KR102095073B1 - 세포 배양 배지 내에서의 바이러스 및 박테리아의 불활성화 방법 - Google Patents

세포 배양 배지 내에서의 바이러스 및 박테리아의 불활성화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 침전물의 생성 및 침전물의 침착이 감소 및/또는 최소화되도록 고온 단시간 (HTST) 처리 및 다양한 파라미터의 조정을 이용하는 바이러스 불활성화 방법을 제공한다.

Description

세포 배양 배지 내에서의 바이러스 및 박테리아의 불활성화 방법 {METHODS FOR INACTIVATION OF VIRUSES AND BACTERIA IN CELL CULTURE MEDIA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 15일 출원된 미국 특허 출원 13/844,051 및 2012년 6월 20일 출원된 미국 특허 가출원 61/662,349를 기초로 한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 침전물의 생성 및 침착이 감소 및/또는 최소화되도록 고온 단시간 (HTST) 처리 및 다양한 파라미터의 조정을 이용하는 바이러스 불활성화 방법을 제공한다.
바이러스는 약물 제조 공정에서, 특히 생물학적 약물이 포유동물 세포 배양물로부터 유래되는 경우에 잠재적인 오염물질이다. 바이러스 오염물질의 공급원은 세포 배양을 위해 사용되는 배지 또는 관심있는 생물학적 물질을 생산하는 세포주일 수 있다. 제조 공정 동안 생물학적 약물의 바이러스 오염을 방지하기 위한 현재의 방법은 원료에 의해 세포 배양 배지 내로 도입될 수 있고 배양 과정 동안 증폭되는 바이러스의 불활성화를 위한 고온 단시간 (HTST) 세포 배지 처리를 포함한다 (문헌 [Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860] 및 [Kiss, R. 2011. PDA J P harm Sci and Tech. 65:715-729] 참조). 효과적인 바이러스 불활성화 방법이 되도록 하기 위해 약 85℃를 초과하는 온도가 HTST를 위해 필요하고, 세포 배양 과정에 발생하는 것으로 문헌에 기재되고 많은 화학적 및 물리적 불활성화제에 저항성인 통상적인 세포 배양 바이러스 오염물질인 파르보바이러스의 불활성화를 위해 약 95℃를 초과하는 온도가 필요함이 보고되었다 (Schleh et al.).
HTST 처리가 바이러스의 불활성화에 매우 효과적인 것으로 입증되었지만, 상기 처리에 적용될 때 다양한 세포 배양 배지에서 침전물의 침전 또는 형성이 발생할 수 있다. 상기 침전은 HTST 시스템 내의 표면에 잔류물의 축적을 야기하고, 장치의 오손(fouling)에 기여하여 배지를 바이러스 오염물질의 적절한 불활성화를 위한 표적 온도로 더 이상 가열할 수 없다. 추가로, 상기 침전은 또한 배지로부터 미생물, 예컨대 박테리아를 제거하기 위한 최종 처리를 위해 HTST 시스템의 하류에서 일반적으로 사용되는 필터를 오손할 수 있다. 상기 필터 오손은 세포 배양 과정 전에 배지 처리 단계를 완료할 수 없도록 만들 수 있다. 일부 예에서, 침전물은 또한 세포 배양 배지의 기능에 영향을 줄 수 있고, 배양된 세포주로부터 생물학적 약물의 효율적인 생산을 억제할 수 있다. 침전을 방지하기 위해, 온도를 낮출 수 있지만, 성공적인 바이러스 불활성화에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 또한, HTST 세포 배지 처리 동안 침전물 형성은 제조 공정 동안 HTST 처리에 사용되는 장비의 빈번한 세정 또는 수리를 야기할 수 있고, 이것은 처리 비용을 유의하게 증가시킬 수 있다. 따라서, 바이러스 오염물질의 제거 또는 불활성화시에 상기 처리의 효능에 유해한 영향을 주지 않으면서 HTST 처리 동안 침전물 형성을 방지하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본원에서 설명되는 발명은 침전물 형성을 감소시키거나 방지하는, 처리 파라미터를 조정한 HTST 처리를 사용하여 세포 배양 배지 내의 바이러스 오염물질을 효과적으로 불활성화시키는 방법을 제공함으로써 상기 필요성을 해결한다.
특허 출원 및 간행물을 비롯하여 본원에서 인용되는 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 고온 단시간 (HTST) 처리를 다양한 파라미터, 예컨대 배지 내의 pH 및/또는 칼슘 및/또는 포스페이트 농도의 조정과 조합하여 사용함으로써 세포 배양 배지 내의 바이러스 오염 및/또는 다른 오염물질을 불활성화하기 위한 방법, 공정, 시스템 및 조성물을 제공한다. 또한, HTST 처리를 위해 사용되는 장치 및 필터의 오손을 감소시키기 위한 방법, 공정, 시스템 및 조성물도 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스 또는 우발적(adventitious) 물질을 불활성화하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하고; (b) pH, 칼슘 수준 및 포스페이트 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터를 조정하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9인, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2인, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이다. 다른 실시양태에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이다. 임의의 실시양태에서, HTST 처리는 배지 내의 바이러스 또는 잠재적인 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 배지의 온도를 적어도 약 85℃로 상승시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스 또는 잠재적인 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 93℃로 상승된다. 일부 실시양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스 또는 잠재적인 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 95, 97, 99, 101 또는 103℃로 상승된다. 일부 실시양태에서, 배지의 pH는 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 일부 실시양태에서, 배지의 pH는 이어서 폴리펩티드 생산기 동안 약 6.9-7.2이 된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 제한된다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 단백질 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용된 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 일부 실시양태에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이다. 일부 실시양태에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이다. 일부 실시양태에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다. 임의의 실시양태에서, HTST 처리는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 배지의 온도를 적어도 약 85℃로 상승시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 93℃로 상승된다. 일부 실시양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 95, 97, 99, 101 또는 103℃로 상승된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용되는 세포 배양 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 제한된다. 일부 실시양태에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다. 임의의 실시양태에서, 바이러스는 파르보비리다에(parvoviridae), 파라믹소비리다에(paramyxoviridae), 오르토믹소비리다에(orthomyxoviridae), 분야비리다에(bunyaviridae), 랍도비리다에(rhabdoviridae), 레오비리다에(reoviridae), 토가비리다에(togaviridae), 칼리시비리다에(caliciviridae) 및 피코르나비리다에(picornaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 실시양태에서, 바이러스는 외피보유 바이러스이다. 임의의 실시양태에서, 바이러스는 비-외피보유 바이러스이다.
도 1은 제조에 사용되는 대표적인 HTST 스키드(skid)의 개략도이다.
도 2는 샌드-배쓰(sand-bath) 방법 및 HTST 처리로부터 102℃ 표적 설정점까지의 가열 프로파일을 보여주는 그래프이다. 트레이스(trace)는 각각의 트레이스의 종점이 종점에서의 시간 및 온도에 의해 설명되는 가열 프로파일을 분 단위로 보여준다 (예를 들어, "6.2, 102"의 종점 값 = 6.2분에서의 종점 값은 102℃이었다).
도 3은 샌드-배쓰 방법에 의한 열 처리 후에 HTST 처리 동안 침전하는 것으로 알려진 배지 샘플의 사진이다. A) 열 처리된 압력 용기 내의 pH 7.0 또는 pH 6.4의 배지 1, 및 pH 7.0 또는 pH 6.7의 배지 2의 원심분리되지 않은 샘플. B) 처리된 압력 용기로부터의 pH 7.0 또는 pH 6.4의 배지 1, 및 pH 7.0 또는 pH 6.7의 배지 2의 원심분리된 분취액.
도 4는 샌드-배쓰 처리된 샘플 탁도의 보다 큰 수준과 연관성이 있는 파라미터 항목에 대한 배지 4 기반 배지 제제로부터 분류된 파라미터 추정치를 보여준다.
도 5는 샌드-배쓰 열 처리 동안 다양한 칼슘, 포스페이트 및 pH 수준을 갖는 배지 4 기반 제제에 대해 3개의 관점으로부터 탁도 (NTU)에 의해 측정된 침전 반응 표면을 보여주는 일련의 그래프이다. 격자무늬가 가시적인 각각의 투시면의 일부는 탁도가 5 NTU 미만이고, 시험된 배지 샘플 내의 가시적인 침전의 부재와 연관성이 있고 안전한 작동 방식을 나타내는 영역을 보여준다. a) 상이한 농도의 포스페이트 및 칼슘이 존재하는 배지에서 탁도 측정치를 보여주는 그래프의 측면도. b) 상이한 농도의 포스페이트 및 칼슘, c) 상이한 농도의 포스페이트 및 pH 수준, 및 d) 상이한 농도의 칼슘 및 pH 수준이 존재하는 배지에서 탁도 측정치를 보여주는 그래프의 상면도.
도 6은 알려진 및 추정된 칼슘 및 포스페이트 농도에 대해 pH 7.0의 배지 4 반응 표면에 위치한 배지 제제를 보여주는 그래프이다. 모든 제제 사이의 다른 조성 차이에도 불구하고, 칼슘 및 포스페이트 농도는 열 처리시의 침전 가능성과 강한 연관성을 보였다. 화살표는 추가의 수준의 포스페이트 및/또는 칼슘을 함유하는 가수분해물의 첨가에 의해 배지의 침전 형태로의 전환을 나타낸다.
도 7은 샌드-배쓰 시스템에서 4개의 배지 제제에 대한 평균 가열 프로파일을 갖는 그래프를 보여준다. 5개의 상이한 온도 종점을 취하였다 (2개의 수치로 표시되고, 예를 들어, "2.5, 75.9" = 2.5분에 취한 샘플, 생성되는 평균 온도 75.9℃). 우측의 사진에는 원심분리되지 않은 또는 원심분리된 샘플에서 관찰된 가시적인 침전과 연관성이 있는 채워진 또는 빈 원이 제시된다. 빈 원= 원심분리되지 않은 또는 원심분리된 샘플에서 가시적인 방법에 의해 침전이 검출되지 않음. 채워진 원= 두 샘플 모두 또는 하나에서 가시적인 방법에 의해 침전이 검출됨.
도 8은 4개의 상이한 배지 제제로부터 취한 5개의 상이한 온도 종점 샘플에 대한 탁도 (NTU) 값을 보여주는 그래프이다. ~8 NTU 초과의 탁도 값은 직접적인 가시적인 검사 또는 원심분리된 샘플의 검사에 의한 가시적인 침전 확인과 연관성이 있었다.
도 9는 HTST 처리 및 여과 조작이 성공적인 HTST 처리시에 철 (상부 패널) 및 구리 (하부 패널)의 손실을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 10은 열 처리 동안 상이한 a) pH 수준, b) 칼슘 (Ca) 농도, c) 포스페이트 (PO4) 농도, d) 철 (Fe) 농도 및 e) 구리 (Cu) 농도에 의한 철 회수에 대한 주요 효과 플롯을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 11은 열 처리 동안 철 회수에 대한 pH, Ca, PO4 및 Fe 사이의 상호작용을 보여주는 통계적으로 설계된 실험 (실험 설계 (DoE)) 결과로부터의 상호작용 플롯을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 12는 열 처리된 배지에서 초기의 Fe 농도에 대한 최종 Fe 농도의 의존성을 보여주는 그래프이다. 모든 다른 배지 성분은 통상적인 1.5x 배지 4 수준이었다.
도 13은 열 처리된 배지에서 몇 가지 파라미터의 조정에 대한 Fe 회수의 의존성을 보여주는 그래프이다. a) pH 수준에 대한 Fe 회수의 의존성, 및 b) 열 처리된 배지 내의 칼슘 및 포스페이트의 농도에 대한 Fe 회수의 의존성. 모든 다른 배지 성분은 통상적인 1.5x 배지 4 수준이었다. 배지 4에 대한 표준 농도는 x축 척도에 1로 표시된다.
도 14는 열 처리 후에 Fe 회수에 대한 칼슘 및 포스페이트 회수의 관계를 보여주는 그래프이다. 적색 원 내의 데이터 점은 가시적인 침전 및 증가된 탁도 (NTU)를 보인 샘플을 나타낸다. 선은 칼슘 데이터 점을 통한 관계를 나타낸다.
도 15는 HTST 처리 전 및 후에 다양한 세포 배양 배지 제제 내의 철 수준을 보여주는 그래프이다. 특정 세포 배양 배지 (예를 들어, 배지 14)의 경우, 좌측 막대는 HTST 처리 후의 세포 배양 배지 내의 철의 예상된 수준을 나타내고, 중앙 막대는 HTST 처리 전의 세포 배양 배지 내의 철의 실제 수준을 나타내고 (Pre-HTST), 우측 막대는 HTST 처리 후의 세포 배양 배지 내의 철의 실제 수준을 나타낸다 (Post-HTST).
도 16은 HTST 처리 배지에 대한 철의 첨가가 세포 배양시에 NS0 하이브리도마 세포주의 성장에 유익함을 보여주는 그래프이다. HTST+는 HTST 처리에 적용된 세포 배양 배지를 나타낸다. HTST-는 HTST 처리에 적용되지 않은 세포 배양 배지를 나타낸다. Fe는 보충된 철의 존재를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 세포 배양 배지의 pH의 조정, 칼슘 농도의 조정, 포스페이트 농도의 조정, 칼슘 및 포스페이트 농도 둘 모두의 조정, 및/또는 세포 배양 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량의 제한, 또는 pH, 칼슘 농도, 및 포스페이트 농도의 조합의 조정, 및 배양 배지를 충분한 시간 동안 특정 온도 범위에서 HTST 처리에 적용하는 것이 배지 내의 바이러스 (또는 다른 감염성 및/또는 우발적 물질)의 불활성화에 효과적이고 또한 침전물 형성을 최소화하거나 방지함으로써 장치의 오손을 감소시킴을 예기치 않게 밝혀내었다.
본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 고온 단시간 (HTST) 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전물을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용되는 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9 또는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 고온 단시간 (HTST) 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전물을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용된 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 다른 측면에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전물을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용되는 세포 배양 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다.
I. 일반적인 기술
본원에서 설명되거나 언급되는 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고 있고, 예를 들어 통상의 기술자에 의해 다음 문헌에 기재된 널리 이용되는 방법과 같은 통상적인 방법을 사용하여 통상적으로 사용된다: [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; [the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
II. 정의
세포의 "배양"은 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 세포의 증식에 적합한 조건 하에 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 의미한다.
"회분식 배양"은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 공정 개시시에 배양 용기에 공급되는 배양을 의미한다.
문구 "유가식(fed batch) 세포 배양"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 및 배양 배지가 배양 용기에 초기에 공급되고, 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수거를 실시하거나 실시하지 않으면서 추가의 배양 영양소가 배양 공정 동안 배양물에 연속적으로 또는 불연속적인 증가량으로 공급되는 회분식 배양을 의미한다.
"관류 배양"은 세포가 예를 들어 여과, 캡슐화(encapsulation), 미세담체( microcarrier)에 대한 고정 등에 의해 배양물 내에 제한되고 배양 배지가 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 배양 용기로부터 제거되는 배양이다.
"배양 용기"는 세포를 배양하기 위해 사용되는 용기를 의미한다. 배양 용기는 세포 배양에 유용하다면 임의의 크기일 수 있다.
용어 "배지" 및 "세포 배양 배지"는 세포를 성장시키거나 유지하기 위해 사용되는 영양소 공급원을 의미한다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 영양소 공급원은 성장 및/또는 생존을 위해 세포가 필요로 하는 성분을 함유할 수 있거나 또는 세포 성장 및/또는 생존을 돕는 성분을 함유할 수 있다. 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산, 및 미량 원소가 배지 성분의 예이다. "배지" 및 "배지들"은 본 명세서 전체에 걸쳐 교환가능하게 사용됨이 이해되어야 한다.
"화학적으로 한정된 세포 배양 배지" 또는 "CDM"은 동물-유래 또는 한정되지 않은 생성물, 예컨대 동물 혈청 및 펩톤이 존재하지 않는 특정 조성을 갖는 배지이다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, CDM은 세포가 CDM과 접촉하여 폴리펩티드를 CDM 내로 분비하는 폴리펩티드 생산 공정에서 사용될 수 있다. 따라서, 조성물이 CDM 및 폴리펩티드 생성물을 함유할 수 있고, 폴리펩티드 생성물의 존재가 CDM을 화학적으로 한정되지 않은 것으로 만들지 않음이 이해된다.
"화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지"는 그의 화학적 조성이 특정될 수 없고 하나 이상의 동물-유래 또는 한정되지 않은 생성물, 예컨대 동물 혈청 및 펩톤을 함유할 수 있는 배지를 의미한다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지는 동물-유래 생성물을 영양소 공급원으로서 함유할 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지쇄일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 사이에 존재할 수 있다. 이 용어는 또한 천연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 정의에는 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함), 및 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드를 포함된다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 사용되는 바와 같이 구체적으로 항체를 포함한다.
"단리된 폴리펩티드"는 그로부터 폴리펩티드가 발현되는 세포 또는 세포 배양으로부터 회수된 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 교환가능하게 사용되는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 형성 전 또는 후에 이루어질 수 있다.
"단리된 핵산"은 그의 통상적인 상황을 벗어나거나 상황으로부터 분리된 비-천연 생성, 재조합 또는 천연 생성 서열을 의미하고 포함한다.
"정제된" 폴리펩티드는 폴리펩티드가 그의 천연 환경에서 존재하는 것보다 및/또는 초기에 생산될 때보다 및/또는 실험 존건 하에 합성 및/또는 증폭될 때보다 순도가 증가됨을 의미한다. 순도는 상대적인 용어이고, 반드시 절대적인 순도를 의미하지는 않는다.
용어 "항체(들)"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 예를 들어 단일 모노클로날 항체 (효능제, 길항제, 및 중화 항체 포함), 다중에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 면역어드헤신, 및 요구되는 생물학적 또는 면역학적 활성을 보인다면 항체의 단편을 포괄한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 교환가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일쇄 항체 분자; 디아바디(diabody); 선형 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 이루는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 천연 생성 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 작용하며, 특이성이 높다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조). 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종에서 유래하거나 또 다른 항체 종류 또는 하위부류에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예, 구세계 원숭이, 유인원 등)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화(primatized)" 항체를 포함한다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체에서 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체인 비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 형태이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수여체의 초가변 영역의 잔기가 요구되는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 교체된 인간 이뮤노글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 대응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 대개 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 대개 인간 이뮤노글로불린의 Fc를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
"오염물질"은 요구되는 폴리펩티드 생성물과 상이한 물질을 의미한다. 오염물질은 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 요구되는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물질; 세포 배양 배지 성분 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "침전물"은 용액 내의 고체 또는 불용성 입자의 형성을 의미한다. 다양한 형태의 침전물이 발생하고, 예시적인 침전물이 본원에서 설명된다. 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 인산칼슘 침전, 불용성 휘틀로카이트(whitlockite), 옥시드, 인산철, 및 인산칼슘철 침전물. 인산칼슘 침전은 용액 내의 칼슘 및 포스페이트가 불용성 입자, 즉, 침전물을 형성하는 과정일 수 있다. 불용성 입자는 인산칼슘으로 언급될 수 있다. 인산칼슘은 비제한적으로 다음을 포함한다: 제일인산칼슘, 제이인산칼슘, 제삼인산칼슘, 휘틀로카이트, 및 히드록시아파타이트. 불용성 입자는 추가의 성분, 즉 폴리펩티드, 핵산, 지질, 이온, 킬레이터, 및 금속을 포함할 수 있다. 또한, 추가의 침전 또는 응집, 침강, 및/또는 재배열에 의한 상기 입자의 성장이 상기 정의에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오손"은 원치 않는 물질의 처리 장치의 표면 상의 축적 및 형성을 의미한다. 오손은 화학물질, 용해도, 부식 및 생물학적 공정이 또한 발생하는, 조합된, 불안정한 상태, 모멘텀, 질량 및 열 전달 문제로서 특징지을 수 있다. 오손은 침전, 즉, 인산칼슘 침전에 의한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "우발적 물질"은 바이러스 및 박테리아 (멸균 등급 필터를 통과할 수 있는 박테리아 포함)를 포함한다. "감염원"은 "우발적 물질"의 한 종류이다.
본원에서 설명되는 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하다", "이로 이루어지다" 및 "본질적으로 이로 이루어지다"를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용하기 위해, 달리 분명하게 나타내지 않으면, 용어 "a", "an" 등의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
본원에서 값 또는 파라미터 앞에 "약"의 사용은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함한다 (그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"의 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 수치를 포함하는 것이다.
III. 세포 배양 배지
세포 배양 배지 내의 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질을 불활성화하는 방법은 바이러스 오염, 가능한 바이러스 오염 또는 다른 감염원에 의한 오염 또는 우발적 물질에 의한 오염에 대한 우려가 존재하는 임의의 종류의 세포 배양 배지에 적용될 수 있다. 본 발명은 조성물 및 방법이 가능한 바이러스 오염 및 실제 바이러스 오염이 존재하는 세포 배양물 및 세포 배양 배지에 적용될 수 있음을 고려함이 이해된다.
바이러스 불활성화, 침전물 형성의 감소 및 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손의 감소 방법은 바이러스, 우발적 물질, 및 다른 감염원이 불활성화된 세포 배양 배지의 조성물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 바이러스 불활성화, 우발적 물질 불활성화, 및/또는 감염원 불활성화의 시스템을 통과하면서 세포 배양 배지 및 그의 중간체의 임의의 조성물이 고려되고, 본원에서 상세하게 설명된다. 구체적인 세포 배양 배지 파라미터 (pH, 칼슘 수준 및 포스페이트 수준)의 조정은 배지에 존재하는 바이러스 오염물질 및 다른 오염물질의 불활성화에 효과적인 온도에서 HTST 처리에 적용된 후 배지 내의 침전물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.
세포 배양 배지 파라미터, 예컨대 pH, 칼슘 농도 또는 양, 및 포스페이트 농도 또는 양 (및 이들의 임의의 조합)의 독립적인 조정은 모두 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 침전물 (예를 들어 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 복합체)을 감소시키기 위해, HTST 장치의 오손을 감소시키기 위해, 필터 오손을 감소시키기 위해 HTST 처리와 함께 사용될 수 있다. 세포 배양을 위한 적합성을 유지하는 세포 배양 배지는 세포 증식, 성장, 생존, 임의의 폴리펩티드, 단백질 또는 화합물의 생산, 임의의 상기 생성물의 배지 내로의 분비, 및 세포 배양의 적합성 목적을 위해 포함되는 것으로 통상의 기술자가 이해하는 임의의 다른 특징을 허용한다.
