KR20200052370A

KR20200052370A - N-메틸글루카미드 및 그의 유도체를 사용한 바이러스 불활성화 방법

Info

Publication number: KR20200052370A
Application number: KR1020207010807A
Authority: KR
Inventors: 셩지앙 리우; 앨리슨 티통; 웬셩 왕; 니콜라스 스파도니
Original assignee: 바이엘 헬쓰케어 엘엘씨
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-05-14
Also published as: EP3684921A1; US20230143494A1; MX2020002939A; JP2020533987A; RU2020113752A; JP2023139096A; PE20201167A1; TW201925163A; US11564392B2; AU2018331357A1; CN111108193A; RU2020113752A3; SG11202002449PA; US20200260727A1; CA3075853A1; IL273229A; JP7317005B2; WO2019055463A1; BR112020005229A2

Abstract

본 개시내용은 바이러스를 불활성화하는 데에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. N-메틸글루카미드를 사용하는 바이러스 불활성화 방법은 단백질 서브유닛, 단백질 (효소, 인자 등), 재조합 단백질, 항체, 백신 또는 유전자 치료 생성물과 같은 생물학적-활성 약물의 정제 과정에 적용가능하다. 이와 같은 방법에서 사용되는 세제는 아미드 결합에 의해 연결된 친수성 글루코스 잔기 및 소수성 지방산 테일로 구성되는 다수의 N-메틸글루카미드 동종체를 기재로 한다. 또한, 이러한 당-기재 세제는 특성상 비이온계로, 약물 단백질, 혈장 생물제제, 비-외피보유 바이러스 백신 또는 아데노 연관 바이러스 입자는 붕괴시키지 않는다. 미식별 외피보유 바이러스 오염물을 갖는 관심 생물학적 생성물 용액의 정제 방법은 관심 생물학적 생성물 용액을 표준 용액과 함께 인큐베이션하는 것, 단계 (a)의 생물학적 생성물 용액에 존재하는 임의의 잠재적 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하는 것, 단계 (b)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것, 별도의 관심 생물학적 생성물 용액을 N-메틸글루카미드 용액과 함께 인큐베이션하는 것, 단계 (d)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것, 및 단계 (c) 및 단계 (e)의 최종 용액 결과를 비교하는 것을 포함한다.

Description

N-메틸글루카미드 및 그의 유도체를 사용한 바이러스 불활성화 방법

생물치료제(biotherapeutics)는 생물학적 기원을 가지는 임의 유형의 원료, 즉 세포주, 세포 배양액, 및 조직액 또는 체액과 연관된 과정으로부터 제조되는 분자이다. 생물학적-유래 치료제의 제조는 안전성을 보장하기 위한 많은 정제 단계를 필요로 하는 복잡한 과정이다. 각 단계 또는 과정 도처에서 미생물 오염이 있을 수 있음을 고려하는 것이 특히 중요하다. 재조합 단백질 제조의 경우, 생물치료제는 대부분 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드 DNA를 내포하는 조작된 인간 또는 동물 유래 세포 [즉 중국 햄스터 난소 (CHO) 또는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포], 또는 하이브리도마 세포, 즉 NS0의 배양, 그리고 정제 과정을 실행하는 일련의 단위 작업들에 의해 제조된다. CHO 및 BHK (문헌 [Chan, S.Y., 1994], [Wang G. et al. 1999] 및 [Suzuki A. et al. 1982]) 세포가 내인성 레트로바이러스-유사 입자 (ERVLP)를 코딩하는 염색체 통합 전구바이러스 요소(proviral element)를 가지고 있다는 것은 잘 알려져 있다. 전혈 또는 혈장으로부터의 생물치료제 제조는 혈액 기원 병원체, 즉 B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 (HCV) 바이러스 등에 의한 원료 오염이라는 문제에 직면한다. 또한, 제조에 추가적인 문제를 야기하는 외래 요소가 제조 중간물에 도입될 수도 있다. 지금까지 생물반응기 바이러스 오염 사고에 대한 많은 보고들이 있었다 (문헌 [Hsieh, W.T. et al. 2008], [Qiu Y. et al., 2013]). 특히, 바이러스의 불활성화 및/또는 제거는 여러 해 동안 생물제제 산업을 괴롭혀 왔다. 일부 이유로는 바이러스가 유래하는 공급원에 있어서의 가변성은 물론, 작은 크기가 포함된다.

바이러스는 외피보유(enveloped) 및 비-외피보유 군으로 나누어진다. 내인성 레트로바이러스-유사 입자는 외피보유되는데, CHO 및 BHK 세포, 및 그의 관련 배양액에서 발견되어, 추가적인 정제 단계, 시설, 기기 및 환경에 오염 위험성을 야기한다. 현재의 방법들을 사용하여서는 감염성이 관찰된 바 없지만, 내인성 레트로바이러스-유사 입자는 환자들 및 관련 산업에 대하여 잠재적인 위험성을 나타낸다. 이러한 모든 이유로, 제조 과정에서 이러한 오염물을 빠르고도 효과적으로 불활성화 및/또는 제거하는 것은 점점 더 중요해지고 있다.

다양한 어레이(array) 및 검정에서, 세제가 바이러스를 불활성화하는 데에 중요한 도구로 사용되어 왔다. 1980년대부터 시작하여, 세제는 혈액 샘플 혼합수집물(pool) (수혈 또는 혈액 구성요소, 예컨대 혈장 유래 치료 생성물을 필요로 하는 환자용) 및 샘플을 취급하는 실험실 요원의 안전성을 증가시켜 왔다. 더 최근에는, 바이러스 오염의 잠재적 위험성을 가지고 있는 생물학적 치료제 및/또는 백신의 제조 과정에서 세제가 광범위하게 사용되고 있다. 생물학적 약물 제조에 있어서, 외피보유 바이러스의 불활성화에 사용되는 가장 잘 특성화되어 있으며 고도로 효과적인 세제는 폴리소르베이트 (트윈(Tween)-20, 트윈-80), 트리톤(Triton) X-100 (옥톡시놀(Octoxinol)-10으로도 알려져 있음) 및 트리-n-부틸 포스페이트 (TnBP, 종종 폴리소르베이트 또는 트리톤 X-100과 함께 용매로 사용됨)와 같은 비이온계 세제이다. 폴리소르베이트는 주변 조건에서 고도로 효과적이나, 상대적으로 높은 농도에서 그러하며, 온도를 낮추게 되면 효능이 감소한다. 따라서, 이와 같은 세제는 생물학적 활성 및 분자 구조를 안정화하는 데에 중요한 더 낮은 온도 조건을 필요로 하는 생물학적 재료의 제조에는 최상의 선택사항이 아닐 수 있다.

트리톤 X-100 (또한 옥톡시놀, 옥톡시놀-3, 프레셉틴(Preceptin))은 바이러스를 불활성화하는 데에 있어서 전통적으로 잘 알려져 있는 효과적인 세제이다. 그의 유도체와 함께, 트리톤 X-100은 매우 낮은 온도에서 매우 강력하다. 트리톤 X-100의 옥틸페놀 성분은 에스트로겐 수용체와 상호작용함으로써, 노출된 동물에서의 생식에 대한 영향으로 이어지는 것으로 특성화되어 있다. 트리톤 X-100을 함유하는 생물공정 폐기물은 직접 환경으로 방출될 경우 특히 수생 생물에 부정적인 결과를 야기하게 된다. 생물공정 폐기물로부터의 트리톤 X-100의 처리 또는 회수는 많은 비용이 들고 문제를 야기하게 된다. 생물활성 약물을 변경하지 않으면서도 효과적으로 바이러스를 불활성화하는 (또는 비-환경독성인) 새로운 환경 친화적 세제의 개발은 많은 생물제약 업계의 우선 사항이 되어 있다. 이에 따라, 효과적이며 강력하고 환경적으로 더 안전한 세제를 발견하는 것이 생물제약 업계의 최우선 사항이 되어 있다.

[발명의 개요]

본 발명 방법의 실시양태는 미식별 외피보유 바이러스 오염물을 갖는 관심 생물학적 생성물 용액을 정제하는 것을 포함하며, 이는 관심 생물학적 생성물 용액을 N-메틸글루카미드 용액과 함께 인큐베이션하는 것, 생물학적 생성물 용액에 존재하는 임의의 잠재적 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하는 것, 및 생물학적 생성물 용액을 정제하는 것을 포함한다.

미식별 외피보유 바이러스 오염물을 갖는 관심 생물학적 생성물 용액의 정제 방법은 관심 생물학적 생성물 용액을 표준 용액과 함께 인큐베이션하는 것, 단계 (a)의 생물학적 생성물 용액에 존재하는 임의의 잠재적 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하는 것, 단계 (b)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것, 별도의 관심 생물학적 생성물 용액을 N-메틸글루카미드 용액과 함께 인큐베이션하는 것, 단계 (d)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것, 및 단계 (c) 및 단계 (e)의 최종 용액 결과를 비교하는 것을 포함한다.

