JP2022525361A - ウイルス不活性化のための代替的界面活性剤 - Google Patents

Abstract

バイオマニュファクチャリング操作で使用できる、環境に優しいと考えられる界面活性剤を含む、エンベロープウイルスを不活化するために使用するための界面活性剤。本明細書では、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体中のエンベロープウイルスを不活化する方法であって、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体を得ることと；液体を表１の界面活性剤に、ウイルス不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することと、を含む、方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年３月１９日出願の米国仮特許出願第６２／８２０，３３０号の利益を主張するものである。

バイオマニュファクチャリング操作でＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ１００の代替物として使用できる、環境に優しいと考えられる界面活性剤を含む、エンベロープウイルスを不活化するために使用するための界面活性剤。

ウイルス不活化プロセス工程は、タンパク質治療薬の安全性を確保するために重要である（Ａｒａｎｈａ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００５；１７－２０；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１５，１３（５），１０－１７）。ウイルス汚染物質は、培地、製造場所、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株内の偶発的なウイルス汚染物質を含む様々な原因から発生し得る（Ａｒａｎｈａ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１２，１０（３），１２－１７）。患者の安全を確保するために、バイオ製造業者はＩＣＨ－Ｑ５Ａによって特定されたガイドラインに従い、これには、不活化及び濾過プロセスを含む直交性ウイルスクリアランス工程が含まれる（Ｖｉｒａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｏｒｉｇｉｎ．Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｉ．Ｃ．Ｏ．，Ｅｄ．１９９９；Ｖｏｌ．Ｑ５Ａ）。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル）は、エンベロープウイルスを不活化する不活化界面活性剤として長い間使用されてきた（Ｄｕｒｎｏ，ａｎｄ Ｔｏｕｎｅｋｔｉ，ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，６９（１），１６３－１７２；Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｔｅｐ ｔｏ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｉｎ Ｅ３０４２－１６，ＡＳＴＭ，Ｅｄ．Ｗｅｓｔ Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ，ＰＡ，２０１６）。界面活性剤は、外側のエンベロープ層を作成する膜脂質を可溶化する（Ｌｉｕｍｂｒｕｎｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ２０１５，３９（１），１１８－１２８）、したがって、界面活性剤は、エンベロープウイルスのみを不活性化して、非エンベロープウイルスは不活性化しない（Ｈｅｌｌｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｓｏｌｈｅｉｍ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，３８（１），６５－７０）。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００はウイルスを強力に不活化するが、界面活性剤は環境毒素でもある。１つの影響は、魚の内分泌系への有害な影響である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、ホルモンのエストラジオールを模倣するオクチルフェノールに分解し、ホルモン系内の変化を引き起こす（Ｌａｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０００，５４（１），１５４－１６７）。ＲＥＡＣＨの第５７条、欧州議会の規則（ＥＣ）Ｎｏ １９０７／２００６の委員会規則（ＥＵ）付属書ＸＩＶ、及び化学物質の登録（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）、認可（Ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ）、及び制限（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）（「ＲＥＡＣＨ」）Ｕｎｉｏｎ，Ｅ．，Ｅｄ．２０１７）に関する理事会に記載されているように、欧州委員会は２０２０年までにバイオ製薬会社によるＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の使用を禁止し始めることにしており、したがって、環境に優しい強力なウイルス不活化代替的界面活性剤を特定することが適切である。Ｃｏｎｌｅｙらによる最近の研究は、エンベロープウイルスを不活化できる環境に優しい双性イオン界面活性剤であるラウリルジメチルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）を特定した。（Ｃｏｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１７，１１４（４），８１３－８２０）、及び米国特許出願公開第２０１５０３０６２２３号明細書。米国特許出願公開第２０１６０３３３０４６号明細書は、また、強力なウイルスクリアランス、並びに生態学的安全性を示す多くの界面活性剤を特定している。

米国特許出願公開第２０１５０３０６２２３号明細書 米国特許出願公開第２０１６０３３３０４６号明細書

Ａｒａｎｈａ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００５；１７－２０ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１５，１３（５），１０－１７

そのようなものであるから、エンベロープウイルスの不活性化に効果的な界面活性剤、特に、バイオマニュファクチャリングにおけるウイルスクリアランスプロセス工程内で使用するための、環境に優しいと考えられる界面活性剤が必要とされている。本明細書に記載の本発明は、複数の治療モダリティのためのバイオマニュファクチャリングプロセスに組み込むことができる効果的なウイルス不活化界面活性剤を特定することによって、この必要性を満たす。

