選,然後是蛋白質活性評估、劑量反應研究、高力價和低力價病毒原液,多病毒和生物應用的動力學研究,而最後是多個製造商比較以確保一致性。初步篩選條件是基於經典Triton X-100清潔劑的歷史數據,其中病毒去活化在2-8℃、120分鐘內成功,而去活化濃度範圍為0.1至0.3%(w/v)。為了確保新清潔劑與已知的強效清潔劑(Triton X-100)可相比擬,選定低溫度並培育30分鐘和120分鐘進行N-甲基葡糖醯胺的初步篩選。評估的濃度是以每種新清潔劑的CMC為基準。然後,使用顯色分析套組,評估去活化包膜病毒最為有效的N-甲基葡糖醯胺候選物對人類因子VIII活性的任何影響。然後針對範圍0.014-01.0%(w/v)的N-甲基葡糖醯胺濃度增加相對於各個個別清潔劑的各別劑量反應來評估N-甲基葡糖醯胺。為了評估去活化有多快發生,使用低力價和高力價病毒製品對N-甲基葡糖醯胺進行了動力學研究。為了增加整個過程中產生 的數據可信度,在類似條件下分析多個供應商來源以證明N-甲基葡糖醯胺的一致性和可靠性。最後,為了評估N-甲基葡糖醯胺在其他血液或血漿相關基質中是否仍然有效,於類似條件下在人類免疫球蛋白G以及人類血漿中測定病毒去活化。總之,這個系統性方法使得所揭示的具體例得以證明N-甲基葡糖醯胺在純化過程中的適用性。
這個使用N-甲基葡糖醯胺去活化病毒的方法適用於生物活性藥物(諸如蛋白質次單位、蛋白質(酶,因子等)、重組蛋白質,或抗體)的純化過程。在該方法中使用對環境更安全(也稱作非生態毒性)的清潔劑是基於多個N-甲基葡糖醯胺同系物,其由透過醯胺鍵連接的親水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸尾部所組成。由於在N-甲基葡糖醯胺中沒有已知的有毒中間體(諸如辛基酚),因此當用於生物製品生產時,它會降低與環境問題相關的風險。另外,這些糖類清潔劑本質上是非離子性,其應不會破壞感興趣藥物蛋白質。這個方法涉及將N-甲基葡糖醯胺與生物產物一起培育,以去活化任何潛在的包膜病毒汙染物。為了評估透過這個方法的病毒減少,將模型包膜病毒(例如異嗜性白血病病毒、偽狂犬病病毒和牛病毒性腹瀉病毒)摻入蛋白質藥物樣品(例如天然蛋白質、重組蛋白質、抗體)中並與N-甲基葡糖醯胺一起培育。培育之後,進行TCID50分析以確定病毒力價和對數減少因子(LRF)(其為未處理對照和經N-甲基葡糖醯胺處理樣品之間病毒感染性力價的差異)。此外,使用N-甲基葡糖醯胺的包膜病毒去活化與業界標準品(Triton X-100)相當。總之,這些優異特性使得N-甲基葡糖醯胺成為生物衍生藥物產物純化過程中的有力工具。
低力價和高力價異嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)原液菌株pNFSTh-1分 別在拜耳病原體安全性實驗室(Berkeley,CA)或Bioreliance Inc.(Rockville,MD)內部製備。高力價豬偽狂犬病病毒(PPV)原液菌株Aujeszky由Bioreliance Inc.(Rockville,MD)製備。高力價牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)原液菌株NADL也由Bioreliance Inc.(Rockville,MD)製備。
貓PG-4細胞(S+L-)(ATCC CRL-2032)、非洲綠猴腎Vero細胞(ATCC CCL-81)以及牛胚氣管EBTr細胞(ATCC CCL-44)是購自於美國典型培養物保存中心(ATCC,www.atcc.org)。
用於PG-4、Vero與ETBr細胞的培養基為McCoy’s 5A(Lonza,12-688F,Slough,UK)和最低必須培養基依格(Corning,10-010-CV,Manassas,VA)。使用下列生長培養基補充物:胎牛血清(FBS)(Hyclone,SH30070.03,Logan,UT)、100x青黴素/鏈黴素(P/S)(Corning,30-002-Cl,Manassas,VA),以及200mM L-麩胺酸(L-Glu)(MP Biomedicals,1680149,Solon,OH)。
化學品溴化己二甲銨(聚凝胺(Polybrene))(Sigma-Aldrich,H9268-5g,St.Louis,MO)用於增加PG-4細胞中的X-MuLV感染效率,並以3μg/ml的最終濃度被添加至McCoy’s 5A培養基。在本研究中經特徵分析的非離子性清潔劑為辛醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 8)(G-Biosciences,DG017,St.Louis,MO或Sigma或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、壬醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 9)(G-Biosciences,DG019,St.Louis,MO或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、癸醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 10)(G-Biosciences,DG021,St.Louis,MO或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、十二醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 12)(Bachem,P-1175.0001,Torrance,CA),以及P-第三辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇 (Triton X-100)(EMD Millipore,1086432500,Billerica,MA)。
各個病毒去活化分析是在生物產物溶液存在下進行,生物產物溶液是由重組人類因子VIII(rFVIII)(全長野生型,拜耳自家製品)、人類IgG或血漿蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)組成。
以5%重量/體積(w/v)原液的目標濃度製備Mega8、Mega9、Mega10和Mega12清潔劑。以粉末形式從製造商獲得每種清潔劑,並適當稱重且使其溶解在Milli-Q水中。如果清潔劑在室溫下沒有完全溶解,則將溶液在37℃的水浴(Mega 10和Mega 12)中加熱歷時約10-15分鐘。最初,5% Mega 12在37℃下並沒有溶解於溶液中,因此,放置在60℃水浴中且溶液在30分鐘後溶解。由於Mega 12的臨界微胞濃度為0.013%,至少10x原液可能方便用於病毒去活化。因此,在Milli-Q水中以0.15%的濃度製備一個新原液,當置於60℃水浴中(約15分鐘)時,混合物可以更快地溶解。將清潔劑儲存在2-8℃的深色容器中。
