CN115491340A - 用于灭活病毒以及其他外源性因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用高温瞬时(HTST)处理的病毒灭活方法，并且调整多个参数以使沉淀物产生和沉积减少和/或最小化。

Description

用于灭活病毒以及其他外源性因子的方法
本申请是中国专利申请201380031879.X的分案申请，原申请的申请日是2013年6月20日，发明名称是“用于灭活病毒以及其他外源性因子的方法”。
相关申请的交互引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号13/844,051和2012年6月20日提交的美国临时专利申请号61/662,349的优先权，将所述专利以其整体并入本文作为参考。
技术领域
本发明提供了使用高温瞬时(HTST)处理以及调整多种参数以使沉淀物的产生和沉积减少和/或最小化的病毒灭活方法。
背景技术
病毒在药物生产工艺中是潜在的污染物，特别是在生物药物来源于哺乳动物细胞培养物的情况下。病毒污染物的来源可以是用于细胞培养的培养基或者产生目的生物制品的细胞系。目前在生产工艺期间防止病毒污染生物药物的方法包括用于灭活病毒的高温瞬时(HTST)细胞培养基处理，所述病毒可能通过原材料引入到细胞培养基中并在培养过程中扩增(Schleh,M.等人2009.Biotechnol.Prog.25(3):854-860和Kiss,R.2011.PDA J PharmSci and Tech.65:715-729)。已经报道，对于HTST所需的约85℃以上的温度是有效的病毒灭活方法，其中对于灭活细小病毒，需要约95℃以上的温度，所述细小病毒是已记录的在细胞培养过程中存在的常见细胞培养病毒污染，并且其抗许多化学和物理灭活剂(inactivating agent)(Schleh等人)。
尽管在病毒的灭活中已经证实HTST处理是高度有效的，但当进行该处理时，在多种细胞培养基中会产生沉淀或生成沉淀物。该沉淀导致残渣在HTST系统内的表面上积累并引起设备结垢，以使其不再能将培养基加热至完全灭活病毒污染物的目标温度。此外，该沉淀还可能使滤器结垢，该滤器通常在HTST系统的下游使用的用于去除来自培养基的微生物如细菌的最终处理。该滤器结垢可能导致不能完成细胞培养工艺之前的培养基处理步骤。在一些实例中，沉淀物还可能影响细胞培养基的性能，并妨碍来自培养的细胞系的生物药物的高效产生。为了防止沉淀，可以降低温度，但可能会不利地影响成功的病毒灭活。此外，HTST细胞培养基处理期间的沉淀生成可能导致在生产工艺期间频繁地清洁或维护用于HTST处理的设备，这显著增加了工艺的成本。因此，在去除或灭活病毒污染物的HTST处理期间存在防止沉淀生成，并且不会不利地影响该处理的效率的需求。
本文中所述的发明通过使用HTST处理，提供在细胞培养基中有效灭活病毒污染物的方法，从而满足了这些需求，所述HTST处理调整了导致沉淀生成减少或防止沉淀生成的工艺参数。
本文中所引用的全部参考文献，包括专利申请和出版物在此处以其整体并入本文作为参考。
发明内容
本发明通过使用高温瞬时(HTST)处理并调整培养基中多种参数如pH和/或钙和/或磷酸盐浓度组合，提供了用于灭活细胞培养基中的病毒污染物和/或其他污染物的方法、工艺、系统和组合物。此外，还提供了减少用于HTST处理的设备和滤器结垢的方法、工艺、系统和组合物。
因此，在一个方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒或外源性因子(adventitious agent)，同时使所述培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括(a)将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，和(b)调整选自pH、钙水平和磷酸盐水平的一个或多个参数。
在其他方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH6.9之间的pH。在另一方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH7.2之间的pH。在一些实施方案中，培养基在HTST处理期间具有约pH5.3至约pH6.3之间的pH。在其他实施方案中，培养基在HTST处理期间具有约pH6.0的pH。在任一实施方案中，HTST处理包括将培养基的温度升高至至少约85℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒或可能的病毒。在一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约93℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒或可能的病毒。在一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101或103℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒或可能的病毒。在一些实施方案中，在多肽产生阶段之前，在HTST处理期间将培养基的pH降低至约pH5.0至约pH6.9之间。在一些实施方案中，然后使培养基的pH达到约6.9-7.2之间，以用于多肽产生阶段。
在另一方面，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些实施方案中，在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至约小于9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在一些实施方案中，在多肽产生阶段之前，在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些实施方案中，在蛋白质产生阶段，然后将培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够多肽产生的水平。
在另一方面，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢的方法，该方法包括将在设备中使用的细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH6.9之间的pH。在一些实施方案中，在HTST处理期间，培养基具有约pH5.3至约pH6.3之间的pH。在一些实施方案中，在HTST处理期间，培养基具有约pH6.0的pH。在一些实施方案中，污垢包含用于HTST处理的设备上的沉淀。在任意实施方案中，HTST处理包括将培养基的温度升高至至少约85℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101或103℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。
在另一方面，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢，以灭活病毒的方法，该方法包括在HTST处理期间，将设备中使用的培养基中的磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些实施方案中，将HTST处理期间，培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在一些实施方案中，污垢包含用于HTST处理的设备上的沉淀。在任一实施方案中，病毒选自细小病毒科(parvoviridae)、paramyoxviridae、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)和小RNA病毒科(picornaviridae)。在任一实施方案中，病毒是有包膜病毒。在任一实施方案中，病毒是无包膜病毒。
附图说明
图1是在生产中使用的代表性HTST skid的示意图。
图2是描述用沙浴法和HTST处理至102℃目标设定点的加热分布图。轨迹显示了以分钟表示的加热分布图，其中通过时间和终点的温度描述了每一轨迹的终点(例如，“6.2,102”的终点值＝在6.2分钟的终点值为102℃)。
图3是在通过沙浴法热处理后，在HTST处理期间已知会沉淀的培养基样品的图。A)在热处理压力容器中pH 7.0或pH 6.4的培养基1和pH 7.0或pH 6.7的培养基2的未离心样品。B)来自经处理的压力容器的pH 7.0或pH 6.4的培养基1和pH 7.0或pH 6.7的培养基2的经离心的整分试样。
图4针对与更高水平的经沙浴处理的样品浑浊度相关的参数术语，描述了培养基制剂(基于培养基4)的分类参数估计。
图5是描述沙浴热处理期间，通过浑浊度测量的沉淀响应面的一系列图，该浑浊度来自基于培养基4制剂的3方面(不同的钙、磷酸盐和pH水平)。每一网格可见的透视平面部分显示了浑浊度低于5NTU的区域，其与测试的培养基样品中不可见的沉淀相关并代表了安全操作方案。A)侧视图，显示具有不同浓度的磷酸盐和钙的培养基中的浑浊度测量。俯视图显示培养基中的浑浊度测量，其中B)具有不同浓度的磷酸盐和钙，C)具有不同的磷酸盐浓度和pH水平，以及D)不同的钙浓度和pH水平。
图6是就已知的和估计的钙和磷酸盐浓度而言，描述位于pH 7.0的培养基4响应面上的培养基制剂的图。尽管全部制剂中的其他组成有差异，但钙和磷酸盐浓度与热处理后可能的沉淀强烈相关。箭头指由于添加了含另外水平的磷酸盐和/或钙的水解产物，培养基移位到了沉淀方案(precipitation regime)。
图7描述了在沙浴系统中四种培养基制剂的平均加热分布图。获取了了五种不同的温度终点(通过两个数字表示，例如“2.5，75.9”＝在2.5分钟获取样品，产生了75.9℃的平均温度)。右边照片中将在未离心和离心样品中观察到的可见沉淀相关的实心圆或空心圆重叠。空心圆＝在未离心的或离心的样品中通过目测方法没有检测到沉淀。实心圆＝在两个或一个样品中通过目测方法检测到了沉淀。
图8是描述获自4种不同培养基制剂的5个不同温度终点样品的浑浊度(NTU)值的图。浑浊度值大于～8NTU与通过直接目测检查或者离心样品检查鉴定的可见沉淀相关。
图9是显示HTST处理后铁(左图)和铜(右图)损耗的一系列图，其中HTST加工和过滤操作都是成功的。
图10是显示在热处理期间，由于改变A)pH水平、B)钙(Ca)浓度、C)磷酸盐(PO4)浓度、D)铁(Fe)浓度和E)铜(Cu)浓度对铁回收的主效应图。
图11描述了显示来自统计学设计实验(实验设计(DoE))结果的相互作用图的一系列图，所述统计学设计实验结果显示了热处理期间pH、Ca、PO4之间和Fe对铁回收的互作效应。
图12是显示在经热处理的培养基中，最终Fe浓度对初始Fe浓度的依赖性的图。全部其他培养基组分都处于正常的1.5×培养基4水平。
图13是显示在经热处理的培养基中，Fe补偿对几种参数的调整的依赖性的图。在经热处理的培养基中，A)Fe回收对pH水平的依赖性，和B)Fe回收对钙和磷酸盐的浓度的依赖性。全部其他培养基组分都处于正常的1.5×培养基4水平。在x轴刻度上，培养基4的标准浓度通过1表示。
图14是显示热处理后，钙和磷酸盐回收与Fe回收的关系图。红色圆圈内的数据点指示显示出可见沉淀和增加的浑浊度(NTU)的样品。直线表示Fe回收与钙数据点的关系。
图15是显示HTST处理前和后，在多种细胞培养基制剂中铁水平的图。对于特定的细胞培养基(例如，培养基14)，左边的棒状图表示HTST处理后细胞培养基中铁的期望水平，中间的棒状图表示HTST处理前(HTST前)细胞培养基中铁的实际水平，右边的棒状图表示HTST处理后(HTST后)细胞培养基中铁的实际水平。
图16是显示将铁加入经HTST处理的培养基中在细胞培养中对NS0骨髓瘤细胞系的生长有益的图。HTST+表示细胞培养基进行了HTST处理。HTST-表示细胞培养基没有进行HTST处理。Fe表示存在补充的铁。
具体实施方式
本发明人得到了出乎意料的发现，调整细胞培养基的pH、调整钙浓度、调整磷酸盐浓度、同时调整钙和磷酸盐浓度和/或限制培养基中磷酸盐和钙的总量或者组合地调整pH、钙浓度和磷酸盐浓度，以及将细胞培养基在特定的温度范围进行HTST处理并持续足够的时间，可以有效地灭活培养基中的病毒(或者其他感染性和/或外源性因子)，并且还可以通过最小化或防止沉淀物形成来减少设备的结垢。
本发明提供了减少用于高温瞬时(HTST)处理的设备上的沉淀物，以灭活病毒的方法，该方法包括将设备中使用的细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH6.9之间或者约pH5.0至约pH7.2之间的pH。在另一方面，本发明提供了减少用于高温瞬时(HTST)处理的设备上的沉淀物，以灭活病毒的方法，该方法包括将设备中使用的细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH7.2之间的pH。在其他方面，本发明提供了减少用于HTST处理的设备上的沉淀物，以灭活病毒的方法，该方法包括在HTST处理期间，将设备中使用的细胞培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。
在另一方面，本发明提供了灭活细胞培养基中病毒的方法，包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH6.9之间的pH。在另一方面，本发明提供了灭活细胞培养基中病毒的方法，包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5.0至约pH7.2之间的pH。在本发明的其他方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH5.0至约pH6.9之间。在一些方面，然后使培养基的pH达到约pH6.9至约pH7.2之间。在其他方面，本发明提供了灭活细胞培养基中病毒的方法，包括在HTST处理期间，将细胞培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。
I.一般技术
本文中所述的或者所参考的技术和方法是本领域技术人员通常熟知和常用的常规方法，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等人eds.,(2003))；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller andM.P.Calos,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,eds.,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janewayand P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)中所述的广泛使用的方法。
II.定义
“培养”细胞指在适合于细胞存活和/或生长和/或细胞增殖的条件下将细胞与细胞培养基接触。
“分批培养”指这样的培养，其中在开始培养时就将用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养营养物)都提供给培养容器。
如本文中所用，短语“补料分批细胞培养”指这样的分批培养，其中最初将细胞和培养基提供给培养容器，并在培养期间，在培养终止之前，将其他培养营养物与周期性细胞和/或产物收获物(product harvest)一起或者不与周期性细胞和/或产物收获物一起连续地或非连续增加地进料到培养物中。
“贯流培养”指这样的培养，其中通过例如过滤、包囊、与微载体锚定等将细胞限制在培养物中，并将培养基连续地或间歇地引入培养容器并从培养容器中去除。
“培养容器”指用于培养细胞的容器。培养容器可以是任意大小，只要其可用于培养细胞。
术语“培养基”和“细胞培养基”指用于培养或维持细胞的营养源。如本领域技术人员所理解，营养源可以含有细胞生长和/或存活所需的组分或者可以含有帮助细胞生长和/或存活的组分。维生素、必需或非必需氨基酸以及痕量元素都是培养基组分的实例。应当理解，在本说明书中“培养基”和“培养液”可互换使用。
“化学成分确知细胞培养基”或“CDM”是具有特定组成的培养基，其不含动物来源的或者未确定成分的产物如动物血清和蛋白胨。如本领域技术人员所理解，可在多肽产生工艺中使用CDM，从而使细胞与CDM接触并将多肽分泌到CDM中。因此，应当理解，组合物可以含有CDM和多肽产物，并且多肽产物的存在并不使CDM的化学成分未确知。
“化学成分未确知细胞培养基”指其化学组成没有指定的培养基，并且其可以含有一种或多种动物来源的或未确定成分的产物如动物血清和蛋白胨。如本领域技术人员所理解，化学成分未确知培养基可以含有动物来源的产物作为营养源。
在本文中可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”指任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或者分支的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。术语还包括天然或者通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸盐酸化或任意其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。如本文中所用，术语“多肽”和“蛋白质”特别地包括抗体。
“分离的多肽”意为从表达多肽的细胞或细胞培养物中回收的多肽。
如在本文中可互换使用的“核酸”指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者是可以通过DNA或RNA聚合酶或者合成反应掺入到聚合物中的任意底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在组装聚合物之前或之后基于核苷酸结构的修饰。
“分离的核酸”意指并包括非天然存在的、重组的或天然存在的序列，该天然存在的序列未存在于其平常背景(usual context)或者从其平常背景分离出来。
“纯化的”多肽意为在纯度上增加的多肽，以使该多肽比其在其天然环境中存在和/或当在实验室条件下最初产生和/或合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语并非必须意为绝对纯度。
术语“抗体”以其最广义使用，并特别地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、免疫黏附素以及抗体的片段，只要该片段表现出期望的生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白(Ig)”在本文中与抗体可互换使用。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除可能天然发生的以最小量存在的突变外，群体包含的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，靶向单个抗原位点。此外，与包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每一单克隆抗体靶向抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体是有利的，因为它们可以合成，而不会被其他抗体污染。并不应将修饰词“单克隆”理解为需要通过任一特定方法产生抗体。例如，可以通过第一次由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备或者在细菌、真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备用于本发明的单克隆抗体。还可以使用Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Mark等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中单克隆抗体包括“嵌合”抗体(其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)，以及此类抗体的片段，只要该片段表现出期望的生物学活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中的目的嵌合抗体包括“灵源化的”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如旧世界猴、类人猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“人源化”抗体是非人(例如，啮齿类动物)抗体的形式，其是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有期望的抗体特异性、亲和力和性能的高变区的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些实例中，用相应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或者在供体抗体中不存在的残基。制备这些修饰，以进一步改进抗体性能。总之，人源化抗体基本上都包含至少一个，以及通常两个可变区，其中全部或基本上全部高变环都对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或者基本上全部FR都是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白恒定区)的一部分。对于其他细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“污染物”指不同于期望的多肽产物的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，例如CHOP；浸出(leached)的蛋白A；核酸；期望多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。