본원에서 설명되는 세포 배양 파라미터의 독립적인 조정은 임의의 세포 배양 과정에 적용될 수 있고, 폴리펩티드 및/또는 단백질의 생산뿐만 아니라 다른 생성물, 예컨대 세포, 배지 및 배지 내의 다른 성분의 생성에도 유익할 수 있다. 세포 배양 배지 내의 침전물의 감소 또는 억졔를 위한 상기 세포 배양 배지 파라미터의 조정은 생물학적 약물, 예컨대 폴리펩티드 약물 제품의 생산에 유익하다. 상기 파라미터 또는 성분이 조정된 세포 배양 배지의 사용은 생물학적 약물 생성물로부터 바이러스 오염물질의 제거뿐만 아니라, 세포 배양 배지의 성능에 영향을 주고 배양된 세포주로부터 생물학적 약물의 효율적인 생산을 억제하고 HTST 장치의 오손의 기여할 수 있는 침전물의 감소 또는 억제에 효과적일 수 있다. 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 배지를 임의의 세포 성장, 유지 및 생물학적 약물 생산 시기에 사용될 수 있고, 기초 배지 및/또는 공급 배지에 사용될 수 있다. 한 변형 양태에서 본원에서 설명되는 배지는 HTST 처리에 적용된 배지에서 성장한 세포 배양물로부터 단리된 생물학적 약물을 포함하는 조성물의 허용가능한 탁도 또는 침전물 수준을 생성한다.
하나 이상의 다음 성분을 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다: (a) 칼슘 및 (b) 포스페이트. 일부 변형 양태에서, 세포 배양 배지는 성분 (a) 또는 (b), 또는 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 다른 변형 양태에서, 세포 배양 배지는 성분 (a) 및 (b)를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 배지 제조를 위해 사용되는 원료 및 취급으로부터 잠재적으로 존재하는 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST로 처리된다.
배지 성분은 관련 기술분야에 공지된 형태로 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 칼슘은 염화칼슘, 염화칼슘 탈수물, 탄산칼슘, 인산칼슘, 제삼인산칼슘, 칼슘 L-락테이트 수화물, 폴린산칼슘, 및 질산칼슘 사수화물 (이로 제한되지 않음)로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 포스페이트는 인산나트륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 제일인산칼륨, 포스페이트 완충 염수, 인산칼슘, 및 제이인산칼슘 (이로 제한되지 않음)으로서 제공될 수 있다.
포스페이트 및 칼슘의 비는 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 복합체 (예를 들어, 인산칼슘 (CaPO4) 복합체)가 형성되지 않도록 HTST 처리를 위해 조정될 수 있다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 및 칼슘의 총량은 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 복합체 (예를 들어, 인산칼슘 (CaPO4) 복합체)가 형성되지 않도록 조정되거나 제한된다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 및 칼슘의 총량은 CaPO4 복합체의 형성이 성공적인 HTST 작동 (예를 들어 HTST 및 여과 장치의 오손 미발생)을 가능하게 하도록 제한된다. 문제를 일으키는 조건의 검출 방법은 일반적으로 탁도를 비롯한 침전에 대한 간접적인 측정, HTST 및 여과 장치의 작동 관찰, 및 HTST 및 여과 장치의 가시적인 관찰 (예를 들어 보어스코프(boroscope)의 사용에 의한)을 수반한다. 한 측면에서, 배지는 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 포스페이트 및 칼슘의 배지 내 농도는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 포스페이트 및 칼슘의 배지 내 농도는 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 변형 양태에서, 총 포스페이트 및 칼슘의 배지 내 농도는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 본 발명의 임의의 측면에서, 배지 내의 칼슘 및 포스페이트의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 본 발명의 추가의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지에는 칼슘 및 포스페이트가 존재하지 않는다.
세포 배양 배지 내의 칼슘 수준은 배지가 포스페이트를 포함하는 경우 조정될 수 있다. 조정은 칼슘 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼슘 수준은 감소된다 (칼슘의 제거 포함). 다른 실시양태에서, 칼슘 수준은 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 감소된다. 다른 실시양태에서, 칼슘은 HTST 처리 전에 배지로부터 제거된다. 임의의 이들 실시양태에서, pH는 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 (예를 들어, 상기 조정이 이루어지지 않을 경우에 형성되는 복합체에 비해 양이 감소하도록) 조정된다. 다른 실시양태에서, 칼슘 수준은 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 처리 후에 추가로 조정될 수 있다. HTST 처리와, 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 후에 칼슘 수준의 조정 사이의 타이밍은 변할 수 있다. 초, 분, 일, 주, 월 또는 연의 시간 경과가 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
또 다른 변형 양태에서, 배지는 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 칼슘의 배지 내 농도는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 칼슘의 배지 내 농도는 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 칼슘의 배지 내 농도는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 본 발명의 임의의 측면에서, 배지 내의 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 본 발명의 추가의 측면에서, 배지 내의 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 일부 측면에서 세포 배양 배지에는 포스페이트가 존재하지 않는다.
또 다른 측면에서, 포스페이트 수준은 배지가 칼슘을 포함하는 경우 조정될 수 있다. 조정은 포스페이트 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 수준은 감소된다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 수준은 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 감소된다. 일부 실시양태에서, 포스페이트는 HTST 처리 전에 배지로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, pH는 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 조정된다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 수준은 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 처리 후에 추가로 조정된다. HTST 처리와, 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 후에 포스페이트 수준의 조정 사이의 타이밍은 변할 수 있다. 초, 분, 일, 주, 월 또는 연의 시간 경과가 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
또 다른 변형 양태에서, 배지는 포스페이트의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 포스페이트의 배지 내 농도는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 포스페이트의 배지 내 농도는 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 또 다른 변형 양태에서, 총 포스페이트의 배지 내 농도는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 1 mM 내지 약 9 mM; 약 2 mM 내지 약 8 mM; 약 3 mM 내지 약 7 mM; 약 4 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 8 mM; 약 1 mM 내지 약 7 mM; 약 1 mM 내지 약 6 mM; 약 1 mM 내지 약 5 mM; 약 1 mM 내지 약 4 mM; 약 1 mM 내지 약 3 mM; 약 1 mM 내지 약 2 mM; 약 2 mM 내지 약 9 mM; 약 3 mM 내지 약 9 mM; 약 4 mM 내지 약 9 mM; 약 5 mM 내지 약 9 mM; 약 6 mM 내지 약 9 mM; 약 7 mM 내지 약 9 mM; 약 8 mM 내지 약 9 mM; 약 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1 mM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 mM 중 어느 것 내지 약 9 mM 이하이다. 본 발명의 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 본 발명의 추가의 측면에서, 배지 내의 포스페이트의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 일부 측면에서 세포 배양 배지에는 칼슘이 존재하지 않는다.
한 변형 양태에서, 세포 배양 배지는 (a) 또는 (b), 또는 (a) 및 (b)의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 성분 (a) 및 (b)의 1 또는 2개 또는 각각을 본원에서 언급되는 농도로 포함한다. 세포 배양 배지는 각각의 및 모든 농도가 마치 구체적이고 개별적으로 나열된 것처럼 본원에서 제시되는 임의의 농도 범위에서 성분 (a) 및 (b)의 조합을 함유할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 한 변형 양태에서 배지는 성분 (a) 및 (b)를 포함하고, 여기서 칼슘은 약 0.5 mM이고, 포스페이트는 약 2.5 mM임이 이해된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 칼슘이 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 칼슘은 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 포스페이트가 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 포스페이트는 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다.
한 변형 양태에서, 배지는 포스페이트 농도가 약 0 mM 내지 약 1 mM이고 칼슘 농도가 약 0.5 mM 내지 약 3 mM인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1 mM 내지 약 1.25 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 2.5 mM이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.25 mM 내지 약 1.5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 2.25 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.5 mM 내지 약 1.75 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 2 mM이다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.75 mM 내지 약 2 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1.75 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2 mM 내지 약 2.25 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1.5 mM이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2 mM 내지 약 2.25 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1.5 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.25 mM 내지 약 2.5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1.25 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.5 mM 내지 약 2.75 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1.15 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.75 mM 내지 약 3 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1 mM이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 3 mM 내지 약 3.5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 0.8 mM이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 3.5 mM 내지 약 4.5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 0.6 mM이다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 4.5 mM 내지 약 5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 0.5 mM이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 5 mM 내지 약 5.5 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 0.25 mM이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 5.5 mM 내지 약 6 mM이고, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 0.1 mM이다. 또 다른 측면에서, pH, 칼슘 및 포스페이트의 파라미터는 탁도 (인산칼슘 기반 침전의 간접적인 척도로서)가 격자무늬 영역 내에 존재하고 (여기서, 격자무늬 영역은 본 예에서 5 NTU의 전반적인 실패(gross-failure) 탁도 역치 또는 그 미만의 탁도 값을 나타냄) 비-격자무늬 영역에 제시된 침전 범위를 벗어나도록 (여기서, 비-격자무늬 영역은 5 NTU의 전반적인 실패 탁도 역치 초과의 탁도 반응을 나타냄) 예시적인 도 5 (예컨대 도 5b, 도 5c, 및 도 5d)에 제시된 바와 같이 독립적으로 조정될 수 있다. 도 5에 도시된 반응 표면은 탁도 (인산칼슘 기반 침전의 간접적인 척도로서)에 대한 pH, 칼슘 농도, 및 포스페이트 농도의 다중 인자 효과를 보여준다. 따라서, 반응 표면은 처리되는 배지 내의 허용가능한 칼슘 및 포스페이트 농도와 조합하여 pH에 대한 허용가능한 HTST 처리 작동 설정점을 발견하기 위해 한번에 하나의 인자가 아니라 인자들이 조합하여 조정될 수 있는 방식을 보여준다.
조절될 수 있는 또 다른 독립적인 파라미터 (다른 독립적인 파라미터로서의 칼슘 및 포스페이트 이외의)는 pH이다. 따라서, pH는 배지가 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 경우 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 HTST 처리 전에 배지 제조시에 적합한 낮은 수준으로 조정된다. 일부 실시양태에서, pH는 적합한 수준으로 저하시킴으로써 조정된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 7.2 미만으로 조정된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 5.0 - 7.2로 조정된다. 일부 실시양태에서, pH는 HTST 처리 후에 세포 배양에 적합한 수준으로 추가로 조정된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.9 - 7.2로 조정된다. HTST 처리와, 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 후에 pH 수준의 조정 사이의 타이밍은 변할 수 있다. 초, 분, 일, 주, 월 또는 연의 시간 경과가 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
다른 측면에서, pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2인 세포 배양 배지가 제공된다. 한 측면에서, pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9인 세포 배양 배지가 제공된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 이것은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전의 것일 수 있다. 임의로, 통상의 기술자는 배지의 pH가 세포 배양 과정에 적합하도록 배지의 pH를 HTST 처리 후에 조정할 수 있다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 한 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다.
한 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 7.2; 약 5.0 내지 약 6.9; 약 5.2 내지 약 6.7; 약 5.4 내지 약 6.5; 약 5.6 내지 약 6.3; 약 5.8 내지 약 6.1; 약 5.9 내지 약 6.0; 약 5.0 내지 약 6.7; 약 5.0 내지 약 6.5; 약 5.0 내지 약 6.3; 약 5.0 내지 약 6.1; 약 5.0 내지 약 5.9; 약 5.0 내지 약 5.7; 약 5.0 내지 약 5.5; 약 5.0 내지 약 5.3; 약 5.0 내지 약 5.1; 약 5.2 내지 약 6.9; 약 5.4 내지 약 6.9; 약 5.6 내지 약 6.9; 약 5.8 내지 약 6.9; 약 6.0 내지 약 6.9; 약 6.0 내지 약 6.9; 약 6.2 내지 약 6.9; 약 6.4 내지 약 6.9; 약 6.6 내지 약 6.9; 약 5.0 또는 5.2 또는 5.4 또는 5.6 또는 5.8 또는 6.0 또는 6.2 또는 6.4 또는 6.6 또는 6.8 또는 6.9; 적어도 약 5.0 또는 5.2 또는 5.4 또는 5.6 또는 5.8 또는 6.0 또는 6.2 또는 6.4 또는 6.6 또는 6.8 및 약 6.9 이하이다. 한 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 5.0 내지 약 6.9; 약 5.2 내지 약 6.7; 약 5.4 내지 약 6.5; 약 5.6 내지 약 6.3; 약 5.8 내지 약 6.1; 약 5.9 내지 약 6.0; 약 5.0 내지 약 6.7; 약 5.0 내지 약 6.5; 약 5.0 내지 약 6.3; 약 5.0 내지 약 6.1; 약 5.0 내지 약 5.9; 약 5.0 내지 약 5.7; 약 5.0 내지 약 5.5; 약 5.0 내지 약 5.3; 약 5.0 내지 약 5.1; 약 5.2 내지 약 6.9; 약 5.4 내지 약 6.9; 약 5.6 내지 약 6.9; 약 5.8 내지 약 6.9; 약 6.0 내지 약 6.9; 약 6.0 내지 약 6.9; 약 6.2 내지 약 6.9; 약 6.4 내지 약 6.9; 약 6.6 내지 약 6.9; 약 5.0 또는 5.2 또는 5.4 또는 5.6 또는 5.8 또는 6.0 또는 6.2 또는 6.4 또는 6.6 또는 6.8 또는 6.9; 적어도 약 5.0 또는 5.2 또는 5.4 또는 5.6 또는 5.8 또는 6.0 또는 6.2 또는 6.4 또는 6.6 또는 6.8 및 약 6.9 이하이다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 이것은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전의 것일 수 있다. 배지는 HTST 처리 후에 필요한 바에 따라 세포 배양 과정에 적합한 pH로 조정될 수 있다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다.
한 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지의 pH는 pH 약 6.9 내지 약 7.2; 약 7.0 내지 약 7.1; 약 6.9 내지 약 7.1; 약 6.9 내지 약 7.0; 약 7.0 내지 약 7.2; 약 7.1 내지 약 7.2; 약 6.9 또는 7.0 또는 7.1 또는 7.2; 적어도 약 6.9 또는 7.0 또는 7.1 및 약 7.2 이하이다. 한 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 pH 약 6.9 내지 약 7.2; 약 7.0 내지 약 7.1; 약 6.9 내지 약 7.1; 약 6.9 내지 약 7.0; 약 7.0 내지 약 7.2; 약 7.1 내지 약 7.2; 약 6.9 또는 7.0 또는 7.1 또는 7.2; 적어도 약 6.9 또는 7.0 또는 7.1 및 약 7.2 이하이다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2이다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2이다.
한 변형 양태에서, 배지는 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이고 포스페이트 및 칼슘의 총량이 약 10 mM 미만인 세포 배양 배지이다. 한 변형 양태에서, 배지는 HTST 처리 동안 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이고 포스페이트 및 칼슘의 총량이 약 10 mM 미만인 세포 배양 배지이다. 임의의 변형 양태에서, pH는 및 칼슘 및 포스페이트의 양은 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 양이다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 칼슘이 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 칼슘은 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 포스페이트가 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 포스페이트는 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다.
한 변형 양태에서, 배지는 포스페이트 농도가 약 0 mM 내지 약 0.5 mM이고 pH가 약 6.4 내지 약 7.4인 세포 배양 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 0.5 mM 내지 약 0.75 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7.35이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 0.75 mM 내지 약 1 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7.25이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1 mM 내지 약 1.25 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7.2이다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.25 mM 내지 약 1.5 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7.1이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.5 mM 내지 약 1.75 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7.05이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 1.75 mM 내지 약 2 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 7이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2 mM 내지 약 2.25 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.9이다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.25 mM 내지 약 2.5 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.85이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.5 mM 내지 약 2.75 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.75이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 2.75 mM 내지 약 3 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.7이다. 추가의 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 3 mM 내지 약 3.25 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.6이다. 한 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 3.25 mM 내지 약 3.5 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.5이다. 또 다른 변형 양태에서, 포스페이트 농도는 약 3.5 mM 내지 약 3.75 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.45이다.
한 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0 mM 내지 약 1 mM이고, pH는 약 6.65 내지 약 7.4이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0.1 mM 내지 약 0.25 mM이고, pH는 약 6.55 내지 약 7.4이다. 추가의 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0.25 mM 내지 약 0.5 mM이고, pH는 약 6.5 내지 약 7.4이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0.5 mM 내지 약 0.6 mM이고, pH는 약 6.5 내지 약 7.2이다. 한 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0.6 mM 내지 약 0.75 mM이고, 및 pH는 약 6.5 내지 약 7이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 0.75 mM 내지 약 1 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.9이다. 추가의 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 1 mM 내지 약 1.1 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.8이다. 추가의 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 1.1 mM 내지 약 1.25 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.7이다. 한 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 1.25 mM 내지 약 1.5 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.65이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 1.5 mM 내지 약 1.75 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.55이다. 추가의 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 1.75 mM 내지 약 2 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.5이다. 한 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 2 mM 내지 약 2.25 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.45이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 2.25 mM 내지 약 2.5 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.43이다. 추가의 변형 양태에서, 칼슘 농도는 약 2.5 mM 내지 약 2.6 mM이고, pH는 약 6.4 내지 약 6.41이다.
개별적인 배지 성분은 하나 이상의 유리한 특성, 예컨대 바이러스 불활성화, 침전물 형성의 감소 및 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손 감소를 유도하는 양으로 존재할 수 있다. 한 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 세포 배양 배지는 표 1에 기재된 배지 파라미터를 함유한다. 배지 조성물은 표 1의 임의의 하나 이상의 배지 성분 (예를 들어, 임의의 하나 이상의 성분 (a)-(c))을 포함할 수 있음이 이해되고, 예컨대 배지 조성물은 각각의 및 모든 성분 및 양이 마치 구체적이고 개별적으로 나열된 것처럼 표 1에 나열된 임의의 양으로 각각의 성분 (a), (b), 및 (c)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 각각의 성분 (a), (b), 및 (d)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 성분 (a) 및 (b)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 각각의 성분 (a) 및 (c)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 각각의 성분 (b) 및 (c)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 각각의 성분 (a) 및 (d)를 포함하거나, 또는 배지 조성물은 각각의 성분 (b) 및 (d)를 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 칼슘이 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 칼슘은 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다. 임의의 측면에서, 배지에는 HTST 처리 동안 포스페이트가 존재하지 않는다. 추가의 측면에서, 포스페이트는 HTST 처리 후에 세포 배양 배지에 첨가된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다.
Figure 112015004197269-pct00001
Figure 112015004197269-pct00002
한 변형 양태에서 본원에서 제공되는 배지는 칼슘 및 포스페이트를 포함한다. 한 변형 양태에서, 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 배지는 공급 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 배지는 기초 배지이다. 일부 측면에서, 공급 배지는 생산 배지이다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 단백질 발현을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 한 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다.
한 변형 양태에서 본원에서 제공되는 배지는 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9인 세포 배양 배지를 포함한다. 한 변형 양태에서, 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 배지는 공급 배지이다. 또 다른 변형 양태에서, 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 배지는 기초 배지이다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정된 세포 배양 배지이다. 다른 측면에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 한정되지 않은 세포 배양 배지이다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 바이러스를 불활성화하기 위해 사용된다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 임의의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다.
변형 양태에서, 본 발명은 세포 배지 성분이 실시예 2에서 상세하게 설명되는 바와 같이 반응 표면을 사용하여 조정된 배지를 제공한다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 세포 배지 성분이 도 5 및 도 6에서 반응 표면을 사용하여 조정된 배지를 제공한다.
변형 양태에서, 본 발명은 배지가 HTST 처리에 적용된 후 미량 금속이 배지에 첨가되는 배지를 제공한다. 한 측면에서, 미량 금속은 철 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 미량 금속이다. 변형 양태에서, 본 발명은 배지가 HTST 처리에 적용된 후 철이 약 1 μM 내지 약 125 μM의 양으로 배지에 첨가되는 배지를 제공한다. 또 다른 변형 양태에서, 철의 배지 내 농도는 배지가 HTST 처리에 적용된 후 약 1 μM 내지 약 125 μM; 약 10 μM 내지 약 120 μM; 약 20 μM 내지 약 110 μM; 약 30 μM 내지 약 100 μM; 약 40 μM 내지 약 90 μM; 약 50 μM 내지 약 80 μM; 약 60 μM 내지 약 70 μM; 1 μM 내지 약 120 μM; 1 μM 내지 약 110 μM; 1 μM 내지 약 100 μM; 1 μM 내지 약 90 μM; 1 μM 내지 약 80 μM; 1 μM 내지 약 70 μM; 1 μM 내지 약 60 μM; 1 μM 내지 약 50 μM; 1 μM 내지 약 40 μM; 1 μM 내지 약 30 μM; 1 μM 내지 약 20 μM; 1 μM 내지 약 10 μM; 10 μM 내지 약 125 μM; 20 μM 내지 약 125 μM; 30 μM 내지 약 125 μM; 40 μM 내지 약 125 μM; 50 μM 내지 약 125 μM; 60 μM 내지 약 125 μM; 70 μM 내지 약 125 μM; 80 μM 내지 약 125 μM; 90 μM 내지 약 125 μM; 100 μM 내지 약 125 μM; 110 μM 내지 약 125 μM; 120 μM 내지 약 125 μM; 약 1 또는 10 또는 20 또는 30 또는 40 또는 50 또는 60 또는 70 또는 80 또는 90 또는 100 또는 110 또는 120 또는 125 μM 중 어느 것; 적어도 약 1 또는 10 또는 20 또는 30 또는 40 또는 50 또는 60 또는 70 또는 80 또는 90 또는 100 또는 110 또는 120 μM 중 어느 것 내지 약 125 μM 이하이다.
한 측면에서 본원에서 제공되는 배지는 상이한 배지가 HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화를 위해 사용될 때의 특징에 비해, HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화를 위한 방법에 사용될 때 하나 이상의 유리한 특징을 유도한다. 생물학적 약물 생성물 (예를 들어, 항체 생성물)의 생산을 위해 바이러스의 불활성화를 위한 HTST 처리에 적용된 세포 배양 배지 내의 침전물 형성은 생물학적 약물 생성물의 품질 특징, 예컨대 생물학적 약물 생성물의 활성에 영향을 줄 수 있다. 또한, HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전물 형성은 HTST 장치의 오손을 유발할 수 있다. HTST 장치의 오손은 바이러스를 효과적으로 불활성화하는 HTST 처리의 능력에 영향을 줄 수 있다. 한 측면에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다. 한 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 배지는 HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화를 위해 사용되는 상이한 배지 내의 침전에 비해, HTST 처리 동안 세포 배양물 내의 바이러스의 불활성화 방법에 사용될 때 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시킨다. 또 다른 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 배지는 HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화를 위해 사용되는 상이한 배지에 의한 HTST 장치의 오손에 비해, HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화 방법에 사용될 때 HTST 장치의 오손을 감소시킨다. 또 다른 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 배지는 상이한 배지의 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전에 비해, 배지의 HTST 처리 동안 바이러스의 불활성화 방법에 사용될 때 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 감소시킨다. 또 다른 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 배지는 상이한 배지 내의 바이러스 불활성화에 비해 배지의 HTST 처리 방법에 사용될 때 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화한다. 또 다른 변형 양태에서, 본원에서 제공되는 배지는 상이한 배지 내의 바이러스 불활성화에 비해 배지의 HTST 처리 방법에서 필터 오손을 야기하는 침전을 감소시킨다.
