ES2625060T3 - Procedimientos para la inactivación vírica y otros agentes adventicios - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la inactivación de virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende (a) someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rápido a alta temperatura (HTST); y (b) ajustar uno o más parámetros seleccionados del grupo que consiste en nivel de pH, calcio y fosfato, con lo que se suprime la formación de precipitado, en el que el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar virus o bacterias presentes en el medio, a) en el que el pH se ajusta cuando el medio comprende calcio y fosfato, el pH se ajusta a un nivel bajo adecuado durante la preparación del medio antes del tratamiento HTST, y el pH se ajusta después del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular; b) en el que el nivel de calcio se ajusta cuando el medio comprende fosfato, el nivel de calcio se reduce de modo que se suprime la formación de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de calcio se ajusta después del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular; o c) en el que el nivel de fosfato se ajusta cuando el medio comprende calcio, el nivel de fosfato se reduce de modo que se suprime la formación de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de fosfato se ajusta después del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos para la inactivacion virica y otros agentes adventicios CAMPO DE LA INVENCION
La invencion proporciona procedimientos de inactivacion virica utilizando un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) y el ajuste de diversos parametros para reducir y/o minimizar la generacion y el deposito de precipitados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los virus son potenciales contaminantes en los procesos de fabricacion de medicamentos, en particular, en los casos en que los farmacos biologicos proceden de cultivos de celulas de mamiferos. Una fuente de contaminantes viricos puede ser el medio utilizado para el cultivo celular o las lineas celulares que producen los productos biologicos de interes. Los enfoques actuales para prevenir la contaminacion virica de los farmacos biologicos durante el proceso de fabricacion incluyen el tratamiento del medio de cultivo celular rapido a alta temperatura (HTST) para la inactivacion de los virus que se pueden introducir en el medio de cultivo celular a traves de las materias primas y que se multiplican durante el proceso de cultivo (Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 y Kiss, R. 20ll. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729). Se ha informado de que se requieren temperaturas superiores a aproximadamente 85 0C para que el tratamiento HTST sea un procedimiento eficaz de inactivacion de virus, con temperaturas superiores a aproximadamente 95 0C necesarias para inactivar el parvovirus, un contaminante virico comun de cultivos celulares que se ha documentado que aparece en los procesos de cultivo celular, y que es resistente a muchos agentes quimicos y fisicos de inactivacion (Schleh et al.).
Aunque el tratamiento HTST ha demostrado ser muy eficaz en la inactivacion de virus, en diversos medios de cultivo celular se puede producir precipitacion o formacion de precipitados cuando se someten a este tratamiento. Dicha precipitacion conduce a una acumulacion de residuos sobre las superficies del sistema HTST y puede contribuir a ensuciar el equipo de modo que ya no pueda calentar el medio a la temperatura objetivo para una adecuada inactivacion de los contaminantes viricos. Ademas, dicha precipitacion tambien puede ensuciar los filtros usados tipicamente corriente abajo del sistema HTST durante el procesamiento final para eliminar microorganismos, tales como bacterias, del medio. Dicho ensuciamiento del filtro puede hacer que resulte imposible completar la etapa de procesamiento del medio antes del proceso de cultivo celular. En algunos casos, el precipitado tambien puede afectar al rendimiento del medio de cultivo celular y prevenir la produccion eficiente de farmacos biologicos a partir de las lineas celulares cultivadas. Para evitar la precipitacion se puede reducir la temperatura, pero esto puede afectar negativamente al exito de la inactivacion virica. Ademas, la formacion de precipitado durante el tratamiento HTST del medio celular puede dar como resultado la necesidad de limpiar o reparar con frecuencia el equipo utilizado para el tratamiento HTST durante el proceso de fabricacion, lo que contribuye significativamente al coste de procesamiento. Por lo tanto, existe una necesidad de procedimientos para prevenir la formacion de precipitado durante el tratamiento HTST sin afectar negativamente a la eficacia de este tratamiento en la eliminacion o inactivacion de contaminantes viricos.
La invencion descrita en el presente documento aborda estas necesidades proporcionando procedimientos para inactivar eficazmente los contaminantes viricos en medios de cultivo celular utilizando el tratamiento HTST con los parametros de procesamiento ajustados para poder reducir o evitar la formacion de precipitados.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCION
La invencion proporciona procedimientos, procesos, sistemas y composiciones para inactivar la contaminacion virica y/u otros contaminantes en medios de cultivo celular mediante el uso de un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) en combinacion con el ajuste de varios parametros, tales como el pH y/o la concentracion de calcio y/o fosfato en el medio de cultivo. Ademas, tambien se divulgan procedimientos, procesos, sistemas y composiciones que reducen el ensuciamiento del equipo y los filtros utilizados para el tratamiento HTST.
En consecuencia, en un aspecto, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende (a) someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST); y (b) ajustar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en nivel de pH, calcio y fosfato, con lo que se suprime la formacion de precipitado, en el que el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar virus o bacterias presentes en el medio,
a) en el que el pH se ajusta cuando el medio comprende calcio y fosfato, el pH se ajusta a un nivel bajo adecuado durante la preparacion del medio antes del tratamiento HTST, y el pH se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular;
b) en el que el nivel de calcio se ajusta cuando el medio comprende fosfato, el nivel de calcio se reduce de modo que
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se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de calcio se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular; o
b) en el que el nivel de fosfato se ajusta cuando el medio comprende calcio, el nivel de fosfato se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de fosfato se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.
En otros aspectos, la invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En otros modos de realizacion, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los modos de realizacion, el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus o virus potenciales presentes en el medio. En algunos modos de realizacion, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus o virus potenciales presentes en el medio. En algunos modos de realizacion, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 95, 97, 99, 101 o 103 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus o virus potenciales presentes en el medio. En algunos modos de realizacion, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos. En algunos modos de realizacion, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente 6,9 a 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos.
En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos. En algunos modos de realizacion, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se incrementa a continuacion hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de proteinas.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus, en donde el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST. En cualquiera de los modos de realizacion, el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En algunos modos de realizacion, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En algunos modos de realizacion, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 95, 97, 99, 101 o 103 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus, en donde el procedimiento comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST. En cualquiera de los modos de realizacion, el virus se selecciona del grupo que consiste en Parvoviridae, Paramyoxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae, Togaviridae, Caliciviridae y Picornaviridae. En cualquiera de los modos de realizacion, el virus es un virus con envoltura. En cualquiera de los modos de realizacion, el virus es un virus sin envoltura.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un esquema de un skid HTST representativo utilizado en la fabricacion.
La Figura 2 es una grafica que representa perfiles de calentamiento del procedimiento en bano de arena y del tratamiento HTST en el punto de ajuste objetivo de 102 0C. Las lineas muestran los perfiles de calentamiento en
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La Figura 3 es una imagen de muestras de medios conocidos por precipitar durante el tratamiento HTST despues del tratamiento termico por el procedimiento en bano de arena. A) Muestras no centrifugadas del Medio 1 a pH 7,0 o pH 6,4 y del Medio 2 a pH 7,0 o pH 6,7 en recipientes a presion sometidos a tratamiento termico. A) Alicuotas centrifugadas del Medio 1 a pH 7,0 o pH 6,4 y del Medio 2 a pH 7,0 o pH 6,7 procedentes de recipientes a presion sometidos a tratamiento.
La Figura 4 muestra estimaciones de parametros seleccionados de formulaciones de medios basados en el Medio 4 para parametros que se correlacionan con un mayor nivel de turbidez de la muestra tratada en bano de arena.
La Figura 5 es una serie de graficos que representan la superficie de respuesta de precipitacion, medida a partir de la turbidez (NTU) desde 3 perspectivas para formulaciones basadas en el Medio 4 con niveles variables de calcio, fosfato y pH durante el tratamiento termico en bano de arena. Las porciones de cada plano de perspectiva en donde la cuadricula es visible muestran una region en la que la turbidez fue inferior a 5 NTU, en correlacion con la ausencia de precipitacion visible en las muestras de medios sometidas a pruebas y representan un regimen de funcionamiento seguro. A) Vista lateral del grafico que muestra las mediciones de turbidez en medios con concentraciones variables de fosfato y de calcio. Vista superior del grafico que muestra las mediciones de turbidez en medios con B) concentraciones variables de fosfato y de calcio, C) concentraciones variables de fosfato y diferentes niveles de pH, y D) concentraciones variables de calcio y diferentes niveles de pH.
La Figura 6 es un grafico que representa formulaciones de medios situados en la superficie de respuesta del Medio 4 para pH 7,0 con respecto a sus concentraciones conocidas y estimadas de calcio y de fosfato. Independientemente de las otras diferencias de composicion entre todas las formulaciones, las concentraciones de calcio y de fosfato estan fuertemente correlacionadas con el potencial de precipitacion tras el tratamiento termico. La flecha indica el desplazamiento de un medio en el regimen de precipitacion debido a la adicion de hidrolizado que contiene niveles adicionales de fosfato y/o calcio.
La Figura 7 representa un grafico con el perfil de calentamiento promedio para cuatro formulaciones de medios en el sistema de bano de arena. Se tomaron cinco puntos finales diferentes de temperatura (indicados mediante 2 numeros, donde, por ejemplo, "2,5;75,9" = muestras tomadas tras 2,5 minutos con una temperatura promedio resultante de 75,9 0C). Las fotografias de la derecha incorporan circulos rellenos o vacios que se correlacionan con la precipitacion visible observada en muestras no centrifugadas o centrifugadas. Circulo vacio = no se detecto precipitacion por el procedimiento visual en muestras no centrifugadas o centrifugadas. Circulo relleno = se detecto precipitacion por el procedimiento visual en una o ambas muestras.
La Figura 8 es un grafico que representa los valores de turbidez (NTU) de las muestras en 5 puntos finales de temperatura diferentes tomadas de 4 formulaciones de medios diferentes. Los valores de turbidez mayores de ~8 NTU se correlacionan con la identificacion de precipitacion visible mediante inspeccion visual directa o inspeccion de muestras centrifugadas.
La Figura 9 es una serie de graficos que muestran la perdida de hierro (grafica de la izquierda) y de cobre (grafica de la derecha) tras el tratamiento HTST cuando las operaciones de procesamiento HTST y filtracion tuvieron exito.
La Figura 10 es una serie de graficos que muestran representaciones de los principales efectos sobre la recuperacion de hierro en funcion de la variacion de A) los niveles de pH, B) las concentraciones de calcio (Ca), C) las concentraciones de fosfato (PO4), D) las concentraciones de hierro (Fe) y E) las concentraciones de cobre (Cu) durante el tratamiento termico.
La Figura 11 representa una serie de graficos que demuestran la interaccion a partir de los resultados de experimentos disenados estadisticamente (diseno de experimentos (DoE)) que muestran los efectos de interaccion entre los niveles pH, Ca, PO4 y Fe sobre la recuperacion de hierro durante el tratamiento termico.
La Figura 12 es un grafico que muestra la dependencia de la concentracion final de Fe con respecto a la concentracion inicial de Fe en medios sometidos a tratamiento termico. El resto de los componentes del medio estaban en niveles normales 1,5 veces superiores a los del Medio 4.
La Figura 13 es un grafico que muestra la dependencia de la recuperacion de Fe con respecto al ajuste de varios parametros en los medios sometidos a tratamiento termico. A) Dependencia de la recuperacion de Fe con respecto a los niveles de pH, y B) dependencia de la recuperacion de Fe con respecto a las concentraciones de calcio y de fosfato en medios sometidos a tratamiento termico. El resto de los componentes del medio estaban en niveles normales 1,5 veces superiores a los del Medio 4. Las concentraciones estandar para el Medio 4 se indican como "1" en la escala del eje X.
La Figura 14 es un grafico que demuestra la relacion entre las recuperaciones de calcio y de fosfato y las
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recuperaciones de Fe tras el tratamiento termico. Los puntos de datos situados dentro del circulo rojo corresponden a muestras que mostraban precipitacion visible y aumento de la turbidez (NTU). La linea indica la relacion entre los puntos de datos de calcio.
La Figura 15 es un grafico que muestra los niveles de hierro en diversas formulaciones de medios de cultivo celular antes y despues del tratamiento HTST. Para un medio de cultivo celular particular (por ejemplo, el Medio 14), la barra de la izquierda indica los niveles esperados de hierro en el medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST, la barra del medio indica los niveles reales de hierro en el medio de cultivo celular antes del tratamiento HTST (Pre- HTST) y la barra de la derecha indica los niveles reales de hierro en el medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST (Post-HTST).
La Figura 16 es un grafico que demuestra que la adicion de hierro a los medios sometidos a tratamiento HTST es beneficiosa para el crecimiento de la linea celular de hibridoma NS0 en el cultivo celular. "HTST+" indica un medio de cultivo celular sometido a un tratamiento HTST. "HTST-" indica un medio de cultivo celular no sometido a un tratamiento HTST. "Fe" indica la presencia de un suplemento de hierro.
DESCRIPCION DETALLADA
Los inventores han hecho el descubrimiento inesperado de que el ajuste del pH del medio de cultivo celular, el ajuste de la concentracion de calcio, el ajuste de la concentracion de fosfato, el ajuste de la concentracion de calcio y de fosfato y/o la limitacion de la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio de cultivo celular, o el ajuste de una combinacion de pH, concentracion de calcio y concentracion de fosfato, y someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST a un intervalo de temperatura especifico durante un periodo de tiempo suficiente resulta eficaz para la inactivacion de virus (o de otros agentes infecciosos y/o adventicios) en el medio de cultivo, ademas de reducir el ensuciamiento del equipo al minimizar o prevenir la formacion de precipitados.
La presente invencion proporciona procedimientos para reducir el precipitado en el equipo utilizado para llevar a cabo un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) para inactivar virus, en donde el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 o de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para reducir el precipitado en el equipo utilizado para llevar a cabo un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) para inactivar virus, en donde el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. En otros aspectos, la presente invencion proporciona procedimientos para reducir el precipitado en el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus, en donde el procedimiento comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, la presente invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. En otros aspectos mas de la invencion, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otros aspectos, la presente invencion proporciona procedimientos para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprenden limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio de cultivo celular a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST.
I. Tecnicas generales
Las tecnicas y procedimientos descritos o citados en el presente documento son en general bien entendidos y comunmente empleados por los expertos en la tecnica usando metodologia convencional, tal como, por ejemplo, las metodologias ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edicion (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain
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Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
II. Definiciones
"Cultivar" una celula se refiere a poner en contacto una celula con un medio de cultivo celular en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento de la celula y/o la proliferacion de la celula.
"Cultivo discontinuo" se refiere a un cultivo en el que todos los componentes para el cultivo celular (incluyendo las celulas y todos los nutrientes de cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al inicio del proceso de cultivo.
La frase "cultivo celular discontinuo alimentado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cultivo discontinuo en el que las celulas y el medio de cultivo se suministran al recipiente de cultivo inicialmente y en el que el cultivo se alimenta con nutrientes de cultivo adicionales durante el proceso de cultivo, de manera continua o en incrementos discretos, con o sin recolecta periodica de celulas y/o producto antes de la finalizacion del cultivo.
"Cultivo por perfusion" es un cultivo por el que las celulas se retienen en el cultivo mediante, por ejemplo, filtracion, encapsulacion, anclaje a microportadores, etc., y en el que el medio de cultivo se introduce y retira del recipiente de cultivo de forma continua o intermitente.
"Recipiente de cultivo" se refiere a un recipiente utilizado para el cultivo de una celula. El recipiente de cultivo puede ser de cualquier tamano, siempre que resulte util para el cultivo de celulas.
Los terminos "medio" y "medio de cultivo celular" se refieren a una fuente de nutrientes utilizada para el crecimiento o el mantenimiento de celulas. Como entiende un experto en la tecnica, la fuente de nutrientes puede contener los componentes requeridos por la celula para el crecimiento y/o la supervivencia o puede contener componentes que ayudan al crecimiento y/o la supervivencia de las celulas. Vitaminas, aminoacidos esenciales o no esenciales y oligoelementos son ejemplos de componentes del medio. Se entiende que "medio" y "medios" se utilizan indistintamente en toda esta memoria descriptiva.
Un "medio de cultivo celular quimicamente definido" o "CDM" es un medio con una composicion especifica que esta libre de productos de origen animal o indefinidos, tales como suero de animales y peptona. Como entenderia un experto en la tecnica, un CDM se puede utilizar en un proceso de produccion de polipeptidos en el que una celula esta en contacto con, y segrega un polipeptido en, el CDM. Por lo tanto, se entiende que una composicion puede contener un CDM y un producto polipeptido y que la presencia del producto polipeptido no hace que el CDM sea quimicamente indefinido.
Un "medio de cultivo celular quimicamente indefinido" se refiere a un medio cuya composicion quimica no se puede especificar y que puede contener uno o mas productos de origen animal o indefinidos tales como suero de animales y peptona. Como entenderia un experto en la tecnica, un medio de cultivo celular quimicamente indefinido puede contener un producto de origen animal como fuente de nutrientes.
Los terminos "polipeptido" y "proteina" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polimeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polimero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un polimero de aminoacidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervencion; por ejemplo, por formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente de etiquetado. Tambien se incluyen dentro de la definicion, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), asi como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Los terminos "polipeptido" y "proteina", tal como se usan en el presente documento, abarcan especificamente anticuerpos.
Un "polipeptido aislado" se refiere a un polipeptido que ha sido recuperado de una celula o cultivo celular en el que se expreso.
Un "acido nucleico", tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a polimeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos o bases modificados, y/o sus analogos, o cualquier sustrato que se puede incorporar a un polimero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reaccion de sintesis. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si esta presente, la modificacion de la estructura de un nucleotido se puede transmitir antes o despues del montaje del polimero.
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Un "acido nucleico aislado" se refiere y abarca una secuencia de origen no natural, recombinante o de origen natural que se encuentra fuera o separada de su contexto habitual.
Un polipeptido "purificado" se refiere a un polipeptido cuya pureza se ha aumentado, de modo que existe en una forma que es mas pura que en su entorno natural y/o que la que se produce inicialmente y/o se sintetiza y/o amplifica en condiciones de laboratorio. La pureza es un termino relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.
El termino "anticuerpo" o "anticuerpos" se utiliza en el sentido mas amplio y cubre especificamente, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitopica, anticuerpos policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos), inmunoadhesinas y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biologica o inmunologica deseada. El termino "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza en el presente documento de forma intercambiable con anticuerpo.
Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una porcion de un anticuerpo de longitud completa, normalmente la region de union al antigeno o la region variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; moleculas de anticuerpo de cadena simple; diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El termino "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos, a excepcion de posibles mutaciones que se producen de forma natural y que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos y se dirigen contra un unico sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante del antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto a que se pueden sintetizar sin contaminacion por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no se debe interpretar como que requiere que la produccion del anticuerpo sea mediante ningun procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que son utiles en la presente invencion se pueden obtener mediante la metodologia de hibridoma descrita en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o se pueden obtener usando procedimientos de ADN recombinante en celulas de bacterias, animales eucariotas o plantas (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) identica(s) u homologa(s) a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada (vease la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes del presente documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias que se unen al dominio variable del antigeno, derivadas de un primate no humano (por ejemplo, el mono del Viejo Mundo, el simio, etc.) y secuencias de region constante humanas.
Los anticuerpos "humanizados" son formas de anticuerpos no humanos (p. ej., de roedores) que son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una region hipervariable del receptor se sustituyen por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tales como raton, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes restos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aun mas el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos los dominios variables, pero al menos uno y tipicamente dos, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tipicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596 (1992).
"Contaminantes" se refiere a materiales que son diferentes del producto polipeptido deseado. El contaminante incluye, sin limitacion: materiales de la celula huesped, tal como CHOP; proteina A lixiviada; acido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipeptido deseado; otro polipeptido; endotoxina; contaminante virico; componente de medio de cultivo celular, etc.
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Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "precipitado" se refiere a la formacion de particulas solidas o insolubles en una solucion. Se producen varias formas de precipitado y en el presente documento se describen ejemplos de precipitados. Ejemplos no limitantes incluyen: precipitacion de fosfato de calcio, whitlockita insoluble, oxidos, fosfato de hierro, y los precipitados de fosfato de calcio y hierro. La precipitacion de fosfato de calcio puede ser un proceso en el que el calcio y los fosfatos en solucion forman particulas insolubles, es decir, un precipitado. Las particulas insolubles se pueden denominar fosfatos de calcio. Los fosfatos de calcio incluyen, sin limitacion: fosfato de calcio monobasico, fosfato de calcio dibasico, fosfato de calcio tribasico, whitlockita e hidroxiapatita. Las particulas insolubles pueden incluir componentes adicionales, es decir, polipeptidos, acidos nucleicos, lipidos, iones, quelantes y metales. Tambien se incluyen dentro de la definicion el crecimiento de tales particulas por precipitacion adicional o por agregacion, floculacion y/o reordenamiento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "ensuciamiento" se refiere a la acumulacion y la formacion de materiales no deseados sobre las superficies del equipo de procesamiento. El ensuciamiento se puede caracterizar como un problema combinado, en estado no estacionario, de transferencia de momento, masa y calor en el que tambien pueden tener lugar procesos quimicos, de solubilidad, corrosion y biologicos. El ensuciamiento se puede deber a la precipitacion, es decir, precipitacion de fosfato de calcio.
Tal como se utiliza en el presente documento, "agente adventicio" abarca los virus y bacterias (incluyendo las bacterias que pueden pasar a traves de filtros de grado de esterilizacion). Un "agente infeccioso" es un tipo de "agente adventicio".
Se entiende que aspectos y modos de realizacion de la invencion descrita en el presente documento incluyen aspectos y modos de realizacion "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en".
Para uso en el presente documento, salvo indicacion clara de lo contrario, los terminos "un", "una" y similares se refiere a uno o mas.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parametro en el presente documento incluye (y describe) modos de realizacion que se aproximan a ese valor o parametro per se. Por ejemplo, la descripcion que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripcion de "X". Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo.
III. Medios de cultivo celular
Los procedimientos para inactivar los virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios presentes en medios de cultivo celular se pueden aplicar a cualquier tipo de medio de cultivo celular en el que exista preocupacion de contaminacion virica, posible contaminacion virica o contaminacion por otros agentes infecciosos o contaminacion por agentes adventicios. Se entiende que la presente invencion contempla composiciones y procedimientos que se pueden aplicar a cultivos de celulas y a medios de cultivo celular donde existe contaminacion virica potencial, asi como contaminacion virica real.
Los procedimientos de inactivacion de virus, la reduccion de la formacion de precipitado y la reduccion del ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST se pueden utilizar para producir una composicion de medio de cultivo celular en donde los virus, los agentes adventicios y otros agentes infecciosos se han inactivado. De este modo, en el presente documento se contempla y se detalla cualquier composicion de medios de cultivo celular y sus intermedios que pasan por el sistema de inactivacion virica, inactivacion de agentes adventicios y/o inactivacion de agentes infecciosos. Se ha identificado que el ajuste de parametros especificos de los medios de cultivo celular (pH, niveles de calcio y niveles de fosfato) permite reducir o prevenir la formacion de precipitados en los medios despues de someterse a un tratamiento HTST a temperaturas eficaces para la inactivacion de contaminantes viricos y de otros contaminantes presentes en los medios.
Ajustes independientes de los parametros de los medios de cultivo celular, tales como pH, concentraciones o cantidades de calcio y concentraciones o cantidades de fosfato (y cualquier combinacion de los mismos) se pueden utilizar con el tratamiento HTST para reducir los precipitados (por ejemplo, un complejo que comprende calcio y fosfato), para reducir el ensuciamiento del equipo HTST y para reducir el ensuciamiento del filtro, todo ello manteniendo la idoneidad para el cultivo celular. Los medios de cultivo celular que mantienen la idoneidad para el cultivo celular permiten que las celulas se propaguen, crezcan, sobrevivan, produzcan cualquier polipeptido, proteina o compuesto, secreten cualquiera de estos productos al medio, y cualquier otra caracteristica que los expertos en la tecnica entenderian que se incluya para la idoneidad del cultivo celular.
Los ajustes independientes de los parametros de cultivo celular descritos en el presente documento son aplicables a cualquier proceso de cultivo celular y pueden ser beneficiosos para la produccion de polipeptidos y/o proteinas, asi como tambien para la generacion de otros productos, tales como celulas, medios y otros componentes de los medios. El ajuste de estos parametros de los medios de cultivo celular para reducir o prevenir la formacion de precipitados en medios de cultivo celular es beneficioso para la produccion de farmacos biologicos, tal como un farmaco polipeptido.
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El uso de medios de cultivo celular con estos parametros o componentes ajustados es eficaz para eliminar los contaminantes vrncos de un farmaco biologico, asf como para reducir o prevenir la formacion de precipitados que pueden afectar al rendimiento de los medios de cultivo celular, evitan la produccion eficiente de farmacos biologicos a partir de las lfneas de celulas cultivadas y contribuyen al ensuciamiento del equipo HTST. Cualquier medio detallado en el presente documento se puede emplear en cualquier etapa de crecimiento celular, mantenimiento y produccion de farmacos biologicos y se puede utilizar en el medio basal y/o en el medio de alimentacion. Los medios, tal como se describen en el presente documento, dan lugar a niveles aceptables de turbidez o de precipitados de una composicion que comprende el farmaco biologico aislado del cultivo de celulas cultivadas en los medios sometidos a tratamiento HTST.
Se proporciona un medio de cultivo celular que comprende uno o mas de los siguientes componentes: (a) calcio y (b) fosfato. En algunas variaciones, un medio de cultivo celular comprende los componentes (a) o (b), o los componentes (a) y (b). En otras variaciones, un medio de cultivo celular no comprende los componentes (a) y (b). En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular qmmicamente definido. En otros aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular qmmicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se trata mediante HTST para inactivar virus potencialmente presentes en las materias primas y en los equipos utilizados para preparar los medios.
Se pueden anadir componentes de medios a una composicion en formas que son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el calcio se puede proporcionar como, pero no limitado a, cloruro de calcio, cloruro de calcio deshidratado, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato de calcio tribasico, L-lactato de calcio hidrato, folinato de calcio y nitrato de calcio tetrahidrato. Por ejemplo, el fosfato se puede proporcionar como, pero no limitado a, fosfato de sodio, fosfato monosodico, fosfato disodico, fosfato de potasio monobasico, solucion salina tamponada con fosfato, fosfato de calcio y fosfato de calcio dibasico.
La relacion entre el fosfato y el calcio se puede ajustar para el tratamiento HTST de modo que los complejos que comprenden calcio y fosfato (por ejemplo, complejos de fosfato de calcio (CaPO4)) no se formen. En una variacion, la cantidad total de fosfato y de calcio se ajusta o se limita de modo que los complejos que comprenden calcio y fosfato (por ejemplo, complejos de fosfato de calcio (CaPO4)) no se formen. En otra variacion, la cantidad total de fosfato y de calcio se limita de modo que la formacion de complejos de CaPO4 permite una operacion exitosa de HTST (por ejemplo, sin ensuciamiento de los equipos de HTST y de filtracion). Los procedimientos de deteccion de condiciones problematicas suelen incluir mediciones indirectas de precipitacion incluyendo turbidez, observaciones operativas de los equipos de HTST y de filtracion y observaciones visuales de los equipos de HTST y de filtracion (por ejemplo, mediante el uso de un horoscopo). En un aspecto, el medio es un medio de cultivo celular que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio a menos de aproximadamente 10 mM. En otra variacion, el fosfato total y el calcio total estan en una concentracion en el medio de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM. En otra
variacion, el fosfato total aproximadamente 9 mM aproximadamente 7 mM aproximadamente 8 mM aproximadamente 6 mM aproximadamente 4 mM aproximadamente 2 mM aproximadamente 9 mM aproximadamente 9 mM
y el calcio total estan de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente de aproximadamente
en una concentracion en el medio de aproximadamente 1 mM
8 mM; de aproximadamente 3 mM
6 mM; de aproximadamente 1 mM
7 mM; de aproximadamente 1 mM 5 mM; de aproximadamente 1 mM 3 mM; de aproximadamente 1 mM
9 mM; de aproximadamente 3 mM 9 mM; de aproximadamente 5 mM 9 mM; de aproximadamente 7 mM
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2 mM 4 mM 6 mM
aproximadamente
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aproximadamente
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aproximadamente
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aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM; aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM. En una variacion, el fosfato total y el calcio total estan en una concentracion en el medio de
aproximadamente 1 mM a aproximadamente 3 mM a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 3 mM a aproximadamente 5 mM a aproximadamente 7 mM a
aproximadamente 9 mM aproximadamente 7 mM aproximadamente 8 mM aproximadamente 6 mM aproximadamente 4 mM aproximadamente 2 mM aproximadamente 9 mM aproximadamente 9 mM aproximadamente 9 mM;
de aproximadamente 2 mM a de aproximadamente 4 mM a de aproximadamente 1 mM a de aproximadamente 1 mM a de aproximadamente 1 mM a de aproximadamente 2 mM a de aproximadamente 4 mM a de aproximadamente 6 mM a
aproximadamente 8 mM aproximadamente 6 mM aproximadamente 7 mM aproximadamente 5 mM aproximadamente 3 mM aproximadamente 9 mM aproximadamente 9 mM aproximadamente 9 mM
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de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM;
aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos de la invencion, la cantidad total de calcio y de fosfato en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales de la invencion, la cantidad total de calcio y de fosfato en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular esta libre de calcio y de fosfato.
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El nivel de calcio en el medio de cultivo celular se puede ajustar cuando el medio comprende fosfato. Los ajustes pueden aumentar o reducir el nivel de calcio. En algunos modos de realizacion, el nivel de calcio se reduce (incluyendo la eliminacion de calcio). En otros modos de realizacion, el nivel de calcio se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato. En otros modos de realizacion, se elimina calcio del medio antes del tratamiento HTST. En cualquiera de estos modos de realizacion, el pH se ajusta de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato (por ejemplo, reduccion de la cantidad en comparacion con los complejos que formarian si no se hicieran estos ajustes). En otros modos de realizacion, el nivel de calcio se puede ajustar aun mas despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular. El tiempo entre el tratamiento HTST y el ajuste de los niveles de calcio despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular se puede modificar. Dentro del alcance de la invencion se contempla un tiempo de segundos, minutos, dias, semanas, meses o anos.
En otra variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende limitar la cantidad total de calcio a menos de aproximadamente 10 mM. En otra variacion, el calcio total esta en una concentracion en el medio de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM. En otra variacion, el calcio total esta en una concentracion en el medio de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 6 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 7 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 3 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 9 mM; de