在重組因子VIII(rFVIII)治療藥物的典型製造條件下,評估N-甲基葡糖醯胺清潔劑(Mega 8、Mega 9、Mega 10,和Mega12)有效且穩健地使異嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)、豬偽狂犬病病毒(PRV),或牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)去活化的能力。每種清潔劑的測試濃度分別是基於臨界微胞濃度(CMC)的0.5x、1x或2x。將每種清潔劑與不含清潔劑的rFVIII蛋白一起培育,並以1:11的比例與高力價X-MuLV原液摻合,且在2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。納入僅含有rFVIII的陽性對照樣品並在2.0±1.0℃下培育歷時0分鐘和30 分鐘。在每個培育時間點之後,取出40μL的每種去活化樣品或對照並轉移至含有4.0mL基礎培養基(亦即,用於X-MuLV的McCoy's5A培養基,補充有3μg/mL的聚凝胺(MP);或EMEM)的15mL管。這個1:101稀釋因素淬滅允許清潔劑稀釋超出對指示細胞株的毒性效果,還允許病毒在用於進行TCID50分析所需的範圍內稀釋。簡言之,評估病毒感染性的TCID50分析是透過在MP或EMEM中滴定各個淬滅樣品連續1:3.2倍至多到第11個稀釋級次來施行。1天之前,在96孔細胞培養盤中每孔3,000個細胞的單層指示細胞,接種100μL每個稀釋度的淬滅與連續稀釋樣品或基礎培養基,重複8次。在37℃下培育1.5至2.5小時之後,向盤的每個孔中添加100μL由基礎培養基(McCoy's5A或用於PRV或BVDV的EMEM)組成的分析培養基,培養基補充4% FBS、2% P/S和2% L-Glu。然後將細胞在37℃下培育至多6-7天,並在光學顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)的形成,其表示為病毒感染。
在rFVIII基質(來自於Milli-Q H2O中製備的5.0%(w/v)原液)中,以0.3%(w/v)的濃度來製備Mega 10,並在2.0±1.0℃下培育歷時120分鐘。還製備了僅摻入Milli-Q H2O的rFVIII基質的稀釋劑對照,並在相同條件下進行培育。培育後,將清潔劑和稀釋劑對照稀釋於1x分析緩衝液中,同時進行顯色分析(Chromogenix COATEST SP4 FVIII Kit,Cat:82409463)FVIII標準品與對照至適當的水平。將30μL的各個清潔劑、對照和標準品以三重複加載到96孔盤上。根據製造商的方案添加顯色分析試劑,並在37.0℃和5.0% CO2下培育歷時8分鐘。在Molecular Devices SpectraMax M5微量盤讀取儀上測量分析盤在t 405和492nm下的吸光度。數據是使用SoftMax Pro V5進行分析。
為了評估與rFVIII一起培育並摻入X-MuLV的Mega 10清潔劑的最低有 效濃度,進行清潔劑劑量反應研究。在重組FVIII(rFVIII)基質中製備0.5%(w/v)的各個清潔劑樣品,然後在rFVIII基質中進行1:2連續稀釋,得到每種清潔劑的6個樣品,範圍為0.014-0.5%(w/v)。另外,納入僅含有rFVIII基質的陽性對照樣品。每種清潔劑樣品和對照以1:11的比例與低力價X-MuLV原液摻合,並在2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。在培育後,取出100μL的各個去活化樣品和對照並轉移至含有3.0mL McCoy's 5A培養基(補充3μg/mL聚凝胺(MP))的15mL管。這個1:31稀釋因素淬滅允許清潔劑稀釋超出對指示細胞株(PG-4)之毒性效果,還允許XMuLV在用於進行TCID50分析所需的範圍內稀釋。簡言之,評估X-MuLV感染性的TCID50分析是透過在MP中滴定各個淬滅樣品連續1:3.2-倍至多到第11個稀釋級次來施行。1天之前,每孔3,000個細胞的單層PG-4細胞,接種100μL每個稀釋度的淬滅樣品或MP,重複8次。在37℃下培育1.5-2.5小時之後,使用100μL由McCoy’s 5A培養基組成的分析培養基(補充有4% FBS,2% P/S和2% L-Glu)來覆蓋細胞。然後將細胞在37℃下培育至多6-7天,並在光學顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)的形成,其表示為X-MuLV感染。
為了評估與rFVIII一起培育並摻入X-MuLV的Mega 10清潔劑的去活化率,進行病毒去活化動力學研究。在重組FVIII(rFVIII)無Triton基質中製備0.02%、0.10%、0.20%與0.30%(w/v)的Mega 10樣品。另外,納入僅含有rFVIII基質的陽性對照樣品或僅培養基的對照。每種清潔劑樣品和對照以1:11的比例與低力價和高力價X-MuLV原液摻合,並在2.0±1.0℃下培育歷時0、5、15、30、60和120分鐘。在各自培育後,取出100或40μL的各個去活化樣品和對照並轉移至含有3.0mL或4.0mL McCoy's 5A培養基(補充3μg/mL聚凝胺(MP))的15mL管。這個1:31(低力價X-MuLV)或1:101(高力價X-MuLV)稀 釋因素淬滅允許清潔劑稀釋超出對指示細胞株(PG-4)之毒性效果,還允許XMuLV在用於進行TCID50分析所需的範圍內稀釋。簡言之,評估X-MuLV感染性的TCID50分析是透過在MP中滴定各個淬滅樣品1:3.2至多到第11個稀釋級次來施行。1天之前,每孔3,000個細胞的單層PG-4細胞,接種100μL每個稀釋度的淬滅樣品或MP,重複8次。在37℃與5% CO2下培育1.5-2.5小時之後,使用100μL由McCoy’s 5A培養基組成的分析培養基(補充有4% FBS,2% P/S和2% L-Glu)來覆蓋細胞。然後將細胞在37℃與5% CO2下培育至多6-7天,並在光學顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)的形成,其表示為X-MuLV感染。
在人類血漿、血漿衍生生物劑或人類抗體的典型製造條件下,評估N-甲基葡糖醯胺清潔劑(Mega 8、Mega 9、Mega 10與Mega 12)有效且穩健使X-MuLV、PRV或BVDV去活化的能力。每種清潔劑的測試濃度分別是基於臨界微胞濃度(CMC)的0.5x、1x或2x。將每種清潔劑與無清潔劑的蛋白質及多種濃度的蛋白質(高蛋白質梯度)一起培育,並以1:11的比例與高力價X-MuLV原液摻合,且在2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。納入僅含有個別蛋白質的陽性對照樣品並在2.0±1.0℃下培育歷時0分鐘和30分鐘。在每個培育時間點之後,取出40μL的每種去活化樣品或對照並轉移至含有4.0mL基礎培養基(亦即,用於X-MuLV的McCoy's5A培養基,補充有3μg/mL的聚凝胺(MP);或用於PRV或BVDV的EMEM)的15mL管。這個1:101稀釋因素淬滅允許清潔劑稀釋超出對指示細胞株的毒性效果,還允許病毒在用於進行TCID50分析所需的範圍內稀釋。簡言之,評估病毒感染性的TCID50分析是透過在基礎培養基(MP或EMEM)中滴定各個樣品連續1:3.2倍至多到第11個稀釋級次。1天之前,每孔3,000個細胞的單層指示細胞,接種100μL每個 稀釋度的淬滅樣品或基礎培養基,重複8次。在37℃下培育1.5至2.5小時,使用100μL由基礎培養基(McCoy's5A或EMEM)組成的分析培養基(補充4% FBS、2% P/S和2% L-Glu)來覆蓋細胞。然後將細胞在37℃下培育至多6-7天,並在光學顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)的形成,其表示為病毒感染。