如本文中所用，术语“沉淀物”指在溶液中生成的固体或不溶性颗粒。存在多种形式的沉淀物，并且在本文中描述了示例性沉淀物。非限制性实例包括：磷酸钙沉淀、不溶性白磷钙石、氧化物、磷酸铁和磷酸铁钙沉淀。磷酸钙沉淀可以是这样的过程，其中溶液中的钙和磷酸盐形成不溶性颗粒，即沉淀。可以将该不溶性颗粒称为磷酸钙。磷酸钙包括，但不限于：磷酸二氢钙、磷酸一氢钙、磷酸三钙、白磷钙石和羟基磷灰石。不溶性颗粒可以包括其他组分，即多肽、核酸、脂质、离子、螯合剂和金属。该定义还包括通过进一步沉淀或者通过聚集、絮凝和/或重排产生的此类颗粒。
如本文中所用，术语“结垢”指在处理设备的表面上积累和形成不想要的物质。可以将结垢表征为复合的、非稳态、动量(momentum)、质量和传热问题，伴随着化学、溶解度、腐蚀以及发生的生物学过程。可以将结垢归因于沉淀，即磷酸钙沉淀。
如本文中所用，“外源性因子”包括病毒和细菌(包括可以穿过无菌级滤器的细菌)。“传染原”是一种类型的“外源性因子”。
应当理解，在本文中所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”以及“基本上由……组成”的方面和实施方案。
对于在本文中使用，除非另外明确指出，术语“一”、“一个”等的使用指一个或多个。
在本文中涉及“约”的数值或参数包括(并且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。例如，描述涉及“约X”包括描述“X”。数值范围包含限定该范围的数值。
III.细胞培养基
可以将灭活培养基中病毒、传染原和/或外源性因子的方法应用于任意类型的细胞培养基，其中所述细胞培养基涉及病毒污染、可能的病毒污染或者被其他传染原污染或者被外源性因子污染。应当理解，本发明考虑了可应用于细胞培养物和细胞培养基的组合物和方法，其中所述细胞培养物和细胞培养基可能存在病毒污染以及实际的病毒污染。
可将病毒灭活、减少沉淀物生成以及减少用于HTST处理的设备结垢的方法用于产生细胞培养基的组合物，其中已经灭活了病毒、外源性因子以及其他传染原。因此，在本文中考虑了且详述了通过病毒灭活、外源性因子灭活和/或传染原灭活的系统处理的细胞培养基及其中间物的任意组合物。已经证实，调整特定的细胞培养基参数(pH、钙水平和磷酸盐水平)，在可以有效灭活培养基中病毒污染物和其他污染物的温度下进行HTST处理后，能减少或防止培养基中沉淀物的生成。
可以将细胞培养基参数如pH、钙浓度或量，以及磷酸盐浓度或量(及其任意组合)的独立调整与HTST处理一起使用，以减少沉淀(例如，包含钙和磷酸盐的复合体)、减少HTST设备结垢、减少滤器结垢，同时保留细胞培养的适合性。保持细胞培养适合性的细胞培养基允许细胞增殖、生长、存活、产生任何多肽、蛋白质或化合物、将任何此类产物分泌到培养基中，以及本领域技术人员理解的细胞培养的适合性目的中包括的任意其他特征。
可以将本文中所述的细胞培养基参数的独立调整应用于任意细胞培养方法，并且可以有益于多肽和/或蛋白质的产生，以及其他产物如细胞、培养基和培养基中其他组分的产生。调整用于减少或防止细胞培养基中沉淀物的这些细胞培养基参数有益于生物药物如多肽药物产物的产生。使用调整了参数或具有经调整的组分的细胞培养基可以有效地从生物药物产物中去除病毒污染物，并且减少或防止沉淀物，该沉淀物可以影响细胞培养基性能，阻碍生物药物从培养的细胞系中有效产生，并且导致HTST设备结垢。可将本文中详述的任意培养基用于细胞生长、维持以及生物药物产生中的任何阶段，并且可用于基础培养基和/或进料培养基(feed medium)。在一个变型中，如本文中所述的培养基导致了组合物的可接受浑浊度或沉淀水平，所述组合物包含从进行了HTST处理的培养基中培养的细胞培养物中分离的生物药物。
提供了包含一种或多种以下组分的细胞培养基：(a)钙和(b)磷酸盐。在一些变型中，细胞培养基包含组分(a)或(b)或者组分(a)和(b)。在其他变型中，细胞培养基不包含组分(a)和(b)。在一些方面，细胞培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知细胞培养基。在任一方面，在HTST处理期间将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，通过HITST处理细胞培养基，以灭活可能来自原料以及用于制备培养基的操作的病毒。
可以以本领域已知的形式将培养基组分加入到组合物中。例如，可以将钙提供为，但不限于氯化钙、无水氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸三钙、L型乳酸钙水合物(calcium L-lactate hydrate)、亚叶酸钙和四水硝酸钙。例如，可以将磷酸盐提供为，但不限于磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸缓冲盐水、磷酸钙和磷酸氢钙。
可以调整磷酸盐和钙的比率以用于HTST处理，以使包含钙和磷酸盐的复合体(例如磷酸钙(CaPO4)复合体)不会形成。在一个变型中，调整或限制磷酸盐和钙的总量，以使包含钙和磷酸盐的复合体(例如磷酸钙(CaPO4)复合体)不会形成。在另一变型中，可以限制磷酸盐和钙的总量，以使CaPO4复合体的生成能使HTST操作成功进行(例如HTST和过滤设备没有结垢)。问题情况的检测方法涉及间接测量沉淀包括浑浊度、操作性地观察HTST和过滤设备，以及目测观察HTST和过滤设备(例如通过使用内孔表面检查仪)。在一个方面，培养基是包含磷酸盐和钙的总量限制在小于约10mM的细胞培养基。在另一变型中，培养基中总磷酸盐和钙的浓度为小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在另一变型中，培养基中总磷酸盐和钙的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在一个变型中，在细胞培养物的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中总磷酸盐和钙的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在本发明的任一方面，在细胞培养物的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中钙和磷酸盐的总量限制在小于约10mM。在本发明的其他方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中钙和磷酸盐的总量增加至足够产生多肽的水平。在一些方面，细胞培养基不含钙和磷酸盐。
当培养基包含磷酸盐时，可以调整细胞培养基中钙的水平。调整可以是增加或减少钙水平。在一些实施方案中，钙水平是减少的(包括去除钙)。在其他实施方案中，钙水平是减少的，以使包含钙和磷酸盐的复合体的生成是受抑制的。在其他实施方案中，在HTST处理之前从培养基中去除钙。在任一这些实施方案中，调整pH，以使包含钙和磷酸盐的复合体的生成是受抑制的(例如，与如果没有进行这些调整所形成的复合体比较，形成的复合体的量是减少的)。在其他实施方案中，可以在HTST处理后将钙水平进一步调整至用于细胞培养的合适水平。可以改变HTST处理与HTST后将钙水平调整至用于细胞培养的合适水平之间的时间。在本发明范围内考虑了秒、分钟、天、周、月或年的时间间隔。
在另一变型中，培养基是包含钙的总量限制在小于约10mM的细胞培养基。在另一变型中，培养基中总钙的浓度为小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在另一变型中，培养基中总钙的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在另一变型中，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中总钙的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在本发明的任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中钙的总量限制在小于约10mM。在本发明的其他方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中钙的总量增加至足够产生多肽的水平。在一些方面，细胞培养基不含磷酸盐。
在另一方面，当培养基包含钙时，可以调整磷酸盐水平。调整可以是增加或者减少磷酸盐水平。在一些实施方案中，磷酸盐水平是减少的。在一些实施方案中，磷酸盐水平是减少的，以使包含钙和磷酸盐的复合体的形成受到抑制。在一些实施方案中，在HTST处理之前从培养基中去除磷酸盐。在一些实施方案中，调整pH，以使包含钙和磷酸盐的复合体的生成受到抑制。在一些实施方案中，在HTST处理之后将磷酸盐水平进一步调整至用于细胞培养的合适水平。可以改变HTST处理与HTST后将磷酸盐水平调整至用于细胞培养的合适水平之间的时间。在本发明范围内考虑了秒、分钟、天、周、月或年的时间间隔。
在另一变型中，培养基是包含磷酸盐的总量限制在小于约10mM的细胞培养基。在另一变型中，培养基中总磷酸盐的浓度为小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在另一变型中，培养基中总磷酸盐的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在另一变型中，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中总磷酸盐的浓度为约1mM至约9mM；约2mM至约8mM；约3mM至约7mM；约4mM至约6mM；约1mM至约8mM；约1mM至约7mM；约1mM至约6mM；约1mM至约5mM；约1mM至约4mM；约1mM至约3mM；约1mM至约2mM；约2mM至约9mM；约3mM至约9mM；约4mM至约9mM；约5mM至约9mM；约6mM至约9mM；约7mM至约9mM；约8mM至约9mM；约9或8或7或6或5或4或3或2或1mM中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8以及不超过约9mM中之一。在本发明的任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基中磷酸盐的总量限制在小于约10mM。在本发明的其他方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中磷酸盐的总量增加至足够产生多肽的水平。在一些方面，细胞培养基不含钙。
在一个变型中，细胞培养基包含组分(a)和(b)中的一种或两种，其中在本文中所述的每一组分(a)和(b)的浓度中将(a)或(b)或者(a)和(b)的总量限制至小于约10mM。应当理解，细胞培养基可以含有任一本文中所提供的浓度范围的组分(a)和(b)的组合，就如同每一浓度都明确单独列出的那样。例如，应当理解，在一个变型中的培养基包含组分(a)和(b)，其中钙为0.5mM并且磷酸盐为约2.5mM。在一些方面，细胞将培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知培养基。在任一方面，在HTST处理期间将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含钙。在另一方面，在HTST处理后将钙加入到细胞培养基中。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含磷酸盐。在另一个方面，在HTST处理后将磷酸盐加入到细胞培养基中。
在一个变型中，培养基是包含约0mM至约1mM磷酸盐浓度和约0.5mM至约3mM钙浓度的细胞培养基。在另一变型中，磷酸盐浓度为约1mM至约1.25mM，钙浓度为约0mM至约2.5mM。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约1.25mM至约1.5mM，并且钙浓度为约0mM至约2.25mM。又在另一变型中，磷酸盐浓度为约1.5mM至约1.75mM，并且钙浓度为约0mM至约2mM。在一个变型中，磷酸盐浓度为约1.75mM至约2mM，并且钙浓度为约0mM至约1.75mM。在另一变型中，磷酸盐浓度为约2mM至约2.25mM，并且钙浓度为约0mM至约1.5mM。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约2mM至约2.25mM，并且钙浓度为约0mM至约1.5mM。在另一变型中，磷酸盐浓度为约2.25mM至约2.5mM，并且钙浓度为约0mM至约1.25mM。仍在另一变型中，磷酸盐浓度为约2.5mM至约2.75mM，并且钙浓度为约0mM至约1.15mM。在另一变型中，磷酸盐浓度为约2.75mM至约3mM，并且钙浓度为约0mM至约1mM。在另一个变型中。磷酸盐浓度为约3mM至约3.5mM，并且钙浓度为约0mM至约0.8mM。又在另一个变型中，磷酸盐浓度为约3.5mM至约4.5mM，并且钙浓度为约0mM至约0.6mM。在一个变型中，磷酸盐浓度为约4.5mM至约5mM，并且钙浓度为约0mM至约0.5mM。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约5mM至约5.5mM，并且钙浓度为约0mM至约0.25m。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约5.5mM至约6mM，并且钙浓度为约0mM至约0.1mM。在另一个方面，如在示例性图5(例如图5B、图5C和图5D)中所示，可以独立地调整pH、钙和磷酸盐的参数，以使浑浊度(作为基于磷酸盐的沉淀的间接测量)保持在网格区(在该实例中，网格区表示浑浊度值等于或低于5NTU的过失误差(gross-failure)浑浊度阈值)，并且避开非网格区(其中非网格区表示浑浊度响应高于5NTU的过失误差浑浊度阈值)所示的沉淀范围。图5中所示的响应面显示了pH、钙浓度和磷酸盐浓度对浑浊度(作为基于磷酸钙的沉淀的间接测量)的多因素效应。因此，响应面显示了如何组合地调整这些因素而不是每次仅调整一种因素，来寻找可接受的HTST处理操作设定点，其针对的是待处理的培养基中pH与可接受的钙和磷酸盐浓度的组合。
可以调整的另一独立参数(除其他独立参数的钙和磷酸盐外)是pH。因此，当培养基包含钙和磷酸盐时，可以调整pH。在一些实施方案中，在HTST处理之前将制备的培养基的pH降低至适当的水平。在一些实施方案中，通过降低至合适的水平来调整pH。在一些实施方案中，将pH调整至小于约7.2。在一些实施方案中，将pH调整至约5.0–7.2。在一些实施方案中，在HTST处理后将pH进一步调整至用于细胞培养的合适水平。在一些实施方案中，将pH调整至约6.9–7.2。可以改变HTST处理与HTST后将pH水平调整至用于细胞培养的合适水平之间的时间间隔。在本发明范围内考虑了秒、分钟、天、周、月或年的时间间隔。
在其他方面，提供了包含约pH 5.0至约pH 7.2之间的pH的细胞培养基。在一个方面，提供各类包含约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH的细胞培养基。在一些方面，细胞培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知细胞培养基。在任一方面，在HTST处理期间将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，在HTST处理期间培养基的pH为约pH 5.0至约pH 7.2之间。这可以在细胞培养的多肽产生阶段之前。任选地，本领域技术人员可以在HTST处理后调整培养基的pH，以使培养基处于适合于细胞培养工艺的pH。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间将培养基的pH降低至约pH5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在一个方面，在HTST处理后，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。
在一个变型中，培养基是包含约pH 5.0至约pH 7.2之间的pH的细胞培养基。在另一变型中，培养基是包含约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH的细胞培养基。在另一变型中，培养基的pH为pH约5.0至约7.2；约5.0至约6.9；约5.2至约6.7；约5.4至约6.5；约5.6至约6.3；约5.8至约6.1；约5.9至约6.0；约5.0至约6.7；约5.0至约6.5；约5.0至约6.3；约5.0至约6.1；约5.0至约5.9；约5.0至约5.7；约5.0至约5.5；约5.0至约5.3；约5.0至约5.1；约5.2至约6.9；约5.4至约6.9；约5.6至约6.9；约5.8至约6.9；约6.0至约6.9；约6.0至约6.9；约6.2至约6.9；约6.4至约6.9；约6.6至约6.9；约5.0或5.2或5.4或5.6或5.8或6.0或6.2或6.4或6.6或6.8或6.9中之一；至少约5.0或5.2或5.4或5.6或5.8或6.0或6.2或6.4或6.6或6.8以及不超过约6.9中之一。在一个变型中，培养基是包含约pH 5.0至约pH 7.2之间的pH的细胞培养基。在另一变型中，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基的pH为pH约5.0至约6.9；约5.2至约6.7；约5.4至约6.5；约5.6至约6.3；约5.8至约6.1；约5.9至约6.0；约5.0至约6.7；约5.0至约6.5；约5.0至约6.3；约5.0至约6.1；约5.0至约5.9；约5.0至约5.7；约5.0至约5.5；约5.0至约5.3；约5.0至约5.1；约5.2至约6.9；约5.4至约6.9；约5.6至约6.9；约5.8至约6.9；约6.0至约6.9；约6.0至约6.9；约6.2至约6.9；约6.4至约6.9；约6.6至约6.9；约5.0或5.2或5.4或5.6或5.8或6.0或6.2或6.4或6.6或6.8或6.9中之一；至少约5.0或5.2或5.4或5.6或5.8或6.0或6.2或6.4或6.6或6.8以及不超过约6.9中之一。在任一方面，培养基的pH在HTST处理期间为约pH 5.0至约pH 7.2之间。这可以在细胞培养的多肽产生阶段之前。HTST处理后，根据需要，可以将培养基调整至适合于细胞培养工艺的pH。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH5.0至约pH 6.9之间。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基的pH为约pH 5.0至约pH 6.9之间。
在一个变型中，培养基是包含约pH 6.9至约pH 7.2之间的pH的细胞培养基。在另一变型中，培养基的pH为pH约6.9至约7.2；约7.0至约7.1；约6.9至约7.1；约6.9至约7.0；约7.0至约7.2；约7.1至约7.2；约6.9或7.0或7.1或7.2中之一；至少约6.9或7.0或7.1以及不超过约7.2中之一。在一个变型中，培养基是包含约pH 6.9至约pH 7.2的pH的细胞培养基。在另一变型中，培养基的pH为pH约6.9至约7.2；约7.0至约7.1；约6.9至约7.1；约6.9至约7.0；约7.0至约7.2；约7.1至约7.2；约6.9或7.0或7.1或7.2中之一；至少约6.9或7.0或7.1以及不超过约7.2中之一，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，在HTST处理后，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，在HTST处理后，培养基的pH为约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。
在一个变型中，培养基是包含约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH的细胞培养基，并且磷酸盐和钙的总量为小于约10mM。在一个变型中，在HTST处理期间，培养基是包含约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH的细胞培养基，并且磷酸盐和钙的总量为小于约10mM。在任一变型中，pH以及钙和磷酸盐的量为本文中所述的任一量。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含钙。在另一方面，在HTST处理后将钙加入到细胞培养基中。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含磷酸盐。在另一方面，在HTST处理后将磷酸盐加入到细胞培养基中。在另一方面，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，在HTST处理后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。
在一个变型中，培养基是包含约0mM至约0.5mM磷酸盐浓度和pH约6.4至约7.4的细胞培养基。在另一变型中，磷酸盐浓度为约0.5mM至约0.75mM，并且pH为约6.4至约7.35。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约0.75mM至约1mM，并且pH为约6.4至约7.25。又在另一变型中，磷酸盐浓度为约1mM至约1.25mM，并且pH为约6.4至约7.2。在一个变型中，磷酸盐浓度为约1.25mM至约1.5mM，并且pH为约6.4至约7.1。在另一变型中，磷酸盐浓度为约1.5mM至约1.75mM，并且pH为约6.4至约7.05。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约1.75mM至约2mM，并且pH为约6.4至约7。又在另一变型中，磷酸盐浓度为约2mM至约2.25mM，并且pH为约6.4至约6.9。在一个变型中，磷酸盐浓度为约2.25mM至约2.5mM，并且pH为约6.4至约6.85。在另一变型中，磷酸盐浓度为约2.5mM至约2.75mM，并且pH为约6.4至约6.75。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约2.75mM至约3mM，并且pH is为6.4至约6.7。在另一个变型中，磷酸盐浓度为约3mM至约3.25mM，并且pH为约6.4至约6.6。在一个变型中，磷酸盐浓度为约3.25mM至约3.5mM，并且pH为约6.4至约6.5。在另一变型中，磷酸盐浓度为约3.5mM至约3.75mM，并且pH为约6.4至约6.45。
