CN116076514B - 一种用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂及灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂及灭活方法。本发明的病毒灭活剂由氯化十六烷基吡啶和缓冲液混合而成，氯化十六烷基吡啶的投料量为5～15g/L，缓冲液包括100～200g/L的氯化钠，50～150g/L的乙醇，4～10g/L的柠檬酸，7～15g/L的柠檬酸钠盐，余量为注射用水。本发明的脂包膜病毒灭活剂能够在更温和的灭活处理条件下高效灭活脂包膜病毒，而对指示细胞没有毒性，适合用于生化医药和生物制品的脂包膜病毒灭活，对生化医药和生物制品的基本没有不良影响。
Description
技术领域
本发明属于病毒灭活技术领域，具体涉及一种用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂及灭活方法。
背景技术
在生化药品和生物制品的生产制备全流程的任何一个环节都可能会发生病毒污染，病毒污染不仅可能导致产品安全性风险，在临床上产生严重后果，还可能对生物制品的生产环境和操作者带来安全风险。因此，生化药品和生物制品的病毒安全性控制对于保证药品的安全性和有效性具有重要意义。
脂包膜病毒是指具有由糖蛋白、脂肪所形成包膜的病毒，包膜也成囊膜，其将病毒粒包裹，这样的结构有高度的稳定性，可以保护病毒核酸不被细胞外环境破坏。包膜病毒采用相似的病毒宿主细胞膜融合机制，即病毒表面糖蛋白结合到宿主细胞受体后，启动了病毒融合蛋白的一系列构象变化。包膜病毒的灭活是生化药品和生物制品安全控制方面的重点。
目前生化药品和生物制品中脂包膜病毒常见的灭活方法有低pH处理法、S/D法、乙醇处理法、加热法等。上述现有方法在对样品进行灭活病毒的同时，现有化学方法在灭活病毒的同时，样品中蛋白也存在一定程度的变性失活，从而可能会造成样品中的核酸或蛋白收率较低。因此，需要开发一种能够在更温和的处理条件下进行脂包膜病毒灭活且对指示细胞没有毒性的脂包膜病毒灭活剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种对指示细胞没有毒性的脂包膜病毒灭活剂。
本发明的另一目的是提供处理条件更温和的脂包膜病毒灭活方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂，所述的病毒灭活剂由氯化十六烷基吡啶和缓冲液混合而成，所述的氯化十六烷基吡啶的投料量为5～15g/L，所述的缓冲液包括100～200g/L的氯化钠，50～150g/L的乙醇，4～10g/L的柠檬酸，7～15g/L的柠檬酸钠盐，余量为注射用水。
优选地，所述的氯化十六烷基吡啶的投料量为8～12g/L，例如8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L。
优选地，所述的缓冲液包括120～160g/L的氯化钠，80～100g/L的乙醇，4～6g/L的柠檬酸，7～10g/L的柠檬酸钠盐，余量为注射用水。
优选地，所述的缓冲液的pH值为4.6～5.0，例如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0。
进一步优选地，所述的缓冲液的pH值为4.6～4.8。
优选地，所述的病毒灭活剂以氯化十六烷基吡啶和缓冲液充分混合后的形式包装。
优选地，所述的缓冲液和所述的氯化十六烷基吡啶分别独立包装，使用时，可以根据具体情况配制特定氯化十六烷基吡啶质量百分浓度的病毒灭活剂。或者，在使用时，再向缓冲液中加入一定量的氯化十六烷基吡啶。
本发明还提供一种灭活脂包膜病毒的方法，将待处理样品置于上述病毒灭活剂中，在20℃～30℃条件下静置处理30～60min。
或者，将待处理样品置于上述缓冲液中，加入所述的氯化十六烷基吡啶，然后在20℃～30℃条件下处理30～60min。
优选在水浴方式下进行，温度稳定，避免温度过高对生化药品或生物制品的品质的影响，同时也避免温度不稳定或过低导致脂包膜病毒灭活效果不好的问题。
