JP2023139096A - Ｎ－メチルグルカミドとその誘導体を使用したウイルスの不活化方法 - Google Patents

Ｎ－メチルグルカミドとその誘導体を使用したウイルスの不活化方法 Download PDF

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Abstract

【課題】生物学的産物溶液中に存在するあらゆる潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化すること、および、生物学的産物溶液を精製する方法を提供する。【解決手段】未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法であって、（a）対象の生物学的産物溶液を、N－メチルグルカミド溶液とともにインキュベートし、但し、インキュベートする工程が、１から３７℃の温度で行われ、（b）該生物学的産物溶液中に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化し、（c）該生物学的産物を精製することを含む、前記方法を提供する。【選択図】図１

Description

背景
生物学的医薬は、あらゆる種類の生物由来の原材料、すなわち細胞株、細胞培養液、組
織または体液に関するプロセスから生成される分子である。生物由来の治療薬の製造は、
安全性を保証するために多くの精製ステップを必要とする複雑なプロセスである。製造途
中の各工程またはプロセスにおいて、微生物汚染の可能性があることを考慮することが特
に重要である。組み換えタンパク質の生産の場合、生物学的医薬は、大概にして、目的の
遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドＤＮＡを有する遺伝子操作されたヒトまたは動物由来
の細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはベビーハムスター腎
臓（ＢＨＫ）細胞］またはハイブリドーマ細胞、例えばＮＳ０の培養および精製プロセス
を実行する一連の単位操作によって行われる。ＣＨＯ細胞とＢＨＫ細胞が、内因性レトロ
ウイルス様粒子（ＥＲＶＬＰ）をコードする染色体に組み込まれたプロウイルスエレメン
トを持っていることはよく知られている（非特許文献１および２）。全血または血漿由来
の生物学的医薬製剤は、血液由来の病原体、即ち、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝
炎（ＨＣＶ）ウイルスなどによる原料汚染の問題に直面している。また、製造中間体に偶
発的な物質が導入される可能性があり、製造にさらなる課題が生じることとなる。これま
でのところ、バイオリアクターによるウイルス汚染事件に関する多くの報告がある（非特
許文献３および４）。特に、ウイルスの不活化および／または除去は、長年にわたって生
物製剤業界を悩ませてきた。その理由には、ウイルスが由来するソースの多様性とその小
さなサイズが含まれる。
ウイルスは、エンベロープグループと非エンベロープグループに分類される。内因性レ
トロウイルス様粒子は、エンベロープを有し、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞とそれらに関連す
る培養液中に認められ、それにより、さらなる精製ステップ、設備、機器、および環境の
汚染のリスクを引き起こす。現在の方法では感染性は観察されていないが、内因性レトロ
ウイルス様粒子は、患者や産業に潜在的なリスクをもたらす。これらすべての理由により
、製造プロセスからこれらの汚染物質を迅速かつ効果的に不活化および／または除去する
ことがますます重要になっている。
界面活性剤は、さまざまなアレイやアッセイにおいてウイルスを不活化するための重要
なツールとして使用されている。１９８０年代以降、界面活性剤は（輸血や血漿由来の治
療用製品などの血液成分を必要とする患者のための）血液サンプルのプールとサンプルを
取り扱う実験室のスタッフの安全性を高めてきた。最近では、ウイルス汚染の潜在的なリ
スクがある生物学的製剤やワクチンの製造プロセスで界面活性剤が広く使用されている。
生物学的製剤の製造において、エンベロープウイルスの不活化に使用される最もよく特徴
付けられた非常に効果的な界面活性剤は、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅ
ｎ－８０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（別名Ｏｃｔｏｘｉｎｏｌ－１０）およびリン酸
トリ－ｎ－ブチル（ＴｎＢＰ、溶媒としてポリソルベートまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１０
０と共にしばしば使用される）などの非イオン性界面活性剤である。ポリソルベートは室
温条件で非常に効果的であるが、比較的高濃度では、低温で効果が低下する。したがって
、これらの界面活性剤は、生物活性と分子構造の安定化に重要な低温条件を必要とする生
物材料の製造に対して、最適な選択肢ではない可能性がある。
Ｃｈａｎ、Ｓ．Ｙ．、１９９４、Ｗａｎｇ Ｇ．ら １９９９ Ｓｕｚｕｋｉ Ａら １９８２ Ｈｓｉｅｈ、Ｗ．Ｔ．ら ２００８ Ｑｉｕ Ｙ．ら、２０１３
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（オクトキシノール、オクトキシノール－３、プレセプチン
）は、ウイルスを不活化する上で定評のある効果的な界面活性剤である。Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００とその誘導体は、極低温で非常に強力である。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００のオ
クチルフェノール成分は、エストロゲン受容体と相互作用して、曝露された動物の生殖へ
影響をもたらすことが特徴である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むバイオプロセス廃棄
物は、環境に直接排出されると、特に水生生物に悪影響を及ぼす。バイオプロセス廃棄物
からのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の処理または回収は、非常に費用がかかり、面倒である
。生理活性薬物を変更せずにウイルスを効果的に不活化する新しい環境にやさしい（また
は非環境毒性）界面活性剤の追求は、多くの生物医薬品業界にとって優先事項となってい
る。したがって、効果的で堅牢で環境に安全な界面活性剤を発見することは、バイオ医薬
品産業にとって極めて優先されている。
概要
本方法の実施形態は、未同定のエンベロープウイルス汚染物質を有する対象の生物学的
産物溶液を精製することを含み、対象の生物学的産物溶液をＮ－メチルグルカミド溶液と
インキュベートし、生物学的産物溶液中に存在するあらゆる潜在的なエンベロープウイル
ス汚染物質を不活化すること、および、生物学的産物溶液を精製することを含む。
未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法
であって、対象の生物学的産物溶液を標準溶液とインキュベートし、ステップ（ａ）の生
物学的産物溶液に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化すること、ス
テップ（ｂ）の最終溶液中に存在するすべての潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を
不活化すること、対象の分離生物学的産物をＮ－メチルグルカミド溶液とインキュベート
すること、ステップ（ｄ）の最終溶液中に存在する不活化されたウイルスを測定すること
、および、ステップ（ｃ）とステップ（ｅ）の最終溶液の結果を比較することを含む方法
。
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するであろう。図面
は、本教示または特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。
図１は、エンベロープウイルスの界面活性剤破壊の理論的な一般メカニズムを示している。レトロウイルスなどのエンベロープウイルスは、二十面体型のヌクレオカプシドを有し、宿主細胞およびウイルスに由来するウイルスのエンベロープによって保護されている。各界面活性剤分子は親水性の頭と疎水性の尾を持つことにより、両親媒性の構造を有している。この２つの部分によって、各界面活性剤の固有の特性である臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が決定される。界面活性剤モノマーは、特定のＣＭＣ未満でウイルスエンベロープ内に挿入され、宿主へのウイルスの付着を妨害する場合と妨害しない場合がある。一方、ＣＭＣ以上の濃度では、より多くの界面活性剤モノマーがエンベロープに挿入されてエンベロープが破壊され、その結果、ウイルスが宿主細胞表面の受容体に結合できなくなる。 図２は、Ｎ－メチルグルカミド界面活性剤の疎水性（非極性）および親水性（極性）領域を示す。 図３は、Ｎ－メチルグルカミド界面活性剤ホモログの二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）構造を示す。各化合物は、同様に、非環式の親水性グルコース糖部分に結合したアミドによって結合された８～１０個または１２個の炭素からなる疎水性脂肪酸鎖で構成されている。 図４は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）をＣＭＣ の０．５倍、１倍、２倍のＭｅｇａｘ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０およびＭｅｇａ １２と個別にインキュベートした場合、Ｘ－ＭｕＬＶが室温で３０分以内に完全に不活化されることを示している。 図５は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）がＣＭＣの１倍および２倍の各界面活性剤（Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、およびＭｅｇａ １２）と別々にインキュベートされた場合、Ｘ－ＭｕＬＶが２．０ ℃で３０分以内に完全に不活化されることを示している。 図６は、組み換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）中２．０℃で３０分間インキュベートすると、０．３％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０および０．３％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によってＸ－ＭｕＬＶの完全な不活化が達成され、これら２つの界面活性剤が同等の潜在能力を有することを示している。 図７は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）が、２．０℃で水またはＭｅｇａ １０と２時間インキュベートした後でもその活性を維持することを示している。 図８は、Ｘ－ＭｕＬＶおよび漸増濃度のＭｅｇａ １０とともに２．０℃で３０分間インキュベートされた組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の用量反応を示している。用量反応曲線は、この糖界面活性剤の濃度が増加するにつれて、Ｘ－ＭｕＬＶの力価が逆に、検出限界（ＬＯＤ）にまで減少しウイルスが検出されなかったことを示している。ｒＦＶＩＩＩ対照（Ｃｔｒｌ）の破線は、Ｘ－ＭｕＬＶのみとインキュベートしたｒＦＶＩＩＩの力価に対応している。 図９は、Ｘ－ＭｕＬＶおよび０．３％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０と共に２．