TW202039836A - 用於連續製造抗體之病毒失活化方法 - Google Patents

用於連續製造抗體之病毒失活化方法 Download PDF

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Abstract

本揭示文係關於用於失活化病毒的方法。該病毒失活化的方法係用於連續製程製造生物製劑，例如抗體之方法中，且係包括使用管柱分離出析出液，將該析出液同時進行低pH和清潔劑的正交(orthogonal)處理，其中病毒失活化的時間減少了。此外，在純化製程中可將清潔劑加入緩衝系統中，以達到相同的效果。在各處理情況下保留生物製劑。

Description

用於連續製造抗體之病毒失活化方法
本具體實例係關於在連續製造生物產品，尤其是以抗體為基礎的治療產品期間，用於病毒失活化的方法。
主管機關要求製造商證明其生產方法係具有藉由移除及/或失活化可能存在其生物治療產品中的病毒污染來清除感染性病毒的能力。因為簡單、低成本及穩健，所以藉由低pH處理來失活化內生性或外生性的外源套膜病毒為在製造過程中常施用的。低pH病毒失活化典型地係在從蛋白親和捕捉管柱所收集的匯集析出液上進行，且該低pH條件係藉由將弱酸滴定到匯集的析出液來達成。然而，並非所有的抗體在低pH條件下皆為穩定的且可能形成聚集物，因此必須要在較高pH的範圍進行處理。結果使得病毒失活化變得較不穩固且需要較長的處理時間以達到相同的病毒感染活性之對數下降。
除了低pH病毒失活化以外，親和管柱層析、陰離子交換層析和病毒過濾常用作為抗體製造上的病毒移除步驟。陰離子交換層析和病毒過濾二者在移除套膜和非套膜病毒上顯示非常有效。然而，不同於陰離子交換層析和病毒過濾，蛋白A親和力在移除病毒的效用則非常有限。因此，希望撤消蛋白A親和層析作為有效的病毒清除步驟並以一更簡單和更穩健的病毒失活化步驟取代之。
先前清潔劑已在生物製劑的製造過程中用於病毒失活化。於澄清的細胞培養上清液中添加清潔劑通常係用來失活化套膜病毒，然而抗 體對於經由傳統的溶劑或清潔劑之低pH處理為不穩定的。Triton X-100在失活化套膜病毒上已顯示非常有效且穩健。亦應用Triton X-100失活化套膜病毒的一般條件。然而，辛基酚，一種Triton x-100的降解產物，為一可能傷害人類、魚類和其他生物的內分泌干擾物，因此對環境有不利影響。再者，就辛基酚排放的限制範圍為十億分之0.01至0.1(ppb)，其就生物製劑製造商而言將之從生物製程的廢料流中移除，應為非常昂貴。
從分批操作模式轉移到連續製造，以符合生物醫藥產業未來要求，在生物醫藥產業中日益受到關注。若一製程係由整合的(實體上相連的)連續單元操作所組成其間無或僅具有最小容納體積，則其係視為完全的連續製程。目前，除了低pH病毒失活化步驟係以分批法進行之外，幾乎所有的標準抗體製造之單元操作係為連續處理就緒模式。一般而言，蛋白A親和管柱捕捉步驟的析出匯集液係藉由將弱酸滴定至匯集的蛋白A析出液中調整至所欲的pH並留置在容器或袋中歷經60-120分鐘所需的失活化時間。雖然在室溫pH
Figure 108141336-A0202-12-0002-25
3.6的條件下，進行
Figure 108141336-A0202-12-0002-26
30分鐘的培養時間，可達到反轉錄病毒
Figure 108141336-A0202-12-0002-27
5.0個對數降低之有效的低pH病毒失活化(ASTM,2012)，但是並非所有的單株抗體在該低pH條件下皆為非常穩定的且可能形成聚集物。因此，病毒失活化處理必須在較高的pH(例如3.7至3.9)進行。一般而言，較高的pH需要較長的失活化時間，由於抗體聚積而有較高的產物流失，其係代表著在調整連續方法上的挑戰。因此，此挑戰為將分批模式的低pH病毒失活化轉變為連續製程，同時確保流動模式的病毒失活化時間能如同其在分批模式中受到精確控制。
為了接納低pH病毒失活化之典型的滯留時間(1-2hr)和流動的析出液，需要長窄的管線來開發單元操作進行連續低pH病毒失活化。然而，此一單元操作可能產生高反壓及寬廣的滯留時間分布，造成抗體分子接近管壁的滯留時間較長。由於低pH處理之無限長的滯留時間，此舉可能有利於形成抗體聚集物而造成單體大大降低。目前，已提出一種由螺旋模組和90度彎頭所組成、具有狹縮滯留時間之「彈狀流型的螺旋流逆變微反應器」(CFI)來解決這些問題。其所需要的是具有狹縮滯留時間分布進行連 續病毒失活化操作之更精確的處理系統。此等和其他問題已藉由本發明具體實例得到解決。
具體實例係包括用於連續製造生物製劑中病毒失活化的方法。此等方法包括使用管柱將帶有生物製劑和活性病毒的析出液分離出，將帶有活性病毒的析出液同時進行低pH和非離子清潔劑的正交處理使病毒失活化，其中相較於個別使用低pH或非離子清潔劑的析出液處理時間，析出液之病毒失活化的時間減少了且保留生物製劑。
熟習技術者將了解下述之圖式僅用於說明之目的。這些圖式並無意欲在任何方面限制本案教示或申請專利範圍。
圖1係顯示以 (A) mAb1蛋白A析出液樣本於pH 7.01和 (B) mAb2蛋白A析出液樣本於pH 7.01藉由各種濃度的Mega-10於16℃之X-MuLV失活化的動力學。將X-MuLV摻入含有各種濃度Mega-10之中和抗體蛋白A析出液中。充分混合後，將混合物以設定在16℃的水浴培養並在所示的時間移出一等份的樣本藉由TCID50分析評估病毒失活化動力學。
圖2係顯示在一mAb1蛋白A析出液樣本中於16℃培養後，以低pH和Mega-10雙處理對於降低X-MuLV感染活性之協同效應。以(
Figure 108141336-A0202-12-0003-28
)表示之直線係顯示在以0.10%的Mega-10培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及Log10減少因子(LRF)；(
Figure 108141336-A0202-12-0003-31
)直線係顯示mAb1蛋白A析出液樣本於pH3.91培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及LRF；(