在一个变型中，钙浓度为约0mM至约1mM，并且pH为约6.65至约7.4。在另一变型中，钙浓度为约0.1mM至约0.25mM，并且pH为约6.55至约7.4。在另一个变型中，钙浓度为约0.25mM至约0.5mM，并且pH为约6.5至约7.4。又在另一变型中，钙浓度为约0.5mM至约0.6mM，并且pH为约6.5至约7.2。在一个变型中，钙浓度为约0.6mM至约0.75mM，并且pH为约6.5至约7。在另一变型中，钙浓度为约0.75mM至约1mM，并且pH为约6.4至约6.9。在另一个变型中，钙浓度为约1mM至约1.1mM，并且pH为约6.4至约6.8。又在另一个变型中，钙浓度为约1.1mM至约1.25mM，并且pH为约6.4至约6.7。在一个变型中，钙浓度为约1.25mM至约1.5mM，并且pH为约6.4至约6.65。在另一变型中，钙浓度为约1.5mM至约1.75mM，并且pH为约6.4至约6.55。在另一个变型中，钙浓度为约1.75mM至约2mM，并且pH为约6.4至约6.5。在一个变型中，钙浓度为约2mM至约2.25mM，并且pH为约6.4至约6.45。在另一变型中，钙浓度为约2.25mM至约2.5mM，并且pH为约6.4至约6.43。在另一个变型中，钙浓度为约2.5mM至约2.6mM，并且pH为约6.4至约6.41。
各个培养基组分可以以产生一种或多种有利性质的量存在，所述性质例如病毒灭活、减少沉淀物生成以及减少用于HTST处理设备结垢。在一个变型中，在本文中提供的细胞培养基含有如表1中所述的培养基参数。应当理解，培养基组合物可以包含表1的任意一种或多种培养基组分(例如，(a)-(c)中的任意一种或多种组分)，例如以表1中列出的任一量包含(a)、(b)和(c)中的每一组分的培养基或者包含(a)、(b)和(d)的培养基组合物或者包含组分(a)和(b)的培养基组合物或者包含组分(a)和(c)的培养基组合物或者包含组分(b)和(c)的培养基组合物或者包含组分(a)和(d)的培养基组合物或者包含组分(b)和(d)的培养基组合物，就好像组分的每一组合和量都明确单独列出的那样。在一些方面，细胞培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知细胞培养基。在任一方面，在HTST处理期间将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含钙。在另一方面，在HTST处理后将钙加入到细胞培养基中。在任一方面，培养基在HTST处理期间不含磷酸盐。在另一方面，在HTST处理后将磷酸盐加入到细胞培养基中。在另一方面，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，在HTST处理后，使养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。
表1.培养基组分或参数的示例性水平
Figure BDA0003929499940000171
Figure BDA0003929499940000181
在一个变型中，本文中提供的培养基包含钙和磷酸盐。在一个变型中，包含钙和磷酸盐的培养基是进料培养基。在另一变型中，包含钙和磷酸盐的培养基是基础培养基。在一些方面，进料培养基是生产培养基。在一些方面，细胞培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知细胞培养基。在任一方面，在HTST处理期间，将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制在小于约10mM。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段，将培养基中磷酸盐和钙的总量增加至足够用于蛋白质表达的水平。在任一方面，在HTST处理期间培养基的pH为约pH 5.0至约pH 6.9之间。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在一个方面，在HTST处理后，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2，以用于细胞培养的多肽产生阶段。
在一个变型中，本文中提供的培养基包含细胞培养基，其中培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在一个变型中，包含钙和磷酸盐的培养基是进料培养基。在一个变型中，包含钙和磷酸盐的培养基是基础培养基。在一些方面，细胞培养基是化学成分确知细胞培养基。在其他方面，细胞培养基是化学成分未确知细胞培养基。在任一方面，在HTST处理期间，将细胞培养基用于灭活病毒。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一方面，在HTST处理后，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在任一方面，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制在小于约10mM。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制在小于约10mM。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量增加至足够用于多肽产生的水平。
在一个变型中，本发明提供了这样的培养基，其中使用实施例2中详述的响应面调整细胞培养基组分。在另一变型中，本发明提供了这样的培养基，其中使用图5和图6中的响应面调整细胞培养基组分。
在一个变型中，本发明提供了这样的培养基，其中在培养基进行HTST处理后将痕量金属加入到培养基中，在一个方面，痕量金属是选自铁或铜的至少一种或多种痕量金属。在一个变型中，本发明提供了这样的培养基，其中在培养基进行HTST处理后将铁以约1μM至约125μM之间的量加入到培养基中。在另一变型中，在培养基进行HTST处理后，培养基中铁的浓度为约1μM至约125μM；约10μM至约120μM；约20μM至约110μM；约30μM至约100μM；约40μM至约90μM；约50μM至约80μM；约60μM至约70μM；1μM至约120μM；1μM至约110μM；1μM至约100μM；1μM至约90μM；1μM至约80μM；1μM至约70μM；1μM至约60μM；1μM至约50μM；1μM至约40μM；1μM至约30μM；1μM至约20μM；1μM至约10μM；10μM至约125μM；20μM至约125μM；30μM至约125μM；40μM至约125μM；50μM至约125μM；60μM至约125μM；70μM至约125μM；80μM至约125μM；90μM至约125μM；100μM至约125μM；110μM至约125μM；120μM至约125μM；约1或10或20或30或40或50或60或70或80或90或100或110或120或125μM中之一；至少约1或10或20或30或40或50或60或70或80或90或100或110或120以及不超过约125μM中之一。
在一个方面，与将不同培养基用于HTST处理期间病毒的灭活时的性质比较，当将本文中提供的培养基用于HTST处理期间病毒灭活的方法时，其导致了一个或多个有利的性质。在将用于产生生物药品(例如，抗体产物)的细胞培养基进行用于灭活病毒的HTST处理中生成的沉淀可能会影响生物药品的质量性质，例如生物药品的活性。此外，HTST处理期间细胞培养基中的沉淀物形成可能会造成HTST设备结垢。HTST设备的结垢可能会影响HTST处理有效灭活病毒的能力。在一个方面，污垢包含用于HTST处理的设备上的沉淀。在一个变型中，与HTST处理期间用于病毒灭活的不同培养基中形成的沉淀比较，当将本文中提供的培养基用于细胞培养中在HTST处理期间灭活病毒的方法时，其减少了细胞培养基中形成的沉淀。在另一变型中，与HTST处理期间使用用于病毒灭活的不同培养基导致的HTST设备的结垢比较，当将本文中提供的培养基用于HTST处理期间灭活病毒的方法时，其减少了HTST设备的结垢。又在另一变型中，与使用不同培养基在HTST处理的设备上形成的沉淀比较，当将本文中提供的培养基用于培养基的HTST处理中灭活病毒的方法时，其减少了用于HTST处理的设备上形成的沉淀物。在另一变型中，与不同培养基中的病毒灭活比较，当将本文中提供的培养基用于培养基的HTST处理方法时，其灭活了细胞培养基中的病毒。又在另一变型中，与不同培养基中的病毒灭活比较，本文中提供的培养基减少了培养基的HTST处理方法中由滤器结垢导致的沉淀。
一个观察结果是在HTST处理期间，对于细胞培养(包括多肽/蛋白质的产生、细胞生长、存活和/或增殖)重要的痕量金属如铜和铁是减少的。因此，本发明还提供了在细胞培养基中灭活病毒或外源性因子同时使培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括(a)将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理；和(b)调整选自pH、钙水平和磷酸盐水平的一个或多个参数，其中还可以调整痕量金属的浓度。痕量金属可以是铁或铜。可以在HTST处理之前独立地调整铁和/或铜的浓度。在一些实例中，如果预期铁和/或铜的浓度是减少的，并且该量是通常已知的，那么可以在HTST处理之前加入铁和/或铜。在其他实例中，其中减少的量是未知的，在HTST处理之前可以从培养基中减少(包括去除)铁和/或铜。然后在HTST处理之后，向培养基补充铁和/或铜至用于细胞培养的合适水平。
IV.本发明的组合物和方法
在HTST处理期间可将本文中详述的细胞培养基用于细胞培养基中灭活病毒、传染原和/或外源性因子的方法。通过分批培养、补料分批培养或者贯流培养，可将培养基用于培养细胞的方法。可将培养基用于培养细胞以产生多肽包括抗体的方法。可将培养基用于培养细胞以产生基于细胞的产物，包括用于组织替换或基因治疗应用的那些产物的方法。可将培养基用于任何细胞培养应用，其中防止可能的病毒污染得益于热处理的使用，所述热处理灭活了病毒但保留了培养基培养细胞的能力。可将培养基用于进行了本文中所述的热处理的任一变型或实施方案的细胞培养基中灭活病毒、传染原和/或外源性因子的方法。
提供了在如本文中所详述的细胞培养基中灭活病毒、传染原和/或外源性因子的方法，其中将细胞培养基进行HTST处理。在一个变型中，该方法包括将细胞培养基进行HTST处理，其中所述培养基包含如表1中所述的一种或多种培养基组分(例如，以表1中列出的任一量包含组分(a)和(b)的培养基或者包含组分(a)和(c)的培养基或者包含组分(b)和(c)的培养基或者包含组分(a)和(d)的培养基或者包含组分(b)和(d)的培养基或者包含(a)-(c)中每一组分或(a)、(b)和(d)的培养基)。
减少用于HTST处理的设备结垢的方法，以灭活病毒、传染原和/或外源性因子，其中在设备中使用如本文中详述的细胞培养基并进行HTST处理。在一个变型中，该方法包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基包含如表1中所述的一种或多种培养基组分(例如，以表1中列出的任一量包含组分(a)和(b)的培养基或者包含组分(a)和(c)的培养基或者包含组分(b)和(c)的培养基或者包含组分(a)和(d)的培养基或者包含组分(b)和(d)的培养基或者包含(a)-(c)中每一组分或(a)、(b)和(d)的培养基)。在特定的变型中，结垢是沉淀物污垢。在一个变型中，结垢是滤器结垢。
A.用于细胞培养基中病毒灭活和传染原和/或外源性因子灭活的方法
在一些变型中，本发明提供了在进行高温处理的细胞培养基中灭活病毒、传染原和/或外源性因子的方法，其中与对热处理不相容性培养基比较，该培养基对热处理是相容的。例如，热处理不相容培养基在有效灭活病毒、传染原和/或外源性因子所需的温度时沉淀或产生沉淀。如在本文中所公开的培养基中所提供，热处理相容性培养基在有效灭活病毒、传染原和/或外源性因子所需的温度时不会沉淀或者具有减少的沉淀。在一些方面，热处理是HTST处理。在其他方面，热处理是分批热处理，包括但不限于沙浴处理和油浴法。
在一个变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在一些方面，培养基在HTST处理期间具有约pH 5.3至约pH 6.3的pH。在其他方面，培养基在HTST处理期间具有约pH 6.0的pH。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在一个方面，在HTST处理后，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至小于约9,8,7,6,5,4,3,2或1mM。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中磷酸盐和钙的总量增加至足够用于多肽产生的水平。又在另一变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH，并且在HTST处理期间所述培养基包含的磷酸盐和钙在培养基中的总量被限制至小于约10mM。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH6.0之间，并将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，并将培养基中磷酸盐和钙的总量增加至足够用于多肽产生的水平。本文中详述的任一方法的病毒可以是本文中详述的任一病毒(例如，细小病毒)，并且本方法的培养基可以是本文中详述的任一培养基，例如包含如表1中详述的培养基参数的培养基。
a)温度和温度保留时间
在本文中详述的任一方法中，热处理包括将培养基的温度升高至至少约85℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在另一方面，将培养基的温度升高至至少约90℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在另一方面，将培养基的温度升高至至少约93℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。又在另一方面，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101或103℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。又在另一方面，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。又在另一另外的方面，将培养基的温度升高至至少约86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、100、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。又在另一方面，将培养基的温度升高至至少约121、121、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在一些方面，将培养基的温度升高至约95℃。在其他方面，将培养基的温度升高至约102℃。在一个变型中，将培养基的温度升高至至少约85℃至约120℃之间并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在另一变型中，将培养基的温度升高至约85℃至约120℃；约87℃至约118℃；约89℃至约116℃；约91℃至约114℃；约93℃至约112℃；约95℃至约110℃；约97℃至约108℃；约99℃至约106℃；约101℃至约104℃；约85℃至约118℃；约85℃至约116℃；约85℃至约114℃；约85℃至约112℃；约85℃至约110℃；约85℃至约108℃；约85℃至约106℃；约85℃至约104℃；约85℃至约102℃；约85℃至约100℃；约85℃至约98℃；约85℃至约96℃；约85℃至约94℃；约85℃至约92℃；约85℃至约90℃；约85℃至约88℃；约87℃至约120℃；约89℃至约120℃；约91℃至约120℃；约93℃至约120℃；约95℃至约120℃；约97℃至约120℃；约99℃至约120℃；约101℃至约120℃；约103℃至约120℃；约105℃至约120℃；约107℃至约120℃；约109℃至约120℃；约111℃至约120℃；约113℃至约120℃；约115℃至约120℃；约117℃至约120℃；约85℃或86℃或88℃或90℃或92℃或94℃或96℃或98℃或100℃或102℃或104℃或106℃或108℃或110℃或112℃或114℃或116℃或118℃或120℃中之一；至少约85℃或86℃或88℃或90℃或92℃或94℃或96℃或98℃或100℃或102℃或104℃或106℃或108℃或110℃或112℃或114℃或116℃或118℃以及不超过约120℃中之一并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在任一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，将培养基温度冷却至约15℃至约40℃之间，以用于多肽产生。
在温度保持时间(temperature holding time)保持热处理温度，以灭活培养基中的病毒。温度保持时间是足以灭活病毒的时间量。在任一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约1秒。在另一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约2秒、3秒、4秒。又在另一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约5、8、10、12、14、16、18或20秒。又在另一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约5、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60秒。在一些方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为10秒。在其他方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为2秒。在另一变型中，足以灭活培养基中病毒的时间量为约1至约60秒；约2至约58秒；约6至约54秒；约10至约50秒；约14至约46秒；约18至约42秒；约22至约38秒；约26至约34秒；约30至约34秒；约1至约56秒；约1至约52秒；约1至约48秒；约1至约44秒；约1至约40秒；约1至约36秒；约1至约32秒；约1至约28秒；约1至约22秒；约1至约18秒；约1至约14秒；约1至约10秒；约1至约6秒；约1至约3秒；约4至约60秒；约8至约60秒；约12至约60秒；约16至约60秒；约20至约60秒；约24至约60秒；约28至约60秒；约32至约60秒；约36至约60秒；约40至约60秒；约44至约60秒；约48至约60秒；约52至约60秒；约56至约60秒；约1或2或4或6或8或10或12或14或16或18或20或22或24或26或28或30或32或34或36或38或40或42或44或46或48或50或52或54或56或58或60秒中之一；至少约1或2或4或6或8或10或12或14或16或18或20或22或24或26或28或30或32或34或36或38或40或42或44或46或48或50或52或54或56或58以及不超过约60秒中之一。在其他方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约1分钟。在另一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约2.5分钟。又在另一方面，足以灭活培养基中病毒的时间量为至少约3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5或11分钟。在另一变型中，足以灭活培养基中病毒的时间量为约1至约11分钟；2至约10分钟；4至约8分钟；约1至约10分钟；约1至约8分钟；约1至约6分钟；约1至约4分钟；约1至约2分钟；约2至约11分钟；约4至约11分钟；约6至约11分钟；约8至约11分钟；约1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11分钟中之一；至少约1或2或3或4或5或6或7或8或9或10以及不超过约11分钟中之一。
b)传染原