优选地，所述的脂包膜病毒为伪狂犬病毒和/或水疱性口炎病毒。
优选地，所述的待处理样品为生化药品或生物制品。
进一步优选地，所述的方法还包括将所述的病毒灭活剂与指示细胞共培养，培养结束后观察所述的指示细胞的形态是否发生改变的步骤。通过观察灭活剂处理后的指示细胞的形态是否发生改变来判断病毒灭活剂对检测系统是否造成影响。如果指示细胞在灭活剂处理前后无变化，则认为病毒灭活剂及灭活方法对指示细胞没有毒性。
优选地，所述的指示细胞为猪睾丸细胞(ST细胞)和/或非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。
本发明人在用季铵盐纯化硫酸软骨素时，意外发现采用特定浓度的氯化十六烷基吡啶缓冲溶液配合特定温度时，能够高效灭活伪狂犬病毒和水疱性口炎病毒，并且该方法环保无毒，条件温和，不易对产品造成不良影响。因此发明人采用特定质量浓度的氯化十六烷基吡啶缓冲溶液作为病毒灭活剂。该病毒灭活剂用于灭活生化药品和生物制品中的病毒时，能够高效灭活脂包膜病毒(例如伪狂犬病毒和水疱性口炎病毒)，且温度更温和，对生化药品和生物制基本无不良影响。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的脂包膜病毒灭活剂能够在更温和的灭活条件下高效灭活脂包膜病毒，而对指示细胞没有毒性，适合用于生化医药和生物制品的脂包膜病毒灭活，对生化医药和生物制品的基本没有不良影响。
附图说明
图1为实施例1中灭活病毒后的ST细胞的显微镜图；
图2为实施例1中灭活病毒后的Vero细胞的显微镜图；
图3为实施例2中阳性对照(PRV病毒引起ST细胞病变)的显微镜图；
图4为实施例2中指示病毒PRV滴度随灭活时间的变化趋势图；
图5为实施例3中阳性对照(VSV病毒引起Vero细胞病变)的显微镜图；
图6为实施例3中指示病毒VSV滴度随灭活时间的变化趋势图；
图7为对比例1中灭活病毒后的ST细胞的显微镜图；
图8为对比例1中灭活病毒后的Vero细胞的显微镜图；
图9为对比例2中PRV病毒滴度随水浴处理时间的变化趋势图；
图10为对比例3中VSV病毒滴度随水浴处理时间的变化趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例提供一种对指示细胞无毒性的脂包膜病毒灭活剂。
1、提供缓冲液：分别将15.5g氯化钠、10g无水乙醇、0.49g柠檬酸和0.72g二水合柠檬酸钠加入至注射用水中，充分溶解混匀后定容至100mL，配制成缓冲液，测得pH值为4.62。
2、取50mL上述缓冲液，加入氯化十六烷基吡啶0.5g，搅拌溶解得到脂包膜病毒灭活剂。
取出100μL上述脂包膜病毒灭活剂，加入接种有猪睾丸细胞(ST细胞)的96孔细胞板上，同时以培养基做阴性对照，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察ST细胞形态。
取出100μL上述脂包膜病毒灭活剂，加入接种有非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的96孔细胞板上，同时以培养基做阴性对照，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察Vero细胞形态。
结果显示：ST细胞形态正常(图1)，Vero细胞形态正常(图2)，可见氯化十六烷基吡啶浓度为10g/L的脂包膜病毒灭活剂对指示细胞ST细胞和Vero细胞均无毒性。
实施例2
本实施例提供一种脂包膜病毒(PRV病毒)的灭活方法。
本实施例中使用的脂包膜病毒灭活剂由缓冲液和氯化十六烷基吡啶组成。
缓冲液的制备方法为：分别将15.5g氯化钠、10g无水乙醇、0.49g柠檬酸和0.72g二水合柠檬酸钠加入至注射用水中，充分溶解混匀后定容至100mL，配制成缓冲液。
脂包膜病毒的灭活方法：