針對本研究分析了四種甲基葡糖醯胺類清潔劑:辛醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 8)、壬醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 9)、癸醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 10)以及十二醯基-N-甲基葡糖醯胺(Mega 12)(表1)。這些清潔劑都是商業上可獲得的N-甲基葡糖醯胺,並且從多個供應商(G-Biosciences、Sigma或Bachem)以粉末形式購得多個批次。
圖1顯示了清潔劑如何破壞病毒包膜的提議理論機制。通常,在低於個別清潔劑的臨界微胞濃度(CMC)下,清潔劑單體可以插入病毒包膜內,其可以允許或消除病毒附接至細胞(宿主)。在濃度高於CMC時,更多種單體插入到病毒包膜引起病毒包膜的完全破壞,且單體可以與自身或與從不完整包膜的微胞和病毒蛋白質的混合物形成微胞。如本件專利案中的後續實例中所述,CMC似乎是有效濃度的指標(實例3)。在處於CMC或以上的濃度下,在本研究中測試的每種甲基葡糖醯胺清潔劑發生病毒去活化。
N-甲基葡糖醯胺含有透過醯胺鍵連接的非環狀親水性葡萄糖極性頭基和疏水性脂肪酸鏈尾部(由8-10或12個碳組成)(圖2)。基於表1,N-甲基葡糖醯胺的組成類似,僅在碳鏈長度有所不同,其與分子量增加成比例相關。基於其他人的研究工作,隨著脂肪酸鏈中的碳增加,臨界微胞濃度(CMC)反向降低。
圖3顯示了本研究中使用的N-甲基葡糖醯胺的二維(2D)和三維(3D)結構。2D和3D結構都顯示出碳、氫、氧和氮分子有類似排列。有趣的是,Mega 8與其他N-甲基葡糖醯胺之間的分子堆集可能形成頭對頭雙層堆集,而其他可能堆集為頭對尾單層堆集。(Jeffery and Malusynksa,1988,Acta Cryst.,B45:447-452)。隨著碳鏈增加,這種堆集差異可能有助於提高效力。
表2列出了清潔劑粉末和內部製品的製造商,這些也在方法部分中詳述。在所製備清潔劑的5%(按體積重量,w/v)中,Mega 8和Mega 9容易地於室溫下溶解於水中。Mega10必須在37℃水浴中加熱,使溶液在15分鐘內溶解。然而,Mega 12不能夠在37℃水浴中溶解於水中,並在60℃水浴中逐漸溶解歷時至少5分鐘。其他者也觀察到了這個情況,並且可能與脂肪鏈長度增加會增強疏水性,從而增少溶解度的可能性有關,特別是在水中(Gaber et al.,Burczyk,2007)。因此,在Milli-Q水中製備了新的0.15%原液,其為CMC的至少10x。在15分鐘內置放於60℃水浴中時,這個新製品能夠溶至溶液中。
存在有許多包膜RNA和DNA病毒,諸如屬於以下病毒科者:逆轉錄病毒科、黃病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、棒狀病毒科、布尼亞病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、沙粒病毒科、嗜肝DNA病毒科、皰疹病毒科、桿狀病毒科和痘病毒科。來自任何這些科的許多血源性病毒可能會汙染用於製造生物活性藥物產物的動物衍生產物。因此,許多製藥公司已使用了模型病毒,如鼠白血病病毒(X-MuLV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和偽狂犬病病毒(PRV)來證明使用其各種純化方法的病毒清除(表3)。X-MuLV是經常用於內源性逆轉錄病毒樣顆粒宿主細胞株(亦即CHO或BHK細胞)以表現蛋白質藥物產物的模型病毒。X-MuLV也是一種其他包膜病毒的模型,包括逆轉錄病毒,例如主要血源性病原體HIV。BVDV是黃病毒的模型,且可以代表諸如茲卡病毒(涉入最近世界性爆發)和C型肝炎病毒(HCV)的病毒。PRV是嗜肝DNA病毒的一個模型,且可代表B型肝炎病毒 (HBV),其為最常見的血源性病原體之一。理論上,這些包膜病毒都對使用N-甲基葡糖醯胺的清潔劑去活化敏感。
使用X-MuLV的低力價和高力價原液來評估N-甲基葡糖醯胺病毒去活化的典型條件(表4)。將低力價的X-MuLV原液用於劑量-反應研究和動力學研究。將高力價的X-MuLV原液用於動力學研究並測定以對數減少因子(LRF)表示的高病毒去活化能力。納入表4中的其他病毒為BVDV和PRV的高力價的病毒原液,這應也是對N-甲基葡糖醯胺清潔劑去活化敏感。
測試了N-甲基葡糖醯胺衍生物去活化高力價X-MuLV原液的能力。在0.5x、1x和2x的CMC下測試每種清潔劑(Mega 8、Mega 9、Mega 10或Mega 12),並與蛋白質藥物(重組因子VIII、rFVIII、抗體或血漿)混合且與包膜病毒(即X-MuLV、PRV,或BVdV)摻合,並在RT或2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。培育之後,淬滅反應並使用適當指示細胞(PG-4、Vero或EBTr細胞)進行TCID50力價分析。TCID50回答了兩個問題:在所測試的任何一孔中是否有任何可觀察到的病毒感染?如果有,則測試樣品中的病毒量(力價)是多 少?一如所料,在2℃和室溫(25℃)下的30分鐘培育之後,測得與X-MuLV摻合的rFVIII對照的力價分別平均為6.40和6.45Log10 TCID50/mL(圖4和圖5)。就各個溫度條件來說,N-甲基葡糖醯胺(MEGA 8、9,10和12)及其測試濃度去活化X-MuLV至偵測限值(LOD)時,若N-甲基葡糖醯胺濃度為1×CMC或以上,表示完全去活化的病毒感染性為104.3-倍或對數減少因子(LRF)為4.3(圖4與圖5,表5和表6)。重要的是注意到偵測限值(LOD)為2.03Log10 TCID50/mL,這也是沒有觀察到病毒時的力價。濃度在0.5x CMC下的Mega 9和Mega 10於25℃時完全去活化X-MuLV,但在2℃為部分去活化。當處理在25℃或2℃下進行時,Mega 8和Mega 12於0.5x CMC下沒有顯著去活化(圖4和圖5)。