Figure 108141336-A0202-12-0003-32
)直線係顯示mAb1蛋白A析出液樣本於pH3.91和0.10%的Mega-10存在下培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及LRF。
圖3係顯示在一mAb2蛋白A析出液樣本中於16℃培養後，以低pH和Mega-10雙重處理對於降低X-MuLV感染活性之協同效應。以(
Figure 108141336-A0202-12-0003-33
)表示之直線係顯示以0.15%的Mega-10培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及LRF；以(
Figure 108141336-A0202-12-0003-34
)表示之直線係顯示mAb2蛋白A析 出液樣本於pH 4.05培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及LRF；以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-35
)表示之直線係顯示mAb2蛋白A析出液樣本於pH4.05和0.15%的Mega-10存在下培養30分鐘期間所達到的X-MuLV失活化動力學及LRF。
圖4係顯示在一mAb1蛋白A析出液樣本中，以低pH和Mega-10雙重處理對於偵測極限量以下之降低失活化X-MuLV所需時間的協同效應。 (A )於18℃和pH 3.91在一mAb1蛋白A析出液樣本中培養240分鐘期間以低pH處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-38
)和(
Figure 108141336-A0202-12-0004-37
)表示之直線為雙重複進行的實驗。( B )於16℃和pH 3.91在一mAb1蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間藉由雙重處理之X-MuLV失活化動力學和剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-39
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價，以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-41
)表示之直線係顯示於pH 3.91在一mAb1蛋白A析出液樣本中以0.1%的Mega-10培養30分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-42
)表示之直線係顯示於pH 3.91在一mAb1蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-92
)表示之直線係顯示於pH 3.91及0.1%的Mega-10的存在下在一mAb1蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。 (C) 於18℃和pH 4.0在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養240分鐘期間以低pH處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。 (D) 於16℃和pH 4.05在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間以雙重處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-43
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價，以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-44
)表示之直線係顯示以0.15%的Mega-10培養30分鐘期間X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-45
)表示之直線係顯示於pH 4.05在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0004-46
)表示之直線係顯示於pH4.05及0.15%的Mega-10的存在下在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。
圖5係顯示在一mAb2蛋白A析出液樣本中，以低pH和Tween 80雙重處理對於偵測極限量以下之降低失活化X-MuLV所需時間的協同效應。 (A )於18℃和pH 4.0在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養240分鐘期間以低pH處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。( B )於16℃和pH 4.0在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間以雙重處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-47
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-48
)表示之直線係顯示以0.5%的Tween 80培養30分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-49
)表示之直線係顯示於pH 4.0在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-50
)表示之直線係顯示於pH 4.0及0.5%的Tween 80的存在下在一mAb2蛋白A析出液樣本中培養30分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。