本发明提供了灭活培养基中病毒和/或外源性因子的方法，包括将培养基进行热处理。病毒可以是本文中详述的任一病毒(例如，细小病毒)，并且细胞培养基可以是本文中详述的任一细胞培养基，例如具有表1中详述组分的培养基。在热处理期间，在细胞培养基中灭活的病毒可以是在工业上与产品生产(例如，多肽、细胞、组织)相关的任一病毒。工业上相关的病毒是本领域技术人员已知的。工业上相关的病毒的非限制性实例为：细小病毒科、paramyoxviradae、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、杯状病毒科和小RNA病毒科。在本文说明书中，病毒种类的正式命名(例如，细小病毒科)与不太正式的命名(例如，细小病毒)可互换使用。应当理解，上述两种命名均指相同的病毒种类(即，细小病毒科包括与细小病毒相同的病毒种类)。在一个变型中，病毒是无包膜病毒。在一些方面，无包膜病毒包括但不限于单链DNA病毒、双链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒。在另一方面，无包膜病毒包括但不限于，细小病毒、呼肠孤病毒或小RNA病毒。在一个变型中，病毒是有包膜病毒。在一些方面，包膜病毒包括但不限于，单链DNA病毒、双链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒。在另一方面，包膜病毒包括但不限于，反转录病毒、疱疹病毒或嗜肝DNA病毒。在本发明的任一变型中，病毒选自腺病毒、非洲猪瘟系病毒(Africanswine fever-line virus)、沙粒病毒(arenavirus)、动脉炎病毒(arterivirus)、星形病毒(astrovirus)、杆状病毒(baculovirus)、杆状DNA病毒属(badnavirus)、杆状RNA病毒属(barnavirus)、双RNA病毒(birnavirus)、雀麦花叶病毒(bromovirus)、布尼亚病毒(bunyavirus)、杯状病毒(calicivirus)、毛状病毒组(capillovirus)、香石竹潜病毒组(carlavirus)、花椰菜花叶病毒(caulimovirus)、圆环病毒(circovirus)、线形病毒组(closterovirus)、豇豆花叶病毒组(comovirus)、冠状病毒(coronavirus)、cotricovirus、囊状病毒(cystovirus)、丁型肝炎病毒(deltavirus)、香石竹环斑病毒组(dianthovirus)、豌豆耳突花叶病毒属(enamovirus)、线状病毒(filovirus)、黄病毒属(flavivirus)、真菌传杆状病毒组(furovirus)、福塞尔噬菌体属(fusellovirus)、双生病毒群(geminivirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)、疱疹病毒(herpesvirus)、大麦病毒(hordeivirus)、减毒病毒(hypovirus)、ideaovirus、丝状病毒(inovirus)、虹彩病毒(iridovirus)、轻小病毒(levivirus)、脂毛病毒(lipothrixvirus)、黄矮病毒组(luteovirus)、玉米褪绿斑驳病毒属(machlomovirus)、marafivovirus、微小病毒属(microvirus)、肌病毒(myovirus)、坏死病毒组(necrovirus)、野田村病毒(nodavirus)、正粘液病毒(orthomyxovirus)、乳多空病毒(papovavirus)、副黏病毒(paramyxovirus)、分病毒(partitivirus)、细小病毒(parvovirus)、藻DNA病毒(phycodnavirus)、小RNA病毒(picornavirus)、plamavirus、短尾病毒(podovirus)、多DNA病毒(polydnavirus)、马铃薯X病毒组(potexvirus)、马铃薯Y病毒组(potyvirus)、痘病毒(poxvirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、反转录病毒(retrovirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、根前毛菌噬菌体属(rhizidiovirus)、sequevirus、长尾病毒(siphovirus)、南方菜豆花叶病毒组(sobemovirus)、复层病毒(tectivirus)、细病毒组(tenuivirus)、四病毒(tetravirus)、tobamavirus、烟草脆裂病毒组(tobravirus)、披膜病毒(togavirus)、番茄丛矮病毒组(tombusvirus)、全病毒(totivirus)、发样病毒属(trichovirus)、芜菁黄花叶病毒组(tymovirus)和伞形植物病毒属(umbravirus)。在一些方面，病毒包括但不限于，兽疫出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus)(EHDV)、小鼠细小病毒(mice minute virus)(MMV)、小鼠细小病毒1型(mouse parvovirus-1)(MPV)、卡什谷病毒(cache valley virus)、囊病毒2117(Vesivirus2117)、猪环状病毒(porcine circovirus)(PCV 1)、猪环状病毒2型(porcine circovirus 2)(PCV 2)、犬细小病毒(canine parvovirus)(CPV)、牛细小病毒(bovine parvovirus)(BPV)或蓝舌病病毒(blue tongue virus)(BTV)。在特定的方面，病毒是细小病毒例如鼠细小病毒。在一个变型中，本发明提供了灭活细胞培养基中亚病毒感染因子的方法，包括将培养基进行热处理。在一些方面，亚病毒感染因子是类病毒或随体(satellite)。在另一变型中，本发明提供了灭活细胞培养基中病毒样因子的方法，包括将培养基进行热处理。
在另一变型中，本发明提供了灭活细胞培养基中传染原的方法，包括将培养基进行热处理。在一些方面，传染原是细菌。在另一方面，细菌是支原体。在另一方面，传染原是小至足以穿过滤器，包括本文中所述的任一滤器的细菌。在另一方面，传染原是真菌。又在另一方面，传染原是寄生虫。仍又在另一方面，传染原是传染原的组分。本领域技术人员应当理解，传染原的组分可以是来源于细胞培养基中不想要的传染原的任意组分。
仍在另一变型中，本发明提供了灭活细胞培养基中外源性因子的方法，包括将培养基进行热处理。本领域技术人员应当理解，易于通过热处理而失活的任一外源性因子都可以使用本文中详述的任一细胞培养基例如具有表1中详述组分的培养基，通过本文中详述的任一方法灭活。在任一变型中，在HTST处理期间，至少一种或多种类型的传染源和/或外源性因子在细胞培养基中是失活的。在一些方面，一种或多种类型的传染源和/或外源性因子是病毒、亚病毒感染因子、病毒样因子、细菌、真菌、寄生虫或传染源和/或外源性因子的组分。在任一变型中，热处理是HTST处理。本领域技术人员应当理解，本文中详述的通过热处理灭活传染源和/或外源性因子的任一方法包括将任一细胞培养基如具有表1中详述组分的培养基进行本文中详述的任一HTST处理。
可以通过本领域技术人员已知的测定法测量病毒的灭活。例如，通过测量或评估活性病毒的给定对数减少值(LRV)来测定病毒灭活。在一个方面，将大于95℃的温度使用HTST处理2秒的细胞培养基中病毒量大于或等于3的对数减少值测定为灭活了培养基中的病毒。在另一方面，将在100℃温度使用HTST处理60秒的细胞培养基中病毒量约3的对数减少值测定为灭活了培养基中的病毒。在任一方面，病毒量是MVM载量。
c)热处理系统
可以将本领域技术人员已知的热处理细胞培养基以用于灭活传染原的方法，例如Schleh,M.等人2009.Biotechnol.Prog.25(3):854-860和Kiss,R.2011.PDA J Pharm Sciand Tech.65:715-729中所述的方法(将所述公开以其整体并入本文作为参考)用于热处理本文中详述的任一细胞培养基，例如具有表1中详述组分的培养基。例如，将高温瞬时(HTST)处理用于灭活病毒的生产工艺。在一个变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在另一变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。又在另一变型中，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，包括将细胞培养基进行HTST处理，其中培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH，并且包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。HTST处理可以包括HTST循环，其中将细胞培养基从环境温度或37℃加热至约102℃，其中使细胞培养基在102℃保持约10秒的温度保持时间，并且然后将细胞培养基冷却至约环境温度或约37℃。在一些方面，环境温度为约15℃至约30℃之间。在其他方面，环境温度为约18℃至约25℃之间。HTST处理可以是使用两个热交换器的连续流程，一个用于加热液体并且一个用于冷却液体，之间的管道系统为给定的流速提供期望的温度保持时间。在一个方面，细胞培养基中病毒的灭活包括将细胞培养基进行一个HTST处理循环。在另一方面，细胞培养基中病毒的灭活包括将细胞培养基进行至少两个或多个HTST处理循环。在一个方面，流速为100LPM。在另一方面，流速为125LPM。又在另一方面，流速可以是适合于提供用于病毒和/或外源性因子灭活的合适的温度和该温度下保留时间的任一流速。在任一方面，将细胞培养基从约37℃加热至约102℃，其中将细胞培养基在102℃保持足以灭活病毒的时间量，并且然后将细胞培养基冷却至约37℃。在另一方面，足以灭活病毒的时间量为约10秒。在任一方面，足以灭活病毒的时间量是如本文中详述的任一温度保持时间。在任一方面，在温度保持时间期间灭活病毒的温度是本文中详述的任一温度。在一个方面，灭活病毒的温度为约85℃至约120℃之间。在一个变型中，将细胞培养基从约15℃加热至102℃，其中在约10秒的温度保持时间期间将细胞培养基保持在102℃，并且然后将细胞培养基冷却至约37℃。在另一变型中，将细胞培养基从约37℃加热至约102℃，其中在约10秒的温度保持时间期间将细胞培养基保持在102℃，并且然后将细胞培养基冷却至约37℃。
对于HTST处理，可以通过用于HTST处理的设备处理约0.5至约20,000升(L)之间体积的细胞培养基，以灭活病毒。本领域技术人员应当理解，可以使用本文中详述的任一细胞培养基如具有表1中详述组分的培养基，通过本文中详述的任一方法中的用于HTST处理的设备处理小于约0.5L或者大于约20,000L的细胞培养基体积。在一个方面，可以在一个HTST操作中处理约0.5L至约20,000L之间的细胞培养基体积。在其他方面，可以在至少两个或多个HTST操作中处理约0.5L至约20,000L之间的细胞培养基体积。如本文中所用，术语“HTST操作”可以指这样的处理，其中在用于HTST处理的设备(例如，HTST skid)中，将指定量的培养基进行至少一个循环(例如，加热、保持、冷却)的HTST处理。本领域技术人员应当理解，可将用于HTST处理的任一设备，例如HTST skid用于本文中详述的任一细胞培养基，如具有表1中详述组分的培养基。在一个方面，HTST操作可以包括连续处理约0.5L至约20,000L之间的至少一个或多个细胞培养基体积。在另一方面，HTST操作包括批处理约0.5L至约20,000L的至少一个或多个细胞培养基体积。在任一方面，至少一个或多个细胞培养基体积可以是相同类型的细胞培养基(例如，培养基1)。在任一方面，至少一个或多个细胞培养基体积可以是至少一种或多种类型的细胞培养基(例如，培养基1和培养基2)。在本文中详述的方法的任一方面，可以通过用于HTST处理的设备处理至少约0.5L的细胞培养基体积，以灭活病毒。在另一方面，通过用于HTST处理的设备处理至少约2L的细胞培养基体积，以灭活病毒。又在另一方面，持续足够的时间灭活至少约5、10、50、100、500、1000、5000、10000或15000升。在一些方面，通过用于HTST处理的设备处理2L的细胞培养基体积，以灭活病毒。在其他方面，通过用于HTST处理的设备处理12000L的细胞培养基体积，以灭活病毒。在另一变型中，通过用于HTST处理的设备处理约0.5至约20000；约2至约18000；约10至约16000；约20至约14000；约40至约12000；约80至约10000；约100至约8000；约200至约6000；约400至约4000；约800至约2000；约0.5至约18000；约0.5至约16000；约0.5至约14000；约0.5至约12000；约0.5至约10000；约0.5至约8000；约0.5至约6000；约0.5至约4000；约0.5至约2000；约0.5至约800；约0.5至约600；约0.5至约400；约0.5至约200；约0.5至约100；约0.5至约50；约0.5至约20；约0.5至约10；约0.5至约5；约0.5至约2；约2至约20000；约10至约20000；约100至约20000；约500至约20000；约1000至约20000；约1500至约20000；约2000至约20000；约5000至约20000；约1000至约20000；约15000至约20000；约1750至约20000升；约0.5或2或10或100或1000或10000或20000升中之一；至少约0.5或2或10或100或1000或10000以及不超过约20000升中之一的细胞培养基体积，以灭活病毒。
本领域技术人员已知在细胞培养基处理期间灭活病毒的方法，例如Kiss,R.2011.PDA J Pharm Sci and Tech.65:715-729中所述的方法，所述公开在本文中以其整体并入本文作为参考，并可以将该方法用于与本文中详述的任一细胞培养基如具有表1中详述组分的培养基的HTST处理组合。例如，可以在生产加工中将高温瞬时(HTST)处理与至少一种或多种病毒屏障(virus barrier)处理组合，以从细胞培养基中去除病毒。在一些方面，一种或多种病毒屏障处理包括但不限于，加热灭菌、UV光暴露、γ照射和过滤。在一些方面，病毒屏障处理是过滤。本发明提供了在进行HTST处理的细胞培养基中去除和/
或灭活病毒的方法，其中在细胞培养基进行HTST处理后，在一个步骤中通过过滤从细胞培养基中去除病毒。在一些方面，过滤是超滤。在超滤之前，将一种或多种培养基组分例如表1中列出的组分加入到进行了HTST处理的细胞培养基中。在一些方面，在超滤之前，将一种或多种培养基组分如痕量金属(例如，铁或铜)加入到进行了HTST处理的细胞培养基中。
超滤膜可以形成自再生的纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏氟乙烯(PVDF)等。代表性超滤膜包括但不限于，
Figure BDA0003929499940000281
膜、
Figure BDA0003929499940000282
Pro膜、
Figure BDA0003929499940000283
180膜、
Figure BDA0003929499940000284
70膜、
Figure BDA0003929499940000285
NFP膜、
Figure BDA0003929499940000286
NFR膜、RetroporeTM膜、Virosart CPV膜、Planova 75膜、Planova 35膜、Planova 20膜、Planova15N膜、VAG 300膜、Ultipor DVD膜、Ultipor DV50膜、Ultipor DV20膜，以及DVD Zeta Plus VRTM滤器。在一些方面，超滤膜能去除细胞病毒颗粒。在一些方面，超滤膜是细小病毒截留膜。
超滤膜的孔径应当足够小从而能截留不想要的病毒颗粒，同时允许水溶液中一种或多种蛋白质穿过膜。在本发明的一些实施方案中，超滤膜的孔径为小于10nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm或200nm。在一些实施方案中，超滤膜的孔径为20nm或以下。
超滤膜的特征在于截留分子量，其表示超滤膜截留的最小蛋白质的平均分子量。例如，具有1000kD截留分子量的超滤膜可以以80-90％的比率截留分子量超过1000kD的大多数球状蛋白质，而分子量小于1000kD的大多数球状蛋白质都可以通过超滤膜。在本发明的一些方面，超滤膜的截留分子量为200kD至1000kD之间。在本发明的一些方面，超滤膜具有200kD、300kD、400kD、500kD、600kD、700kD、900kD或1000kD的截留分子量。
通过死端(正常)流过滤(NFF)或切向流过滤(TFF)，可以使一种或多种超滤膜影响过滤。在NFF中，进料流穿过膜，并且大分子量物质被捕获在滤器中，而滤出液在另一端释放。在TFF中，绝大多数进料流切向经过滤器表面，而不是穿过滤器。因此，在过滤加工期间，充分地冲洗了滤饼，延长了过滤装置可以运行的时间。可以以筒式(NFF)如
Figure BDA0003929499940000291
NFP病毒滤器或者以盒式(对于TFF)如
Figure BDA0003929499940000292
盒提供任一过滤模式的超滤膜。在优选的实施方案中，过滤是正常流过滤。
在本发明的工艺中可以使用一个以上的超滤膜。在一些实施方案中，一个以上的超滤膜与水溶液平行接触。可将一种以上的病毒屏障处理与HTST处理的组合用于处理本文中公开的任一细胞培养基如具有表1中详述组分的细胞培养基，以用于蛋白质和多肽治疗剂的工业规模产生。
在用于灭活传染原的HTST处理期间使用的细胞培养基可以是HTST相容性培养基或者HTST不相容性培养基。如本文中所用，术语“HTST相容性培养基”可以指在HTST处理期间具有减少的或者没有沉淀的细胞培养基。如本文中所用，术语“HTST不相容性培养基”可以指在HTST处理期间具有可测量的或者可检测的沉淀的细胞培养基。在一个变型中，本发明提供了在HTST处理期间筛选用于病毒灭活的HTST相容性细胞培养基的方法，其中与HTST不相容性培养基中的沉淀比较，HTST相容性培养基具有减少的沉淀。在一个方面，在HTST处理期间，与HTST不相容性就培养基中形成的沉淀比较，HTST相容性细胞培养基没有沉淀。在任一变型中，在HTST处理后，与HTST不相容性培养基比较，HTST相容性培养基具有更高水平的痕量金属。在一个方面，痕量金属是选自铁或铜的至少一种或多种痕量金属。在任一变型中，与另一HTST相容性培养基比较，HTST相容性培养基具有较低水平的痕量金属。在一个方面，痕量金属是选自铁或铜的至少一种或多种痕量金属。本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法。在一个变型中，本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法，其中如表1中所详述，调整细胞培养基组分。在另一变型中，本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法，其中使用如实施例2中所详述的响应面，调整细胞培养基组分。在一个变型中，本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法，其中将培养基的pH调整至约pH 5.0至约pH6.9之间。在另一变型中，本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法，其中将培养基的pH调整至约pH 5.0至约pH 7.2之间。在一些方面，将HTST不相容性培养基的pH调整至pH 5.3至约pH 6.3之间，以将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基。在另一方面，将HTST不相容性培养基的pH调整至pH 6.0，以将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将HTST不相容性培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使HTST不相容性培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一方面，在HTST处理后，然后使HTST不相容性培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将HTST不相容性培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 7.2之间。在变型中，本发明提供了将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的方法，其中将培养基中磷酸盐和钙的总量调整至小于约10mM。在另一方面，将HTST不相容性培养基中总的磷酸盐和钙的浓度调整至小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，将HTST不相容性培养基中磷酸盐和钙的总量调整至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将HTST不相容性培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。
d)沉淀物形成的减少
在一个变型中，本发明提供了在用于灭活病毒的热处理期间，减少细胞培养基中沉淀的方法。该方法包括调整进行热处理的细胞培养基中钙、磷酸盐和pH中的一种或多种水平。在一个方面，热处理是HTST处理。在一个变型中，本发明提供了在用于灭活病毒的热处理期间，减少细胞培养基中沉淀的方法；其中该培养基在HTST处理期间具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在另一变型中，本发明提供了在用于灭活病毒的HTST处理期间，减少细胞培养基中沉淀的方法；其中该培养基在HTST处理期间具有约pH 5.0至约pH 7.2之间的pH。在一些方面，培养基在HTST处理期间具有约pH 5.3至约pH 6.3之间的pH。在其他方面，培养基在HTST处理期间具有约pH 6.0的pH。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 7.2之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一方面，在HTST处理后，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在一个变型中，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，培养基的pH为约pH 5.0至约pH 7.2之间。在另一变型中，本发明提供了在用于灭活病毒的HTST处理期间减少细胞培养基中沉淀的方法，包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在HTST处理期间，将培养基中总的磷酸盐和钙的浓度限制至小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。又在另一变型中，本发明提供了在用于灭活病毒的HTST处理期间减少细胞培养基中沉淀的方法，其中该培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH，并且包括在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在HTST处理期间，将培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.0之间，并将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，并将培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。