N-甲基葡糖醯胺對X-MuLV的去活化與Triton X-100一樣有效,但對分析指示細胞的毒性較小(圖6)。在0.3%(w/v)下,兩種清潔劑皆完全去活化X-MuLV;Mega 10得到的偵測限值(LOD)為2.03TCID50/mL,而Triton X-100的LOD為2.54TCID50/mL(圖6)。總之,這些結果顯示這些生態友善型清潔劑在病毒去活化上是有效且穩健的。
在N-甲基葡糖醯胺篩選之後,由於在較低濃度(~0.2%)下的效力高和溶解度,Mega 10確定為最好的N-甲基葡糖醯胺候選物。為了確保Mega 10不會對蛋白質藥物活性產生負面影響,使用顯色分析套組來測量rFVIII製品的活性。分析的原理涉及血液凝固機制中的特定步驟,其中因子X被轉化為因子Xa,導致顯色受質水解。這個反應是取決於因子VIII(FVIII)的活性,且與可測量的顏色強度直接相關。rFVIII製品的樣品與0.3%(重量/體積,w/v)的Mega 10或0.3%(體積/體積,v/v)的水在2.0±1.0℃下一起培育歷時2小時,並使用顯色分析套組來測定rFVIII的活性。水對照和經Mega 10處理的樣品的平均活性(IU/mL)相當,分別為57.19IU/mL和52.26IU/mL(圖7)。這些結果指出,即使在與Mega 10一起培育2小時後仍保有rFVIII活性,這是一個遠遠超過30分鐘病毒去活化的時間點。結果證明,Mega 10不僅有效去活化包膜病毒,對蛋白質藥物的活性也沒有任何影響。
為了確認Mega 10的最低有效濃度,進行劑量反應研究。將範圍為0.014-0.5%(重量/體積,w/v)之漸增濃度與重組FVIII(rFVIII)在2.0±1.0℃下一起培育並摻入X-MuLV(低力價)歷時30分鐘。僅有rFVIII的對照也在相同條件下進行培育。培育之後,淬滅所有反應,並取出樣品在TCID50分析中進行連續稀釋。關於Mega 10反應,病毒力價相當於濃度為0.014-0.06%(w/v) 之間的對照,這指出Mega 10在那些低濃度下不能夠去活化所述包膜病毒(圖8)。只要Mega 10濃度增加至約0.11%,病毒力價顯著降低至約2.62Log10 TCID50/mL。在約0.23%的Mega 10下,病毒力價顯著降低至未觀察到病毒感染的水平(圖7和表7)。在0.23%(w/v)下,Mega 10的偵測限值(LOD)是1.52Log10 TCID50/mL,因此mega 10在2.0±1.0℃下歷時30分鐘的LRF是3.96(表7)。總之,就Mega 10來說,快速且完全去活化X-MuLV的最低濃度約為0.23%。
使用低力價和高力價病毒製品進行動力學研究,以確定Mega 10可以多快和多廣泛地去活化X-MuLV。動力學研究需要多種濃度(0.02%、0.10%、0.20%和0.30%(w/v))、時間點(0、5、15、30、60和120分鐘)以及低力價和高力價X-MuLV原液。透過測試額外的高力價X-MuLV原液,可以達到更高的分析靈敏度,這將反映在對數減少因子更高。在2.0±1.0℃下將0.3%的Mega 10與重組FVIII(rFVIII)製品一起培育,並摻入低力價X-MuLV病毒歷時0、5、15、30、60和120分鐘。然後,淬滅反應樣品並取樣品進行TCID50分析。關於Mega 10的結果顯示,病毒在X-MuLV與含有清潔劑的樣品混合後(t~0)立即去活化(圖9)。在任何分析時間點沒有偵測到病毒感染性,再次指出完全去活化的偵測限值達到1.52Log10 TCID50/mL且對數減少因子為3.80。
在重複使用高力價X-MuLV原液和多個Mega 10濃度的類似實驗後,於0分鐘(t~0)(0.20% Mega 10)觀察到病毒部分去活化,5分鐘前達到完全去活化(0.20% Mega 10)(圖10)。值得注意的是,在0.20%的Mega 10下,從培育5到120分鐘沒有觀察到活病毒,偵測限值為2.03Log10 TCID50/mL,導致病毒感染性減少104.80倍(表9)。這個實例證明,Mega 10在低濃度下於0-5分鐘的範圍內快速作用非常地有效。
為了確保Mega 10在多個供應商和製造批次之間的一致性,進行劑量反應,其比較來自G-Bioscience和Sigma的清潔劑產物。就每個供應商來說,以多種濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4% w/v)製備樣品,並在2.0±1.0℃下與重組FVIII(rFVIII)一起培育,且摻入X-MuLV(高力價)歷時30分鐘。僅rFVIII的對照也在相同條件下進行培育。培育之後,淬滅所有反應並滴定TCID50分析。對於每個G-Bioscience和Sigma生產的Mega 10樣品,病毒力價在其各自的濃度水平下彼此一致(圖11)。X-MuLV去活化概況顯示,兩種來源的Mega 10產物相當。用0.2-0.4% Mega 10的各產物處理樣品,得到完全去活化為2.03Log10 TCID50/mL而LRF為4.45。總之,來自不同來源的Mega 10產生彼此之間以及與先前數據一致的結果。
為了進一步確定透過N-甲基葡糖醯胺有效且快速的X-MuLV去活化是否同樣適用其他包膜病毒,在重組FVIII(rFVIII的)溶液中評估Mega 9與Mega 10去活化BVDV和PRV的能力。
經由劑量反應研究測定透過Mega 9和Mega 10的BVDV去活化。含有0.5、0.8和1.0%(w/v)Mega 9和0.2、0.3和0.4%(w/v)Mega 10的rFVIII樣品以1:11與BVDV原液摻合並在2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。培育之後,將樣品猝滅並進行滴定以使用EBTr指示細胞進行TCID50分析。結果顯示,Mega 9能夠僅以1.0%的濃度去活化BVDV達到偵測限值(2.03Log10 TCID50/mL)。Mega 10在0.2、0.3和0.4%(w/v)下能夠完全去活化BVDV。兩種清潔劑都能夠減少BDVD的感染性達105.14倍。
將PRV摻入(1:11)含有0.2或0.3%(w/v)Mega 10的rFVIII製品中,並在2.0±1.0℃下於0、5、15、30和60分鐘的時間點時進行分析。培育之後,將樣品淬滅,並在TCID50分析中使用Vero指示細胞進行滴定。結果顯示,0.2和0.3% Mega 10均能夠立即降低病毒感染性達104.5倍或更高,並在15分鐘時達到偵測限值(2.03Log10 TCID50/mL),兩種濃度的Mega 10均降低感染性105.10倍(圖12)。
總之,Mega 10能夠在0.2%下於15分鐘內去活化PRV,以及在0.2%下於混合後立即去活化BVDV,表示BVDV感染性降低105.14倍。Mega 9在處理30分鐘內有效去活化BVDV達LOD為1.0%(w/v)。Mega 10和Mega 9都能夠去活化BVDV達LOD,代表BVDV感染性降低105.14倍。Mega 10去活化BVDV比Mega 9快得多且濃度低。這些結果證明,無論病毒的科和種為何,N-甲基葡糖醯胺都能有效地去活化包膜病毒(圖13)。