숙련 기술자라면, 하기하는 도면이 오로지 예시 목적을 위한 것임을 알고 있을 것이다. 어떠한 방식으로도 도면으로서 본 발명 교시 또는 청구범위의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.
도 1은 외피보유 바이러스의 세제 붕괴에 대한 이론적인 일반적 메커니즘을 나타낸다. 레트로바이러스와 같은 외피보유 바이러스는 숙주 세포 및 바이러스로부터 기원하는 바이러스 외피에 의해 보호되는 20면체-형상의 뉴클레오캡시드를 가진다. 각 세제 분자는 그의 양친매성 구조에 기여하는 친수성 헤드 및 소수성 테일을 가진다. 상기 2개 부분은 각 세제의 고유 특성인 임계 미셀 농도 (CMC)를 결정한다. 세제 단량체는 특정 CMC 미만에서 바이러스 외피 내에 삽입될 수 있으며, 숙주에 대한 바이러스의 부착을 방해하거나 그렇지 않을 수 있다. 반대로, CMC 이상의 농도에서는, 더 많은 세제 단량체가 외피에 삽입되어 외피의 붕괴를 야기함으로써, 바이러스가 숙주 세포 표면상의 그의 수용체에 결합할 수 없게 될 수 있다.
도 2는 N-메틸글루카미드 세제의 소수성 (비극성) 및 친수성 (극성) 영역을 나타낸다.
도 3은 N-메틸글루카미드 세제 동종체들의 2-차원 (2D) 및 3-차원 (3D) 구조를 나타낸다. 마찬가지로, 각 화합물은 아미드 결합에 의해 비고리형인 친수성 글루코스 당 잔기에 연결된 8-10 또는 12개 탄소로 구성되는 소수성 지방산 사슬로 구성된다.
도 4는 재조합 FVIII (rFVIII)가 개별적으로 메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12 CMC의 0.5x, 1x, 2x와 함께 인큐베이션되었을 때, X-MuLV가 실온에서 30분 이내에 완전히 불활성화된다는 것을 보여준다.
도 5는 재조합 FVIII (rFVIII)가 별도로 각 세제 (메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12) CMC의 1x 및 2x와 함께 인큐베이션되었을 때, X-MuLV가 2.0 ℃에서 30분 이내에 완전히 불활성화된다는 것을 보여준다.
도 6은 2.0 ℃로 30분 동안 재조합 FVIII (rFVIII) 중에서 인큐베이션되었을 때 0.3 % (w/v) 메가 10 및 0.3 % (w/v) 트리톤 X-100에 의해 완전한 X-MuLV 불활성화가 달성된다는 것을 보여줌으로써, 두 가지 세제의 유사한 효능을 입증하고 있다.
도 7은 2.0 ℃에서의 물 또는 메가 10과의 2시간 인큐베이션 후에도 재조합 FVIII (rFVIII)가 그의 활성을 유지한다는 것을 보여준다.
도 8은 2.0 ℃에서 30분 동안 X-MuLV 및 점증 농도의 메가 10과 함께 인큐베이션된 재조합 FVIII (rFVIII)의 투여량-반응을 나타낸다. 투여량 반응 곡선은 당 세제의 농도가 증가하면서 X-MuLV의 역가가 바이러스가 검출가능하지 않은 검출 한계 (LOD)까지 역으로 감소한다는 것을 보여준다. rFVIII 대조군 (Ctrl) 파선은 X-MuLV 단독과 함께 인큐베이션된 rFVIII의 역가에 해당한다.
도 9는 2.0 ℃에서 0, 5, 15, 30, 60 및 120분 동안 X-MuLV 및 0.3 % (w/v) 메가 10과 함께 인큐베이션된 재조합 FVIII (rFVIII)의 동역학을 나타낸다. 메가 10 처리는 바이러스가 검출가능하지 않은 검출 한계 (LOD)에 달하는 바이러스 역가의 즉시 감소 (완전한 불활성화)로 이어졌는데, 이는 rFVIII 단독 및 배지 단독 대조군과 반대되는 것이다.
도 10은 2.0 ℃에서 0, 5, 30, 60 및 120분 동안 0.02 %, 0.10 % 또는 0.20 % (w/v) 메가 10을 동반하여 X-MuLV의 고-역가 모액과 함께 인큐베이션된 재조합 FVIII (rFVIII)의 동역학을 나타낸다. 바이러스 불활성화가 관찰되지 않은 0.02 % (w/v) 메가 10, rFVIII 및 배지 단독 대조군 샘플들과 달리, 0.10 % (w/v)의 메가 10은 바이러스 역가의 감소로 이어진 반면, 0.20 % (w/v)는 5분 이내에 바이러스가 검출가능하지 않은 검출 한계 (LOD)에 달하는 바이러스 역가의 즉시 감소 (완전한 불활성화)로 이어졌다.
도 11은 상이하게 제조된 메가 10 분자가 유사하고 재현가능한 투여량 반응 결과를 산출한다는 것을 보여준다.
도 12는 재조합 FVIII (rFVIII) 중에서 인큐베이션되었을 때, 돼지 거짓광견병 바이러스 (PRV)가 2.0 ℃에서 15분 이내에 0.2 및 0.3 (w/v) 메가 10에 의해 검출 한계까지 불활성화된다는 것을 보여준다.
도 13은 2.0 ℃로 30분 동안 재조합 FVIII (rFVIII) 중에서 인큐베이션되었을 때, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)가 0.2, 0.3 및 0.4 (w/v)의 메가 10 및 1.0 % (w/v)의 메가 9에 의해 검출 한계까지 완전히 불활성화된다는 것을 보여준다.
도 14는 2.0 ℃로 30분 동안 인간 이뮤노글로불린 G (IgG) 및 인간 혈장 단백질 용액 중에서 0.2, 0.3 및 0.4 % (w/v) 메가 10과 함께 인큐베이션되었을 때, X-MuLV가 검출 한계까지 완전히 불활성화된다는 것을 보여준다. 두 단백질 용액은 각각 30 mg/mL의 최종 농도를 가지도록 제조되었다.
도 15는 메가 10 (M10) 단독, 트윈 20 (Tw20) 단독, 그리고 0.01 % (w/v), 0.02 % (w/v) 또는 0.06 % (w/v) Tw20이 있거나 없는 메가 10 농도 0.05 % (w/v), 0.10 % (w/v) 또는 0.30 % (w/v)에서의 메가 10의 Tw20과의 혼합물을 사용한 X-MuLV 불활성화를 나타낸다. 농도 0.30 % (w/v) M10 단독, 또는 0.30 % (w/v) M10 + 0.06 % (w/v) Tw20 혼합물에서 X-MuLV는 30분 이내에 완전히 불활성화되었다.
도 16은 메가 10 (M10) 단독, 트리(n-부틸)포스페이트 (TnBP) 단독, 그리고 0.05 % (w/v) 또는 0.30 % (w/v) 농도에서의 메가 10의 TnBP와의 혼합물 (1:1)을 사용한 X-MuLV 불활성화를 나타낸다. 농도 0.30 % (w/v) M10 단독 또는 0.30 % (w/v) M10 + 0.30 % (w/v) TnBP 혼합물에서, X-MuLV는 30분 이내에 완전히 불활성화되었다. 흥미롭게도, 0.05 % (w/v) M10 + 0.05 % (w/v) TnBP에서 바이러스 역가의 감소가 존재함으로써 (그러나 완전한 불활성화는 아님), 메가 10과 TnBP 사이에 상승작용성 효과가 있을 수 있음을 나타내었다. 바이러스 역가가 rFVIII 대조군 (세제가 없는 것)과 유사하였으므로, 나머지 세제 처리들은 바이러스 불활성화를 산출하지 않았다.
도 17은 550 mM NaCl이 있거나 없는 0.06 % (w/v), 0.10 % (w/v) 또는 0.20 % (w/v)의 메가 10, 또는 0.30 % (w/v), 0.51 % (w/v) 또는 0.71 % (w/v)의 메가 9를 사용한 X-MuLV 불활성화를 나타낸다. 500 mM NaCl이 있거나 없는 농도 0.20 % (w/v) 메가 10 단독, 0.20 % (w/v) 메가 10 + NaCl 및 0.71 % (w/v) 메가 9에서, X-MuLV가 상당히 불활성화되었다. 0.10 % (w/v) 메가 10 + 550 mM NaCl 및 0.51 % (w/v) 메가 9 + 500 mM NaCl에서 바이러스 역가의 감소가 존재함으로써, 메가 10 또는 메가 9와 NaCl 사이에 약간의 상승작용성 효과가 있을 수 있음을 나타내었다. 바이러스 역가가 rFVIII 대조군 (세제가 없는 것) 및 NaCl 대조군 (세제가 없는 것)과 유사하였으므로, 나머지 세제 처리들은 바이러스 불활성화를 산출하지 않았다.

본 개시내용은 바이러스 불활성화와 관련한 방법 및 조성물을 제공한다.

정의

본 명세서를 해석하는 데에 있어서, 하기의 정의가 적용될 것이다. 하기에서 제시되는 임의의 정의가 본원에 참조로 포함되는 임의의 문서를 포함한 임의의 다른 문서에서의 그 단어의 용도와 상충하는 경우, (예를 들면 그 용어가 원래 사용되는 문서에서) 반대의 의미가 분명하게 드러나지 않는 한 하기에서 제시되는 정의가 항상 본 명세서 및 그의 관련 청구범위를 해석하는 데에 있어서 우선해야 한다.

적절할 경우, 단수로 사용되는 용어는 복수도 포함하게 되며, 그 반대도 마찬가지이다. 본원에서 "단수형태"의 사용은 달리 언급되거나 "하나 이상"의 사용이 분명하게 부적절하지 않은 한 "하나 이상"을 의미한다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "포함하다(comprise)" "포함하다(comprises)" "포함하는(comprising)" "포함되다(include)" "포함되다(includes)" 및 "포함한(including)"의 사용은 호환가능한 것으로, 제한하는 것이 아니다. "~와 같은", "예를 들면" 및 "예컨대"라는 용어들 역시 제한하고자 하는 것이 아니다. 예를 들어, "포함한"이라는 용어는 "포함하나, 제한되는 것은 아닌"을 의미해야 한다.

본원에서 사용될 때, "약"이라는 용어는 제공된 단위 값의 +/- 10 %를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "실질적으로"라는 용어는 관심 특징 또는 특성의 전체적이거나 개략적인 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 기술분야 통상의 기술자라면, 생물학적 및 화학적 조성물 및 재료의 시험, 제조 및 저장에 영향을 주는 많은 변수로 인하여, 그리고 생물학적 및 화학적 조성물 및 재료의 시험, 제조 및 저장에 사용되는 기기 및 장비의 본질적인 오차로 인하여, 생물학적 및 화학적 현상이 있다 하더라도 드물게 절대적인 결과를 달성하거나 회피한다는 것을 이해하고 있을 것이다. 따라서, "실질적으로"라는 용어는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 잠재적인 완전성의 결핍을 표현하는 데에 사용된다.