한 관찰은 세포 배양 (폴리펩티드/단백질의 생산, 세포 성장, 생존 및/또는 증식 포함)에 중요할 수 있는 미량 금속, 예컨대 구리 및 철이 HTST 처리 과정에서 감소된다는 점이다. 따라서, 본 발명은 또한 세포 배양 배지가 세포 배양에 대한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스 또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하고; (b) pH, 칼슘 수준 및 포스페이트 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터를 조정하는 것을 포함하고, 여기서 미량 금속 농도가 추가로 조정된다. 미량 금속은 철 또는 구리일 수 있다. 철 및/또는 구리 농도는 HTST 처리 전에 배지 내에서 독립적으로 조정될 수 있다. 일부 예에서, 철 및/또는 구리 농도의 감소가 예상되고 감소량이 일반적으로 알려져 있으면, 철 및/또는 구리는 HTST 처리 전에 배지에 첨가될 수 있다. 감소의 양이 알려져 있지 않은 경우에는, 철 및/또는 구리는 HTST 처리 전에 배지로부터 감소될 수 있다 (제거 포함). 이어서, 철 및/또는 구리는 세포 배양에 적합한 수준으로 HTST 처리 후 배지에 보충될 수 있다.
IV. 본 발명의 조성물 및 방법
본원에서 상세하게 설명되는 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질의 불활성화 방법에 사용될 수 있다. 배지는 회분식 배양, 유가식 배양 또는 관류 배양에 의해 세포를 배양하는 방법에 사용될 수 있다. 배지는 항체를 포함하는 폴리펩티드를 생산하기 위해서 세포를 배양하는 방법에 사용될 수 있다. 배지는 조직 치환술 또는 유전자 요법 적용을 위해 사용되는 것을 포함하는 세포 기반 생성물을 생성하기 위해 세포를 배양하는 방법에 사용될 수 있다. 배지는 잠재적인 바이러스 오염의 방지가, 배지가 세포를 배양하는 능력을 유지하도록 하면서 바이러스를 불활성화하는 열 처리의 이용으로부터 이로움을 얻는 임의의 세포 배양 용도에 사용될 수 있다. 배지는 본원에서 설명되는 열 처리의 임의의 변형 양태 또는 실시양태에 적용되는 세포 배양 배지 내의 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질을 불활성화하는 방법에 사용될 수 있다.
본원에서 상세하게 설명되는 세포 배양 배지 내의 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질을 불활성화하는 방법이 제공되고, 여기서 세포 배양 배지는 HTST 처리에 적용된다. 한 변형 양태에서, 이 방법은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지는 표 1에 설명된 하나 이상의 배지 성분을 포함한다 (예를 들어, 배지는 표 1에 나열된 임의의 양으로 성분 (a) 및 (b)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (a) 및 (c)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (b) 및 (c)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (a) 및 (d)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (b) 및 (d)를 포함하거나 또는 배지는 각각의 성분 (a)-(c) 또는 (a), (b), 및 (d)를 포함한다).
바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키는 방법이 제공되고, 여기서 본원에서 상세하게 설명되는 세포 배양 배지는 장치에 사용되고 HTST 처리에 적용된다. 한 변형 양태에서, 이 방법은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지는 표 1에 설명된 하나 이상의 배지 성분을 포함한다 (예를 들어, 배지는 표 1에 나열된 임의의 양으로 성분 (a) 및 (b)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (a) 및 (c)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (b) 및 (c)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (a) 및 (d)를 포함하거나 또는 배지는 성분 (b) 및 (d)를 포함하거나 또는 배지는 각각의 성분 (a)-(c) 또는 (a), (b), 및 (d)를 포함한다). 특정 변형 양태에서, 오손은 침전물 오손이다. 한 변형 양태에서, 오손은 필터 오손이다.
A. 세포 배양 배지 내의 바이러스 불활성화 및 감염원 및/또는 우발적 물질의 불활성화를 위한 방법
일부 변형 양태에서, 본 발명은 고온 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질을 불활성화하는 방법을 제공하고, 여기서 배지는 부적합한 배지에 비해 열 처리를 위해 적합하다. 예를 들어, 부적합한 배지는 침전되거나 또는 그의 열 처리는 효과적인 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질의 불활성화를 위해 필요한 온도에서 침전을 유발한다. 본원에서 개시되는 배지에 제시되는 바와 같이, 열 처리 적합 배지는 침전되지 않거나 또는 효과적인 바이러스, 감염원 및/또는 우발적 물질의 불활성화에 필요한 온도에서 침전을 감소시킨다. 일부 측면에서, 열 처리는 HTST 처리이다. 다른 측면에서, 열 처리는 샌드-배쓰 처리 및 오일-배쓰(oil-bath) 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는 회분식 열 처리이다.
변형 양태에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이다. 다른 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 한 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 추가의 측면에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 제한된다. 일부 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고 (여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9임), 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0로 저하되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 약 10 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법의 바이러스는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스)일 수 있고, 방법의 배지는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명되는 배지 파라미터를 포함하는 배지일 수 있다.
a) 온도 및 온도 유지 시간
본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법에서, 열 처리는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 배지의 온도를 적어도 약 85℃로 상승시키는 것을 포함한다. 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 90℃로 상승된다. 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 93℃로 상승된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 95, 97, 99, 101, 또는 103℃로 상승된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 또는 117℃로 상승된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 또는 120℃로 상승된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 121, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150℃로 상승된다. 일부 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 약 95℃로 상승된다. 다른 측면에서, 배지의 온도는 약 102℃로 상승된다. 한 변형 양태에서, 배지의 온도는 약 85℃ 내지 약 120℃로 상승된다. 또 다른 변형 양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 약 85℃ 내지 약 120℃; 약 87℃ 내지 약 118℃; 약 89℃ 내지 약 116℃; 약 91℃ 내지 약 114℃; 약 93℃ 내지 약 112℃; 약 95℃ 내지 약 110℃; 약 97℃ 내지 약 108℃; 약 99℃ 내지 약 106℃; 약 101℃ 내지 약 104℃; 약 85℃ 내지 약 118℃; 약 85℃ 내지 약 116℃; 약 85℃ 내지 약 114℃; 약 85℃ 내지 약 112℃; 약 85℃ 내지 약 110℃; 약 85℃ 내지 약 108℃; 약 85℃ 내지 약 106℃; 약 85℃ 내지 약 104℃; 약 85℃ 내지 약 102℃; 약 85℃ 내지 약 100℃; 약 85℃ 내지 약 98℃; 약 85℃ 내지 약 96℃; 약 85℃ 내지 약 94℃; 약 85℃ 내지 약 92℃; 약 85℃ 내지 약 90℃; 약 85℃ 내지 약 88℃; 약 87℃ 내지 약 120℃; 약 89℃ 내지 약 120℃; 약 91℃ 내지 약 120℃; 약 93℃ 내지 약 120℃; 약 95℃ 내지 약 120℃; 약 97℃ 내지 약 120℃; 약 99℃ 내지 약 120℃; 약 101℃ 내지 약 120℃; 약 103℃ 내지 약 120℃; 약 105℃ 내지 약 120℃; 약 107℃ 내지 약 120℃; 약 109℃ 내지 약 120℃; 약 111℃ 내지 약 120℃; 약 113℃ 내지 약 120℃; 약 115℃ 내지 약 120℃; 약 117℃ 내지 약 120℃; 약 85℃ 또는 86℃ 또는 88℃ 또는 90℃ 또는 92℃ 또는 94℃ 또는 96℃ 또는 98℃ 또는 100℃ 또는 102℃ 또는 104℃ 또는 106℃ 또는 108℃ 또는 110℃ 또는 112℃ 또는 114℃ 또는 116℃ 또는 118℃ 또는 120℃; 적어도 약 85℃ 또는 86℃ 또는 88℃ 또는 90℃ 또는 92℃ 또는 94℃ 또는 96℃ 또는 98℃ 또는 100℃ 또는 102℃ 또는 104℃ 또는 106℃ 또는 108℃ 또는 110℃ 또는 112℃ 또는 114℃ 또는 116℃ 또는 118℃ 및 약 120℃ 이하로 상승된다. 임의의 측면에서, 배지의 온도는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 약 15℃ 내지 약 40℃로 냉각된다.
열 처리 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 온도 유지 시간에 유지된다. 온도 유지 시간은 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간이다. 임의의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 1초이다. 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 2초, 3초, 또는 4초이다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20초이다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 또는 60초이다. 일부 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 10초이다. 다른 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 2초이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 약 1 내지 약 60초; 약 2 내지 약 58초; 약 6 내지 약 54초; 약 10 내지 약 50초; 약 14 내지 약 46초; 약 18 내지 약 42초; 약 22 내지 약 38초; 약 26 내지 약 34초; 약 30 내지 약 34초; 약 1 내지 약 56초; 약 1 내지 약 52초; 약 1 내지 약 48초; 약 1 내지 약 44초; 약 1 내지 약 40초; 약 1 내지 약 36초; 약 1 내지 약 32초; 약 1 내지 약 28초; 약 1 내지 약 22초; 약 1 내지 약 18초; 약 1 내지 약 14초; 약 1 내지 약 10초; 약 1 내지 약 6초; 약 1 내지 약 3초; 약 4 내지 약 60초; 약 8 내지 약 60초; 약 12 내지 약 60초; 약 16 내지 약 60초; 약 20 내지 약 60초; 약 24 내지 약 60초; 약 28 내지 약 60초; 약 32 내지 약 60초; 약 36 내지 약 60초; 약 40 내지 약 60초; 약 44 내지 약 60초; 약 48 내지 약 60초; 약 52 내지 약 60초; 약 56 내지 약 60초; 약 1 또는 2 또는 4 또는 6 또는 8 또는 10 또는 12 또는 14 또는 16 또는 18 또는 20 또는 22 또는 24 또는 26 또는 28 또는 30 또는 32 또는 34 또는 36 또는 38 또는 40 또는 42 또는 44 또는 46 또는 48 또는 50 또는 52 또는 54 또는 56 또는 58 또는 60초; 적어도 약 1 또는 2 또는 4 또는 6 또는 8 또는 10 또는 12 또는 14 또는 16 또는 18 또는 20 또는 22 또는 24 또는 26 또는 28 또는 30 또는 32 또는 34 또는 36 또는 38 또는 40 또는 42 또는 44 또는 46 또는 48 또는 50 또는 52 또는 54 또는 56 또는 58 및 약 60초 이하이다. 다른 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 1분이다. 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 2.5분이다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 10.5 또는 11분이다. 또 다른 변형 양태에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 약 1 내지 약 11분; 2 내지 약 10분; 4 내지 약 8분; 약 1 내지 약 10분; 약 1 내지 약 8분; 약 1 내지 약 6분; 약 1 내지 약 4분; 약 1 내지 약 2 분; 약 2 내지 약 11분; 약 4 내지 약 11분; 약 6 내지 약 11분; 약 8 내지 약 11분; 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11분; 적어도 약 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 및 약 11분 이하이다.
b) 감염원
본 발명은 배지를 열 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스 및/또는 우발적 물질을 불활성화하는 방법을 제공한다. 바이러스는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스)일 수 있고, 세포 배양 배지는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지일 수 있다. 열 처리 동안 세포 배양 배지에서 불활성화되는 바이러스는 생성물 (예를 들어, 폴리펩티드, 세포, 조직)의 제조 동안 산업상 관련된 임의의 바이러스일 수 있다. 산업상 관련된 바이러스는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 산업상 관련된 바이러스의 비-제한적인 예는 다음과 같다: 파르보비리다에, 파라믹소비리다에, 오르토믹소비리다에, 분야비리다에, 랍도비리다에, 레오비리다에, 토가비리다에, 칼리시비리다에 및 피코르나비리다에. 바이러스의 부류 (예를 들어, 파르보비리다에)에 대한 공식적인 명명법은 보다 덜 공식적인 명명법 (예를 들어, 파르보바이러스)과 함께 명세서 전체에 걸쳐 교환가능하게 사용된다. 명명법은 바이러스의 동일한 부류를 지칭함 (즉, 파르보비리다에는 파르보바이러스와 동일한 바이러스 부류를 포함함)을 이해하여야 한다. 한 변형 양태에서, 바이러스는 비-외피보유 바이러스이다. 일부 측면에서, 비-외피보유 바이러스는 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 RNA 바이러스, 및 단일 가닥 RNA 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 측면에서, 비-외피보유 바이러스는 파르보바이러스, 레오바이러스, 또는 피코르나바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 한 변형 양태에서, 바이러스는 외피보유 바이러스이다. 일부 측면에서, 외피보유 바이러스는 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스, 이중 가닥 RNA 바이러스, 및 단일 가닥 RNA 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 측면에서, 외피보유 바이러스는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 헤파드나바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 임의의 변형 양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아프리카 돼지 열병(African swine fever-line) 바이러스, 아레나바이러스, 아르테리바이러스, 아스트로바이러스, 바큘로바이러스, 반다바이러스, 바르나바이러스, 비르나바이러스, 브로모바이러스, 분야바이러스, 칼리시바이러스, 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카울리모바이러스, 써코바이러스, 클로스테로바이러스, 코모바이러스, 코로나바이러스, 코트리코바이러스, 시스토바이러스, 델타바이러스, 디안토바이러스, 에나모바이러스, 필로바이러스, 플라비바이러스, 푸로바이러스, 푸셀로바이러스, 제미니바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 호르데이바이러스, 히포바이러스, 이데아오바이러스, 이노바이러스, 이리도바이러스, 레비바이러스, 리포트릭스바이러스, 루테오바이러스, 마클로모바이러스, 마라피보바이러스, 마이크로 바이러스, 미오바이러스, 네크로바이러스, 노다바이러스, 오르토믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르티티바이러스, 파르보바이러스, 피코드나바이러스, 피코르나바이러스, 플라마바이러스, 포도바이러스, 폴리드나바이러스, 포텍스바이러스, 포티바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 랍도바이러스, 리지디오바이러스, 세퀘바이러스, 시포바이러스, 소베모바이러스, 텍티바이러스, 테누이바이러스, 테트라바이러스, 토바마바이러스, 토브라바이러스, 토가바이러스, 톰부스바이러스, 토티바이러스, 트리코바이러스, 티모바이러스, 및 움브라바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 바이러스는 유행성 출혈병 바이러스 (EHDV), 마우스 미세(minute) 바이러스 (MMV), 마우스 파르보바이러스-1 (MPV), 캐시 밸리(cache valley) 바이러스, 베시바이러스 2117, 돼지 써코바이러스 (PCV 1), 돼지 써코바이러스 2 (PCV 2), 개 파르보바이러스 (CPV), 소 파르보바이러스 (BPV), 또는 청설 바이러스 (BTV)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 바이러스는 파르보바이러스, 예컨대 뮤린 미세 바이러스이다. 변형 양태에서, 본 발명은 배지를 열 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스의 일부를 이루는 물질(subviral agent)을 불활성화하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 바이러스의 일부를 이루는 물질은 바이로이드(viroid) 또는 위성체(satellite)이다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지를 열 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스-유사 물질을 불활성화하는 방법을 제공한다.
또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 열 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 감염원을 불활성화하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 감염원은 박테리아이다. 추가의 측면에서, 박테리아는 미코플라즈마이다. 또 다른 측면에서, 감염원은 본원에서 설명되는 임의의 필터를 포함하는 필터를 통과하기에 충분히 작은 박테리아이다. 또 다른 측면에서, 감염원은 진균이다. 또 다른 측면에서, 감염원은 기생충이다. 또 다른 측면에서, 감염원은 감염원의 성분이다. 감염원의 성분은 세포 배양 배지에서 요구되지 않는 감염원으로부터 유래된 임의의 성분일 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해된다.
또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지를 열 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 우발적 물질을 불활성화하는 방법을 제공한다. 열 처리에 의한 불활성화에 민감한 임의의 우발적 물질은 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지를 사용하여 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법에 의해 불활성화될 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해된다. 임의의 변형 양태에서, 적어도 하나 이상의 종류의 감염성 및/또는 우발적 물질은 HTST 처리 동안 세포 배양 배지에서 불활성화된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 종류의 감염성 및/또는 우발적 물질은 바이러스, 바이러스의 일부를 이루는 물질, 바이러스-유사 물질, 박테리아, 진균, 기생충 또는 감염성 및/또는 우발적 물질의 성분이다. 임의의 변형 양태에서, 열 처리는 HTST 처리이다. 열 처리에 의해 감염성 및/또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법은 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지를 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 HTST 처리에 적용하는 것을 포함함이 통상의 기술자에 의해 이해된다.
바이러스의 불활성화는 통상의 기술자에게 알려진 검정에 의해 측정된다. 예를 들어, 바이러스 불활성화는 활성 바이러스의 제시된 log 감소 값 (LRV)의 측정 또는 평가에 의해 결정된다. 한 측면에서, 95℃ 초과의 온도에서 2초 동안 HTST 처리를 사용할 때 세포 배양 배지 내의 바이러스 로드 (load)의 3 이상의 log 감소 값은 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 것으로 결정된다. 또 다른 측면에서, 100℃의 온도에서 60초 동안 HTST 처리를 사용할 때 세포 배양 배지 내의 바이러스 로드의 약 3 log 감소 값은 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 것으로 결정된다. 임의의 측면에서, 바이러스 로드는 MVM 로드이다.
c) 열 처리 시스템
통상의 기술자에게 알려진 감염원의 불활성화를 위한 세포 배양 배지의 열 처리 방법, 예를 들어 그 개시내용 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860] 및 [Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729]에 기재된 방법이, 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지를 열 처리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고온 단시간 (HTST) 처리가 바이러스를 불활성화하기 위해 제조 공정에 사용된다. 변형 양태에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고 (여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9임) 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공한다. HTST 처리는 세포 배양 배지가 주위 온도 또는 37℃로부터 약 102℃로 가열되고 세포 배양 배지가 약 10초의 온도 유지 시간 동안 102℃에서 유지된 후, 세포 배양 배지가 약 주위 온도 또는 약 37℃로 냉각되는 HTST 사이클을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 주위 온도는 약 15℃ 내지 약 30℃이다. 다른 측면에서, 주위 온도는 약 18℃ 내지 약 25℃이다. HTST 처리는 하나는 유체를 가열하기 위한 것이고 다른 하나는 유체를 냉각시키기 위한 것인 2개의 열 교환기 (요구되는 온도 유지 시간을 제시된 유속에 제공하기 위해 그 사이에 배관이 존재함)를 사용하는 연속 유동 공정일 수 있다. 한 측면에서, 세포 배양 배지 내의 바이러스의 불활성화는 세포 배양 배지를 HTST 처리의 1 사이클에 적용하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 세포 배양 배지 내의 바이러스의 불활성화가 세포 배양 배지를 적어도 2회 이상의 사이클의 HTST 처리에 적용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 유속은 100 LPM이다. 또 다른 측면에서, 유속은 125 LPM이다. 또 다른 측면에서, 유속은 바이러스 및/또는 우발적 물질 불활성화를 위해 적절한 온도 및 온도 유지 시간을 제공하기 적합한 임의의 유속일 수 있다. 임의의 측면에서, 세포 배양 배지는 약 37℃로부터 약 102℃로 가열되고, 세포 배양 배지는 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 102℃에서 유지된 후, 세포 배양 배지는 약 37℃로 냉각된다. 추가의 측면에서, 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 약 10초이다. 임의의 측면에서, 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 온도 유지 시간이다. 임의의 측면에서, 온도 유지 시간 동안 바이러스를 불활성화하기 위한 온도는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 온도이다. 한 측면에서, 바이러스를 불활성화하기 위한 온도는 약 85℃ 내지 약 120℃이다. 한 변형 양태에서, 세포 배양 배지는 약 15℃로부터 약 102℃로 가열되고, 세포 배양 배지는 약 10초의 온도 유지 시간 동안 102℃에서 유지된 후, 세포 배양 배지는 약 37℃로 냉각된다. 또 다른 변형 양태에서, 세포 배양 배지는 약 37℃로부터 약 102℃로 가열되고, 세포 배양 배지는 약 10초의 온도 유지 시간 동안 102℃에서 유지된 후, 세포 배양 배지는 약 37℃로 냉각된다.