０℃で０、５、１５、３０、６０、および１２０分間インキュベートした組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の動力学を示している。Ｍｅｇａ １０処理により、ウイルス力価の即時の低下（完全な不活化）が検出限界（ＬＯＤ）に達し、ウイルスは検出されなかった。これは、ｒＦＶＩＩＩのみおよび培地のみの対照とは対照的である。 図１０は、０．０２％、０．１０％または０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０を含むＸ－ＭｕＬＶの高力価ストックと共に２．０℃で０、５、３０、６０および１２０分間インキュベートした組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の動力学を示している。ウイルスの不活化が観察されなかった０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０、ｒＦＶＩＩＩおよび培地のみの対照サンプルとは対照的に、０．１０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０はウイルス力価の低下をもたらし、０．２０％（ｗ／ｖ）はウイルス力価の即時の低下（完全な不活化）を引き起こし、５分以内に検出限界（ＬＯＤ）に達した。 図１１は、製造が異なるＭｅｇａ１０分子が、類似の再現可能な用量反応結果をもたらすことを示している。 図１２は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）でインキュベートしたときに、０．２および０．３（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０で２．０℃、１５分以内にブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が検出限界まで不活化されることを示している。 図１３は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）が、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）中で２．０℃で３０分インキュベートした場合、０．２、０．３、および０．４（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０および１．０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ ９によって、検出限界まで完全に不活化されることを示している。 図１４は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびヒト血漿タンパク質溶液中で０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０とともに２．０℃で３０分間インキュベートすると、Ｘ－ＭｕＬＶが検出限界まで完全に不活化されることを示している。両方のタンパク質溶液は、それぞれが３０ ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように調製された。 図１５は、Ｍｅｇａ １０（Ｍ１０）のみ、Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｗ２０）のみ、および０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）、または０．３０の濃度のＭｅｇａ １０とＴｗ２０無し、または、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）もしくは０．０６％（ｗ／ｖ）のＴｗ２０との混合物によるＸ－ＭｕＬＶの不活化を示している。０．３０％（ｗ／ｖ）０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０単独または０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．０６％（ｗ／ｖ）Ｔｗ２０混合物の濃度では、Ｘ－ＭｕＬＶは３０分以内に完全に不活化された。 図１６は、Ｍｅｇａ １０（Ｍ１０）のみ、リン酸トリ（ｎ－ブチル）（ＴｎＢＰ）のみ、および０．０５％（ｗ／ｖ）または ０．３０％（ｗ／ｖ）の濃度のＭｅｇａ １０とＴｎＢＰ混合物による、Ｘ－ＭｕＬＶの不活化を示す。０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０単独または０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．３０％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰ混合物の濃度では、Ｘ－ＭｕＬＶは３０分以内に完全に不活化された。興味深いことに、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．０５％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰにはウイルス力価の低下があり（完全な不活化ではない）、Ｍｅｇａ １０とＴｎＢＰの間に相乗効果があることを示している。その他の界面活性剤処理では、ウイルス力価はｒＦＶＩＩＩ対照（界面活性剤なし）と同等であり、ウイルスの不活化は生じなかった。 図１７は、５５０ ｍＭ ＮａＣｌとの共存または不在における、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）または０．２０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０あるいは０．３０％（ｗ／ｖ）、０．５１％（ｗ／ｖ）または０．７１％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ ９によるＸ－ＭｕＬＶの不活化を示している。０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０のみ、０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０＋ＮａＣｌ、および５００ｍＭのＮａＣｌと共存または不在の０．７１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ ９の濃度で、Ｘ－ＭｕＬＶは有意に不活化された。０．１０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０＋５５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ ９＋５００ ｍＭ ＮａＣｌにおいてウイルス力価が低下し、このことは、Ｍｅｇａ １０またはＭｅｇａ ９とＮａＣｌの間に相乗効果があることを示している。その他の界面活性剤処理では、ウイルス力価がｒＦＶＩＩＩ対照（界面活性剤なし）とＮａＣｌ対照（界面活性剤なし）と同等であり、ウイルスの不活化は生じなかった。
詳細な説明
この開示は、ウイルス不活化に関連する方法および組成物を提供する。
定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。以下に記載されている定義が、
参照により本明細書に組み込まれている文書を含む他の文書におけるその単語の使用と矛
盾する場合、以下に記載されている定義は、（この用語が最初に使用された文献などで）
反対の意味が明確に意図されていない限り、この明細書とそれに関連するクレームを解釈
する目的で常に支配する。
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆もまた同様で
ある。ここでの「ａ」の使用は、特に明記しない限り、または「１つ以上」の使用が明ら
かに不適切でない限り、「１つ以上」を意味する。「または」の使用は、特に明記しない
限り「および／または」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐ
ｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）
」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用
は交換可能であり、限定的ではない。「など」、「たとえば」、「例」などの用語もまた
、限定を意図したものではない。例えば、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という
用語は、「含んでいるがそれに限定されない」ことを意味するものとする。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、提供される単位値の＋／－１０％を
指す。
本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、関心のある特徴または特性の全
体またはおおよその程度を示す定性的状態を指す。生物学の当業者は、生物学的および化
学的組成および材料の試験、製造、および保管に影響を与える多くの変動要素のために、
また、生物学的および化学的組成および材料の試験、製造、および保管に使用される機器
および機器に固有の誤差のために、生物学的および化学的現象は、絶対的な結果を達成ま
たは回避することは、仮にあったとしても、非常に稀であることを理解するであろう。し
たがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象
に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるために使用される。
１９８０年代以降、献血者から集めた血液をプールしてウイルスを不活化するための必
須手段として、界面活性剤が使用されてきた。このプロセスは、血液、血漿、または血漿
由来の第ＶＩＩＩ因子（ｐｄＦＶＩＩＩ）などの血液／血漿由来の成分を受ける患者の安
全にとって重要である。さらに、この浄化手段は、臨床検査室または血漿由来生物学的製
剤（ＰＤＢＰ）の製造施設での血液の処理に直接関与する要員の安全性を改善する。最近
では、この手法は、動物由来の材料を含む生物学的治療薬やワクチンの生物医薬品製造プ
ロセスにも不可欠となっている。動物由来の材料（すなわち、哺乳動物細胞で生成された
血液、血漿、組織、タンパク質）は、内因性ウイルスを運ぶか、または外来ウイルスで簡
単に汚染される可能性がある。したがって、医薬品製造プロセスには、患者がウイルスの
ない治療を受けることを保証するための一連の効果的なウイルス不活化（すなわち、溶剤
洗浄、低ｐＨ、および熱処理）と除去技術（すなわち、ウイルス濾過）が含まれる。これ
らのプロセスは、生物学的に誘導された治療製品またはワクチン製品の安全な一般利用に
不可欠である。効率、堅牢性、そして最も重要なこれらの製品の全体的な安全性を向上さ
せる新しい方法が非常に必要とされている。これらの要求を満たすために、環境に優しい
Ｎ－メチルグルカミドをベースとする界面活性剤を使用する新しい方法が、この明細書に
おいて特徴付けられている。
界面活性剤は、親水性（極性）頭部基と疎水性（非極性）尾部基で構成される両親媒性
分子である。この普遍的な構造により、界面活性剤と他の分子、特にタンパク質やエンベ
ロープウイルスとの相互作用が水溶液中で可能になる。基礎科学と応用技術では、界面活
性剤を可溶化剤または安定剤として使用して、生体分子の凝集を防止したり、細胞培養物
や組織懸濁液から膜タンパク質を可溶化することが可能である。タンパク質の可溶化に使
用する場合、次の特性により、特定の界面活性剤は他のものよりも望ましいものとなる：
１）電荷のない界面活性剤（非イオン性界面活性剤）は、目的のタンパク質の構造と活性
を維持するのに有用である、２）臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低い界面活性剤は、透析に