aproximadamente 3 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 9 mM; de

aproximadamente 5 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 9 mM; de
aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM; aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 yno mas de aproximadamente 9 mM. En otra variacion, el calcio total esta en una concentracion en el medio de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 4 mM a

aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 1 mM a

aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a

aproximadamente 5 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM; de aproximadamente 1 mM a

aproximadamente 3 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; de aproximadamente 2 mM a

aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 4 mM a

aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 6 mM a

aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 8 mM a
aproximadamente 9 mM; de aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos de la invencion, la cantidad total de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales de la invencion, la cantidad total de calcio en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular esta libre de fosfato.
En otro aspecto, el nivel de fosfato se puede ajustar cuando el medio comprende calcio. Los ajustes pueden aumentar o reducir el nivel de fosfato. En algunos modos de realizacion, el nivel de fosfato se reduce. En algunos modos de realizacion, el nivel de fosfato se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato. En algunos modos de realizacion, se elimina fosfato del medio antes del tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato. En algunos modos de realizacion, el nivel de fosfato se puede ajustar aun mas despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular. El tiempo entre el tratamiento HTST y el ajuste de los niveles de fosfato despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular se puede modificar. Dentro del alcance de la invencion se contempla un tiempo de segundos, minutos, dias, semanas, meses o anos.
En otra variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende limitar la cantidad total de fosfato a menos de aproximadamente 10 mM. En otra variacion, el fosfato total esta en una concentracion en el medio de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM. En otra variacion, el fosfato total esta en una concentracion en el medio de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 6 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 7 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 3 mM; de

aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 9 mM; de

aproximadamente 3 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 9 mM; de

aproximadamente 5 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 9 mM; de
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aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM; aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 yno mas de aproximadamente 9 mM. En otra variacion, el fosfato total esta en una
concentracion en aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente
el medio de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
de
3 mM a aproximadamente 7 mM 1 mM a aproximadamente 8 mM 1 mM a aproximadamente 6 mM 1 mM a aproximadamente 4 mM 1 mM a aproximadamente 2 mM 3 mM a aproximadamente 9 mM 5 mM a aproximadamente 9 mM 7 mM a aproximadamente 9 mM
de aproximadamente cualquiera de 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos de la invencion, la cantidad total de fosfato en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales de la invencion, la cantidad total de fosfato en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular esta libre de calcio.
8 mM
6 mM
7 mM 5 mM 3 mM
9 mM 9 mM 9 mM 9 mM;
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
aproximadamente
2 mM 4 mM 1 mM 1 mM
1 mM
2 mM 4 mM 6 mM 8 mM
En una variacion, un medio de cultivo celular comprende 1 o 2 o ambos componentes (a) y (b) en las concentraciones enumeradas en el presente documento que comprende limitar la cantidad total de (a) o de (b) o de (a) y (b) a menos de aproximadamente 10 mM. Se entiende que un medio de cultivo celular puede contener una combinacion de los componentes (a) y (b) en cualquiera de los intervalos de concentracion proporcionados en el presente documento de igual forma que si todas y cada una de las concentraciones se hubieran enumerado de forma especifica e individual. Por ejemplo, se entiende que el medio en una variacion que comprende los componentes (a) y (b), en el que la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,5 mM y la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,5 mM. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente definido. En otros aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el medio esta libre de calcio durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade calcio al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el medio esta libre de fosfato durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade fosfato al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST.
En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende una concentracion de fosfato de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1 mM y una concentracion de calcio de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 3 mM. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1,25 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 2,5 mM. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,25 mM a aproximadamente 1,5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 2,25 mM. En otra variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,5 mM a aproximadamente 1,75 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 2 mM. En una variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,75 mM a aproximadamente 2 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1,75 mM. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 2,25 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1,5 mM. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 2,25 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1,5 mM. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,25 mM a aproximadamente 2,5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1,25 mM. En otra variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 2,75 mM, y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1,15 mM. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,75 mM a aproximadamente 3 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1 mM. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 3,5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,8 mM. En una variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 3,5 mM a aproximadamente 4,5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,6 mM. En una variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 4,5 mM a aproximadamente 5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,5 mM. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 5,5 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,25 mM. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 5,5 mM a aproximadamente 6 mM y la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,1 mM. En otro aspecto, los parametros de pH, calcio y fosfato se pueden ajustar de forma independiente como se muestra en ejemplo de la Figura 5 (tal como la figura 5B, la Figura 5C y la Figura 5D) de modo que la turbidez (como una medida indirecta de precipitacion a base de fosfato de calcio) permanece en el area de la cuadricula (en donde el area de la cuadricula representa los valores
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de turbidez en o por debajo del umbral de turbidez de fracaso total de 5 NTU en este ejemplo) y evita los intervalos de precipitacion que se muestran en las areas sin cuadricula (donde las areas sin cuadricula representan la respuesta de turbidez por encima del umbral de turbidez de fracaso total de 5 NTU). La superficie de respuesta mostrada en la Figura 5 muestra los efectos multifactoriales del pH, las concentraciones de calcio y las concentraciones de fosfato en la turbidez (como una medida indirecta de precipitacion a base de fosfato de calcio). Por lo tanto, la superficie de respuesta demuestra que los factores se pueden ajustar en combinacion y no solo como un unico factor a la hora de encontrar puntos de ajuste de operacion del tratamiento HTST que sean aceptables para pH en combinacion con concentraciones de calcio y de fosfato aceptables en el medio que se va a procesar.
Otro parametro independiente (ademas del calcio y fosfato como otros parametros independientes) que se puede ajustar es el pH. Como tal, el pH se puede ajustar cuando el medio comprende calcio y fosfato. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta a un nivel bajo adecuado durante la preparacion del medio antes del tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta mediante reduccion a un nivel adecuado. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta a menos de aproximadamente 7,2. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta a aproximadamente 5,0 a 7,2. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta aun mas despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular. En algunos modos de realizacion, el pH se ajusta a aproximadamente 6,9 a 7,2. El tiempo entre el tratamiento HTST y el ajuste de los niveles de pH despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular se puede modificar. Dentro del alcance de la invencion se contempla un tiempo de segundos, minutos, dias, semanas, meses o anos.
En otros aspectos, se proporciona un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2. En un aspecto, se proporciona un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente definido. En otros aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. Esto puede ser antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. Opcionalmente, un experto en la tecnica puede ajustar el pH del medio despues del tratamiento HTST, de modo que el medio se encuentra a un pH que es adecuado para procesos de cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2. En otra variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de
aproximadamente
pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9. En otra variacion el pH del medio es un pH de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
5,2 a aproximadamente 6,7; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,5; de
aproximadamente
5,6 a aproximadamente 6,3; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,1 de
aproximadamente
5,9 a aproximadamente 6,0; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,7; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 6,5; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,3; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 6,1 de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,9; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 5,7; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,5; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 5,3; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,1 de
aproximadamente
5,2 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
5,6 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
6,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
6,2 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 o 6,9; al menos aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 y no mas de aproximadamente 6,9. En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2. En otra variacion, el pH del medio es un pH de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,7; de
aproximadamente
5,4 a aproximadamente 6,5; de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,3; de
aproximadamente
5,8 a aproximadamente 6,1 de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,0; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 6,7; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 6,3; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,1 de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 5,9; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,7; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 5,5; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,3; de
aproximadamente
5,0 a aproximadamente 5,1 de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
5,4 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
5,8 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9; de
aproximadamente
6,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,9; de
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aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 o 6,9; al menos aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 y no mas de aproximadamente 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. Esto puede ser antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. El medio se puede ajustar a un pH adecuado para procesos de cultivo celular segun sea necesario despues del tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2. En otra variacion, el pH del medio es de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,0; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 o 7,2; de al menos aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 y no mas de aproximadamente 7,2. En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2. En otra variacion, el pH del medio es de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,0; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 o 7,2; de al menos aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 y no mas de aproximadamente 7,2 para la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio es de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM. En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En cualquier variacion, el pH y la cantidad de calcio y de fosfato es cualquier cantidad detallada en el presente documento. En cualquier aspecto, el medio esta libre de calcio durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade calcio al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el medio esta libre de fosfato durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade fosfato al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion, el medio es un medio de cultivo celular que comprende una concentracion de fosfato de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 0,5 mM y un pH de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,4. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 0,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,35. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 0,75 mM a aproximadamente 1 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,25. En otra variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,2. En una variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,25 mM a aproximadamente 1,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,1. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,5 mM a aproximadamente 1,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,05. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 1,75 mM a aproximadamente 2 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7. En otra variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 2,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,9. En una variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,25 mM a aproximadamente 2,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,85. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 2,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,75. En una variacion adicional, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 2,75 mM a aproximadamente 3 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,7. En una variacion adicional mas, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 3,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,6. En una variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 3,25 mM a aproximadamente 3,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,5. En otra variacion, la concentracion de fosfato es de aproximadamente 3,5 mM a aproximadamente 3,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,45.
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En una variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1 mM y el pH es de aproximadamente 6,65 a aproximadamente 7,4. En otra variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,55 a aproximadamente 7,4. En una variacion adicional, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,25 mM a aproximadamente 0,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,4. En otra variacion adicional mas, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 0,6 mM y el pH es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,2. En una variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,6 mM a aproximadamente 0,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7. En otra variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 0,75 mM a aproximadamente 1 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,9. En una variacion adicional, la concentracion de calcio es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1,1 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,8. En una variacion adicional mas, la concentracion de calcio es de aproximadamente 1,1 mM a aproximadamente 1,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,7. En una variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 1,25 mM a aproximadamente 1,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,65. En otra variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 1,5 mM a aproximadamente 1,75 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,55. En una variacion adicional, la concentracion de calcio es de aproximadamente 1,75 mM a aproximadamente 2 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,5. En una variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 2,25 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,45. En otra variacion, la concentracion de calcio es de aproximadamente 2,25 mM a aproximadamente 2,5 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,43. En una variacion adicional, la concentracion de calcio es de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 2,6 mM y el pH es de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,41.
Componentes de medios individuales pueden estar presentes en cantidades que resultan en una o mas ventajosas propiedades, tales como la inactivacion virica, la reduccion de la formacion de precipitado y la reduccion del ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST. En una variacion, un medio de cultivo celular como se proporciona en el presente documento contiene parametros de medios como los que se describen en la Tabla 1. Se entiende que una composicion de medio puede comprender uno o mas de los componentes del medio de la Tabla 1 (por ejemplo, uno o mas de los componentes (a) a (c), tal como una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (a), (b) y (c), o una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (a), (b) y (d), o una composicion de medio que comprende los componentes (a) y (b), o una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (a) y (c), o una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (b) y (c), o una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (a) y (d), o una composicion de medio que comprende cada uno de los componentes (b) y (d) en cualquiera de las cantidades que aparecen en la Tabla 1, de la misma manera que si todas y cada una de las combinaciones de componentes y cantidades se hubieran enumerado de forma especifica e individual. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente definido. En otros aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el medio esta libre de calcio durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade calcio al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el medio esta libre de fosfato durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, se anade fosfato al medio de cultivo celular despues del tratamiento HTST. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se lleva hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
Tabla 1. Ejemplos de niveles de componentes o parametros del medio
Componente parametro medio
o
del
Nivel de componente o parametro en el medio
(a) Calcio
de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 2 mM a
aproximadamente
8 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 7 mM; de
aproximadamente
4 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente
8 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 7 mM; de
aproximadamente
1 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente
5 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM; de
aproximadamente
1 mM a aproximadamente 3 mM; de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente
2 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 9 mM; de
aproximadamente
3 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 4 mM a
aproximadamente
9 mM; de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 9 mM; de
aproximadamente
6 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 7 mM a
aproximadamente
9 mM; de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM;
aproximadamente cualquiera de9u8o7o6o5o4o3o2o1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM.
(b) Fosfato
de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 2 mM a
aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 8 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 7 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 6 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 3 mM; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2 mM; de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 9 mM; de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 9 mM; aproximadamente cualquiera de9u8o7o6o5o4o3o2o1 mM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 y no mas de aproximadamente 9 mM.
(c) pH (antes de la fase de produccion de polipeptidos)
de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,7; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,5; de aproximadamente 5.6 a aproximadamente 6,3; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,1; de aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,0; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,7; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,3; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,1; de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 5,9; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,7; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,5; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,3; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,1; de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5.6 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,9; sobre cualquiera de 5.0 o 5.2 o 5.4 o 5.6 o 5.8 o 6.0 o 6.2 o 6.4 o 6.6 o 6.8 o 6.9; al menos aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 y no mas de aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 5.2 a aproximadamente 6,9; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 6,6; de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 6,3; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,0; de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 5,4 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 5,8 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5,2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6.2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 o 6,9 o 7,0 o 7,1 o 7,2; de al menos aproximadamente cualquiera de 5,0 o 5.2 o 5,4 o 5,6 o 5,8 o 6,0 o 6,2 o 6,4 o 6,6 o 6,8 o 7,0 y no mas de aproximadamente 7,2.
(c) pH (para la fase de produccion de polipeptidos)
de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,1; de aproximadamente 6,9a aproximadamente 7,0; de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,2; de aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 o 7,2; de al menos aproximadamente cualquiera de 6,9 o 7,0 o 7,1 y no mas de aproximadamente 7,2.
Un medio proporcionado en el presente documento en una variacion comprende calcio y fosfato. En una variacion, el medio que comprende calcio y fosfato es un medio de alimentacion. En otra variacion, el medio que comprende calcio y fosfato es un medio basal. En algunos aspectos, el medio de alimentacion es un medio de produccion. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente definido. En otros aspectos, el medio 5 de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta hasta un nivel suficiente para la expresion de proteinas durante la 10 fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos 15 del cultivo celular. En un aspecto, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
Un medio proporcionado en el presente documento en una variacion comprende un medio de cultivo celular en el que
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el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9. En una variacion, el medio que comprende calcio y fosfato es un medio de alimentacion. En otra variacion, el medio que comprende calcio y fosfato es un medio basal. En algunos aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente definido. En otros aspectos, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular quimicamente indefinido. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el medio de cultivo celular se utiliza para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En aspectos adicionales, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En cualquiera de los aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion, la invencion proporciona un medio en el que los componentes del medio celular se ajustan utilizando una superficie de respuesta, como se detalla en el Ejemplo 2. En otra variacion, la invencion proporciona un medio en el que los componentes de del medio celular se ajustan utilizando la superficie de respuesta de la Figura 5 y la Figura 6.
En una variacion, la invencion proporciona un medio en el que se anaden metales traza al medio despues de que el medio se someta a tratamiento HTST. En un aspecto, un metal traza es al menos uno o mas metales traza seleccionados del grupo que consiste en hierro o cobre. En una variacion, la invencion proporciona un medio en el que se anade hierro al medio en una cantidad aproximadamente 1 mM a aproximadamente 125 pM despues de que el medio se someta a tratamiento HTST. En otra variacion, el hierro esta en una concentracion en el medio de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 125 pM; de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 120 pM; de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 110 pM; de aproximadamente 30 pM a aproximadamente 100 pM; de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 90 pM; de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 80 pM; de aproximadamente 60 pM a aproximadamente 70 pM; 1 m a aproximadamente 120 pM; 1 m a aproximadamente 110 pM; 1 m a aproximadamente 100 pM; 1 m a aproximadamente 90 pM; 1 m a aproximadamente 80 pM; 1 m a aproximadamente 70 pM; 1 m a aproximadamente 60 pM; 1 m a aproximadamente 50 pM; 1 m a aproximadamente 40 pM; 1 m a aproximadamente 30 pM; 1 m a aproximadamente 20 pM; 1 m a aproximadamente 10 pM; 10 m a aproximadamente 125 pM; 20 m a aproximadamente 125 pM; 30 m a aproximadamente 125 pM; 40 m a
aproximadamente 125 pM; 50 m a aproximadamente 125 pM; 60 m a aproximadamente 125 pM; 70 m a
aproximadamente 125 pM; 80 m a aproximadamente 125 pM; 90 m a aproximadamente 125 pM; 100 m a
aproximadamente 125 pM; 110 m a aproximadamente 125 pM; 120 m a aproximadamente 125 pM; de
aproximadamente cualquiera de 1 o 10 o 20 o 30 o 40 o 50 o 60 o 70 u 80 o 90 o 100 o 110 o 120 o 125 pM; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 10 o 20 o 30 o 40 o 50 o 60 o 70 u 80 o 90 o 100 o 110 o 120 y no mas de aproximadamente 125 pM despues de que el medio se someta a tratamiento HTST.
Un medio proporcionado en el presente documento en un aspecto da lugar a uno o mas atributos favorables cuando se utiliza en un procedimiento para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST en comparacion con los atributos que se obtienen cuando se utiliza un medio diferente para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. La formacion de precipitado en medios de cultivo celular sometidos a tratamiento HTST para la inactivacion de virus para la produccion de un farmaco biologico (por ejemplo, un anticuerpo) puede afectar a los atributos de calidad de un farmaco biologico, tales como la actividad del farmaco biologico. Ademas, la formacion de precipitado en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST puede provocar el ensuciamiento del equipo HTST. El ensuciamiento del equipo HTST puede afectar a la capacidad del tratamiento HTST para inactivar los virus de manera eficaz. En un aspecto, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST. En una variacion, un medio como se proporciona en el presente documento reduce la precipitacion en el medio de cultivo celular cuando se utiliza en un procedimiento para la inactivacion de virus en un cultivo celular durante el tratamiento HTST en comparacion con la precipitacion en un medio diferente utilizado para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En otra variacion, un medio como se proporciona en el presente documento reduce el ensuciamiento del equipo HTST cuando se utiliza en un procedimiento para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST en comparacion con el ensuciamiento del equipo HTST por un medio diferente utilizado para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST. En otra variacion adicional mas, un medio como se proporciona en el presente documento reduce el precipitado sobre el equipo utilizado para el tratamiento HTST cuando se utiliza en un procedimiento para la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST del medio en comparacion con el precipitado sobre el equipo utilizado para el tratamiento HTST de un medio diferente. En otra variacion, un medio como se proporciona en el presente documento inactiva virus en medios de cultivo celular cuando se utiliza en un procedimiento para el tratamiento HTST del medio en comparacion con la inactivacion de virus en un medio diferente. En otra variacion adicional mas, un medio como se proporciona en el presente documento reduce la precipitacion resultante del ensuciamiento del filtro en un procedimiento para el tratamiento HTST del medio en comparacion con la
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inactivacion de virus en un medio diferente.
Una observacion es que los metales traza, tales como cobre y hierro, que podrfan ser importantes para el cultivo celular (incluyendo la produccion de polipeptidos/protefnas, el crecimiento celular, la supervivencia y/o la proliferacion) se reducen en el transcurso del tratamiento HTST. Como tal, la invencion tambien proporciona procedimientos para la inactivacion de virus o agentes adventicios en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende (a) someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST); y (b) ajustar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en pH, nivel de calcio y nivel de fosfato en el que hay un ajuste adicional de las concentraciones de metales traza. Los metales traza pueden ser hierro o cobre. Las concentraciones de hierro y/o cobre se pueden ajustar de forma independiente en el medio antes de llevar a cabo el tratamiento HTST. En algunos casos, si se anticipa una disminucion de la concentracion de hierro y/o cobre y, en general, la cantidad es conocida, se puede anadir hierro y/o cobre al medio antes de llevar a cabo el tratamiento HTST. En otros casos en los que no se conoce la cantidad de disminucion, el hierro y/o el cobre se pueden reducir (incluso eliminar) del medio antes de llevar a cabo el tratamiento HTST. A continuacion, el medio se puede suplementar con hierro y/o cobre despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular.
IV. Composiciones y procedimientos de la invencion
Los medios de cultivo celular que se detallan en el presente documento se pueden utilizar en un procedimiento para la inactivacion de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST. El medio se puede utilizar en un procedimiento de cultivo de celulas, ya sea mediante cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado o cultivo por perfusion. El medio se puede utilizar en un procedimiento para el cultivo de celulas para producir polipeptidos, incluyendo anticuerpos. El medio se puede utilizar en un procedimiento para el cultivo de celulas para producir productos basados en celulas, incluyendo los utilizados en aplicaciones de reemplazo de tejidos o de terapia genica. El medio se puede utilizar en cualquier aplicacion de cultivo celular en el que la prevencion de la potencial contaminacion vfrica se beneficie del uso de un tratamiento termico que inactiva los virus, manteniendo la capacidad del medio para cultivar celulas. El medio se puede utilizar en un procedimiento de inactivacion de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios en medios de cultivo celular sometidos a cualquiera de las variaciones o modos de realizacion de tratamiento termico descritos en el presente documento.
Se proporcionan procedimientos de inactivacion de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios en medios de cultivo celular tal como se detallan en el presente documento en el que el medio de cultivo celular se somete a tratamiento HTST. En una variacion, el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio comprende uno o mas componentes de medio como se describen en la Tabla 1 (por ejemplo, un medio que comprende los componentes (a) y (b) o un medio que comprende los componentes (a ) y (c) o un medio que comprende los componentes (b) y (c) o un medio que comprende los componentes (a) y (d) o un medio que comprende los componentes (b) y (d) o un medio que comprende cada uno de los componentes (a ) a (c) o (a), (b) y (d) en cualquiera de las cantidades que aparecen en la Tabla 1).
Procedimientos para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios en el que el medio de cultivo celular tal como se detalla en el presente documento se utiliza en el equipo y se somete a tratamiento HTST. En una variacion, el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio comprende uno o mas componentes de medio como se describen en la Tabla 1 (por ejemplo, un medio que comprende los componentes (a) y (b) o un medio que comprende los componentes (a ) y (c) o un medio que comprende los componentes (b) y (c) o un medio que comprende los componentes (a) y (d) o un medio que comprende los componentes (b) y (d) o un medio que comprende cada uno de los componentes (a ) a (c) o (a), (b) y (d) en cualquiera de las cantidades que aparecen en la Tabla 1). En una variacion particular, el ensuciamiento es ensuciamiento por precipitado. En una variacion, el ensuciamiento es el ensuciamiento del filtro.
A. Procedimientos para la inactivacion vfrica y la inactivacion de agentes infecciosos y/o agentes adventicios en medios de cultivo celular
En algunas variaciones, la invencion proporciona procedimientos de inactivacion de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios en medios de cultivo celular sometidos a tratamiento a alta temperatura en los que el medio es compatible con el tratamiento termico en comparacion con los medios incompatibles. Por ejemplo, el tratamiento termico de un medio incompatible precipita o da lugar a precipitacion a las temperaturas necesarias para la inactivacion eficaz de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios. Tal como se establece en los medios divulgados en el presente documento, los medios compatibles con el tratamiento termico no precipitan o reducen la precipitacion a la temperatura necesaria para la inactivacion eficaz de virus, agentes infecciosos y/o agentes adventicios. En algunos aspectos, el tratamiento termico es un tratamiento HTST. En otros aspectos, el tratamiento termico es un tratamiento termico por lotes, incluyendo, pero no limitado a, un tratamiento en bano de arena y un procedimiento en bano de aceite.
En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que
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comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En otros aspectos, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el
tratamiento HTST. En un aspecto adicional, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos
de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En una variacion adicional mas, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y que
comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el
tratamiento HTST. En algunos aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces a aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se eleva hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. Los virus de cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento pueden ser cualquier virus detallado en el presente documento (por ejemplo, un parvovirus) y el medio del procedimiento puede ser cualquier medio detallado en el presente documento, tal como un medio que comprende los parametros de los medios que se detallan en la Tabla 1.
a) Temperatura y tiempo de mantenimiento de la temperatura
En cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento, el tratamiento termico comprende elevar la temperatura del medio a al menos aproximadamente 85 0C durante una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En un aspecto adicional, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 90 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En un aspecto adicional, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En un aspecto adicional mas, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 95, 97, 99, 101 o 103 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En otro aspecto adicional mas, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, o 117 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En aun otro aspecto adicional, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En aun otro aspecto adicional, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En algunos aspectos, la temperatura del medio se eleva hasta aproximadamente 95 0C. En otros aspectos, la temperatura del medio se eleva hasta aproximadamente 102 0C. En una variacion, la temperatura del medio se eleva hasta aproximadamente 85 0C a aproximadamente 120 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En otra variacion, la temperatura del medio se eleva hasta aproximadamente 85 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 87 0C a aproximadamente 118 0C; de aproximadamente 89 0C a aproximadamente 116 0C; de aproximadamente 91 0C a