在本发明的一些方面，在本文中详述的任一培养基如具有表1中详述的特定组分的培养基在用于灭活传染原的HTST处理期间减少了沉淀。在一个方面，当与在HTST处理期间缺少特定培养基组分的相同培养基中存在的沉淀的量比较时，培养基中的特定组分使沉淀减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。可以使用本领域熟知的技术进行培养基中沉淀量的定量测定。在一个变型中，本发明提供了在进行HTST处理的细胞培养基中减少沉淀的方法，其中该培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9的pH，并且当与在HTST处理期间不具有约pH 5.0至约pH6.9的pH的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。在一个方面，培养基在HTST处理期间具有约pH5.3至约pH 6.3的pH，并且当与在HTST处理期间不具有约pH 5.3至约pH 6.3的pH的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。在另一方面，培养基在HTST处理期间具有约pH 6.0的pH，并且当与在HTST处理期间不具有约pH 5.3至约pH 6.0的pH的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。在一个变型中，本发明提供了在细胞培养基中减少沉淀的方法，包括在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM，并且当与在HTST处理期间其中磷酸盐和钙的总量大于约10mM的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。在一个方面，在HTST处理期间，培养基中磷酸盐和钙的总浓度为小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM，并且当与在HTST处理期间其中磷酸盐和钙的总浓度不低于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。在一个变型中，本发明提供了在进行HTST处理的细胞培养基中减少沉淀的方法，其中该培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9的pH，并且该方法包括在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM，并且当与在HTST处理期间不具有约pH 5.0至约pH 6.9的pH并且其中磷酸盐和钙的总量大于约10mM的培养基中的沉淀比较时，该培养基使沉淀减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中之一。
本文中详述的任一方法的传染原可以是本文中详述的任一病毒(例如，细小病毒)，并且该方法的培养基可以是本文中详述的任一培养基，例如具有表1中详述组分的培养基。B.减少用于热处理的设备结垢的方法
本发明提供了减少用于HTST处理以灭活细胞培养基中病毒的设备结垢的方法。本发明人发现，调整进行HTST处理的细胞培养基中特定组分或参数的水平可以减少用于HTST处理以灭活病毒的设备结垢。可将本文中详述的任一细胞培养基例如具有表1中详述组分的培养基用于本文中详述的减少用于HTST处理以灭活病毒的设备结垢的任一方法。在本文中详述的任一方法中，污垢包括用于HTST处理的设备上的沉淀。
在一个变型中，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢的方法，方法包括将设备中使用的细胞培养基进行HTST处理，其中在HTST处理期间，该培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在一个方面，在HTST处理期间，该培养基具有约pH 5.3至约pH 6.3之间的pH。在另一方面，在HTST处理期间，该培养基具有约pH 6.0的pH。又在另一方面，污垢包括用于HTST处理的设备上的沉淀。在任一方面，HTST处理包括将温度升高至至少约85℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在另一方面，将培养基的温度升高至至少约93℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。又在另一方面，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101或103℃并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在一个变型中，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢的方法，该方法包括在HTST处理期间，将在设备中使用的细胞培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一个方面，在HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在另一方面，污垢包括用于HTST处理的设备上的沉淀。
在任一方面，与HTST不相容性培养基比较，当使用HTST相容性培养基时，减少了用于HTST处理的设备的结垢。在一个方面，HTST相容性培养基包括在HTST处理期间约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在另一方面，HTST相容性培养基包括总量少于约10mM的磷酸盐和钙。又在另一方面，在HTST处理期间，HTST相容性培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH以及总量少于约10mM的磷酸盐和钙。HTST相容性培养基是本文中详述的任一细胞培养基，例如具有表1中详述组分的培养基。
用于测量和监测用于生产加工的多种设备结垢的方法是本领域技术人员已知的，例如Awad,M.2011.Heat Transfer:Theoretical Analysis,ExperimentalInvestigations and Industrial Systems.Chapter 20,page 505-542中描述的方法，将所述公开在此处以其整体并入本文作为参考，并且可以将其用于监测和测量设备的结垢，所述设备用于HTST处理本文中公开的任一细胞培养基，如具有表1中详述组分的培养基和实施例中详述的培养基。例如，可以通过测量对于达到目标培养基温度设定点所需的热交换器蒸汽压力的改变或者通过测量达到的温度的改变(降低)来测量设备结垢。在任一方面，污垢包括用于HTST处理的设备上的沉淀。在一个方面，由于使用HTST不相容性培养基，易于结垢的一种或多种设备包括但不限于HTST skid、热交换器、管道系统、过滤装置以及滤膜。
C.使用经热处理的细胞培养基产生多肽的方法
a)细胞
可以将提供的方法和组合物应用于适合于在本文中所述的培养基中生长和/或产生多肽(例如，抗体)的任一细胞，包括动物、酵母或昆虫细胞。在一个方面，可应用本方法和组合物的细胞是适合于细胞培养和表达多肽的任一哺乳动物细胞或细胞类型。因此，本文中提供的方法(例如，灭活细胞培养基中病毒的方法)和组合物可以应用于任一合适类型的细胞，包括动物细胞。在一个方面，本方法和组合物应用于哺乳动物细胞。本方法和组合物还可以应用于杂交瘤细胞。在一个变型中，哺乳动物细胞是非杂交瘤哺乳动物细胞，已经用外源的编码想要的多肽如抗体、抗体片段(包括配体结合片段)和嵌合抗体的分离核酸转化所述细胞。在一个变型中，本方法和组合物所应用的哺乳动物细胞选自人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(293或在悬浮培养中生长的亚克隆293细胞，Graham等人,J.GenVirol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4 cells；以及人肝癌细胞(Hep G2)。在特定的变型中，将本方法和组合物应用于CHO细胞。在特定的变型中，使用CHO细胞系培养，并从CHO细胞系中表达多肽(例如，抗体)。多肽(例如，抗体)可以分泌到本文中公开的培养基中，其中可以分离和/或纯化多肽，或者可以通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞，将多肽释放到本文中公开的培养基中。
适用于在重组脊椎动物细胞中合成目的多肽的方法、载体和宿主细胞是本领域技术已知的，并且例如描述于Gething等人,Nature,293:620-625(1981)；Mantei等人,Nature,281:40-46(1979)；Levinson等人；EP 117,060；和EP 117,058中。用于哺乳动物细胞培养表达多肽的的特别有用的质粒是pRK5(P pub.no.307,247)或pSVI6B(1991年6月13日公布的CT pub.no.WO 91/08291)。
用表达或克隆载体转化宿主细胞，并在改良为适合用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码想要的序列的基因的营养培养基中培养。对于哺乳动物细胞，优选的是Graham和van der Erb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法或Hawley-Nelson,Focus15:73(1193)的阳离子脂质体法(lipofectamine.TM)(Gibco BRL)。本领域已知哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面，并例如由Axel描述于1983年8月16日发行的美国专利号4,399,216中。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见例如Keown等人,Methods inEnzymology(1989)、Keown等人,Methods in Enzymology,185:527-537(1990)，以及Mansour等人,Nature,336:348-352(1988)。
本发明的方法和组合物还包括使用在细胞培养物中分泌单克隆抗体的杂交瘤。通过从经免疫的动物回收免疫细胞(一般是脾细胞或来自淋巴结组织的淋巴细胞)，以常规的方式永生化细胞(例如可以通过与骨髓瘤细胞融合或者通过埃巴(EB)病毒转化进行)，并筛选表达想要的抗体的克隆来制备单克隆抗体。已经将最初由Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.,6:511(1976)描述，以及也由Hammerling等人,In:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,pp.563-681(1981)描述的杂交瘤技术广泛地应用于产生杂交细胞系，其分泌针对许多特异性抗原的高水平的单克隆抗体。
b)多肽
通过本文中详述的组合物(例如，细胞)和方法产生的并且在本文中提供的组合物中存在的多肽可以是与宿主细胞同源的，或者优选地可以是外源的，这意为它们对所使用的宿主细胞是异源的，即外来的，例如通过中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白质或者通过哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在一个变型中，多肽是通过宿主细胞直接分泌到培养基中的哺乳动物多肽(例如抗体)。在另一变型中，通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞，将多肽释放到培养基中。
在一个变型中，多肽是氨基酸的序列，其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构。在一个方面，多肽具有至少约5-20kD，备选地至少约15-20kD，优选地至少约20kD的分子量。
根据本公开，可以根据本公开产生可在宿主细胞中表达的多肽，并且其存在于所提供的组合物中。多肽可以由宿主细胞内源的基因或者通过基因工程引入到宿主细胞的基因表达。多肽可以是天然存在的多肽，或者可以备选地具有通过人工改造的或者选择的序列。经改造的多肽可以由天然单独存在的其他多肽区段组装，或者可以包括非天然存在的一个或多个区段。
通常基于感兴趣的生物学或化学活性选择期望根据本发明表达的多肽。例如，可将本发明用于表达任一制药或商业相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合因子等。
可以根据本文中提供的方法产生各种多肽，并且其存在于本文中提供的组合物中。细菌多肽的实例包括例如，碱性磷酸酶和β-内酰胺酶。哺乳动物多肽的实例包括以下分子：如肾素、生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和vonWillebrands factor；抗-凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物如尿激酶或者人尿型或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(调节正常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒管抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；前松弛素(prorelaxin)；小鼠促性腺素关连肽；微生物蛋白质如β-内酰胺酶；DNase；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨来源的神经生长因子(BDNF),神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的蛋白质；转运蛋白；归巢受体；addressing；调节蛋白；抗体；以及任一上面列出的多肽的片段。
抗体是可以根据本文中提供的方法产生的哺乳动物多肽的实例，并且其可以存在于提供的组合物中。抗体是对特定抗原表现出结合特异性的优选的一种多肽。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每一轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量是不同的。每一重链和轻链还具有规律性间隔的链内二硫键。每一重链在一端具有可变域(V.sub.H)，然后是若干恒定域。每一轻链在一端具有可变区(V.sub.L)，而恒定区在其另一端；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐排列；并且轻链可变域与重链的可变域对齐排列。认为特定的氨基酸残基形成了轻链和重链可变域之间的界面。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，基于免疫球蛋白折叠，其具有不同的结构。例如，IgG抗体具有通过二硫键连接的两个“重”链和两个“轻”链，以形成有功能的抗体。每一重链和轻链自身包含“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区决定了抗体的抗原结合特异性，而C区在与免疫效应物非抗原特异性相互作用中提供了结构支持并起作用。抗体的抗原结合特异性或抗体的抗原结合片段是抗体特异性结合特定抗原的能力。
可以通过V区的结构特征测定抗体的抗原结合特异性。在涵盖110个氨基酸跨度的可变域，变异性并不是均匀分布的。相反，V区由相对不变的称为构架区(15-30个氨基酸)的一段序列组成，该构架区由称为“高变区”的高度变异性较短区域(每一区域长9-12个氨基酸)分隔。天然重链和轻链的可变区都包含通过三个高变区连接的四个FR，该高变区形成环连接，该FR主要采用β-折叠构型，并且在一些情况下形成部分的β-折叠结构。每一链中的高变区通过FR紧密邻近地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起帮助形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域区并不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出多种效应子功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
每一V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，每一CDR含有“高变环”)，以及四个构架区。因此，抗体结合位点(用基本的亲和力与特定期望的抗原结合所需的最小结构单元)通常包括三个CDR和至少三个，优选地四个构架区，该构架区散布在该CDR之间以使CDR维持合适的构型。经典的四链抗体具有通过VH和VL协作限定的抗原结合位点。某些抗体如骆驼和鲨鱼抗体缺少轻链，并仅依赖于通过重链形成的结合位点。可以制备经改造的单结构域免疫球蛋白，其中在不存在VH和VL之间的协作的情况下，仅通过重链或轻链形成结合位点。
术语“可变的”指抗体中可变域的某些部分在序列上大量不同的事实，其用于每一特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不是均匀分布在整个抗体的可变域中的。在轻链和重链可变域中，其都集中在称为高变区的三个区段。可变区中更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区都包含由三个高变区形成环连接而连接起来的四个FR，其主要采用β-折叠构型，并且在一些情况下形成部分的β-折叠结构。每一链中的高变区通过FR以紧密邻近的方式结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出多种效应子功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
当在本文中使用时，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)左右，以及VH中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)左右()Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或那些来自“高变环”(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))的残基。
如本文中所定义，“构架”或“FR”残基是那些除高变区以外的可变区残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生了称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段(每一片段具有单个抗原结合位点)，以及残基“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点的F(ab')2片段，其仍能交联抗原。
“Fv”是含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由紧密的、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域形成的二聚体组成。在该构型中，每一可变域的三个高变区相互作用，限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，六个高变区赋予抗体的抗原结合特异性。然而，尽管比整个结合位点的亲和力更低，但甚至单个可变域(或者Fv的一半，即仅包含对抗原特异的三个高变区)也具有识别和结合抗原的能力。
Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。通过在重链CH1结构域的羧基端添加几个残基而导致Fab’片段与Fab片段不同，该残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。在本文中Fab'-SH指代了Fab'，其中恒定域的半胱氨酸残基携带了至少一个游离的巯基。F(ab')2抗体片段最初产生为Fab'片段对，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
基于抗体轻链恒定区的氨基酸序列，可将来自任一脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”归属为两种明确不同类型(称为κ和λ)之一。