1980년대 이후, 세제는 혈액 공여자로부터 수집된 혼합수집 혈액에서 바이러스를 불활성화하기 위한 필수적인 도구로 사용되어 왔다. 그와 같은 과정은 혈액, 혈장 또는 혈액/혈장 유래 성분, 예컨대 혈장 유래 인자 VIII (pdFVIII)를 투여받는 환자의 안전성에 중요하다. 또한, 이와 같은 정제 수단은 혈장 유래 생물학적 생성물 (PDBP)의 임상 실험실 또는 제조 설비에서의 혈액의 처리와 직접적으로 연관되는 요원의 안전성을 증가시킨다. 더 최근에는, 이와 같은 작업이 동물-유래 재료를 포함하는 생물학적 치료제 또는 백신을 위한 생물제약 약물 제조 과정에 필수적이 되기도 하였다. 동물-유래 재료 (즉 포유동물 세포에서 생성되는 혈액, 혈장, 조직 및 단백질)는 내인성 바이러스를 보유할 수 있거나, 또는 외래 바이러스에 의해 쉽게 오염될 수 있다. 따라서, 약물 제조 과정은 환자가 바이러스 없는 치료를 받는 것을 보장하기 위한 일련의 효과적인 바이러스 불활성화 (즉 용매-세제, 낮은 pH 및 열 처리) 및 제거 기술 (즉 바이러스 여과)을 포함한다. 이러한 과정들은 생물학적-유래 치료제 또는 백신 제품의 안전한 공공 출시에 필수적이다. 그러한 제품의 효율, 강력성 및 가장 중요한 것으로 전체적인 안전성을 증가시키기 위한 신규 방법이 강력하게 요구되고 있다. 이러한 요구를 충족하기 위하여, 본 개시내용에서는 환경친화적인 N-메틸글루카미드 기재 세제의 새로운 사용 방법을 특성화한다.

세제는 친수성 (극성) 헤드 기 및 소수성 (비극성) 테일 기로 구성되는 양친매성 분자이다. 이와 같은 범용 구조는 수용액 중에서의 세제의 다른 분자, 가장 두드러지게는 단백질 또는 외피보유 바이러스와의 상호작용을 가능하게 한다. 기초 과학 및 응용 기술에서, 세제는 생물학적 분자가 응집하는 것을 방지하거나 세포 배양물 또는 조직 현탁액으로부터의 멤브레인 단백질을 가용화하기 위한 가용화제 또는 안정화제로서 사용될 수 있다. 단백질을 가용화하는 데에 사용될 경우, 하기의 특성들이 특정 세제를 다른 것에 비해 더 바람직하게 한다: 1) 전하가 결핍되어 있는 세제 (비이온계 세제)는 관심 단백질의 구조 및 활성을 유지하는 것을 도움, 2) 낮은 임계 미셀 농도 (CMC)를 가지는 세제는 투석을 통한 세제의 용이한 제거를 가능하게 함, 3) 투명한 세제는 그에 따라 단백질 흡광도 판독치에 영향을 주지 않음, 그리고 4) 고도로 순수한 세제는 실험들 간의 가변성을 감소시킴. 유사하게, 이러한 특성들 대부분은 단백질 약물을 파괴하지 않고, 세제로부터의 간섭 없이 단백질 농도를 검출하고, 세제가 고도로 순수해서 바이러스 불활성화가 일관되게 이루어지는 것을 보장할 필요가 있을 때 바이러스 불활성화를 위한 세제 후보를 선택하는 경우에 적용가능하다.

일반적으로, 외피보유 바이러스 불활성화는 특정 세제의 양친매성 구조 및 임계 미셀 농도 (CMC)에 의존한다. CMC는 세제 단량체가 응집하여 미셀 구조를 형성하는 농도를 지칭한다. 수용액에서는, 더 많은 세제 단량체들이 접촉될 때, 친수성 헤드가 인접하여 수용액으로부터 소수성 테일을 차폐함으로써, 궁극적으로 미셀 구조로 조직화될 수 있다. CMC는 특정 조건하에 주어진 세제에서 바이러스 불활성화가 이루어지게 되는 농도와 연계될 가능성이 있다. 이론적인 바이러스 불활성화 메커니즘은 세제 CMC 미만에서 단량체가 바이러스 외피에 삽입되는 것으로, 이는 바이러스에 유해할 수 있다. 농도가 CMC 이상이 되자마자, 멤브레인에 존재하는 이러한 세제 단량체는 바이러스 외피의 완전성을 붕괴시키거나 그것을 완전히 탈거할 수 있는 미셀을 형성한다. 바이러스 외피 없이는, 바이러스는 그의 숙주 세포 원형질 멤브레인상 그의 수용체에 결합하여 그의 복제 및 확산을 촉진할 수 없다.

지금까지, 생물치료제 제조 산업은 외피보유 바이러스를 불활성화하는 데에 수많은 세제들을 사용하여 왔다. 대중적인 비이온계 세제들 중 하나인 트리톤 X-100은 단백질 약물을 붕괴시키지 않으면서 외피보유 바이러스를 불활성화하는 데에 매우 효과적이었다. 생물치료제 제조 과정에서의 트리톤 X-100의 사용 후, 그것은 폐수 처리 플랜트로 폐기되거나, 또는 바로 수성 환경으로 방출된다 (문헌 [Madsen et al., 1996, JAOCS, 73:929-933]). 불행히도, 트리톤 X-100 부산물은 에스트로겐 수용체 기질을 모방할 수 있으며 동물, 특히 수생 생물의 생식 시스템에 부정적인 영향을 줄 수 있는 옥틸페놀을 함유한다. 이에 따라, 이와 같은 세제는 수많은 나라에서 환경에 대하여 독성인 화학물질로 간주되어, 그의 사용이 금지되기 시작하였다. 많은 생물치료제 업계가 트리톤 X-100에 필적하는 효능을 가지는 환경적으로 더 안전한 세제의 탐색에 전념해 왔다. 예를 들어, 바이오젠, 인크.(Biogen, Inc.) 사 및 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 사는 각각 라우릴 디메틸아민 N-옥시드 (LDAO) 및 알킬 글루코시드로 눈을 돌렸다 (콘리(Conley) 등의 2014 US 특허 #W02014025771A2호; 문헌 [Conley et al., 2016, Biotechnol. Bioeng., Epub ahead of print]; 피셔(Fisher) 등의 2016 US 특허 #20160333046A1호). 이들 동료들이 상이한 클래스의 새로운 세제를 식별할 수 있었던 반면, 본 발명의 실시양태는 외피보유 바이러스의 불활성화에, 완전히 신규하며 고도로 효과적인 클래스의 비이온계 세제인 N-메틸글루카미드 (지방산 당으로도 알려져 있음)를 규정하는 바이다.

당-기재 세제는 뛰어난 물리적 특성을 가지며, 고도로 생분해성이고, 비-독성으로, 이는 특히 수성 환경을 위한 그의 안전성 프로파일에 기여한다 (문헌 [Bogdan, 2007], [Stalmans et al., 1993]). 따라서, 개시되는 실시양태들은 생체활성-약물 제조에서 바이러스를 불활성화하기 위한 새로운 방법으로서의 당-기재 세제인 N-메틸글루카미드의 사용에 초점을 맞춘다.

N-메틸글루카미드는 아미드 결합에 의해 연결되는 고도로 친수성인 글루코스 잔기 및 소수성 지방산 사슬로 구성되는 비이온계 세제이다. 이와 같은 세제는 환경친화적인데, 그것이 재생가능 탄소 지수 약 95 %로 고도로 생분해성인 것으로 알려져 있으며, 특히 수생 생물에 대하여 비-독성으로 간주되기 때문이다 (문헌 [Stalmans et al., 1993, SOFW, 119:794-808]). 그의 증가된 안전성 프로파일 및 뛰어난 물리적 특성으로 인하여, 이와 같은 세제는 기초 과학 기술에서의 용도는 물론 샴푸 및 접시세척 비누에서의 용도로도 높은 관심을 얻고 있다. 마찬가지로, 이와 같은 세제는 생물학적-유래 약물 생성물의 바이러스 불활성화를 위한 주요 후보가 될 수 있다.

재조합 단백질의 대부분은 유전적으로 조작된 포유동물 세포 (즉 CHO 및 BHK)의 발효에 의해 제조된다. 이러한 세포들은 확인된 감염성이 결핍되어 있는 외피보유 바이러스 입자인 내인성 레트로바이러스-유사 입자 (ERVLP)를 생성시키는 염색체 통합 레트로바이러스 전구-바이러스 유전자 또는 요소를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. ERVLP의 불활성화를 확인하는 데에는, 구체적인 내인성 레트로바이러스 모델로서 X-MuLV가 사용되었는데, 주어진 정제 단위 작업에 의한 임의의 불활성화 또는 제거에 적용되는 샘플을 스파이킹(spiking)하는 것에 의해 제조 정제 과정을 평가하기 위한 실험실 도구로서 현재 사용되고 있는 것이다. 이에 따라, 개시되는 실시양태는 N-메틸글루카미드를 사용하여 X-MuLV와 같은 외피보유 바이러스를 불활성화하는 이와 같은 새로운 방법을 사용하게 된다. X-MuLV 모델로 볼 때, 헤르페스바이러스, 플라비바이러스, 필로바이러스 등을 포함하여 다른 모든 외피보유 바이러스들이 모두 N-메틸글루카미드 불활성화에 감수성일 가능성이 크다. 또한, 이와 같은 새로운 방법은 투석 또는 컬럼 크로마토그래피와 같이 세제 제거 단계와 연관될 수 있는 약물 정제 과정 전체 중 어떠한 단계에도 적용가능하다.