より界面活性剤を簡単に除去できる、３）透明な界面活性剤であり、したがって、タンパ
ク質の吸光度の測定値には影響を与えない、４）純度の高い界面活性剤は、実験ごとのば
らつきを減らす。同時に、タンパク質薬物を破壊せず、界面活性剤からの干渉なしにタン
パク質濃度を検出し、界面活性剤が非常に純粋であり必ずウイルスが不活化されることを
保証することが必要であることから、上記特性のほとんどは、ウイルス不活化の界面活性
剤酵素を選択するうえで利用できる。
一般的に、エンベロープウイルスの不活化は、両親媒性構造と具体的な界面活性剤の臨
界ミセル濃度（ＣＭＣ）に依存する。ＣＭＣは、界面活性剤モノマーが凝集してミセル構
造を形成する濃度を意味する。水溶液では、より多くの界面活性剤モノマーが接触すると
、親水性の頭部が隣接して、水溶液から疎水性の尾を保護し、最終的にミセル構造に組織
化する。ＣＭＣは、特定の条件下で所定の界面活性剤のウイルス不活化が発生する濃度に
関連している可能性がある。ウイルス不活化の理論的メカニズムは、モノマーが界面活性
剤ＣＭＣ未満でウイルスエンベロープに挿入されことであり、これはウイルスに有害であ
る可能性がある。濃度がＣＭＣ以上になるとすぐに、膜内に存在するこれらの界面活性剤
モノマーがミセルを形成し、完全性を破壊したり、ウイルスのエンベロープを完全に取り
除くことができる。ウイルスのエンベロープがないと、ウイルスは宿主細胞の原形質膜上
の受容体に結合できず、複製と拡散を進めることができない。
これまでのところ、生物医薬品製造業界では、エンベロープウイルスを不活化するため
にいくつかの界面活性剤が使用されている。汎用される非イオン性界面活性剤の１つであ
るＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、タンパク質薬物を破壊することなくエンベロープウイル
スを不活化するのに非常に効果的である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、生物医薬品製造
プロセスで使用された後、廃水処理プラントに廃棄されるか、水域環境に直接放出される
（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ、１９９６、ＪＡＯＣＳ、７３：９２９－９３３）。残念な
がら、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の副産物には、エストロゲン受容体基質を模倣し、動物
の生殖システム、特に水生生物に悪影響を与える可能性のあるオクチルフェノールが含ま
れている。したがって、この界面活性剤は、多くの国において、環境に対して有毒な化学
物質であるとみなされ、その使用が禁止されはじめている。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に
匹敵する有効性を持つ、環境に安全な界面活性剤を見出すために、多くの生物医薬品業界
が熱心に取り組んできた。たとえば、Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．とＧｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉ
ｎｃ．は、それぞれラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）とアルキルグルコ
シドを調査している（Ｃｏｎｌｅｙら，２０１４，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ＃Ｗ０２０１４０
２５７７１Ａ２； Ｃｏｎｌｅｙら，２０１６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．
刊行前のＥｐｕｂ、Ｆｉｓｈｅｒら，２０１６，米国特許＃２０１６０３３３０４６Ａ１
）。これら企業は異なるクラスの新しい界面活性剤を区別することができたが、本発明の
実施形態は、エンベロープウイルスの不活化において、完全に新規で非常に効果的なクラ
スの非イオン性界面活性剤、Ｎ－メチルグルカミド（脂肪酸糖としても知られる）を特定
する。
糖をベースとする界面活性剤は優れた物理的特性を持ち、生分解性が高く、毒性がない
ため、特に水生環境の安全性プロファイルに貢献する（Ｂｏｇｄａｎ，２００７，Ｓｔａ
ｌｍａｎｓら，１９９３）。したがって、開示される実施形態は、生物活性薬物製造にお
いてウイルスを不活化するための新しい方法として、糖ベースの界面活性剤であるＮ－メ
チルグルカミドの使用に焦点を合わせている。
Ｎ－メチルグルカミドは、親水性の高いグルコース部分と疎水性の脂肪酸鎖がアミド結
合で結合した非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、約９５％の再生可能
炭素指数で高度に生分解性であることが知られており、特に水生生物に対して無毒である
と考えられているため、環境に優しい（Ｓｔａｌｍａｎｓら，１９９３，ＳＯＦＷ，１１
９：７９４－８０８）。高い安全性と優れた物理的特性により、これらの界面活性剤は、
基礎的な科学技術での使用だけでなく、シャンプーや食器用洗剤への使用に対する関心も
高まっている。同様に、これらの界面活性剤は、生物学的に誘導された医薬品のウイルス
不活化の主要な候補となり得る。
組換えタンパク質の大部分は、遺伝子操作された哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯおよび
ＢＨＫ）の発酵によって生成される。これらの細胞は、感染力が確認されていないエンベ
ロープウイルス粒子である内在性レトロウイルス様粒子（ＥＲＶＬＰ）を生成する、染色
体に組み込まれたレトロウイルスプロウイルス遺伝子またはエレメントを持っていること
が知られている。ＥＲＶＬＰの不活化を実証するために、Ｘ－ＭｕＬＶが内因性レトロウ
イルスの具体的なモデルとして使用され、現在、所与の精製ユニット操作による不活化ま
たは除去に曝されるサンプルに加えることによって製造精製プロセスを評価するための実
験室ツールとして使用されている。したがって、開示された実施形態は、Ｎ－メチルグル
カミドを使用して、Ｘ－ＭｕＬＶなどのエンベロープウイルスを不活化するこの新しい方
法を使用する。Ｘ－ＭｕＬＶモデルに基づいて、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、フ
ィロウイルスなどを含む、他のすべてのエンベロープウイルスも、Ｎ－メチルグルカミド
の不活化の影響を受けやすいと予想される。さらに、この新しい方法は、透析やカラムク
ロマトグラフィーなどの界面活性剤除去ステップを含む可能性がある、薬物精製プロセス
全体の全てのステップに適用できる。
一般に、この新しいクラスの界面活性剤によるウイルスの不活化には、Ｎ－メチルグル
カミドを含むタンパク質サンプル（例えば、組換え第ＶＩＩＩ因子、ヒトＩｇＧ抗体およ
び血漿成分）に加えられたＸ－ＭｕＬＶの実験室株の試験、２－８℃でのサンプルのイン
キュベーション、および、それに続く、ウイルス感染を観察するための指標細胞株（例え
ばＰＧ－４、Ｖｅｒｏ、またはＥＢＴｒ細胞株）での反応管の実験が含まれる。Ｎ－メチ
ルグルカミドをテストするための体系的なアプローチは、さまざまな条件下での最初のス
クリーニングから始まり、その後に、タンパク質活性評価、用量反応試験、高力価と低力
価のウイルス株を用いた動力学研究、複数のウイルスと生物学的アプリケーション、そし
て最後に一貫性を確保するための複数のメーカーの比較が続く。最初のスクリーニング条
件は、２～８°Ｃで１２０分以内にウイルスの不活化が可能であり、０．１～０．３％（
ｗ／ｖ）の範囲の不活化濃度であった、旧来のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤の履
歴データに基づいていた。新しい界面活性剤が既知の強力な界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００）と同等であることを確認するために、Ｎ－メチルグルカミドの最初のスクリ
ーニングでは、低温と３０および１２０分のインキュベーションを選択した。評価された
濃度は、新しい界面活性剤のそれぞれのＣＭＣに基づいて決定した。次に、エンベロープ
ウイルスの不活化に最も効果的であったＮ－メチルグルカミド候補を、発色アッセイキッ
トを使用して、ヒト第ＶＩＩＩ因子活性への影響について評価した。次に、Ｎ－メチルグ
ルカミドを、個々の界面活性剤ごとに０．０１４～０１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で増加す
る濃度のＮ－メチルグルカミドに対するそれぞれの用量反応について評価した。不活化が
どれだけ迅速に生じるかを評価するために、力価の低いウイルス調製物と高力価ウイルス
調製物の両方を使用して、Ｎ－メチルグルカミドを用いた動力学的研究を行った。プロセ
ス全体をとおして得られたデータの信頼性を高めるために、複数の製品を同様の条件下で
分析し、試験したＮ－メチルグルカミドの一貫性と信頼性を実証した。最後に、Ｎ－メチ
ルグルカミドが他の血液または血漿関連マトリックスで有効性を維持しているかどうかを
評価するために、ウイルス免疫の不活化を同様の条件下でヒト免疫グロブリンＧおよびヒ
ト血漿で測定した。まとめると、この体系的なアプローチにより、開示された実施形態は
、精製プロセスにおけるＮ－メチルグルカミドの適用性を実証することができた。
Ｎ－メチルグルカミドでウイルスを不活化するこの方法は、タンパク質サブユニット、
タンパク質（酵素、因子など）、組換えタンパク質、または抗体などの生物活性薬物の精
製プロセスに適用できる。この方法で使用される環境に安全な（または非生態毒性）界面
活性剤は、アミド結合で結合された、親水性グルコース部分と疎水性脂肪酸尾部からなる
複数のＮ－メチルグルカミド同族体をベースとする。Ｎ－メチルグルカミドにはオクチル
フェノールなどの既知の有毒な中間体が存在しないため、生物製剤の製造に使用した場合
、環境への懸念に関連するリスクが排除される。さらに、これらの糖ベースの界面活性剤
は本来非イオン性であり、目的の薬物タンパク質を破壊しない。この方法は、Ｎ－メチル
グルカミドと生物学的製剤とのインキュベーションにより、エンベロープウイルスの潜在
的な汚染物質を不活化する。この方法によるウイルスの減少を評価するために、モデルエ
ンベロープウイルス（異種栄養性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下
痢ウイルスなど）をタンパク質薬物サンプル（たとえば、天然タンパク質、組換えタンパ
ク質、抗体）に加え、Ｎ－メチルグルカミドとインキュベートした。インキュベーション
後、ＴＣＩＤ５０アッセイを実施して、ウイルス力価と、非処理対照とＮ－メチルグルカ
ミド処理サンプル間のウイルス感染力価の差である対数減少係数（LRF）を決定した。さ
らに、Ｎ－メチルクルカミドによるエンベロープウイルスの不活化は、業界標準のＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ－１００に匹敵するものである。総合すると、これらの優れた特性により、Ｎ
－メチルグルカミドは生物由来医薬品の精製プロセスにおける強力なツールとなる。
材料
例１－ウイルス株：
低力価および高力価の異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）株、ｐＮＦＳ
Ｔｈ－１株は、それぞれバイエル病原菌安全研究所（カリフォルニア州バークレー）ま
たはＢｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって内部で調
製された。高力価のブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＰＶ）株、Ａｕｊｅｓｚｋｙ株は、Ｂｉｏ
ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって調製された。高力価
のウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）株、ＮＡＤＬ株も、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ
Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって調製された。
例２－細胞株：
ネコＰＧ－４細胞（Ｓ＋Ｌ－）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０３２）、アフリカミドリザル
腎臓Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）、および胚性ウシ気管ＥＢＴｒ細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ－４４）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から購入した。
例３－細胞培養培地とサプリメント：
ＰＧ－４、Ｖｅｒｏ、およびＥＴＢｒ細胞に使用した培地は、マッコイ５Ａ（Ｌｏｎｚ
ａ、１２－６８８Ｆ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）およびＭｉｎｕｔｅｓｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１０－ＣＶ、Ｍａｎａ
ｓｓａｓ、ＶＡ）である。以下の増殖培地サプリメントを使用した：ウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７０．０３、ローガン、ユタ州）、１００ｘペニシリ
ン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（コーニング、３０－００２－Ｃｌ、マナッサス、バ
ージニア州）、および ２００ ｍＭ Ｌ－グルタミンターゼ（Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｕ
ｔｅｓｅ）（Ｌ－Ｇｌｕ）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１６８０１４９、Ｓｏｌｏ
ｎ、ＯＨ）。
例４－化学物質：
臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ９２６８－５
ｇ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、ＰＧ－４細胞におけるＸ－ＭｕＬＶ感染の効
率を高め、マッコイ５Ａ培地に最終濃度３ μｇ／ｍｌで添加した。この試験で特性検討
される非イオン性界面活性剤は、オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ ８）
（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０１７、ミズーリ州セントルイスまたはＳｉｇｍａ
もしくはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、ノナノイル－Ｎ－メ
チルグルカミド（Ｍｅｇａ ９）（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０１９、ミズーリ
州セントルイスまたはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、デカノ
イル－Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ １０）（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０
２１、ミズーリ州セントルイスまたはＳｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セント
ルイス）、ドデカノイル－Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ １２）（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ
－１１７５．０００１、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）、およびＰ－ｔｅｒｔ－オクチノフェ
ノキシ）ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ、１０８６４３２５００、 ビレリカ、ＭＡ）である。
生物学的溶液：
各ウイルス不活化アッセイは、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）（全長野生
型、バイエル社内準備）、ヒトＩｇＧまたは血漿タンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃ
ｈ、セントルイス、 ＭＯ）のいずれかを含む生物学的産物溶液の存在下に実施した。
方法
実施例１ 界面活性剤の準備
界面活性剤Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、Ｍｅｇａ １２は、５％重
量／体積（ｗ／ｖ）ストック溶液の目標濃度で調製した。各界面活性剤は、製造元から粉
末として入手し、適切に計量し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解した。界面活性剤が室温で完全
に溶解しなかった場合、溶液を≦３７℃の水浴（Ｍｅｇａ １０およびＭｅｇａ １２）
で約１０～１５分間加熱した。当初、５％Ｍｅｇａ １２が≦３７℃で溶液に溶解しなか
ったため、≦６０℃の水浴に入れた。その結果、３０分後に溶解した。Ｍｅｇａ １２の
臨界ミセル濃度は０．０１３％であったため、少なくとも１０倍ストック溶液がウイルス
不活化での使用に便利であると思われた。したがって、新しいストック溶液を０．１５％
の濃度でＭｉｌｌｉ－Ｑ水を用いて調製した。この条件では、≦６０℃の水浴に入れた場
合（約１５分）、混合物をより早く溶液にすることができた。界面活性剤は２－８℃で暗
容器に保存した。
実施例２ Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、およびＭｅｇａ １２ウイ
ルス不活化スクリーニング
組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）治療薬の一般的な製造条件下で、異種指向性マ
ウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）、ブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、またはウシ
ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を効果的かつ確実に不活化する能力について、Ｎ
－メチルグルカミド界面活性剤（Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、Ｍｅｇ
ａ １２）を評価した。各界面活性剤について試験された濃度は、それぞれ臨界ミセル濃
度（ＣＭＣ）の０．５倍、１倍、または２倍を基準とした。各界面活性剤は、界面活性剤
を含まないｒＦＶＩＩＩタンパク質とインキュベートし、１：１１の比率でＸ－ＭｕＬＶ
の高力価ストックを加えて、２．０±１．０°Ｃで３０分間インキュベートした。ｒＦＶ
ＩＩＩのみを含む陽性対照サンプルを加え、２．０±１．０℃で０および３０分間インキ
ュベートした。各インキュベーション時間後、４０ μＬの各不活化サンプルまたは対照
を取り出し、４．０ ｍＬの基本培地（即ち、Ｘ－ＭｕＬＶ用の３ μｇ／ｍＬのポリブ
レンが補充されたマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）またはＥＭＥＭ）を含む１５ ｍＬチューブ
に移した。この１：１０１の希釈係数クエンチにより、指標細胞株に対する毒性の影響を
超えて界面活性剤を希釈できると同時に、ウイルスがＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要
な範囲内で希釈されることになる。簡単に説明すると、ウイルスの感染性を評価するため
のＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチしたサンプルをＭＰまたはＥＭＥＭで、１１回希釈
レベルまで、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した。１日前に９６穴細胞培養
プレートに３，０００細胞／ウェルで播種された指標細胞の単層を、８連で、クエンチさ
れ連続希釈されたサンプルまたは基本培地の希釈１００ μＬでインキュベートした。３
７℃で１．５～２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２
％Ｌ－Ｇｌｕを補充した基本培地（ＰＲＶまたはＢＶＤＶ用のマッコイ５ＡまたはＥＭＥ
Ｍ）からなる１００ μＬのアッセイ培地をプレートの各ウェルに加えた。その後、細胞
を３７℃で最大６～７日間インキュベートし、光学顕微鏡下でウイルス感染を示す細胞変
性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
実施例３ ヒト第ＶＩＩＩ因子活性を評価するための発色アッセイ
Ｍｅｇａ １０は、ｒＦＶＩＩＩマトリックス中に０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で調製し（
Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏで調製された５．０％（ｗ／ｖ）ストック溶液から）、２．０±
１．０℃で１２０分間インキュベートした。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏのみを添加したｒＦ
ＶＩＩＩマトリックスの希釈液対照も準備し、同じ条件下でインキュベートした。インキ
ュベーション後、界面活性剤と希釈液対照を発色アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃ
ＯＡＴＥＳＴ ＳＰ４ ＦＶＩＩＩキット、カタログ：８２４０９４６３）ＦＶＩＩＩ標
準および対照とともに１ｘアッセイバッファーで適切なレベルに希釈した。３０ μＬの
各界面活性剤、対照、および標準液を３連で９６ウェルプレートにロードした。発色アッ
セイ試薬を製造元のプロトコルにしたがって追加し、３７．０℃、５．０％ＣＯ２で８分
間インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ
Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いて４０５および４９２ ｎｍでアッセイプレートの
吸光度を測定した。データはＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５を使用して分析した。
実施例４ Ｔｒｉｔｏｎを含まないｒＦＶＩＩＩマトリックスの用量応答
ｒＦＶＩＩＩとインキュベートし、Ｘ－ＭｕＬＶを加えたＭｅｇａ １０界面活性剤の
最低有効濃度を評価するために、界面活性剤の用量反応試験を実施した。各界面活性剤の
０．５％（ｗ／ｖ）サンプルを組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）マトリックス中で調製
し、ｒＦＶＩＩＩマトリックスで１：２連続希釈して、０．０１４～０．５％（ｗ／ｖ）
範囲の各界面活性剤の６サンプルを調製した。さらに、ｒＦＶＩＩＩマトリックスのみを
含む陽性対照サンプルを加えた。各界面活性剤サンプルと対照に、１：１１の比率で低力
価のＸ－ＭｕＬＶを添加し、２．０±１．０℃で３０分間インキュベートした。インキュ