取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体指定为不同的种类。完整抗体有5种主要的种类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，可将其中的一些种类进一步划分成亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于抗体不同种类的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接体，其能使scFv形成抗原结合的期望结构。对于scFv的综述，参见Plückthun在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上两个结构域之间配对的连接体，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并生成两个抗原结合位点。例如在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更详细地描述了双抗体。
出于本文中的目的，“完整抗体”是包含重链可变域和轻链可变域以及Fc区的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或者其氨基酸序列变型。优选地，完整抗体具有一个或多个效应子功能。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其包含两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链。每一轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而在不同免疫球蛋白同种型的重链中，二硫键的数目是不同的。每一重链和轻链还具有规律性间隔的链内二硫键。每一重链在一端具有可变域(VH)，然后是若干恒定域。每一轻链在一端具有可变域(VL)，并且恒定域在其另一端；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对其排列，并且轻链可变域与重链的可变域对其排列。认为特定的氨基酸残基形成了轻链可变域和重链可变域之间的界面。
“裸抗体”是不与异源分子如细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体(如在本文中所定义)。
抗体靶向目的抗原。优选地，抗原是生物学重要的多肽，并且向患疾病或病症的个体施用抗体可以在哺乳动物中导致治疗益处。然而，还可以使用靶向非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂类抗体；参见美国专利号5,091,178)的抗体。
在抗原是多肽的情况下，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。示例性抗原包括分子如肾素、生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和von Willebrands factor；抗-凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物如尿激酶或者人尿型或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(调节正常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒管抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；前松弛素；小鼠促性腺素关连肽；微生物蛋白质如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨来源的神经生长因子(BDNF),神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质如CD3、CD4、CD8、CD18、CD19、CD20和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的蛋白质；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及任一上面列出的多肽的片段。
在本文中详述的抗体的优选分子靶标包括CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD18、CD19、CD20、CD34和CD40；ErbB受体家族的成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白包括其α或β亚基(如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子如VEGF；组织因子(TF)；α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。
可以通过本文中方法产生的抗体(包括其片段，还包其抗原结合片段)包括但不限于抗-HER2、抗体2C4、抗-VEGF、抗体C2B8、抗CD11a、抗-组织因子、IgG4b、抗-CD40、抗-CD20、抗-IgE、E25和E26、抗-PCSK9和抗-β7。
c)细胞生长和多肽产生
通常，细胞在促进任一细胞生长、维持和/或多肽产生的一个或多个条件下，与本文中所述的任一细胞培养基组合(接触)。培养细胞和产生多肽的方法使用培养容器(生物反应器)以含有细胞和细胞培养基。培养容器可以由适合于培养细胞的任一物质制成，其包括玻璃、塑料或金属。通常，培养容器可以是至少1升，并且可以使10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000升或更多。在培养工艺期间，可以调整培养条件，其包括但不限于pH和温度。
通常在有助于细胞培养物存活、生长和生存(维持)的条件下，使细胞培养物维持在初始生长阶段。精确的条件取决于细胞类型、细胞所来源的组织以及表达的多肽的性质和特征而变化。
可以主要基于细胞培养物保持存活的温度范围，来选择初始生长阶段细胞培养物的温度。例如，在初始生长阶段，CHO细胞在37℃生长良好。总之，大多数哺乳动物细胞在约25℃至40℃的范围内生长良好。取决于细胞的需求以及生产需求，本领域普通技术人员能选择合适的温度或者培养细胞的温度。
在本发明的一个实施方案中，将初始生长阶段的温度维持于单一的恒温。在另一实施方案中，将初始生长阶段的温度维持在一系列温度内。例如，可以在初始生长阶段稳定地增加或降低温度。备选地，可以在初始生长阶段，在不同时间使温度增加或降低非连续量。本领域普通技术人员能测定是否可以使用单个或者多个温度，并且是否可以稳定地或者非连续量地调整温度。
在初始生长阶段期间，可以培养细胞更长或者更短的时间量。在一个变型中，培养细胞一段时间，使其足以达到这样的活细胞密度，其是如果允许细胞不受干扰地生长最终可以达到的最大活细胞密度的给定百分比。例如，可以培养细胞一段时间，使其足以达到最大活细胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％的期望活细胞密度。
在另一个实施方案中，允许培养细胞限定的一段时间。例如，取决于细胞培养物的起始浓度、培养细胞的温度，以及细胞的固有生长速率，可以培养细胞0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或者更多天。在一些情况下，允许培养细胞一个月或更长。
为了增加细胞的氧合和营养物的分散，可以在初始生长阶段期间搅拌或振荡细胞培养物。根据本发明，本领域普通技术人员应当理解，在初始生长阶段期间，控制或调节生物反应器的某些内部条件，包括但不限于pH、温度、氧合等是有益的。例如，可以通过供应合适量的酸或碱控制pH，并且可以使用本领域熟知的喷射装置(sparging device)控制氧合。
初始培养步骤是生长阶段，其中改良了批次细胞培养条件，以促进重组细胞的生长，产生seed train。生长阶段通常指指数生长期，其中细胞通常快速分裂，例如生长。在该阶段期间，培养细胞一段时间，通常1至4天，例如1、2、3或4天，并且在该条件下，细胞生长是最佳的。对于特定的宿主细胞，宿主细胞的生长周期的测定可以通过本领域技术人员已知的方法测定。
在生长阶段，可以将基础培养基和细胞分批供应给培养容器。在一个方面，培养基含有小于约5％或者小于1％或者小于0.1％的血清以及其他动物来源的蛋白质。然而，根据需要，可以使用血清以及其他动物来源的蛋白质。在特定的变型中，在灭活病毒的HTST处理期间，基础培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9的pH。在一个方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在灭活病毒的HTST处理期间，将基础培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9之间。在另一方面，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一方面，在HTST处理后，然后使培养基的pH达到约pH6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽产生阶段。在另一特定的变型中，在灭活病毒的HTST处理期间，将基础培养基包含的磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一个方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在灭活病毒的HTST处理期间，将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后将培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。在另一变型中，在灭活病毒的HTST处理期间，基础培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9的pH和小于约10mM磷酸盐和钙的总量。在一个方面，在细胞培养的多肽产生阶段之前，在灭活病毒的HTST处理期间，将基础培养基的pH降低至约pH 5.0至约pH 6.9，并且其包含的磷酸盐和钙的总量少于约10mM。在另一方面，在细胞培养的多肽产生阶段期间，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，并且使培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。在任一方面，基础培养基是化学成分确知培养基。在任一方面，基础培养基是化学成分未确知培养基。可以使用欧洲专利EP 307,247或美国专利号6,180,401中指定范围的一倍或两倍的氨基酸、维生素、痕量元素以及其他培养基组分，所述文件在本文中以其整体并入本文作为参考。
备选地，市售培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基([MEM]，Sigma),RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium([DMEM]，Sigma)适合于培养动物细胞，并且可以用本文中详述的化学成分确知培养基组分补充(例如，通过使用提供的试剂盒)。此外，可将Ham和Wallace,Meth.Enz.,58:44(1979)、Barnes和Sato,Anal.Biochem.,102:255(1980)、美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利号Re.30,985；或美国专利号5,122,469(所述全部公开在本文中以其整体并入本文作为参考)中描述的任一培养基用作为宿主细胞的培养基，可以用本文中详述的化学成分确知培养基组分补充所述每一培养基(例如，通过使用提供的试剂盒)。
根据需要，还可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围在终浓度中存在的无机化合物)、痕量金属(如铁和铜),以及葡萄糖或等同的能源补充本文中提供的任一培养基。本领域技术人员已知还以合适浓度包括的任意其他必需补充物。
在细胞生长的特定点，细胞可以形成接种物，以在产生阶段中在开始培养时接种培养基。备选地，生产阶段可以与生长阶段连续。细胞生长阶段通常接着是多肽生产阶段。
在多肽生产阶段期间，在有助于细胞培养物存活和活力以及适合于表达期望多肽的第二组培养条件(与生长阶段比较)下维持细胞培养。例如，在随后的生产阶段期间，CHO细胞在25℃至35℃良好地表达重组多肽和蛋白质。可以应用多个非连续的温度改变，以增加细胞密度或活力或者增加重组多肽或蛋白质的表达。如本文中所述，术语“多肽生产阶段”或“蛋白质表达阶段”指其中细胞培养物产生生物药品(例如，多肽)的细胞培养阶段。
可以将细胞维持在随后的生产阶段，直到达到期望的细胞密度或产物滴度。在一个实施方案中，将细胞维持在随后的生产阶段，直到重组多肽的滴度达到最大。在其他实施方案中，可以在该点之前收获培养物。例如，可以将细胞维持一段时间，所述时间足以达到最大活细胞密度的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的活细胞密度。在一些情况下，期望的是允许活细胞密度达到最大，然后在收获培养物之前允许活细胞密度下降到一定水平。
在某些情况下，在随后的多肽生产阶段期间，用已经被细胞耗尽或代谢的营养物或其他培养基组分补充细胞培养物是有益的或者必需的。例如，在监测细胞培养期间，用观察到的已经耗尽的营养物或其他培养基组分补充细胞培养物是有利的。在一些方面，在随后的生产阶段之前，一种或多种耗尽的组分包括钙、磷酸盐、铁和铜。在一些方面，补充的培养基组分包括钙、磷酸盐、铁和铜。备选地或另外地，在随后的多肽生产阶段之前补充细胞培养物是有益的或者必需的。在一些方面，在随后的生产阶段之前，用一种或多种培养基组分包括钙、磷酸盐、铁和铜补充细胞培养物。作为非限制性实例，用激素和/或其他生长因子、特定的离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、痕量金属(如铁和铜)、氨基酸、脂质或葡萄糖或者其他能源补充细胞培养物是有益的或者必需的。
在特定的变型中，进料培养基在灭活病毒的HTST处理期间具有约pH 5.0至约pH6.9之间的pH。在一些方面，然后使进料培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽生产阶段。在一些方面，在HTST处理后，然后使进料培养基的pH达到约pH6.9至约pH 7.2之间，以用于细胞培养的多肽生产阶段。在另一特定的变型中，在灭活病毒的HTST处理期间，将进料培养基包含的磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些方面，在细胞培养的多肽生产阶段期间，然后使进料培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。在另一变型中，在灭活病毒的HTST处理期间，进料培养基具有约pH 5.0至约pH6.9之间的pH，并且磷酸盐和钙的总量少于约10mM。在一些方面，在细胞培养的多肽生产阶段期间，然后使培养基的pH达到约pH 6.9至约pH 7.2之间，并使培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足够产生多肽的水平。在任一方面，进料培养基是化学成分确知培养基。在任一方面，进料培养基是化学成分未确知培养基。可以使用欧洲专利EP 307,247或美国专利号6,180,401中指定范围的一倍或两倍的氨基酸、维生素、痕量元素以及其他培养基组分，所述文件在本文中以其整体并入本文作为参考。
D.试剂盒
描述了使用化学成分确知的组分补充细胞培养基的试剂盒。该试剂盒可以含有待重构的干组分，并且还可以含有使用说明(例如，在用试剂盒组分补充培养基中使用)。试剂盒可以以适合于补充细胞培养基的量含有本文中提供的培养基组分。在一个变型中，试剂盒包含表1的培养基组分。在另一变型中，试剂盒包含将培养基pH调整成表1中公开的pH水平的培养基组分。
E.组合物
还提供了包含细胞培养基以及一种或多种其他组分，如细胞或期望的多肽(例如，抗体)的组合物。在一个变型中，提供的组合物包含：(a)包含编码多肽的分离核酸的细胞；和(b)如本文中提供的细胞培养基。在另一变型中，提供的组合物包含：(a)多肽；和(b)如本文中提供的细胞培养基，其中在一个方面，通过包含编码多肽的分离核酸的细胞将多肽分泌到培养基中。又在另一变型中，提供的组合物包含：(a)多肽；和(b)如本文中提供的细胞培养基，其中在一个方面，通过裂解包含编码多肽的分离核酸的细胞将多肽释放到培养基中。组合物的细胞可以是本文中详述的任一细胞(例如，CHO细胞)，并且组合物的培养基可以是本文中详述的任一培养基，如包含表1中详述的培养基组分的培养基。同样地，组合物的多肽可以是本文中详述的任一多肽，例如抗体。
F.用于病毒灭活的系统
本发明考虑了用于细胞培养基的病毒灭活系统和/或工艺。该系统可以包括但不限于，培养基、培养基容器装置(media containment unit)、pH计(或者用于测量pH的另一工具)、用于测量和/或定量钙和/或磷酸盐浓度和/或量的工具；用于转移培养基的工具(例如管道系统)、用于增加培养基温度的热源、用于调整目标设定点(例如，温度)的工具、保温容器装置(holding containment unit)(例如，保温管)、降低培养基温度的冷源、空气供给、用于压力输入和输出的工具(例如，压力阀、蠕动泵、离心泵、容积泵)、用于培养基输入和输出的工具、用于气体输入和输出的工具、用于过滤的工具、用于调整流速和与流动力学相关的其他方面的工具，以及任选地与生产期望的多肽或细胞培养物或细胞培养基的生物反应器连接的工具。
包含上述元件的病毒灭活系统还可以包括用于热处理的系统。图1中显示了可以使用本文中描述的多种参数(例如，pH、钙和/或磷酸盐浓度)的示例性热处理系统。可将本文中描述的此类系统用于实施在细胞培养基中灭活病毒的方法，以使培养基用于产生多种终产物(例如，多肽、抗体等)。
G.示例性实施方案
在一个方面，本发明提供了灭活培养基中病毒或外源性因子，同时使所述培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括(a)将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理；和(b)调整选自pH、钙水平和磷酸盐水平的一个或多个参数。
在上述实施方案中的任一个中，该方法进一步包括调整痕量金属的浓度。
在上述实施方案中的任一个中，痕量金属选自铁和铜。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理之前调整培养基中铁和/或铜的浓度。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理之前，从培养基中除去铁和/或铜。
在上述实施方案中的任一个中，该方法进一步包括在HTST处理后，在培养基中将铁和/或铜补充至适合于细胞培养的水平。
在上述实施方案中的任一个中，当培养基包含钙和磷酸盐时，调整pH。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理之前，在制备所述培养基时将所述pH调整至合适的低水平。
在上述实施方案中的任一个中，通过将pH降低至合适的水平来调整pH。
在上述实施方案中的任一个中，将pH调整至小于约7.2。
在上述实施方案中的任一个中，将pH调整至约5.0–7.2。
在上述实施方案中的任一个中，该方法进一步包括在HTST处理后将pH调整至适合于细胞培养的水平。
在上述实施方案中的任一个中，将pH调整至约6.9–7.2。
在上述实施方案中的任一个中，当培养基包含磷酸盐时，调整钙水平。
在上述实施方案中的任一个中，钙水平是减少的。
在上述实施方案中的任一个中，钙水平是减少的，以使包含钙和磷酸盐的复合体的形成受到抑制。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理之前，从培养基中除去钙。
在上述实施方案中的任一个中，调整pH，以使包含钙和磷酸盐的复合体的形成受到抑制。
在上述实施方案中的任一个中，该方法进一步包括在HTST处理后，将钙水平调整至适合于细胞培养的水平。
在上述实施方案中的任一个中，当培养基包含钙时，调整磷酸盐水平。
在上述实施方案中的任一个中，磷酸盐水平是降低的。
在上述实施方案中的任一个中，降低磷酸盐水平，以使包含钙和磷酸盐的复合体的形成受到抑制。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理之前，从培养基中去除磷酸盐。
在上述实施方案中的任一个中，调整pH，以使包含钙和磷酸盐的复合体的形成受到抑制。
在上述实施方案中的任一个中，该方法进一步包括在HTST处理后将磷酸盐水平调整至适合于细胞培养的水平。
在上述实施方案中的任一个中，在HTST处理期间，培养基中磷酸盐和钙的总浓度小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。
在上述实施方案中的任一个中，调整钙和磷酸盐水平。
在上述实施方案中的任一个中，调整pH、钙和磷酸盐水平。
在另一方面，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒或外源性因子，同时使所述培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，其中在HTST处理之前和/或期间，培养基具有约pH 5.0至约pH 7.2之间的pH。在一些实施方案中，在HTST处理之前和/或期间，pH为约pH 5.0至约pH 6.9之间、约pH 5.3至约pH6.3之间或者约pH 6.9至约pH 7.2之间。在一些实施方案中，该方法进一步包括在HTST处理后，将pH调整至适合于细胞培养的水平。在一些实施方案中，培养基包含钙和磷酸盐。在一些实施方案中，在HTST处理之前，调整培养基中痕量金属(例如，铁和/或铜)的浓度。在一些实施方案中，在HTST处理之前和/或期间，培养基不含铁和/或铜。在一些实施方案中，培养基还包含在HTST处理后，向培养基中补充铁和/或铜至适合于细胞培养的水平。