일반적으로, 이와 같은 새로운 클래스의 세제를 사용한 바이러스 불활성화는 N-메틸글루카미드를 사용하여 단백질 샘플 (즉 재조합 인자 VIII, 인간 IgG 항체 및 혈장 구성요소들)에 스파이킹된 X-MuLV의 실험실 균주를 시험하는 것, 2-8 ℃에서 30분 동안의 샘플의 인큐베이션, 및 바이러스 감염을 관찰하기 위한 지표 세포주 (즉 PG-4, 베로(Vero) 또는 EBTr 세포주)에서의 반응 튜브의 이후 실험을 포함한다. N-메틸글루카미드를 시험하기 위한 체계적인 접근법은 다양한 조건하에서의 최초 스크리닝으로 시작하여, 단백질 활성 평가, 투여량 반응 연구, 고역가 및 저역가 바이러스 모액을 사용한 동역학 연구, 다수 바이러스 및 생물학적 적용, 그리고 마지막으로 일관성을 보장하기 위한 다수-제조자 비교로 이어진다. 최초 스크리닝 조건은 2-8 ℃하에 120분 이내에서, 그리고 0.1 내지 0.3 % (w/v) 범위인 불활성화 농도에서 바이러스 불활성화가 성공적이었던 전통적인 트리톤 X-100 세제의 역사적 데이터를 바탕으로 하였다. 새로운 세제가 공지의 강력한 세제 (트리톤 X-100)에 필적한다는 것을 보장하기 위하여, 낮은 온도, 그리고 30 및 120분 동안의 인큐베이션을 N-메틸글루카미드의 최초 스크리닝용으로 선택하였다. 평가 농도는 각 신규 세제의 CMC를 기준으로 하였다. 다음에, 외피보유 바이러스를 불활성화하는 데에 가장 효과적이었던 N-메틸글루카미드 후보들을 색소원 검정 키트를 사용하여 인간 인자 VIII 활성에 대한 임의 효과에 대해 평가하였다. 다음에, 각 개별 세제와 관련하여, 0.014-01.0 % (w/v) 범위인 N-메틸글루카미드의 점증 농도로 그의 각 투여량 반응에 대하여 N-메틸글루카미드를 평가하였다. 얼마나 빠르게 불활성화가 이루어지는지를 평가하기 위하여, 저역가 및 고역가 바이러스 조제물 모두를 사용하여 N-메틸글루카미드로 동역학 연구를 수행하였다. 과정 내내 생성되는 데이터의 신뢰성을 증가시키기 위하여, 유사한 조건하에서 다수의 판매자 공급원을 검정하여 시험된 N-메틸글루카미드의 일관성 및 신뢰성을 확인하였다. 마지막으로, N-메틸글루카미드가 다른 혈액 또는 혈장-관련 매트릭스에서 효과적으로 유지되는지 여부를 평가하기 위하여, 유사한 조건하에 인간 이뮤노글로불린 G 및 인간 혈장에서 바이러스 불활성화를 확인하였다. 종합하면, 이와 같은 체계적인 접근법은 개시되는 실시양태가 정제 과정에서의 N-메틸글루카미드의 적용가능성을 확인해주는 것을 가능하게 하였다.

N-메틸글루카미드를 사용한 바이러스 불활성화 방법은 단백질 서브유닛, 단백질 (효소, 인자 등), 재조합 단백질 또는 항체와 같은 생물학적으로 활성인 약물의 정제 과정에 적용가능하다. 이와 같은 방법에서 사용되는 환경적으로 더 안전한 (비환경독성이라고도 지칭됨) 세제는 아미드 결합에 의해 연결된 친수성 글루코스 잔기 및 소수성 지방산 테일로 구성되는 다수의 N-메틸글루카미드 동종체를 기재로 한다. N-메틸글루카미드에는 옥틸페놀과 같은 알려져 있는 독성 중간물이 없기 때문에, 생물제제 제조에서 사용되는 경우 그것이 환경상의 우려와 관련된 위험성을 배제한다. 또한, 이러한 당-기재 세제는 특성상 비이온계로, 관심 약물 단백질을 붕괴시킬 가능성이 없다. 이와 같은 방법은 임의의 잠재적인 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하기 위한 N-메틸글루카미드의 생물학적 생성물과의 인큐베이션을 포함한다. 이와 같은 방법에 의한 바이러스 감소를 평가하기 위하여, 모델 외피보유 바이러스 (예컨대 친이종 백혈병 바이러스, 거짓광견병 바이러스 및 소 바이러스성 설사 바이러스)를 단백질 약물 샘플 (예컨대 천연 단백질, 재조합 단백질, 항체)에 스파이킹하고, N-메틸글루카미드와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에는, TCID₅₀ 검정을 수행함으로써, 바이러스 역가, 그리고 비처리 대조군과 N-메틸글루카미드 처리 샘플 사이의 바이러스 감염성 역가 차이인 log 감소 계수 (LRF)를 측정하였다. 역시, N-메틸글루카미드를 사용한 외피보유 바이러스의 불활성화는 산업 표준물인 트리톤 X-100의 것에 필적한다. 종합하면, 이러한 뛰어난 특징들이 N-메틸글루카미드를 생물학적 유래 약물 생성물의 정제 과정에 있어서의 강력한 도구가 되게 한다.

재료

실시예 1 - 바이러스 모액:

각각 바이엘 병원체 안전성 실험실(Bayer Pathogen Safety Laboratory) (캘리포니아 버틀리 소재) 또는 바이오릴라이언스 인크.(Bioreliance Inc.) (매릴랜드 로크빌 소재) 사에서 내부적으로 저역가 및 고역가 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV) 모액 균주 pNFS Th-1을 제조하였다. 바이오릴라이언스 인크. 사 (매릴랜드 로크빌 소재)에서 고역가 돼지 거짓광견병 바이러스 (PPV) 모액 균주 아우제츠키(Aujeszky)를 제조하였다. 바이오릴라이언스 인크. 사 (매릴랜드 로크빌 소재)에서 고역가 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV) 모액 균주 NADL도 제조하였다.

실시예 2 - 세포주:

미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection) (ATCC, www.atcc.org)로부터 고양이 PG-4 세포 (S+L-) (ATCC CRL-2032), 아프리카 녹색 원숭이 신장 베로(Vero) 세포 (ATCC CCL-81), 및 소 배아 기관 EBTr 세포 (ATCC CCL-44)을 구매하였다.

실시예 3 - 세포 배양 배지 및 보충제:

PG-4, 베로 및 ETBr 세포에 사용된 배양 배지는 맥코이(McCoy's) 5A (론자(Lonza) 사, 12-688F, 영국 슬러프 소재) 및 미뉴테시멈 필수 배지 이글(Minutesimum Essential Medium Eagle) (코닝(Corning) 사, 10-010-CV, 버지니아 마나싸스 소재)이었다. 하기의 성장 배지 보충제를 사용하였다: 소 태아 혈청 (FBS) (하이클론(Hyclone) 사, SH30070.03, 유타 로간 소재), 100x 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) (코닝 사, 30-002-Cl, 버지니아 마나싸스 소재) 및 200 mM L-글루타미누테세 (L-Glu) (MP 바이오메디칼스(Biomedicals) 사, 1680149, 오하이오 솔론 소재).

실시예 4 - 화학물질:

PG-4 세포에서의 X-MuLV 감염의 효율을 증가시키기 위하여 화학물질 헥사디메트린 브로마이드 (폴리브렌) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사, H9268-5g, 미주리 세인트루이스 소재)를 사용하였으며, 3 ㎍/ml의 최종 농도로 맥코이 5A 배지에 첨가하였다. 이와 같은 연구에서 특성화된 비이온계 세제는 옥타노일-N-메틸글루카미드 (메가(Mega) 8) (G-바이오사이언시즈(Biosciences) 사, DG017, 미주리 세인트루이스 소재 또는 시그마 또는 시그마-알드리치 사, 미주리 세인트루이스 소재), 노나오일-N-메틸글루카미드 (메가 9) (G-바이오사이언시즈 사, DG019, 미주리 세인트루이스 소재 또는 시그마-알드리치 사, 미주리 세인트루이스 소재), 데카노일-N-메틸글루카미드 (메가 10) (G-바이오사이언시즈 사, DG021, 미주리 세인트루이스 소재 또는 시그마-알드리치 사, 미주리 세인트루이스 소재), 도데카노일-N-메틸글루카미드 (메가 12) (바켐(Bachem) 사, P-1175.0001, 캘리포니아 토란스 소재), 및 P-tert-옥틸페녹시) 폴리에톡시에탄올 (트리톤 X-100) (EMD 밀리포어(Millipore) 사, 1086432500, 매사추세츠 빌레리카 소재)이다.

생물학적 용액:

각 바이러스 불활성화 검정은 재조합 인간 인자 VIII (rFVIII) (전체 길이 야생형, 바이엘 사내 제조), 인간 IgG 또는 혈장 단백질 (시그마-알드리치 사, 미주리 세인트루이스 소재) 중 어느 하나로 구성되는 생물학적 생성물 용액의 존재하에서 수행하였다.

방법

실시예 1 - 세제 제조

모용액 부피 당 5 중량% (w/v)의 목표 농도로 메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12 세제를 제조하였다. 각 세제를 제조자로부터 분말로 입수하고, 적절하게 칭량한 후, 밀리(Milli)-Q 워터에 용해시켰다. 세제가 실온에서 완전히 가용화되지 않은 경우, 용액을 ≤ 37 ℃ 수조에서 (메가 10 및 메가 12) 약 10-15분 동안 가열하였다. 처음에, 5 % 메가 12는 ≤ 37 ℃에서 용액이 되지 않았으며, 그에 따라 ≤ 60 ℃ 수조에 위치시키자, 30분 후 용액이 가용화되었다. 메가 12의 임계 미셀 농도는 0.013 %에 있었으므로, 바이러스 불활성화에 사용하는 데에는 10x 이상의 모용액이면 편리할 가능성이 있었다. 이에 따라, ≤ 60 ℃ 수조에 위치시켰을 때 (약 15분) 혼합물이 더 빠르게 용액이 되도록 하는 0.15 %의 농도로 밀리-Q 워터 중에서 새로운 모용액을 제조하였다. 어두운 용기 중에서 2-8 ℃로 세제를 저장하였다.