圖6係顯示在一mAb3蛋白A析出液樣本中，以低pH和Tween 80或Tween 20雙重處理對於偵測極限量以下之降低失活化X-MuLV所需時間的協同效應。 (A )於16℃和pH3.97在一mAb3蛋白A析出液樣本中在培養240分鐘期間以低pH處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。( B )於16℃和pH3.97在一mAb3蛋白A析出液樣本中在培養60分鐘期間以低pH和Tween 80雙重處理之X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-51
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-52
)表示之直線係顯示以0.5%的Tween 80培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-53
)表示之直線係顯示於pH3.97在一mAb3蛋白A析出液樣本中培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-93
)表示之直線係顯示於pH3.97及0.5%的Tween 80的存在下在一mAb3蛋白A析出液樣本中培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。 (C) 於16℃和pH3.97在一mAb3蛋白A析出液樣本中培養60分鐘期間以低pH和Tween 20雙重處理的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-54
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價，以(
Figure 108141336-A0202-12-0005-55
)表示之直線係顯示以0.5%的Tween 20培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-56
)表示之直線係顯示於pH3.97在一mAb3蛋白A析出液樣本中培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-57
)表示之直線係顯示於pH3.97及0.5%的Tween 20的存在下在一mAb3蛋白A析出液樣本中培養60分鐘期間的X-MuLV失活化動力學及剩餘的病毒感染活性。
圖7係顯示在一mAb3蛋白A析出液樣本中各種濃度的Tween 80和各種pH值對於偵測極限量以下降低失活化X-MuLV所需時間之雙重處理的效應。 (A )於16℃和pH3.99在一mAb3蛋白A析出液樣本中以0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的Tween 80處理之X-MuLV失活化動力學。以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-58
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-59
)表示之直線係顯示在一pH 3.99含有0.1%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-60
)表示之直線係顯示在一pH 3.99含有0.2%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-61
)表示之直線係顯示在一pH 3.99含有0.3%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-62
)表示之直線係顯示在一pH 3.99含有0.5%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學。( B )於16℃和pH 4.00、3.90、3.80和3.70在一mAb3蛋白A析出液樣本中以0.1%的Tween 80處理的X-MuLV失活化動力學。以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-63
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-64
)表示之直線係顯示在一pH 4.00含有0.1%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-65
)表示之直線係顯示在一pH 3.90含有0.1%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-66
)表示之直線係顯示在一pH 3.80含有0.1%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0006-67
)表示之直線係顯示在一pH 3.70含有0.1%的Tween 80之mAb3蛋白A析出液樣本中培養10分鐘期間的X-MuLV失活化動力學。
圖8係顯示同時以低pH和清潔劑處理，藉由低pH即使在高如4.30的pH值下可減少使X-MuLV完全失活化所需要的時間。(A)於18℃和pH 4.11在一mAb4蛋白A析出液樣本中以1%的Tween 80處理之X-MuLV失活化動力學。以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-68
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-69
)表示之直線係顯示在一pH 4.11含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-70
)表示之直線係顯示於pH 4.11在一mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-71