aproximadamente 114 0C; de aproximadamente 93 0C a aproximadamente 112 0C; de aproximadamente 95 0C a

aproximadamente 110 0C; de aproximadamente 97 0C a aproximadamente 108 0C; de aproximadamente 99 0C a
aproximadamente 106 0C; de aproximadamente 101 0C a aproximadamente 104 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 118 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 116 0C; de aproximadamente 85 0C a

aproximadamente 114 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 112 0C; de aproximadamente 85 0C a

aproximadamente 110 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 108 0C; de aproximadamente 85 0C a

aproximadamente 106 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 104 0C; de aproximadamente 85 0C a

aproximadamente 102 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 100 0C; de aproximadamente 85 0C a
98 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 96 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 94 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 92 0C; de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 90 0C; de

aproximadamente 85 0C a aproximadamente 88 0C; de aproximadamente 87 0C a aproximadamente 120 0C; de

aproximadamente 89 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 91 0C a aproximadamente 120 0C; de

aproximadamente 93 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 95 0C a aproximadamente 120 0C; de
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aproximadamente 97 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 99 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 101 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 103 0C a aproximadamente 120 0C; de

aproximadamente 105 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 107 0C a aproximadamente 120 0C; de

aproximadamente 109 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 111 0C a aproximadamente 120 0C; de

aproximadamente 113 0C a aproximadamente 120 0C; de aproximadamente 115 0C a aproximadamente 120 0C; de
aproximadamente 117 0C a aproximadamente 120 0C; acerca de cualquiera de 85 0C u 86 0C u 88 0C o 90 0C o 92 0C o 94 0C o 96 0C o 98 0C o 100 0C o 102 0C o 104 0C o 106 o 108 0C o 110 0C o 112 0C o 114 0C o 116 0C o 118 0C o 120 0C; al menos aproximadamente cualquiera de 85 0C u 86 0C u 88 0C o 90 0C o 92 °C o 94 0C o 96 0C o 98 0C o 100 0C o 102 0C o 104 0C o 106 0C o 108 0C o 110 0C o 112 0C o 114 0C o 116 0C o 118 0C y no mas de aproximadamente 120 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En cualquiera de los aspectos, la temperatura del medio se enfria hasta aproximadamente 15 0C a aproximadamente 40 0C para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
La temperatura del tratamiento termico se mantiene durante el tiempo de mantenimiento de la temperatura para inactivar los virus presentes en el medio. El tiempo de mantenimiento de la temperatura es una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus. En cualquiera de los aspectos, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 1 segundo. En un aspecto adicional, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 2 segundos, 3 segundos o 4 segundos. En otro aspecto adicional mas, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 segundos. En otro aspecto adicional mas, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 o 60 segundos. En algunos aspectos, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de 10 segundos. En otros aspectos, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de 2 segundos. En otra variacion, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 2 a aproximadamente 58 segundos; de aproximadamente 6 a aproximadamente 54 segundos; de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 segundos; de aproximadamente 14 a aproximadamente 46 segundos; de aproximadamente 18 a aproximadamente
42 segundos; de aproximadamente 22 a aproximadamente 38 segundos; de aproximadamente 26 a aproximadamente
34 segundos; de aproximadamente 30 a aproximadamente 34 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 56 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 52 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 48 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 44 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 36 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 32segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 28 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 22 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 segundos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 segundos; de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 8 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 12 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 16 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 20 a aproximadamente
60 segundos; de aproximadamente 24 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 28 a aproximadamente
60 segundos; de aproximadamente 32 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 36 a aproximadamente
60 segundos; de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 44 a aproximadamente
60 segundos; de aproximadamente 48 a aproximadamente 60 segundos; de aproximadamente 52 a aproximadamente
60 segundos; de aproximadamente 56 a aproximadamente 60 segundos; aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 4 o
6 u 8 o 10 o 12 o 14 o 16 o 18 o 20 o 22 o 24 o 26 o 28 o 30 o 32 o 34 o 36 o 38 o 40 o 42 o 44 o 46 o 48 o 50 o 52 o
54 o 56 o 58 o 60 segundos; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 4 o 6 u 8 o 10 o 12 o 14 o 16 o 18 o 20 o 22 o 24 o 26 o 28 o 30 o 32 o 34 o 36 o 38 o 40 o 42 o 44 o 46 o 48 o 50 o 52 o 54 o 56 o 58 y no mas de aproximadamente 60 segundos. En otros aspectos, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 1 minuto. En un aspecto adicional, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 2,5 minutos. En aun otro aspecto adicional, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5 u 11 minutos. En otra variacion,

una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de aproximadamente 1 a

aproximadamente 11 minutos; de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 minutos; de aproximadamente 4 a

aproximadamente 8 minutos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos; de aproximadamente 1 a
aproximadamente 8 minutos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 minutos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 minutos; de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 minutos; de aproximadamente 2 a aproximadamente 11 minutos; de aproximadamente 4 a aproximadamente 11 minutos; de aproximadamente 6 a aproximadamente 11 minutos; de aproximadamente 8 a aproximadamente 11 minutos; aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 o 9 o 10 o 11 minutos; al menos aproximadamente cualquiera de 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o
7 u 8 o 9 o 10 y no mas de aproximadamente 11 minutos.
b) Agentes infecciosos
La invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de virus y/o bacterias en un medio de cultivo celular que comprenden someter el medio a un tratamiento termico. Los virus pueden ser cualquier virus detallado en el presente
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documento (por ejempio, parvovirus) y el medio de cultivo celular puede ser cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. Los virus inactivados en el medio de cultivo celular durante el tratamiento termico pueden ser cualquier virus que sea industrialmente relevante para la fabricacion de productos (por ejemplo, polipeptidos, celulas, tejidos). Los virus industrialmente relevantes son conocidos por los expertos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de virus industrialmente relevantes son: Parvoviridae, Paramyoxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae, Togaviridae, Caliciviridae y Picornaviridae. La nomenclatura formal para la clase de virus (por ejemplo, Parvoviridae), se utiliza de manera intercambiable en toda la memoria descriptiva con una nomenclatura menos formal (por ejemplo, parvovirus). Se entiende que cualquiera de las nomenclaturas se refiere a la misma clase de virus (es decir, Parvoviridae abarca la misma clase de virus que parvovirus). En una variacion, el virus es un virus sin envoltura. En algunos aspectos, un virus sin envoltura incluye, pero no se limita a, un virus de ADN de cadena sencilla, un virus de ADN de doble cadena, un virus de ARN de doble cadena y un virus de ARN de cadena sencilla. En aspectos adicionales, un virus sin envoltura incluye, pero no se limita a, un parvovirus, un reovirus o un picornavirus. En una variacion, el virus es un virus con envoltura. En algunos aspectos, un virus con envoltura incluye, pero no se limita a, un virus de ADN de cadena sencilla, un virus de ADN de doble cadena, un virus de ARN de doble cadena y un virus de ARN de cadena sencilla. En aspectos adicionales, un virus con envoltura incluye, pero no se limita a, un retrovirus, un virus de herpes o un hepadnavirus. En cualquier variacion de la invencion, un virus se selecciona del grupo que consiste en un adenovirus, virus de la peste porcina africana, arenavirus, arterivirus, astrovirus, baculovirus, badnavirus, barnavirus, bimavirus, bromovirus, bunyavirus, calicivirus, capillovirus, carlavirus, caulimovirus, circovirus, closterovirus, comovirus, coronavirus, cotricovirus, cystovirus, deltavirus, dianthovirus, enamovirus, filovirus, flavivirus, furovirus, fusellovirus, geminivirus, hepadnavirus, herpesvirus, hordeivirus, hypovirus, ideaovirus, inovirus, iridovirus, levivirus, lipothrixvirus, luteovirus, machlomovirus, marafivovirus, microvirus, myovirus, necrovirus, nodavirus, orthomyxovirus, papovavirus, paramyxovirus, partitivirus, parvovirus, phycodnavirus, picornavirus, plamavirus, podovirus, polydnavirus, potexvirus, potyvirus, poxvirus, reovirus, retrovirus, rhabdovirus, rhizidiovirus, sequevirus, siphovirus, sobemovirus, tectivirus, tenuivirus, tetravirus, tobamavirus, tobravirus, togavirus, tombusvirus, totivirus, trichovirus, tymovirus y umbravirus. En algunos aspectos, los virus incluyen, pero no se limitan a, virus de la enfermedad hemorragica epizootica (EHDV), virus diminuto del raton (MMV), parvovirus-1 de raton (MPV), virus del Valle de Cache, Vesivirus 2117, circovirus porcino (PCV 1), circovirus porcino 2 (PCV 2), parvovirus canino (CPV), parvovirus bovino (BPV) o virus de la lengua azul (BTV). En un aspecto particular, el virus es un parvovirus tal como el virus murino diminuto. En una variacion, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de un agente subvirico en un medio de cultivo celular que comprenden someter el medio a un tratamiento termico. En algunos aspectos, el agente subvirico es un viroide o un satelite. En otra variacion, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de un agente similar a virus en un medio de cultivo celular que comprenden someter el medio a un tratamiento termico.
En otra variacion, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de un agente infeccioso en un medio de cultivo celular que comprenden someter el medio a un tratamiento termico. En algunos aspectos, el agente infeccioso es una bacteria. En un aspecto adicional, la bacteria es un micoplasma. En otro aspecto, el agente infeccioso es una bacteria que es suficientemente pequena para pasar a traves de filtros, incluyendo cualquiera de los filtros descritos en el presente documento. En otro aspecto, el agente infeccioso es un hongo. En otro aspecto adicional mas, el agente infeccioso es un parasito. En otro aspecto mas, el agente infeccioso es un componente de un agente infeccioso. Un experto en la tecnica entiende que un componente de un agente infeccioso puede ser cualquier componente que se obtiene a partir de un agente infeccioso y que no es deseado en los medios de cultivo celular.
En otra variacion adicional mas, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de un agente adventicio en un medio de cultivo celular que comprenden someter los medios a un tratamiento termico. Un experto en la tecnica entiende que cualquier agente adventicio que es susceptible a la inactivacion por tratamiento termico se puede inactivar mediante cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento utilizando cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. En cualquiera de las variaciones, al menos uno o mas tipos de agentes infecciosos y/o adventicios se inactivan en el medio de cultivo celular durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, uno o mas tipos de agentes infecciosos y/o adventicios son un virus, agente subvirico, agente similar a virus, bacteria, hongo, parasito o un componente de un agente infeccioso y/o adventicio. En cualquiera de las variaciones, el tratamiento termico es un tratamiento HTST. Un experto en la tecnica entiende que cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento para la inactivacion de un agente infeccioso y/o adventicio mediante tratamiento termico comprende someter cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1, para cualquier tratamiento HTST detallado en el presente documento.
La inactivacion de virus se mide mediante ensayos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la inactivacion virica se determina mediante medicion o evaluacion de un valor de reduccion logaritmica (LRV) dado del virus activo. En un aspecto, un valor de reduccion logaritmica mayor o igual a 3 para la carga virica de un medio de cultivo celular utilizando el tratamiento HTST a temperaturas mayores de 95 0C durante 2 segundos se determina como la inactivacion de los virus presentes en el medio. En otro aspecto, un valor de reduccion logaritmica de aproximadamente 3 en la carga virica de un medio de cultivo celular utilizando el tratamiento HTST a una temperatura de 100 0C durante 60 segundos se determina como la inactivacion de los virus presentes en el medio. En cualquiera de los aspectos, la carga virica es una carga MVM.
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c) Sistemas de tratamiento termico
Los procedimientos de tratamiento termico de medios de cultivo celular para la inactivacion de agentes infecciosos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como, por ejemplo, las metodologias descritas en Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 y Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729 se pueden utilizar para el tratamiento termico de cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. Por ejemplo, el tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) se utiliza en los procesos de fabricacion para inactivar virus. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En aun una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para inactivar virus en medios de cultivo celular que comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. El tratamiento HTST puede comprender un ciclo de HTST en el que el medio de cultivo celular se calienta desde una temperatura ambiente o 37 0C a aproximadamente 102 0C, en el que el medio de cultivo celular se mantiene a 102 0C durante un tiempo de mantenimiento de temperatura de aproximadamente 10 segundos, y en el que el medio de cultivo celular se enfria entonces a aproximadamente la temperatura ambiente o aproximadamente 37 0C. En algunos aspectos, la temperatura ambiente es de aproximadamente 15 0C a aproximadamente 30 0C. En otros aspectos, la temperatura ambiente es de aproximadamente 18 0C a aproximadamente 25 0C. El tratamiento HTST puede ser un proceso de flujo continuo que utiliza dos intercambiadores de calor, uno para calentar el fluido y uno para enfriar el fluido, con tubos intermedios para proporcionar un tiempo de mantenimiento de la temperatura deseado para un caudal dado. En un aspecto, la inactivacion de virus en el medio de cultivo celular comprende someter el medio de cultivo celular a un ciclo de tratamiento HTST. En otro aspecto, la inactivacion de virus en el medio de cultivo celular comprende someter el medio de cultivo celular a al menos dos o mas ciclos de tratamiento HTST. En un aspecto, el caudal es 100 lpm. En otro aspecto, el caudal es 125 lpm. En aun otro aspecto, el caudal puede ser cualquier caudal que sea adecuado para proporcionar la temperatura y el tiempo de mantenimiento de la temperatura adecuados para la inactivacion de los virus y/o agentes adventicios. En cualquier aspecto, el medio de cultivo celular se calienta de aproximadamente 37 0C a aproximadamente 102 0C, en el que el medio de cultivo celular se mantiene a 102 0C durante una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus, y en el que el medio de cultivo celular se enfria entonces hasta aproximadamente 37 0C. En un aspecto adicional, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus es de aproximadamente 10 segundos. En cualquier aspecto, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus es cualquier tiempo de mantenimiento de temperatura detallado en el presente documento. En algunos aspectos, la temperatura para inactivar los virus durante el tiempo de mantenimiento de la temperatura es cualquier temperatura detallada en el presente documento. En un aspecto, la temperatura para inactivar los virus es de aproximadamente 85 0C a aproximadamente 120 0C. En una variacion, el medio de cultivo celular se calienta de aproximadamente 15 0C a aproximadamente 102 0C, en el que el medio de cultivo celular se mantiene a 102 0C durante un tiempo de mantenimiento de temperatura de aproximadamente 10 segundos, y en el que el medio de cultivo celular se enfria entonces hasta aproximadamente 37 0C. En otra variacion, el medio de cultivo celular se calienta de aproximadamente 37 0C a aproximadamente 102 0C, en el que el medio de cultivo celular se mantiene a 102 0C durante un tiempo de mantenimiento de temperatura de aproximadamente 10 segundos, y en el que el medio de cultivo celular se enfria entonces hasta aproximadamente 37 0C.
Para el tratamiento HTST, el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus procesa un volumen de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 000 litros (l). Un experto en la tecnica entiende que el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus puede procesar un volumen de medio de cultivo celular inferior a aproximadamente 0,5 l o superior a aproximadamente 20 000 l en cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento utilizando cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. En un aspecto, un volumen de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 l a aproximadamente 20 000 l se procesa en una ejecucion HTST. En otros aspectos, un volumen de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 l a aproximadamente 20 000 l se procesa en al menos dos o mas ejecuciones HTST. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "ejecucion HTST" se puede referir al proceso en el que una cantidad especificada del medio se somete a un tratamiento HTST en el equipo (por ejemplo, skid HTST) que se utiliza para el tratamiento HTST durante al menos un ciclo (por ejemplo, calentamiento, mantenimiento, enfriamiento) de tratamiento HTST. Un experto en la tecnica entiende que cualquier equipo, tal como un skid HTST, que se utiliza para el tratamiento HTST se puede utilizar para el tratamiento termico de cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. En un aspecto, una ejecucion HTST puede comprender el procesamiento continuo de al menos uno o mas volumenes de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 l a aproximadamente 20 000 l. En otro aspecto, una ejecucion de HTST puede comprender el procesamiento por lotes de al menos uno o mas volumenes de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 l a aproximadamente 20 000 l. En cualquier aspecto, al menos uno o mas volumenes de medio de cultivo celular pueden ser el mismo tipo de medio de cultivo celular (por ejemplo, Medio 1). En cualquier aspecto, al menos uno o mas volumenes de medio de cultivo
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celular pueden ser de al menos uno o mas tipos de medios de cultivo celular (por ejemplo, Medio 1 y Medio 2). En cualquier aspecto de los procedimientos detallados en el presente documento, un volumen de medio de cultivo celular de al menos aproximadamente 0,5 l se procesa a traves del equipo para el tratamiento HTST para inactivar virus. En un aspecto adicional, un volumen de medio de cultivo celular de al menos aproximadamente 2 l se procesa a traves del equipo para el tratamiento HTST para inactivar virus. En otro aspecto adicional mas, una cantidad de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio es de al menos aproximadamente 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10 000 o 15 000 litros. En algunos aspectos, un volumen de medio de cultivo celular de 2 l se procesa a traves del equipo para el tratamiento HTST para inactivar virus. En otros aspectos, un volumen de medio de cultivo celular de 12 000 l se procesa a traves del equipo para el tratamiento HTST para inactivar virus. En otra variacion, un volumen de medio de cultivo celular de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 2 a
aproximadamente
18 000 ; de aproximadamente 10 a aproximadamente 16 000; de aproximadamente 20 a
aproximadamente
14 000 ; de aproximadamente 40 a aproximadamente 12 000; de aproximadamente 80 a
aproximadamente
10 000 de aproximadamente 100 a aproximadamente 8000; de aproximadamente 200 a
aproximadamente
6000; de aproximadamente 400 a aproximadamente 4000; de aproximadamente 800 a
aproximadamente
2000; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 18 000; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
16 000 de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 14 000; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
12 000 de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 000; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
8000; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 6000; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
4000; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2000; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
800; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 600; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
400; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 200; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente
100; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 20; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2; de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 100 a aproximadamente 20 000; de