실시예 2 - 메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12 바이러스 불활성화 스크린

N-메틸글루카미드 세제들 (메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12)을 재조합 인자 VIII (rFVIII) 치료 약물의 통상적인 제조 조건하에서 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV), 돼지 거짓광견병 바이러스 (PRV) 또는 소 바이러스성 설사병 바이러스 (BVDV)를 효과적이고도 강력하게 불활성화하는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 각 세제에 대하여 시험된 농도는 각각 임계 미셀 농도 (CMC)의 0.5x, 1x 또는 2x를 기준으로 하였다. 각 세제를 무-세제 rFVIII 단백질과 함께 인큐베이션하고, 1:11의 비로 X-MuLV의 고-역가 모액을 스파이킹한 후, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. rFVIII만을 함유하는 양성 대조군 샘플을 포함시키고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 0 및 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 시점 후, 40 μL 의 각 불활성화 샘플 또는 대조군을 분리하여, 4.0 mL의 기본 배지 (즉 X-MuLV용으로 mL 당 3 ㎍의 폴리브렌 (MP)이 보충된 맥코이 5A 배지, 또는 EMEM)를 함유하는 15 mL 튜브로 옮겼다. 이와 같은 1:101 희석 계수 켄치(quench)는 세제가 지표 세포주에 대한 독성의 효과를 넘어 희석되는 것을 가능하게 하였으며, 또한 바이러스가 TCID₅₀ 검정을 수행하는 데에 필요한 범위 이내로 희석되는 것을 가능하게 하였다. 간단하게 말하자면, 11번째 희석 수준까지 MP 또는 EMEM 중에 1:3.2-배 연속으로 켄칭된 샘플 각각을 적정하는 것에 의해 바이러스 감염성을 평가하기 위한 TCID₅₀ 검정을 수행하였다. 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 3,000개 세포로 1일 전에 시딩된 지표 세포 단층에 8반복으로 희석 당 100 μL의 켄칭 및 연속 희석된 샘플 또는 기본 배지를 접종하였다. 37 ℃에서 1.5-2.5시간 인큐베이션 후, 4 % FBS, 2 % P/S 및 2 % L-Glu가 보충된 기본 배지 (PRV 또는 BVDV용 맥코이 5A 또는 EMEM)로 구성되는 100 μL의 검정 배지를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 다음에, 세포를 37 ℃에서 6-7일까지 동안 인큐베이션하면서, 광학 현미경하에서 바이러스 감염을 나타내는 세포변성 효과 (CPE)의 형성에 대하여 관찰하였다.

실시예 3 - 인간 인자 VIII 활성을 평가하기 위한 색소원 검정

rFVIII 매트릭스 중 0.3 % (w/v) (밀리-Q H₂O 중에서 제조된 5.0 % (w/v) 모용액으로부터의 것)의 농도로 메가 10을 제조하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 밀리-Q H₂O만이 스파이킹된 rFVIII 매트릭스의 희석 대조군도 제조하여, 동일 조건하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세제 및 희석 대조군을 색소원 검정 (크로모제닉스(Chromogenix) 사 코티스트(COATEST) SP4 FVIII 키트, Cat: 82409463) FVIII 표준물 및 대조군과 함께 적절한 농도로 1x 검정 완충제에 희석하였다. 30 μL의 각 세제, 대조군 및 표준물을 3반복으로 96-웰 플레이트상에 적재하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 색소원 검정 시약들을 첨가하고, 37.0 ℃ 및 5.0 % CO₂에서 8분 동안 인큐베이션하였다. 몰큘라 디바이시즈 스펙트라맥스(Molecular Devices SpectraMax) M5 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도 t 405 및 492 nm에 대하여 검정 플레이트를 측정하였다. 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) v5를 사용하여, 데이터를 분석하였다.

실시예 4 - rFVIII 무트리톤 매트릭스에서의 투여량 반응

rFVIII와 함께 인큐베이션되고 X-MuLV가 스파이킹된 메가 10 세제의 최저 유효 농도를 평가하기 위하여, 세제 투여량 반응 연구를 수행하였다. 재조합 FVIII (rFVIII) 매트릭스에서 각 세제의 0.5 % (w/v) 샘플을 제조한 후, 이어서 rFVIII 매트릭스 중에 1:2 연속 희석함으로써, 0.014-0.5 % (w/v) 범위의 각 세제 샘플 6개를 산출하였다. 또한, rFVIII 매트릭스만을 함유하는 양성 대조군 샘플을 포함시켰다. 각 세제 샘플 및 대조군에 1:11 비로 저역가 X-MuLV 모액을 스파이킹하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 각 불활성화 샘플 및 대조군을 분리하여, mL 당 3 ㎍의 폴리브렌 (MP)이 보충된 맥코이 5A 배지 3.0 mL를 함유하는 15 mL 튜브로 옮겼다. 이와 같은 1:31 희석 계수 켄치는 세제가 지표 세포주 (PG-4)에 대한 독성의 효과를 넘어 희석되는 것을 가능하게 하였으며, 또한 X-MuLV가 TCID₅₀ 검정을 수행하는 데에 필요한 범위 이내로 희석되는 것을 가능하게 하였다. 간단하게 말하자면, 11번째 희석 수준까지 MP 중에 1:3.2-배 연속으로 켄칭된 샘플 각각을 적정하는 것에 의해 X-MuLV 감염성을 평가하기 위한 TCID₅₀ 검정을 수행하였다. 웰 당 3,000개 세포로 1일 전에 시딩된 PG-4 세포 단층에 8반복으로 희석 당 100 μL의 켄칭된 샘플 또는 MP를 접종하였다. 37 ℃에서 1.5-2.5시간 인큐베이션 후, 4 % FBS, 2 % P/S 및 2 % L-Glu가 보충된 맥코이 5A 배지로 구성되는 100 μL의 검정 배지를 사용하여 세포를 피복하였다. 다음에, 세포를 37 ℃에서 6-7일까지 동안 인큐베이션하면서, 광학 현미경하에서 X-MuLV 감염을 나타내는 세포변성 효과 (CPE)의 형성에 대하여 관찰하였다.

실시예 4 - 바이러스 불활성화 동역학

rFVIII와 함께 인큐베이션되고 X-MuLV가 스파이킹된 메가 10 세제의 불활성화율을 평가하기 위하여, 바이러스 불활성화 동역학 연구를 수행하였다. 재조합 FVIII (rFVIII) 무트리톤 매트릭스에서 메가 10의 0.02 %, 0.10 %, 0.20 % 및 0.30 % (w/v) 샘플을 제조하였다. 또한, rFVIII 매트릭스만을 함유하는 양성 대조군 샘플 또는 배지 단독 대조군을 포함시켰다. 각 세제 샘플 및 대조군에 1:11 비로 저역가 및 고역가 X-MuLV 모액을 스파이킹하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 0, 5, 15, 30, 60 및 120분 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 후, 100 또는 40 μL의 각 불활성화 샘플 및 대조군을 분리하여, mL 당 3 ㎍의 폴리브렌 (MP)이 보충된 맥코이 5A 배지 3.0 mL 또는 4.0 mL를 함유하는 15 mL 튜브로 옮겼다. 이와 같은 1:31 (저역가 X-MuLV) 또는 1:101 (고역가 X-MuLV) 희석 계수 켄치는 세제가 지표 세포주 (PG-4)에 대한 독성의 효과를 넘어 희석되는 것을 가능하게 하였으며, 또한 X-MuLV가 TCID₅₀ 검정을 수행하는 데에 필요한 범위 이내로 희석되는 것을 가능하게 하였다. 간단하게 말하자면, 11번째 희석 수준까지 MP 중에 1:3.2 켄칭된 샘플 각각을 적정하는 것에 의해 X-MuLV 감염성을 평가하기 위한 TCID₅₀ 검정을 수행하였다. 웰 당 3,000개 세포로 1일 전에 시딩된 PG-4 세포 단층에 8반복으로 희석 당 100 μL의 켄칭된 샘플 또는 MP를 접종하였다. 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 1.5-2.5시간 인큐베이션 후, 4 % FBS, 2 % P/S 및 2 % L-Glu가 보충된 맥코이 5A 배지로 구성되는 100 μL의 검정 배지를 사용하여 세포를 피복하였다. 다음에, 세포를 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 6-7일까지 동안 인큐베이션하면서, 광학 현미경하에서 X-MuLV 감염을 나타내는 세포변성 효과 (CPE)의 형성에 대하여 관찰하였다.

실시예 5 - 다른 단백질 존재하에서의 N-메틸글루카미드 세제 바이러스 불활성화

N-메틸글루카미드 세제들 (메가 8, 메가 9, 메가 10 및 메가 12)을 인간 혈장, 혈장 유래 생물제제 또는 인간 항체의 통상적인 제조 조건하에서 X-MuLV, PRV 또는 BVDV를 효과적이고도 강력하게 불활성화하는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 각 세제에 대하여 시험된 농도는 각각 임계 미셀 농도 (CMC)의 0.5x, 1x 또는 2x를 기준으로 하였다. 각 세제를 세제 및 다수 농도의 유리 단백질 (높은 단백질 구배)와 함께 인큐베이션하고, 1:11의 비로 X-MuLV의 고-역가 모액을 스파이킹한 후, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 단백질만을 함유하는 양성 대조군 샘플을 포함시키고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 0 및 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 시점 후, 40 μL 의 각 불활성화 샘플 또는 대조군을 분리하여, 4.0 mL의 기본 배지 (즉 X-MuLV용으로 mL 당 3 ㎍의 폴리브렌 (MP)이 보충된 맥코이 5A 배지, 또는 PRV 또는 BVDV용 EMEM)를 함유하는 15 mL 튜브로 옮겼다. 이와 같은 1:101 희석 계수 켄치는 세제가 지표 세포주에 대한 독성의 효과를 넘어 희석되는 것을 가능하게 하였으며, 또한 바이러스가 TCID₅₀ 검정을 수행하는 데에 필요한 범위 이내로 희석되는 것을 가능하게 하였다. 간단하게 말하자면, 11번째 희석 수준까지 기본 배지 (MP 또는 EMEM) 중에 1:3.2-배 연속으로 켄칭된 샘플 각각을 적정하는 것에 의해 바이러스 감염성을 평가하기 위한 TCID₅₀ 검정을 수행하였다. 웰 당 3,000개 세포로 1일 전에 시딩된 지표 세포 단층에 8반복으로 희석 당 100 μL의 켄칭된 샘플 또는 기본 배지를 접종하였다. 37 ℃에서 1.5-2.5시간 인큐베이션 후, 4 % FBS, 2 % P/S 및 2 % L-Glu가 보충된 기본 배지 (맥코이 5A 또는 EMEM)로 구성되는 100 μL의 검정 배지를 사용하여 세포를 피복하였다. 다음에, 세포를 37 ℃에서 6-7일까지 동안 인큐베이션하면서, 광학 현미경하에서 바이러스 감염을 나타내는 세포변성 효과 (CPE)의 형성에 대하여 관찰하였다.