用其他化合物測試甲基葡糖醯胺以確認對病毒去活化的潛在協同效應。將甲基葡糖醯胺與或不與Tween 20(Tw20)清潔劑、磷酸三(正丁基)酯(TnBP)溶劑或氯化鈉(NaCl)鹽混合,並與X-MuLV一起培育。然後,使用先前描述的TCID50分析來分析每個樣品或對照的力價。針對每個實驗(圖15、16和17),對照組由摻入X-MuLV且不含清潔劑的rFVIII組成,而產生的力價在約6.5log10 TCID50/mL的預期範圍。將濃度為0.05%(w/v)、0.10%(w/v)或0.30%(w/v)的Mega 10與0.01%(w/v),0.02%(w/w)或0.06%(w/v)的常用Tw20清潔劑混合,病毒力價與單獨Mega 10相當(圖15)。因此,Mega 10+Tw20沒有進一步提高病毒去活化。將濃度為0.05%(w/v)或0.30%(w/v)的Mega 10與0.05%(w/v)或0.30%(w/v)的常用TnBP溶劑(分別)混合,與單獨的0.05%(w/v)Mega10相比,0.05%(w/v)Mega 10+0.05%(w/v)TnBP的病毒力價略為降低(圖16)。因此,Mega 10+TnBP略微提高病毒去活化。最後,濃度0.10%(w/v)Mega10或0.51%(w/v)Mega9與500mM NaCl混合,相較於僅只0.10%(w/v)Mega 10或0.51%(w/v)Mega 9,病毒力價降低(圖17)。因此,Mega 10或Mega 9+NaCl提高病毒去活化。總之,結果顯示在甲基葡糖醯胺和TnBP或NaCl之間觀察到協同效應,並且可以用於提高甲基葡糖醯胺的病毒去活化效率。
到目前為止,Mega 10已被證明在重組FVIII蛋白質基質中是多種包膜病毒的有效去活化劑。為了評估Mega 10在其它血漿相關蛋白質基質中是否有效,在人類免疫球蛋白G(IgG)與血漿溶液中進行X-MuLV去活化。每種蛋白質基質樣品均以30mg/mL的濃度製備,含有0.2、0.3和0.4%(w/v)Mega10,並摻入X-MuLV原液(1:11),且在2.0±1.0℃下培育歷時30分鐘。培 育之後,將樣品淬滅並使用PG-4指示細胞在TCID50分析中進行連續稀釋。結果顯示,在這兩種人類IgG和人類血漿樣品中,Mega 10能夠去活化X-MuLV達到偵測限值(2.03Log10 TCID50/mL)並減少X-MuLV感染性達104.46倍(IgG)和103.50倍(人類血漿溶液中)(圖14)。兩種蛋白質基質的病毒感染性降低值的差異是由於人類血漿樣品相較IgG陽性對照具有較低的陽性對照病毒力價。這個差異的原因咸信是因為血漿在進行實驗前並未被熱去活化,導致補體媒介的病毒去活化不具特異性。總之,Mega 10能夠像rFVIII蛋白質溶液中一樣在多種血液相關蛋白質基質中有效且快速地去活化X-MuLV,指出N-甲基葡糖醯胺的病毒去活化不受生物產物類型,來源和濃度所影響。
這種用N-甲基葡糖醯胺去活化病毒的方法適用於生物活性藥物(諸如蛋白質次單位、蛋白質(酶,因子等)、重組蛋白質或抗體或人類血液/血漿衍生治療劑)的純化過程。在這個方法中使用的對環境安全的清潔劑是糖類多種N-甲基葡糖醯胺同系物,其由親水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸尾部透過醯胺鍵連接所組成。因為沒有已知的毒性中間體(諸如N-甲基葡糖醯胺中的辛基酚),它減低了與環境問題有關的風險。另外,這些糖類清潔劑本身無毒,其已被證明不會破壞感興趣的藥物蛋白質。從本質上來說,N-甲基葡糖醯胺應該對無包膜病毒以及核酸製品沒有影響。這個方法涉及將N-甲基葡糖醯胺與蛋白質藥物產物一起培育,以去活化任何潛在的包膜病毒汙染物。為了透過這種方法評估病毒減少,多個模型包膜病毒(例如異嗜性白血病病毒、偽狂犬病病毒和牛病毒性腹瀉病毒)分別被摻入蛋白質藥物樣品(例如天然蛋白質、重組蛋白質、抗體、人類血漿)中,並與N-甲基葡糖醯胺一起培育。在培育之後,進行TCID50分析,以確定病毒感染性力價。此外,用N-甲基葡糖醯胺去活化包膜病毒與經充分證明的病毒去活化清潔劑 Triton X-100相當。總之,這些優異的特性使得N-甲基葡糖醯胺成為生物衍生藥物產物純化過程中的有力工具。
Claims (14)
- 一種純化具有未經鑑定之包膜病毒汙染物之感興趣生物產物溶液的方法,其包含:(a)將感興趣的生物產物溶液以及濃度為0.1至0.3%(w/v)之N-甲基葡糖醯胺溶液於2.0±1.0℃一起培育30分鐘,直到該生物產物溶液中存在的包膜病毒汙染物去活化以形成去活化病毒汙染物;以及(b)純化步驟(a)之生物產物溶液,以去除該去活化病毒汙染物。
- 如請求項1之方法,其中該包膜病毒包含RNA或DNA病毒,單股或雙股病毒。
- 如請求項1之方法,其中包膜病毒已被摻入該生物產物溶液中。
- 如請求項2之方法,其中該病毒進一步包含逆轉錄病毒。
- 如請求項1之方法,其中該病毒屬於選自下列組成之群中的一或多個下列病毒科:逆轉錄病毒科、黃病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、棒狀病毒科、布尼亞病毒科(Bunyaviriae)、正黏液病毒科、副黏液病毒科、沙粒病毒科、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、皰疹病毒科、桿狀病毒科和痘病毒科。
- 如請求項1之方法,其中該包膜病毒包含異嗜性白血病病毒、偽狂犬病病毒或牛病毒性腹瀉病毒。
- 如請求項1之方法,其中N-甲基葡糖醯胺由藉由醯胺鍵連接至非環狀、親水性葡萄糖部分的碳長度為n之脂肪酸疏水性鏈所組成,其中n不小於3。
- 如請求項1之方法,其中N-甲基葡糖醯胺選自由Mega 8、Mega 9、Mega 10、Mega 11以及Mega 12組成之群。
- 如請求項1之方法,其中該生物產物選自由重組蛋白質、抗體、細胞激素、血漿蛋白質、疫苗溶液、核酸治療劑以及基因療法產物組成之群。
- 如請求項1之方法,其中該生物產物是由真核細胞所產生。
- 如請求項10之方法,其中該真核細胞包含哺乳動物細胞。
- 如請求項1之方法,其中該生物產物是由原核細胞所產生。
- 如請求項8之方法,其中該包膜病毒已摻入至生物產物溶液中。
- 一種在包膜病毒溶液中去活化包膜病毒的方法,包含:(a)於2.0±1.0℃向包膜病毒溶液添加濃度為0.1至0.3%(w/v)之N-甲基葡糖醯胺溶液歷時30分鐘,以及(b)去活化該包膜病毒溶液中的包膜病毒。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762559812P | 2017-09-18 | 2017-09-18 | |
US62/559,812 | 2017-09-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201925163A TW201925163A (zh) | 2019-07-01 |
TWI834623B true TWI834623B (zh) | 2024-03-11 |
Family
ID=63762999