aproximadamente 500 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20 000; de

aproximadamente 1500 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 2000 a aproximadamente 20 000; de

aproximadamente 5000 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20 000; de
aproximadamente 15 000 a aproximadamente 20 000; de aproximadamente 1750 a aproximadamente 20 000 litros; de aproximadamente cualquiera de 0,5 o 2 o 10 o 100 o 1000 o 10 000 o 20 000 litros; de al menos aproximadamente cualquiera de 0,5 o 2 o 10 o 100 o 1000 o 10 000 y no mas de aproximadamente 20 000 litros se procesa a traves del equipo para el tratamiento HTST para inactivar virus.
Procedimientos de inactivacion de virus durante el procesamiento del cultivo celular son conocidos por los expertos en la tecnica, tal como, por ejemplo, las metodologias descritas en Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729 y se pueden usar en combinacion con el tratamiento HTST de cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1. Por ejemplo, el tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) se puede utilizar en combinacion con al menos uno o mas tratamientos de barrera para los virus en los procesos de fabricacion para eliminar los virus del medio de cultivo celular. En algunos aspectos, uno o mas tratamientos de barrera para los virus incluyen, pero no se limitan a, esterilizacion por calor, exposicion a luz UV, irradiacion gamma yfiltracion. En algunos aspectos, un tratamiento de barrera para los virus es filtracion. La presente invencion proporciona procedimientos para la eliminacion y/o inactivacion de un virus en medios de cultivo celular sometidos a un tratamiento HTST, en el que el virus se elimina del medio de cultivo celular mediante filtracion en una etapa posterior a que el medio de cultivo celular se someta al tratamiento HTST. En algunos aspectos, la filtracion es ultrafiltracion. Antes de la ultrafiltracion, uno o mas componentes de medios tales como los componentes enumerados en la Tabla 1 se anaden al medio de cultivo celular sometido a un tratamiento HTST. En algunos aspectos, antes de la ultrafiltracion, uno o mas componentes de medios, tales como metales traza (por ejemplo, hierro o cobre) se anaden al medio de cultivo celular sometido a un tratamiento HTST.
Las membranas de ultrafiltracion se pueden formar a partir de celulosa regenerada, polietersulfona, poliarilsulfonas,
polisulfona, poliimida, poliamida, difluoruro de polivinilideno (PVDF) o similares. Membranas de ultrafiltracion
representativas incluyen, pero no se limitan a, membranas Viresolve®, membranas Viresolve® Pro, membranas 1 ® J ' ® ® ®
Viresolve 180, membranas Viresolve 70, membranas Viresolve PFN, membranas Viresolve NFR, membranas
Retropore ™, membranas Virosart CPV, membranas Planova 75, membranas Planova 35, membranas Planova 20,
membranas Planova 15N, membranas VAG 300, membranas Ultipor DVD, membranas Ultipor DV50, membranas
Ultipor DV20 y filtros DVD Zeta Plus VR™. En algunos aspectos, la membrana de ultrafiltracion es capaz de eliminar
particulas de parvovirus. En algunos aspectos, la membrana de ultrafiltracion es una membrana de retencion de
parvovirus.
El tamano de poro de las membranas de ultrafiltracion debe ser lo suficientemente pequeno para retener las particulas de virus no deseados al tiempo que permite el paso de una o mas proteinas de la solucion acuosa a traves de la membrana. En algunos modos de realizacion de la invencion, el tamano de poro de la membrana de ultrafiltracion es inferior a 10 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm o 200 nm. En algunos modos de realizacion, el tamano de poro de la membrana de ultrafiltracion es de 20 nm o menos.
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Las membranas de ultrafiltracion se pueden caracterizar por un corte molecular que representa el peso molecular promedio de la protema mas pequena que retiene la membrana de ultrafiltracion. Por ejemplo, una membrana de ultrafiltracion con un corte molecular de 1000 kD retendra la mayorfa de las protemas globulares con un peso molecular superior a 1000 kD en una tasa del 80 al 90 %, mientras que la mayorfa de las protemas globulares con un peso molecular inferior a 1000 kD pasaran a traves de la membrana de ultrafiltracion. En algunos aspectos de la invencion, el corte molecular de la membrana de ultrafiltracion es de entre 200 kD y 1000 kD. En algunos aspectos de las invenciones, la membrana de ultrafiltracion tiene un corte molecular de 200 kD, 300 kD, 400 kD, 500 kD, 600 kD, 700 kD, 900 kD o 1.000 kD.
La filtracion se puede efectuar con una o mas membranas de ultrafiltracion, ya sea por filtracion de flujo perpendicular (normal) (NFF) o por filtracion de flujo tangencial (TFF). En NFF, el flujo de alimentacion se hace pasar a traves de una membrana y las sustancias de gran peso molecular quedan atrapadas en el filtro, mientras que el filtrado es liberado en el otro extremo. En TFF, la mayorfa del flujo de alimentacion se desplaza tangencialmente a traves de la superficie del filtro, en lugar pasar por el filtro. De este modo, la torta de filtrado se elimina sustancialmente durante el proceso de filtracion, lo que aumenta la cantidad de tiempo que una unidad de filtrado puede estar operativa. Las membranas de ultrafiltracion para cualquiera de los modos de filtracion se pueden suministrar en forma de un cartucho (NFF), tal como los filtros vfricos VIRESOLVE® NFP, o como casetes (para TFF), tal como las casetes PELLICON®. En un modo de realizacion preferente, la filtracion es filtracion de flujo normal.
En los procedimientos de la invencion se puede utilizar mas de una membrana de ultrafiltracion. En algunos modos de realizacion, mas de una membrana de ultrafiltracion se pone en contacto con la solucion acuosa en paralelo. El tratamiento HTST en combinacion con un tratamiento adicional de barrera para los virus se puede utilizar para el tratamiento de cualquier medio de cultivo celular divulgado en el presente documento, tal como un medio de cultivo celular con los componentes que se detallan en la Tabla 1, para la produccion a escala industrial de protemas y polipeptidos terapeuticos.
Los medios de cultivo celular utilizados durante el tratamiento HTST para la inactivacion de agentes infecciosos pueden ser medios compatibles con HTST o medios incompatibles con HTST. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "medios compatibles con HTST" se puede referir a medios de cultivo celular que presentan reducida o nula precipitacion durante el tratamiento HTST. Tal como se usa en el presente documento, el termino "medios incompatibles con HTST" se puede referir a medios de cultivo celular que presentan una precipitacion medible o detectable durante el tratamiento HTST. En una variacion, la invencion proporciona procedimientos para el cribado de medios de cultivo celular compatible con HTST para su uso en la inactivacion de virus durante el tratamiento HTST, en el que el medio compatible con HTST presenta una reducida precipitacion en comparacion con la precipitacion del medio incompatible con HTST. En un aspecto, el cultivo celular compatible con HTST no presenta ninguna precipitacion en comparacion con la precipitacion del medio incompatible con HTST durante el tratamiento HTST. En cualquier variacion, el medio compatible con HTST tiene niveles mas altos de un metal traza en comparacion con el medio incompatible con HTST despues del tratamiento HTST. En un aspecto, un metal traza es al menos uno o mas metales traza seleccionados del grupo que consiste en hierro o cobre. En cualquier variacion, el medio compatible con HTST tiene niveles mas bajos de un metal traza en comparacion con otro medio compatible con HTST. En un aspecto, un metal traza es al menos uno o mas metales traza seleccionados del grupo que consiste en hierro o cobre. La invencion proporciona procedimientos para convertir medios incompatibles con HTST en medios compatibles con HTST. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para convertir un medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST en el que los componentes del medio celular se ajustan, tal como se detalla en la Tabla 1. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para convertir un medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST en el que los componentes del medio celular se ajustan utilizando una superficie de respuesta, como se detalla en el Ejemplo 2. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para convertir un medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST en el que el pH del medio se ajusta a aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para convertir un medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST en el que el pH del medio se ajusta a aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2. En algunos aspectos, el pH del medio incompatible con HTST se ajusta a aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 para convertir el medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST. En algunos aspectos, el pH del medio incompatible con HTST se ajusta a aproximadamente pH 6,0 para convertir el medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST. En algunos aspectos, el pH del medio incompatible con HTST se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio incompatible con HTST se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio incompatible con HTST se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el pH del medio incompatible con HTST es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para convertir un medio incompatible con HTST en un medio compatible con HTST en el que la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se ajusta a menos de aproximadamente 10 mM. En un aspecto adicional, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio incompatible con HTST se ajusta a menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM. En algunos aspectos, la
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cantidad total de fosfato y de calcio en el medio incompatible con HTST se ajusta a menos de aproximadamente 10 mM antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio incompatible con HTST se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
d) Reduccion de la formacion de precipitado
En una variacion, la invencion proporciona procedimientos para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular durante el tratamiento termico para la inactivacion de virus. Los procedimientos comprenden el ajuste de uno o mas niveles de calcio, fosfato y pH en el medio de cultivo celular sometido a tratamiento termico. En un aspecto, el tratamiento termico es un tratamiento HTST. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST para la inactivacion de virus en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST para la inactivacion de virus en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En otros aspectos, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En algunos aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En una variacion, el pH del medio es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST para la inactivacion de virus que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion mas, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular durante el tratamiento HTST para la inactivacion de virus en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En algunos aspectos, el pH del medio se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces a aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se eleva hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En algunos aspectos de la invencion, cualquier medio detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes especificos que se detallan en la Tabla 1, reduce la precipitacion durante el tratamiento HTST para la inactivacion de agentes infecciosos. En un aspecto, los componentes especificos del medio reducen la precipitacion en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 %, en comparacion con la cantidad de precipitacion presente en el mismo medio que carece de los componentes de medio especificos durante el tratamiento HTST. La determinacion cuantitativa de la cantidad de precipitacion en el medio se puede realizar usando tecnicas bien conocidas en la tecnica. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular sometidos a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que no tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En un aspecto, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que no tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que no tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular
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que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que tiene una cantidad total de fosfato y de calcio superior a aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En un aspecto, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio es inferior a aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 mM durante el tratamiento HTST y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que no tiene una concentracion total de fosfato y de calcio inferior a aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 mM durante el tratamiento HTST. En una variacion, la invencion proporciona un procedimiento para reducir la precipitacion en medios de cultivo celular sometidos a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y que comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST y en el que el medio presenta una precipitacion reducida en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, en comparacion con la precipitacion presente en un medio que no tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y que tiene una cantidad total de fosfato y de calcio superior a aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST.
El agente infeccioso de cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento puede ser cualquier virus detallado en el presente documento (por ejemplo, un parvovirus) y el medio de los procedimientos puede ser cualquier medio detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1.
B. Metodos para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento termico
La divulgacion proporciona procedimientos para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para la inactivacion de virus en medios de cultivo celular. Los inventores han descubierto que el ajuste de los niveles de componentes o parametros especificos del medio de cultivo celular sometido a tratamiento HTST reduce el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus. Cualquier medio de cultivo celular que se detalla en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1, se puede utilizar en cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus. En cualquiera de los procedimientos detallados en el presente documento, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST.
En una variacion, la divulgacion proporciona un procedimiento para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST, en donde el procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a un tratamiento HTST en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En un aspecto, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, el medio tiene un pH de aproximadamente pH 6,0 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto mas, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST. En cualquier aspecto, el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En un aspecto adicional, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En un aspecto adicional mas, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 95, 97, 99, 101 o 103 0C durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio. En una variacion, la divulgacion proporciona un procedimiento para reducir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST, en donde el procedimiento comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio de cultivo celular utilizado en el equipo a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. En un aspecto, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST. En un aspecto adicional, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST.
En cualquier aspecto, el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST se reduce cuando se utiliza un medio compatible con HTST en comparacion con un medio incompatible con HTST. En un aspecto, un medio compatible con HTST comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST. En otro aspecto, el medio compatible con HTST comprende una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM. En aun otro aspecto, el medio compatible con HTST comprende un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST. Un medio compatible con HTST es cualquier medio de cultivo celular detallado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1.
Los procedimientos de medicion y monitorizacion del ensuciamiento de distintos equipos utilizados en los procesos de fabricacion son conocidos por los expertos en la tecnica, tal como, por ejemplo, las metodologias descritas en Awad, M. 2011. Heat Transfer: Theoretical Analysis, Experimental Investigations and Industrial Systems. Capitulo 20, paginas 505 a 542 y se pueden utilizar para monitorizar y medir el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST de cualquier medio de cultivo celular divulgado en el presente documento, tal como un medio con los componentes que se detallan en la Tabla 1 y los medios que se detallan en los Ejemplos. Por ejemplo, el ensuciamiento del equipo
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se puede medir midiendo cambios en la presion de vapor del intercambiador de calor requerida para alcanzar la temperatura objetivo del medio o midiendo los cambios (reduccion) en la temperatura alcanzada. En cualquier aspecto, el ensuciamiento comprende precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST. En un aspecto, uno o mas equipos susceptibles al ensuciamiento debido al uso de medios incompatibles con HTST incluyen, pero no se limitan a, un skid HTST, un intercambiador de calor, un tubo, un dispositivo de filtracion y una membrana de filtracion.
C. Metodos para la produccion de polipeptidos con medios de cultivo celular sometidos a tratamiento termico
a) Celulas
Los procedimientos y composiciones proporcionados pueden emplear cualquier celula que sea adecuada para el crecimiento celular y/o la produccion de un polipeptido (por ejemplo, un anticuerpo) en un medio descrito en el presente documento, incluyendo celulas de animal, levadura o insecto. En un aspecto, una celula de los procedimientos y composiciones es cualquier celula o tipo de celula de mamifero adecuada para el cultivo de celulas y para la expresion de polipeptidos. Los procedimientos proporcionados en el presente documento (por ejemplo, los procedimientos de inactivacion de virus en medios de cultivo celular) y composiciones pueden, por tanto, emplear cualquier tipo de celula adecuado, incluyendo una celula animal. En un aspecto, los procedimientos y composiciones emplean una celula de mamifero. Los procedimientos y composiciones tambien pueden emplear celulas de hibridoma. En una variacion, la celula de mamifero es una celula de mamifero distinta del hibridoma que ha sido transformada con un acido nucleico aislado exogeno que codifica un polipeptido deseado, tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo (incluyendo un fragmento de union a ligando) y anticuerpos quimericos. En una variacion, los procedimientos y composiciones emplean celulas de mamiferos seleccionadas del grupo que consiste en retinoblastos humanos (PER.C6 (Crucell, Leiden, Paises Bajos)); linea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); celulas de rinon de cria de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino / DHFR (cHo, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); celulas de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de higado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de higado humano (Hep G2, HB 8065); celulas de tumor de mama murino (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2). En una variacion particular, los procedimientos y composiciones emplean celulas CHO. En una variacion particular, se emplea el cultivo de lineas de celulas CHO y la expresion de polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) a partir de lineas de celulas CHO. Los polipeptidos (por ejemplo, anticuerpos) se pueden secretar al medio divulgado en el presente documento a partir del cual los polipeptidos se pueden aislar y/o purificar o el polipeptido se puede liberar al medio divulgado en el presente documento mediante lisis de una celula que comprende un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido .
Procedimientos, vectores y celulas huesped adecuados para la adaptacion a la sintesis del polipeptido de interes en cultivos de celulas de vertebrados recombinantes se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060; y EP 117.058. Un plasmido particularmente util para la expresion del polipeptido en cultivo de celulas mamiferas es pRK5 (pub. EP n.° 307.247) o pSVI6B (pub. PCT n.° WO 91/08291 publicada el 13 de junio de 1991).
Las celulas huesped se transforman con vectores de expresion o clonacion y se cultivan en medios nutrientes modificados segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Para las celulas de mamifero, el procedimiento de precipitacion de fosfato de calcio de Graham y van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978) o el procedimiento de Lipofectamine™. (Gibco BRL) de Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193) son preferentes. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas huesped de celulas de mamiferos se conocen en la tecnica y se han descrito, por ejemplo, por Axel en la patente de EE. Uu. n.° 4 399 216 publicada el 16 de agosto de 1983. Para diversas tecnicas de transformacion de celulas de mamiferos, vease, por ejemplo, Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Los procedimientos y composiciones tambien abarcan el uso de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales en cultivo celular. Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando celulas inmunes (tipicamente, celulas esplenicas o linfocitos de tejido de ganglios linfaticos) de animales inmunizados e inmortalizando las celulas de manera convencional, por ejemplo, mediante fusion con celulas de mieloma o mediante transformacion con el virus de Epstein-Barr (EB) y seleccion para obtener clones que expresan el anticuerpo deseado. La tecnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976), y tambien descrita por Hammerling et al, In.: Monoclonal Antibodies and T-Cell hibridomas, Elsevier, NY, pp. 563-681 (1981) se ha aplicado ampliamente para producir lineas celulares hibridas que secretan altos niveles de anticuerpos monoclonales contra numerosos antigenos especificos.
b) Polipeptidos
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Los polipeptidos producidos por las composiciones (por ejemplo, celulas) y los procedimientos que se detallan en el presente documento y que estan presentes en las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser homologos a la celula huesped, o preferentemente, pueden ser exogenos, lo que significa que son heterologos, es decir, extranos, para la celula huesped que se esta utilizando, tal como una proteina humana producida por una celula de ovario de hamster chino, o un polipeptido de levadura producido por una celula de mamifero. En una variacion, el polipeptido es un polipeptido de mamifero (tal como un anticuerpo) secretado directamente al medio por la celula huesped. En otra variacion, el polipeptido se libera al medio mediante lisis de una celula que comprende un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido.
En una variacion, el polipeptido es una secuencia de aminoacidos con una longitud de cadena que es suficiente para producir los niveles superiores de estructura terciaria y/o cuaternaria. En un aspecto, el polipeptido tendra un peso molecular de al menos aproximadamente 5 a 20 kD, de forma alternativa de al menos aproximadamente 15 a 20 kD, preferentemente de al menos aproximadamente 20 kD.
Cualquier polipeptido que se pueda expresar en una celula huesped se puede producir de acuerdo con la presente divulgacion y puede estar presente en las composiciones proporcionadas. El polipeptido se puede expresar a partir de un gen que es endogeno a la celula huesped, o de un gen que se introduce en la celula huesped mediante ingenieria genetica. El polipeptido puede ser uno existe en la naturaleza o puede tener alternativamente una secuencia que ha sido disenada o seleccionada por la mano del hombre. Un polipeptido de diseno se puede ensamblar a partir de otros segmentos polipeptidicos que se producen de forma individual en la naturaleza, o puede incluir uno o mas segmentos que no son de origen natural.
Los polipeptidos que deseablemente se pueden expresar de acuerdo con la presente invencion se seleccionaran a menudo sobre la base de una actividad biologica o quimica interesante. Por ejemplo, la presente invencion se puede emplear para expresar cualquier enzima, receptor, anticuerpo, hormona, factor regulador, antigeno, agente de union, etc. farmaceuticamente o comercialmente relevantes.
Varios polipeptidos se pueden producir de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento, y presentes en las composiciones proporcionadas en el presente documento. Ejemplos de polipeptidos bacterianos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y beta-lactamasa. Ejemplos de polipeptidos de mamiferos incluyen moleculas tales como renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteinas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular y el factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como la Proteina C; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminogeno, tal como activador de plasminogeno de tipo uroquinasa u orina o tisular (t-PA) humano; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (quimiocina de regulacion por activacion expresada y secretada normalmente por linfocitos T); proteina inflamatoria de macrofagos humana (MIP-1 -alfa); una albumina serica tal como albumina serica humana; sustancia inhibidora de Muller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una proteina microbiana, tal como la beta-lactamasa; ADNsa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteina A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso como NGF- beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF- beta, incluyendo TGF-beta 1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 o TGF-beta5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteinas de union del factor de crecimiento similar a la insulina; proteinas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteina morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteinas de membrana de superficie; factor acelerador de la descomposicion; antigeno virico tal como, por ejemplo, una porcion de la cubierta del virus del SIDA; proteinas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteinas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente.
Los anticuerpos son ejemplos de polipeptidos de mamiferos producidos de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento y que pueden estar presentes en las composiciones proporcionadas. Los anticuerpos son una clase preferente de polipeptidos que exhiben especificidad de union a un antigeno especifico. Los anticuerpos nativos son, en general, glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera presenta asimismo puentes disulfuro intracatenarios separados a intervalos regulares. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un cierto numero de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio
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variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que ciertos restos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada.
Los anticuerpos son moleculas de inmunoglobulina de origen natural que tienen estructuras diferentes, todas basadas en el pliegue de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que se unen mediante puentes disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras comprende una region "constante" (C) y una region "variable" (V). Las regiones V determinan la especificidad de union al antigeno del anticuerpo, mientras que las regiones C proporcionan soporte estructural y funcion en interacciones no especificas de antigeno con efectores inmunologicos. La especificidad de union al antigeno de un anticuerpo o fragmento de union al antigeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo para unirse especificamente a un antigeno particular.
La especificidad de union al antigeno de un anticuerpo viene determinada por las caracteristicas estructurales de la region V. La variabilidad no se distribuye uniformemente en los 110 aminoacidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones marco (FR) de 15-30 aminoacidos separadas por regiones mas cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que tienen 9-12 aminoacidos de longitud cada una. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de lamina p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de lamina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad gracias a las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antigeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Cada una de las regiones V comprende tipicamente tres regiones determinantes de complementariedad ("CDR", cada una de las cuales contiene un "bucle hipervariable") y cuatro regiones marco. Por tanto, un sitio de union de anticuerpo, la unidad estructural minima requerida para unirse con una afinidad sustancial a un antigeno particular deseado, incluira tipicamente las tres CDR, y al menos tres, preferentemente cuatro, regiones marco intercaladas para sostener y presentar las CDR en la conformacion apropiada. Los anticuerpos de cuatro cadenas clasicos tienen sitios de union al antigeno que se definen mediante dominios VH y VL en colaboracion. Ciertos anticuerpos, tales como anticuerpos de camello y de tiburon, carecen de cadenas ligeras y se basan en los sitios de union formados solo por cadenas pesadas. Se pueden preparar inmunoglobulinas de dominio unico de diseno en las que los sitios de union estan formados por cadenas pesadas o cadenas ligeras solamente, en ausencia de colaboracion entre VH y VL.
El termino "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en cuanto a su secuencia en los diferentes anticuerpos y se utilizan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los dominios variables de cadena pesada. Las porciones mejor conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de lamina p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan a, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lamina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad gracias a las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antigeno de los anticuerpos (vease Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El termino "region hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union al antigeno. La region hipervariable puede comprender restos de aminoacidos de una "region determinante de complementariedad" o "CDR" (p. ej., aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio VL y aproximadamente los restos 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (p.ej., los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio VL y los restos 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio VH; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