검정 실시예

실시예 1: N-메틸글루카미드 세제: 특성, 제조 및 평가

본 연구에서는 하기 4종의 메틸글루카미드-기재 세제를 분석하였다: 옥타노일-N-메틸글루카미드 (메가 8), 노나오일-N-메틸글루카미드 (메가 9), 데카노일-N-메틸글루카미드 (메가 10) 및 도데카노일-N-메틸글루카미드 (메가 12) (표 1). 이들 세제는 모두 시중에서 구입가능한 N-메틸글루카미드로, 매우 많은 것들이 다수의 판매자 (G-바이오사이언시즈 사, 시그마 사 또는 바켐 사)로부터 분말-형태로 구매된다.

도 1은 어떻게 세제가 바이러스의 외피를 붕괴시킬 수 있는지에 대한 제안되어 있는 이론적 메커니즘을 나타낸다. 일반적으로, 각 세제의 임계 미셀 농도 (CMC) 미만에서는, 세제 단량체가 바이러스 외피 내부에 삽입될 수 있으며, 그것은 바이러스가 세포 (숙주)에 부착하는 것을 가능하게 할 수도, 또는 무산시킬 수도 있다. CMC를 초과하는 농도에서는, 더 많은 단량체가 바이러스 외피에 삽입되어 바이러스 외피의 완전한 붕괴를 야기하며, 단량체들이 그 자체와, 또는 미셀과 해체된 외피 유래 바이러스 단백질의 혼합물과 미셀로 형성될 수 있다. 본 특허의 이하 실시예에서 기술되는 바와 같이, CMC가 유효 농도의 지표인 것으로 보인다 (실시예 3). CMC 이상의 농도에서는, 본 연구에서 시험된 메틸글루카미드 세제 각각에서 바이러스 불활성화가 이루어졌다.

N-메틸글루카미드는 아미드 결합에 의해 연결된 비고리형의 친수성인 글루코스 극성 헤드 기 및 소수성인 지방산 사슬 테일 (8-10 또는 12개의 탄소로 구성됨)을 함유한다 (도 2). 표 1로 볼 때, N-메틸글루카미드들은 유사하게 구성되며 탄소 사슬 길이에서만 다른데, 이는 분자량의 증가에 상응하여 비례한다. 기타 연구로 볼 때, 지방산 사슬의 탄소가 증가하면서 임계 미셀 농도 (CMC)는 역으로 감소한다.

<표 1>

도 3은 본 연구에서 사용된 N-메틸글루카미드들의 2-차원 (2D) 및 3-차원 (3D) 구조를 나타낸다. 2D 및 3D 구조들은 모두 유사한 탄소, 수소, 산소 및 질소 분자의 배열을 나타낸다. 흥미롭게도, 다른 것들에 대비한 메가 8 사이의 분자 패킹(packing)은 N-메틸글루카미드들이 헤드-대-헤드 이층 패킹을 형성할 수 있는 반면, 다른 것들은 헤드-대-테일 단층 패킹으로 패킹될 수 있다 (문헌 [Jeffery and Malusynksa ,1988, Acta Cryst., B45:447-452]). 패킹에 있어서의 이와 같은 차이는 탄소 사슬 증가에 따른 효능의 증가에 기여할 수 있다.

표 2는 세제 분말의 제조자들, 및 방법 부문에도 상술되어 있는 사내 제조에 대해 열거하고 있다. 제조된 5 % (부피 당 중량, w/v) 세제들 중, 메가 8 및 메가 9는 실온에서 물에 용이하게 가용화되었다. 메가 10의 경우에는 37 ℃ 수조에서 가온될 필요가 있었는데, 그것은 용액이 15분 이내에 가용화되도록 하였다. 그러나, 메가 12는 37 ℃ 수조에서는 물에 용해될 수 없었으며, 적어도 5분 동안의 60 ℃ 수조에서 점차적으로 가용화되었다. 이와 같은 양상은 다른 것에서도 관찰됨으로써, 소수성을 강화하여 특히 물에서 용해도의 가능성을 감소시키는 지방 사슬 길이의 증가와 관계가 있을 수 있었다 (문헌 [Gaber et al., Burczyk, 2007]). 이에 따라, 밀리-Q 워터 중에서 새로운 0.15 % 모액을 제조하였는데, 이는 CMC의 적어도 10x이다. 이와 같은 새로운 조제물은 60 ℃ 수조에 위치시켰을 때 15분 이내에 용액이 될 수 있었다.

<표 2>

실시예 2: 바이러스: 배경 및 특성

기존의 많은 외피보유 RNA 및 DNA 바이러스들이 존재하는데, 예컨대 하기 바이러스 과에 속하는 것들이다: 레트로비리다에(Retroviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 분야비리다에(Bunyaviriae), 오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridea), 아레나비리다에(Arenaviridae), 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 바큘로비리다에(Baculoviridae) 및 폭스비리다에(Poxviridae). 이들 과 중 어느 것에 속하는 많은 혈액-계 바이러스들이 잠재적으로 생물학적으로 활성인 약물 생성물의 제조에 사용되는 동물-유래 생성물들을 오염시킬 수 있다. 이에 따라, 자체의 다양한 정제 방법들을 사용한 바이러스 제거를 입증하기 위하여, 많은 제약 회사들이 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV), 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV) 및 거짓광견병 바이러스 (PRV)와 같은 모델 바이러스를 사용해 왔다 (표 3). X-MuLV는 단백질 약물 생성물을 발현하는 내인성 레트로바이러스 유사 입자 숙주 세포 계열 (즉 CHO 또는 BHK 세포)에 통상적으로 사용되는 모델 바이러스이다. X-MuLV는 또한 레트로바이러스를 포함한 다른 외피보유 바이러스, 예컨대 주요 혈액-계 병원체인 HIV용 모델이기도 하다. BVDV는 플라비바이러스용 모델로, 지카 바이러스 (최근의 전세계적 발발과 연관되어 있음) 및 C형 간염 바이러스 (HCV)와 같은 바이러스를 대표할 수 있다. PRV는 헤파드나바이러스용 모델로, 가장 흔한 혈액-계 병원체 중 하나인 B형 간염 바이러스 (HBV)를 대표할 수 있다. 이론상, 이들 외피보유 바이러스는 모두 N-메틸글루카미드를 사용한 세제 불활성화에 민감성이다.

<표 3>

X-MuLV의 저역가 및 고역가 모액을 사용하여 N-메틸글루카미드 바이러스 불활성화의 통상적인 조건을 평가하였다 (표 4). X-MuLV의 저-역가 모액은 투여량-반응 연구 및 동역학 연구에 사용하였다. X-MuLV의 고-역가 모액은 동역학 연구, 및 log 감소 계수 (LRF)로 표현되는 바이러스 불활성화 고도 능력의 측정에 사용하였다. 표 4에 포함된 다른 바이러스들은 역시 N-메틸글루카미드 세제 불활성화에 민감성일 가능성 큰 BVDV 및 PRV의 고역가 바이러스 모액이다.

<표 4>

실시예 3: N-메틸글루카미드 유도체들의 스크린

N-메틸글루카미드 유도체들을 X-MuLV의 고역가 모액을 불활성화하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 각 세제 (메가 8, 메가 9, 메가 10 또는 메가 12)를 CMC의 0.5x, 1x 및 2x에서 시험하였으며, 단백질 약물 (재조합 인자 VIII, rFVIII, 항체 또는 혈장)과 혼합하고, 외피보유 바이러스 (즉 X-MuLV, PRV 또는 BVDV)를 스파이킹한 후, RT 또는 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응을 켄칭하고, 적절한 지표 세포 (PG-4, 베로 또는 EBTr 세포)를 사용하여 TCID₅₀ 적정 검정을 수행하였다. TCID₅₀은 하기 두 가지 질문에 대한 답을 주었다: 시험된 웰들 중 어느 것에서 임의의 관찰가능한 바이러스 감염이 존재하는가? 그렇다면, 시험된 샘플 중 바이러스의 양 (역가)은 얼마인가? 예상대로, 2 ℃ 및 실온 (25 ℃)에서의 30분 인큐베이션 후, X-MuLV가 스파이킹된 rFVIII 대조군의 측정된 역가는 각각 평균 6.40 및 6.45 Log₁₀TCID₅₀/mL이었다 (도 4 및 도 5). 각 온도 조건에 있어서, 시험된 N-메틸글루카미드 (메가 8, 9, 10 및 12) 및 그의 농도는 N-메틸글루카미드 농도가 1x CMC 이상이었던 경우 검출 한계 (LOD)까지 X-MuLV를 불활성화함으로써, ≥10^4.3-배의 완전한 바이러스 감염성 불활성화 또는 ≥4.3의 log 감소 계수 (LRF)를 나타내었다 (도 4 및 도 5, 표 5 및 표 6). 검출 한계 (LOD)가 바이러스가 관찰되지 않을 때의 역가이기도 한 ≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL이었다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 메가 9 및 메가 10의 0.5x CMC에서의 농도는 25 ℃에서는 완전히, 그러나 2 ℃에서는 부분적으로 X-MuLV를 불활성화하였다. 메가 8 및 메가 12의 0.5x CMC에서는, 25 ℃ 또는 2 ℃에서 처리가 이루어졌을 때 유의성 있는 불활성화가 없었다 (도 4 및 도 5). N-메틸글루카미드에 의한 X-MuLV의 불활성화는 트리톤 X-100만큼 효과적이었으나, 검정 지표 세포에 대하여 덜 독성이었다 (도 6). 0.3 % (w/v)에서는, 두 세제가 X-MuLV를 완전히 불활성화하였는데; 메가 10은 ≤2.03 TCID₅₀/mL의 검출 한계 (LOD)를 나타낸 반면, 트리톤 X-100은 ≤2.54 TCID₅₀/mL의 LOD를 가졌다 (도 6). 요약하면, 이러한 결과는 이와 같은 환경친화적 세제가 바이러스 불활성화에 있어서 효과적이면서도 강력하다는 것을 나타낸다.