取出45mL上述缓冲液，加入5mL伪狂犬病毒(PRV)，混匀后从中取1mL，用培养基3倍稀释后暂存于2～8℃冰箱；在剩余溶液中加入氯化十六烷基吡啶0.5g，搅拌溶解后置于25℃恒温水浴锅中静置60min，在计时至0min，15min，30min，45min和60min时分别从中取样1mL，用培养基3倍稀释后暂存于2～8℃冰箱。
以培养基做阴性对照，以含PRV病毒的培养基做阳性对照，分别接种ST细胞，然后置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察ST细胞形态。结果显示：阴性对照中ST细胞形态与图1一致；阳性对照中ST细胞形态见图3，PRV病毒已经引起ST细胞病变。
按照微量滴定法测定病毒滴度：将各取样点样品进行10倍梯度稀释，取0.1ml添加至接种有ST细胞的培养基中，每个稀释度接种8孔，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察ST细胞病变情况。按Karber法计算样品中PRV病毒滴度及95％置信区间：以半数细胞感染剂量TCID50表示，log10TCID50＝L-d(S-0.5)，其中L＝最高稀释度的对数，d＝稀释对数之间的差，S＝阳性孔比率总和。PRV病毒滴度变化曲线见图4，处理30min，PRV灭活至检出限0.21logs以下。
实施例3
本实施例提供一种脂包膜病毒(VSV病毒)的灭活方法。本实施例基本同实施例2，区别仅是将PRV病毒换成VSV病毒，将ST细胞换成Vero细胞。
电镜结果中，阴性对照中Vero细胞形态与图2一致；阳性对照中Vero细胞形态见图5，VSV病毒已经引起Vero细胞病变。VSV病毒滴度变化曲线见图6，处理30min时，VSV灭活至检测限0.21logs以下。
对比例1
本对比例提供一种脂包膜病毒灭活剂。
1、提供缓冲液：分别将15g氯化钠、1g吐温80、0.4g柠檬酸和0.8g二水合柠檬酸钠加入至注射用水中，充分溶解混匀后定容至100ml，配制成缓冲液，测得pH值为4.91。
2、取50mL上述缓冲液，加入氯化十六烷基吡啶0.5g，搅拌溶解得到脂包膜病毒灭活剂。
取出100μL上述脂包膜病毒灭活剂，加入接种有ST细胞的96孔培养板中，接种后，以培养基做阴性对照，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察ST细胞形态。
取出100μL上述脂包膜病毒灭活剂，加入接种有非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的培养基中，以培养基做阴性对照，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察Vero细胞形态。
结果显示：ST细胞形态异常(图7)，Vero细胞形态异常(图8)，该脂包膜病毒灭活剂对指示细胞有毒性作用。
对比例2
本实施例提供一种脂包膜病毒(PRV病毒)的灭活方法。
1、配制缓冲液：分别将13g氯化钠、8g无水乙醇、6.35g盐酸和1.18g Tris-Base加入至注射用水中，充分溶解混匀后定容至100mL，配制成缓冲液，测pH为7.46。
2、从上述缓冲液中取出50mL，加入氯化十六烷基吡啶0.5g，搅拌溶解后从中取出45ml，按溶液与伪狂犬病毒(PRV)的体积比为9∶1的比例向溶液中加入PRV 5mL，混匀后将其置于26℃恒温水浴锅中静置60min，在计时至0min，15min，30min，45min和60min时分别从中取样1mL，用培养基5倍稀释后暂存于2～8℃冰箱。同时以培养基接种ST细胞做阴性对照，以含PRV病毒的培养基接种ST细胞做阳性对照，阴性对照中ST细胞形态与图1一致；阳性对照中PRV病毒已经引起ST细胞病变。
3、按照微量滴定法测定病毒滴度：将各取样点样品进行10倍梯度稀释，取0.1mL接种至ST细胞，每个稀释度接种8孔，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察ST细胞病变情况。按Karber法计算样品中病毒滴度及95％置信区间：以半数细胞感染剂量TCID50表示，log10 TCID50＝L-d(S-0.5)，其中L＝最高稀释度的对数，d＝稀释对数之间的差，S＝阳性孔比率总和。