Los restos "marco" o "FR" son los restos del dominio variable diferentes de los restos de la region hipervariable, como se define en el presente documento.
La digestion con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos identicos de union al antigeno, llamados "Fab", cada
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uno con un unico sitio de union al antigeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union al antigeno y que todavia es capaz de unirse al antigeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antigeno y de union al antigeno. Esta region consiste en un dimero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en estrecha asociacion no covalente. Es en esta configuracion cuando las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union al antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union al antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tiene capacidad para reconocer y unirse al antigeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de union completo.
El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos restos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion utilizada en el presente documento para el fragmento Fab' en el que el(los) resto(s) de cisteina de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas se pueden dividir, ademas, en subclases (isotipos), p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 5, £, A y p, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptidica. En algunos modos de realizacion, el polipeptido Fv comprende ademas un polipeptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la union al antigeno. Para una revision de scFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union al antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptidica (VH - VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de union al antigeno. Los diacuerpos se describen mas en detalle en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
A los efectos del presente documento, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros, asi como una region Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (p.ej., dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoacidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o mas funciones efectoras.
Los "anticuerpos nativos" son, en general, glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150 000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera presenta asimismo puentes disulfuro intracatenarios separados a intervalos regulares. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un cierto numero de dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que ciertos restos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.
Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en el presente documento) que no esta conjugado a una molecula heterologa, tal como un resto citotoxico o radiomarcador.
Un anticuerpo se dirige contra un antigeno de interes. Preferentemente, el antigeno es un polipeptido biologicamente
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importante y la administracion del anticuerpo a un individuo que padece una enfermedad o afeccion puede resultar en un beneficio terapeutico en ese mamifero. Sin embargo, tambien se pueden utilizar anticuerpos dirigidos contra antigenos no polipeptidicos (tales como antigenos de glicolipidos asociados a tumores; vease la patente de EE.UU. n.2 5.091.178).
Cuando el antigeno es un polipeptido, puede ser una molecula transmembrana (por ejemplo, receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Antigenos de ejemplo incluyen moleculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberacion de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteinas; alfa-1- antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulacion tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular (TF) y el factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como la Proteina C; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminogeno, tal como activador de plasminogeno de tipo uroquinasa u orina o tisular humano (t- PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyetico; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (quimiocina de regulacion por activacion expresada y secretada normalmente por linfocitos T); proteina inflamatoria de macrofagos humana (MIP-1 -alfa); una albumina serica tal como albumina serica humana; sustancia inhibidora de Muller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; una proteina microbiana, tal como la beta-lactamasa; ADNsa; IgE; un antigeno asociado a linfocito T citotoxico (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteina A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso como NGF-beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 o TGF-beta5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteinas de union del factor de crecimiento similar a la insulina; proteinas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteina morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon-alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G- CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteinas de membrana de superficie; factor acelerador de la descomposicion; antigeno virico tal como, por ejemplo, una porcion de la cubierta del virus del SIDA; proteinas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteinas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antigeno asociado a tumor como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipeptidos enumerados anteriormente.
Dianas moleculares preferentes para los anticuerpos que se detallan en el presente documento incluyen proteinas CD tales como CD3, cD4, CD8, cD18, CD19, CD20, CD34 y CD40; miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina alfa4/beta7, e integrina alfa5/beta3 incluyendo cualquier subunidad alfa o beta de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF; factor tisular (TF); interferon alfa (alfa-IFN); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antigenos de grupos sanguineos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteina C y similares.
Los anticuerpos (incluyendo fragmentos de los mismos, incluyendo a su vez fragmentos de union al antigeno de los mismos) que se pueden producir por los procedimientos del presente documento incluyen, sin limitaciones, anti-HER2, anticuerpo 2C4, anti-VEGF, anticuerpo C2B8, anti-CD11a, anticuerpo anti-factor tisular, IgG4b, anti-CD40, anti-CD20, anti-IgE, E25 y E26, anti-PCSK9 y anti-Beta7.
c) Crecimiento celular y produccion de polipeptidos
En general, las celulas se combinan (ponen en contacto) con cualquiera de los medios de cultivo celular descritos en el presente documento en una o mas condiciones que promueven el crecimiento celular, el mantenimiento y/o la produccion de polipeptidos. Los procedimientos de crecimiento celular y de produccion de un polipeptido emplean un recipiente de cultivo (biorreactor) para contener las celulas y el medio de cultivo celular. El recipiente de cultivo puede estar compuesto de cualquier material que sea adecuado para el cultivo de celulas, incluyendo vidrio, plastico o metal. Tipicamente, el recipiente de cultivo sera de al menos 1 litro y puede ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10 000 litros o mas. Las condiciones de cultivo que se pueden ajustar durante el proceso de cultivo incluyen, pero no se limitan a, pH y temperatura.
En general, un cultivo celular se mantiene en la fase de crecimiento inicial en condiciones que conducen a la supervivencia, el crecimiento y la viabilidad (mantenimiento) del cultivo celular. Las condiciones precisas variaran dependiendo del tipo de celula, del organismo del que procedan las celulas y de la naturaleza y el caracter del polipeptido expresado.
La temperatura del cultivo celular en la fase de crecimiento inicial se seleccionara basandose principalmente en el intervalo de temperaturas a las que el cultivo celular sigue siendo viable. Por ejemplo, durante la fase de crecimiento inicial, las celulas CHO crecen bien a 37 °C. En general, la mayoria de las celulas de mamiferos crecen bien en un
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intervalo de aproximadamente 25 0C a 42 0C. Preferentemente, las celulas de mamiferos crecen bien en el intervalo de aproximadamente 35 0C a 40 0C. Los expertos en la tecnica seran capaces de seleccionar la temperatura o temperaturas apropiadas a las que las celulas crecen, dependiendo de las necesidades de las celulas y los requisitos de produccion.
En un modo de realizacion de la presente invencion, la temperatura de la fase de crecimiento inicial se mantiene a una temperatura unica y constante. En otro modo de realizacion, la temperatura de la fase de crecimiento inicial se mantiene dentro de un intervalo de temperaturas. Por ejemplo, la temperatura se puede aumentar o disminuir de manera constante durante la fase de crecimiento inicial. Alternativamente, la temperatura se puede aumentar o disminuir en cantidades discretas a diversos tiempos durante la fase de crecimiento inicial. Un experto en la tecnica sera capaz de determinar si se debe utilizar una unica temperatura o multiples temperaturas, y si la temperatura se debe ajustar de manera constante o en variaciones discretas.
Las celulas se pueden cultivar durante la fase de crecimiento inicial durante una cantidad mayor o menor de tiempo. En una variacion, las celulas se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para lograr una densidad de celulas viables que es un porcentaje dado de la densidad maxima de celulas viables que las celulas alcanzarian finalmente si se dejan crecer sin interrupciones. Por ejemplo, las celulas se pueden cultivar durante un periodo de tiempo suficiente para lograr una densidad de celulas viables deseada de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad maxima de celulas viables.
En otro modo de realizacion, las celulas se dejan crecer durante un periodo de tiempo definido. Por ejemplo, dependiendo de la concentracion inicial del cultivo celular, la temperatura a la que se cultivan las celulas y de la tasa de crecimiento intrinseca de las celulas, las celulas se pueden cultivar durante 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas dias. En algunos casos, las celulas se pueden dejar crecer durante un mes o mas.
El cultivo celular se puede agitar durante la fase de cultivo inicial a fin de incrementar la oxigenacion y la dispersion de nutrientes a las celulas. De acuerdo con la presente invencion, un experto en la tecnica entendera que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor durante la fase de crecimiento inicial, incluyendo, pero no limitado a, pH, temperatura, oxigenacion, etc. Por ejemplo, el pH se puede controlar mediante el suministro de una cantidad apropiada de acido o base y la oxigenacion se puede controlar con burbujeadores que son bien conocidos en la tecnica.
Un paso inicial de cultivo es una fase de crecimiento, en la que las condiciones de cultivo discontinuo de celulas se modifican para mejorar el crecimiento de celulas recombinantes, para producir una serie de semillas. La fase de crecimiento se refiere en general al periodo de crecimiento exponencial en el que las celulas se dividen en general de forma rapida, por ejemplo, creciendo. Durante esta fase, las celulas se cultivan durante un periodo de tiempo, en general de 1 a 4 dias, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 dias, y en condiciones tales que el crecimiento celular es optimo. La determinacion del ciclo de crecimiento de la celula huesped se puede determinar para la celula huesped particular mediante procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica.
En la fase de crecimiento, el medio de cultivo basal y las celulas se pueden suministrar al recipiente de cultivo de forma discontinua. En un aspecto, el medio de cultivo contiene menos de aproximadamente 5 % o menos de 1 % o menos de 0,1 % de suero y otras proteinas de origen animal. Sin embargo, el suero y las proteinas de origen animal se pueden usar si asi se desea. En una variacion particular, el medio basal tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En un aspecto, el pH del medio basal se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST para inactivar virus antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion particular, el medio basal comprende limitar la cantidad total de fosfato y de calcio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En un aspecto, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se limita a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion, el medio basal tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En un aspecto, el pH del medio basal se reduce hasta aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y comprende una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus antes de la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En un aspecto adicional, el pH del medio se lleva entonces a aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se eleva hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el medio basal es un medio quimicamente definido. En cualquiera de los aspectos, el medio basal es un medio quimicamente indefinido. Los aminoacidos, vitaminas, oligoelementos y otros componentes de medios se pueden usar en una cantidad de una o dos veces los intervalos especificados en la
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patente europea EP 307.247 o en la patente de EE. UU. n.° 6.180.401.
Alternativamente, medios comercialmente disponibles tales como Ham's F10 (Sigma), medio esencial mmimo ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ([DMEM], Sigma) son adecuados para cultivar las celulas animales y se pueden suplementar con componentes de medios qmmicamente definidos como los detallados en el presente documento (por ejemplo, mediante el uso de un kit proporcionado). Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), las patentes de EE. UU. n.2 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762 o 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; la patente de EE. UU. n.° 30.985; o la patente de EE. UU. n.° 5.122.469 se puede utilizar como medio de cultivo para las celulas huesped, cada uno de los cuales se puede suplementar con componentes de medios qmmicamente definidos como los detallados en el presente documento (por ejemplo, mediante el uso de un kit proporcionado).
Cualquier medio proporcionado en el presente documento tambien se puede suplementar segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), iones (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleosidos (tales como adenosina y timidina), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), metales traza (tales como hierro y cobre) y glucosa o una fuente de energfa equivalente. Cualquier otro suplemento necesario tambien se puede incluir en concentraciones apropiadas que serfan conocidas por los expertos en la tecnica.
En un punto particular de su crecimiento, las celulas pueden formar un inoculo para inocular un medio de cultivo al comienzo del cultivo en la fase de produccion. Alternativamente, la fase de produccion puede ser continua con la fase de crecimiento. En general, la fase de crecimiento de las celulas va seguida de una fase de produccion de polipeptidos.
Durante la fase de produccion de polipeptidos, el cultivo celular se puede mantener en un segundo conjunto de condiciones de cultivo (en comparacion con la fase de crecimiento) que conduce a la supervivencia y viabilidad del cultivo celular y que es apropiado para la expresion del polipeptido deseado. Por ejemplo, durante la fase de produccion subsiguiente, las celulas CHO expresan polipeptidos y protefnas recombinantes en un intervalo de 25 °C a 35 °C. Se pueden emplear multiples cambios discretos de temperatura para aumentar la densidad o viabilidad de las celulas o para aumentar la expresion del polipeptido o protefna recombinante. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "fase de produccion de polipeptidos" o "fase de expresion de protemas" se puede referir a la fase de cultivo celular en la que el cultivo de celulas produce un farmaco biologico (por ejemplo, un polipeptido).
Las celulas se pueden mantener en la fase de produccion subsiguiente hasta que se alcance una densidad de celulas deseada o se alcance el tftulo de la produccion. En un modo de realizacion, las celulas se mantienen en la fase de produccion subsiguiente hasta que el tftulo para el polipeptido recombinante alcanza un maximo. En otros modos de realizacion, el cultivo se puede recolectar antes de este punto. Por ejemplo, las celulas se pueden mantener durante un perfodo de tiempo suficiente para lograr una densidad de celulas viables de un 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad maxima de celulas viables. En algunos casos, puede ser deseable permitir que la densidad de celulas viables alcance un maximo, y despues permitir que la densidad de celulas viables disminuya hasta cierto nivel antes de recolectar el cultivo.
En ciertos casos, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular durante la fase de produccion de polipeptidos subsiguiente con nutrientes u otros componentes del medio que se hayan agotado o que las celulas hayan metabolizado. Por ejemplo, podrfa ser ventajoso suplementar el cultivo celular con nutrientes u otros componentes del medio que se haya observado que se han agotado durante la monitorizacion del cultivo celular. En algunos aspectos, el componente o los componentes agotados incluyen calcio, fosfato, hierro y cobre antes de la fase de produccion subsiguiente. En algunos aspectos, los componentes de medios suplementados incluyen calcio, fosfato, hierro y cobre. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular antes de la fase de produccion de polipeptidos subsiguiente. En algunos aspectos, el cultivo celular se suplementa con uno o mas componentes de medios incluyendo calcio, fosfato, hierro y cobre antes de la fase de produccion subsiguiente. Como ejemplos no limitantes, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato), tampones, vitaminas, nucleosidos o nucleotidos, oligoelementos (compuestos inorganicos usualmente presentes en concentraciones finales muy bajas), metales traza (tales como hierro y cobre), aminoacidos, lfpidos o glucosa u otra fuente de energfa. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "medio de alimentacion" o "medio de produccion" se refiere a un medio de cultivo celular utilizado durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular.
En una variacion particular, el medio de alimentacion tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En algunos aspectos, el pH del medio de alimentacion se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptido del cultivo celular. En algunos aspectos, el pH del medio se lleva entonces hasta aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 despues del tratamiento HTST para llevar a cabo la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion particular, el medio de alimentacion comprende limitar la cantidad total de fosfato y de
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calcio a menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En algunos aspectos, la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se aumenta entonces hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En otra variacion, el medio de alimentacion tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante el tratamiento HTST para inactivar virus. En algunos aspectos, el pH del medio se lleva entonces a aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 y la cantidad total de fosfato y de calcio en el medio se eleva hasta un nivel suficiente para la produccion de polipeptidos durante la fase de produccion de polipeptidos del cultivo celular. En cualquiera de los aspectos, el medio de alimentacion es un medio quimicamente definido. En cualquiera de los aspectos, el medio de alimentacion es un medio quimicamente indefinido. Los aminoacidos, vitaminas, oligoelementos y otros componentes de medios se pueden usar en una cantidad de una o dos veces los intervalos especificados en la patente europea EP 307.247 o en la patente de EE. UU. n.° 6.180.401.
D. Kits
Se describe un kit para suplementar un medio de cultivo celular con componentes quimicamente definidos. El kit puede contener componentes secos que haya que reconstituir, y tambien puede contener instrucciones de uso (por ejemplo, para suplementar un medio con los componentes del kit). El kit puede contener los componentes del medio proporcionados en el presente documento en cantidades adecuadas para suplementar un medio de cultivo celular. En una variacion, un kit comprende los componentes del medio de la Tabla 1. En otra variacion, un kit comprende componentes del medio para ajustar el pH del medio a los niveles de pH divulgados en la Tabla 1.
E. Composiciones
Las composiciones que comprende el medio de cultivo celular y uno o mas componentes, tales como una celula o un polipeptido deseado (por ejemplo, un anticuerpo), tambien se proporcionan. En una variacion, se proporciona una composicion que comprende: (a) una celula que comprende un acido nucleico aislado que codifica un polipeptido; y (b) un medio de cultivo celular como se proporciona en el presente documento. En otra variacion, se proporciona una composicion que comprende: (a) un polipeptido; y (b) un medio de cultivo celular como se proporciona en el presente documento, en el que, en un aspecto, el polipeptido es secretado al medio por una celula que comprende un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido. En otra variacion mas, se proporciona una composicion que comprende: (a) un polipeptido; y (b) un medio de cultivo celular como se proporciona en el presente documento, en el que, en un aspecto, el polipeptido es liberado al medio por lisis de una celula que comprende un acido nucleico aislado que codifica el polipeptido. La celula de la composicion puede ser cualquier celula detallada en el presente documento (por ejemplo, una celula CHO) y el medio de la composicion puede ser cualquier medio detallado en el presente documento, tal como un medio que comprende los componentes del medio que se detallan en la Tabla 1. Del mismo modo, el polipeptido de la composicion puede ser cualquier polipeptido detallado en el presente documento, tal como un anticuerpo.
F. Sistemas para inactivacion vi'rica
La invencion contempla sistemas y/o procesos para la inactivacion de virus para medios de cultivo celular. El sistema puede incluir, pero no se limita a: medios, unidad(es) de contencion del medio, medidor de pH (u otro medio para medir el pH), medios para medir y/o cuantificar la concentracion y/o cantidad de calcio y/o fosfato; medios para la transferencia del medio (por ejemplo, tubos), fuente(s) de calor para aumentar la temperatura del medio, medios para ajustar un punto de control objetivo (por ejemplo, temperatura), unidades de contencion de mantenimiento (por ejemplo, tubos de mantenimiento), fuente(s) de enfriamiento para disminuir la temperatura del medio, suministro de aire, medios para entrada y salida de presion (por ejemplo, valvulas de presion, bomba peristaltica, bomba centrifuga, bomba de desplazamiento positivo), medios para entrada y salida del medio, medios para entrada y salida de gas, medios para filtracion, medios para ajustar el caudal y otros aspectos relacionados con la dinamica de flujo y, opcionalmente, conectado a un biorreactor donde se lleva a cabo la produccion de polipeptidos deseados o cultivo celular o medio de cultivo celular.
Un sistema para inactivacion virica que comprende los elementos anteriores tambien puede incluir un sistema para tratamiento termico. Un sistema de tratamiento termico ejemplar que se puede utilizar con diversos parametros (por ejemplo, pH, concentraciones de calcio y/o fosfato) que se describen en el presente documento se muestra en la Figura 1. Tales sistemas descritos en el presente documento son utiles para llevar a cabo los procesos de inactivacion de virus en medios de cultivo celular a fin de que los medios se puedan utilizar para la produccion de diversos productos finales (por ejemplo, polipeptidos, anticuerpos, etc.)
G. Ejemplos de modos de realizacion
En un aspecto, la invencion proporciona procedimientos para la inactivacion de virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende (a) someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST); y (b) ajustar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en pH, nivel de calcio y el nivel de fosfato.
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En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los procedimientos comprenden ademas ajustar las concentraciones de metales traza.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los metales traza se seleccionan del grupo que consiste en hierro y cobre.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, las concentraciones de hierro y/o cobre se ajustan en el medio antes del tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, se eliminan hierro y/o cobre del medio antes del tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los procedimientos comprenden, ademas, suplementar el medio con hierro y/o cobre despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta cuando el medio comprende calcio y fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta a un nivel bajo adecuado durante la preparacion
del medio antes del tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta mediante reduccion a un nivel adecuado.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta a menos de aproximadamente 7,2.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta a aproximadamente 5,0 a 7,2.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el procedimiento comprende ademas ajustar el pH despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta a aproximadamente 6,9 a 7.2.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de calcio se ajusta cuando el medio comprende fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de calcio se reduce.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de calcio se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, se elimina calcio del medio antes del tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los procedimientos comprenden ademas ajustar el nivel de calcio despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de fosfato se ajusta cuando el medio comprende calcio.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de fosfato se reduce.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el nivel de fosfato se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, se elimina fosfato del medio antes del tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el pH se ajusta de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los procedimientos comprenden ademas ajustar el nivel de fosfato despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la concentracion total de fosfato y de calcio en el medio es inferior a aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los niveles de calcio y de fosfato se ajustan.
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En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, los niveles de pH, de calcio y de fosfato se ajustan.
En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para inactivar virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST), en el que el medio tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 7,2 antes de y/o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el pH es de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9, de aproximadamente pH 5,3 a aproximadamente pH 6,3 o de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 antes de o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas ajustar el pH despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular. En algunos modos de realizacion, el medio comprende calcio y fosfato. En algunos modos de realizacion, la concentracion de metales traza (por ejemplo, hierro y/o cobre) en el medio se ajusta antes del tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio no contiene hierro y/o cobre antes de o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas suplementar el medio con hierro y/o cobre despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular.
En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para inactivar virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST), en el que la cantidad total de fosfato y calcio en el medio es inferior a aproximadamente 10 mM antes de y/o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, la cantidad total de fosfato y calcio en el medio es inferior a aproximadamente 9, 8, 7, 6,
5, 4, 3, 2 o 1 mM antes de o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio no contiene fosfato antes de o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio no contiene calcio antes de o durante el tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas ajustar el nivel de fosfato y/o de calcio despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular. En algunos modos de realizacion, la concentracion de metales traza (por ejemplo, hierro y/o cobre) en el medio se ajusta antes del tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el medio no contiene hierro y/o cobre antes del tratamiento HTST. En algunos modos de realizacion, el procedimiento comprende ademas suplementar el medio con hierro y/o cobre despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la formacion de precipitado se suprime.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el ensuciamiento del equipo utilizado para el tratamiento HTST se reduce.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el ensuciamiento del filtro se suprime.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar virus o bacterias presentes en el medio.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93, 95, 97, 99, 101, 102 o 103 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, la temperatura se eleva durante al menos aproximadamente 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 segundos.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el virus se selecciona del grupo que consiste en Parvoviridae, Paramyoxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae, Togaviridae, Caliciviridae y Picornaviridae.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el virus es un virus con envoltura.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el virus es un virus sin envoltura.
En cualquiera de los modos de realizacion anteriores, el agente adventicio es una bacteria.
Todas las caracteristicas divulgadas en esta memoria descriptiva se pueden combinar en cualquier combinacion. Cada una de las caracteristicas divulgadas en esta memoria descriptiva se puede sustituir por una caracteristica alternativa que tenga un proposito igual, equivalente o similar. Por lo tanto, a menos que se indique expresamente lo contrario, cada una de las caracteristicas divulgadas es solo un ejemplo de una serie generica de caracteristicas equivalentes o similares.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invencion.
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EJEMPLOS