HTST 처리를 위해, 약 0.5 내지 약 20,000 리터 (L)의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치에 의해 처리된다. 약 0.5 L 미만 또는 약 20,000 L 초과의 세포 배양 배지 부피가 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지를 사용하는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법에서 HTST 처리를 위해 사용되는 장치에 의해 처리될 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해된다. 한 측면에서, 약 0.5 L 내지 약 20,000 L의 세포 배양 배지 부피가 1회의 HTST 실행에서 처리된다. 다른 측면에서, 약 0.5 L 내지 약 20,000 L의 세포 배양 배지 부피가 적어도 2회 이상의 HTST 실행에서 처리된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HTST 실행"은 특정한 양의 배지가 HTST 처리의 적어도 하나의 사이클 (예를 들어, 가열, 유지, 냉각)을 위해 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 (예를 들어, HTST 스키드)에서 HTST 처리에 적용되는 과정을 의미할 수 있다. HTST 처리를 위해 사용되는 임의의 장치, 예컨대 HTST 스키드는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지의 열 처리를 위해 사용될 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해된다. 한 측면에서, HTST 실행은 약 0.5 L 내지 약 20,000 L의 적어도 하나 이상의 세포 배양 배지 부피의 연속 처리를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, HTST 실행은 약 0.5 L 내지 약 20,000 L의 적어도 하나 이상의 세포 배양 배지 부피의 회분식 처리를 포함할 수 있다. 임의의 측면에서, 적어도 하나 이상의 세포 배양 배지 부피는 동일한 종류의 세포 배양 배지 (예를 들어, 배지 1)일 수 있다. 임의의 측면에서, 적어도 하나 이상의 세포 배양 배지 부피는 적어도 하나 이상의 종류의 세포 배양 배지 (예를 들어, 배지 1 및 배지 2)일 수 있다. 본원에서 상세하게 설명되는 방법의 임의의 측면에서, 적어도 약 0.5 L의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위한 장치를 통해 처리된다. 추가의 측면에서, 적어도 약 2 L의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위한 장치를 통해 처리된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 충분한 시간은 적어도 약 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 또는 15000 리터이다. 일부 측면에서, 2 L의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위한 장치를 통해 처리된다. 다른 측면에서, 12000 L의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위한 장치를 통해 처리된다. 또 다른 변형 양태에서, 약 0.5 내지 약 20000; 약 2 내지 약 18000; 약 10 내지 약 16000; 약 20 내지 약 14000; 약 40 내지 약 12000; 약 80 내지 약 10000; 약 100 내지 약 8000; 약 200 내지 약 6000; 약 400 내지 약 4000; 약 800 내지 약 2000; 약 0.5 내지 약 18000; 약 0.5 내지 약 16000; 약 0.5 내지 약 14000; 약 0.5 내지 약 12000; 약 0.5 내지 약 10000; 약 0.5 내지 약 8000; 약 0.5 내지 약 6000; 약 0.5 내지 약 4000; 약 0.5 내지 약 2000; 약 0.5 내지 약 800; 약 0.5 내지 약 600; 약 0.5 내지 약 400; 약 0.5 내지 약 200; 약 0.5 내지 약 100; 약 0.5 내지 약 50; 약 0.5 내지 약 20; 약 0.5 내지 약 10; 약 0.5 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 2; 약 2 내지 약 20000; 약 10 내지 약 20000; 약 100 내지 약 20000; 약 500 내지 약 20000; 약 1000 내지 약 20000; 약 1500 내지 약 20000; 약 2000 내지 약 20000; 약 5000 내지 약 20000; 약 1000 내지 약 20000; 약 15000 내지 약 20000; 약 1750 내지 약 20000 리터; 약 0.5 또는 2 또는 10 또는 100 또는 1000 또는 10000 또는 20000 리터; 적어도 약 0.5 또는 2 또는 10 또는 100 또는 1000 또는 10000 및 약 20000 리터 이하의 세포 배양 배지 부피가 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위한 장치를 통해 처리된다.
세포 배양 과정 동안 바이러스를 불활성화하는 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어 그 개시내용 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729]에 기재된 방법이 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지의 HTST 처리와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 고온 단시간 (HTST) 처리는 세포 배양 배지로부터 바이러스를 제거하기 위해 제조 공정의 적어도 하나 이상의 바이러스 장벽 처리와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 바이러스 장벽 처리는 열 멸균, UV 광 노출, 감마선 조사, 및 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 바이러스 장벽 처리는 여과이다. 본 발명은 HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 바이러스의 제거 및/또는 불활성화 방법을 제공하고, 여기서 바이러스는 세포 배양 배지가 HTST 처리에 적용된 후에 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 제거된다. 일부 측면에서 여과는 한외여과이다. 한외여과 전에, 하나 이상의 배지 성분, 예컨대 표 1에 제시된 성분이 HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 측면에서, 한외여과 전에, 하나 이상의 배지 성분, 예컨대 미량 금속 (예를 들어, 철 또는 구리)이 HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지에 첨가된다.
한외여과 막은 재생 셀룰로스, 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리술폰, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 등으로부터 형성될 수 있다. 대표적인 한외여과 막은 비레솔브(Viresolve)® 막, 비레솔브® 프로(Pro) 막, 비레솔브® 180 막, 비레솔브® 70 막, 비레솔브® NFP 막, 비레솔브® NFR 막, 레트로포어(Retropore)™ 막, 비로사르트(Virosart) CPV 막, 플라노바(Planova) 75 막, 플라노바 35 막, 플라노바 20 막, 플라노바 15N 막, VAG 300 막, 울티포르(Ultipor) DVD 막, 울티포르 DV50 막, 울티포르 DV20 막, 및 DVD 제타 플러스(Zeta Plus) VR™ 필터를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 한외여과 막은 파르보바이러스 입자를 제거할 수 있다. 일부 측면에서, 한외여과 막은 파르보바이러스 보유 막이다.
한외여과 막의 세공 크기는 수용액 내의 하나 이상의 단백질이 막을 통과하도록 허용하면서 바람직하지 않은 바이러스 입자를 보유하기에 충분히 작아야 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 한외여과 막의 세공 크기는 10 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm 또는 200 nm 미만이다. 일부 실시양태에서, 한외여과 막의 세공 크기는 20 nm 이하이다.
한외여과 막은 한외여과 막에 의해 보유되는 가장 작은 단백질의 평균 분자량을 나타내는 분자량 컷오프(cut off)에 의해 특징지을 수 있다. 예를 들어, 분자량이 1000 kD보다 큰 대부분의 구형 단백질은 분자량 컷오프가 1000 kD인 한외여과 막에 의해 80-90%의 비율로 보유되는 반면, 분자량이 1000 kD 미만인 대부분의 구형 단백질은 한외여과 막을 통과할 것이다. 본 발명의 일부 측면에서, 한외여과 막의 분자량 컷오프는 200 kD 내지 1000 kD이다. 본 발명의 일부 측면에서, 한외여과 막의 분자량 컷오프는 200 kD, 300 kD, 400 kD, 500 kD, 600 kD, 700 kD, 900 kD, 또는 1000 kD이다.
여과는 전량(dead end) (통상적인) 유동 여과 (NFF) 또는 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 하나 이상의 한외여과 막에 의해 수행될 수 있다. NFF에서, 공급 스트림은 막을 통과하고, 분자량이 큰 물질은 필터에 포획되고, 여액은 다른 말단에서 방출된다. TFF에서, 대부분의 공급 유동액은 필터 내가 아니라 필터의 표면을 가로질러 접선 방식으로 이동한다. 따라서, 필터 케이크는 여과 과정 동안 실질적으로 세척 제거되고, 필터 유닛이 작동될 수 있는 시간을 증가시킬 수 있다. 어느 한 여과 방식을 위한 한외여과 막은 카트리지 (NFF) 형태, 예컨대 비레솔브® NFP 바이러스 필터에, 또는 카세트(cassette) (TFF에 대해), 예컨대 펠리콘(PELLICON)® 카세트로서 공급될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 여과는 통상적인 유동 여과이다.
하나 초과의 한외여과 막이 본 발명의 공정에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 한외여과 막은 수용액과 동시에 접촉된다. 하나 더 많은 바이러스 장벽 처리와 조합한 HTST 처리는 단백질 및 폴리펩티드 치료제의 산업적 규모 생산을 위해 본원에 개시되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 세포 배양 배지의 처리를 위해 사용될 수 있다.
감염원의 불활성화를 위해 HTST 처리 동안 사용되는 세포 배양 배지는 HTST 적합 배지 또는 HTST 부적합 배지일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HTST 적합 배지"는 HTST 처리 동안 침전이 감소되거나 침전이 발생하지 않는 세포 배양 배지를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HTST 부적합 배지"는 HTST 처리 동안 측정가능한 또는 검출가능한 침전을 보이는 세포 배양 배지를 의미할 수 있다. 한 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 처리 동안 바이러스 불활성화에 사용하기 위한 HTST 적합한 세포 배양 배지의 스크리닝 방법을 제공하고, 여기서 HTST 적합 배지는 HTST 부적합 배지에서의 침전에 비해 감소된 침전을 보인다. 한 측면에서, HTST 적합한 세포 배양 배지는 HTST 처리 동안 HTST 부적합 배지에서의 침전에 비해 침전을 보이지 않는다. 임의의 변형 양태에서, HTST 적합 배지는 HTST 처리 후에 HTST 부적합 배지에 비해 더 높은 수준의 미량 금속을 갖는다. 한 측면에서, 미량 금속은 철 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 미량 금속이다. 임의의 변형 양태에서, HTST 적합 배지는 또 다른 HTST 적합 배지에 비해 보다 낮은 수준의 미량 금속을 갖는다. 한 측면에서, 미량 금속은 철 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 미량 금속이다. 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공한다. 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공하고, 여기서 세포 배지 성분은 표 1에 상세하게 설명되는 바와 같이 조정된다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공하고, 여기서 세포 배지 성분은 실시예 2에서 상세하게 설명되는 바와 같이 반응 표면을 사용하여 조정된다. 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 조정된다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2로 조정된다. 일부 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하기 위해 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3으로 조정된다. 추가의 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하기 위해 pH 6.0으로 조정된다. 일부 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 추가의 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 일부 측면에서, HTST 부적합 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 방법을 제공하고, 여기서 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 약 10 mM 미만으로 조정된다. 추가의 측면에서, HTST 부적합 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 조정된다. 일부 측면에서, HTST 부적합 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 약 10 mM 미만으로 조정된다. 추가의 측면에서, HTST 부적합 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다.
d) 침전물 형성의 감소
한 변형 양태에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 열 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 열 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 칼슘, 포스페이트 및 pH 중의 하나 이상의 수준을 조정하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 열 처리는 HTST 처리이다. 변형 양태에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이다. 다른 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 한 변형 양태에서, 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 바이러스의 불활성화를 위한 HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 추가의 측면에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 제한된다. 일부 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 또 다른 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0으로 저하되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다.
본 발명의 일부 측면에서, 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 특정 성분을 갖는 배지는 감염원의 불활성화를 위한 HTST 처리 동안 침전을 감소시킨다. 한 측면에서, 배지 내의 특정 성분은 HTST 처리 동안 특정 성분이 결여된 동일한 배지에 존재하는 침전의 양에 비해 침전을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100% 감소시킨다. 배지 내의 침전의 양의 정량적 결정은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 한 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이고, 배지는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9의 pH를 갖지 않는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다. 한 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이고, 배지는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3의 pH를 갖지 않는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다. 또 다른 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이고, 배지는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.0의 pH를 갖지 않는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다. 한 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지는 HTST 처리 동안 약 10 mM 초과의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 갖는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다. 한 측면에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는, 1 mM 미만이고, 배지는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는, 1 mM 미만의 총 포스페이트 및 칼슘 농도를 갖지 않는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다. 한 변형 양태에서, 본 발명은 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함하는, HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 침전을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이고, 배지는, HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9의 pH를 갖지 않고 약 10 mM 초과의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 갖는 배지 내의 침전에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소된 침전을 갖는다.
본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법의 감염원은 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스)일 수 있고, 방법의 배지는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지일 수 있다.
B. 열 처리에 사용되는 장치의 오손을 감소시키는 방법
본 발명은 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명자들은 HTST 처리에 적용되는 세포 배양 배지 내의 특정 성분 또는 파라미터 수준의 조정이 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시킴을 밝혀내었다. 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지가 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키기 위해 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 방법, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다.
한 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용되는 세포 배양 배지를 HTST 처리에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 한 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3이다. 또 다른 측면에서, 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 6.0이다. 또 다른 측면에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다. 임의의 측면에서, HTST 처리는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 온도를 적어도 약 85℃로 승온하는 것을 포함한다. 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 93℃로 상승된다. 또 다른 추가의 측면에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 95, 97, 99, 101 또는 103℃로 상승된다. 한 변형 양태에서, 본 발명은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 장치에 사용되는 세포 배양 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다.
임의의 측면에서, HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손은 HTST 부적합 배지에 비해 HTST 적합 배지가 사용될 때 감소된다 . 한 측면에서, HTST 적합 배지의 pH는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 또 다른 측면에서, HTST 적합 배지는 약 10 mM 미만의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 포함한다. 또 다른 측면에서, HTST 적합 배지는 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9의 pH 및 약 10 mM 미만의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 포함한다. HTST 적합 배지는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지이다.
제조 공정에 사용되는 다양한 장치의 오손을 측정하고 모니터링하는 방법은 예를 들어 그 개시내용 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Awad, M. 2011. Heat Transfer: Theoretical Analysis, Experimental Investigations and Industrial Systems. Chapter 20, page 505-542]에 기재된 방법과 같이 통상의 기술자에게 알려져 있고, 본원에 개시된 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명된 성분을 갖는 배지 및 실시예에서 상세하게 설명되는 배지의 HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손을 모니터링하고 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 장치 오손은 표적 배지 온도 설정점(setpoint)을 달성하기 위해 필요한 열 교환기 스팀 압력의 변화를 측정함으로써 또는 달성되는 온도의 변화 (감소)를 측정함으로써 측정될 수 있다. 임의의 측면에서, 오손은 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상의 침전을 포함한다. 한 측면에서, HTST 부적합 배지의 사용에 의한 오손에 취약한 하나 이상의 장치는 HTST 스키드, 열 교환기, 배관, 여과 장치, 및 여과 막을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
C. 열 처리된 세포 배양 배지를 사용하여 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법
a) 세포
제공되는 방법 및 조성물은 동물, 효모 또는 곤충 세포를 비롯하여, 본원에서 설명되는 배지 내의 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 성장 및/또는 생산에 적합한 임의의 세포를 사용할 수 있다. 한 측면에서, 방법 및 조성물의 세포는 세포 배양 및 폴리펩티드의 발현에 적합한 임의의 포유동물 세포 또는 세포 종류이다. 본원에서 제공되는 방법 (예를 들어, 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하는 방법) 및 조성물은 따라서 동물 세포를 비롯하여 임의의 적합한 종류의 세포를 이용할 수 있다. 한 측면에서, 방법 및 조성물은 포유동물 세포를 이용한다. 방법 및 조성물은 또한 하이브리도마 세포를 이용할 수 있다. 한 변형 양태에서, 포유동물 세포는 비-하이브리도마 포유동물 세포이고, 이것은 요구되는 폴리펩티드, 예컨대 항체, 항체 단편 (리간드-결합 단편 포함), 및 키메라 항체를 코딩하는 외인성 단리된 핵산으로 형질전환된 것이다. 한 변형 양태에서, 방법 및 조성물은 인간 망막모세포 (PER.C6 (크루셀(CruCell), 네덜란드 라이덴)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 경부암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 세포를 이용한다. 특정 변형 양태에서, 방법 및 조성물은 CHO 세포를 이용한다. 특정 변형 양태에서, CHO 세포주의 배양 및 CHO 세포주로 제한된다 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 발현이 사용된다. 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)는 그로부터 폴리펩티드가 단리 및/또는 정제될 수 있는 본원에 개시된 배지 내로 분비될 수 있거나 또는 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 본원에 개시된 배지 내로 방출될 수 있다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 관심있는 폴리펩티드의 합성에 적용하기 적합한 방법, 벡터, 및 숙주 세포는 관련 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; 레빈슨(Levinson) 등의 EP 117,060; 및 EP 117,058에 기재되어 있다. 폴리펩티드의 포유동물 세포 배양 발현을 위해 특히 유용한 플라스미드는 pRK5 (EP pub. no. 307,247) 또는 pSVI6B (PCT pub. no. WO 91/08291 (1991년 6월 13일 공개))이다.
숙주 세포는 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 요구되는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절한 변형된 영양 배지에서 배양된다. 포유동물 세포에 대해, 문헌 [Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법 또는 문헌 [Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193)]의 리포펙타민(lipofectamine)™ (깁코 비알엘 (Gibco BRL)) 방법이 바람직하다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 관련 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 악셀(Axel)의 미국 특허 4,399,216 (1983년 8월 16일 등록)에 기재되어 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 다양한 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology (1989)], [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)], 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
방법 및 조성물은 또한 세포 배양물에서 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 사용을 포함한다. 모노클로날 항체는 면역화된 동물로부터 면역 세포 (일반적으로 비장 세포 또는 림프절 조직으로부터의 림프구)를 회수하고 세포를 통상적인 방식으로, 예를 들어 골수종 세포와의 융합에 의해 또는 엡스타인-바 (EB)-바이러스 형질전환에 의해 불멸화하고, 요구되는 항체를 발현하는 클론의 스크리닝에 의해 제조한다. 문헌 [Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976)]에 처음 기재되고, 또한 문헌 [Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)]에도 기재된 하이브리도마 기술이 많은 특이적 항원에 대한 모노클로날 항체를 높은 수준으로 분비하는 하이브리드 세포주를 생산하기 위해 널리 적용되고 있다.
b) 폴리펩티드
본원에서 상세하게 설명되는 조성물 (예를 들어, 세포) 및 방법에 의해 생산되고 본원에서 제공되는 조성물에 존재하는 폴리펩티드는 숙주 세포에 상동성일 수 있거나, 또는 바람직하게는 외인성일 수 있고, 이것은 이들이 이용되는 숙주 세포에 이종성, 즉, 외래 물질임을 의미한다 (예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 생산되는 인간 단백질, 또는 포유동물 세포에 의해 생산되는 효모 폴리펩티드). 한 변형 양태에서, 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 배지 내로 직접 분비되는 포유동물 폴리펩티드 (예컨대 항체)이다. 또 다른 변형 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 배지 내로 방출된다.
한 변형 양태에서, 폴리펩티드는, 쇄 길이가 보다 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생산하기에 충분한 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서, 폴리펩티드의 분자량은 적어도 약 5-20 kD, 별법으로 적어도 약 15-20 kD, 바람직하게는 적어도 약 20 kD일 것이다.
숙주 세포에서 발현가능한 임의의 폴리펩티드는 본 개시내용에 따라 생산될 수 있고, 제공된 조성물에 존재할 수 있다. 폴리펩티드는 숙주 세포에 내인성인 유전자로부터, 또는 유전공학을 통해 숙주 세포 내로 도입된 유전자로부터 발현될 수 있다. 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 것일 수 있거나, 또는 별법으로 인간에 의해 조작되거나 선택된 서열을 가질 수 있다. 조작된 폴리펩티드는 개별적으로 자연에서 발생하는 다른 폴리펩티드 절편으로부터 회합될 수 있거나, 또는 천연 생성되지 않는 하나 이상의 절편을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩티드는 관심있는 생물학적 또는 화학적 활성을 기초로 하여 종종 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 제약상 또는 상업적으로 관련된 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 폴리펩티드는 본원에서 제공되는 방법에 따라 생산될 수 있고, 본원에서 제공되는 조성물에 존재할 수 있다. 박테리아 폴리펩티드의 예는 예를 들어 알칼리성 포스파타제 및 베타-락타마제를 포함한다. 포유동물 폴리펩티드의 예는 분자, 예컨대 레닌, 인간 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1 -항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시에 제어되고 정상적으로 T-세포로부터 발현되고 분비됨); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러(mullerian)-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티즘 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, 또는 TGF-베타5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19; 에리쓰로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론- 알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소(homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 항체; 및 임의의 상기 제시된 폴리펩티드의 단편을 포함한다.
항체는 본원에서 제공되는 방법에 따라 생산되고 제공되는 조성물에 존재할 수 있는 포유동물 폴리펩티드의 예이다. 항체는 특이적인 항원에 대한 결합 특이성을 보이는 폴리펩티드의 바람직한 부류이다. 천연 항체는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄 사이에 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH), 이어서 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드(fold)를 기초로 하여 상이한 구조를 갖는 천연 생성 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 디술피드 결합되어 기능성 항체를 형성하는 2개의 "중쇄" 및 2개의 "경쇄"를 갖는다. 각각의 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, C 영역은 구조적 지지를 제공하고 면역 이펙터와의 비-항원-특이적 상호작용에서 기능한다. 항체 또는 항체의 항원 결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적 특징에 의해 결정된다. 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 영역에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 극도의 가변성의 보다 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 변함없는 스트레치(stretch)로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 입체형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
각각의 V 영역은 일반적으로 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR", 각각 "초가변 루프"를 함유함), 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 특정 요구되는 항원에 대한 실질적인 친화도로 결합하기 위해 필요한 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 따라서 일반적으로 3개의 CDR, 및 CDR을 적절한 입체형태로 유지하고 제시하기 위해 그 사이에 산재된 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 전통적인 4개 쇄의 항체는 VH 및 VL 도메인에 의해 함께 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 항체, 예컨대 낙타 및 상어 항체에는 경쇄가 결여되고, 중쇄만으로 형성된 결합 부위에 의존한다. 결합 부위가 VH와 VL 사이의 협조 없이 중쇄 또는 경쇄 단독에 의해 형성된 단일 도메인 조작 이뮤노글로불린을 제조할 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두 내의 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 입체형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL의 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH의 대략 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, VL의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH의 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)])를 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
항체를 파파인으로 소화하면 단일 항원 결합 부위를 각각 갖는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 강한 비공유 회합 상태의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의하기 위해 상호작용하는 것은 바로 상기 입체형태에서 이루어진다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)이라도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 자유 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 관련 기술분야에 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류의 하나로 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 무손상 항체, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 항체에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭해진다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 입체형태는 잘 알려져 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하고, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시키게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원의 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"천연 항체"는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄에서 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 분자, 예컨대 세포독성 모이어티(moiety) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체 (본원에서 정의됨)이다.
항체는 관심있는 항원에 대해 작용한다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질병 또는 병태로 고통 받는 개체에 대한 항체의 투여는 해당 포유동물에서 치료상 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원 (예컨대 종양-연관 당지질 항원; 미국 특허 5,091,178 참조)에 대해 작용하는 항체도 사용될 수 있다.
항원이 폴리펩티드인 경우, 이것은 막횡단 분자 (예를 들어 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 분자, 예컨대 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1 -항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시에 제어되고 정상적으로 T-세포로부터 발현되고 분비됨); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1 -알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티즘 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래된 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, 또는 TGF-베타5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, 및 CD40; 에리쓰로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 임의의 상기 제시된 폴리펩티드의 단편을 포함한다.
본원에서 상세하게 설명되는 항체에 대한 바람직한 분자 표적은 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; ErbB 수용체 패밀리의 멤버, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 그의 알파 또는 베타 하위단위 (예를 들어 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체)를 포함하는 알파v/베타3 인테그린; 성장 인자, 예컨대 VEGF; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파-IFN); 인터류킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등을 포함한다.
본원의 방법에 의해 생산될 수 있는 항체 (그의 항원 결합 단편을 포함하는 그의 단편 포함)는 비제한적으로 항-HER2, 항체 2C4, 항-VEGF, 항체 C2B8, 항CD11a, 항-조직 인자, IgG4b, 항-CD40, 항-CD20, 항-IgE, E25, 및 E26, 항-PCSK9 및 항-베타7을 포함한다.
c) 세포 성장 및 폴리펩티드 생산
일반적으로 세포는 임의의 세포 성장, 유지 및/또는 폴리펩티드 생산을 촉진하는 하나 이상의 조건 하에 본원에서 설명되는 임의의 세포 배양 배지와 배합 (접촉)된다. 세포를 성장시키고 폴리펩티드를 생산하는 방법은 세포 및 세포 배양 배지를 담기 위해 배양 용기 (생물반응기)를 사용한다. 배양 용기는 유리, 플라스틱 또는 금속을 비롯하여 세포 배양에 적합한 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 배양 용기는 적어도 1 리터일 것이고, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000 리터 또는 그 초과일 수 있다. 배양 공정 동안 조정될 수 있는 배양 조건은 pH 및 온도를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
세포 배양은 일반적으로 세포 배양물의 생존, 성장 및 생존성 (유지)에 도움이 되는 조건 하에 초기의 성장기에서 유지된다. 정확한 조건은 세포 종류, 세포가 유래된 유기체, 및 발현된 폴리펩티드의 성질 및 특징에 따라 상이할 것이다.