<표 5>

<표 6>

실시예 4: rFVIII에 대한 N-메틸글루카미드 효과

N-메틸글루카미드 스크리닝 후, 메가 10을 최고 N-메틸글루카미드 후보인 것으로 결정하였는데, 더 낮은 농도 (~0.2 %)에서의 높은 효능 및 가용성 때문이다. 메가 10이 단백질 약물 활성에 부정적인 효과를 발휘하지 않았다는 것을 보장하기 위하여, 색소원 검정 키트를 사용하여 rFVIII 조제물의 활성을 측정하였다. 검정의 원리는 인자 X가 인자 Xa로 전환되어 색소원 기질의 가수분해로 이어지는 혈액 응고 메커니즘의 특정 단계와 연관된다. 그와 같은 반응은 인자 VIII (FVIII)의 활성에 의존하며, 측정가능한 색상 강도와 직접적으로 상관된다. rFVIII 조제물의 샘플을 2.0 ± 1.0 ℃에서 2시간 동안 0.3 % (중량/부피, w/v)의 메가 10 또는 0.3 % (부피/부피, v/v)의 물과 함께 인큐베이션하고, 색소원 검정 키트를 사용하여 rFVIII의 활성을 측정하였다. 물 대조군 및 메가 10-처리된 샘플의 평균 활성 (IU/mL)은 각각 57.19 및 52.26 IU/mL로 유사하였다 (도 7). 이러한 결과는 rFVIII 활성이 메가 10을 동반한 2시간 인큐베이션 후에도 유지된다는 것을 나타내는데, 이는 30분의 바이러스 불활성화를 충분히 넘는 시점이다. 상기 결과는 메가 10이 외피보유 바이러스를 불활성화하는 데에 효과적일 뿐만 아니라, 단백질 약물의 활성에 영향을 주지도 않는다는 것을 입증하고 있다.

실시예 5: 투여량 반응

메가 10의 최저 유효 농도를 측정하기 위하여, 투여량 반응 연구를 수행하였다. 0.014-0.5 % (중량/부피, w/v) 범위의 점증 농도를 재조합 FVIII (rFVIII)와 함께 인큐베이션하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 X-MuLV (저역가)를 스파이킹하였다. rFVIII 단독 대조군도 동일 조건하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 모든 반응을 켄칭하고, TCID₅₀ 검정에서의 연속 희석을 위하여 샘플을 채취하였다. 메가 10 반응의 경우, 농도 0.014-0.06 % (w/v) 사이에서는 바이러스 역가가 대조군과 유사해서, 메가 10이 그러한 낮은 농도에서는 외피보유 바이러스를 불활성화할 수 없다는 것을 나타내었다 (도 8). 메가 10 농도가 약 0.11 %로 증가하자마자, 바이러스 역가는 약 2.62 Log₁₀TCID₅₀/mL로 눈에 띄게 감소하였다. 대략 0.23 %의 메가 10에서는, 바이러스 역가가 바이러스 감염이 관찰되지 않는 수준까지 상당히 감소하였다 (도 7 및 표 7). 0.23 % (w/v)에서, 메가 10의 검출 한계 (LOD)는 ≤1.52 Log₁₀TCID₅₀/mL이었으며, 그에 따라 30분 동안의 2.0 ± 1.0 ℃에서의 메가 10에서의 LRF는 ≥3.96이었다 (표 7). 요약하면, X-MuLV를 빠르고도 효과적으로 불활성화하는 최저 농도는 메가 10의 경우 대략 0.23 %이다.

<표 7>

실시예 6: 동역학 연구

메가 10이 얼마나 빠르고 광범위하게 X-MuLV를 불활성화할 수 있는지를 확인하기 위해, 저역가 및 고역가 바이러스 조제물 모두를 사용하여 동역학 연구를 수행하였다. 동역학 연구는 다수의 농도 (0.02 %, 0.10 %, 0.20 % 및 0.30 % (w/v)), 시점 (0, 5, 15, 30, 60 및 120분) 및 저역가 및 고역가 X-MuLV 모액을 수반하였다. 추가적인 고역가 X-MuLV 모액을 시험하는 것에 의하면, 더 높은 log 감소 계수에 반영되게 될 더 큰 검정 민감도가 달성될 수 있다. 0.3 %의 메가 10을 재조합 FVIII (rFVIII) 조제물과 함께 인큐베이션하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 0, 5, 15, 30, 60 및 120분 동안 저역가 X-MuLV 바이러스를 스파이킹하였다. 다음에, 반응 샘플을 켄칭하고, TCID₅₀ 검정용으로 샘플을 채취하였다. 메가 10의 결과는 X-MuLV를 세제 함유 샘플과 혼합한 후 즉시 (t~0) 바이러스가 불활성화 되었음을 보여준다 (도 9). 검정된 모든 시점에서 바이러스 감염성이 검출되지 않음으로써, 다시 한번 ≤1.52의 Log₁₀TCID₅₀/mL 및 ≥3.80의 log 감소 계수에 달하는 검출 한계의 완전한 불활성화를 나타내었다.

<표 8>

고역가 X-MuLV 모액 및 다수의 메가 10 농도를 사용한 유사한 실험의 반복시, 0분 (t~0) (0.20 % 메가 10)에서는 바이러스의 부분적인 불활성화가 관찰되었으며, 5분 (0.20 % 메가 10)에서는 완전한 불활성화가 달성되었다 (도 10). 특히, 0.20 % 메가 10에서, ≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL의 검출 한계로 5 내지 120분의 인큐베이션에서 살아있는 바이러스가 관찰되지 않았으며, ≥10^4.80-배의 바이러스 감염성 감소로 이어졌다 (표 9). 이와 같은 실시예는 메가 10이 0-5분 범위인 빠른 작용으로 낮은 농도에서 고도로 효과적이라는 것을 입증해주었다.

<표 9>

실시예 7: 메가 10 로트-대-로트 비교

다수의 판매자 및 제조 로트에 걸친 메가 10의 일관성을 보장하기 위하여, G-바이오사이언스 사 및 시그마 사로부터의 세제 제품을 비교하는 투여량 반응을 수행하였다. 각 판매자에 대하여, 다수의 농도 (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 % w/v)로 샘플을 제조하고, 재조합 FVIII (rFVIII)와 함께 인큐베이션한 후, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 X-MuLV (고역가)를 스파이킹하였다. rFVIII 단독 대조군도 동일 조건하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 모든 반응을 켄칭하고, TCID₅₀ 검정을 위하여 적정하였다. G-바이오사이언스 사 및 시그마 사 생산 메가 10 샘플 각각에 있어서, 바이러스 역가는 해당 각 농도 수준에서 서로 일치하였다 (도 11). X-MuLV 불활성화 프로파일은 두 공급자로부터의 메가 10 제품이 유사하다는 것을 보여준다. 각 제품의 0.2-0.4 % 메가 10으로 처리된 샘플은 ≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL 및 LRF ≥4.45의 완전한 불활성화를 제공하였다. 요약하면, 서로 다른 공급자로부터 공급된 메가 10들이 서로, 그리고 이전의 데이터와 일치하는 결과를 산출하였다.

실시예 8: N-메틸글루카미드에 의한 재조합 FVIII에서의 다른 외피보유 바이러스 (BVDV 및 PRV)의 불활성화

N-메틸글루카미드에 의한 강력하고 빠른 X-MuLV 불활성화가 다른 외피보유 바이러스에도 동일하게 작용하는지 여부를 추가적으로 확인하기 위하여, 메가 9 및 10을 재조합 FVIII (rFVIII) 용액에서 BVDV 및 PRV를 불활성화하는 그의 능력에 대하여 평가하였다.

메가 9 및 10에 의한 BVDV 불활성화는 투여량 반응 연구를 통하여 확인하였다. 0.5, 0.8 및 1.0 % (w/v)로 메가 9를, 그리고 0.2, 0.3 및 0.4 % (w/v)로 메가 10을 함유하는 rFVIII의 샘플들에 1:11로 BVDV 모액을 스파이킹하고, 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 켄칭하고, 적정함으로써 EBTr 지표 세포를 사용한 TCID₅₀ 검정을 수행하였다. 결과는 메가 9가 겨우 1.0 %의 농도로 검출 한계 (≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL)까지 BVDV를 불활성화할 수 있다는 것을 보여주었다. 메가 10은 0.2, 0.3 및 0.4 % (w/v)에서 BVDV를 완전히 불활성화할 수 있었다. 두 세제는 ≥10^5.14-배까지 BDVD 감염성을 감소시킬 수 있었다.

PRV를 0.2 또는 0.3 % (w/v)로 메가 10을 함유하는 rFVIII 조제물에 스파이킹하고 (1:11), 2.0 ± 1.0 ℃에서 0, 5, 15, 30 및 60분의 시점으로 검정하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 켄칭하고, 베로 지표 세포를 사용한 TCID₅₀ 검정에서 적정하였다. 결과는 0.2 및 0.3 % 메가 10 모두가 바이러스 감염성을 즉시 10^4.5-배 이상까지 감소시킬 수 있으며, 두 농도의 메가 10에서 감염성의 감소 ≥10^5.10-배로 15분에 검출 한계 (≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL)에 도달한다는 것을 보여주었다 (도 12).

요약하면, 메가 10은 PRV를 0.2 %에서 15분 이내에 불활성화할 수 있으며, BVDV를 0.2 %에서 혼합 직후에 불활성화할 수 있어서, BVDV 감염성의 ≥10^5.14-배 감소를 나타낸다. 메가 9는 1.0 % (w/v)에서 처리 30분 이내에 LOD까지 BVDV를 불활성화하는 데에 효과적이었다. 메가 10 및 메가 9 모두는 BVDV를 LOD까지 불활성화할 수 있어서, BVDV 감염성의 ≥10^5.14-배 감소를 나타내었다. BVDV의 메가 10 불활성화는 메가 9에 비해 훨씬 더 빠르고 더 낮은 농도였다. 이러한 결과는 N-메틸글루카미드가 바이러스의 과 및 종에 관계없이 외피보유 바이러스를 효과적으로 불활성화할 수 있다는 것을 입증하고 있다 (도 13).