La contaminacion por agentes viricos de los procesos de cultivo celular representa una amenaza para la produccion de farmacos biologicos (por ejemplo, proteinas recombinantes) a partir de lineas celulares y plantea potenciales problemas de seguridad con respecto a la capacidad de eliminar los agentes viricos durante la purificacion del producto. Se pueden adoptar diversos enfoques para reducir al minimo el riesgo de que agentes adventicios entren en los procesos de produccion, incluyendo el uso de un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST) de medios de cultivo celular. Sin embargo, aunque es eficaz en la inactivacion de virus cuando funciona correctamente, un medio determinado puede ser incompatible con el uso del tratamiento HTST para la inactivacion de particulas viricas (Schleh, M. et al. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 y Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729). La incompatibilidad del medio puede dar como resultado el ensuciamiento de las superficies del equipo HTST que estan en contacto con el proceso. Un elemento que contribuye al ensuciamiento es la precipitacion del medio como resultado de las operaciones de calentamiento y de enfriamiento del tratamiento HTST. La precipitacion conduce al deposito de residuos que ensucian los intercambiadores de calor y provoca la parada del skid HTST debido a la incapacidad del sistema para mantener los puntos de ajuste de temperatura. Ademas, la precipitacion en un medio que es incompatible con el tratamiento termico puede provocar el ensuciamiento de los filtros del proceso utilizados para eliminar las bacterias presentes en el medio que no se inactivaron en las condiciones HTST. El ensuciamiento de los filtros debido a la precipitacion puede conducir a un fallo de procesamiento y a un aumento significativo en los costes de filtracion. Ademas, la precipitacion en un medio incompatible con el tratamiento termico puede afectar negativamente al rendimiento de cultivo de celulas (por ejemplo, titulo de producto, crecimiento celular, viabilidad celular) y a la calidad del producto.
Como se describe en el presente documento, se han identificado varias modificaciones en el medio que hacen que sea compatible para su uso durante el tratamiento HTST u otro tratamiento termico para la inactivacion de virus. Se han identificado varias formulaciones de medios que reducen o previenen la precipitacion en el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus. Se describen los procedimientos de inactivacion de virus en los medios proporcionados en el presente documento, asi como los procedimientos para reducir el precipitado en el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus. En un aspecto, un medio puede tener un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST para su uso en la inactivacion de virus. En otro aspecto, un medio puede tener un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 durante el tratamiento HTST para su uso en la inactivacion de virus antes de la fase de expresion de proteinas del cultivo celular. En un aspecto adicional, se puede llevar el pH de un medio de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,2 para la fase de expresion de proteinas del cultivo celular. En un aspecto, un medio puede comprender limitar la cantidad total de fosfato y de calcio a menos de aproximadamente 10 mM durante tratamiento HTST para su uso en la inactivacion de virus. En otro aspecto, un medio puede comprender limitar la cantidad total de fosfato y de calcio a menos de aproximadamente 10 mM durante tratamiento HTST para su uso en la inactivacion de virus antes de la fase de expresion de proteinas del cultivo celular. En un aspecto adicional, se puede aumentar la cantidad total de fosfato y de calcio de un medio hasta un nivel suficiente para la expresion de proteinas durante la fase de expresion de proteinas del cultivo celular. En cualquier aspecto, el medio puede comprender un pH de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,9 y una cantidad total de fosfato y de calcio de menos de aproximadamente 10 mM durante tratamiento HTST para su uso en la inactivacion de virus en medios de cultivo celular. Los medios se pueden usar en todas las fases del cultivo celular y se pueden usar en el medio basal y/o el medio de alimentacion. Los medios se pueden usar para reducir el precipitado en el equipo utilizado para el tratamiento HTST para inactivar virus. Tambien se contemplan kits para suplementar un medio de cultivo celular con componentes quimicamente definidos.
Ejemplo 1: Validacion del procedimiento de seleccion en bano de arena para reproducir las observaciones de funcionamiento del skid HTST.
Durante el tratamiento HTST a escala de fabricacion, las preparaciones liquidas del medio de cultivo celular se calientan a 102 0C durante 10 segundos en un proceso de flujo continuo que utiliza dos intercambiadores de calor, uno para calentar el fluido y uno para enfriar el fluido, con tubos intermedios para proporcionar un tiempo de mantenimiento de la temperatura deseado para un caudal dado (Fig. 1). El procedimiento de seleccion en bano de arena se utilizo para probar mas rapidamente composiciones de medios con requisitos de volumen del medio a escala de laboratorio (~20 ml) para evaluar el comportamiento despues del tratamiento termico. Este procedimiento se basa en "el peor caso" de exposicion termica para detectar e identificar medios compatibles para su uso en skids HTST a escala piloto y de fabricacion (Tabla 2).
Tabla 2. Principales diferencias entre el aparato de bano de arena y el skid HTST a dos escalas de funcionamiento.
Caracteristica
Bano de arena Skid HTST a escala piloto Skid HTST a escala de fabricacion
Escala de volumen del proceso
~20 ml ~50a 400 l ~1000sde l
Flujo de fluido (tasa de transferencia de calor en el lado de la muestra)
Estatico (conveccion impulsada por calentamiento) ~1-2 l/min, flujo de piston ~ 100 l/min, flujo de piston
Material (resistencia a la
Vidrio Acero inoxidable 316L Acero inoxidable 316L
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transferencia de calor)
Perfil de la exposicion termica
Funcion de paso lento (aumento gradual durante 58 minutos de 19-25 0C o 37 0C a 102 0C, mantenimiento durante 10 s, seguido de enfriamiento por extincion durante varios minutos) Funcion de paso casi instantaneo (t.a. o 37 0C a 102 0C, mantenimiento durante 10 s, seguido de retorno a 37 0C) Funcion de paso casi instantaneo (t.a. o 37 0C a 102 0C, mantenimiento durante 10 s, seguido de retorno a 37 0C)
Materiales y procedimientos
Preparacion de medios
Los medios utilizados en este estudio incluyen medios de produccion basales y medios de alimentacion discontinua con diferentes niveles de pH (Tabla 3). Todos los medios se prepararon utilizando agua purificada desionizada procesada a traves de un sistema de purificacion de agua ultrapura Millipore SuperQ. Los medios se prepararon utilizando los caldos de medio en polvo apropiado (SAFC y Life Technologies). Se utilizaron una sonda de pH de electrodo de vidrio (Mettler Toledo) y un osmometro (Advanced Instruments) durante las preparaciones liquidas para garantizar el pH y la osmolalidad objetivo de una preparacion dada. Tras la disolucion completa de los componentes y los ajustes finales de pH y osmolalidad, los medios se filtraron usando filtros de membrana PES de tamano de poro de 0,1 pm en frascos que variaban desde 250 ml a 1 l (Corning) para las preparaciones a pequena escala.
Tabla 3. Formulaciones de medios sometidas a prueba de estabilidad durante el tratamiento termico
Descripcion de los medios
pH objetivo
Medio 1 (alimentado, indefinido)
6,40
7,00
Media 2 (basal, indefinido)
6,70
7,00
Ajuste del pH
La desviacion de pH debida a la liberacion de gases que se produjo durante el tiempo transcurrido entre la finalizacion de la preparacion del medio y la aplicacion del tratamiento termico se corrigio. Antes del tratamiento termico, una alicuota de 30 ml de cada preparacion de medio se transfirio a tubos de 50 ml (Falcon) y las tapas de los tubos Falcon originales se reemplazaron por tapas ventiladas de matraces Erlenmeyer de 250 ml de Corning. Los tubos se colocaron a continuacion en una incubadora con corriente de CO2 durante 30 minutos para reducir el pH (CO2 al 15 % para muestras a pH 6.2 y CO2 al 12 % para las demas muestras, 200 rpm, 37 0C); este paso fue capaz de reducir el pH por debajo del valor objetivo. Los tubos se agitaron manualmente mientras se monitorizaba el pH utilizando una sonda de pH con electrodo de vidrio y un medidor (Mettler Toledo) hasta que el pH volvio de nuevo a un valor por encima del pH objetivo. Las mediciones finales de pH se realizaron con un analizador NOVA bioprofiler.
Procedimiento en bano de arena
Para el procedimiento en bano de arena, 22 ml de medio liquido preparado se transfirieron a recipientes a presion de vidrio de 20 ml (vidrio Ace). Los recipientes se sellaron con una tapa roscada con vaina (thermowell) para que no quede ningun espacio de cabeza de aire en el recipiente al llenarlo completamente y permitir que el exceso de medio sea desplazado por la tapa y el thermowell. El exterior del recipiente se limpio para evitar el ensuciamiento de la superficie exterior con los medios expuestos directamente a la matriz de la fuente de calor. Se utilizo cinta de teflon para cubrir la interfaz entre el borde del recipiente de vidrio y la tapa roscada para mejorar el sellado del recipiente de vidrio a presion y evitar que la arena o el aceite del deposito del termopar entraran en contacto con las muestras para el tratamiento termico. Se configuro un bano de arena fluidizado (Techne SBS-4) con regulador de temperatura (Techne TC-8D) (presion de entrada de aire comprimido = 5 kPa, temperatura del bano = 110 0C) y se dejo equilibrar durante 30 minutos. Los termopares conectados a un unico termometro digital VWR se insertaron en los thermowells de los recipientes de muestra geometricamente situados en el centro de la dimension radial del tubo. Se anadio aceite de silicona al deposito del termopar para proporcionar un medio de transferencia de calor entre la pared de vidrio del deposito del termopar y el termopar. Los recipientes de las muestras se colocaron en el bano de arena y se puso en marcha un temporizador. Se registraron datos cineticos de temperatura aproximadamente cada 30-60 segundos. Cuando un recipiente alcanzo 102 0C segun las lecturas del termometro, se mantuvo en el bano de arena durante un periodo de mantenimiento de 10 segundos. Tras los pasos de calentamiento y mantenimiento, los recipientes se transfirieron a un bano de agua a temperatura ambiente hasta que la lectura de temperatura del termometro alcanzo 35 0C. Despues del tratamiento termico, 15 ml de cada muestra se transfirieron a un vial para realizar mediciones de turbidez y visuales.
Mediciones de precipitacion
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La precipitacion de las muestras de medios se analizo antes y despues del tratamiento termico por dos procedimientos: 1) medicion de turbidez mediante un turbidfmetro (2100Q Hach); y 2) centrifugacion de las muestras en tubos Falcon de 50 ml a 10 000 x g durante 10 minutos (Sorvall RC 6 plus, rotor SS-34) para obtener el sedimento de precipitado para la identificacion visual y la determinacion cualitativa de precipitacion basada en el tamano de granulo (por ejemplo, cantidad nula, baja, moderada o alta de precipitado visible). Las muestras no centrifugadas tambien se analizaron para la identificacion visual de la precipitacion.
Resultados
A partir de los perfiles de calentamiento en bano de arena y HTST se realizaron dos observaciones principales: 1) el perfil de calentamiento del sistema de tratamiento termico en bano de arena fue considerablemente mas largo que el de las operaciones del skid HTST a mayor escala y 2) el bano de arena fue capaz de alcanzar el punto objetivo de 102°C en aproximadamente 6,5 minutos (Fig. 2). Los perfiles de calentamiento del procedimiento en bano de arena variaron consistentemente de 5 a 8 minutos con un tiempo promedio de ~6 a ~6,5 minutos para calentar desde la temperatura ambiente (~21 a 25 °C) o 37 0C hasta el valor objetivo de 102 0C para el mantenimiento de 10 segundos antes de enfriar las muestras en un bano de agua. En cuanto a los sistemas HTST de flujo continuo a escala piloto o de fabricacion, el area bajo la curva para el calentamiento, el mantenimiento y el enfriamiento fue considerablemente mayor en el procedimiento en bano de arena. Se determino que las muestras de medios del procedimiento en bano de arena eran el peor caso de exposicion termica total en relacion con las operaciones HTST a escala piloto y de fabricacion. Por lo tanto, cualquier cambio significativo en los componentes de una formulacion de medio determinada impulsadoprincipalmente por la exposicion termica en el procedimiento en bano de arena proporcionarfa datos relevantes para tratamientos HTST a escalas mas grandes.
Se observo que, durante el tratamiento HTST, la disminucion del pH de la formulacion del medio de alimentacion (Medio 1) desde pH 7,0 a pH 6,4 podrfa aliviar cualquier problema operativo de HTST (Tabla 3). Del mismo modo, en el caso de la formulacion del medio basal (Medio 2), se encontro que el tratamiento del medio a un pH de 6,7 en lugar de pH 7,0 tambien aliviarfa cualquier problema operativo (Tabla 3). Estos medios se procesaron cada uno a los dos niveles de pH en el procedimiento en bano de arena para determinar si el procedimiento en bano de arena podrfa reflejar de forma precisa el comportamiento de precipitacion que se produjo en las operaciones de tratamiento HTST a escala. Las mediciones visuales antes y despues del tratamiento termico indicaron que el sistema de bano de arena demostro con precision el comportamiento de precipitacion debido al tratamiento termico para medios con conocidos problemas de compatibilidad con HTST en el procesamiento a pH neutro (Fig. 3A y B). En consonancia con "el peor caso" para cambios basados en la exposicion termica de los medios, el Medio 2 todavfa mostraba signos de precipitacion a pH 6,7 en el bano de arena a pesar de que se habfa mejorado significativamente en relacion con la muestra tratada a pH 7.0 del mismo medio. En general, estos resultados validaron el uso del procedimiento en bano de arena para detectar e identificar formulaciones de medios que sean compatibles para su uso en tratamiento HTST a escala piloto y de fabricacion.
Ejemplo 2: Los niveles de pH, calcio y fosfato contribuyen a la precipitacion en los medios durante el tratamiento termico para inactivacion vfrica.
Materiales y procedimientos
Preparacion de medios
Los medios utilizados en este estudio incluyen medios basales de produccion y medios de alimentacion discontinua a niveles de pH en un intervalo de aproximadamente pH 5,9 a aproximadamente pH 7,5, intervalos de concentracion de calcio de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 3,5 mM (o mayor en los medios indefinidos) e intervalos de concentracion de fosfato de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 6,5 mM (o mayor en los medios indefinidos). Todos los medios se prepararon utilizando agua purificada desionizada procesada a traves de un sistema de purificacion de agua ultrapura Millipore SuperQ. Los medios se prepararon utilizando los caldos de medio en polvo apropiado (SAFC y Life Technologies). Se utilizaron una sonda de pH de electrodo de vidrio (Mettler Toledo) y un osmometro (Advanced Instruments) durante las preparaciones lfquidas para garantizar el pH y la osmolalidad objetivo de una preparacion dada. Tras la disolucion completa de los componentes y los ajustes finales de pH y osmolalidad, los medios se filtraron usando filtros de membrana PES de tamano de poro de 0,1 pm en frascos que variaban desde 250 ml a 1 l (Corning) para las preparaciones a pequena escala.
Ajuste del pH
La desviacion de pH debida a la liberacion de gases que se produjo durante el tiempo transcurrido entre la finalizacion de la preparacion del medio y la aplicacion del tratamiento termico se corrigio. Antes del tratamiento termico, una alfcuota de 30 ml de cada preparacion de medio se transfirio a tubos de 50 ml (Falcon) y las tapas de los tubos Falcon originales se reemplazaron por tapas ventiladas de matraces Erlenmeyer de 250 ml de Corning. Los tubos se colocaron a continuacion en una incubadora con corriente de CO2 durante 30 minutos para reducir el pH (CO2 al 15 % para muestras a pH 6.2 y CO2 al 12 % para las demas muestras, 200 rpm, 37 0C); este paso fue capaz de reducir el pH por debajo del valor objetivo. Los tubos se agitaron manualmente mientras se monitorizaba el pH utilizando una
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sonda de pH con electrodo de vidrio y un medidor (Mettler Toledo) hasta que el pH volvio de nuevo a un valor por encima del pH objetivo. Las mediciones finales de pH se realizaron con un analizador NOVA bioprofiler.
Procedimiento en bano de arena
Para el procedimiento en bano de arena, 22 ml de medio liquido preparado se transfirieron a recipientes a presion de vidrio de 20 ml (vidrio Ace). Los recipientes se sellaron con una tapa roscada con vaina (thermowell) para que no quede ningun espacio de cabeza de aire en el recipiente al llenarlo completamente y permitir que el exceso de medio sea desplazado por la tapa y el thermowell. El exterior del recipiente se limpio para evitar el ensuciamiento de la superficie exterior con los medios expuestos directamente a la matriz de la fuente de calor. Se utilizo cinta de teflon para cubrir la interfaz entre el borde del recipiente de vidrio y la tapa roscada para mejorar el sellado del recipiente de vidrio a presion y evitar que la arena o el aceite del deposito del termopar entraran en contacto con las muestras para el tratamiento termico. Se configuro un bano de arena fluidizado (Techne SBS-4) con regulador de temperatura (Techne TC-8D) (presion de entrada de aire comprimido = 5 kPa, temperatura del bano = 110 0C) y se dejo equilibrar durante 30 minutos. Los termopares conectados a un unico termometro digital VWR se insertaron en los thermowells de los recipientes de muestra geometricamente situados en el centro de la dimension radial del tubo. Se anadio aceite de silicona al deposito del termopar para proporcionar un medio de transferencia de calor entre la pared de vidrio del deposito del termopar y el termopar. Los recipientes de las muestras se colocaron en el bano de arena y se puso en marcha un temporizador. Se registraron datos cineticos de temperatura aproximadamente cada 30-60 segundos. Cuando un recipiente alcanzo 102 0C segun las lecturas del termometro, se mantuvo en el bano de arena durante un periodo de mantenimiento de 10 segundos. Tras los pasos de calentamiento y mantenimiento, los recipientes se transfirieron a un bano de agua a temperatura ambiente hasta que la lectura de temperatura del termometro alcanzo 35 0C. Despues del tratamiento termico, 15 ml de cada muestra se transfirieron a un vial para realizar mediciones de turbidez y visuales.
Mediciones de precipitacion
La precipitacion de las muestras de medios se analizo antes y despues del tratamiento termico por dos procedimientos: 1) medicion de turbidez mediante un turbidimetro (2100Q Hach); y 2) centrifugacion de las muestras en tubos Falcon de 50 ml a 10 000 x g durante 10 minutos (Sorvall RC 6 plus, rotor SS-34) para obtener el sedimento de precipitado para la identificacion visual y la determinacion cualitativa de precipitacion basada en el tamano de granulo (por ejemplo, cantidad nula, baja, moderada o alta de precipitado visible). Las muestras no centrifugadas tambien se analizaron para la identificacion visual de la precipitacion.
Resultados
Se prepararon varias formulaciones de medios con niveles variables de valores de pH, asi como de concentraciones de calcio y de fosfato (Tabla 4). La precipitacion de los medios preparados se evaluo antes y despues del tratamiento termico mediante observaciones visuales de las muestras no centrifugadas y centrifugadas, y mediante mediciones de turbidez.
Tabla 4. Formulaciones de medios sometidas a prueba de precipitacion en el procedimiento en bano de arena
Descripcion de los medios
pH real pH objetivo Precipitacion (Si / No) Turbidez (NTU) [Ca] mM [PO4] mM Relacion [Ca]/[PO4]
7,00 7,00 Si 50,7 3,5 3,17 1,10
Medio 1f
n/d 6,90 Si n/d 3,5 3,17 1,10
n/d 6,50 Si n/d 3,5 3,17 1,10
(alimentado, indefinido)
6,40 6,40 No 1,2 3,5 3,17 1,10
n/d 6,20 No n/d 3,5 3,17 1,10
Medio 2f
7,00 7,00 Si 100,2 2,1 1,9 1,11
(basal, indefinido)
6,68 6,70 Si 37,5 2,1 1,9 1,11
Medio 3 (basal, definido)
7,05 7,00 Si 8,3 1,5 3 0,50
Medio 4
n/d 7,20 Si n/d 1,5 3 0,50
7,11
7,10 Si 23,0 1,5 3 0,50
(basal, definido)
6,93 6,70 No 19,11 1,5 3 0,50
6,35
6,30 No 2,94 1,5 3 0,50
Medio 5f (basal, indefinido)
7,02 7,00 Si 20,5 1,3 2,6 0,5
Medio 6 (basal, definido)
7,07 7,10 No 1,0 0,42 2,54 0,17
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Medio 7 (basal, definido)
7,00 7,00 No 0,5 0,4 4,15 0,10
Medio 8 (alimentado, definido)
7,04 7,00 No 0,2 0 30 0
Medio 9
6,90 7,20 No 0,2 0 30 0
(alimentado, definido)
6,50 6,50 No 1,1 0 30 0
Medio 10
n/d 7,20 Si n/d 2,3 2,9 n/d
n/d 6,70 Si n/d 2,3 2,9 n/d
(basal, indefinido)
n/d 6,20 Si n/d 2,3 2,9 n/d
f = para los Medios 1, 2, 5 y 10, la contribucion del hidrolizado/peptona no esta incluida en la estimacion de las concentraciones de calcio y fosfato.
n/d indica no disponible.
La medicion de precipitacion en las muestras indico que los datos obtenidos por el procedimiento en bano de arena reflejan un escenario posible para la exposicion termica total en relacion con las operaciones de tratamiento HTST, ya que las formulaciones del Medio 4 y del Medio 5, que previamente no habian mostrado problemas operacionales en el tratamiento HTST a escala piloto o de fabricacion, mostraron turbidez medible y precipitacion visible en el procedimiento en bano de arena. A traves del procedimiento en bano de arena, se determino que las concentraciones de calcio y fosfato y los niveles de pH son componentes de las formulaciones de medios que contribuyen a provocar cambios significativos en los medios durante la exposicion termica a al menos 102 0C. En varias formulaciones, la reduccion de los niveles de pH sin modificar las concentraciones de calcio y fosfato dio lugar a una menor turbidez (Tabla 4). Ademas, las formulaciones sin calcio o con bajas concentraciones de calcio tampoco mostraron eventos de precipitacion y no se obtuvieron mediciones de alta turbidez incluso a pH neutro (Tabla 4). Se observo una correlacion entre la precipitacion reducida y la menor proporcion entre el calcio y el fosfato, ademas de con las menores concentraciones de calcio y de fosfato (Tabla 4). Estas observaciones condujeron a la determinacion de que la formacion de precipitados de fosfato de calcio tras el calentamiento y el enfriamiento que se llevan a cabo durante el tratamiento termico es una funcion de la concentracion de calcio, la concentracion de fosfato y los niveles de pH.
El Medio 4 se eligio para un diseno de los experimentos (DoE) con todos los factores para el analisis multivariante de formulaciones sometidas a tratamiento termico en el sistema de bano de arena y se utilizo la medida de respuesta a la turbidez (NTU) para generar una superficie de respuesta a la precipitacion. Las variables que se variaron fueron la concentracion de calcio (0,1 a 2,9 mM), la concentracion de fosfato (0,1 a 5.9 mM) y el pH (6,0 a 7,2). Las estimaciones de los parametros ordenados determinadas mediante mediciones de turbidez y confirmadas mediante observaciones visuales, identificaron que la formacion de fosfato de calcio dependiente del pH tras el tratamiento termico de una formulacion de medio que contiene calcio y fosfato da como resultado la formacion de precipitacion en el medio (Fig. 4). El efecto que mas influye en la precipitacion del medio es el producto vectorial de la concentracion de calcio y de fosfato (Fig. 4). Esto esta de acuerdo con la cinetica de reaccion esperada de las formas insolubles de fosfato de calcio que depende de la concentracion de calcio y de fosfato. Ademas, la estimacion de la turbidez a partir del producto de las concentraciones de calcio y de fosfato tambien esta de acuerdo con la observacion de que, si la concentracion de calcio o la concentracion de fosfato son cero, no se producira ningun incremento significativo de la turbidez (como una estimacion de la compatibilidad con HTST).
Posteriormente, se realizo una modelizacion de una superficie de respuesta a partir de los datos de turbidez y de los insumos (concentracion de calcio, concentracion de fosfato y pH) de los DoE. El punto de corte para un regimen operativo bueno frente a un regimen operativo malo en el peor caso de tratamiento termico en bano de arena elegido fue una turbidez de 5 NTU basandose en el analisis de todos los valores de turbidez relativos a la precipitacion visible observada durante la inspeccion visual de muestras de medios sometidas a tratamiento termico centrifugadas y no centrifugadas. Los datos sugieren que son posibles multiples opciones o palancas para la modificacion de una formulacion de medio para garantizar la compatibilidad con HTST. En particular, la reduccion de la concentracion de calcio, la concentracion de fosfato, el pH, o alguna combinacion de los tres parametros fueron todas las palancas potenciales para la obtencion de una formulacion de medio que fuera compatible para el tratamiento HTST u otros procedimientos de tratamiento termico (Fig. 5).
Basandose en la superficie de respuesta modelizada generada a partir de los datos del Medio 4 sometido a tratamiento termico, la estabilidad de los medios en los estudios de tratamiento termico en bano de arena resulto ser particularmente dependiente de las concentraciones de calcio y de fosfato, asi como de los niveles de pH. Para determinar modificaciones en otras formulaciones de medios que permitirian pasar de un medio incompatible con HTST a un medio compatible con HTST, otras formulaciones de medios que no comprenden hidrolizado (Medio 3, Medio 4, Medio 6, Medio 7, Medio 8, Medio 9, Medio 11, Medio 12 y Medio 13) se representaron en el modelo de superficie de respuesta basandose en sus concentraciones de calcio y fosfato a un pH de 7,0 (Fig. 6). Los medios que contenian hidrolizado anadieron complejidad al analisis debido a los niveles variables de calcio y fosfato. El Medio 11
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caia en el area de superficie de respuesta que indicaba que estaba fuera del intervalo de precipitacion y, por lo tanto, se determino que era probable que fuera un medio compatible con HTST (Fig. 6, punto C). La adicion de hidrolizado el Medio 11 para la produccion del Medio 5 (Tabla 4) y, basandose en las estimaciones conocidas de los niveles de fosfato y de calcio en el hidrolizado, dio lugar a un desplazamiento del medio hacia el intervalo de precipitacion y, por lo tanto, a la probabilidad de que fuera un medio incompatible con HTST (Fig. 6, flecha en punto C). El Medio 12 estaba dentro del intervalo de precipitacion y, basandose en el modelo, se predijo que la adicion de hidrolizado para la produccion del Medio 2 (Tabla 4) desplazaria el medio aun mas hacia el intervalo de precipitacion (Fig. 6, flecha en punto D). Las formulaciones que se preveia que estuvieran dentro o fuera del intervalo de precipitacion basandose en el modelo de superficie de respuesta se correlacionaron con precipitacion visible tras el tratamiento termico en bano de arena, incluyendo las dos formulaciones que tenian problemas de ensuciamiento del intercambiador de calor en las operaciones del skid HTST a escala de fabricacion. El uso de los modelos de superficie de respuesta generados indico que habia una fuerte correlacion entre la presencia de precipitacion en la formulacion de medio de cultivo celular tras el tratamiento termico y las altas concentraciones de calcio y fosfato a pH casi neutro (Fig. 5 y 6). Ademas, se pueden generar modelos de superficie de respuesta basados en los datos del bano de arena para proporcionar una recomendacion de cambios que se pueden realizar en la formulacion para convertir medios incompatibles con HTST en medios compatibles con HTST.
Ejemplo 3: Efecto de la temperatura sobre el comportamiento de precipitacion de los medios durante la inactivacion virica.
Materiales y procedimientos Preparacion de medios
Los medios utilizados en este estudio incluyen medios de produccion basales y medios de alimentacion discontinua. Todos los medios se prepararon utilizando agua purificada desionizada procesada a traves de un sistema de purificacion de agua ultrapura Millipore SuperQ. Los medios se prepararon utilizando los caldos de medio en polvo apropiado (SAFC y Life Technologies). Se utilizaron una sonda de pH de electrodo de vidrio (Mettler Toledo) y un osmometro (Advanced Instruments) durante las preparaciones liquidas para garantizar el pH y la osmolalidad objetivo de una preparacion dada. Tras la disolucion completa de los componentes y los ajustes finales de pH y osmolalidad, los medios se filtraron usando filtros de membrana PES de tamano de poro de 0,1 pm en frascos que variaban desde 250 ml a 1 l (Corning) para las preparaciones a pequena escala.
Ajuste del pH
La desviacion de pH debida a la liberacion de gases que se produjo durante el tiempo transcurrido entre la finalizacion de la preparacion del medio y la aplicacion del tratamiento termico se corrigio. Antes del tratamiento termico, una alicuota de 30 ml de cada preparacion de medio se transfirio a tubos de 50 ml (Falcon) y las tapas de los tubos Falcon originales se reemplazaron por tapas ventiladas de matraces Erlenmeyer de 250 ml de Corning. Los tubos se colocaron a continuacion en una incubadora con corriente de CO2 durante 30 minutos para reducir el pH (CO2 al 15 % para muestras a pH 6.2 y CO2 al 12 % para las demas muestras, 200 rpm, 37 0C); este paso fue capaz de reducir el pH por debajo del valor objetivo. Los tubos se agitaron manualmente mientras se monitorizaba el pH utilizando una sonda de pH con electrodo de vidrio y un medidor (Mettler Toledo) hasta que el pH volvio de nuevo a un valor por encima del pH objetivo. Las mediciones finales de pH se realizaron con un analizador NOVA bioprofiler.
Procedimiento en bano de arena
Para el procedimiento en bano de arena, 22 ml de medio liquido preparado se transfirieron a recipientes a presion de vidrio de 20 ml (vidrio Ace). Los recipientes se sellaron con una tapa roscada con vaina (thermowell) para que no quede ningun espacio de cabeza de aire en el recipiente al llenarlo completamente y permitir que el exceso de medio sea desplazado por la tapa y el thermowell. El exterior del recipiente se limpio para evitar el ensuciamiento de la superficie exterior con los medios expuestos directamente a la matriz de la fuente de calor. Se utilizo cinta de teflon para cubrir la interfaz entre el borde del recipiente de vidrio y la tapa roscada para mejorar el sellado del recipiente de vidrio a presion y evitar que la arena o el aceite del deposito del termopar entraran en contacto con las muestras para el tratamiento termico. Se configuro un bano de arena fluidizado (Techne SBS-4) con regulador de temperatura (Techne TC-8D) (presion de entrada de aire comprimido = 5 kPa, temperatura del bano = 110 0C) y se dejo equilibrar durante 30 minutos. Los termopares conectados a un unico termometro digital VWR se insertaron en los thermowells de los recipientes de muestra geometricamente situados en el centro de la dimension radial del tubo. Se anadio aceite de silicona al deposito del termopar para proporcionar un medio de transferencia de calor entre la pared de vidrio del deposito del termopar y el termopar. Los recipientes de las muestras se colocaron en el bano de arena y se puso en marcha un temporizador. Se registraron datos cineticos de temperatura aproximadamente cada 30-60 segundos. Cuando un recipiente alcanzo 102 0C segun las lecturas del termometro, se mantuvo en el bano de arena durante un periodo de mantenimiento de 10 segundos. Tras los pasos de calentamiento y mantenimiento, los recipientes se transfirieron a un bano de agua a temperatura ambiente hasta que la lectura de temperatura del termometro alcanzo 35 0C. Despues del tratamiento termico, 15 ml de cada muestra se transfirieron a un vial para realizar mediciones de turbidez y visuales.