ベーション後、１００ μＬの各不活化サンプルと対照を取り出し、３ μｇ／ｍＬポリ
ブレンを補充した３．０ ｍＬのマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）を含む１５ ｍＬチューブに
移した。この１：３１希釈係数クエンチにより、指標細胞株（ＰＧ－４）に対する毒性の
影響を超えて界面活性剤を希釈でき、またＸ－ＭｕＬＶをＴＣＩＤ５０アッセイの実行に
必要な範囲内で希釈できることとなった。簡単に説明すると、Ｘ－ＭｕＬＶ感染を評価す
るためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチしたサンプルをＭＰで、１１回希釈レベルま
で、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した。１日前に９６穴細胞培養プレート
に３，０００細胞／ウェルで播種されたＰＧ－４細胞の単層を、８連で、クエンチされた
サンプルまたはＭＰの希釈１００μＬでインキュベートした。３７℃で１．５～２．５時
間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％Ｌ－Ｇｌｕを補充した
マッコイ５Ａからなる１００ μＬのアッセイ培地を用いて細胞を覆った。その後、細胞
を３７℃で最大６～７日間インキュベートし、光学顕微鏡下でＸ－ＭｕＬＶ感染を示す細
胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
実施例４ ウイルス不活化動力学
ｒＦＶＩＩＩとインキュベートし、Ｘ－ＭｕＬＶを加えたＭｅｇａ １０界面活性剤の
不活化率を評価するために、ウイルス不活化動態研究を実施した。Ｍｅｇａ １０の０．
０２％、０．１０％、０．２０％、および０．３０％（ｗ／ｖ）サンプルは、Ｔｒｉｔｏ
ｎを含まない組み換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）マトリックスで調製した。さらに、ｒ
ＦＶＩＩＩマトリックスのみを含む陽性対照サンプルまたは培地のみの対照を加えた。各
界面活性剤サンプルと対照に、１：１１の比率で低力価と高力価のＸ－ＭｕＬＶストック
を添加し、２．０±１．０℃で０、５、１５、３０、６０、１２０分間インキュベートし
た。各インキュベーション後、１００または４０ μＬの各不活化サンプルと対照を取り
出し、３ μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した３．０ ｍＬまたは４．０ ｍＬのマッコ
イ５Ａ培地（ＭＰ）を含む１５ ｍＬチューブに移した。この１：３１（低力価Ｘ－Ｍｕ
ＬＶ）または１：１０１（高力価Ｘ－ＭｕＬＶ）の希釈係数クエンチにより、指標細胞株
（ＰＧ－４）に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈でき、さらにＸ－ＭｕＬＶが
ＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈されるようになる。簡単に説明すると
、Ｘ－ＭｕＬＶの感染性を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチした各サン
プルをＭＰで、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した
。１日前にウェルあたり３，０００セルで播種されたＰＧ－４細胞の単層に、８連でクエ
ンチされたサンプルまたはＭＰの希釈あたり１００ μＬを接種した。３７℃、５％ＣＯ
２で１．５～２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％
Ｌ－Ｇｌｕを補充したマッコイ５Ａ培地からなる１００ μＬのアッセイ培地を使用して
、細胞を覆った。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で最大６～７日間インキュベートし、
光学顕微鏡で観察して、Ｘ－ＭｕＬＶ感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察し
た。
実施例５ 他のタンパク質の存在下でのＮ－メチルグルカミド界面活性剤によるウイル
ス不活化
ヒト血漿、血漿由来生物製剤またはヒト抗体の一般的な製造条件下でＸ－ＭｕＬＶ、Ｐ
ＲＶまたはＢＶＤＶを効果的かつ確実に不活化する能力について、Ｎ－メチルグルカミド
界面活性剤（Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、Ｍｅｇａ １２）を評価し
た。各界面活性剤について試験された濃度は、それぞれ臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の０．
５倍、１倍、または２倍に基づいて決定された。各界面活性剤を、界面活性剤および複数
の濃度の遊離タンパク質（高タンパク質勾配）とともにインキュベートし、１：１１の比
率でＸ－ＭｕＬＶの高力価ストックを添加し、２．０±１．０℃で３０分間インキュベー
トした。それぞれのタンパク質のみを含む陽性対照サンプルを加え、２．０±１．０℃で
０および３０分間インキュベートした。各インキュベーション時間後、４０ μＬの各不
活化サンプルまたは対照を取り出し、４．０ ｍＬの基本培地（即ち、Ｘ－ＭｕＬＶ用の
３ μｇ／ｍＬのポリブレンが補充されたマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）またはＰＶＲもしく
はＢＶＤＶ用のＥＭＥＭ）を含む１５ ｍＬチューブに移した。この１：１０１の希釈係
数クエンチにより、指標細胞株に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈でき、ウイ
ルスがＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈されることになる。簡単に説明
すると、ウイルスの感染性を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチした各サ
ンプルを基本培地（ＭＰまたはＥＭＥＭ）で、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連
続希釈した。１日前にウェルあたり３，０００細胞で播種された指標細胞の単層に、８連
で、クエンチされたサンプルまたは基本培地の希釈１００ μＬでインキュベートした。
３７℃で１．５～２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および
２％Ｌ－Ｇｌｕを補充した基本培地（マッコイ５ＡまたはＥＭＥＭ）からなる１００ μ
Ｌのアッセイ培地を使用して細胞を覆った。次に、細胞を３７℃で最大６～７日間インキ
ュベートし、光学顕微鏡下でウイルス感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察し
た。
アッセイ例
実施例１：Ｎ－メチルグルカミド界面活性剤：特性、調製、および評価
この試験では、４つのメチルグルカミドをベースとする界面活性剤オクタノイル－Ｎ－
メチルグルカミド（Ｍｅｇａ ８）、ノナオイル－Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ ９
）、デカノイル－Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ １０）、およびドデカノイル－Ｎ－
メチルグルカミド（Ｍｅｇａ １２））を分析した（表１）。これらの界面活性剤はすべ
て市販のＮ－メチルグルカミドで、複数のロットを複数の販売業者（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ、またはＢａｃｈｅｍ）から粉末状で購入した。
図１は、界面活性剤がどのようにしてウイルスのエンベロープを破壊することができる
かについての理論的なメカニズムを示している。一般に、それぞれの界面活性剤の臨界ミ
セル濃度（ＣＭＣ）を下回ると、界面活性剤のモノマーがウイルスのエンベロープ内に挿
入され、ウイルスが細胞（宿主）に付着するのを阻止したり排除することが可能となる。
ＣＭＣを超える濃度では、より多くのモノマーがウイルスエンベロープに挿入され、ウイ
ルスエンベロープが完全に破壊される。モノマーは、それ自体で、または、剥離されたエ
ンベロープ由来のミセルとウイルスタンパク質の混合物で、ミセルを形成できる。この明
細書内の下記の例で説明するように、ＣＭＣは有効濃度の指標となるようである（実施例
３）。ＣＭＣ以上の濃度では、この研究で試験したメチルグルカミド界面活性剤のそれぞ
れでウイルスの不活化が生じた。
Ｎ－メチルグルカミドは、アミド結合によって連結された非環式親水性グルコース極性
頭部基および（８～１０個、または１２個の炭素からなる）疎水性脂肪酸鎖尾部を含む（
図２）。表１に示されるように、Ｎ－メチルグルカミド類は同様に構成され、分子量の増
加に比例して対応する炭素鎖長のみが異なる。他の研究によれば、脂肪酸鎖の炭素が増加
すると、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は逆に減少する。
Figure 2023139096000002
図３は、この研究で使用したＮ－メチルグルカミドの２次元（２Ｄ）および３次元（３
Ｄ）構造を示している。２次元構造と３次元構造はどちらも、炭素、水素、酸素、窒素の
分子の同様の配置を示している（Ｊｅｆｆｅｒｙ ａｎｄ Ｍａｌｕｓｙｎｋｓａ ，１
９８８， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．， Ｂ４５：４４７－４５２）。興味深いことに、Ｍ
ｅｇａ ８と他のＮ－メチルグルカミドとの間の分子パッキングは、頭から頭の二層パッ
キング（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｐａｃｋｉｎｇ）を形成する可能
性があるが、その他のものは、頭から尾の単層パッキング（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ
ｂｉｌａｙｅｒ ｐａｃｋｉｎｇ）でパッキング形成する可能性がある（Ｊｅｆｆｅｒｙ
ａｎｄ Ｍａｌｕｓｙｎｋｓａ、１９８８、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ。、Ｂ４５：４４７
－４５２）。このパッキングの違いは、炭素鎖が増加するにつれて、効力の増加に寄与す
る可能性がある。
表２は、方法の項でも詳述されている界面活性剤粉末の製造元と自社調製を示している
。調製した５％（重量／容量、ｗ／ｖ）の界面活性剤のうち、Ｍｅｇａ ８とＭｅｇａ
９は室温で水に容易に溶解した。Ｍｅｇａ １０は３７℃の水浴で温める必要があり、溶
液を１５分以内に可溶化した。しかし、Ｍｅｇａ １２は３７℃の水浴で水に溶解できず
、６０℃の水浴で少なくとも５分間で徐々に溶解した。Ｔ同様の事象は他者によっても観
察されており、疎水性を高める脂肪鎖の長さの増加と関係があり、溶解性、特に水への溶
解の可能性を低下させる可能性がある（Ｇａｂｅｒ ｅｔ ａｌ。、Ｂｕｒｃｚｙｋ、２
００７）。そのため、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で新たに０．１５％ストックを準備したが、これ
はＣＭＣの少なくとも１０倍である。６０℃の水浴に入れると、この新しい調剤は１５分
以内に溶解することができた。
Figure 2023139096000003
実施例２：ウイルス－背景と特徴
レトロウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フィロウ
イルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソ
ウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウ