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW107132077A TWI834623B (zh) | 2017-09-18 | 2018-09-12 | 使用n-甲基葡糖醯胺及其衍生物以使病毒去活化之方法 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11564392B2 (zh) |
EP (1) | EP3684921A1 (zh) |
JP (2) | JP7317005B2 (zh) |
KR (1) | KR20200052370A (zh) |
CN (1) | CN111108193A (zh) |
AU (1) | AU2018331357A1 (zh) |
BR (1) | BR112020005229A2 (zh) |
CA (1) | CA3075853A1 (zh) |
IL (1) | IL273229A (zh) |
MX (1) | MX2020002939A (zh) |
PE (1) | PE20201167A1 (zh) |
SG (1) | SG11202002449PA (zh) |
TW (1) | TWI834623B (zh) |
WO (1) | WO2019055463A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7317005B2 (ja) * | 2017-09-18 | 2023-07-28 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | N-メチルグルカミドとその誘導体を使用したウイルスの不活化方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5733885A (en) * | 1992-12-16 | 1998-03-31 | Immuno Aktiengesellschaft | Method of producing a virus-safe biological preparation |
CN102766606A (zh) * | 2006-12-15 | 2012-11-07 | 先灵-普劳有限公司 | 在培养物中复制流感病毒的方法 |
WO2015073633A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Genentech, Inc. | Methods for viral inactivation using eco-friendly detergents |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5650270A (en) | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
SE8405493D0 (sv) | 1984-11-01 | 1984-11-01 | Bror Morein | Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel |
DE3704550A1 (de) * | 1987-02-13 | 1988-08-25 | Behringwerke Ag | Verfahren zur inaktivierung huellhaltiger viren in mittels einer zelle in vitro hergestellten protein-praeparationen |
DE4103800A1 (de) | 1990-09-27 | 1992-04-02 | Helmuth Schmoock | Folie |
DE4125625C2 (de) | 1991-08-02 | 1999-12-02 | Octapharma Ag Glarus | Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten Immunglobulinlösungen |
US5695928A (en) | 1993-12-10 | 1997-12-09 | Novartis Corporation | Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction |
DE19528221C2 (de) | 1995-08-01 | 1998-10-22 | Blutspendedienst Der Drk Lande | Verfahren zur Herstellung eines virussicheren, therapeutischen Präparates aus Humanplasma |
CA2175719A1 (en) | 1996-05-03 | 1997-11-04 | Brian J. Underdown | Compositions and methods for protection against immunologically diverse isolates of influenza virus |
US6093743A (en) | 1998-06-23 | 2000-07-25 | Medinox Inc. | Therapeutic methods employing disulfide derivatives of dithiocarbamates and compositions useful therefor |
WO2000024377A1 (en) | 1998-10-23 | 2000-05-04 | Idea Innovative Dermale Applikationen Gmbh | Method for developing, testing and using associates of macromolecules and complex aggregates for improved payload and controllable de/association rates |
WO2002065125A1 (en) | 2001-02-13 | 2002-08-22 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for isolation of biological macromolecules |
US8546075B2 (en) | 2003-10-28 | 2013-10-01 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method of detecting hepatitis C virus |
JP4131850B2 (ja) | 2003-12-04 | 2008-08-13 | アークレイ株式会社 | インフルエンザウイルスの免疫学的測定方法 |