)表示之直線係顯示在一pH 77.0含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；(B)於18℃和pH 4.20在一mAb4蛋白A析出液樣本中以1%的Tween 80處理之X-MuLV失活化動力學。以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-72
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-73
)表示之直線係顯示在一pH 4.20含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-74
)表示之直線係顯示於pH 4.20在一mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-75
)表示之直線係顯示在一pH 7.0含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；(C)於18℃和pH 4.30在一mAb4蛋白A析出液樣本中以1%的Tween 80處理之X-MuLV失活化動力學。以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-76
)表示之直線係顯示陽性對照組的安定性和效價；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-77
)表示之直線係顯示在一pH 4.300含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-78
)表示之直線係顯示於pH 4.30在一mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學；以(
Figure 108141336-A0202-12-0007-79
)表示之直線係顯示在一pH 7.0含有1%的Tween 80之mAb4蛋白A析出液樣本中的X-MuLV失活化動力學。
本揭示文係提供與病毒失活化有關的方法和組成物。
定義
就解釋本說明書之目的，將提供下列定義。當下列所述的任何定義與其在任何其他文件(包括文中以引用的方式併入之任何文件)的語詞中之用法產生衝突的情況下，除非有明確指出相反意義，否則就解釋本 說明書及其相關申請專利範圍之目的，應以下述之定義為準(例如在原先使用此術語的文件中)。
在任何適當的情況下，以單數使用的術語亦應包括多數且反之亦然。除非另有陳述或明確的指出「一或多」為不適當的，否則文中所使用的「一」係指「一或多」。除非另有陳述否則所使用的「或」係指「及/或」。所使用的「包括」和「包含」可交換使用且不受限。術語「如」、「舉例而言」和「例如」亦不希望受限。例如，術語「包括」應指「包括，但不限於」。
如文中所用，術語「大約」係指所提供之單位數值的+/- 10%。
如文中所用，術語「實質上」係指展現一總計或大約程度的感興趣特性或性質之質性狀況。生物技術之一般技術者應能了解，因影響生物和化學組成物和材料之試驗、製造和儲存的許多變數，以及因用於生物和化學組成物和材料之試驗、製造和儲存的儀器和設備之固有誤差，生物和化學現象鮮少達到或避免一絕對結果。術語「實質上」因此在文中係用於捕捉在生物和化學現象中可能缺乏的固有完整性。
如文中所用，術語「正交」(orthogonal)係指運用不同的機制來移除/失活化病毒之個別可識別步驟或方法。因為此項係關於製程開發，請了解一般其係指多步驟純化製程應運用彼此相互不同的分離機制；各步驟係代表笛卡爾座標空間中的一個軸。應用陰離子交換和疏水交互作用層析(HIC)之二步驟方法應理解為正交的。
1980年代以來，清潔劑已在從捐血者所收取的匯集血液中用作為失活化病毒的必要工具。此程序對於接受血液、血漿或血液/血漿衍生組份，例如血漿衍生因子VIII(pdFVIII)的病患之安全性為重要的。此外，此純化措施增加了在臨床實驗室或血漿衍生生物產品(PDBP)之製造設施中直接涉及處理血液之人員的安全性。新近，此作法亦已變成使用動物衍生物質之生物治療劑或疫苗的生物醫藥製造過程中所不可或缺。動物衍生物質(亦即血液、血漿、組織)和哺乳動物細胞中所製造的蛋白可能帶有內生性病毒或可能容易經外源病毒污染。因此，藥物製造過程包括一系列的有效病毒失活化(亦即溶劑-潔劑、低pH和熱處理)及移除技術(亦即病毒過濾)以 確保病患接受到無病毒的生物治療產品。這些程序對於生物性-衍生治療劑或疫苗產品的安全性至關重要。極需要用於增加這些產品的功效、穩定性和最重要地整體安全性之新穎方法。
清潔劑類型
清潔劑為由親水性(極性)頭端基團和疏水性(非極性)尾端基團所組成之兩親分子。此共通的結構使清潔劑得以與其他分子相互作用，最值得注意地為水溶液中的蛋白或套膜病毒。在基礎科學和應用技術中，清潔劑可用作為增溶劑或作為安定劑，防止生物分子聚集或使膜蛋白從細胞培養或組織懸浮液中溶解出。當用於溶解蛋白時，下列性質使得特定清潔劑比其他清潔劑更適用：1)缺少電荷的清潔劑(非離子清潔劑)幫助保留感興趣蛋白之結構和活性；2)低臨界微胞濃度(CMC)的清潔劑能經由透析容易地移除此清潔劑；3)澄清且因而不會影響蛋白吸光度讀數的清潔劑；及4)高純度、降低實驗間之變異的清潔劑。同樣地，當在選擇病毒失活化之候選清潔劑時，大部分這些性質亦適用，因為清潔劑必須不能擾亂蛋白藥物，在無清潔劑干擾下偵測蛋白濃度，以及確保該清潔劑為高純度使病毒失活化一致地進行。
一般而言，套膜病毒失活化係依賴特定清潔的兩親結構和臨界微胞濃度(CMC)。CMC係指清潔劑單體聚集而形成微胞結構時之濃度。在水性溶液中，因有更多的清潔劑單體交流，所以親水性頭端可鄰接而遮擋疏水性尾端與水溶液接觸，最後組成微胞結構。CMC可能與特定清潔劑在特定條件下發生病毒失活化之濃度相關聯。病毒失活化的理論機制為該等單體在低於清潔劑CMC下插入病毒套膜中，其可能對病毒有害。只要濃度達到或高於CMC，此清潔劑單體則出現在膜中形成微胞，其可破壞病毒套膜的完整性或完全剝除病毒套膜。無此病毒套膜，該病毒則無法與其宿主細胞之細胞膜上的受體結合來促使其複製和散播。