イルス科およびポックスウイルス科など、多数のエンベロープＲＮＡおよびＤＮＡウイル
スが存在する。これらの科に属する血液感染性ウイルスの多くは、生物学的に活性な医薬
品の製造に使用される動物由来の製品を汚染する可能性がある。したがって、多くの製薬
会社は、マウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ
Ｖ）、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）などのモデルウイルスを使用して、さまざまな精製方
法でウイルスの除去を実証している（表３）。Ｘ－ＭｕＬＶは、タンパク質製剤を発現さ
せるための宿主細胞株（ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞など）における内因性レトロウイルス様
粒子のモデルウイルスとして一般的に使用される。Ｘ－ＭｕＬＶは、主要な血液感染性病
原体ＨＩＶなど、レトロウイルスを含む他のエンベロープウイルスのモデルでもある。Ｂ
ＶＤＶはフラビウイルスのモデルであり、（最近の世界的な発生に関与する）ジカウイル
スやＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスの代替となり得る。ＰＲＶはヘパドナウ
イルスのモデルであり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の代替となり得ることができるが、
ＨＢＶは最も一般的な血液媒介性病原体の１つである。理論的には、これらのエンベロー
プウイルスはすべて、Ｎ－メチルグルカミドによる界面活性剤不活化の影響を受けやすい
。
Figure 2023139096000004
Ｎ－メチルグルカミドウイルス不活化の典型的な条件は、Ｘ－ＭｕＬＶの低および高力
価ストックを使用して評価されている（表４）。Ｘ－ＭｕＬＶの低力価のストックを用量
反応研究および速度論研究に使用した。Ｘ－ＭｕＬＶの高力価ストックを、速度論研究と
、対数減少係数（ＬＲＦ）で表されるウイルス不活化の高容量の決定に使用した。表４に
含まれるその他のウイルスは、ＢＶＤＶとＰＲＶの高力価ウイルス株である。これらは、
Ｎ－メチルグルカミド界面活性剤の不活化の影響を受けやすいはずである。
Figure 2023139096000005
実施例３：Ｎ－メチルグルカミド誘導体のスクリーニング
Ｘ－ＭｕＬＶの高力価ストックを不活化する能力について、Ｎ－メチルグルカミド誘導
体を試験した。各界面活性剤（Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、またはＭ
ｅｇａ １２）をＣＭＣの０．５倍、１倍、および２倍で試験した。タンパク質薬剤（組
換え第ＶＩＩＩ因子、ｒＦＶＩＩＩ、抗体または血漿）と混合し、エンベロープウイルス
（Ｘ－ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、またはＢＶＤＶ）を加え、室温または２．０±１．０℃で３０
分間インキュベートした。インキュベーション後、反応を停止し、適切な指標細胞（ＰＧ
－４、Ｖｅｒｏ、またはＥＢＴｒ細胞）を使用してＴＣＩＤ５０力価アッセイを行った。
ＴＣＩＤ５０は、次の２つの疑問、即ち、試験したウェルのいずれかに観察可能なウイル
ス感染はあるか？、もしあるなら、試験されたサンプル中のウイルスの量（力価）はどれ
くらいか？との疑問に対する回答を提供する。予想通り、２℃あるいは室温（２５℃）で
の３０分間のインキュベーション後、Ｘ－ＭｕＬＶを加えたｒＦＶＩＩＩ対照の測定力価
は、平均してそれぞれ６．４０と６．４５ Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった（図
４および図５）。各温度条件について、Ｎ－メチルグルカミド（Ｍｅｇａ ８、９、１０
、１２）とその濃度をテストすると、Ｎ－メチルグルカミドの濃度が１ｘ ＣＭＣ以上の
場合、検出限界（ＬＯＤ）までＸ－ＭｕＬＶが不活化されたが、このことは、１０４．３
倍以上の完全なウイルス感染性の不活化、即ち、４．３以上の対数減少係数（ＬＲＦ）を
示している（図４および図５、表５および表６）。検出限界（ＬＯＤ）が２．０３ Ｌｏ
ｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以下であることに注意することが重要である。これは、ウイル
スが観察されない場合の力価でもある。Ｍｅｇａ ９およびＭｅｇａ １０は０．５ｘ
ＣＭＣの濃度では、Ｘ－ＭｕＬＶを２５℃で完全に不活化したが、２℃では部分的に不活
化した。０．５ｘ ＣＭＣのＭｅｇａ ８およびＭｅｇａ １２は、２５℃または２℃で
処理を行った場合、有意な不活化はなかった（図４および図５）。Ｎ－メチルグルカミド
によるＸ－ＭｕＬＶの不活化はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と同じくらい効果的であるが、
アッセイ指標細胞に対する毒性は低かった（図６）。０．３％（ｗ／ｖ）では、両方の界
面活性剤がＸ－ＭｕＬＶを完全に不活化した。Ｍｅｇａ １０は、２．０３ ＴＣＩＤ５
０／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）以下を示したが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、２．５４
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以下のＬＯＤを示した（図６）。要約すると、これらの結果は、こ
れらの環境にやさしい界面活性剤がウイルス不活化に効果的で強力であることを示してい
る。
Figure 2023139096000006
Figure 2023139096000007
実施例４：ｒＦＶＩＩＩに対するＮ－メチルグルカミドの効果
Ｎ－メチルグルカミド類のスクリーニングにより、低濃度（～０．２％）での高い有効
性と溶解性により、Ｍｅｇａ １０がＮ－メチルグルカミド類のトップ候補に決定された
。Ｍｅｇａ １０がタンパク質の薬物活性に悪影響を及ぼさないことを保証するために、
発色アッセイキットを使用して、ｒＦＶＩＩＩ調製物の活性を測定した。このアッセイの
原理には、血液凝固メカニズムの特定のステップが含まれ、第Ｘ因子が第Ｘａ因子に変換
されて、発色基質の加水分解が行われる。この反応は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活
性に依存し、測定可能な色の強度に直接相関する。ｒＦＶＩＩＩ調製物のサンプルを０．
３％（重量／体積、ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０または０．３％（体積／体積、ｖ／ｖ）の
水と２．０±１．０℃で２時間インキュベートし、発色アッセイキットを使用してｒＦＶ
ＩＩＩの活性を測定した。水対照およびＭｅｇａ１０処理サンプルの平均活性（ＩＵ／ｍ
Ｌ）は、それぞれ５７．１９および５２．２６ ＩＵ／ｍＬで同等であった（図７）。こ
れらの結果は、Ｍｅｇａ １０との２時間のインキュベーション（これは、３０分のウイ
ルス不活化をはるかに超える時点である）後でさえ、ｒＦＶＩＩＩ活性が維持されている
ことを示している。この結果は、Ｍｅｇａ １０がエンベロープウイルスの不活化に効果
的であるだけでなく、タンパク質薬剤の活性に影響がないことを示している。
実施例５：用量反応
Ｍｅｇａ １０の最低効果濃度を決定するために、用量反応試験を行った。０．０１４
～０．５％（重量／容量、ｗ／ｖ）の範囲で濃度を上げ、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩ
Ｉ）とインキュベートし、Ｘ－ＭｕＬＶ（低力価）を２．０±１．０℃で３０分間加えた
。ｒＦＶＩＩＩのみの対照も同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、
すべての反応を停止し、サンプルを採取してＴＣＩＤ５０アッセイで段階希釈した。Ｍｅ
ｇａ １０反応では、０．０１４～０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度でウイルス力価は対照と
同等であり、Ｍｅｇａ １０がこれらの低濃度ではエンベロープウイルスを不活化できな
かったことを示している（図８）。Ｍｅｇａ １０濃度を約０．１１％に上げると、たち
まち、ウイルス力価は約２．６２ Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬに顕著に減少した。
Ｍｅｇａ１０の約０．２３％で、ウイルス力価はウイルス感染が観察されないレベルまで
顕著に減少した（図７および表７）。０．２３％（ｗ／ｖ）では、Ｍｅｇａ １０の検出
限界（ＬＯＤ）は１．５２未満のＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、したがって、
Ｍｅｇａ １０のＬＲＦは２．０±１．０℃で３０分間で３．９６以上であった（表７）
。要約すると、Ｘ－ＭｕＬＶを迅速かつ完全に不活化する最低濃度は、Ｍｅｇａ １０で
約０．２３％である。
Figure 2023139096000008
実施例６：動力学試験
力価の低いウイルス調製物と力価の高いウイルス調製物の両方を使用して動力学試験を
行い、Ｍｅｇａ １０がＸ－ＭｕＬＶをどれだけ迅速かつ広範囲に不活化できるかを決定
した。動力学試験は、複数の濃度（０．０２％、０．１０％、０．２０％、および０．３
０％（ｗ ／ ｖ））、タイムポイント（０、５、１５、３０、６０、および１２０分）
、および低力価と高力価のＸ－ＭｕＬＶ株において実施した。新たに高力価Ｘ－ＭｕＬＶ
株を試験することにより、より高いアッセイ感度が得られ、これはより高いＬＲＦに反映
されている。０．３％のＭｅｇａ １０を組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）調製物とイ
ンキュベートし、低力価Ｘ－ＭｕＬＶウイルスを２．０±１．０℃で０、５、１５、３０
、６０、および１２０分間加えた。次に、反応サンプルを反応停止し、ＴＣＩＤ５０アッ
セイのためにサンプルを採取した。Ｍｅｇａ １０の結果は、Ｘ－ＭｕＬＶを界面活性剤
含有サンプルと混合した直後にウイルスが不活化されたことを示している（ｔ～０）（図
９）。アッセイされたどの時点でもウイルス感染性は検出されず、≦１．５２Ｌｏｇ１０
ＴＣＩＤ５０／ｍＬの検出限界に達し、ＬＲＦが３．８０以上である完全な不活化が再
度示された。
Figure 2023139096000009
高力価のＸ－ＭｕＬＶストックと複数のＭｅｇａ １０濃度で同様の実験を繰り返すと
、０分（ｔ～０）（０．２０％Ｍｅｇａ １０）でウイルスの部分的な不活化が観察され
、５分（０．２０％Ｍｅｇａ １０）で完全に不活化された（図１０）。特に、Ｍｅｇａ
１０の０．２０％では、インキュベーションの５～１２０分で生ウイルスは観察されず
、２．０３以下Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの検出限界であり、ウイルス感染性減少
が１０４．８０倍以上に達した（表９）。この例は、Ｍｅｇａ １０が低濃度で、０～５
分の範囲内のクイックアクションをもって、非常に効果的であることを示している。
Figure 2023139096000010
実施例７：Ｍｅｇａ １０のロット間比較
複数の販売元と製造ロットにわたってＭｅｇａ １０の一貫性を確保するために、Ｇ－
ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅとＳｉｇｍａの界面活性剤製品を比較した用量反応試験を行った。
各販売元について、サンプルは複数の濃度（０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４
％ｗ／ｖ）で調製し、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）とインキュベートし、Ｘ－Ｍｕ