초기 성장기에서 세포 배양물의 온도는 1차적으로 세포 배양물이 생존성을 유지하는 온도의 범위를 기초로 하여 선택될 것이다. 예를 들어, 초기 성장기 동안, CHO 세포는 37℃에서 잘 성장한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 통상의 기술자는 세포의 요구 및 생산 요건에 따라 세포를 성장시키기 위해 적절한 온도 또는 온도들을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 초기 성장기의 온도는 일정한 단일 온도에서 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 초기 성장기의 온도는 온도 범위 내에서 유지된다. 예를 들어, 온도는 초기 성장기 동안 꾸준히 상승하거나 감소할 수 있다. 별법으로, 온도는 초기 성장기 동안 다양한 시간에 별개의 양만큼 상승하거나 감소할 수 있다. 통상의 기술자는 단일 또는 다중 온도가 사용되어야 하는지, 및 온도를 꾸준히 또는 별개의 양만큼 조정하여야 하는지 결정할 수 있을 것이다.
세포는 보다 길거나 짧은 시간 동안 초기의 성장기 동안 성장할 수 있다. 한 변형 양태에서, 세포는 성장이 방해되지 않을 경우 세포가 최종적으로 도달하는 최대 생존 세포 밀도의 제시된 비율인 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장한다. 예를 들어, 세포는 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 요구되는 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 성장할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 한정된 시간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들어, 세포 배양의 출발 농도, 세포가 성장하는 온도, 및 세포의 고유한 성장 속도에 따라, 세포는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 초과의 시간 동안 성장할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1개월 또는 그 초과의 시간 동안 성장하도록 허용될 수 있다.
세포 배양물은 세포에 대한 산소 공급 및 영양소의 분산을 증가시키기 위해 초기 배양기 동안 교반되거나 진탕될 수 있다. 본 발명에 따르면, 통상의 기술자는 pH, 온도, 산소 공급 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 초기 성장기 동안 생물반응기의 특정한 내부 조건을 제어하거나 조절하는 것이 유리함을 이해할 것이다. 예를 들어, pH는 산 또는 염기의 적절한 양을 공급함으로써 제어될 수 있고, 산소 공급은 관련 기술분야에 공지된 살포 장치를 사용하여 제어될 수 있다.
초기의 배양 단계는 회분식 세포 배양 조건이 씨드 트레인(seed train)을 생산하기 위해 재조합 세포의 성장을 향상시키도록 변형된 성장기이다. 성장기는 일반적으로 세포가 일반적으로 빠르게 분할하는, 예를 들어 성장하는 지수 성장기를 의미한다. 이 시기 동안, 세포는 일정 시간, 대체로 1 내지 4일, 예를 들어 1, 2, 3, 또는 4일 동안 세포 성장이 최적인 조건 하에 배양된다. 숙주 세포에 대한 성장 사이클은 통상의 기술자에게 알려진 방법에 의해 특정 숙주 세포에 대해 결정될 수 있다.
성장기에, 기초 배양 배지 및 세포는 배양 용기에 회분식으로 공급된다. 배양 배지는 한 측면에서 약 5% 미만 또는 1% 미만 또는 0.1% 미만의 혈청 및 다른 동물-유래된 단백질을 함유한다. 그러나, 혈청 및 동물-유래된 단백질은 요구될 경우 사용될 수 있다. 특정 변형 양태에서, 기초 배지의 pH는 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 한 측면에서, 기초 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 또 다른 특정 변형 양태에서, 기초 배지는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 약 10 mM 미만으로 제한된다. 추가의 측면에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 또 다른 변형 양태에서, 기초 배지는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9의 pH, 약 10 mM 미만의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 갖는다. 한 측면에서, 기초 배지의 pH는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 전에 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9로 저하되고, 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 이어서 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 임의의 측면에서, 기초 배지는 화학적으로 한정된 배지이다. 임의의 측면에서, 기초 배지는 화학적으로 한정되지 않은 배지이다. 유럽 특허 EP 307,247 또는 미국 특허 6,180,401에 제시된 범위의 1 또는 2배의 아미노산, 비타민, 미량 원소 및 다른 배지 성분이 사용될 수 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
별법으로, 상업상 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham)의 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ([MEM], 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코(Dulbecco)의 변형 이글(Modified Eagle) 배지 ([DMEM], 시그마)가 동물 세포의 배양에 적합하고, 본원에서 상세하게 설명되는 화학적으로 한정된 배지 구성성분으로 보충될 수 있다 (예를 들어, 제공되는 키트의 사용에 의해). 또한, 그 개시내용 전부가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979)], [Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 또는 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; 미국 특허 Re. 30,985; 또는 미국 특허 5,122,469에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있고, 이들은 각각 본원에서 상세하게 설명되는 화학적으로 한정된 배지 구성성분으로 보충될 수 있다 (예를 들어, 제공되는 키트의 사용에 의해).
본원에서 제공되는 임의의 배지는 또한 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 미량 원소 (대체로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 한정됨), 미량 금속 (예컨대 철 및 구리), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 통상의 기술자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다.
성장 중의 특정 시점에서, 세포는 생산기의 배양 출발시에 배양 배지를 접종하기 위한 접종물을 형성할 수 있다. 별법으로, 생산기는 성장기와 이어질 수 있다. 세포 성장기 다음에 일반적으로 폴리펩티드 생산기가 존재한다.
폴리펩티드 생산기 동안, 세포 배양물은 세포 배양물의 생존 및 생존성에 도움이 되고 요구되는 폴리펩티드의 발현을 위해 적절한 제2 세트의 배양 조건 (성장기에 비해) 하에 유지될 수 있다. 예를 들어, 후속적인 생산기 동안, CHO 세포는 25℃ 내지 35℃의 범위 내에서 재조합 폴리펩티드 및 단백질을 발현한다. 세포 밀도 또는 생존성을 증가시키기 위해 또는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위해 다수의 별개의 온도 변화를 이용할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드 생산기" 또는 "단백질 발현기"는 세포 배양물이 생물학적 약물 제품 (예를 들어, 폴리펩티드)를 생산하는 세포 배양기를 의미할 수 있다.
세포는 요구되는 세포 밀도 또는 생산 역가에 도달할 때까지 후속적인 생산기에서 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 재조합 폴리펩티드에 대한 역가가 최대에 도달할 때까지 후속적인 생산기에 유지된다. 다른 실시양태에서, 배양물은 상기 지점 이전에 수거될 수 있다. 예를 들어, 세포는 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 유지될 수 있다. 일부 경우에, 생존 세포 밀도가 최대에 도달하도록 허용한 후, 생존 세포 밀도를 배양물 수거 전에 어느 수준까지 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
특정한 경우에, 후속적인 폴리펩티드 생산기 동안 고갈되거나 세포에 의해 대사된 영양소 또는 다른 배지 성분으로 세포 배양을 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양의 모니터링 동안 고갈된 것으로 관찰된 영양소 또는 다른 배지 성분으로 세포 배양물을 보충하는 것이 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 고갈된 성분은 후속적인 생산기 전에 칼슘, 포스페이트, 철, 및 구리를 포함한다. 일부 측면에서, 보충된 배지 성분은 칼슘, 포스페이트, 철, 및 구리를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 후속적인 폴리펩티드 생산기 전에 세포 배양물을 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 일부 측면에서, 세포 배양물은 후속적인 생산기 전에 칼슘, 포스페이트, 철, 및 구리를 포함하는 하나 이상의 배지 성분으로 보충된다. 비-제한적인 예로서, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (대체로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 미량 금속 (예컨대 철 및 구리), 아미노산, 지질, 또는 글루코스 또는 다른 에너지 공급원으로 세포 배양물을 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공급 배지" 또는 "생산 배지"는 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 세포 배양 배지를 의미한다.
특정 변형 양태에서, 공급 배지의 pH는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이다. 일부 측면에서, 공급 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 일부 측면에서, 공급 배지의 pH는 이어서 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 HTST 처리 후에 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 된다. 또 다른 특정 변형 양태에서, 공급 배지는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 공급 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 또 다른 변형 양태에서, 공급 배지는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9의 pH 및 약 10 mM 미만의 포스페이트 및 칼슘의 총량을 갖는다. 일부 측면에서, 배지의 pH는 이어서 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2가 되고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 폴리펩티드 생산기 동안 폴리펩티드 생산을 위해 충분한 수준으로 상승한다. 임의의 측면에서, 공급 배지는 화학적으로 한정된 배지이다. 임의의 측면에서, 공급 배지는 화학적으로 한정되지 않은 배지이다. 유럽 특허 EP 307,247 또는 미국 특허 6,180,401에 제시된 범위의 1 또는 2배의 아미노산, 비타민, 미량 원소 및 다른 배지 성분이 사용될 수 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
D. 키트
화학적으로 한정된 구성성분으로 세포 배양 배지를 보충하기 위한 키트를 설명한다. 키트는 재구성되는 건조된 구성성분을 함유하고, 사용 설명서 (예를 들어, 키트 구성성분으로 배지를 보충하는데 사용하기 위한)를 또한 포함한다. 키트는 본원에서 제공되는 배지 구성성분을 세포 배양 배지를 보충하기 위해 적합한 양으로 포함한다. 한 변형 양태에서, 키트는 표 1의 배지 성분을 포함한다. 또 다른 변형 양태에서, 키트는 배지 pH를 표 1에 개시된 pH 수준으로 조정하기 위해 배지 구성성분을 포함한다.
E. 조성물
세포 배양 배지 및 하나 이상의 다른 성분, 예컨대 세포 또는 요구되는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 한 변형 양태에서, (a) 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; 및 (b) 본원에서 제공되는 세포 배양 배지를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 변형 양태에서, (a) 폴리펩티드; 및 (b) 본원에서 제공되는 세포 배양 배지를 포함하는 조성물이 제공되고, 한 측면에서 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포에 의해 배지 내로 분비된다. 또 다른 변형 양태에서, (a) 폴리펩티드; 및 (b) 본원에서 제공되는 세포 배양 배지를 포함하는 조성물이 제공되고, 한 측면에서 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 배지 내로 방출된다. 조성물의 세포는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 세포 (예를 들어, CHO 세포)일 수 있고, 조성물의 배지는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 배지, 예컨대 표 1에 상세하게 설명되는 배지 성분을 포함하는 배지일 수 있다. 이와 유사하게, 조성물의 폴리펩티드는 본원에서 상세하게 설명되는 임의의 폴리펩티드, 예컨대 항체일 수 있다.
F. 바이러스 불활성화를 위한 시스템
본 발명은 세포 배양 배지에 대한 바이러스의 불활성화를 위한 시스템 및/또는 공정을 고려한다. 시스템은 다음을 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다: 배지, 배지 보유 유닛(들), pH 미터 (또는 pH 측정을 위한 또 다른 수단), 칼슘 및/또는 포스페이트 농도 및/또는 양의 측정 및/또는 정량 수단; 배지 이송 수단 (예를 들어 튜브), 배지 온도를 올리기 위한 열원(들), 표적 설정점 (예를 들어, 온도) 조정 수단, 유지 보유 유닛 (예를 들어, 유지 튜브), 배지 온도를 내리기 위한 냉각원(들), 공기 공급원, 압력 인가 및 해제 수단 (예를 들어, 압력 밸브, 연동 펌프, 원심분리 펌프, 양변위 펌프), 배지 투입 및 배출 수단, 기체 투입 및 배출 수단, 여과 수단, 유속 및 유체 역학 관련 다른 측면의 조정 수단, 및 임의로 연결된 요구되는 폴리펩티드 또는 세포 배양물 또는 세포 배양 배지의 생산이 이루어지는 생물반응기.
상기 요소를 포함하는 바이러스 불활성화를 위한 시스템은 또한 열 처리를 위한 시스템을 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 다양한 파라미터 (예를 들어, pH, 칼슘 및/또는 포스페이트 농도)와 함께 사용될 수 있는 예시적인 열 처리 시스템을 도 1에 제시한다. 본원에서 설명되는 상기 시스템은 배지가 다양한 최종 생성물 (예를 들어, 폴리펩티드, 항체 등)의 생산을 위해 사용될 수 있도록 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 공정의 수행에 유용하다.
G. 예시적인 실시양태
한 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스 또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하고; (b) pH, 칼슘 수준 및 포스페이트 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터를 조정하는 것을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 미량 금속 농도의 조정을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 미량 금속은 철 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 상기 실시양태에서, 철 및/또는 구리 농도는 HTST 처리 전에 배지 내에서 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 철 및/또는 구리는 HTST 처리 전에 배지로부터 제거된다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후 배지에 철 및/또는 구리를 세포 배양에 적합한 수준으로 보충하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 배지가 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 경우 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 HTST 처리 전 배지의 제조에 있어서 적합한 낮은 수준으로 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 적합한 수준으로의 저하에 의해 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 약 7.2 미만으로 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 약 5.0 - 7.2로 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후에 pH를 세포 배양에 적합한 수준으로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 약 6.9 - 7.2로 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 칼슘 수준은 배지가 포스페이트를 포함하는 경우 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 칼슘 수준은 감소된다.
임의의 상기 실시양태에서, 칼슘 수준은 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 감소된다.
임의의 상기 실시양태에서, 칼슘은 HTST 처리 전에 배지로부터 제거된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후에 칼슘 수준을 세포 배양에 적합한 수준으로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 포스페이트 수준은 배지가 칼슘을 포함하는 경우 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 포스페이트 수준은 감소된다.
임의의 상기 실시양태에서, 포스페이트 수준은 칼슘 및 포스페이트로 이루어지는 복합체의 형성이 억제되도록 감소된다.
임의의 상기 실시양태에서, 포스페이트는 HTST 처리 전에 배지로부터 제거된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH는 칼슘 및 포스페이트로 이루어지는 복합체의 형성이 억제되도록 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후에 포스페이트 수준을 세포 배양에 적합한 수준으로 조정하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도는 HTST 처리 동안 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만이다.
임의의 상기 실시양태에서, 칼슘 및 포스페이트 수준이 조정된다.
임의의 상기 실시양태에서, pH, 칼슘 및 포스페이트 수준이 조정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스 또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하는 것을 포함하고, 배지의 pH는 HTST 처리 전에 및/또는 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.2이다. 일부 실시양태에서, pH는 HTST 처리 전에 또는 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9, 약 pH 5.3 내지 약 pH 6.3, 또는 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2이다. 일부 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후에 pH를 세포 배양에 적합한 수준으로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 칼슘 및 포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 미량 금속 (예를 들어, 철 및/또는 구리)의 농도는 HTST 처리 전에 조정된다. 일부 실시양태에서, 배지는 HTST 처리 전에 또는 처리 동안 철 및/또는 구리를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후 배지에 철 및/또는 구리를 세포 배양에 적합한 수준으로 보충하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스 또는 우발적 물질을 불활성화하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 배양 배지를 고온 단시간 (HTST) 처리에 적용하는 것을 포함하고, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 HTST 처리 전 및/또는 처리 동안 약 10 mM 미만이다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 HTST 처리 전 또는 처리 동안 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만이다. 일부 실시양태에서, 배지는 HTST 처리 전 또는 처리 동안 포스페이트를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 배지는 HTST 처리 전 또는 처리 동안 칼슘을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후에 포스페이트 및/또는 칼슘 수준을 세포 배양에 적합한 수준으로 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지 내의 미량 금속 (예를 들어, 철 및/또는 구리)의 농도는 HTST 처리 전에 조정된다. 일부 실시양태에서, 배지는 HTST 처리 전에 철 및/또는 구리를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 HTST 처리 후 배지에 철 및/또는 구리를 세포 배양에 적합한 수준으로 보충하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 침전물 형성이 억제된다.
임의의 상기 실시양태에서, HTST 처리를 위해 사용되는 장치의 오손이 감소된다.
임의의 상기 실시양태에서, 필터 오손이 억제된다.
임의의 상기 실시양태에서, HTST 처리는 배지 내에서 바이러스 또는 우발적 물질을 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 배지의 온도를 적어도 약 85℃로 상승시키는 것을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 배지의 온도는 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 시간 동안 적어도 약 93, 95, 97, 99, 101, 102 또는 103℃로 상승된다.
임의의 상기 실시양태에서, 온도는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15초 동안 상승된다.
임의의 상기 실시양태에서, 바이러스는 파르보비리다에, 파라믹소비리다에, 오르토믹소비리다에, 분야비리다에, 랍도비리다에, 레오비리다에, 토가비리다에, 칼리시비리다에 및 피코르나비리다에로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 상기 실시양태에서, 바이러스는 외피보유 바이러스이다.
임의의 상기 실시양태에서, 바이러스는 비-외피보유 바이러스이다.
임의의 상기 실시양태에서, 우발적 물질은 박테리아이다.
본원 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본원 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 또는 유사한 목적에 알맞은 대체 특징에 의해 교체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않으면, 개시된 각각의 특징은 단지 포괄적인 일련의 동등한 또는 유사한 특징의 예일 뿐이다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만 본 발명을 제한하지는 않는다.
본원에 개시된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
세포 배양 과정의 바이러스 물질 오염은 세포주로부터 생물학적 약물 (예를 들어, 재조합 단백질)의 생산에 위협을 가하고, 생성물의 정제 동안 바이러스 물질을 제거하는 능력에 관한 잠재적인 안전성 문제를 제기한다. 세포 배양 배지의 고온 단시간 (HTST) 처리의 이용을 비롯한 몇몇 방안이 우발적 물질의 위험을 최소화하기 위해 생산 공정 내로 또는 생산 공정을 통하여 취해질 수 있다. 그러나, 적합하게 기능할 때 바이러스를 불활성화하는데 효과적이지만, 제시된 배지가 바이러스 입자 불활성화를 위한 HTST 처리를 이용하기에 부적합할 수 있다 (문헌 [Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860] 및 [Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729]). 배지 부적합성은 HTST 장치 내에서 공정-접촉 표면에 오손을 일으킬 수 있다. 오손의 하나의 기여인자는 HTST 처리의 가열 및 냉각 작업의 결과로서 배지의 침전이다. 침전은 열 교환기를 오손시키는 잔류물의 침착을 일으키고, 시스템이 온도 설정점을 유지하지 못하기 때문에 HTST 스키드 정지(shutdown)를 일으킨다. 추가로, 열 처리에 부적합한 배지 내의 침전은 HTST 조건에 의해 배지 내에서 불활성화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 사용된 공정 필터의 오손을 일으킬 수 있다. 침전으로 인한 필터 오손은 처리 실패 및 여과 비용의 유의한 증가를 일으킬 수 있다. 또한, 열 처리에 부적합한 배지 내의 침전은 세포 배양 성능 (예를 들어, 제품 역가, 세포 성장, 세포 생존성) 및 제품 품질에 불리한 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같이, HTST 처리 동안 또는 바이러스의 불활성화를 위한 다른 열 처리 동안 배지를 사용하기 적합하게 만드는, 배지에 대한 몇 가지 변형이 확인되었다. 바이러스를 불활성화하기 위해 HTST 처리를 위해 사용된 장치 상의 침전을 감소 또는 방지하는 몇몇 배지 제제가 확인되었다. 본원에서 제공되는 배지 내에서 바이러스를 불활성화하는 방법을 설명하고, 또한 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용된 장치 상의 침전물을 감소시키기 위한 방법을 설명한다. 한 측면에서, 배지의 pH는 바이러스 불활성화에 사용하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9일 수 있다. 또 다른 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 단백질 발현기 전에 바이러스 불활성화에 사용하기 위한 HTST 처리 동안 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9일 수 있다. 추가의 측면에서, 배지의 pH는 세포 배양의 단백질 발현기 동안 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2로 될 수 있다. 한 측면에서, 배지는 바이러스 불활성화에 사용하기 위해 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 배지는 세포 배양의 단백질 발현기 전에 바이러스 불활성화에 사용하기 위한 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 제한하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, 배지의 포스페이트 및 칼슘의 총량은 세포 배양의 단백질 발현기 동안 단백질 발현을 위해 충분한 수준으로 상승될 수 있다. 임의의 측면에서, 배지의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.9이고, 세포 배양 배지에서 바이러스 불활성화에 사용하기 위한 HTST 처리 동안 포스페이트 및 칼슘의 총량을 약 10 mM 미만으로 포함할 수 있다. 배지는 세포 배양의 모든 기를 통해 사용되고, 기초 및/또는 공급 배지에서 사용될 수 있다. 배지는 바이러스를 불활성화하기 위한 HTST 처리를 위해 사용되는 장치 상에 침전물을 감소시키기 위해 사용된다. 화학적으로 한정된 구성성분으로 세포 배양 배지를 보충하기 위한 키트를 또한 고려한다.
실시예 1: HTST 스키드 작동으로부터 관찰을 재현하기 위한 샌드 - 배쓰 스크리닝 방법의 확인.
제조 규모 HTST 처리 동안, 세포 배양 배지의 액체 제제를 하나는 유체를 가열하기 위한 것이고 다른 하나는 유체를 냉각시키기 위한 것인 2개의 열 교환기 (요구되는 유지 시간을 제시된 유속에 제공하기 위해 그 사이에 배관이 존재함)를 사용하는 연속 유동 공정에서 10초 동안 102℃로 가열하였다 (도 1). 샌드-배쓰 스크리닝 방법은 열 처리 이후 거동에 대해 실험실 규모 (~20 mL) 배지 부피 요건을 갖는 배지 조성물을 보다 빠르게 시험하기 위해 사용되었다. 상기 방법은 파일럿 및 제조 규모 HTST 스키드에서 사용하기 위해 적합한 배지를 스크리닝 및 확인하기 위해 "최악 조건의(worst-case)" 열 노출에 기반하였다 (표 2).