至今，生物治療劑製造業已使用一些清潔劑進行失活化套膜病毒。一普及的非離子清潔劑Triton X-100在無破壞蛋白藥物下，已有效的失活化套膜病毒。在生物醫藥製造程序中使用Triton X-100後，其係棄置於廢水處理廠或直接釋入水生環境中(Madsen et al,1996,JAOCS,73：929-933)。 不幸地，Triton X-100副產物含有辛基酚，已被許多國家視作環境有毒化合物。許多生物醫藥業者因此致力於研發具有相當於Triton X-100效用對環境更安全的清潔劑。例如，某些公司分別已研發出月桂基二甲基胺N-氧化物(LDAO)和烷基糖苷(Conley等人，2014，美國專利#W02014025771A2；Conley等人，2016,Biotechnol.Bioeng.,印刷版前的先行電子版(Epub ahead of print)；Fisher等人，2016，美國專利#20160333046A1)。當這些公司已能區別不同種類的新清潔劑時，本具體實例定義了一用於套膜病毒失活化的完全新穎及高效的非離子清潔劑類別。
以糖為基礎的清潔劑具有優良的物理性質，為高度生物可降解且無毒，造就其安全性樣貌，尤其是對於水生環境(Bogdan,2007,Stalmans et al.,1993)。因此，所揭示的具體實例係聚焦在使用以糖為基礎的清潔劑N-甲基葡糖醯胺，做為生物活性藥物製造上失活化病毒之新方法。N-甲基葡糖醯胺為由高親水性葡萄糖基團和疏水性脂肪酸鏈連結一醯胺鍵所組成的非離子清潔劑。這些清潔劑為環境友善的，因為其已知為帶有約95%可再生碳指數之高度生物可降解且被認為，尤其是對水生生物為無毒的(Stalmans et al.,1993,SOFW,119：794-808)。
Mega-10為一種由高親水性葡萄糖基團和疏水性脂肪酸鏈連結醯胺鍵所組成的以糖為基礎之非離子清潔劑，使其為帶有約95%可再生碳指數之高度生物可降解且對水生環境為無毒性(Burczyk,B.,Wilk,K.A.,Sokolowski,A.,and Syper,L.,2001)(Foley,P.,Pour,A.K.,Beach,E.S.,and Zimmerman,J.B.,2012)。再者，首次觀察到在清潔劑，例如Mega-10或Tween 80或Tween 20的存在下，低pH的雙重處理可能對於降低病毒感染活性和有效失活化反轉錄病毒所需的時間，具有協同效應。這些病毒失活化的雙重機制可能可用於以連續處理製造單株抗體之病毒失活化中。
病毒、蛋白和清潔劑
用於評估病毒失活化的模型套膜病毒為購自BioReliance(Rockvile,MD)之異嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV)。選擇X-MuLV作為用於低pH和清潔劑失活化研究之特定模型病毒，因為其類似常在哺乳動物培養生產中發現的內生性類反轉錄病毒顆粒(ERLP)。
在淨化其個別的細胞培養後，收集模型蛋白mAb1(IgG1)的樣本、mAb2(IgG1)的樣本和mAb3(IgG2)的樣本作為蛋白A親和管柱層析之析出匯集液。這些mAb的等電點(pI)值分別為8.9、7.1和7.7。
N-甲基葡糖醯胺(Mega-10)、Tween 20和Tween 80係購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。藉由將0.5克的Mega-10粉末溶於10mL的Milli-Q水，製備5%的Mega-10儲存液(w/v)。以Milli-Q水製備5%濃度(w/v)的Tween 20或Tween 80清潔劑之儲存液。
病毒失活化實驗
清潔劑之病毒失活化
以1M Tris緩衝液將各蛋白A析出液的pH調整至7.0。然後經由一0.22um過濾器將調整過pH的析出液過濾。將不同體積Mega-10、Tween 20或Tween 80的5%儲存液加到過濾過的中和蛋白A析出液。此舉係用來製備含有不同濃度之各清潔劑的蛋白A析出液。然後將X-MuLV以1：20比率加到在摻入病毒前已於16℃水浴預培養、含有不同濃度之各清潔劑的中和蛋白A析出液中。充分混合後，立即移出一等份的樣本並就Mega-10以1：12的稀釋劑(含有3μg/mL聚凝胺的McCoy培養基)，就Tween 20和Tween 80為1：100的稀釋劑中止反應，停止失活化，並將該樣本指定為時間起算點(time-zero)的樣本。將剩餘摻入病毒的析出液放回水浴並於指定的時間點收集樣本，評估病毒失活化動力學。
低pH之病毒失活化
以1M乙酸將mAb1、mAb2和mAb3蛋白A析出液的pH調整至3.91、4.05或3.97。然後以0.22um過濾器將調整過pH的析出液過濾。將過濾過的蛋白A析出液以16℃水浴預培養，之後以1：20比率摻入X-MuLV。充分混合後，立即移出一等份的樣本並以1M Tris緩衝液中和，停止失活化反應，及指定為時間起算點的樣本。將剩餘摻入病毒的析出液放回水浴並於指定的時間點收集樣本，評估病毒失活化動力學。
低pH和清潔劑之雙重病毒失活化
以1M乙酸將mAb1、mAb2和mAb3蛋白A析出液的pH調整至3.91、4.05或3.97。然後以0.22um過濾器將調整過pH的析出液過濾。 然後將不同體積的5%清潔劑儲存液加到過濾過的蛋白A析出液。將含有Mega-10、Tween 80或Tween 20的低pH蛋白A析出液以16℃水浴預培養，之後以1：20比率摻入X-MuLV。充分混合後，立即移出一等份的樣本並以1M Tris緩衝液中和，停止低pH失活化反應，然後就Mega-10以1：12的稀釋劑，就Tween 20和Tween 80為1：100的稀釋劑立即中止反應，停止清潔劑的病毒失活化。將收集的樣本指定為時間起算點的參照物。將剩餘摻入病毒的析出液放回水浴並於指定的時間點收集樣本，評估病毒失活化動力學。
以X-MuLV細胞-為基礎的感染活性分析