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Mediciones de precipitacion
La precipitacion de las muestras de medios se analizo antes y despues del tratamiento termico por dos procedimientos: 1) medicion de turbidez mediante un turbidimetro (2100Q Hach); y 2) centrifugacion de las muestras en tubos Falcon de 50 ml a 10 000 x g durante 10 minutos (Sorvall RC 6 plus, rotor SS-34) para obtener el sedimento de precipitado para la identificacion visual y la determinacion cualitativa de precipitacion basada en el tamano de granulo (por ejemplo, cantidad nula, baja, moderada o alta de precipitado visible). Las muestras no centrifugadas tambien se analizaron para la identificacion visual de la precipitacion.
Resultados
El efecto de la temperatura sobre la precipitacion del medio se estudio adicionalmente mediante la variacion del punto de ajuste objetivo para el calentamiento en el sistema de bano de arena. Las mediciones se realizaron a temperaturas de aproximadamente 75, 85, 90, 97 y 102 0C para el Medio 1 (alimentado, indefinido), el Medio 2 (basal, indefinido), el Medio 4 (basal, definido) y el Medio 10 (basal, indefinido), todos ellos formulados a pH neutro de 7,0. La inspeccion visual de las muestras no centrifugadas y centrifugadas tomadas a lo largo de la curva de calentamiento demostro que las cuatro formulaciones de medios diferentes presentaban eventos de precipitacion en el momento en que las muestras alcanzaban 90 0C (Fig. 7, circulos rellenos). El Medio 4 y el Medio 10 continuaron mostrando eventos de precipitacion a temperaturas mas bajas de 85 0C y 75 0C (Fig. 7, circulos rellenos). El Medio 2 mostro eventos de precipitacion a 85 0C durante el tratamiento termico, pero no produjo precipitados visibles a 75 0C, lo que indica que el Medio 2 es compatible con el tratamiento termico a una temperatura de aproximadamente 75 0C o menos (Fig. 7, circulo vacio). El Medio 1 no produjo precipitacion a 85 0C lo que indica que el Medio 1 es compatible con el tratamiento termico a temperaturas de aproximadamente 850C o menos (Fig. 7, circulo vacio). Estas observaciones se confirmaron con las mediciones de turbidez, que demostraron que las cuatro formulaciones de medios diferentes tenian una medida de turbidez de aproximadamente 20 NTU o mayor en el momento en que las muestras alcanzaban 90 0C (Fig. 8). Los valores de turbidez de los medios sometidos a tratamiento termico disminuyeron al pasar de 97 0C a 102 0C para los Medios 2, 4 y 10 (Fig. 8). La turbidez de una solucion como la de los medios es una funcion de la distribucion de tamano de particula y, en particular, un intervalo especifico de tamanos de particulas coloidales sera mas activo en la medicion que otras partes de la distribucion de tamanos. Por lo tanto, es posible que la disminucion en la turbidez medida a la temperatura mas alta sea un resultado del comportamiento de floculacion/agregacion de particulas que conduce a un cambio en la distribucion de tamano de particula que produce un artefacto en los datos de turbidez (por ejemplo, mayor tamano de particula pero menor cantidad). Estos resultados indicaron que una ligera reduccion de la temperatura mientras todavia se mantiene la inactivacion de virus no redujo significativamente la turbidez.
Se requieren temperaturas superiores a 85 0C a 90 0C en periodos de mantenimiento relevantes de la operacion de HTST a gran escala para que un procedimiento de inactivacion de virus sea eficaz y se requieren temperaturas superiores a 95 0C para lograr las reducciones logaritmicas deseadas para los parvovirus de interes industrial. Aunque el procedimiento en bano de arena es mas riguroso para la observacion de eventos de precipitacion de medios derivados del tratamiento termico, los datos sugieren que se puede usar una operacion a una temperatura menor que el punto de ajuste objetivo actual del tratamiento HTST de 102 0C para evitar eventos de precipitaciones que conducen al ensuciamiento de los intercambiadores de calor. Puesto que el proposito del tratamiento HTST es la inactivacion virica, es evidente que la reduccion del punto de ajuste de temperatura objetivo no es una opcion y que, para diversas formulaciones de medios, la precipitacion es un problema operativo potencial para aplicaciones de HTST en los medios. Por lo tanto, las concentraciones de calcio y de fosfato, asi como los niveles de pH, son componentes que se pueden ajustar para reducir o prevenir eventos de precipitacion durante la inactivacion virica de los medios mediante el tratamiento HTST a temperaturas de al menos 90 0C.
Ejemplo 4: Los niveles de pH, calcio y fosfato contribuyen a la precipitacion en los medios durante el tratamiento HTST de medios a escala piloto y a gran escala para la inactivacion virica.
Materiales y procedimientos
HTST a escala piloto
Para los estudios que utilizan HTST a escala piloto, las formulaciones de medios se procesaron desde la concentracion mas baja hasta la concentracion mas alta de calcio o de fosfato con el fin de minimizar la posible transferencia a ejecuciones posteriores. Cada ejecucion HTST requirio 15 l a 20 l de medio para eliminar el agua de enjuague desionizada utilizada entre ejecuciones y para equilibrar la bobina de calentamiento a la temperatura de funcionamiento de 102 0C (intervalo aceptable: 97 °C-110 0C) para el proceso HTST. Tras el equilibrado, se procesaron aproximadamente 20 l de medio en el skid HTST y el flujo de salida se recogio en un contenedor de plastico. Se recogieron muestras del medio antes del tratamiento HTST del tanque de mezcla de medios y del medio de salida en el contenedor, y se filtraron a traves de un filtro de membrana de capsula de PVDF de 0,1 pm (Millipore) a una bolsa de almacenamiento del medio para servir como las muestras “Pre-HTST” y “Post-HTST”. Todas las muestras de medios filtrados procesadas y no procesadas se almacenaron entonces a 2-8 0C antes de su uso en
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ensayos de rendimiento de cultivo celular y pruebas analiticas.
HTST a escala de fabricacion
Se utilizo una preparacion de Medio 4 o Medio 1 de 1800 l para una ejecucion de ingenieria a escala de fabricacion para el tratamiento termico de medios con un skid HTST a escala de fabricacion. El proposito de esta preparacion de medios fue determinar: 1) si las condiciones de mezcla para la fabricacion para el Medio 4 eran suficientes para cumplir con los tiempos de mezcla de la receta de control de calidad especificados, y 2) para generar datos de rendimiento del tratamiento HTST a escala de fabricacion del Medio 4. Se recogieron muestras del medio antes y despues del tratamiento HTST mediante la conexion aseptica de los colectores de bolsas de recogida de medio de 6 x 20 l (Sartorius Stedim Biotech) a los puertos de toma de muestras del tanque de mezcla de medios y al biorreactor de destino. Para las muestras tomadas antes del tratamiento HTST, los medios se filtraron a traves de un filtro de membrana de capsula de PVDF de 0,1 pm (Millipore) antes de la recogida y, para las muestras tomadas despues de la HTST, los medios se pasaron a traves de la serie de filtros de fabricacion que consiste en un cartucho filtrante de PVDF de doble capa 0,5/0,2 pm pre-filtro (Millipore) y un filtro final de 0,1 pm de nylon (Pall) antes de la recoleccion. Las muestras se utilizaron entonces para los ensayos de rendimiento de cultivo de celulas y pruebas analiticas.
Resultados
En las operaciones HTST a escala piloto y a escala de fabricacion no se produjeron eventos durante el proceso que condujeran al apagado del skid HTST o a dificultades para controlar la temperatura de salida cuando se procesaron volumenes deseados de Medio 4. Por lo tanto, no habia ninguna indicacion de eventos de precipitacion suficientemente importantes como para provocar el ensuciamiento de las superficies del intercambiador de calor o en la posterior filtracion. El Medio 4 procesado a escala piloto estaba visualmente libre de particulas antes de la filtracion final y de su uso en el cultivo de celulas. No se pudieron tomar muestras del Medio 4 procesado a escala de fabricacion antes de la filtracion final debido a la disposicion de los puertos de muestreo para el sistema. Se realizaron pruebas de rendimiento del cultivo celular y pruebas analiticas en el Medio 4 con y sin el tratamiento HTST. Las pruebas analiticas realizadas en el Medio 4 mostraron que se estaban produciendo perdidas de metales traza en el tratamiento HTST lo que sugiere que se estaban produciendo eventos de precipitacion que modifican las concentraciones de los componentes de los medios sin conducir a una precipitacion suficiente para generar dificultades operativas durante el tratamiento HTST. En el tratamiento HTST a escala de fabricacion del Medio 4, los datos de los ensayos de espectrometria de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) y espectrometria de emision optica con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES) mostraron una perdida de Fe (hierro) de un 24 % y una perdida de Cu (cobre) de un 16 % tras un tratamiento termico en relacion con el Medio 4 no sometido a tratamiento termico (Fig. 9).
En las operaciones HTST a escala piloto y a escala de fabricacion se produjeron eventos durante el proceso que condujeron al apagado del skid HTST y a dificultades para controlar la temperatura de salida cuando se procesaron volumenes deseados de Medio 1 a pH 7,10. Los eventos de precipitacion fueron suficientemente significativos para dar lugar al ensuciamiento de las superficies del intercambio de calor. El Medio 1 procesado a escala piloto presentaba particulas antes de la filtracion final y de su uso en el cultivo de celulas. No se pudieron tomar muestras del Medio 1 procesado a escala de fabricacion antes de la filtracion final debido a la disposicion de los puertos de muestreo para el sistema. El ajuste del pH del Medio 1 a aproximadamente pH 6,34 redujo la precipitacion. En las operaciones HTST a escala piloto y a escala de fabricacion no se produjeron eventos durante el proceso que condujeran al apagado del skid HTST o a dificultades para controlar el punto de ajuste de temperatura de salida cuando se procesaron volumenes deseados de Medio 1 a pH 6,34. Por lo tanto, no habia ninguna indicacion de eventos de precipitacion suficientemente importantes como para provocar el ensuciamiento de las superficies del intercambiador de calor. El Medio 1 procesado a escala piloto estaba visualmente libre de particulas antes de la filtracion final y de su uso en el cultivo de celulas. No se pudieron tomar muestras del Medio 1 procesado a escala de fabricacion antes de la filtracion final debido a la disposicion de los puertos de muestreo para el sistema.
Ejemplo 5: Los niveles de pH, calcio y fosfato contribuyen a la perdida de metales traza en los medios durante el tratamiento termico para inactivacion virica.
Materiales y procedimientos
Preparacion de medios
Los medios utilizados en este estudio incluyen medios basales de produccion y medios de alimentacion discontinua a niveles de pH en un intervalo de aproximadamente pH 5,9 a aproximadamente pH 7,5, intervalos de concentracion de calcio de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 3,5 mM (o mayor en los medios indefinidos), intervalos de concentracion de fosfato de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 6,5 mM (o mayor en los medios indefinidos) e intervalos de concentracion de hierro de aproximadamente 0 pM a aproximadamente 125 pM (o mayor en los medios indefinidos). Todos los medios se prepararon utilizando agua purificada desionizada procesada a traves de un sistema de purificacion de agua ultrapura Millipore SuperQ. Los medios se prepararon utilizando los caldos de medio en polvo apropiado (SAFC y Life Technologies). Se utilizaron una sonda de pH de electrodo de vidrio (Mettler Toledo)
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y un osmometro (Advanced Instruments) durante las preparaciones liquidas para garantizar el pH y la osmolalidad objetivo de una preparacion dada. Tras la disolucion completa de los componentes y los ajustes finales de pH y osmolalidad, los medios se filtraron usando filtros de membrana PES de tamano de poro de 0,1 pm en frascos que variaban desde 250 ml a 1 l (Corning) para las preparaciones a pequena escala.
Ajuste del pH
La desviacion de pH debida a la liberacion de gases que se produjo durante el tiempo transcurrido entre la finalizacion de la preparacion del medio y la aplicacion del tratamiento termico se corrigio. Antes del tratamiento termico, una alicuota de 30 ml de cada preparacion de medio se transfirio a tubos de 50 ml (Falcon) y las tapas de los tubos Falcon originales se reemplazaron por tapas ventiladas de matraces Erlenmeyer de 250 ml de Corning. Los tubos se colocaron a continuacion en una incubadora con corriente de CO2 durante 30 minutos para reducir el pH (CO2 al 15 % para muestras a pH 6.2 y CO2 al 12 % para las demas muestras, 200 rpm, 37 0C); este paso fue capaz de reducir el pH por debajo del valor objetivo. Los tubos se agitaron manualmente mientras se monitorizaba el pH utilizando una sonda de pH con electrodo de vidrio y un medidor (Mettler Toledo) hasta que el pH volvio de nuevo a un valor por encima del pH objetivo. Las mediciones finales de pH se realizaron con un analizador NOVA bioprofiler.
Procedimiento en bano de arena
Para el procedimiento en bano de arena, 22 ml de medio liquido preparado se transfirieron a recipientes a presion de vidrio de 20 ml (vidrio Ace). Los recipientes se sellaron con una tapa roscada con vaina (thermowell) para que no quede ningun espacio de cabeza de aire en el recipiente al llenarlo completamente y permitir que el exceso de medio sea desplazado por la tapa y el thermowell. El exterior del recipiente se limpio para evitar el ensuciamiento de la superficie exterior con los medios expuestos directamente a la matriz de la fuente de calor. Se utilizo cinta de teflon para cubrir la interfaz entre el borde del recipiente de vidrio y la tapa roscada para mejorar el sellado del recipiente de vidrio a presion y evitar que la arena o el aceite del deposito del termopar entraran en contacto con las muestras para el tratamiento termico. Se configuro un bano de arena fluidizado (Techne SBS-4) con regulador de temperatura (Techne TC-8D) (presion de entrada de aire comprimido = 5 kPa, temperatura del bano = 110 0C) y se dejo equilibrar durante 30 minutos. Los termopares conectados a un unico termometro digital VWR se insertaron en los thermowells de los recipientes de muestra geometricamente situados en el centro de la dimension radial del tubo. Se anadio aceite de silicona al deposito del termopar para proporcionar un medio de transferencia de calor entre la pared de vidrio del deposito del termopar y el termopar. Los recipientes de las muestras se colocaron en el bano de arena y se puso en marcha un temporizador. Se registraron datos cineticos de temperatura aproximadamente cada 30-60 segundos. Cuando un recipiente alcanzo 102 0C segun las lecturas del termometro, se mantuvo en el bano de arena durante un periodo de mantenimiento de 10 segundos. Tras los pasos de calentamiento y mantenimiento, los recipientes se transfirieron a un bano de agua a temperatura ambiente hasta que la lectura de temperatura del termometro alcanzo 35 0C. Despues del tratamiento termico, 15 ml de cada muestra se transfirieron a un vial para realizar mediciones de turbidez y visuales.
HTST a escala piloto
Para los estudios que utilizan HTST a escala piloto, las formulaciones de medios se procesaron desde la concentracion mas baja hasta la concentracion mas alta de calcio o de fosfato con el fin de minimizar la posible transferencia a ejecuciones posteriores Cada ejecucion HTST requirio 15 l a 20 l de medio para eliminar el agua de enjuague desionizada utilizada entre ejecuciones y para equilibrar la bobina de calentamiento a la temperatura de funcionamiento de 102 0C (intervalo aceptable: 97 °C-110 0C) para el proceso HTST. Tras el equilibrado, se procesaron aproximadamente 20 l de medio en el skid HTST y el flujo de salida se recogio en un contenedor de plastico. Se recogieron muestras del medio antes del tratamiento HTST del tanque de mezcla de medios y del medio de salida en el contenedor, y se filtraron a traves de un filtro de membrana de capsula de PVDF de 0,1 pm (Millipore) a una bolsa de almacenamiento del medio para servir como las muestras “Pre-HTST” y “Post-HTST”. Todas las muestras de medios filtrados procesadas y no procesadas se almacenaron entonces a 2-8 0C antes de su uso en ensayos de rendimiento de cultivo celular y pruebas analiticas.
HTST a escala de fabricacion
Se utilizo una preparacion de Medio 4 de 1800 l para una ejecucion de ingenieria en apoyo de una campana de produccion de anticuerpos y se utilizo el skid HTST U1281 a escala de fabricacion para tratar el medio. El proposito de esta preparacion de medios fue determinar: 1) si las condiciones de mezcla para el Medio 4 eran suficientes para cumplir con los tiempos de mezcla de la receta especificados, y 2) para generar datos de rendimiento del tratamiento HTST a escala de fabricacion del Medio 4. Se recogieron muestras del medio antes y despues del tratamiento HTST mediante la conexion aseptica de los colectores de bolsas de recogida de medio de 6 x 20 l (Sartorius Stedim Biotech) a los puertos de toma de muestras del tanque de mezcla de medios y al biorreactor de destino. Para las muestras tomadas antes del tratamiento HTST, los medios se filtraron a traves de un filtro de membrana de capsula de PVDF de 0,1 pm (Millipore) antes de la recogida y, para las muestras tomadas despues de la HTST, los medios se pasaron a traves de la serie de filtros GMP que consiste en un cartucho filtrante de PVDF de doble capa 0,5/0,2 pm pre-filtro (Millipore) y un filtro final 0,1 pm de nylon (Pall) antes de la recoleccion. Las muestras se utilizaron entonces para los
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ensayos de rendimiento de cultivo de celulas y pruebas analiticas.
Mediciones de precipitacion
La precipitacion de las muestras de medios se analizo antes y despues del tratamiento termico por dos procedimientos: 1) medicion de turbidez mediante un turbidimetro (2l00Q Hach); y 2) centrifugacion de las muestras en tubos Falcon de 50 ml a 10 000 x g durante 10 minutos (Sorvall RC 6 plus, rotor SS-34) para obtener el sedimento de precipitado para la identificacion visual y la determinacion cualitativa de precipitacion basada en el tamano de granulo (por ejemplo, cantidad nula, baja, moderada o alta de precipitado visible). Las muestras no centrifugadas tambien se analizaron para la identificacion visual de la precipitacion.
Analisis de los cambios en la concentracion de componente de medios
Los sobrenadantes pre-HTST y post-HTST tratados se analizaron para detectar cualquier cambio significativo en las concentraciones de componentes de medios medibles. Los ensayos usados incluyen: medicion de vitaminas solubles en agua, medicion de aminoacidos y medicion de fosfato inorganico. Los oligoelementos se analizaron mediante dos ensayos diferentes de espectrometria de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS). Ademas, las muestras para el hierro, cobre y zinc se midieron mediante un ensayo de espectrometria de emision optica con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-OES) para una cuantificacion de mayor rendimiento de estos elementos. Todos los analisis estadisticos, en caso aplicable, se realizaron y representaron graficamente utilizando el software JMP y Excel.
Resultados
Con el fin de comprender mejor las perdidas de metales traza que se producen a las escalas de fabricacion mas grandes, se realizaron estudios en bano de arena usando el Medio 4 como una formulacion de medio modelo. Para determinar si las perdidas de metales traza estaban asociadas a los eventos de precipitacion de fosfato de calcio en medios que contienen dichos componentes y que se procesan a pH neutro o superior, se genero un diseno semifactorial para evaluar el efecto de variar el pH, calcio (Ca), fosfato inorganico (PO4), hierro (Fe) y cobre (Cu) sobre los niveles de Fe y Cu recuperados tras un tratamiento termico (Tabla 5).
Tabla 5. Concentraciones de componentes probados
Factores
Concentraciones
pH
5,9 - 7,5
Ca (mM)
0 - 3,5
PO4 (mM)
0 - 6,5
Fe (pM)
0 - 125
Cu (nM)
0 - 1750
Nota: Con la excepcion de los factores anteriores, el resto de componentes del Medio 4 se encontraban en niveles normales
El analisis de la recuperacion de metales traza demostro que los niveles altos de pH, Ca y PO4 fueron los principales factores responsables de las perdidas de Fe (Fig. 10). Un aumento de los niveles de uno cualquiera de estos tres factores conduce a menores recuperaciones de Fe. La concentracion inicial de Fe muestra un efecto principal similar, pero menor en comparacion con los niveles de pH, Ca, y PO4, mientras que el nivel de Cu no muestra practicamente ningun efecto sobre la recuperacion de Fe. La importancia de los niveles de pH, Ca y PO4 esta de acuerdo con la posibilidad de que las perdidas de Fe esten relacionados con eventos de precipitacion de fosfato de calcio que no son perceptibles desde una perspectiva operacional (por ejemplo, no lo suficientemente importantes para causar problemas operativos en el skid HTST), pero que son perceptibles desde la perspectiva de los efectos adversos sobre el rendimiento de los medios de cultivo celular (por ejemplo, titulo de producto, crecimiento celular, viabilidad celular y calidad del producto).
Con el fin de explicar la varianza o dispersion en las principales representaciones graficas de efectos, se genero un modelo factorial completo a partir de los datos usando los cuatro factores mas potentes (pH, Ca, PO4 y Fe). Los graficos de interacciones de este analisis demuestran dos efectos de interaccion que influyen en las recuperaciones de Fe despues del tratamiento termico: 1) pH*Ca y 2) pH*PO4 (Fig. 11). Estos resultados sugieren que se requiere reduccion de las concentraciones de calcio y fosfato, reduccion de los niveles de pH o reduccion de alguna combinacion de los tres factores con el fin de generar formulaciones de medios que eviten perdidas de Fe tras el tratamiento termico. Ademas, estos datos demuestran que la perdida de Fe se produce incluso cuando no se observa precipitacion visible ni un aumento de la turbidez.
Un medio con niveles de sulfato ferroso en el intervalo de 75 a 150 pM (pero por lo demas equivalente al Medio 4) se sometio a pruebas para determinar el alcance de la relacion entre los niveles de Fe post-HTST y los niveles iniciales de Fe. Los datos muestran una relacion no lineal inesperada entre la concentracion inicial de Fe y la concentracion post-HTST de Fe (Fig. 12). Sin embargo, se descubrio que la muestra de Fe 125 pM experimento una variacion de pH en relacion con las otras tres muestras. En ambos conjuntos de muestras, la muestra de Fe 125 pM tenia el pH mas alto antes de la prueba HTST. El pH vario entre 7,08 y 7,17 y entre 7,09 y 7,14 para los conjuntos de muestras del
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Ensayo 1 y del Ensayo 2.
Los resultados del experimento DoE sugirieron que el medio a pH 7,0 estaba cerca de producir un fallo en el sistema de tratamiento termico en bano de arena y que la perdida de Fe comienza a producirse por encima de pH 6,7. Preparaciones del Medio 4 con niveles de pH en el intervalo de 6,6 a 7,2 se sometieron a pruebas para caracterizar este regimen. La evidencia de que cualquier variacion de pH (incluso una de tan solo una fraccion de una unidad de pH) puede ser significativa en el sistema de tratamiento termico en bano de arena se muestra en los datos de la valoracion de pH a alta resolucion (Fig. 13A). A partir de pH 6,8, la recuperacion de Fe fue muy sensible al pH, cayendo rapidamente y llegando a una meseta a pH 7,2. Esta fuerte dependencia del pH sugirio que los resultados de las valoraciones de sulfato ferroso se habian confundido muy probablemente por la variabilidad del pH. Tambien sugiere que un cambio muy pequeno en el pH (es decir, 0,2 unidades de pH) podria colocar las formulaciones de medios en un regimen en el que no se producen perdidas de Fe.
Los resultados del experimento DoE tambien sugirieron que se podian conseguir grandes mejoras en la recuperacion de Fe con cambios relativamente pequenos en los niveles de Ca y PO4 (Fig. 13B). Preparaciones del Medio 4 con niveles de Ca y PO4 que van desde 0,5 a 1,17 veces los niveles estandar del Medio 4 se sometieron a pruebas para cuantificar mejor los cambios en Ca y PO4 que serian necesarios para conseguir el beneficio observado con anterioridad. Para esta valoracion, la relacion de los niveles de Ca y PO4 se mantuvo constante a 0,5. El analisis de los datos graficos demostro un perfil curvado con mayor perdida de Fe cuanto mayores son los niveles de Ca y PO4 (Fig. 13B). La formulacion del Medio 4 se encuentra en la parte de la pendiente mas pronunciada, donde es posible conseguir grandes mejoras en la recuperacion de Fe con pequenos cambios en las concentraciones de Ca y PO4. Por ejemplo, la disminucion de las concentraciones de Ca y PO4 en un 30 % (y manteniendo la misma relacion) puede dar lugar a una recuperacion de Fe del 100 % tras un tratamiento termico en bano de arena que se puede trasladar a un tratamiento HTST.
Si las perdidas de metal traza se correlacionaron con la precipitacion de fosfato de calcio, deberia existir una relacion entre la recuperacion de calcio y fosfato y la recuperacion de Fe. El analisis de los datos demostro que la recuperacion de fosfato no muestra una relacion clara con la recuperacion de Fe cuando las recuperaciones de Fe eran bajas y se identifico precipitacion (Fig. 14, los diamantes dentro de un circulo). Es posible que la deteccion de pequenas diferencias de concentracion en la muestra con alta concentracion inicial relativa de fosfato fuera dificil debido a la relacion senal-ruido. Relacionando esto con la posibilidad de que el fosfato de calcio estuviera interactuando con el hierro, una cantidad relativamente pequena de fosfato podia ser eliminada en estequiometria 1:1 con el hierro y seria dificil detectar la perdida de fosfato. Otra causa potencial puede estar relacionada con el hecho de que el ensayo detecta solamente una forma particular de fosfato inorganico. La recuperacion de calcio estaba en el intervalo de 6080 % y parecia estar linealmente relacionada con la recuperacion de Fe en el intervalo de 10-30 %, cuando las recuperaciones Fe eran bajas y se identifico precipitacion (Fig. 14, los cuadrados dentro de un circulo). El analisis de ese subconjunto de datos con una regresion de minimos cuadrados demostro que un 69 % de la varianza en la recuperacion de Ca podia explicarse por la recuperacion de Fe. Estos datos muestran que el Fe esta directamente vinculado a la recuperacion de Ca.
Tambien se realizaron ejecuciones de tratamiento HTST a escala piloto y escala de fabricacion del Medio 4 (y variaciones del Medio 4) y del Medio 9. Se obtuvieron datos de las ejecuciones realizadas para ensayos analiticos y para estudios de rendimiento del cultivo celular para evaluar el impacto del tratamiento HTST sobre el rendimiento del cultivo celular y la calidad del producto. En las pruebas analiticas no se identificaron perdidas significativas de ningun componente, con la excepcion de hierro y cobre. Ademas, no se observaron cambios significativos en los parametros clave de rendimiento del cultivo celular (titulo, crecimiento, viabilidad) ni en la calidad del producto (incluyendo variantes basicas). La perdida de cobre no dio lugar a cambios en el rendimiento del cultivo celular ni en los niveles de variantes basicas, ya que las perdidas no eran lo suficientemente grandes como para provocar cambios ilicitos en la linea de celulas huesped utilizada para las pruebas basadas en las valoraciones de cobre para esa linea celular. Las cantidades relativamente pequenas de metales traza tales como hierro y cobre (75 pM y 1 pM, respectivamente) en comparacion con el calcio y el fosfato (1,5 mM y 3 mM, respectivamente) en las formulaciones del Medio 4 permitieron la formacion de cantidades muy escasas de precipitados de fosfato de calcio (complejos de CaPO4) que no dieron lugar a un ensuciamiento significativo de los intercambiadores de calor, pero que podian interactuar con el hierro y el cobre presentes en el medio liquido. Estas interacciones de complejos de CaPO4 pueden quelar el hierro y el cobre de alguna manera para secuestrarlos del medio liquido y depositarlos en algun lugar dentro del flujo de proceso, junto con los complejos de CaPO4 que precipitan. Independientemente del mecanismo, el hecho es que se observan perdidas de hierro y cobre tras el tratamiento HTST de los medios, incluso cuando el medio se trata con exito para inactivar virus. Las reducciones de las concentraciones de hierro y de cobre tras el tratamiento HTST podrian influir negativamente en el uso exitoso de los medios sometidos a tratamiento HTST en la fase de produccion posterior si las perdidas son significativas con respecto a las concentraciones de hierro y cobre requeridas para la fase de produccion.
Se llevaron a cabo ejecuciones de tratamiento HTST a escala piloto y escala de fabricacion para siete formulaciones de medios diferentes. Los niveles de hierro en la formulacion del medio se midieron antes del tratamiento HTST y se determinaron los niveles esperados de hierro despues de un tratamiento HTST. El analisis de los niveles de hierro en los medios despues del tratamiento HTST (post-HTST) demostro que el tratamiento HTST habia provocado la perdida de los niveles de hierro. La perdida de hierro fue de un 44 % en el Medio 14, de un 42 % en el Medio 15, de un 20 %
en el Medio 16, de un 1,3 % en el Medio 17 y de un 42 % en el Medio 18 (Fig. 15). El Medio 19 y el Medio 20 se suplementaron con hierro despues del tratamiento HTST.
Se realizaron ensayos de crecimiento de celulas NS0, una linea celular de mieloma murino, en medios de cultivo 5 celular que se habian sometido a tratamiento HTST y se habian suplementado con hierro. El analisis del crecimiento celular demostro que las celulas cultivadas en medios de cultivo celular no tratados por HTST, tanto si se habian suplementado o no con hierro, habian crecido de forma comparable en el tiempo (Fig. 16). En comparacion, las celulas crecieron en cantidades inferiores cuando se cultivaron en medios tratados con HTST y no suplementados con hierro. La adicion de hierro al cultivo celular tratado por HTST permitio la recuperacion del crecimiento celular a niveles 10 mas altos en comparacion con los medios de cultivo celular no tratados por HTST (Fig. 16).
En general, estos datos demostraron que las perdidas de Fe se correlacionan con niveles de calcio, fosfato y pH que sugieren una estrecha relacion entre las perdidas de metales traza y los eventos de precipitacion de fosfato de calcio durante el tratamiento termico, incluyendo aquellos eventos que no son necesariamente detectables como 15 precipitados visibles, cambios significativos de turbidez o problemas operacionales. La perdida de metales traza tales como Fe puede afectar negativamente al rendimiento del cultivo celular en diversas lineas de celulas y a la calidad del producto.