在另一方面，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒或外源性因子，同时使所述培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括将细胞培养基进行高温瞬时(HTST)处理，其中在HTST处理之前和/或期间，培养基中磷酸盐和钙的总量小于约10mM。在一些实施方案中，在HTST处理之前和/或期间，培养基中磷酸盐和钙的总量小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mM。在一些实施方案中，在HTST处理之前和/或期间，培养基不含磷酸盐。在一些实施方案中，在HTST处理之前和/或期间，培养基不含钙。在一些实施方案中，该方法进一步包括在HTST处理后，将磷酸盐和/或钙水平调整至适合于细胞培养的水平。在一些实施方案中，在HTST处理之前，调整培养基中痕量金属(例如，铁和/或铜)的浓度。在一些实施方案中，在HTST处理之前，培养基不含铁和/或铜。在一些实施方案中，该方法进一步包括在HTST处理后，向培养基中补充铁和/或铜至适合于细胞培养的水平。
在上述实施方案中的任一个中，沉淀物形成是受抑制的。
在上述实施方案中的任一个中，用于HTST处理的设备结垢是减少的。
在上述实施方案中的任一个中，滤器结垢是受抑制的。
在上述实施方案中的任一个中，HTST处理包括将培养基的温度升高至至少约85℃并持续足够灭活培养基中病毒或外源性因子的时间。
在上述实施方案中的任一个中，将培养基的温度升高至至少约约93、95、97、99、101、102或103℃并持续足够灭活培养基中的病毒的时间。
在上述实施方案中的任一个中，使温度升高并持续至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15秒。
在上述实施方案中的任一个中，该病毒选自细小病毒科、paramyoxviradae、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、杯状病毒科和小RNA病毒科。
在上述实施方案中的任一个中，病毒是有包膜病毒。
在上述实施方案中的任一个中，病毒是无包膜病毒。
在上述实施方案中的任一个中，外源性因子是细菌。
在本说明书中公开的全部特征可以以任意组合进行组合。可以用具有相同的、等同的或者相似的目的的备选特征替换本说明书公开的每一特征。因此，除非另外明确指明，公开的每一特征仅是一系列等同或者相似特征的一个实例。
提供了以下实施例，以说明并非限制本发明。
将在本文中公开的全部参考文献都在本文中对于全部目的以其整体并入本文作为参考。
实施例
污染细胞培养工艺的病毒感染因子对从细胞系中产生生物药物(例如，重组蛋白质)造成了威胁，并提高了对于在产物的纯化期间清除病毒感染因子能力的潜在安全性的关注。已经采取了几种方法，以最小化进入到生产过程中的外源性因子的风险，包括使用高温瞬时(HTST)处理细胞培养基。然而，尽管当正确地运行时可以有效灭活病毒，但给定培养基可能与用于病毒颗粒灭活的HTST处理不相容(Schleh,M.等人2009.Biotechnol.Prog.25(3):854-860和Kiss,R.2011.PDA J Pharm Sci and Tech.65:715-729)。培养基不相容性可以导致HTST设备中加工接触表面结垢。结垢的一个原因是由于HTST处理的加热和冷却操作导致的培养基沉淀。沉淀导致残留物沉积，该残留物使热交换器结垢，并且由于系统不能维持温度设定点，导致HTST skid关闭。此外，与热处理不相容的培养基中的沉淀可以引起加工滤器结垢，所述加工滤器用于去除培养基中通过HTST处理没有灭活的细菌。由于沉淀导致的滤器结垢可以引起加工故障(processing failure)，并显著增加过滤成本。此外，与热处理不相容的培养基中的沉淀可以不利地影响细胞培养物的性能(例如，产物滴度、细胞生长、细胞活性)，以及产物质量。
如本文中所述，已经确认了几种培养基的改良，使该培养基可以相容地用于HTST处理或用于灭活病毒的其他热处理。已经确认了几种培养基制剂，其可以在用于灭活病毒的HTST处理的设备上减少或防止沉淀。将本文中提供的灭活培养基中病毒的方法描述为减少用于灭活病毒的HTST处理的设备上沉淀物的方法。在一个方面，在用于病毒灭活的HTST处理期间，培养基可以具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在另一方面，在细胞培养物的蛋白质表达阶段之前，在用于病毒灭活的HTST处理期间，培养基具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH。在另一方面，使培养基达到约pH 6.9至约pH 7.2之间的pH，以用于细胞培养的蛋白质表达阶段。在一个方面，在用于病毒灭活的HTST处理期间，将培养基包含的磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的蛋白质表达阶段之前，在用于病毒灭活的HTST处理期间，将培养基包含的磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在另一方面，在细胞培养的蛋白质表达阶段期间，将培养基具有的磷酸盐和钙的总量升高至足够蛋白质表达的水平。在任一方面，在用于病毒灭活的HTST处理期间，细胞培养基可以具有约pH 5.0至约pH 6.9之间的pH，以及包含总量小于约10mM的磷酸盐和钙。发现可将培养基用于细胞培养的全部阶段，并且可用于基础培养基和/或进料培养基。发现可将培养基用于减少用于灭活病毒的HTST处理的设备上的沉淀物。还考虑了使用化学成分确知的组分补充细胞培养基的试剂盒。
实施例1：用于重复地观察HTST skid操作的沙浴筛选法的验证。
在生产规模HTST处理期间，在使用两个热交换器(一个用于加热液体，并且一个用于冷却液体，其中两个换热器之间具有管道系统，以为给定流速提供期望的维持时间)的连续流工艺中将细胞培养基的液体制备物加热至102℃并维持10秒(图1)。沙浴筛选法用于在热处理后，更快速地测试具有实验室规模(～20mL)培养基体积的培养基组合物的性能。该方法基于“最坏情况(worst-case)”受热(heat explosure)，以筛选并鉴定用于中试规模和生产规模HTST skid的相容性培养基(表2)。
表2.以两种规模运行的沙浴装置和HTST skid之间的关键差异
Figure BDA0003929499940000481
材料和方法
培养基制备
在该研究中使用的培养基包括具有不同pH水平的基础生产培养基和分批进料培养基(表3)。使用经Millipore SuperQ超纯水纯化系统加工的纯化的去离子水制备全部培养基。使用合适的培养基粉末储备物(SAFC and Life Technologies)制备培养基。在液体制备期间使用玻璃电极pH探针(Mettler Toledo)和渗透压计(Advanced Instruments)，以确保给定制备物的目标pH和渗透性。在组分完全溶解以及最终的pH和渗透性调整后，使用0.1μm孔径PES膜滤器将培养基过滤到用于小规模制备的250mL至1L(Corning)的瓶中。
表3.用于测试热处理稳定性的培养基制剂
Figure BDA0003929499940000491
pH调整
校正了在培养基制备完成和应用热处理之间的时间中由于除气导致的pH偏差。在热处理之前，将来自每一培养基制备物的30mL整分试样转移到50mL试管(Falcon)中，并用来自250mL Corning Erlenmeyer烧瓶的通风帽替换最初的Falcon管帽。然后将试管放置在具有CO2的恒温箱中30分钟，以降低pH(对于pH6.2样品，15％CO2，并且对于全部其他样品，12％CO2，200转/分钟，37℃)；该步骤能迫使pH低于目标。然后手动地振荡试管，并且使用玻璃电极pH探针和测量计(Mettler Toledo)检测pH，直到pH缓慢回到目标pH。使用NOVAbioprofiler进行最终的pH测量。
沙浴法
对于沙浴法，将22mL制备的液体培养基转移到20mL玻璃压力容器(Aceglassware)中。使用具有热电偶套管的螺纹帽密封容器，通过将容器装满并允许瓶帽和热电偶套管排出过多的培养基，以使溶液中顶空不会留有空气。清洁容器的外部，以防止直接暴露于热源基质的培养基外表面的结垢。将Teflon带用于覆盖玻璃容器的瓶口与螺纹帽之间的界面，以更好地密封玻璃压力容器，并防止沙子或热电偶孔的油进入用于热处理的样品。配置具有温度控制器(Techne TC-8D)的流化沙浴(Techne SBS-4)(压缩空气入口压力＝5psig，浴温＝110℃)，并给定30分钟的平衡。将与单个VWR数字式温度计结合的热电偶插入到按几何学分布于试管的径向维度的中央的样品容器热电偶套管。将硅油加入到热电偶孔中，以提供热电偶孔玻璃壁与热电偶之间的传热介质。将样品容器放置在沙浴中，并开始计时。大约每30-60秒记录一次温度动力学数据。一旦容器达到温度计读数的102℃，将其维持在沙浴中10秒。加热和维持步骤后，将容器转移到处于室温的水浴中，直到温度计温度读数达到35℃。热处理后，将15mL的每一样品转移到小瓶中，用于浑浊度和目视测量。
沉淀测量
通过以下两种方法在热处理前和热处理后分析培养基样品的沉淀，该方法为：1)通过比浊计(2100Q Hach)测量浑浊度；和2)在50-mL Falcon试管中以10,000×g离心样品10分钟(Sorvall RC 6plus，SS-34转子)，以沉降沉淀，目视鉴定并基于颗粒大小(例如，不可见、低、中等、高)定性测定沉淀。对于目视鉴定沉淀，还分析了未离心的样品。
结果
从沙浴和HTST加热分布图中得到了两个主要的发现：1)沙浴热处理系统的加热分布图比较大规模HTST skid操作的加热分布图显著更长和2)在大约6.5分钟，沙浴能达到102℃的目标设定点(图2)。在水浴中冷却样品之前，对于从室温(～21-25℃)或37℃加热至目标102℃并维持10秒，沙浴法加热分布图通常为5至8分钟，平均时间为～6至～6.5分钟。相对于生产规模或中试规模连续流HTST系统，加热、维持和冷却的曲线下方面积在沙浴法中明显更大。相对于中试规模和生产规模HTST操作，测定沙浴法中的培养基样品为全部受热的最坏情况。因此，在沙浴法中主要通过受热驱动的给定培养基制剂中组分的任一显著改变均可以提供较大规模的HTST处理的相关数据。
观察到在HTST处理期间，将培养基1进料培养基制剂的pH从pH 7.0降低至pH 6.4可以减少任一HTST操作问题(表3)。相似地，对于培养基2基础培养基制剂，发现在pH 6.7而不是在pH 7.0处理培养基也可以减少任一HTST操作问题(表3)。在沙浴法中，在两个pH水平处理这些培养基中的每一个，以测定沙浴法是否可以准确地反映在规模HTST处理操作中发生的沉淀行为。热处理之前和之后的可见性测量表明沙浴系统准确地显示了沉淀行为(图3A和B)，该沉淀行为是已知在中性pH处理时具有HTST-相容性问题的培养基的热处理导致的。与培养基基于受热改变的“最坏情况”一致，培养基2在沙浴中仍显示出沉淀的指征，尽管相对于同一培养基的pH 7.0处理样品，培养基2已经显著减少了沉淀。总之，这些结果证实，可将沙浴法用于筛选和鉴定在中试规模和生产规模HTST处理中相容性使用的培养基制剂。
实施例2：在用于病毒灭活的热处理期间，pH、钙和磷酸盐水平促进了培养基中的沉淀材料和方法
培养基制备
在该研究中使用的培养基包括具有约pH 5.9至约pH 7.5的pH水平、约0mM至约3.5mM的钙浓度(或者在成分未确知培养基中更高)，以及约0mM至约6.5mM的磷酸盐浓度(或者在成分未确知培养基中更高)的基础生产培养基和分批进料培养基。使用经MilliporeSuperQ超纯水纯化系统加工的纯化的去离子水制备全部培养基。使用合适的培养基粉末储备物(SAFC and Life Technologies)制备培养基。在液体制备期间使用玻璃电极pH探针(Mettler Toledo)和渗透压计(Advanced Instruments)，以确保给定制备物的目标pH和渗透性。在组分完全溶解以及最终的pH和渗透性调整后，使用0.1μm孔径PES膜滤器将培养基过滤到用于小规模制备的250mL至1L(Corning)的瓶中。
pH调整
校正了在培养基制备完成和应用热处理之间的时间中由于除气导致的pH偏差。在热处理之前，将来自每一培养基制备物的30mL整分试样转移到50mL试管(Falcon)中，并用来自250mL Corning Erlenmeyer烧瓶的通风帽替换最初的Falcon管帽。然后将试管放置在具有CO2的恒温箱中30分钟，以降低pH(对于pH6.2样品，15％CO2，并且对于全部其他样品，12％CO2，200转/分钟，37℃)；该步骤能迫使pH低于目标。然后手动地振荡试管，并且使用玻璃电极pH探针和测量计(Mettler Toledo)检测pH，直到pH缓慢回到目标pH。使用NOVAbioprofiler进行最终的pH测量。
沙浴法
对于沙浴法，将22mL制备的液体培养基转移到20mL玻璃压力容器(Aceglassware)中。使用具有热电偶套管的螺纹帽密封容器，通过将容器装满并允许瓶帽和热电偶套管排出过多的培养基，以使溶液中顶空不会留有空气。清洁容器的外部，以防止直接暴露于热源基质的培养基外表面的结垢。将Teflon带用于覆盖玻璃容器的瓶口与螺纹帽之间的界面，以更好地密封玻璃压力容器，并防止沙子或热电偶孔的油进入用于热处理的样品。配置具有温度控制器(Techne TC-8D)的流化沙浴(Techne SBS-4)(压缩空气入口压力＝5psig，浴温＝110℃)，并给定30分钟的平衡。将与单个VWR数字式温度计结合的热电偶插入到按几何学分布于试管的径向维度的中央的样品容器热电偶套管。将硅油加入到热电偶孔中，以提供热电偶孔玻璃壁与热电偶之间的传热介质。将样品容器放置在沙浴中，并开始计时。大约每30-60秒记录一次温度动力学数据。一旦容器达到温度计读数的102℃，将其维持在沙浴中10秒。加热和维持步骤后，将容器转移到处于室温的水浴中，直到温度计温度读数达到35℃。热处理后，将15mL的每一样品转移到小瓶中，用于浑浊度和目视测量。
沉淀测量
通过以下两种方法在热处理前和热处理后分析培养基样品的沉淀，该方法为：1)通过比浊计(2100Q Hach)测量浑浊度；和2)在50-mL Falcon试管中以10,000×g离心样品10分钟(Sorvall RC 6plus，SS-34转子)，以沉降沉淀，目视鉴定并基于颗粒大小(例如，不可见、低、中等、高)定性测定沉淀。对于目视鉴定沉淀，还分析了未离心的样品。
结果
使用不同的pH值水平以及钙和磷酸盐浓度，制备了几种培养基制剂(表4)。通过目视观察未离心的和离心的样品，并且通过浑浊度测量评估了热处理之前和之后制备的培养基的沉淀。
表4.在沙浴法中测试培养基制剂的沉淀
Figure BDA0003929499940000521
Figure BDA0003929499940000531
Figure BDA0003929499940000532
＝对于培养基1、2、5和10，在钙和磷酸盐浓度的估计中并不包括水解产物/蛋白胨的影响。
N/A表示无效。
在样品中沉淀的测量结果表明，相对于HTST处理操作，通过沙浴法获得的数据反映了总体受热的可能情况，因为以前在中试或生产规模HTST中并不显示出操作问题的培养基4和培养基5制剂在沙浴法中显示出可测量的浑浊度和可见的沉淀。通过沙浴法，测定钙和磷酸盐浓度以及pH水平都是培养基制剂中的这样的组分，在至少102℃的受热期间，该组分促成了培养基中的显著改变。在几种制剂中，降低pH水平，但不修饰钙和磷酸盐浓度导致了较低的浑浊度(表4)。此外，没有钙或者具有低钙浓度的制剂即使在中性pH也不会显示出沉淀事件，并且也不具有高浑浊度的测量结果(表4)。除降低钙和磷酸盐浓度外，减少沉淀与降低钙与磷酸盐的比率之间存在相关性(表4)。这些观察结果导致了这样的判断，在热处理期间通过加热和冷却形成的磷酸钙沉淀是钙浓度、磷酸盐浓度以及pH水平的函数。
对于沙浴系统中热处理制剂的多变量分析，将培养基4选择用于实验的全析因设计(DoE)，并将浑浊度(NTU)响应度量用于产生沉淀响应面。可改变的变量是钙浓度(0.1至2.9mM)、磷酸盐浓度(0.1、5.9mM)和pH(6.0至7.2)。通过浑浊度测量测定的，并且通过目视观察确认的分类参数估计判定，热处理含钙和磷酸盐的培养基制剂后，依赖于pH的磷酸钙形成导致了培养基中的沉淀(图4)。影响培养基沉淀的最强效应是钙和磷酸盐浓度的向量积(图4)。这与期望反应动力学一致：不溶性磷酸钙形成取决于钙和磷酸盐浓度。此外，通过钙和磷酸盐浓度的产物估计浑浊度也与当钙或磷酸盐的浓度为零时观察到的浑浊度一致，不存在浑浊度的显著增加(作为HTST相容性的估计)。
随后根据DoE浑浊度数据和输入数据(钙浓度、磷酸盐浓度和pH)模式响应面。相对于通过对离心的和未离心的热处理培养基样品目视检查可见沉淀，基于全部浑浊度值的分析，将在最坏情况沙浴热处理中相对于不良运行方案的良好运行方案的截断值选定为5NTU的浑浊度。数据表明，对于确保HTST相容性，用于改良培养基制剂的多种选择或水平是可能的。特别地，降低钙浓度、磷酸盐浓度、pH或者三种参数的一些组合都可以是制备培养基制剂的可能手段，该培养基制剂与HTST处理或者其他热处理方法相容(图5)。
根据从热处理培养基4的数据产生的模式响应面(modeled response surface)，沙浴热处理研究中培养基的稳定性特别地依赖于钙和磷酸盐的浓度以及pH水平。为了测定其他培养基制剂中的改良(该改良可以将培养基制剂从HTST不相容性转变成相容性培养基)，基于培养基制剂在pH 7.0的钙和磷酸盐浓度，将不含水解产物的其他培养基制剂(培养基3、培养基4、培养基6、培养基7、培养基8、培养基9、培养基11、培养基12和培养基13)描绘在模式响应面上(图6)。由于钙和磷酸盐的不同水平，含水解产物的培养基增加了分析的复杂性。培养基11落在响应面的区域内，表明其处于沉淀范围之外，因此确定培养基11很有可能是HTST相容的(图6，点C)。将水解产物添加到培养基11中产生了培养基5(表4)，并且基于水解产物中磷酸盐和钙水平的已知估计，该水解产物的添加导致培养基5向沉淀范围中移位，因此其很可能是HTST不相容的(图6，点C箭头)。培养基12在沉淀范围内，并且基于该模型，预测通过添加水解产物而产生的培养基2，添加的水解产物(表4)会使培养基2进一步移位到沉淀范围中(图6，点D箭头)。基于与沙浴热处理后的可见沉淀相关的模式响应面，预测在沉淀范围内或之外的制剂包括在生产规模HTST skid运行中具有热交换器结垢问题的两种制剂。产生的响应面模型的使用表明，热处理后细胞培养基制剂中的沉淀与在中性pH附近高浓度的钙和磷酸盐强烈相关(图5和6)。此外，可以产生基于沙浴数据的响应面模型，以提供用于将HTST不相容性培养基转变成HTST相容性培养基的制剂改变的建议。
实施例3：在病毒灭活期间，温度对培养基的沉淀行为的影响
材料和方法
培养基制备
在该研究中使用的培养基包括基础生产培养基和分批进料培养基。使用经Millipore SuperQ超纯水纯化系统加工的纯化的去离子水制备全部培养基。使用合适的培养基粉末储备物(SAFC and Life Technologies)制备培养基。在液体制备期间使用玻璃电极pH探针(Mettler Toledo)和渗透压计，以确保给定制备物的目标pH和渗透性。在组分完全溶解以及最终的pH和渗透性调整后，使用0.1μm孔径PES膜滤器将培养基过滤到用于小规模制备的250mL至1L(Corning)的瓶中。
pH调整
校正了在培养基制备完成和应用热处理之间的时间中由于除气导致的pH偏差。在热处理之前，将来自每一培养基制备物的30mL整分试样转移到50mL试管(Falcon)中，并用来自250mL Corning Erlenmeyer烧瓶的通风帽替换最初的Falcon管帽。然后将试管放置在具有CO2的恒温箱中30分钟，以降低pH(对于pH6.2样品，15％CO2，并且对于全部其他样品，12％CO2，200转/分钟，37℃)；该步骤能迫使pH低于目标。然后手动地振荡试管，并且使用玻璃电极pH探针和测量计(Mettler Toledo)检测pH，直到pH缓慢回到目标pH。使用NOVAbioprofiler进行最终的pH测量。
沙浴法
对于沙浴法，将22mL制备的液体培养基转移到20mL玻璃压力容器(Aceglassware)中。使用具有热电偶套管的螺纹帽密封容器，通过将容器装满并允许瓶帽和热电偶套管排出过多的培养基，以使溶液中顶空不会留有空气。清洁容器的外部，以防止直接暴露于热源基质的培养基外表面的结垢。将Teflon带用于覆盖玻璃容器的瓶口与螺纹帽之间的界面，以更好地密封玻璃压力容器，并防止沙子或热电偶孔的油进入用于热处理的样品。配置具有温度控制器(Techne TC-8D)的流化沙浴(Techne SBS-4)(压缩空气入口压力＝5psig，浴温＝110℃)，并给定30分钟的平衡。将与单个VWR数字式温度计结合的热电偶插入到按几何学分布于试管的径向维度的中央的样品容器热电偶套管。将硅油加入到热电偶孔中，以提供热电偶孔玻璃壁与热电偶之间的传热介质。将样品容器放置在沙浴中，并开始计时。大约每30-60秒记录一次温度动力学数据。一旦容器达到温度计读数的102℃，将其维持在沙浴中10秒。加热和维持步骤后，将容器转移到处于室温的水浴中，直到温度计温度读数达到35℃。热处理后，将15mL的每一样品转移到小瓶中，用于浑浊度和目视测量。
沉淀测量
通过以下两种方法在热处理前和热处理后分析培养基样品的沉淀，该方法为：1)通过比浊计(2100Q Hach)测量浑浊度；和2)在50-mL Falcon试管中以10,000×g离心样品10分钟(Sorvall RC 6plus，SS-34转子)，以沉降沉淀，目视鉴定并基于颗粒大小(例如，不可见、低、中等、高)定性测定沉淀。对于目视鉴定沉淀，还分析了未离心的样品。
结果