Figure 112015004197269-pct00003
물질 및 방법
배지 제조
본 연구에 사용된 배지는 다양한 pH 수준을 갖는 기초 생산 배지 및 회분식 공급 배지를 포함한다 (표 3). 모든 배지는 밀리포어 SuperQ 초순수 정제 시스템을 통해 처리된 정제된 탈이온수를 사용하여 제조하였다. 배지를 적절한 배지 분말 원료(powder stock) (SAFC 앤드 라이프 테크놀로지스(SAFC and Life Technologies))를 사용하여 제조하였다. 제시된 제제에 대한 표적 pH 및 오스몰 농도를 보장하기 위해 액체 제조 동안 유리 전극 pH 프로브 (메틀러 톨레도(Mettler Toledo)) 및 삼투압계 (어드밴스드 인스트루먼츠(Advanced Instruments))를 사용하였다. 성분의 완전한 용해 및 최종 pH 및 오스몰 농도 조정 시에, 배지를 0.1 ㎛ 세공 크기 PES 막 필터를 사용하여 소규모 제조를 위해 250 mL 내지 1 L의 병 (코닝(Corning)) 내로 여과하였다.
Figure 112015004197269-pct00004
pH 조정
배지 제조의 완료와 열 처리가 적용된 때 사이의 시간 동안 발생한 가스 배출(off-gassing)로 인한 pH 변동을 보정하였다. 열 처리 전에, 각각의 제조 배지로부터 30 mL 분취액을 50 mL 튜브 (팔콘(Falcon))로 옮기고, 원래의 팔콘 튜브 캡을 250 mL 코닝 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크의 배기 구멍이 있는(vented) 캡으로 교체하였다. 이어서, 튜브를 pH를 저하시키기 위해 30분 동안 C02 오버레이가 있는 인큐베이터에 넣었고 (pH 6.2 샘플에 대해 15% C02 및 모든 다른 샘플에 대해 12% C02, 200 rpm, 37℃); 상기 단계를 통해 pH를 표적 미만으로 낮출 수 있었다. 유리 전극 pH 프로브 및 미터 (메틀러 톨레도)를 사용하여 pH를 모니터링하면서 pH가 다시 표적 pH로 서서히 상승할 때까지 튜브를 수동으로 교반하였다. 최종 pH 측정은 NOVA 바이오프로파일러를 사용하여 수행하였다.
샌드-배쓰 방법
샌드-배쓰 방법을 위해, 22 mL의 제조된 액체 배지를 20 mL 유리 압력 용기 (에이스 글래스웨어(Ace glassware))에 옮겼다. 상부 공간을 완전히 채우고 과량의 배지가 캡 및 써모웰(thermowell)에 의해 대체되도록 함으로써 공기 상부 공간이 용기에 존재하지 않도록 용기를 써모웰이 있는 나삿니 캡(threaded cap)으로 밀봉하였다. 용기 외부는 가열원 매트릭스에 직접 노출된 배지로부터 외부 표면의 오손을 방지하기 위해 세정하였다. 유리 압력 용기를 보다 잘 밀봉하고 열 처리를 위해 샘플 내로 샌드 또는 열전쌍 설치구 오일이 도입되는 것으로부터 보호하기 위해, 테플론(Teflon) 테이프를 사용하여 유리 용기의 주둥이 부분과 나삿니 캡 사이의 계면을 덮었다. 온도 제어기 (Techne TC-8D)가 구비된 유동화 샌드배쓰 (Techne SBS-4)를 설정하고 (압축 공기 유입구 압력 = 5 psig, 배쓰 온도 = 110℃), 30분 동안 평형화하였다. 단일 VWR 디지탈 온도계에 부착된 열전쌍을 튜브의 반지름 치수의 중심에 기하학적으로 위치한 샘플 용기 써모웰 내로 삽입하였다. 열전쌍 설치구 유리 벽과 열전쌍 사이에 열 전달 매질을 제공하기 위해 실리콘 오일을 열전쌍 설치구에 첨가하였다. 샘플 용기를 샌드-배쓰에 넣고, 타이머를 작동시켰다. 온도 운동 데이터를 대략 30-60초마다 기록하였다. 용기가 온도계 판독에 의해 102℃에 도달한 후, 10초 유지를 위해 샌드-배쓰에서 유지하였다. 가열 및 유지 단계 후에, 용기를 온도계 온도 판독치가 35℃에 도달할 때까지 실온의 수조로 옮겼다. 열 처리 후에, 15 mL의 각각의 샘플을 탁도 및 가시적인 측정을 위해 바이알로 옮겼다.
침전 측정
배지 샘플을 다음과 같은 2가지 방법에 의해 침전에 대해 열 처리 전 및 후를 분석하였다: 1) 탁도계 (2100Q Hach)를 통한 탁도; 및 2) 펠렛 크기 (예를 들어, 비-가시적, 저, 중, 고)를 기초로 한 침전의 가시적인 확인 및 정성적인 결정을 위해 침전물을 침강시키기 위한, 10,000 x g에서 10분 동안 50 mL 팔콘 튜브 내의 샘플의 원심분리 (소발(Sorvall) RC 6 플러스, SS-34 로터). 원심분리되지 않은 샘플도 침전의 가시적인 확인을 위해 분석하였다.
결과
샌드-배쓰 및 HTST 가열 프로파일로부터 2가지 주요 관찰이 존재하였다: 1) 샌드-배쓰 열 처리 시스템에 대한 가열 프로파일은 보다 대규모 HTST 스키드 작동에 대한 것보다 상당히 더 길었고, 2) 샌드-배쓰는 대략 6.5분에 102℃의 표적 설정점에 도달할 수 있었다 (도 2). 샌드-배쓰 방법 가열 프로파일은 수조 내에서 샘플을 냉각시키기 전에 10초 유지를 위해 주위 (~21-25℃) 또는 37℃로부터 표적 102℃로 가열하기 위해 일관되게 5 내지 8분의 범위이었다 (~6 내지 ~6.5분 평균 시간). 제조 또는 파일럿 규모 연속 유동 HTST 시스템에 비해, 가열, 유지, 및 냉각에 대한 곡선 하 면적은 샌드-배쓰 방법에서 상당히 더 컸다. 샌드-배쓰 방법에서 배지 샘플은 파일럿 및 제조 규모 HTST 작동에 비해 총 열 노출에 대한 최악 조건인 것으로 결정되었다. 따라서, 샌드-배쓰 방법에서 열 노출에 의해 1차적으로 유도되는 제시된 배지 제제 내의 성분에 대한 임의의 유의한 변화는 보다 큰 규모의 HTST 처리를 위한 관련 데이터를 제공할 것이다.
HTST 처리 동안, 배지 1 공급 배지 제제의 pH를 pH 7.0으로부터 pH 6.4로 낮추면 임의의 HTST 작동 문제를 완화할 수 있음이 관찰되었다 (표 3). 이와 유사하게, 배지 2 기초 배지 제제의 경우, 배지를 pH 7.0 대신에 pH 6.7에서 처리하면 임의의 HTST 작동 문제를 완화할 수 있음이 발견되었다 (표 3). 이들 배지는 샌드-배쓰 방법이 -규모 HTST 처리 작동에서 발생한 침전 거동을 정확하게 반응할 수 있는지 결정하기 위해 샌드-배쓰 방법에서 2개의 pH 수준에서 각각 처리하였다. 열 처리 전후의 가시성 측정은 중성 pH 처리시의 HTST-적합성 문제를 갖는 것으로 알려진 배지에 대한 열 처리에 의한 침전 거동을 샌드-배쓰 시스템이 정확하게 제시함을 나타내었다 (도 3A 및 B). 배지에 대한 열 노출에 따른 변화에 대한 "최악 조건"과 일치하게, 배지 2는 샌드-배쓰에서 동일한 배지의 pH 7.0 처리 샘플에 비해 유의하게 개선되지만 pH 6.7에서는 침전 징후를 계속 보여주었다. 전체적으로, 상기 결과는 파일럿 및 제조 규모 HTST 처리에 사용하기 적합한 배지 제제를 스크리닝 및 확인하기 위한 샌드-배쓰 방법의 효과를 입증하였다.
실시예 2: pH , 칼슘 및 포스페이트 수준은 바이러스 불활성화를 위한 열 처리 동안 침전에 기여한다.
물질 및 방법
배지 제조
본 연구에 사용된 배지는 약 pH 5.9 내지 약 pH 7.5의 pH 수준, 약 0 mM 내지 약 3.5 mM (또는 한정되지 않은 배지에서 그 초과)의 칼슘 농도 범위, 및 약 0 mM 내지 약 6.5 mM (또는 한정되지 않은 배지에서 그 초과)의 포스페이트 농도 범위의 기초 생산 배지 및 회분식 공급 배지를 포함한다. 모든 배지는 밀리포어 SuperQ 초순수 정제 시스템을 통해 처리된 정제된 탈이온수를 사용하여 제조하였다. 배지는 적절한 배지 분말 원료 (SAFC 앤드 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 제조하였다. 제시된 제제에 대한 표적 pH 및 오스몰 농도를 보장하기 위해 액체 제조 동안 유리 전극 pH 프로브 (메틀러 톨레도) 및 삼투압계 (어드밴스드 인스트루먼츠)를 사용하였다. 성분의 완전한 용해 및 최종 pH 및 오스몰 농도 조정 시에, 배지를 0.1 ㎛ 세공 크기 PES 막 필터를 사용하여 소규모 제조를 위한 250 mL 내지 1 L의 병 (코닝) 내로 여과하였다.
pH 조정
배지 제조의 완료와 열 처리가 적용된 때 사이의 시간 동안 발생한 가스 배출로 인한 pH 변동을 보정하였다. 열 처리 전에, 각각의 제조 배지로부터 30 mL 분취액을 50 mL 튜브 (팔콘)로 옮기고, 원래의 팔콘 튜브 캡을 250 mL 코닝 얼렌마이어 플라스크의 배기 구멍이 있는 캡으로 교체하였다. 이어서, 튜브를 pH를 저하시키기 위해 30분 동안 C02 오버레이가 있는 인큐베이터에 넣었고 (pH 6.2 샘플에 대해 15% C02 및 모든 다른 샘플에 대해 12% C02, 200 rpm, 37℃); 상기 단계를 통해 pH를 표적 미만으로 낮출 수 있었다. 유리 전극 pH 프로브 및 미터 (메틀러 톨레도)를 사용하여 pH를 모니터링하면서 pH가 다시 표적 pH로 서서히 상승할 때까지 튜브를 수동으로 교반하였다. 최종 pH 측정은 NOVA 바이오프로파일러를 사용하여 수행하였다.
샌드-배쓰 방법
샌드-배쓰 방법을 위해, 22 mL의 제조된 액체 배지를 20 mL 유리 압력 용기 (에이스 글래스웨어)에 옮겼다. 상부 공간을 완전히 채우고 과량의 배지가 캡 및 써모웰에 의해 대체되도록 함으로써 공기 상부 공간이 용기에 존재하지 않도록 용기를 써모웰이 있는 나삿니 캡으로 밀봉하였다. 용기 외부는 가열원 매트릭스에 직접 노출된 배지로부터 외부 표면의 오손을 방지하기 위해 세정하였다. 유리 압력 용기를 보다 잘 밀봉하고 열 처리를 위해 샘플 내로 샌드 또는 열전쌍 설치구 오일이 도입되는 것으로부터 보호하기 위해, 테플론 테이프를 사용하여 유리 용기의 주둥이 부분과 나삿니 캡 사이의 계면을 덮었다. 온도 제어기 (Techne TC-8D)가 구비된 유동화 샌드배쓰 (Techne SBS-4)를 설정하고 (압축 공기 유입구 압력 = 5 psig, 배쓰 온도 = 110℃), 30분 동안 평형화하였다. 단일 VWR 디지탈 온도계에 부착된 열전쌍을 튜브의 반지름 치수의 중심에 기하학적으로 위치한 샘플 용기 써모웰 내로 삽입하였다. 열전쌍 설치구 유리 벽과 열전쌍 사이에 열 전달 매질을 제공하기 위해 실리콘 오일을 열전쌍 설치구에 첨가하였다. 샘플 용기를 샌드-배쓰에 넣고, 타이머를 작동시켰다. 온도 운동 데이터를 대략 30-60초마다 기록하였다. 용기가 온도계 판독에 의해 102℃에 도달한 후, 10초 유지를 위해 샌드-배쓰에서 유지하였다. 가열 및 유지 단계 후에, 용기를 온도계 온도 판독치가 35℃에 도달할 때까지 실온의 수조로 옮겼다. 열 처리 후에, 15 mL의 각각의 샘플을 탁도 및 가시적인 측정을 위해 바이알로 옮겼다.
침전 측정
배지 샘플을 다음과 같은 2가지 방법에 의해 침전에 대해 열 처리 전 및 후를 분석하였다: 1) 탁도계 (2100Q Hach)를 통한 탁도; 및 2) 펠렛 크기 (예를 들어, 비-가시적, 저, 중, 고)를 기초로 한 침전의 가시적인 확인 및 정성적인 결정을 위해 침전물을 침강시키기 위한, 10,000 x g에서 10분 동안 50 mL 팔콘 튜브 내의 샘플의 원심분리 (소발 RC 6 플러스, SS-34 로터). 원심분리되지 않은 샘플도 침전의 가시적인 확인을 위해 분석하였다.
결과
다양한 수준의 pH 값과 칼슘 및 포스페이트 농도를 갖는 몇몇 배지 제제를 제조하였다 (표 4). 제조된 배지를 원심분리되지 않은 및 원심분리된 샘플의 가시적인 관찰에 의해, 및 탁도 측정에 의해 열 처리 전후에 침전에 대해 평가하였다.
Figure 112015004197269-pct00005
샘플 중에서 침전의 측정은 파일럿 또는 제조 규모 HTST에서 작동 문제를 이전에 보이지 않은 배지 4 및 배지 5 제제가 샌드-배쓰 방법에서 측정가능한 탁도 및 가시적인 침전을 보였기 때문에 샌드-배쓰 방법에 의해 얻은 데이터가 HTST 처리 작동에 비해 총 열 노출에 대한 가능한 시나리오를 반영함을 나타내었다. 샌드-배쓰 방법을 통해, 칼슘 및 포스페이트 농도, 및 pH 수준이 적어도 102℃의 열 노출 동안 배지 내의 유의한 변화에 기여하는 배지 제제 내의 성분임이 결정되었다. 몇 가지의 제제에서, 칼슘 및 포스페이트 농도를 변경하지 않으면서 pH 수준을 낮추면 탁도가 저하되었다 (표 4). 또한, 칼슘이 없거나 또는 낮은 칼슘 농도를 갖는 제제도 침전 사건을 보이지 않았고, 중성 pH에서도 높은 탁도 측정을 나타내지 않았다 (표 4). 보다 낮은 칼슘 및 포스페이트 농도에 추가로 감소된 침전과 보다 낮은 칼슘 대 포스페이트 비 사이에 상관관계가 존재하였다 (표 4). 이들 관찰을 통해, 열 처리 동안 가열 및 냉각시 인산칼슘 침전물의 형성은 칼슘 농도, 포스페이트 농도, 및 pH 수준의 함수임을 결정하였다.
배지 4를 샌드-배쓰 시스템에서 열 처리된 제제의 다변량 분석을 위한 완전 요인 실험 설계 (DoE)를 위해 선택하고, 탁도 (NTU) 반응 측정 기준을 사용하여 침전 반응 표면을 생성하였다. 변화된 변수는 칼슘 농도 (0.1 내지 2.9 mM), 포스페이트 농도 (0.1, 5.9 mM) 및 pH (6.0 내지 7.2)이었다. 탁도 측정에 의해 결정되고 가시적인 관찰에 의해 확인된 분류된 파라미터 추정치를 통해, 칼슘 및 포스페이트 둘 모두를 함유하는 배지 제제의 열 처리시에 pH-의존성 인산칼슘 형성이 배지의 침전을 야기함을 확인하였다 (도 4). 배지 침전에 영향을 주는 가장 강한 효과는 칼슘 및 포스페이트 농도의 외적(cross-product)이었다 (도 4). 이것은 칼슘 및 포스페이트 농도 둘 모두에 의존하는 불용성 인산칼슘 형태의 예상된 반응 동역학과 일치한다. 또한, 칼슘 및 포스페이트 농도의 곱에 의한 탁도의 추정 역시, 칼슘 또는 포스페이트 농도가 0일 때 탁도의 유의한 증가가 존재하지 않을 것 (HTST 적합성에 대한 추정치로서)이라는 관찰과 일치한다.
반응 표면은 DoE 탁도 데이터 및 입력 (칼슘 농도, 포스페이트 농도, 및 pH)으로부터 후속적으로 모델링하였다. 최악 조건의 샌드-배쓰 열 처리에서 우수 대 불량 작동 방식에 대한 컷오프를, 원심분리된 및 원심분리되지 않은 열 처리된 배지 샘플의 시각적 검사로부터 가시적인 침전에 대한 모든 탁도 값의 분석을 기초로 하여 5 NTU의 탁도로 선택하였다. 데이터는 배지 제제를 변형하기 위한 다중 옵션 또는 수단이 HTST-적합성을 보장하기 위해 가능함을 제시한다. 특히, 칼슘 농도, 포스페이트 농도, pH, 또는 3개의 파라미터의 일부 조합의 저하는 배지 제제를 HTST 처리 또는 다른 열 처리 방법에 적합하게 만들기 위한 모든 잠재적인 수단이었다 (도 5).
열 처리된 배지 4에 대한 데이터로부터 생성된 모델링한 반응 표면을 기초로 하여, 샌드-배쓰 열 처리 연구에서 배지의 안정성은 특히 칼슘 및 포스페이트 농도뿐만 아니라 pH 수준에도 의존하였다. 다른 배지 제제를 HTST 부적합 배지로부터 적합 배지로 전환할 수 있는 상기 배지 제제의 변형을 결정하기 위해, 가수분해물을 포함하지 않는 다른 배지 제제 (배지 3, 배지 4, 배지 6, 배지 7, 배지 8, 배지 9, 배지 11, 배지 12, 및 배지 13)를 pH 7.0에서 그의 칼슘 및 포스페이트 농도를 기초로 하여 모델 반응 표면에 대해 플롯팅하였다 (도 6). 가수분해물을 함유하는 배지는 칼슘 및 포스페이트의 가변 수준 때문에 분석을 보다 복잡하게 만들었다. 배지 11은 침전 범위 외에 존재함을 나타내는 반응 표면의 영역에 해당하였고, 따라서 HTST 적합일 가능성이 있는 것으로 결정되었다 (도 6, 점 C). 배지 5의 생산을 위한 배지 11에 대한 가수분해물의 첨가 (표 4)는 가수분해물 내의 포스페이트 및 칼슘 수준의 공지된 추정치를 기초로 할 때 배지의 침전 범위로의 전환을 야기하고, 따라서 HTST 부적합일 가능성이 있다 (도 6, 점 C 화살표). 배지 12는 침전 범위 내에 해당하였고, 이 모델을 기초로 하여 배지 2 (표 4)의 생산을 위한 가수분해물의 첨가는 배지를 추가로 침전 범위로 전환할 것으로 예측되었다 (도 6, 점 D 화살표). 모델 반응 표면을 기초로 하여 침전 범위 내 또는 외에 해당하는 것으로 예측된 제제는 제조 규모 HTST 스키드 작동에서 열 교환기 오손 문제를 갖는 2개의 제제를 포함하는 샌드-배쓰 열 처리시에 가시적인 침전과 상관관계가 있었다. 생성된 반응 표면 모델의 사용은 중성 pH 근처의 고 농도의 칼슘 및 포스페이트에 대해 열 처리시 세포 배양 배지 제제 내의 침전에 대한 강한 상관관계가 존재함을 나타내었다 (도 5 및 6). 또한, 샌드-배쓰 데이터를 기초로 한 반응 표면 모델은 HTST 부적합 배지를 HTST 적합 배지로 전환하는 제제 변화에 대한 권장사항을 제공하기 위해 생성될 수 있다.
실시예 3: 바이러스 불활성화 동안 배지의 침전 거동에 대한 온도의 효과.
물질 및 방법
배지 제조
본 연구에 사용된 배지는 기초 생산 배지 및 회분식 공급 배지를 포함한다. 모든 배지는 밀리포어 SuperQ 초순수 정제 시스템을 통해 처리된 정제된 탈이온수를 사용하여 제조하였다. 배지는 적절한 배지 분말 원료 (SAFC 앤드 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 제조하였다. 제시된 제제에 대한 표적 pH 및 오스몰 농도를 보장하기 위해 액체 제조 동안 유리 전극 pH 프로브 (메틀러 톨레도) 및 삼투압계 (어드밴스드 인스트루먼츠)를 사용하였다. 성분의 완전한 용해 및 최종 pH 및 오스몰 농도 조정 시에, 배지를 0.1 ㎛ 세공 크기 PES 막 필터를 사용하여 소규모 제조를 위한 250 mL 내지 1 L의 병 (코닝) 내로 여과하였다.
pH 조정
배지 제조의 완료와 열 처리가 적용된 때 사이의 시간 동안 발생한 가스 배출로 인한 pH 변동을 보정하였다. 열 처리 전에, 각각의 제조 배지로부터 30 mL 분취액을 50 mL 튜브 (팔콘)로 옮기고, 원래의 팔콘 튜브 캡을 250 mL 코닝 얼렌마이어 플라스크의 배기 구멍이 있는 캡으로 교체하였다. 이어서, 튜브를 pH를 저하시키기 위해 30분 동안 C02 오버레이가 있는 인큐베이터에 넣었고 (pH 6.2 샘플에 대해 15% C02 및 모든 다른 샘플에 대해 12% C02, 200 rpm, 37℃); 상기 단계를 통해 pH를 표적 미만으로 낮출 수 있었다. 유리 전극 pH 프로브 및 미터 (메틀러 톨레도)를 사용하여 pH를 모니터링하면서 pH가 다시 표적 pH로 서서히 상승할 때까지 튜브를 수동으로 교반하였다. 최종 pH 측정은 NOVA 바이오프로파일러를 사용하여 수행하였다.