DE602005025626D1 (de) | 2004-05-19 | 2011-02-10 | Advanced Life Science Inst Inc | Verfahren zum nachweis von hepatitis-b-virus |
CN101023098B (zh) | 2004-09-22 | 2012-07-18 | 株式会社先端生命科学研究所 | 乙肝病毒s抗原的检测方法 |
CA2766173A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-26 | Schering-Plough Ltd. | Method for replicating influenza virus in culture |
CN101081298A (zh) * | 2007-06-26 | 2007-12-05 | 陈少莺 | 一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法 |
CN102083415A (zh) * | 2008-04-18 | 2011-06-01 | 纳米生物公司 | 用于治疗疱疹病毒感染的方法 |
EP2278997B1 (en) | 2008-04-21 | 2016-08-10 | Nanobio Corporation | Nanoemulsion influenza vaccine |
WO2010014903A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed olfactory receptor-based microsurface plasmon polariton detector |
JP2010077091A (ja) | 2008-09-26 | 2010-04-08 | Beacle Inc | B型肝炎ウイルスタンパク質中空バイオナノ粒子とリポソームを用いたsiRNAの内包と細胞選択的なsiRNAの導入方法 |
EP2729169A1 (en) | 2011-07-06 | 2014-05-14 | Nanobio Corporation | Human respiratory syncytial virus vaccine |
EP2879691B1 (en) | 2012-08-06 | 2019-03-27 | Biogen MA Inc. | Methods for inactivating enveloped viruses |
EP3043814B1 (en) | 2013-09-13 | 2020-12-02 | Salipro Biotech AB | Antigen and method for production thereof |
JP2016182112A (ja) | 2015-03-25 | 2016-10-20 | 東ソー株式会社 | ウイルスからの核酸抽出試薬 |
JP7317005B2 (ja) * | 2017-09-18 | 2023-07-28 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | N-メチルグルカミドとその誘導体を使用したウイルスの不活化方法 |
-
2018
- 2018-09-12 JP JP2020515732A patent/JP7317005B2/ja active Active
- 2018-09-12 AU AU2018331357A patent/AU2018331357A1/en active Pending
- 2018-09-12 US US16/646,600 patent/US11564392B2/en active Active
- 2018-09-12 EP EP18782592.2A patent/EP3684921A1/en active Pending
- 2018-09-12 TW TW107132077A patent/TWI834623B/zh active
- 2018-09-12 CA CA3075853A patent/CA3075853A1/en active Pending
- 2018-09-12 KR KR1020207010807A patent/KR20200052370A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-09-12 MX MX2020002939A patent/MX2020002939A/es unknown
- 2018-09-12 PE PE2020000381A patent/PE20201167A1/es unknown
- 2018-09-12 SG SG11202002449PA patent/SG11202002449PA/en unknown
- 2018-09-12 WO PCT/US2018/050579 patent/WO2019055463A1/en unknown
- 2018-09-12 BR BR112020005229-9A patent/BR112020005229A2/pt unknown
- 2018-09-12 CN CN201880060493.4A patent/CN111108193A/zh active Pending
-
2020
- 2020-03-11 IL IL273229A patent/IL273229A/en unknown
-
2022
- 2022-10-28 US US17/975,645 patent/US20230143494A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-07-18 JP JP2023116731A patent/JP2023139096A/ja active Pending
- 2023-12-13 US US18/538,562 patent/US20240196891A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5733885A (en) * | 1992-12-16 | 1998-03-31 | Immuno Aktiengesellschaft | Method of producing a virus-safe biological preparation |
CN102766606A (zh) * | 2006-12-15 | 2012-11-07 | 先灵-普劳有限公司 | 在培养物中复制流感病毒的方法 |
WO2015073633A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Genentech, Inc. | Methods for viral inactivation using eco-friendly detergents |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2020113752A (ru) | 2021-10-20 |