还通过改变沙浴系统中加热的目标设定点，研究了温度对培养基沉淀的影响。对于全部配制为中性pH 7.0的培养基1(进料培养基，成分未确知)、培养基2(基础培养基，成分未确知)、培养基4(基础培养基，成分确知)和培养基10(基础培养基，成分未确知)，在约75、85、90、97和102℃的温度进行了测量。与加热曲线一同进行的未离心和离心样品的目视检查显示，当样品达到90℃的时间时，全部四种不同的培养基制剂都产生了沉淀事件(图7，实心圆)。在85℃和75℃的较低温度，培养基4和10仍继续显示出沉淀事件(图7，实心圆)。培养基2在85℃的热处理期间显示出沉淀事件，但在75℃没有产生可见的沉淀物，表明培养基2在75℃左右或者以下的温度是与热处理相容的(图7，空心圆)。培养基1在85℃没有产生沉淀，表明培养基1在85℃左右或者以下的温度与热处理是相容的(图7，空心圆)。浑浊度测量确认了这些观察结果，所述浑浊度测量显示，当样品达到90℃时，全部四种不同的培养基制剂的浑浊度测量结果均为大约20NTU或者更高(图8)。对于培养基2、4和10，当从97℃至102℃时，经热处理的培养基浑浊度值是减少的(图8)。在溶液如培养基中，浑浊度是粒度分布的函数，并且特别地在测量中，胶粒大小的特定范围比其他部分的大小分布更有效。因此，在最高温度测量的浑浊度的减少是由于颗粒絮凝/聚集行为产生的，所述颗粒絮凝/聚集行为导致粒度分布的改变(例如，增加粒度但减少了数量)，其导致浑浊度数据中产生赝象。这些结果表明，稍微降低温度而仍维持病毒灭活并不会显著地降低浑浊度。
对于大规模HTST操作而言，在相关持续时间超过85℃至90℃的温度是有效灭活病毒的方法所需要的，并且对于工业相关的细小病毒而言，超过95℃的温度是达到期望的对数减少所必需的。尽管对于观察热处理衍生的培养基沉淀事件而言，沙浴法更加严格，但数据显示，为了避免导致热交换器结垢的沉淀事件，可以使用低于102℃的当前目标HTST处理设定点的操作。因为HTST处理的目的是病毒灭活，所以明确的是降低目标温度设定点并不是一个选择，并且几种培养基制剂的沉淀也是培养基HTST应用的潜在操作问题。因此，在至少90℃的温度通过HTST处理对培养基中的病毒灭活期间，钙和磷酸盐浓度以及pH水平是可以调整的组分，以减少或防止沉淀事件。
实施例4：在用于病毒灭活的中试规模和大规模HTST培养基处理期间，pH、钙和磷酸盐水平对培养基中沉淀的贡献
材料和方法
中试规模HTST
对于使用中试规模HTST进行的研究，为了最小化对后续运行的可能影响(carry-over)，从钙或磷酸盐的最低浓度至最高浓度处理培养基制剂。每一HTST操作需要15L至20L的培养基，以冲洗运行之间所使用的去离子漂洗液，并将加热盘管平衡至102℃的操作温度(可接受的范围：97℃-110℃)，以用于HTST处理。平衡后，通过HTST skid运行大约20L的培养基，并将流出液(outlet flow)收集到塑料方容器中。从培养基收集样品，该培养基来自HTST处理之前的培养基混合罐以及来自方容器中流出的培养基，并通过0.1μm PVDF囊膜滤器(capsule membrane filter)(Millipore)，将其过滤到培养基储存袋中，用作为“HTST前”和“HTST后”样品。然后在细胞培养性能测定和分析测试之前，将全部经处理的和未经处理的过滤培养基样品储存于2-8℃。
生产规模HTST
对于具有生产规模HTST skid的培养基热处理，将1800L培养基4或培养基1制备物用于生产规模的操作运行。该培养基制备物的目的是了测定：1)用于培养基4的生产混合条件是否足以满足特定的质量控制方法混合次数(quality control recipe mix time)，和2)使用培养基4产生生产规模HTST处理性能数据。通过将6×20-L培养基袋岐管(SartoriusStedim Biotech)与培养基混合罐和目的生物反应器上的采样孔无菌连接，来收集HTST处理之前和之后的培养基样品。对于HTST处理之前获取的样品，在收集之前，通过0.1μm PVDF囊膜滤器(Millipore)过滤培养基，对于HTST处理之后获取的样品，在收集之前，使培养基穿过生产滤器串，其由0.5/0.2μm双层筒式滤器PVDF预滤器(Millipore)和0.1μm Nylon终滤器(Pall)组成。然后将样品用于细胞培养性能测定和分析测试。
结果
对于中试规模和生产规模HTST操作，当处理期望体积的培养基4时，不存在导致HTST skid关闭或者控制输出温度困难的加工中事件。因此，不存在显著的足以导致热交换器表面或后续过滤结垢的沉淀事件的指征。在终过滤和用于细胞培养之前，中试规模处理的培养基4在视觉上是没有颗粒的。由于系统采样孔的排列，不能在终过滤之前对生产规模处理的培养基4取样。在进行HTST处理和不进行HTST处理的情况下，对培养基4进行了分析测试和细胞培养性能测试。培养基4的分析测试显示在HTST处理后发生了痕量金属损失，表明在HTST处理期间，发生了改变培养基组合物浓度的沉淀事件，其不是导致操作困难的足够沉淀。对于培养基4的生产规模HTST处理，来自电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和电感耦合等离子体-发射光谱(ICP-OES)测定的数据显示，相对于未经热处理的培养基4，热处理后损失了24％的Fe(铁)和16％的Cu(铜)(图9)。
对于中试规模和生产规模HTST操作，当处理期望体积的pH7.10的培养基1时，存在导致HTST skid关闭或者控制输出温度困难的加工中事件。沉淀事件是显著的，足以导致热交换器表面结垢。在终过滤和用于细胞培养之前，中试规模处理的培养基1具有颗粒。由于系统采样孔的排列，不能在终过滤之前对生产规模处理的培养基1取样。将培养基1的pH调整至约pH 6.34减少了沉淀。对于中试规模和生产规模HTST操作，当处理期望体积的pH6.34的培养基1时，不存在导致HTST skid关闭或者控制输出温度困难的加工中事件。因此，不存在显著的足以导致热交换器表面结垢的沉淀事件的指征。在终过滤和用于细胞培养之前，中试规模处理的培养基1在视觉上是没有颗粒的。由于系统采样孔的排列，不能在终过滤之前对生产规模处理的培养基1取样。
实施例5：在用于病毒灭活的热处理期间，pH、钙和磷酸盐水平对培养基中痕量金属损失的贡献
材料和方法
培养基制备
在该研究中使用的培养基包括pH水平为约pH 5.9至约pH 7.5，钙浓度为约0mM至约3.5mM(或者在成分未确知培养基中更高)、磷酸盐浓度为约0mM至约6.5mM(或者在成分未确知培养基中更高)和铁浓度为约0μM至约125μM(或者在成分未确知培养基中更高)的基础生产培养基和分批进料培养基。使用经Millipore SuperQ超纯水纯化系统加工的纯化的去离子水制备全部培养基。使用合适的培养基粉末储备物(SAFC and Life Technologies)制备培养基。在液体制备期间使用玻璃电极pH探针(Mettler Toledo)和渗透压计(AdvancedInstruments)，以确保给定制备物的目标pH和渗透性。在组分完全溶解以及最终的pH和渗透性调整后，使用0.1μm孔径PES膜滤器将培养基过滤到用于小规模制备的250mL至1L(Corning)的瓶中。
pH调整
校正了在培养基制备完成和应用热处理之间的时间中由于除气导致的pH偏差。在热处理之前，将来自每一培养基制备物的30mL整分试样转移到50mL试管(Falcon)中，并用来自250mL Corning Erlenmeyer烧瓶的通风帽替换最初的Falcon管帽。然后将试管放置在具有CO2的恒温箱中30分钟，以降低pH(对于pH6.2样品，15％CO2，并且对于全部其他样品，12％CO2，200转/分钟，37℃)；该步骤能迫使pH低于目标。然后手动地振荡试管，并且使用玻璃电极pH探针和测量计(Mettler Toledo)检测pH，直到pH缓慢回到目标pH。使用NOVAbioprofiler进行最终的pH测量。
沙浴法
对于沙浴法，将22mL制备的液体培养基转移到20mL玻璃压力容器(Aceglassware)中。使用具有热电偶套管的螺纹帽密封容器，通过将容器装满并允许瓶帽和热电偶套管排出过多的培养基，以使溶液中顶空不会留有空气。清洁容器的外部，以防止直接暴露于热源基质的培养基外表面的结垢。将Teflon带用于覆盖玻璃容器的瓶口与螺纹帽之间的界面，以更好地密封玻璃压力容器，并防止沙子或热电偶孔的油进入用于热处理的样品。配置具有温度控制器(Techne TC-8D)的流化沙浴(Techne SBS-4)(压缩空气入口压力＝5psig，浴温＝110℃)，并给定30分钟的平衡。将与单个VWR数字式温度计结合的热电偶插入到按几何学分布于试管的径向维度的中央的样品容器热电偶套管。将硅油加入到热电偶孔中，以提供热电偶孔玻璃壁与热电偶之间的传热介质。将样品容器放置在沙浴中，并开始计时。大约每30-60秒记录一次温度动力学数据。一旦容器达到温度计读数的102℃，将其维持在沙浴中10秒。加热和维持步骤后，将容器转移到处于室温的水浴中，直到温度计温度读数达到35℃。热处理后，将15mL的每一样品转移到小瓶中，用于浑浊度和目视测量。
中试规模HTST
对于使用中试规模HTST进行的研究，为了最小化对后续运行的可能影响(carry-over)，从钙或磷酸盐的最低浓度至最高浓度处理培养基制剂。每一HTST操作需要15L至20L的培养基，以冲洗运行之间所使用的去离子漂洗液，并将加热盘管平衡至102℃的操作温度(可接受的范围：97℃-110℃)，以用于HTST处理。平衡后，通过HTST skid运行大约20L的培养基，并将流出液(outlet flow)收集到塑料方容器中。从培养基收集样品，该培养基来自HTST处理之前的培养基混合罐以及来自方容器中流出的培养基，并通过0.1μm PVDF囊膜滤器(capsule membrane filter)(Millipore)，将其过滤到培养基储存袋中，用作为“HTST前”和“HTST后”样品。然后在细胞培养性能测定和分析测试之前，将全部经处理的和未经处理的过滤培养基样品储存于2-8℃。
生产规模HTST
将1800L操作运行的培养基4制备物用于支持抗体产生方案，并将生产规模HTSTskid U1281用于处理培养基。该培养基制备物的目的是了测定：1)用于培养基4的混合条件是否足以满足特定的方法混合次数(recipe mix time)，和2)使用培养基4产生生产规模HTST处理性能数据。通过将6×20-L培养基袋岐管(Sartorius Stedim Biotech)与培养基混合罐和目的生物反应器上的采样孔无菌连接，来收集HTST处理之前和之后的培养基样品。对于HTST处理之前获取的样品，在收集之前，通过0.1μm PVDF囊膜滤器(Millipore)过滤培养基，对于HTST处理之后获取的样品，在收集之前，使培养基穿过GMP滤器串，其由0.5/0.2μm双层筒式滤器PVDF预滤器(Millipore)和0.1μm Nylon终滤器(Pall)组成。然后将样品用于细胞培养性能测定和分析测试。
沉淀测量
通过以下两种方法在热处理前和热处理后分析培养基样品的沉淀，该方法为：1)通过比浊计(2100Q Hach)测量浑浊度；和2)在50-mL Falcon试管中以10,000×g离心样品10分钟(Sorvall RC 6plus，SS-34转子)，以沉降沉淀，目视鉴定并基于颗粒大小(例如，不可见、低、中等、高)定性测定沉淀。对于目视鉴定沉淀，还分析了未离心的样品。
培养基组分浓度改变的分析
测定HTST前和HTST后经处理的上清液残留，以筛选可测量培养基组分浓度的任一显著改变。所使用的测定包括：测量水溶性维生素、测量氨基酸，以及测量无机磷酸盐。使用两种不同的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定法分析痕量元素。此外，通过电感耦合等离子体-发射光谱(ICP-OES)测量样品中的铁、铜和锌，用于更高通量地定量这些元素。当适用时，使用JMP软件和Excel进行全部统计学分析并作图。
结果
为了更好地理解在更大生产规模时发生的痕量金属损失，将培养基4作为模型培养基制剂来进行沙浴研究。为了测定痕量金属损失是否与含这些组分的培养基中的磷酸钙沉淀事件以及在中性或更高pH处理相关，产生了半阶乘(half-factorial design)设计，以评价热处理后，不同pH、钙(Ca)、无机磷酸盐(PO4)、铁(Fe)和铜(Cu)对回收的Fe和Cu水平的影响。
表5.测试的组分的浓度
Figure BDA0003929499940000601
备注：除上述因素外，培养基4中的其他组分处于正常水平。
痕量金属回收的分析显示，高pH、Ca和PO4水平是Fe损失的主要因素(图10)。增加这三种因素中任意之一的水平都导致Fe回收降低。与pH、Ca和PO4比较，初始Fe浓度显示出相似的但更小的主效应，表明其实际上对Fe回收没有影响。pH、Ca和PO4的重要性同Fe损失与磷酸钙沉淀事件相关的Fe损失的可能性一致，所述磷酸钙沉淀事件在操作方面(例如，不足以显著地引起HTST skid操作问题)并不显著，但在不利地影响细胞培养基性能(例如，产物滴度、细胞生长、细胞生成和产物质量)方面是显著的。
为了解释主效应图中的变化或扩展(variance or spread)，从使用四种最强的因素(pH、Ca、PO4和Fe)的数据中产生了全阶乘模型。来自该分析的相互作用图显示了热处理后影响Fe回收的两种互用效应：1)pH*Ca和2)pH*PO4(图11)。这些结果表明，为了产生热处理后避免Fe损失的培养基制剂，需要降低钙和磷酸盐的浓度、降低pH水平或者减少这些因素的一些组合。此外，这些数据显示，即使是在未观察到可见沉淀和增加的浑浊度的时候，仍然会发生Fe损失。
测试了75-150μM硫酸亚铁水平(但在别的方面却培养基4等同)的培养基，以测定初始Fe水平与HTST后Fe水平之间存在函数关系的程度(degree)。数据显示，初始Fe与HTST后Fe浓度之间存在不期望的非线性关系(图12)。然而，发现相对于其他三种样品，125μM Fe样品经历了pH偏移。在这两组样品中，HTST测试前，125μM Fe样品具有最高的pH。对于测试1和测试2的样品组，pH为7.08至7.17以及7.09至7.14。
来自DoE实验的结果显示，在沙浴热处理系统中，pH 7.0的培养基接近于失败的边缘，并且Fe损失在pH 6.7以上开始发生。测试了6.6-7.2的pH水平的培养基4制备物，以表征该方案。在高分辨率pH滴定数据中，显示了在沙浴热处理系统中显著的pH偏移(甚至小至pH单位的分数)的证据(图13A)。pH 6.8后，Fe回收对pH高度敏感，下降很快并且在pH 7.2达到平台期。该明显的pH依赖性表明硫酸亚铁滴定结果最可能受pH可变性影响。还表明，pH非常小的变化(即0.2个pH单位)可能使方案中的培养基制剂不发生Fe损失。
来自DoE实验的结果还表明，Ca和PO4水平相对小的改变可以实现Fe回收的极大改进(图13B)。测试了具有0.5-1.17×标准培养基4水平的Ca和PO4水平的培养基4制备物，以更好地定量对于实现前面观察到的益处所需的Ca和PO4的改变。对于该滴定，将Ca和PO4水平的比率恒定保持于0.5。图解数据分析显示了这样的曲线图，其中增加的Fe损失与增加的Ca和PO4水平相关(图13B)。培养基4制剂位于斜坡的最陡峭部分，其中Ca和PO4浓度的小改变可以极大地改进Fe回收。例如，使Ca和PO4浓度降低30％(并保持相同的比率)可以产生能转化成HTST处理的100％Fe回收的沙浴后热处理。
如果痕量金属损失与磷酸钙沉淀相关，那么钙和磷酸盐回收与Fe回收之间存在关系。数据分析显示，磷酸盐回收与Fe回收之间未形成明显的关系，其中Fe回收很低并且确认存在沉淀(图14，圆圈中的菱形)。由于信噪比，很难在相对高的初始磷酸盐浓度样品中检测小浓度的差异。由于磷酸钙与铁之间相互作用的的可能性，所以铁可能以1:1的化学计量与相对小量的磷酸盐一起被去除，并且很难检测到磷酸盐损失。另一可能原因与测定法仅检测特定形式的无机磷酸盐的事实相关。钙回收为60-80％，并且表现出与10-30％的Fe回收线性相关，其中Fe回收很低并且确认存在沉淀(图14，圆圈中的正方形)。使用最小二乘回归法分析该亚组显示，Fe回收可以解释69％Ca回收中的变化。该数据显示Fe与Ca回收直接相关。
还进行了培养基4(以及培养基4的变型)和培养基9的中试规模和生产规模HTST处理操作。从用于分析测定和细胞培养性能研究的运行收集数据，以评估HTST处理对细胞培养性能和产物质量的影响。分析测试中确认，除铁和铜之外不存在任一组分的显著损失。此外，没有观察到关键细胞培养性能测量(滴度、生长、活性)或产物质量(包括其基本变型)的显著改变。铜损失并没有导致培养基性能或水平(培养基性能的基本变型)的改变，因为基于该细胞系的铜滴定，损失并没有足够地大到不正当地(illicit)改变用于测试的宿主细胞系。由于与培养基4制剂中钙和磷酸盐(分别为1.5mM和3mM)比较，痕量金属如铁和铜的量相对较少(分别为75μM和1μM)，所以有可能形成非常少的磷酸钙沉淀(CaPO4复合体)，其不导致热交换器显著结垢，但可以与液体培养基中存在的铁和铜相互作用。CaPO4复合体的这些相互作用可以以某种方式螯合铁和铜，以使其与液体培养基分离，并将其与沉淀的CaPO4复合体一起沉积在加工流程的某些地方。关于该机制，事实是在培养基的HTST处理后，包括当已经成功处理并灭活了培养基中的病毒时，观察到了铁和铜损失。HTST处理后，如果相对于生产阶段所需的铁和铜浓度，损失是显著的，那么铁和铜浓度的降低可能会在后续生产阶段不利地影响经HTST处理的培养基的成功使用。
进行了几种不同培养基制剂的中试规模和生产规模HTST处理操作。在HTST处理前测量了培养基制剂中的铁水平，并测定了HTST处理后铁的期望水平。HTST处理后(HTST后)培养基中铁水平的分析显示，HTST处理导致了铁水平的损失。铁损失为培养基14中44％、培养基15中12％、培养基16中20％、培养基17中1.3％，以及培养基18中42％(图15)。在HTST处理后用铁补充培养基19和培养基20。
测定了在进行了HTST处理并且补充了铁的细胞培养基中NS0细胞(鼠骨髓瘤细胞系)的生长。细胞生长的分析显示，在不通过HTST处理的补充或者没有补充铁的培养基中，细胞随时间生长的量相当(图16)。相比较，当在用HTST处理且没有补充铁的培养基中培养时，细胞生长的量更低。与不用HTST处理的细胞培养基比较，向经HTST处理的细胞培养物中添加铁允许细胞生长恢复至较高的水平。
总之，该数据显示Fe损失与钙、磷酸盐和pH水平相关，表明热处理期间痕量金属损失与磷酸钙沉淀事件之间的紧密关系，包括那些并不需要检测到，如可见沉淀物、显著的浑浊度改变或者运行问题的事件。痕量金属如Fe的损失可能不利地影响多种细胞系的细胞培养性能以及产物质量。

Claims (25)

1.灭活哺乳动物细胞培养基中病毒或外源性因子，同时使所述培养基维持对哺乳动物细胞培养适应性的方法，所述方法包括
a)调节细胞培养基的pH，其中细胞培养基在HTST处理之前具有pH5.0至pH6.9，
b)将细胞培养基进行HTST处理，和
c)在HTST处理之后将细胞培养基的pH升高到6.9至7.2之间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在HTST处理之前将所述细胞培养基的pH调节到pH5.0至pH6.7。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在HTST处理之前将所述细胞培养基的pH调节到pH5.0至6.3。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在HTST处理之后将所述细胞培养基的pH升高到pH7.0至pH7.2。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在HTST处理之后将所述细胞培养基的pH升高到pH7.0至pH7.2。
6.根据权利要求1所述的方法，包括在HTST处理之前将所述细胞培养基中钙和磷酸盐的总量限制在小于9mM。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在HTST处理期间，所述培养基中的总磷酸盐和钙浓度小于8mM。
8.根据权利要求3所述的方法，其中在HTST处理期间，所述培养基中的总磷酸盐和钙浓度小于8mM。
9.根据权利要求6所述的方法，其中在HTST处理期间，所述培养基中的总磷酸盐和钙浓度小于4mM。
10.根据权利要求3所述的方法，其中在HTST处理期间，所述培养基中的总磷酸盐和钙浓度小于4mM。
11.根据权利要求6所述的方法，还包括在HTST处理之后将钙和磷酸盐水平调节到适合细胞培养的水平。
12.根据权利要求9所述的方法，还包括在HTST处理之后将钙和磷酸盐水平调节到适合细胞培养的水平。
13.根据权利要求1所述的方法，其中HTST处理包括将所述培养基的温度从约85摄氏度升高到约118摄氏度，持续足够的时间以灭活培养基中的病毒或外源性因子。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述培养基的温度升高到约97摄氏度至约120摄氏度，持续足够的时间以灭活培养基中的病毒。
15.根据权利要求3所述的方法，其中将所述培养基的温度升高到约97摄氏度至约120摄氏度，持续足够的时间以灭活培养基中的病毒。
16.根据权利要求14所述所述的方法，其中，所述温度升高约1秒约60秒。
17.根据权利要求16所述所述的方法，其中，所述温度升高约1秒至约18秒。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将温度升高到102摄氏度持续10秒。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒选自细小病毒科、paramyoxviradae、正粘病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、calciviridae和小RNA病毒科。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是有包膜病毒。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是无包膜的病毒。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源性因子是细菌。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养基用于培养CHO细胞。
24.根据权利要求1所述的方法，其中在HTST处理之前，所述细胞培养基中不存在铁和铜中的一种或多种。
25.根据权利要求1所述的方法，还包括在HTST处理之后将铁和铜中的一种或多种补充到所述培养基中，至适合细胞培养的水平。
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