샌드-배쓰 방법
샌드-배쓰 방법을 위해, 22 mL의 제조된 액체 배지를 20 mL 유리 압력 용기 (에이스 글래스웨어)에 옮겼다. 상부 공간을 완전히 채우고 과량의 배지가 캡 및 써모웰에 의해 대체되도록 함으로써 공기 상부 공간이 용기에 존재하지 않도록 용기를 써모웰이 있는 나삿니 캡으로 밀봉하였다. 용기 외부는 가열원 매트릭스에 직접 노출된 배지로부터 외부 표면의 오손을 방지하기 위해 세정하였다. 유리 압력 용기를 보다 잘 밀봉하고 열 처리를 위해 샘플 내로 샌드 또는 열전쌍 설치구 오일이 도입되는 것으로부터 보호하기 위해, 테플론 테이프를 사용하여 유리 용기의 주둥이 부분과 나삿니 캡 사이의 계면을 덮었다. 온도 제어기 (Techne TC-8D)가 구비된 유동화 샌드배쓰 (Techne SBS-4)를 설정하고 (압축 공기 유입구 압력 = 5 psig, 배쓰 온도 = 110℃), 30분 동안 평형화하였다. 단일 VWR 디지탈 온도계에 부착된 열전쌍을 튜브의 반지름 치수의 중심에 기하학적으로 위치한 샘플 용기 써모웰 내로 삽입하였다. 열전쌍 설치구 유리 벽과 열전쌍 사이에 열 전달 매질을 제공하기 위해 실리콘 오일을 열전쌍 설치구에 첨가하였다. 샘플 용기를 샌드-배쓰에 넣고, 타이머를 작동시켰다. 온도 운동 데이터를 대략 30-60초마다 기록하였다. 용기가 온도계 판독에 의해 102℃에 도달한 후, 10초 유지를 위해 샌드-배쓰에서 유지하였다. 가열 및 유지 단계 후에, 용기를 온도계 온도 판독치가 35℃에 도달할 때까지 실온의 수조로 옮겼다. 열 처리 후에, 15 mL의 각각의 샘플을 탁도 및 가시적인 측정을 위해 바이알로 옮겼다.
침전 측정
배지 샘플을 다음과 같은 2가지 방법에 의해 침전에 대해 열 처리 전 및 후를 분석하였다: 1) 탁도계 (2100Q Hach)를 통한 탁도; 및 2) 펠렛 크기 (예를 들어, 비-가시적, 저, 중, 고)를 기초로 한 침전의 가시적인 확인 및 정성적인 결정을 위해 침전물을 침강시키기 위한, 10,000 x g에서 10분 동안 50 mL 팔콘 튜브 내의 샘플의 원심분리 (소발 RC 6 플러스, SS-34 로터). 원심분리되지 않은 샘플도 침전의 가시적인 확인을 위해 분석하였다.
결과
샌드-배쓰 시스템에서 가열에 대한 표적 설정점을 변경함으로써 배지 침전에 대한 온도의 효과를 추가로 연구하였다. 측정은 모두 중성 pH 7.0에서 제제화된 배지 1 (공급, 한정되지 않음), 배지 2 (기초, 한정되지 않음), 배지 4 (기초, 한정됨) 및 배지 10 (기초, 한정되지 않음)에 대해 약 75, 85, 90, 97, 및 102℃의 온도에서 수행하였다. 가열 곡선과 함께 채취한 원심분리되지 않은 및 원심분리된 샘플의 시각적 검사는 모든 4개의 상이한 배지 제제가 샘플이 90℃에 도달한 시간까지 침전 사건을 보임을 제시하였다 (도 7, 채워진 원). 배지 4 및 10은 85℃ 및 75℃의 보다 낮은 온도에서 계속 침전 사건을 나타내었다 (도 7, 채워진 원). 배지 2는 열 처리 동안 85℃로 상승된다 침전 사건을 나타내었지만, 75℃에서 가시적인 침전물을 생성하지 않았고, 이것은 배지 2가 대략 75℃ 또는 그 미만의 온도에서의 열 처리에 적합함을 나타낸다 (도 7, 빈 원). 배지 1은 85℃에서 침전물을 생성하지 않았고, 이것은 배지 1이 대략 85℃ 또는 그 미만의 온도에서의 열 처리에 적합함을 나타낸다 (도 7, 빈 원). 이들 관찰은 모든 4개의 상이한 배지 제제가 샘플이 90℃에 도달하는 시간까지 대략 20 NTU 또는 그 초과의 탁도 측정치를 나타냄을 제시한 탁도 측정으로 확인되었다 (도 8). 열 처리된 배지 탁도 값은 배지 2, 4, 및 10에 대해 97℃에서 102℃로 상승할 때 감소하였다 (도 8). 배지와 같은 용액 내의 탁도는 입자 크기 분포의 함수이고, 특히 특정 범위의 콜로이드 입자 크기가 크기 분포의 다른 부분보다 측정에서 보다 활성을 나타낼 것이다. 따라서, 최고 온도에서 측정된 탁도의 감소는 탁도 데이터의 인위적인 결과 (예를 들어 증가된 입자 크기, 그러나 감소된 수)를 생산하는 입자 크기 분포를 유발하는 입자 침강/응집 거동의 결과임이 가능하다. 이러한 결과는 경미하게 감소된 온도가 바이러스 불활성화를 계속 유지하면서 탁도를 유의하게 감소시키지 않음을 나타내었다.
대규모 HTST 작동을 위한 관련 유지 시간에서 85℃ 내지 90℃ 초과의 온도는 효과적인 바이러스 불활성화 방법을 위해 필요하고, 95℃ 초과의 온도는 산업상 관련된 파르보바이러스에 대한 요구되는 log 감소를 달성하기 위해 필요하다. 샌드-배쓰 방법이 열 처리 유래 배지 침전 사건에 대해 보다 엄격하지만, 데이터는 102℃의 현재 표적 HTST 처리 설정점보다 낮은 온도에서의 작동이 열 교환기의 오손을 야기하는 침전 사건을 방지하기 위해 사용될 수 있음을 제시한다. HTST 처리의 목적은 바이러스 불활성화이기 때문에, 표적 온도 설정점의 저하는 옵션이 아니고 몇 가지의 배지 제제에서 침전은 배지 HTST 적용을 위한 잠재적인 작동상의 문제임이 분명하다. 따라서, 칼슘 및 포스페이트 농도뿐만 아니라 pH 수준은 적어도 90℃의 온도에서 HTST 처리에 의한 배지 내의 바이러스 불활성화 동안 침전 사건을 감소시키거나 억제하기 위해 조정될 수 있다.
실시예 4: pH , 칼슘 및 포스페이트 수준은 바이러스 불활성화를 위한 파일럿 및 대규모 HTST 배지 처리 동안 배지 내의 침전에 기여한다.
물질 및 방법
파일럿 규모 HTST
파일럿 규모 HTST를 사용하는 연구를 위해, 후속 실행까지 가능한 잔존을 최소화하기 위해 배지 제제를 최저 농도로부터 최고 농도의 칼슘 또는 포스페이트에서 처리하였다. 각각의 HTST 실행은 실행 사이에 사용된 탈이온시킨 세정수를 씻어내고 HTST 공정을 위해 102℃의 작동 온도 (허용가능한 범위: 97℃-110℃)로 가열 코일을 평형화하기 위해 15 L 내지 20 L의 배지를 필요로 하였다. 평형화 후에, 대략 20 L의 배지를 HTST 스키드를 통해 이동시키고, 유출 유동액을 플라스틱 큐비테이너(cubitainer) 내에 수거하였다. 샘플을 배지 혼합 탱크로부터 HTST 처리 전의 배지로부터 및 큐비테이너 내의 유출 배지로부터 수집하고, "HTST 전" 및 "HTST 후" 샘플로 사용하기 위해 0.1 ㎛ PVDF 캡슐 막 필터 (밀리포어)를 통해 배지 보관 백 내로 여과하였다. 이어서, 모든 처리된 및 비처리된 여과된 배지 샘플을 세포 배양 성능 검정 및 분석적 시험을 위해 사용 전에 2-8℃에서 보관하였다.
제조 규모 HTST
1800 L 배지 4 또는 배지 1 제제를 제조 규모 HTST 스키드를 사용한 배지 열 처리를 위한 제조 규모 처리를 위해 사용하였다. 상기 배지 제조의 목적은 1) 배지 4에 대한 제조 혼합 조건이 구체적인 품질 제어 방법 혼합 시간을 충족하기에 충분한 지 결정하고, 2) 배지 4를 사용하여 제조 규모 HTST 처리 성능 데이터를 생성하기 위한 것이었다. 6x20-L 배지 백 매니폴드(manifold) (사르토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech))를 배지 혼합 탱크 및 목적 생물반응기 상의 샘플링 포트에 무균 상태로 연결함으로써 HTST 처리 전후의 배지 샘플을 수거하였다. HTST 처리 전에 채취한 샘플에 대해, 배지는 수거 전에 0.1 ㎛ PVDF 캡슐 막 필터 (밀리포어)를 통해 여과하고, HTST 후에 채취한 샘플에 대해, 배지는 수거 전에 0.5/0.2 ㎛ 이중층 카트리지 필터 PVDF 프리-필터 (밀리포어) 및 0.1 ㎛ 나일론 최종 필터 (폴(Pall))로 이루어진 제조 필터 트레인을 통과시켰다. 이어서, 샘플을 세포 배양 성능 검정 및 분석적 시험을 위해 사용하였다.
결과
파일럿 및 제조 규모 HTST 작동 모두에 대해, 요구되는 부피의 배지 4를 처리할 때 HTST 스키드의 정지 또는 출력 온도 제어의 어려움을 야기하는 공정 중의 사건이 존재하지 않았다. 따라서, 열 교환기 표면 또는 후속적인 여과의 오손을 야기하기에 충분히 유의한 침전 사건의 표시가 존재하지 않았다. 파일럿 규모 처리된 배지 4는 최종 여과 및 세포 배양에 사용하기 전에 가시적으로 입자가 존재하지 않았다. 제조 규모 처리된 배지 4는 시스템에 대한 샘플 포트의 배열 때문에 최종 여과 전에 샘플을 채취할 수 없었다. 배지 4에 대해 HTST 처리를 실시하거나 실시하지 않으면서 분석적 및 세포 배양 성능 시험을 수행하였다. 배지 4에 대한 분석적 시험은 미량 금속 손실이 HTST 처리시에 발생함을 보여주었고, 이것은 HTST-처리 동안 작동상 어려울 정도로 충분한 침전을 야기하지 않으면서 배지 조성물 농도를 변경하는 침전 사건이 발생함을 시사한다. 배지 4의 제조 규모 HTST 처리에서, 유도 결합형 플라즈마 질량 분광 (ICP-MS) 및 유도 결합형 플라즈마 광 방출 질량 분광 (ICP-OES) 검정으로부터의 데이터는 비-열 처리된 배지 4에 비해 열 처리시에 Fe (철)의 24% 손실 및 Cu (구리)의 16% 손실을 보여주었다 (도 9).
파일럿 및 제조 규모 HTST 작동 모두에 대해, pH 7.10의 요구되는 부피의 배지 1을 처리할 때 HTST 스키드의 정지 또는 출력 온도 제어의 어려움을 야기하는 공정 중의 사건이 존재하였다. 침전 사건은 열 교환기 표면의 오손을 야기하기에 충분히 유의하였다. 파일럿 규모 처리된 배지 1은 최종 여과 및 세포 배양에 사용하기 전에 입자가 존재하였다. 제조 규모 처리된 배지 1은 시스템에 대한 샘플 포트의 배열 때문에 최종 여과 전에 샘플을 채취할 수 없었다. 배지 1에서 약 pH 6.34로의 pH 조정은 침전을 감소시켰다. 파일럿 및 제조 규모 HTST 작동 모두에 대해, pH 6.34의 요구되는 부피의 배지 1을 처리할 때 HTST 스키드의 정지 또는 출력 온도 설정점 제어의 어려움을 야기하는 공정 중의 사건이 존재하지 않았다. 따라서, 열 교환기 표면의 오손을 야기하기에 충분히 유의한 침전 사건의 표시가 존재하지 않았다. 파일럿 규모 처리된 배지 1은 최종 여과 및 세포 배양에 사용하기 전에 가시적으로 입자가 존재하지 않았다. 제조 규모 처리된 배지 1은 시스템에 대한 샘플 포트의 배열 때문에 최종 여과 전에 샘플을 채취할 수 없었다.
실시예 5: pH, 칼슘 및 포스페이트 수준은 바이러스 불활성화를 위한 열 처리 동안 배지 내의 미량 금속의 손실에 기여한다.
물질 및 방법
배지 제조
본 연구에 사용된 배지는 약 pH 5.9 내지 약 pH 7.5 범위의 pH 수준, 약 0 mM 내지 약 3.5 mM (또는 한정되지 않은 배지에서 더 큰)의 칼슘 농도 범위, 약 0 mM 내지 약 6.5 mM (또는 한정되지 않은 배지 내에서 더 큰)의 포스페이트 농도 범위, 및 약 0 μM 내지 약 125 μM (또는 한정되지 않은 배지 내에서 더 큰)의 철 농도 범위의 기초 생산 배지 및 회분식 공급 배지를 포함한다. 모든 배지는 밀리포어 SuperQ 초순수 정제 시스템을 통해 처리된 정제된 탈이온수를 사용하여 제조하였다. 배지는 적절한 배지 분말 원료 (SAFC 앤드 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 제조하였다. 제시된 제제에 대한 표적 pH 및 오스몰 농도를 보장하기 위해 액체 제조 동안 유리 전극 pH 프로브 (메틀러 톨레도) 및 삼투압계 (어드밴스드 인스트루먼츠)를 사용하였다. 성분의 완전한 용해 및 최종 pH 및 오스몰 농도 조정 시에, 배지를 0.1 ㎛ 세공 크기 PES 막 필터를 사용하여 소규모 제조를 위해 250 mL 내지 1 L의 병 (코닝) 내로 여과하였다.
pH 조정
배지 제조의 완료와 열 처리가 적용된 때 사이의 시간 동안 발생한 가스 배출로 인한 pH 변동을 보정하였다. 열 처리 전에, 각각의 제조 배지로부터 30 mL 분취액을 50 mL 튜브 (팔콘)로 옮기고, 원래의 팔콘 튜브 캡을 250 mL 코닝 얼렌마이어 플라스크의 배기 구멍이 있는 캡으로 교체하였다. 이어서, 튜브를 pH를 저하시키기 위해 30분 동안 C02 오버레이가 있는 인큐베이터에 넣었고 (pH 6.2 샘플에 대해 15% C02 및 모든 다른 샘플에 대해 12% C02, 200 rpm, 37℃); 상기 단계를 통해 pH를 표적 미만으로 낮출 수 있었다. 유리 전극 pH 프로브 및 미터 (메틀러 톨레도)를 사용하여 pH를 모니터링하면서 pH가 다시 표적 pH로 서서히 상승할 때까지 튜브를 수동으로 교반하였다. 최종 pH 측정은 NOVA 바이오프로파일러를 사용하여 수행하였다.
샌드-배쓰 방법
샌드-배쓰 방법을 위해, 22 mL의 제조된 액체 배지를 20 mL 유리 압력 용기 (에이스 글래스웨어)에 옮겼다. 상부 공간을 완전히 채우고 과량의 배지가 캡 및 써모웰에 의해 대체되도록 함으로써 공기 상부 공간이 용기에 존재하지 않도록 용기를 써모웰이 있는 나삿니 캡으로 밀봉하였다. 용기 외부는 가열원 매트릭스에 직접 노출된 배지로부터 외부 표면의 오손을 방지하기 위해 세정하였다. 유리 압력 용기를 보다 잘 밀봉하고 열 처리를 위해 샘플 내로 샌드 또는 열전쌍 설치구 오일이 도입되는 것으로부터 보호하기 위해, 테플론 테이프를 사용하여 유리 용기의 주둥이 부분과 나삿니 캡 사이의 계면을 덮었다. 온도 제어기 (Techne TC-8D)가 구비된 유동화 샌드배쓰 (Techne SBS-4)를 설정하고 (압축 공기 유입구 압력 = 5 psig, 배쓰 온도 = 110℃), 30분 동안 평형화하였다. 단일 VWR 디지탈 온도계에 부착된 열전쌍을 튜브의 반지름 치수의 중심에 기하학적으로 위치한 샘플 용기 써모웰 내로 삽입하였다. 열전쌍 설치구 유리 벽과 열전쌍 사이에 열 전달 매질을 제공하기 위해 실리콘 오일을 열전쌍 설치구에 첨가하였다. 샘플 용기를 샌드-배쓰에 넣고, 타이머를 작동시켰다. 온도 운동 데이터를 대략 30-60초마다 기록하였다. 용기가 온도계 판독에 의해 102℃에 도달한 후, 10초 유지를 위해 샌드-배쓰에서 유지하였다. 가열 및 유지 단계 후에, 용기를 온도계 온도 판독치가 35℃에 도달할 때까지 실온의 수조로 옮겼다. 열 처리 후에, 15 mL의 각각의 샘플을 탁도 및 가시적인 측정을 위해 바이알로 옮겼다.
파일럿 규모 HTST
파일럿 규모 HTST를 사용하는 연구를 위해, 후속 실행까지 가능한 잔존을 최소화하기 위해 배지 제제를 최저 농도로부터 최고 농도의 칼슘 또는 포스페이트에서 처리하였다. 각각의 HTST 실행은 실행 사이에 사용된 탈이온시킨 세정수를 씻어내고 HTST 공정을 위해 102℃의 작동 온도 (허용가능한 범위: 97℃-110℃)로 가열 코일을 평형화하기 위해 15 L 내지 20 L의 배지를 필요로 하였다. 평형화 후에, 대략 20 L의 배지를 HTST 스키드를 통해 이동시키고, 유출 유동액을 플라스틱 큐비테이너 내에 수거하였다. 샘플을 배지 혼합 탱크로부터 HTST 처리 전의 배지로부터 및 큐비테이너 내의 유출 배지로부터 수집하고, "HTST 전" 및 "HTST 후" 샘플로 사용하기 위해 0.1 ㎛ PVDF 캡슐 막 필터 (밀리포어)를 통해 배지 보관 백 내로 여과하였다. 이어서, 모든 처리된 및 비처리된 여과된 배지 샘플을 세포 배양 성능 검정 및 분석적 시험을 위해 사용 전에 2-8℃에서 보관하였다.
제조 규모 HTST
1800 L 처리 실행 배지 4 제조를 항체 생산 활동의 지지 하에 수행하고, 제조 규모 HTST 스키드 U1281을 사용하여 배지를 처리하였다. 상기 배지 제조의 목적은 1) 배지 4에 대한 혼합 조건이 구체적인 방법 혼합 시간을 충족하기에 충분한 지 결정하고, 2) 배지 4를 사용하여 제조 규모 HTST 처리 성능 데이터를 생성하기 위한 것이었다. 6x20-L 배지 백 매니폴드 (사르토리우스 스테딤 바이오테크)를 배지 혼합 탱크 및 목적 생물반응기 상의 샘플링 포트에 무균 상태로 연결함으로써 HTST 처리 전후의 배지 샘플을 수거하였다. HTST 처리 전에 채취한 샘플에 대해, 배지는 수거 전에 0.1 ㎛ PVDF 캡슐 막 필터 (밀리포어)를 통해 여과하고, HTST 후에 채취한 샘플에 대해, 배지는 수거 전에 0.5/0.2 ㎛ 이중층 카트리지 필터 PVDF 프리-필터 (밀리포어) 및 0.1 ㎛ 나일론 최종 필터 (폴)로 이루어진 GMP 필터 트레인을 통과시켰다. 이어서, 샘플을 세포 배양 성능 검정 및 분석적 시험을 위해 사용하였다.
침전 측정
배지 샘플을 다음과 같은 2가지 방법에 의해 침전에 대해 열 처리 전 및 후를 분석하였다: 1) 탁도계 (2100Q Hach)를 통한 탁도; 및 2) 펠렛 크기 (예를 들어, 비-가시적, 저, 중, 고)를 기초로 한 침전의 가시적인 확인 및 정성적인 결정을 위해 침전물을 침강시키기 위한, 10,000 x g에서 10분 동안 50 mL 팔콘 튜브 내의 샘플의 원심분리 (소발 RC 6 플러스, SS-34 로터). 원심분리되지 않은 샘플도 침전의 가시적인 확인을 위해 분석하였다.
배지 성분 농도 변화에 대한 분석
HTST 처리 전 및 HTST 처리 후 상청액 보유액을 측정가능한 배지 성분 농도의 임의의 유의한 변화에 대해 스크리닝하기 위해 검정하였다. 사용된 검정은 다음을 포함하였다: 수용성 비타민의 측정, 아미노산의 측정, 및 무기 포스페이트의 측정. 미량 원소는 2개의 상이한 유도 결합형 플라즈마 질량 분광 (ICP-MS) 검정을 사용하여 분석하였다. 또한, 철, 구리, 및 아연에 대한 샘플은 이들 원소의 보다 고속 정량을 위해 유도 결합형 플라즈마 광 방출 질량 분광 (ICP-OES) 검정에 의해 측정하였다. 적용가능한 모든 통계적 분석을 수행하고, JMP 소프트웨어 및 엑셀(Excel)을 사용하여 그래프로 표시하였다.
결과
보다 큰 제조 규모에서 발생하는 미량 금속 손실을 보다 잘 이해하기 위해서, 모델 배지 제제로서 배지 4를 사용하여 샌드-배쓰 연구를 수행하였다. 미량 금속의 손실이 해당 성분을 함유하고 중성 또는 더 높은 pH에서 처리된 배지 내의 인산칼슘 침전 사건과 연관되는지 결정하기 위해서, 반 요인 실험(half-factorial) 설계를 생성하여 열 처리 후에 회수된 Fe 및 Cu 수준에 대한 다양한 pH, 칼슘 (Ca), 무기 포스페이트 (PO4), 철 (Fe), 및 구리 (Cu)의 효과를 평가하였다 (표 5).
Figure 112015004197269-pct00006
미량 금속 회수에 대한 분석은 높은 pH, Ca, 및 PO4 수준이 Fe 손실에 대한 주요 인자임을 보여주었다 (도 10). 상기 3개의 인자 중 임의의 하나의 수준이 증가하면, Fe 회수가 감소한다. 초기의 Fe 농도는 pH, Ca, 및 PO4에 비해 유사하지만 더 작은 주요 효과를 보이는 반면, Cu는 Fe 회수에 대해 실질적으로 어떠한 효과도 보이지 않는다. pH, Ca, 및 PO4의 중요성은 Fe 손실이 작동 관점으로부터 뚜렷하지 않지만 (예를 들어, HTST 스키드 작동 문제를 야기하기에 충분히 유의하지 않음) 세포 배양 배지 성능 (예를 들어, 제품 역가, 세포 성장, 세포 생존성, 및 제품 품질)의 불리한 영향의 관점으로부터 뚜렷한 인산칼슘 침전 사건에 관련될 가능성과 일치한다.