樣本失活化處理後的剩餘X-MuLV感染活性係藉由TCID50分析來測定，其為定量50%的接種組織培養細胞中產生細胞病變作用所需的病毒量之終點稀釋分析。使用Spearman-Karber法估算病毒效價並以帶有計算的95%信賴區間(CI)之TCID50/mL提出報告。簡言之，在開始病毒失活化實驗的前一天，準備帶有PG-4細胞之足量的96-孔盤(feline S+L-,ATCC#CRL-2032)並於37℃濕化的CO2孵育器中培養至隔夜。以稀釋板塊製備10個一組3.2倍稀釋的稀釋陽性對照組(1：100)和病毒失活化樣本。將各11個連續稀釋的樣本組比照地接種至已預先植入PG-4細胞之96-孔盤的前11列孔槽(每孔100μL)。在相同測定盤的第12列接種對應的稀釋劑，作為無病毒的陰性對照組。藉由以1：20的比率將X-MuLV摻入過濾過的中和蛋白A析出液中，製備陽性對照組。將後將已接種的測定盤於37℃濕化的CO2孵育器中培養大約2小時。在培養終了時，將100uL之量的2X分析培養基(92% McCoy’s 5A培養基，4% FBS，2%青黴素/鏈黴素，2% L-麩醯胺酸)加到測定盤的各孔槽中。然後將測定盤放回到相同的孵育器中，並持續培養6天。於顯微鏡下就出現的細胞病變作用(CPE)對測定盤的各孔槽進行評分並將結果記錄在計分單上。然後使用Spearman-Karber法估算病毒效價並以帶有計算的95%信賴區間(CI)之TCID50/mL提出報告。
在mAb之蛋白A析出液中Mega-10的X-MuLV失活化穩健性
為了評估mAb1之蛋白A析出液中Mega-10的X-MuLV失活化穩健性，係將X-MuLV以1：20比率摻入含有0.1%、0.2%和0.3%的 Mega-10之中和mAb1蛋白A析出液中。充分混合後，在16℃培養後的0、2.5、5、10和30分鐘移出一等份的樣本。以TCID50分析測定在所收集樣本中的剩餘病毒效價。TCID50分析的結果顯示，在2.5分鐘的處理後，0.2%和0.3%濃度的Mega-10使X-MuLV快速失活化至低於偵測極限的程度(圖1A)並分別達到
Figure 108141336-A0202-12-0013-80
5.58±0.19和
Figure 108141336-A0202-12-0013-81
5.58±0.19的LRF值(表1A)。
Figure 108141336-A0202-12-0013-1
亦於第二mAb產品mAb2樣本的蛋白A析出液上評估Mega-10清潔劑失活化病毒的效用。當以含有0.1%、0.15%、0.2%和0.3%的Mega-10之中和mAb2蛋白A析出液培養X-MuLV時，觀察到類似的病毒失活化效應(圖1B)。在處理2.5分鐘之後，0.3%濃度的Mega-10顯示快速使X-MuLV失活化至偵測極限以下的程度並達到
Figure 108141336-A0202-12-0013-82
5.81±0.18的LRF值 (表1B)。在2.5分鐘處理之後，0.2% Mega-10亦達到5.31±0.75之LRF的顯著病毒失活化(表1B)。
Figure 108141336-A0202-12-0014-2
低pH和Mega-10雙處理對於減低X-MuLV感染活性之協同效應
以清潔劑失活化套膜病毒所運用的機制係歸因於清潔劑與套膜病毒之脂質膜的交互作用。此交互作用破壞了膜並造成病毒殼蛋白的解體，使其轉而讓套膜病毒無法與細胞結合，導致喪失病毒感染活性(Pamphilon,2000)(Kempf,C.,Stucki,M.,and Boschetti,N.,2007)。另一方面，低pH-媒介的病毒失活化感信係經由另外的機制來作用。低pH環境引發病毒形態改變，導致病毒顆粒聚集，為牽涉低pH病毒失活化之機制(Gaudin,Y.,Ruigrok,R.,Knossow,M.,and Flamand,A.,1993)。
因為清潔劑和低pH失活化套膜病毒的潛藏機制很不同，所以並非直覺或明確的將這些處理共同組合。
X-MuLV的失活化係於低pH和清潔劑-媒介的病毒失活化之局部最適化(sub-optimal)條件下進行。神奇地，當以pH 3.91含有0.1% Mega-10的mAb1蛋白A析出液樣本培養X-MuLV時，觀察到對於降低X-MuLV感染活性的協同效應(圖2和表2)。培養2.5分鐘後，0.1%的Mega-10樣本顯示對X-MuLV失活化無效用並產生的0.33±0.29的LRF。在相同的培養時間之後，單獨在pH 3.91處理產生2.60±0.33之LRF的中度病毒感染活性降低。令人驚訝的，在相同的培養時間之後，0.1%Mega-10和pH 3.9的雙處理有效地失活化X-MuLV至偵測極限以下的程度並產生
Figure 108141336-A0202-12-0015-83
5.40±0.21的LRF。當在含有0.15%的Mega-10、pH 4.05的mAb2蛋白A析出液樣本上進行X-MuLV失活化時，亦觀察到類似的效應(圖3和表3)。
Figure 108141336-A0202-12-0015-3
Figure 108141336-A0202-12-0015-4
Figure 108141336-A0202-12-0016-5
培養5分鐘之後，僅含0.15%的Mega-10產生1.68±0.31的LRF而單獨以pH 4.05處理產生0.61±0.18的LRF。然而，0.15%的Mega-10和pH 4.05的雙處理產生5.50±0.83的LRF，其遠大於其個別功效的總和。因此，可總結出於低pH在清潔劑的存在下處理蛋白A析出液，由於雙重的病毒失活化之正交機制，所以對於降低套膜病毒的感染活性具有協同效應。
低pH和清劑雙重處理對於降低失活化X-MuLV至偵測極限以下程度所需時間之協同效應
除了低pH和Mega-10雙重處理對於降低X-MuLV感染活性的協同效應之外，吾等亦觀察到同時的低pH和Mega-10處理對於降低失活化X-MuLV至偵測極限以下程度或完全失活化X-MuLV所需處理時間之協同效應。如圖4A中所示，當於pH 3.91和18℃培養mAb1蛋白A析出液時，花費240分鐘失活化X-MuLV至偵測極限以下程度(圖4A)。驚人地，於pH 3.91在另外0.1%的Mega-10的存在下以16℃的溫度培養相同的蛋白A析出液，則僅花費2.5分鐘失活化X-MuLV至偵測極限以下程度(圖4B)。同樣地，在含有0.15% Mega-10的mAb2蛋白A析出液之不同mAb樣本中，於pH 4.05和16℃的溫度亦能將失活化X-MuLV至偵測極限以下程度所需的時間從低pH(pH 4.0)和較高溫度(18℃)的120分鐘培養時間(圖4C)降低至僅10分鐘(圖4D)。