MX2020002939A (es) | 2020-07-22 |
US20240196891A1 (en) | 2024-06-20 |
CN111108193A (zh) | 2020-05-05 |
US20230143494A1 (en) | 2023-05-11 |
EP3684921A1 (en) | 2020-07-29 |
US20200260727A1 (en) | 2020-08-20 |
AU2018331357A1 (en) | 2020-04-02 |
KR20200052370A (ko) | 2020-05-14 |
PE20201167A1 (es) | 2020-10-28 |
CA3075853A1 (en) | 2019-03-21 |
BR112020005229A2 (pt) | 2020-09-24 |
RU2020113752A3 (zh) | 2022-04-22 |
JP2023139096A (ja) | 2023-10-03 |
JP7317005B2 (ja) | 2023-07-28 |
JP2020533987A (ja) | 2020-11-26 |
SG11202002449PA (en) | 2020-04-29 |
US11564392B2 (en) | 2023-01-31 |
WO2019055463A1 (en) | 2019-03-21 |
TW201925163A (zh) | 2019-07-01 |
IL273229A (en) | 2020-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Artika et al. | Pathogenic viruses: Molecular detection and characterization | |
Li et al. | African swine fever virus: a review | |
Cox et al. | FluBlok, a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells | |
US9080204B2 (en) | Compositions and methods for rapid, real-time detection of influenza a virus (H1N1) Swine 2009 | |
Welsh et al. | Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV): propagation, quantitation, and storage | |
US20240196891A1 (en) | Methods of inactivation of viruses using n-methylglucamide and its derivatives | |
Zimmer et al. | Stability and inactivation of vesicular stomatitis virus, a prototype rhabdovirus | |
KR20050114625A (ko) | 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 | |
CN116585504A (zh) | 作为病原体灭活剂的二元醇 | |
JP2005523709A (ja) | インフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの検出のための細胞 | |
Young | Polioviruses, coxsackieviruses, and echoviruses: comparison of the genomes by RNA hybridization | |
JP2019110900A (ja) | 痰試料を処理するための組成物 | |
CN111840535A (zh) | 利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺 | |
Byrne et al. | Prefusion stabilization of the Hendra and Langya virus F proteins | |
RU2783667C2 (ru) | Способы инактивации вирусов с применением n-метилглюкамида и его производных | |
Lauro et al. | Overcoming Biopharmaceutical Interferents for Quantitation of Host Cell DNA Using an Automated, High-Throughput Methodology | |
JP2023024808A (ja) | Rnaウイルス検出方法 | |
JP2023521803A (ja) | ウイルス核酸の検出用製品及びその検出方法 | |
TW202039836A (zh) | 用於連續製造抗體之病毒失活化方法 | |
Das et al. | Assessment and verification of chemical inactivation of peste des petits ruminants virus by virus isolation following virus capture using Nanotrap magnetic virus particles | |
AU7275300A (en) | A method for producing quality assured biological sample and composition containing the same | |
Klimaj et al. | Seoul orthohantavirus evades innate immune activation in reservoir endothelial cells | |
Oladejo et al. | Structural insight into the mechanism of neuraminidase inhibitor-resistant mutations in human-infecting H10N8 Influenza A virus | |
Iqbal | Zoological Approaches for Biochemical Investigation of Viral Infections and COVID-19 | |
Michael | Evaluating Inactivated and Genetically Modified Viruses in Organ Tissue Equivalents |