주요 효과 플롯에서 가변성 또는 확산을 설명하기 위해서, 완전 요인 모델을 4개의 가장 강력한 인자 (pH, Ca, PO4, 및 Fe)를 사용한 데이터로부터 생성하였다. 이 분석으로부터의 상호작용 플롯은 열 처리 후에 Fe 회수에 영향을 주는 다음과 같은 2개의 상호작용 효과를 보여준다: 1) pH*Ca 및 2) pH*PO4 (도 11). 이들 결과는 칼슘 및 포스페이트의 농도의 감소, pH 수준의 감소, 또는 3개의 인자의 일부 조합의 저하가, 열 처리시에 Fe 손실을 방지하는 배지 제제를 생성하기 위해 필요함을 시사한다. 또한, 상기 데이터는 가시적인 침전 및 탁도 증가가 관찰되지 않는 경우에도 Fe 손실이 발생함을 보여준다.
HTST 후 Fe 수준이 초기 Fe 수준의 함수인 정도를 결정하기 위해 75-150 μM의 황산제1철 수준을 갖는 배지 (그 외는 배지 4와 동등함)를 시험하였다. 데이터는 초기 Fe와 HTST 후 Fe 농도 사이의 예기치 않은 비-선형 관계를 보여준다 (도 12). 그러나, 125 μM Fe 샘플이 다른 3개의 샘플에 비해 pH 일탈(excursion)을 경험함이 발견되었다. 두 샘플 세트 모두에서, 125 μM Fe 샘플은 HTST 시험 전에 가장 높은 pH를 나타냈다. pH는 검정 1 및 검정 2 샘플 세트에 대해 7.08 내지 7.17 및 7.09 내지 7.14이었다.
DoE 실험 결과는 pH 7.0의 배지가 샌드-배쓰 열 처리 시스템의 실패에 매우 근접하고 Fe 손실이 pH 6.7 초과에서 발생하기 시작함을 제시하였다. pH 수준이 6.6 내지 7.2인 배지 4 제제를 상기 방식을 특성화하기 위해 시험하였다. 임의의 pH 일탈 (심지어 pH 단위의 몇 분의 일만큼 작은 것)이 샌드-배쓰 열 처리 시스템에서 유의할 수 있다는 증거가 고분해능(high-resolution) pH 적정 데이터에서 밝혀졌다 (도 13a). pH 6.8 후에, Fe 회수는 pH에 대해 크게 감수성이고, pH 7.2까지 빠르게 저하되고 평탄역에 도달하였다. 이러한 급격한 pH 의존성은 황산제1철 적정 결과가 pH 가변성에 의해 혼동될 가능성이 큼을 제시하였다. 이것은 또한 매우 작은 pH 변화 (즉, 0.2 pH 단위)가 배지 제제를 Fe 손실이 발생하지 않는 방식으로 존재하게 함을 시사한다.
DoE 실험 결과는 또한 Fe 회수의 큰 개선이 Ca 및 PO4 수준에 대한 비교적 작은 변화를 통해 달성될 수 있음을 시사하였다 (도 13b). 표준 배지 4 수준의 0.5-1.17x의 Ca 및 PO4 수준을 갖는 배지 4 제제를 이전에 관찰된 이점을 달성하기 위해 필요한 Ca 및 PO4의 변화를 보다 잘 정량하기 위해 시험하였다. 상기 적정을 위해, Ca 대 PO4 수준의 비를 0.5로 일정하게 유지하였다. 그래프 데이터 분석은 Fe 손실이 증가된 곡선 프로파일이 Ca 및 PO4 수준 증가와 상관관계가 있음을 보여주었다 (도 13b). 배지 4 제제는 가장 가파른 경사면 부분에 위치하고, 여기서 Ca 및 PO4 농도의 작은 변화에도 Fe 회수의 가장 큰 개선이 가능하다. 예를 들어, Ca 및 PO4 농도의 30% 감소 (및 비를 동일하게 유지함)는 HTST 처리로 해석될 수 있는 샌드-배쓰 열 처리 후 100% Fe 회수를 달성할 수 있다.
미량 금속 손실이 인산칼슘 침전과 상관관계가 있는 경우, 칼슘 및 포스페이트 회수와 Fe 회수의 관계가 존재할 것이다. 데이터 분석은 포스페이트 회수가 Fe 회수와 분명한 관계를 형성하지 않음을 제시하였고, 여기서 Fe 회수는 낮고 침전이 확인되었다(도 14, 원 내의 다이아몬드). 비교적 높은 초기의 포스페이트 농도 샘플에서 작은 농도 차이의 검출이 신호 대 노이즈(noise) 때문에 어려울 가능성이 있다. 이를 인산칼슘이 철과 상호작용할 가능성과 관련시키면, 비교적 소량의 포스페이트를 철과 1:1의 화학양론으로 제거될 수 있고, 포스페이트 손실의 검출이 어려울 것이다. 또 다른 잠재적인 원인은 검정이 무기 포스페이트의 특정 형태만을 검출한다는 사실과 관련될 수 있다. 칼슘 회수는 60-80%의 범위이고, 10-30% 범위의 Fe 회수와 선형 관계가 있는 것으로 보이고, 여기서 Fe 회수는 낮고 침전이 확인되었다(도 14, 원 내의 정사각형). 최소 제곱 회귀(least squares regression)을 사용한 하위세트의 분석은 Ca 회수의 69%의 변동이 Fe 회수에 의해 설명될 수 있음을 보여주었다. 상기 데이터는 Fe가 Ca 회수에 직접 연결됨을 보여준다.
배지 4 (및 배지 4의 변형) 및 배지 9에 대한 파일럿 규모 및 제조 규모 HTST 처리 실행을 또한 수행하였다. 세포 배양 성능 및 제품 품질에 대한 HTST 처리의 영향을 평가하기 위해 분석적 검정 및 세포 배양 성능 연구를 위한 실행으로부터 데이터를 수집하였다. 철 및 구리를 제외한 임의의 성분의 유의한 손실이 분석적 시험으로부터 확인되지 않았다. 또한, 핵심 세포 배양 성능 측정 기준 (역가, 성장, 생존성) 또는 제품 품질 (기본적인 변이체 포함)의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 구리 손실은 손실이 세포주에 대한 구리 적정을 기초로 하여 시험을 위해 사용된 숙주 세포주에서 변화를 유발할 수 있을 정도로 충분히 크지는 않기 때문에 기본적인 변이체의 세포 배양 성능 또는 수준의 변화를 유도하지 않았다. 배지 4 제제 내의 칼슘 및 포스페이트 (각각 1.5 mM 및 3 mM)에 비해 철 및 구리 (각각 75 μM 및 1 μM)과 같은 비교적 소량의 미량 금속 때문에, 열 교환기의 유의한 오손을 야기하지 않지만 액체 배지에 존재하는 철 및 구리와 상호작용할 수 있는 매우 작은 인산칼슘 침전물 (CaPO4 복합체)이 형성될 수 있었다. CaPO4 복합체의 상기 상호작용은 철 및 구리를 액체 배지로부터 격리하여, 침전하는 CaPO4 복합체와 함께 공정 유동 내의 어느 부위에서 침착시키기 위해 몇몇 방식으로 철 및 구리를 킬레이팅할 수 있다. 메카니즘과 무관하게, 바이러스를 불활성화하기 위해 배지가 성공적으로 처리될 때를 포함하여 배지의 HTST 처리시에 철 및 구리 손실이 관찰된다는 사실은 계속 유지된다. HTST 처리시에 철 및 구리 농도 감소는 손실이 생산기를 위해 필요한 철 및 구리 농도에 대해 유의할 경우 후속적인 생산기에서 HTST-처리 배지의 성공적인 사용에 부정적인 영향을 줄 수 있다.
7개의 상이한 배지 제제에 대한 파일럿 규모 및 제조 규모 HTST 처리 실행을 수행하였다. 배지 제제 내의 철 수준을 HTST 처리 전에 측정하고, HTST 처리 후의 예상된 철 수준을 결정하였다. HTST 처리 후의 배지 내의 철 수준의 분석 (HTST 후)은 HTST 처리가 철 수준의 손실을 유발함을 보여주었다. 철의 손실은 배지 14에서 44%, 배지 15에서 42%, 배지 16에서 20%, 배지 17에서 1.3%, 및 배지 18에서 42%이었다 (도 15). 배지 19 및 배지 20은 HTST 처리 후에 철을 보충하였다.
HTST 처리에 적용되고 철이 보충된 세포 배양 배지 내의 뮤린 골수종 세포주 NS0 세포의 성장을 검정하였다. 세포 성장의 분석은 철로 보충되거나 보충되지 않은, HTST에 의해 처리되지 않은 세포 배양 배지에서 성장한 세포가 시간에 걸쳐 대등한 양으로 성장함을 보여주었다 (도 16). 이와 대조적으로, 세포는 HTST로 처리되고 철로 보충되지 않은 배지에서 배양될 때 보다 낮은 수준으로 성장하였다. HTST 처리된 세포 배양물에 대한 철의 첨가는 세포 성장을 HTST로 처리되지 않은 세포 배양 배지에 비해 더 높은 수준으로 회복시켰다 (도 16).
종합하면, 상기 데이터는 Fe 손실이 칼슘, 포스페이트 및 pH 수준과 상관관계가 있음을 보여주었고, 이것은 열 처리 동안 가시적인 침전물, 유의한 탁도 변화 또는 작동 문제처럼 반드시 검출가능한 것은 아닌 사건을 비롯하여 미량 금속 손실과 인산칼슘 침전 사건 사이의 밀접한 관계를 시사한다. 미량 금속, 예컨대 Fe의 손실은 다양한 세포주 내에서 세포 배양 성능 및 제품 품질에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

Claims (60)

  1. (a) 고온 단시간 (HTST) 처리 전에 세포 배양 배지 내에서 pH의 조정, 칼슘 총량의 제한, 및 포스페이트 총량의 제한 중 하나 이상을 수행하여, 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 하고; (b) 상기 세포 배양 배지를 HTST 처리하여 바이러스를 불활성화하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는
    (i) 0 mM 내지 4.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도;
    (ii) 0 mM 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 2.75 mM의 칼슘 농도;
    (iii) 1 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1 mM의 칼슘 농도;
    (iv) 2 내지 2.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1.5 mM의 칼슘 농도;
    (v) 1 내지 2 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (vi) 0 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (vii) 0 mM 내지 0.5 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.4의 pH;
    (viii) 0 mM 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH;
    (ix) 0 내지 1 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (x) 1 내지 2 mM의 칼슘 농도 및 5.4 내지 6.5의 pH;
    (xi) 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (xii) 0 mM 내지 1.3 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH; 또는
    (xiii) 5.0 내지 6.9의 pH 및 10 mM 미만의 칼슘 및 포스페이트 총량
    을 포함하는 것인,
    세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 방법.
  2. (a) 고온 단시간 (HTST) 처리 전에 세포 배양 배지 내에서 pH의 조정, 칼슘 총량의 제한, 및 포스페이트 총량의 제한 중 하나 이상을 수행하여, 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 하고; (b) 상기 세포 배양 배지를 HTST 처리하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는
    (i) 0 mM 내지 4.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도;
    (ii) 0 mM 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 2.75 mM의 칼슘 농도;
    (iii) 1 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1 mM의 칼슘 농도;
    (iv) 2 내지 2.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1.5 mM의 칼슘 농도;
    (v) 1 내지 2 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (vi) 0 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (vii) 0 mM 내지 0.5 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.4의 pH;
    (viii) 0 mM 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH;
    (ix) 0 내지 1 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (x) 1 내지 2 mM의 칼슘 농도 및 5.4 내지 6.5의 pH;
    (xi) 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (xii) 0 mM 내지 1.3 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH; 또는
    (xiii) 5.0 내지 6.9의 pH 및 10 mM 미만의 칼슘 및 포스페이트 총량
    을 포함하는 것인,
    세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 HTST 처리 동안 세포 배양 배지의 침전을 감소시키기 위한 방법.
  3. (a) 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서, 고온 단시간 (HTST) 처리 전에 세포 배양 배지 내에서 pH의 조정, 칼슘 총량의 제한, 및 포스페이트 총량의 제한 중 하나 이상을 수행하여, 칼슘 및 포스페이트로 구성된 복합체의 형성이 억제되도록 하고; (b) 상기 세포 배양 배지를 HTST 처리하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는
    (i) 0 mM 내지 4.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도;
    (ii) 0 mM 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 0 mM 내지 2.75 mM의 칼슘 농도;
    (iii) 1 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1 mM의 칼슘 농도;
    (iv) 2 내지 2.5 mM의 포스페이트 농도 및 0 내지 1.5 mM의 칼슘 농도;
    (v) 1 내지 2 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (vi) 0 내지 1 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (vii) 0 mM 내지 0.5 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 7.4의 pH;
    (viii) 0 mM 내지 3 mM의 포스페이트 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH;
    (ix) 0 내지 1 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.9의 pH;
    (x) 1 내지 2 mM의 칼슘 농도 및 5.4 내지 6.5의 pH;
    (xi) 0 mM 내지 0.5 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 7.2의 pH;
    (xii) 0 mM 내지 1.3 mM의 칼슘 농도 및 6.4 내지 6.7의 pH; 또는
    (xiii) 5.0 내지 6.9의 pH 및 10 mM 미만의 칼슘 및 포스페이트 총량
    을 포함하는 것인,
    HTST 처리를 위한 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 철 또는 구리 농도를 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 철 또는 구리 농도가 HTST 처리 전에 배지 내에서 조정되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 철 또는 구리가 HTST 처리 전에 배지로부터 제거되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 철 및 구리 중 하나 이상이 HTST 처리 전에 배지 내에 존재하지 않는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 철이 HTST 처리 후 60 μM 내지 125 μM의 농도로 세포 배양 배지에 첨가되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 경우 pH가 HTST 처리 전에 조정되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, pH가 HTST 처리 전에 pH 5.0 내지 pH 7.2로 조정되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, pH가 HTST 처리 전에 pH 5.0 내지 pH 6.9로 조정되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, pH가 HTST 처리 전에 pH 5.2 내지 pH 6.7로 조정되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HTST 처리 후에 pH가 pH 6.9 내지 pH 7.2로 조정되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 포스페이트를 포함하는 경우 칼슘 수준이 HTST 처리 전에 제한되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 칼슘이 HTST 처리 전에 배지로부터 제거되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 칼슘이 HTST 처리 전에 배지 내에 존재하지 않는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 칼슘 농도가 HTST 처리 전에 4 mM 미만인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 칼슘 농도가 HTST 처리 전에 2 mM 미만인 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 칼슘을 포함하는 경우 포스페이트 수준이 HTST 처리 전에 제한되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 포스페이트가 HTST 처리 전에 배지 내에 존재하지 않는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 포스페이트 농도가 HTST 처리 전에 4 mM 미만인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 포스페이트 농도가 HTST 처리 전에 2 mM 미만인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 포스페이트가 HTST 처리 전에 배지로부터 제거되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도가 HTST 처리 동안 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 mM 미만인 방법.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 및 포스페이트 수준이 HTST 처리 전에 제한되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HTST 처리 전에 pH가 조정되고 칼슘 및 포스페이트 수준이 제한되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HTST 처리가 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 양의 시간 동안 배지의 온도를 85℃ 내지 118℃로 상승시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 배지의 온도가 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 양의 시간 동안 97℃ 내지 120℃로 상승되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 온도가 1 내지 60초 동안 상승되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 온도가 1 내지 18초 동안 상승되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 온도가 10초 동안 102℃로 상승되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 파르보비리다에(parvoviridae), 파라믹소비리다에(paramyxoviridae), 오르토믹소비리다에(orthomyxoviridae), 분야비리다에(bunyaviridae), 랍도비리다에(rhabdoviridae), 레오비리다에(reoviridae), 토가비리다에(togaviridae), 칼리시비리다에(caliciviridae) 및 피코르나비리다에(picornaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 외피보유 바이러스인 방법.
  34. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 비-외피보유 바이러스인 방법.
  35. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 포유동물 세포 배양 배지인 방법.
  36. a) HTST 처리 전에 세포 배양 배지의 pH를 pH 5.0 내지 pH 6.9로 조정하고,
    b) 상기 세포 배양 배지를 HTST 처리하고,
    c) HTST 처리 후에 pH를 pH 6.9 내지 pH 7.2로 상승시키는 것
    을 포함하는, 세포 배양 배지가 세포 배양을 위한 적합성을 유지하면서 포유동물 세포 배양 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위한 방법.
  37. 제36항에 있어서, 세포 배양 배지의 pH가 HTST 처리 전에 pH 5.0 내지 pH 6.7로 조정되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 세포 배양 배지의 pH가 HTST 처리 전에 pH 5.0 내지 pH 6.3으로 조정되는 것인 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지의 pH가 HTST 처리 후에 pH 7.0 내지 pH 7.2로 상승되는 것인 방법.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, HTST 처리 전에 세포 배양 배지 내의 칼슘 및 포스페이트 총량을 제한하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, HTST 처리 동안 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도가 8 mM 미만인 방법.
  42. 제41항에 있어서, HTST 처리 동안 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도가 6 mM 미만인 방법.
  43. 제42항에 있어서, HTST 처리 동안 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도가 4 mM 미만인 방법.
  44. 제43항에 있어서, HTST 처리 동안 배지 내의 총 포스페이트 및 칼슘 농도가 2 mM 미만인 방법.
  45. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, HTST 처리가 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 양의 시간 동안 배지의 온도를 85℃ 내지 118℃로 상승시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 배지의 온도가 배지 내의 바이러스를 불활성화하기 위해 충분한 양의 시간 동안 97℃ 내지 120℃로 상승되는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 온도가 1 내지 60초 동안 상승되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 온도가 1 내지 18초 동안 상승되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 온도가 10초 동안 102℃로 상승되는 것인 방법.
  50. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 파르보비리다에(parvoviridae), 파라믹소비리다에(paramyxoviridae), 오르토믹소비리다에(orthomyxoviridae), 분야비리다에(bunyaviridae), 랍도비리다에(rhabdoviridae), 레오비리다에(reoviridae), 토가비리다에(togaviridae), 칼리시비리다에(caliciviridae) 및 피코르나비리다에(picornaviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  51. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 외피보유 바이러스인 방법.
  52. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 비-외피보유 바이러스인 방법.
  53. 삭제
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9493744B2 (en) 2012-06-20 2016-11-15 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation and other adventitious agents
BE1024230B1 (fr) * 2016-11-08 2017-12-20 Univercells Sa Production contenue de cellules et/ou de produits cellulaires
SG11202100756RA (en) 2018-08-10 2021-02-25 Genentech Inc Cell culture strategies for modulating protein glycosylation

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4153509A (en) * 1977-10-17 1979-05-08 Union Carbide Corporation Microbial production of hydroxylated biphenyl compounds
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
GB2048981B (en) 1979-05-23 1982-11-17 Coal Ind Equipment for laying a layer of elongate material adjacent to an exposed rock or mineral surface in an underground mine
USRE30385E (en) 1979-07-16 1980-08-26 American Cyanamid Company Light and heat stabilizers for polyolefins
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4992363A (en) 1983-11-09 1991-02-12 Thomas Jefferson University Method for preparing glucose free media for storing blood platelets
JPH0825902B2 (ja) * 1985-02-21 1996-03-13 株式会社ミドリ十字 γ−グロブリンの加熱処理方法
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4762714A (en) * 1986-04-08 1988-08-09 Miles Laboratories, Inc. Preparation of retrovirus-free immunoglobulins
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
DE3816139A1 (de) * 1987-10-17 1989-04-27 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von paramunitaetsinducern
EP0323667B1 (en) 1987-12-28 1993-09-15 The Procter & Gamble Company Preparation of calcium-supplemented fruit juice beverages by dispersing calcium hydroxide slurry in pasteurized juice stream
US4872919A (en) 1988-01-28 1989-10-10 The Procter & Gamble Company Method for removing precipitated calcium citrate from juice pasteurization or sterilization equipment
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DK0502036T3 (da) 1989-11-22 1996-05-06 Genentech Inc Latens-associeret peptid og anvendelser herfor
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB2251249B (en) 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
US5378488A (en) 1993-06-10 1995-01-03 Abbott Laboratories Aseptic processing of infant formula
CN1139457A (zh) * 1993-12-01 1997-01-01 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 曲霉表达系统
US5856179A (en) 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
JP3815794B2 (ja) * 1994-09-08 2006-08-30 ジェネンテク・インコーポレイテッド リン酸カルシウムトランスフェクション法
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US6043092A (en) 1996-03-18 2000-03-28 University Of Pittsburgh Cell culture media for mammalian cells
JP2000512128A (ja) * 1997-03-12 2000-09-19 ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ 哺乳類細胞用の細胞培養培地
AT405608B (de) * 1997-04-08 1999-10-25 Immuno Ag Verfahren zur inaktivierung von pathogenen, insbesondere von viren, in einem biologischen material
AU778837B2 (en) * 1999-08-12 2004-12-23 Zoetis Services Llc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
AU2002246493A1 (en) * 2000-08-10 2002-07-30 Boston Biomedica, Inc. Pressure cycling inactivation of pathogens in biological materials used for therapeutics or vaccines
CA2414570A1 (en) * 2002-01-24 2003-04-03 Ecopia Biosciences Inc. Method, system, and knowledge repository for identifying a secondary metabolite from a microorganism
GB0304799D0 (en) 2003-03-03 2003-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel method
WO2004113510A2 (en) 2003-06-18 2004-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Production of pantothenate using microorganisms incapable of sporulation
JP4825409B2 (ja) 2004-08-31 2011-11-30 株式会社日本触媒 光学用面状熱可塑性樹脂成形体、これを用いる偏光板および液晶表示装置
JP2008532554A (ja) 2005-03-17 2008-08-21 ハーキュリーズ・インコーポレーテッド 食品および飲料の加熱加工中のファウリングを減少させる方法
RU2015103990A (ru) * 2008-09-24 2015-10-27 Медиммун, Ллк Способы культивирования клеток, размножения и очистки вирусов
LT2464725T (lt) 2009-08-11 2020-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Baltymų gamyba ląstelių mitybinėje terpėje, kurioje nėra glutamino
JP5293499B2 (ja) * 2009-08-24 2013-09-18 旭硝子株式会社 リン酸カルシウムの沈着を抑制したコラーゲンビトリゲル
US20150337269A1 (en) 2012-04-10 2015-11-26 Genentech, Inc. Methods for inactivation of viruses and bacteria in cell culture media
US9493744B2 (en) 2012-06-20 2016-11-15 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation and other adventitious agents

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Angelo DePalma. Genetic Engineering & Biotechnology News. 2011.09.01., Vol. 31, No. 2.
Marc Schleh 등. Biotechnology Progress, 2009, vol. 25, no. 3, pp. 854-860.
Natarajan Vijayasankaran 등. Animal Cell Culture Media. 2010. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology., John Wiley & Sons.

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Publication number Publication date
US20130344570A1 (en) 2013-12-26
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