吾等進一步研究該所觀察到的病毒失活化雙處理之協同效應是否僅限於Mega-10清潔劑。就低pH於其他非離子清潔劑，例如Tween 80或Tween 20的存在下對失活化X-MuLV進行實驗。X-MuLV的雙處理對於含有0.5% Tween 80於pH 4.05和16℃溫度之mAb2蛋白A析出液亦能將失活化X-MuLV至偵測極限以下程度所需的時間，從pH(pH 4.0)和較高溫度(18℃)的120分鐘培養時間(圖5A)降低至10分鐘(圖5B)。當在含有0.5%Tween 80(圖6B)或0.5%Tween 20(圖6C)於pH 3.97之不同亞型的mAb3(IgG2) 蛋白A析出液進行雙重病毒失活化時，亦觀察到類似的協同效應。在任一案例中，失活化X-MuLV至偵測極限以下程度所需的培養時間從單獨以低pH處理的120分鐘(圖6A)下降至5分鐘(圖6B和6C)。
吾等進一步驗證添加0.2%最少濃度的Tween 80於pH 3.99的蛋白A析出液中足以將所需要的失活化時間從120分鐘降至5分鐘，而當Tween 80的濃度增加至0.3%或0.5%時並未觀察到進一步的時間減少(圖7A)。在另一方面，當含有0.1% Tween 80的mAb3蛋白A析出液之pH從4.0降至3.9、3.8及3.7時，X-MuLV失活化所需的時間從10分鐘分別降至2.5分鐘、1分鐘及0分鐘(圖7B)。因此，當清潔劑的濃度增加及蛋白A析出液的pH值降低時，同時雙處理失活化X-MuLV所需的時間下降。此外，雙處理所需要的Tween 80最小有效濃度為pH依賴的，pH值越低所需要的最小有效濃度越低。
吾等亦驗證了低pH和清潔劑的同時處理，藉由低pH即使在高如4.30的pH值可降低完全失活化X-MuLV所需要的時間。pH 4.11、4.20或4.30、含有1% Tween 80的mAb4蛋白A析出液，分別在處理1、3或4小時後，能完全失活化X-MuLV，使其對於含有1% Tween 80低於4.30之pH值，或對於含有Tween 20或Triton X-100高如pH 4.50的蛋白A析出液pH值在無需進行任何pH調整下，而能進行抗體製造的低pH病毒失活化步驟。目前，低pH病毒失活化係在pH 3.70至3.90下經由調整通常具有4.10至4.50之pH值的蛋白A析出液pH來進行。因此，在無需調整蛋白A析出液pH下進行低pH病毒失活化可使得抗體純化程序更快速及更有效率(圖8)。
如所論述的，本具體實例驗證了環保清潔劑Mega-10可以低濃度在單株抗體的中和蛋白A析出液上有效地失活化模型套膜病毒X-MuLV。因此，以Mega-10的套膜病毒之清潔劑病毒失活化可在低pH病毒失活化之後併入單株抗體製程中作為穩健的病毒失活化步驟。為了在一pH 6.0-8.0、澄清、無細胞的mAb或IgG Fc融合蛋白之中間物上達到
Figure 108141336-A0202-12-0017-84
4.0的LRF反轉錄病毒失活化，需要在15-25℃的溫度Triton X-100濃度
Figure 108141336-A0202-12-0017-85
0.5%及持續時間
Figure 108141336-A0202-12-0017-86
60分鐘，但以Mega-10，在單株抗體的中和蛋白A析出液上(pH 7.0)以0.2%的濃度於16℃持續30分鐘後，可達到
Figure 108141336-A0202-12-0018-87
5.81的LRF之病毒失活化。因此，Mega-10可作為Triton X-100之可行的替代物，供用作為單株抗體製造的病毒失活化清潔劑，因為Mega-10在反轉錄病毒的失活化上比Triton X-10更有效且為高生物可降解，對水生環境無毒性。
吾等亦首次觀察到低pH和清潔劑，例如Mega-10或Tween 80或Tween 20之同時雙處理對於降低病毒感染活性和有效失活化反轉錄病毒所需的時間可具有協同效應。例如，以0.1%的Mega-10存在樣本的中和蛋白A析出液或以pH 3.91的蛋白A析出液，2.5分鐘的X-MuLV處理分別產生0.33±0.29和2.50±0.33的LRF。以存在pH 3.91蛋白A析出液中0.1% Mega-10之X-MuLV雙處理(同時低pH和清潔劑處理)歷時2.5分鐘，有效地失活化X-MuLV至偵測極限以下的程度並產生
Figure 108141336-A0202-12-0018-88
5.40±0.21的LRF。當在pH 4.05、含有0.15% Mega-10的樣本蛋白A析出液中進行失活化X-MuLV時，亦觀察到類似效應。當用存在0.15% Mega-10的中和蛋白A析出液或用pH 4.05的蛋白A析出液時，5分鐘的X-MuLV處理分別產生的1.68±0.31和0.61±0.18的LRF。以存在pH4.05蛋白A析出液中0.15% Mega-10之X-MuLV雙處理(同時低pH和清潔劑處理)產生5.50±0.83的LRF，其遠大於其個別效用的總和。由Mega-10和低pH雙處理所觀察到的協同效應係歸因於利用清潔劑或低pH處理失活化套膜病毒的不同機制。再者，清潔劑和低pH處理的同時雙處理不僅對於降低病毒感染活性具有協同效應，亦對於降低失活化套膜病毒所需的時間具有協同效應。吾等觀察到，在清潔劑，例如Mega-10或Tween-80或Tween 20的存在下，低pH蛋白A析出液的雙處理可將失活化X-MuLV至偵測極限以下程度所需之時間從以低pH單獨處理的1-2小時降低至以雙重處理的2.5-10分鐘。低pH和清潔劑同時處理的協同效應，在降低達到LRF
Figure 108141336-A0202-12-0018-89
5.0所需的時間上，從在pH
Figure 108141336-A0202-12-0018-90
3.90於16℃低pH處理的
Figure 108141336-A0202-12-0018-91
120分鐘降低至10分鐘以下，其在經由連續處理之單株抗體製造期間於反轉錄病毒失活化上將具有潛在效用。