ＬＶ（高力価）を３０分間、２．０±１．０℃で添加した。ｒＦＶＩＩＩのみの対照も同
じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、すべての反応を停止し、ＴＣＩ
Ｄ５０アッセイで力価測定した。Ｇ－ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＳｉｇｍａが作製した
Ｍｅｇａ １０サンプルそれぞれについて、ウイルス力価はそれぞれの濃度レベルで互い
に一致した（図１１）。このＸ－ＭｕＬＶ不活化プロファイルは、両方の供給源からのＭ
ｅｇａ １０製品が同等であることを示している。０．２－０．４％Ｍｅｇａ １０の各
製品で処理されたサンプルは、２．０３以下のＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬと４．４
５以上のＬＲＦの完全な不活化を示した。要約すると、異なる供給源からのＭｅｇａ １
０は、相互に、および以前のデータと一貫した結果をもたらした。
実施例８：Ｎ－メチルグルカミドによる組換えＦＶＩＩＩ中のその他エンベロープウイ
ルス（ＢＶＤＶおよびＰＲＶ）の不活化
さらに、Ｎ－メチルグルカミドによる強力かつ即効性のＸ－ＭｕＬＶ不活化が、他のエ
ンベロープウイルスにおいても同様に機能するか否かを判断するために、組換えＦＶＩＩ
Ｉ（ｒＦＶＩＩＩ）溶液中で、Ｍｅｇａ ９およびＭｅｇａ １０がＢＶＤＶおよびＰＲ
Ｖを不活化する能力を評価した。
Ｍｅｇａ ９およびＭｅｇａ １０によるＢＶＤＶの不活化は、用量反応試験によって
測定した。０．５、０．８、および１．０％（ｗ ／ ｖ）のＭｅｇａ ９と、０．２、
０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０を含むｒＦＶＩＩＩのサンプルに、
ＢＶＤＶストックを１：１１で添加し、２．０±１．０℃で３０分インキュベートした。
インキュベーション後、サンプルを反応停止し、ＥＢＴＲ指標細胞を使用してＴＣＩＤ５
０アッセイを行い力価決定した。結果は、Ｍｅｇａ ９が１．０％の濃度でのみＢＶＤＶ
を検出限界（≦２．０３Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）まで不活化できることを示し
た。Ｍｅｇａ １０は、０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）でＢＶＤＶを完全に
不活化することができた。どちらの界面活性剤も、ＢＤＶＤの感染力を１/１０５．１４
倍以下に低下させることができた。
ＰＲＶを、０．２または０．３％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０を含むｒＦＶＩＩＩ調製
物に添加（１：１１）し、２．０±１．０℃で０、５、１５、３０、および６０分の時点
でアッセイした。インキュベーション後、サンプルの反応を停止し、Ｖｅｒｏ指標細胞を
使用したＴＣＩＤ５０アッセイで力価測定した。その結果、０．２％と０．３％のＭｅｇ
ａ １０が即座にウイルス感染性を１／１０４．５以下に低下させることができ、１５分
で検出限界（≦２．０３Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）に達して、両濃度のＭｅｇａ
１０によって1/１０５．１０以下の感染性低下が示された（図１２）。
要約すると、Ｍｅｇａ １０は、０．２％で１５分以内にＰＲＶを不活化し、０．２％
で混合直後にＢＶＤＶを不活化することができ、１/１０５．１４倍以下にＢＶＤＶ感染
は減少を示した。Ｍｅｇａ ９は１．０％（ｗ ／ ｖ）で、処置後３０分以内にＢＶＤ
ＶをＬＯＤに達するまで不活化することが可能であった。 Ｍｅｇａ １０とＭｅｇａ
９はどちらもＢＶＤＶをＬＯＤに達するまで不活化することができ、ＢＶＤＶの感染力が
1/１０５．１４以下に減少したことを示している。ＢＶＤＶのＭｅｇａ １０による不活
化はＭｅｇａ ９よりもはるかに速く、低濃度によるものである。これらの結果は、Ｎ－
メチルグルカミドがウイルスの科や種に関係なくエンベロープウイルスを効果的に不活化
できることを示している（図１３）。
メチルグルカミドを他の化合物と共に試験して、ウイルス不活化に対する潜在的な相乗
効果を調べた。メチルグルカミドを、Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｗ２０）界面活性剤、リン酸
トリ（ｎ－ブチル）（ＴｎＢＰ）溶媒、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）塩と共に、ま
たは無しで、混合し、Ｘ－ＭｕＬＶとインキュベートした。次に、各サンプルまたは対照
の力価を、前述のＴＣＩＤ５０アッセイを使用して測定した。各実験（図１５、１６、１
７）において、対照は界面活性剤を含むことなくＸ－ＭｕＬＶを添加されたｒＦＶＩＩＩ
から構成され、測定された力価は約６．５ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの予想範囲
内であった。０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）、または０．３０％（ｗ／ｖ
）の濃度のＭｅｇａ １０を、一般的に使用される０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（
ｗ／ｖ）、または０．０６％（ｗ／ｖ）のＴｗ２０界面活性剤と混合し、その際のウイル
ス力価は、Ｍｅｇａ １０単独と同等であった（図１５）。したがって、Ｍｅｇａ １０
＋Ｔｗ２０はウイルスの不活化をさらに促進するものではなかった。０．０５％（ｗ／ｖ
）または０．３０％（ｗ／ｖ）の濃度Ｍｅｇａ １０を、一般的に使用される０．０５％
（ｗ／ｖ）または０．３０％（ｗ／ｖ）のＴｎＢＰ溶媒と（それぞれ）混合したが、０．
０５％Ｍｅｇａ １０のみの場合に比較して、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ １０＋０
．０５％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰを使用した場合には、ウイルス力価がわずかに低下した（図
１６）。したがって、Ｍｅｇａ １０＋ＴｎＢＰは、ウイルスの不活化をわずかに増強し
た。最後に、０．１０％（ｗ／ｖ）濃度のＭｅｇａ １０または０．５１％（ｗ／ｖ）濃
度のＭｅｇａ ９を５００ ｍＭ ＮａＣｌと混合した場合には、０．１０％（ｗ／ｖ）
Ｍｅｇａ １０単独または０．５１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ ９単独に比較して、ウイルス
力価を低下させた（図１７）。したがって、Ｍｅｇａ １０もしくはＭｅｇａ ９＋Ｎａ
Ｃｌはウイルスの不活化を促進した。まとめると、結果は、メチルグルカミドとＴｎＢＰ
またはＮａＣｌの間で相乗効果が観察され、メチルグルカミドのウイルス不活化効率を高
めるために使用できることを示している。
実施例９：Ｎ－メチルグルカミドによるヒト抗体溶液およびヒト血漿中のエンベロープ
ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）の不活化
この時点で、Ｍｅｇａ １０は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質マトリックス中の複数の
エンベロープウイルスの強力な不活化因子であることが示されている。Ｍｅｇａ １０が
他の血漿関連タンパク質マトリックスで有効かどうかを評価するために、ヒト免疫グロブ
リンＧ（ＩｇＧ）および血漿溶液でＸ－ＭｕＬＶ不活化を行った。各タンパク質マトリッ
クスサンプルは、０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ １０を含む３
０ ｍｇ／ｍＬで調製し、Ｘ－ＭｕＬＶストック（１：１１）を添加し、２．０±１．０
℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを反応停止し、ＰＧ
－４指標細胞を使用したＴＣＩＤ５０アッセイにおいて連続希釈した。結果は、ヒトＩｇ
Ｇとヒトの血漿サンプルの両方で、Ｍｅｇａ １０がＸ－ＭｕＬＶを検出限界（≦２．０
３Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）まで不活化し、ＩｇＧにおける1/１０４．４６以下
へのＸ－ＭｕＬＶ感染力低下とヒト血漿溶液における1/１０３．５０以下へのＸ－ＭｕＬ
Ｖ感染力低下を示した（図１４）。上記２つのタンパク質マトリックスに対するウイルス
感染力低下の値の違いは、ＩｇＧ陽性対照と比較して、ヒト血漿サンプルの陽性対照ウイ
ルス力価が低かったためである。この不一致の考えられる原因は、実験を実行する前に血
漿が熱で不活化されていないことに起因する、非特異的な補体媒介ウイルス不活化である
。要約すると、Ｍｅｇａ １０は、ｒＦＶＩＩＩタンパク質溶液と同様に、複数の血液関
連タンパク質マトリックスでＸ－ＭｕＬＶを効果的かつ迅速に不活化することができ、Ｎ
－メチルグルカミドによるウイルス不活化は、生物学的製剤の種類、発生源、濃度に影響
されないことを示している。
Ｎ－メチルグルカミドでウイルスを不活化するこの方法は、タンパク質サブユニット、
タンパク質（酵素、因子など）、組換えタンパク質、もしくは抗体またはヒト血液／血漿
由来の医薬などの生物活性薬物の精製プロセスに適用できる。この方法で使用される環境
的に安全な界面活性剤は、アミド結合で結合された親水性のグルコース部分と疎水性の脂
肪酸尾部で構成されている、糖をベースとした複数のＮ－メチルグルカミド同族体群であ
る。Ｎ－メチルグルカミドにはオクチルフェノールのような有毒中間体の存在が知られて
いないため、環境への懸念に関連するリスクが排除される。さらに、これらの糖ベースの
界面活性剤は本来非イオン性であり、非イオン性界面活性剤は目的の薬物タンパク質を破
壊しないことが示されている。本来、Ｎ－メチルグルカミドは非エンベロープウイルスや
核酸調製物に影響を与えない。この方法は、潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不
活化するために、Ｎ－メチルグルカミドとタンパク質製剤とのインキュベーション工程を
含む。この方法によるウイルスの減少を評価するために、複数のモデルエンベロープウイ
ルス（たとえば、異種向性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイ
ルス）をタンパク質薬物サンプル（たとえば、天然タンパク質、組換えタンパク質、抗体
、ヒト血漿）に個別に添加し、Ｎ－メチルグルカミドとインキュベートした。インキュベ
ーション後、ウイルス感染力価を測定するためにＴＣＩＤ５０アッセイを実施した。さら
に、Ｎ－メチルグルカミドによるエンベロープウイルスの不活化は、数多くの文献がある
ウイルス不活化界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の不活化に匹敵する。総合すると、
これらの優れた特性により、Ｎ－メチルグルカミドは生物由来医薬品の精製プロセスにお
ける強力なツールとなる。

Claims (18)

  1. 未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法
    であって、
    （ａ）対象の生物学的産物溶液を、Ｎ－メチルグルカミド溶液とともにインキュベートし
    、（ｂ）該生物学的産物溶液中に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活
    化し、
    （ｃ）該生物学的産物溶液を精製する
    ことを含む、前記方法。
  2. 前記エンベロープウイルスが、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス、一本鎖または二本鎖ウイ