바이러스 불활성화에 대한 잠재적인 상승작용성 효과를 확인하기 위하여, 다른 화합물들과 함께 메틸글루카미드를 시험하였다. 메틸글루카미드를 트윈 20 (Tw20) 세제, 트리(n-부틸)포스페이트 (TnBP) 용매 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 염과 혼합한 후, 그리고 그것 없이, X-MuLV와 함께 인큐베이션하였다. 다음에, 이전에 기술된 바와 같은 TCID₅₀ 검정을 사용하여 각 샘플 또는 대조군의 역가를 검정하였다. 각 실험 (도 15, 16 및 17)에 있어서, 대조군은 세제 없이 X-MuLV가 스파이킹된 rFVIII로 구성되었는데, 산출된 역가는 약 6.5 Log₁₀TCID₅₀/ml인 예상 범위 이내였다. 농도 0.05 % (w/v), 0.10 % (w/v) 또는 0.30 % (w/v)의 메가 10을 0.01 % (w/v), 0.02 % (w/v) 또는 0.06 % (w/v)의 통상적으로 사용되는 Tw20 세제와 혼합하였는데, 바이러스 역가는 메가 10 단독과 유사하였다 (도 15). 이에 따라, 메가 10 + Tw20은 바이러스 불활성화를 더 강화하지는 않았다. 농도 0.05 % (w/v) 또는 0.30 % (w/v)의 메가 10을 (각각) 0.05 % (w/v) 또는 0.30 % (w/v)의 통상적으로 사용되는 TnBP 용매와 혼합하였는데, 0.05 % (w/v) 메가 10 + 0.05 % (w/v) TnBP에서 0.05 % 메가 10 단독에 비해 바이러스 역가가 약간 감소하였다 (도 16). 이에 따라, 메가 10 + TnBP는 바이러스 불활성화를 약간 강화하였다. 마지막으로, 농도 0.10 % (w/v)의 메가 10 또는 0.51 % (w/v)의 메가 9를 500 mM NaCl과 혼합하였는데, 0.10 % (w/v) 메가 10 또는 0.51 % (w/v) 메가 9 단독에 비해 바이러스 역가가 감소하였다 (도 17). 이에 따라, 메가 10 또는 메가 9 + NaCl은 바이러스 불활성화를 강화하였다. 종합하면, 상기 결과는 메틸글루카미드와 TnBP 또는 NaCl 사이에서는 상승작용성 효과가 관찰되며, 메틸글루카미드의 바이러스 불활성화 효율을 강화하는 데에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 9: N-메틸글루카미드에 의한 인간 항체 용액 및 인간 혈장에서의 외피보유 바이러스 (X-MuLV)의 불활성화

지금까지는, 메가 10이 재조합 FVIII 단백질 매트릭스에서의 다수 외피보유 바이러스의 강력한 불활성화제임을 나타내었다. 메가 10이 다른 혈장 관련 단백질 매트릭스에서 효과적인지를 평가하기 위하여, 인간 이뮤노글로불린 G (IgG) 및 혈장 용액에서 X-MuLV 불활성화를 수행하였다. 0.2, 0.3 및 0.4 % (w/v)의 메가 10을 함유하는 30 mg/mL로 각 단백질 매트릭스 샘플을 제조하고, X-MuLV 모액을 스파이킹한 후 (1:11), 2.0 ± 1.0 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 켄칭하고, PG-4 지표 세포를 사용한 TCID₅₀ 검정에서 연속 희석하였다. 결과는 인간 IgG 및 인간 혈장 샘플 모두에서 메가 10이 IgG에서는 ≥10^4.46-배, 그리고 인간 혈장 용액에서는 ≥10^3.50-배까지의 X-MuLV 감염성의 감소로, 검출 한계 (≤2.03 Log₁₀TCID₅₀/mL)까지 X-MuLV를 불활성화할 수 있다는 것을 보여주었다 (도 14). 두 가지 단백질 매트릭스에서의 바이러스 감염성 감소 값의 차이는 인간 혈장 샘플이 IgG 양성 대조군의 것에 비해 더 낮은 양성 대조군 바이러스 역가를 가진다는 사실에 기인하였다. 이와 같은 불일치의 짐작되는 원인은 혈장이 실험 수행 전에 열 불활성화되지 않음으로써 비특이적인 보체 매개 바이러스 불활성화로 이어졌던 것에 기원한다는 것이다. 요약하면, 메가 10은 다수의 혈액 관련 단백질 매트릭스에서 rFVIII 단백질 용액에서와 같이 효과적이고도 빠르게 X-MuLV를 불활성화할 수 있음으로써, N-메틸글루카미드에 의한 바이러스 불활성화가 생물학적 생성물 유형, 공급원 및 농도에 의해 영향을 받지 않음을 나타내었다.

N-메틸글루카미드를 사용한 이와 같은 바이러스 불활성화 방법은 단백질 서브유닛, 단백질 (효소, 인자 등), 재조합 단백질, 또는 항체 또는 인간 혈액/혈장 유래 치료제와 같은 생물학적-활성 약물의 정제 과정에 적용가능하다. 이와 같은 방법에 사용되는 환경적으로 안전한 세제는 아미드 결합에 의해 연결된 친수성 글루코스 잔기 및 소수성 지방산 테일로 구성되는 당 기재의 다수의 N-메틸글루카미드 동종체들이다. N-메틸글루카미드에는 옥틸페놀과 같은 알려져 있는 독성 중간물이 없기 때문에, 그것이 환경상의 우려와 관련된 위험성을 배제한다. 또한, 이러한 당-기재 세제는 특성상 비이온계로, 관심 약물 단백질의 붕괴를 나타내지 않는 것으로 입증되었다. 특성상, N-메틸글루카미드는 비-외피보유 바이러스 및 핵산 조제물에 대해서는 효과가 없을 가능성이 크다. 이와 같은 방법은 임의의 잠재적인 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하기 위한 N-메틸글루카미드의 단백질 약물 생성물과의 인큐베이션을 포함한다. 이와 같은 방법에 의한 바이러스 감소를 평가하기 위하여, 다수의 모델 외피보유 바이러스 (예컨대 친이종 백혈병 바이러스, 거짓광견병 바이러스 및 소 바이러스성 설사 바이러스)를 별도로 단백질 약물 샘플 (예컨대 천연 단백질, 재조합 단백질, 항체, 인간 혈장)에 스파이킹하고, N-메틸글루카미드와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에는, TCID₅₀ 검정을 수행하여 바이러스 감염성 역가를 측정하였다. 역시, N-메틸글루카미드를 사용한 외피보유 바이러스의 불활성화는 익히 입증된 바이러스 불활성화 세제인 트리톤 X-100의 것에 필적한다. 종합하면, 이러한 뛰어난 특징들이 N-메틸글루카미드를 생물학적 유래 약물 생성물의 정제 과정에 있어서의 강력한 도구가 되게 한다.

Claims

미식별 외피보유 바이러스 오염물을 갖는 관심 생물학적 생성물 용액의 정제 방법이며,
(a) 관심 생물학적 생성물 용액을 N-메틸글루카미드 용액과 함께 인큐베이션하는 것,
(b) 생물학적 생성물 용액에 존재하는 임의의 잠재적 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하는 것, 및
(c) 생물학적 생성물 용액을 정제하는 것
을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 외피보유 바이러스가 RNA 또는 DNA 바이러스, 단일 가닥 또는 이중 가닥 바이러스를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 외피보유 바이러스가 생물학적 생성물 용액에 스파이킹된 것인 방법.
제2항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 바이러스가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하기 바이러스 과 중 1종 이상에 속하는 것인 방법:
레트로비리다에, 플라비비리다에, 토가비리다에, 코로나비리다에, 필로비리다에, 라브도비리다에, 분야비리다에, 오르소믹소비리다에, 파라믹소비리다에, 아레나비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 바큘로비리다에 및 폭스비리다에.
제1항에 있어서, 외피보유 바이러스가 친이종 백혈병 바이러스, 거짓광견병 바이러스 또는 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, N-메틸글루카미드가 아미드 결합에 의해 비고리형 친수성 글루코스 당 잔기에 연결된 탄소 길이 n (n≥3)의 지방산 소수성 사슬로 구성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, N-메틸글루카미드가 메가 8, 메가 9, 메가 10, 메가 11 및 메가 12로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 생성물이 재조합 단백질, 항체, 시토카인, 혈장 단백질, 백신 용액, 핵산 치료제 및 유전자 요법 생성물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 생성물이 진핵 세포로부터 생성되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 생성물이 원핵 세포로부터 생성되는 것인 방법.
제7항에 있어서, N-메틸글루카미드 용액의 농도가 임계 미셀 농도 (CMC)의 0.5 내지 10.0배 범위인 방법.
제1항에 있어서, 인큐베이션 단계가 낮은 온도에서 수행되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 인큐베이션 단계가 1 내지 37 ℃의 온도 범위에서 이루어지는 것인 방법.
(a) 외피보유 바이러스 용액에 N-메틸글루카미드 용액을 첨가하는 것, 및
(b) 외피보유 바이러스 용액 중 외피보유 바이러스를 불활성화하는 것
을 포함하는, 외피보유 바이러스 용액 중 외피보유 바이러스의 불활성화 방법.
제15항에 있어서, 외피보유 바이러스가 생물학적 생성물 용액에 스파이킹된 것인 방법.
미식별 외피보유 바이러스 오염물을 갖는 관심 생물학적 생성물 용액의 정제 방법이며,
(a) 관심 생물학적 생성물 용액을 표준 용액과 함께 인큐베이션하는 것,
(b) 단계 (a)의 생물학적 생성물 용액에 존재하는 임의의 잠재적 외피보유 바이러스 오염물을 불활성화하는 것,
(c) 단계 (b)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것,
(d) 별도의 관심 생물학적 생성물 용액을 N-메틸글루카미드 용액과 함께 인큐베이션하는 것,
(e) 단계 (d)의 최종 용액에 존재하는 불활성화된 바이러스를 측정하는 것,
(f) 단계 (c) 및 단계 (e)의 최종 용액 결과를 비교하는 것
을 포함하는 방법.