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la inactivacion de virus o bacterias en medios de cultivo celular mientras se mantiene la idoneidad de los medios para el cultivo celular, en donde dicho procedimiento comprende (a) someter el medio de cultivo celular a un tratamiento rapido a alta temperatura (HTST); y (b) ajustar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en nivel de pH, calcio y fosfato, con lo que se suprime la formacion de precipitado, en el que el tratamiento HTST comprende elevar la temperatura del medio hasta al menos aproximadamente 85 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar virus o bacterias presentes en el medio,
    a) en el que el pH se ajusta cuando el medio comprende calcio y fosfato, el pH se ajusta a un nivel bajo adecuado durante la preparacion del medio antes del tratamiento HTST, y el pH se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular;
    b) en el que el nivel de calcio se ajusta cuando el medio comprende fosfato, el nivel de calcio se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de calcio se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular; o
    c) en el que el nivel de fosfato se ajusta cuando el medio comprende calcio, el nivel de fosfato se reduce de modo que se suprime la formacion de complejos que comprenden calcio y fosfato, y el nivel de fosfato se ajusta despues del tratamiento HTST a un nivel adecuado para el cultivo celular.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 que comprende ademas el ajuste de las concentraciones de metales traza, en el que el metal traza se selecciona del grupo que consiste en hierro y cobre, y en el que se eliminan hierro y/o cobre del medio antes del tratamiento HTST.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2 que comprende ademas suplementar el medio con hierro y/o cobre despues del tratamiento HTST para alcanzar un nivel adecuado para el cultivo celular.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el pH se ajusta a aproximadamente 5,0 - 7,2 antes del tratamiento HTST.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el pH se ajusta a aproximadamente 6,9 - 7,2 despues del tratamiento HTST.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se elimina calcio del medio antes del tratamiento HTST.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se elimina fosfato del medio antes del tratamiento HTST.
  8. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentracion total de fosfato y
    calcio en el medio es inferior a aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mM durante el tratamiento HTST.
  9. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los niveles de calcio y de fosfato se ajustan.
  10. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los niveles de pH, de calcio y de fosfato se ajustan.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la temperatura del medio se eleva hasta al menos aproximadamente 93, 95, 97, 99, 101, 102 o 103 grados Celsius durante un periodo de tiempo suficiente para inactivar los virus presentes en el medio.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 1 u 11, en el que la temperatura se eleva durante al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 segundos.
  13. 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el virus se selecciona del grupo que consiste en Parvoviridae, Paramyoxviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae, Togaviridae, Caliciviridae y Picornaviridae.
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