    ルスを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記エンベロープウイルスが前記生物学的産物溶液に加えられている、請求項１に記載
    の方法。
  4. ウイルスが更にレトロウイルスを含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記ウイルスが、レトロウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイ
    ルス科、フィロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイル
    ス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイル
    ス科、バキュロウイルス科およびポックスウイルス科から成る群から選択されるウイルス
    科の１以上に属する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記エンベロープウイルスが、異種指向性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、または
    牛ウイルス性下痢ウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記Ｎ－メチルグルカミドが、アミド結合により非環式親水性グルコース糖部分に連結
    された炭素長がｎ（ｎ≧３）の脂肪酸疎水性鎖から構成される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記Ｎ－メチルグルカミドが、Ｍｅｇａ ８、Ｍｅｇａ ９、Ｍｅｇａ １０、Ｍｅｇ
    ａ １１、およびＭｅｇａ １２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記生物学的産物が、組換えタンパク質、抗体、サイトカイン、血漿タンパク質、ワク
    チン溶液、核酸治療剤および遺伝子治療産物からなる群から選択される、請求項１記載の
    方法。
  10. 前記生物学的産物が真核細胞から産生されたものであるである、請求項１に記載の方法
    。
  11. 前記真核細胞が哺乳類細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記生物学的産物が原核細胞から産生されたものである、請求項１に記載の方法。
  13. Ｎ－メチルグルカミド溶液の濃度が、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の０．５から１０．０
    倍の範囲内である、請求項７に記載の方法。
  14. インキュベートする工程が低温で成される、請求項１に記載の方法。
  15. インキュベートする工程が、１から３７℃の温度範囲で行われる、請求項８に記載の方
    法。
  16. エンベロープウイルス溶液中でエンベロープウイルスを不活化する方法であって、
    （ａ）Ｎ－メチルグルカミド溶液をエンベロープウイルス溶液に加え、
    （ｂ）該エンベロープウイルス溶液中のエンベロープウイルスを不活化する
    ことを含む、前記方法。
  17. 前記エンベロープウイルスが前記生物学的産物溶液に加えられている、請求項１５に記
    載の方法。
  18. 未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法
    であって、
    （ａ）対象の生物学的産物溶液を標準溶液とインキュベートし、
    （ｂ）工程（ａ）の生物学的産物溶液中に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物
    質を不活化し、
    （ｃ）工程（ｂ）の最終溶液中に存在する不活化ウイルスを測定し、
    （ｄ）別の対象の生物学的産物溶液をＮ－メチルグルカミンとインキュベートし、
    （ｅ）工程（ｄ）の最終溶液中に存在する不活化ウイルスを測定し、
    （ｆ）工程（ｃ）の最終溶液の結果と工程（ｅ）の最終溶液の結果を比較する
    ことを含む、前記方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5650270A (en) 1982-02-01 1997-07-22 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
DE3704550A1 (de) * 1987-02-13 1988-08-25 Behringwerke Ag Verfahren zur inaktivierung huellhaltiger viren in mittels einer zelle in vitro hergestellten protein-praeparationen
DE4103800A1 (de) 1990-09-27 1992-04-02 Helmuth Schmoock Folie
DE4125625C2 (de) * 1991-08-02 1999-12-02 Octapharma Ag Glarus Verfahren zur Herstellung von virusinaktivierten Immunglobulinlösungen
AU6653094A (en) * 1992-12-16 1994-07-04 Immuno Aktiengesellschaft Process for preparing a virus-safe biological composition
US5695928A (en) 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
DE19528221C2 (de) 1995-08-01 1998-10-22 Blutspendedienst Der Drk Lande Verfahren zur Herstellung eines virussicheren, therapeutischen Präparates aus Humanplasma
CA2175719A1 (en) 1996-05-03 1997-11-04 Brian J. Underdown Compositions and methods for protection against immunologically diverse isolates of influenza virus
US6093743A (en) 1998-06-23 2000-07-25 Medinox Inc. Therapeutic methods employing disulfide derivatives of dithiocarbamates and compositions useful therefor
CA2309633C (en) 1998-10-23 2010-12-14 Idea Innovative Dermale Applikationen Gmbh Method for developing, testing and using associates of macromolecules and complex aggregates for improved payload and controllable de/association rates
US20020127587A1 (en) 2001-02-13 2002-09-12 Domenica Simms Methods and compositions for isolation of biological macromolecules
EP1691198B1 (en) 2003-10-28 2010-10-20 Advanced Life Science Institute, Inc. Method of detecting hepatitis c virus
JP4131850B2 (ja) 2003-12-04 2008-08-13 アークレイ株式会社 インフルエンザウイルスの免疫学的測定方法
KR20070012838A (ko) 2004-05-19 2007-01-29 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠 Ｂ형간염 바이러스의 검출방법
EP1806363B1 (en) 2004-09-22 2013-09-04 Advanced Life Science Institute, Inc. METHOD OF DETECTING HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN
SG177887A1 (en) * 2006-12-15 2012-02-28 Schering Plough Ltd Method for replicating influenza virus in culture
CN101610787B (zh) * 2006-12-15 2013-07-03 先灵-普劳有限公司 在培养物中复制流感病毒的方法
CN101081298A (zh) 2007-06-26 2007-12-05 陈少莺 一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法
WO2009129470A2 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Nanobio Corporation Methods for treating herpes virus infections
US9144606B2 (en) 2008-04-21 2015-09-29 Nanobio Corporation Nanoemulsion influenza vaccine
WO2010014903A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed olfactory receptor-based microsurface plasmon polariton detector
JP2010077091A (ja) 2008-09-26 2010-04-08 Beacle Inc Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質中空バイオナノ粒子とリポソームを用いたｓｉＲＮＡの内包と細胞選択的なｓｉＲＮＡの導入方法
EP2729169A1 (en) 2011-07-06 2014-05-14 Nanobio Corporation Human respiratory syncytial virus vaccine
DK2879691T3 (da) * 2012-08-06 2019-06-11 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til inaktivering af kappebærende vira
WO2015036549A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Löving Robin Antigen and method for production thereof
KR102238133B1 (ko) * 2013-11-15 2021-04-09 제넨테크, 인크. 환경-친화적 세제를 사용한 바이러스 불활성화 방법
JP2016182112A (ja) 2015-03-25 2016-10-20 東ソー株式会社 ウイルスからの核酸抽出試薬
US11564392B2 (en) * 2017-09-18 2023-01-31 Bayer Healthcare Llc Methods of inactivation of viruses using n-methlyglucamide and its derivatives

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