因為其成本低、資本投資較低、更具靈活性、更能控制製程、更容易擴大規模及產品品質較佳，所以連續處理在生物醫藥公司間更常見。對於生物醫藥業從分批操作模式轉移到連續製造以符合生物醫藥業的未來 需要，日益受到關注。生物醫藥的市場，尤其是以抗體為基礎的生物治療產品在最近十年間變化極大，因為超過20種第一代暢銷生物製劑的專利即將到期。因此，對於可靈活切換生產作業用於穩定或不穩定、不同量的不同生物治療產品之具成本效益的製造方法，有其需求。若一製程係由整合的(實體上相連的)連續單元操作所組成其間無或僅具有最小容納體積，則其係視為完全的連續製程。目前，除了低pH病毒失活化步驟係以分批法進行之外，幾乎所有的標準單株抗體製造之單元操作係以連續處理就緒模式。一般而言，蛋白A親和管柱捕捉步驟的析出匯集液係經調整至所欲的pH並依照製程參數留置在一容器或一袋中歷經60-120分鐘所需的失活化時間。一般而言，pH越高需要的失活化時間越長，且由於抗體聚積而有較高的產物流失。此項代表著在調整連續製程上的挑戰。當將目前分批製程的低pH病毒失活化轉變為連續製程時，一重要的考量為確保流動模式的病毒失活化時間能如同其在分批模式中般精確和受控制。為了遷就此低pH病毒失活化之典型的滯留時間(1-2hr)和蛋白A連續層析析出液的流速(50-300L/hr)以及大量的析出匯集液，需要一非常長窄的管線來開發一單元操作進行連續低pH病毒失活化。然而，應注意，此單元操作可能產生高反壓及寬廣的滯留時間分布，造成單體大大減少而形成抗體聚集物。目前，已提出一種由螺旋模組和90度彎頭所組成、具有狹縮滯留時間之「彈狀流型的螺旋流逆變微反應器」(CFI)來解決這些問題(Klutz,S.,Lobedann,M.,Bramsiepe,C.,and Schembecker,G.,2016)且目前係處於概念驗證階段。
本具體實體藉由以低pH和清潔劑的同時雙處理取代現有的處理製程用以縮短病毒失活化所需時間，解決了從目前批式製程轉變成連續製程中與低pH病毒失活化有關的技術挑戰。本具體實體和發現顯著地及意外地驗證了低pH蛋白A析出液添加低濃度清潔劑，例如Mega-10或Tween-80或Tween 20的同時雙處理，可將失活化反轉錄病毒所需的時間從以低pH處理的60-120分鐘降低至2.5-10分鐘。因此，將低pH和清潔劑的同時雙處理併入連續單株抗體製程中可大大地減少低pH病毒失活化所需的時間，因此不需要長窄管線或CFI來容納延長的低pH病毒失活化所需之時間。此項可對在低pH條件和長滯留時間下不穩定的抗體提供改善的製造結果和 產率。再者，在連續製程中併入低pH和清潔劑的同時雙處理將具有成本效益並幫助免去設計和使用昂貴的CFI縮小規模模型之需求。

Claims (16)

  1. 一種用於連續製程製造生物製劑之病毒失活化方法，係包括：
    (a)使用管柱分離出帶有生物製劑和活性病毒的析出液；
    (b)將帶有該活性病毒的該析出液同時進行低pH和Mega-10非離子清潔劑之正交處理，用以失活化該病毒；
    其中相較於使用低pH或Mega-10非離子清潔劑分開處理析出液的時間，該析出液之病毒失活化時間減少了並保留了生物製劑。
  2. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該pH係從3.0至4.0。
  3. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該管柱係包括親和管柱。
  4. 如請求項3中所述之病毒失活化方法，其中該親和管柱係包括蛋白A管柱。
  5. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該生物製劑係包括蛋白。
  6. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該生物製劑係包括抗體。
  7. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該生物製劑係包括抗體片段。
  8. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該析出液係包括1至100mg/mL(w/v)的生物製劑。
  9. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該病毒係包括由下列組成之群的科別中選出的套膜病毒：反轉錄病毒科(Retroviridae)、黄病毒科(Flaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridea)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)、 皰疹病毒科(Herpesviridae)、桿狀病毒科(Baculoviridae)和痘病毒科(Poxviridae)。
  10. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該病毒失活化時間係從60-120分鐘降至3-4分鐘。
  11. 如請求項9中所述之病毒失活化方法，其中該反轉錄病毒係包括X-MuLV。
  12. 如請求項9中所述之病毒失活化方法，其中該皰疹病毒科係包括豬偽狂犬病病毒(PRV)。
  13. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該Mega-10非離子清潔劑濃度係在0.05-1%(w/v)的範圍內。
  14. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該病毒失活化方法係在2-30℃的溫度範圍內進行。
  15. 如請求項1中所述之病毒失活化方法，其中該析出液進一步係包括Tween 80、Tween 20或Triton X-100清潔劑。
  16. 如請求項15中所述之病毒失活化方法，其中該析出液的pH為4.5。
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