4、用质量百分浓度为1％的氯化十六烷基吡啶溶液对指示病毒PRV处理前后的滴度变化曲线见图8，处理60min，PRV滴度下降4.23logs。
对比例3
本实施例提供一种脂包膜病毒(VSV病毒)的灭活方法。
1、配制缓冲液：分别将14g氯化钠、10g无水乙醇、0.1g柠檬酸和1.36g二水合柠檬酸钠加入至注射用水中，充分溶解混匀后定容至100mL，配制成缓冲液，测pH为6.53。
2、从上述缓冲液中取出45mL，按溶液与水疱性口炎病毒(VSV)的体积比为9：1的比例向缓冲液中加入VSV 5mL，混匀后从中取样1mL，用培养基3倍稀释后暂存于2～8℃冰箱；在剩余染毒样品中加入氯化十六烷基吡啶0.5g，搅拌溶解后置于20℃恒温水浴锅中静置60min，在计时至0min，15min，30min，45min和60min时分别从中取样1mL，用培养基3倍稀释后暂存于2～8℃冰箱。同时以培养基接种Vero细胞做阴性对照，阴性对照中Vero细胞形态与图2一致。以含VSV病毒的培养基接种ST细胞做阳性对照，阳性对照中VSV病毒已经引起Vero细胞病变。
3、按照微量滴定法测定病毒滴度：将各取样点样品进行10倍梯度稀释，取0.1mL接种至Vero细胞，每个稀释度接种8孔，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72h，在倒置显微镜下观察Vero细胞病变情况。按Karber法计算样品中病毒滴度及95％置信区间：以半数细胞感染剂量TCID50表示，log10TCID50＝L-d(S-0.5)，其中L＝最高稀释度的对数，d＝稀释对数之间的差，S＝阳性孔比率总和。
4、用质量百分浓度为0.5％的氯化十六烷基吡啶溶液对指示病毒VSV处理前后的滴度变化曲线见图10，处理60min，VSV滴度下降3.07logs。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂，其特征在于：所述的病毒灭活剂由氯化十六烷基吡啶和缓冲液混合而成，所述的氯化十六烷基吡啶的投料量为5～15g/L，所述的缓冲液包括100～200g/L的氯化钠，50～150g/L的乙醇，4～10g/L的柠檬酸，7～15g/L的柠檬酸钠盐，余量为注射用水，所述的缓冲液的pH值为4.6～5.0。
2.根据权利要求1所述的用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂，其特征在于：所述的氯化十六烷基吡啶的投料量为8～12g/L。
3.根据权利要求1所述的用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂，其特征在于：所述的缓冲液包括120～160g/L的氯化钠，80～100g/L的乙醇，4～6g/L的柠檬酸，7～10g/L的柠檬酸钠盐，余量为注射用水。
4.根据权利要求1所述的用于灭活脂包膜病毒的病毒灭活剂，其特征在于：所述的缓冲液的pH值为4.6～4.8。
5.一种灭活脂包膜病毒的方法，其特征在于：将待处理样品置于权利要求1～4中任一项所述的病毒灭活剂中，在20℃～30℃条件下静置处理30～60min；
或，将待处理样品置于权利要求1～4中任一项所述的缓冲液中，加入所述的氯化十六烷基吡啶，然后在20℃～30℃条件下静置处理30～60min。
6.根据权利要求5所述的灭活脂包膜病毒的方法，其特征在于：所述的脂包膜病毒为伪狂犬病毒和/或水疱性口炎病毒。
7.根据权利要求5所述的灭活脂包膜病毒的方法，其特征在于：所述的待处理样品为生化药品或生物制品。
8.根据权利要求7所述的灭活脂包膜病毒的方法，其特征在于：所述的方法还包括将所述的病毒灭活剂与指示细胞共培养，培养结束后观察所述的指示细胞的形态是否发生改变的步骤。
9.根据权利要求8所述的灭活脂包膜病毒的方法，其特征在于：所述的指示细胞为ST细胞和/或Vero细胞。
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