本発明は、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体中のエンベロープウイルスを不活化する方法であって、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体を得ることと；液体を表１の界面活性剤に、ウイルス不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、界面活性剤は、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する。一実施形態では、界面活性剤は、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、又はＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０秒～少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも１０分間曝露される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０分間曝露される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の少なくとも２．５倍～少なくとも１０倍又はそれ以上である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも５倍である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも７．５倍である。別の関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも１０倍である。一実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃～２２℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも１５℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも２０℃の温度で行われる。別の実施形態では、不活性化は、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定される。一実施形態では、液体は、目的の組換えタンパク質を含む。一実施形態では、液体は、回収された宿主細胞培養液である。一実施形態では、液体は、回収工程、濾過工程、又はクロマトグラフィー工程を含む単位操作からの流出液流、溶出液、プール、保存物、又は保持物由来である。関連実施形態では、液体は、深層濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから回収される溶出液である。一関連実施形態では、液体は、回収された細胞培養液、深層濾過からの溶出液、親和性クロマトグラフィーからの溶出液、イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液、マルチモーダルクロマトグラフィーからの溶出液、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出液、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの溶出液を含有するプールである。別の関連実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬクロマトグラフィーである。一実施形態では、界面活性剤の濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも１０分である。
本発明は、少なくとも１つのウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる目的の組換えタンパク質を含む液体を得ることと；液体を少なくとも１つの界面活性剤に、液体中のエンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することであって、界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有することと；ウイルス不活性化液体を少なくとも濾過工程又はクロマトグラフィー工程を含む少なくとも１つの単位操作に曝露することと、を含む、目的の組換えタンパク質の精製中にエンベロープウイルスを不活性化するための方法を提供する。一実施形態では、界面活性剤は、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０秒～少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも１０分間曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０分間曝露される。別の関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の少なくとも２．５倍～少なくとも１０倍又はそれ以上である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも５倍である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも７．５倍である。別の関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも１０倍である。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃～２２℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも１５℃の温度で行われる。別の実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも２０℃の温度で行われる。別の実施形態では、不活性化は、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定される。別の実施形態では、液体は、目的の組換えタンパク質を含む。別の実施形態では、液体は、回収された宿主細胞培養液である。別の実施形態では、液体は、回収工程、濾過工程、又はクロマトグラフィー工程を含む単位操作からの流出液流、溶出液、プール、保存物、又は保持物由来である。別の実施形態では、液体は、深層濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから回収される溶出液である。別の実施形態では、液体は、回収された細胞培養液、深層濾過からの溶出液、親和性クロマトグラフィーからの溶出液、イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液、マルチモーダルクロマトグラフィーからの溶出液、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出液、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの溶出液を含有するプールである。一関連実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬクロマトグラフィーである。別の実施形態では、クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；混合モーダル若しくはマルチモーダルクロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される。別の実施形態では、液体は、回収された宿主細胞培養液であり、単位操作は、深層濾過を含む。別の実施形態では、液体は、回収された宿主細胞培養液であり、単位操作は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、液体は、プロテインＡ溶出液であり、単位操作は、深層濾過を含む。別の実施形態では、単位操作は、深層濾過を含む。一実施形態では、単位操作は、精密濾過を含む。一実施形態では、界面活性剤の濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも１０分である。

本発明はまた、単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、目的の組換えタンパク質を発現するように細胞を培養することと；目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；少なくとも２つの単位操作により、目的の組換えタンパク質を含有する液体を処理することであって、少なくとも１つの単位操作中に、目的の組換えタンパク質を含有する液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤と、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で組み合わせる工程が存在することと；単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、界面活性剤は、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０秒～少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも１０分間曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０分間曝露される。別の関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の少なくとも２．５倍～少なくとも１０倍又はそれ以上である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも５倍である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも７．５倍である。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも１０倍である。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃～２２℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも１５℃の温度で行われる。別の実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも２０℃の温度で行われる。別の実施形態では、不活性化は、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定される。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される捕捉クロマトグラフィー工程が挙げられる。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択されるポリッシュクロマトグラフィー工程が挙げられる。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、ウイルス濾過、深層濾過、及びＵＦ／ＤＦから選択される工程が挙げられる。別の実施形態では、ウイルス不活性化工程を含む単位操作は、親和性クロマトグラフィーを含む単位操作の前に行われる。別の実施形態では、親和性クロマトグラフィーを含む単位操作は、ウイルス不活性化工程を含む単位操作の前に行われる。一実施形態では、ウイルス不活性化工程を含む単位操作は、深層濾過を含む単位操作の前に行われる。一実施形態では、上記の方法に従って、単離され、精製された目的の組換えタンパク質が提供される。一実施形態では、上記の方法に従って、単離された目的のタンパク質を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、界面活性剤の濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも１０分である。
本発明はまた、単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、目的の組換えタンパク質を発現するように細胞を培養することと；目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；目的の組換えタンパク質を含有する回収された液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤に、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で曝露することと；少なくとも２つの更なる単位操作により、目的の組換えタンパク質を含有するウイルス不活化液体を処理することと；単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、界面活性剤は、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される。一実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０秒～少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも１０分間曝露される。関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０分間曝露される。別の関連実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される。別の実施形態では、界面活性剤の濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の少なくとも２．５倍～少なくとも１０倍又はそれ以上である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも５倍である。関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも７．５倍である。別の関連実施形態では、界面活性剤の濃度は、そのＣＭＣの少なくとも１０倍である。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃～２２℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも５℃の温度で行われる。関連実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも１５℃の温度で行われる。別の実施形態では、液体の界面活性剤への曝露は、少なくとも２０℃の温度で行われる。別の実施形態では、不活性化は、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定される。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される捕捉クロマトグラフィー工程が挙げられる。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択されるポリッシュクロマトグラフィー工程が挙げられる。別の実施形態において、少なくとも１つの単位操作としては、ウイルス濾過、深層濾過、及びＵＦ／ＤＦから選択される工程が挙げられる。別の実施形態では、ウイルス不活性化工程を含む単位操作は、親和性クロマトグラフィーを含む単位操作の前に行われる。別の実施形態では、親和性クロマトグラフィーを含む単位操作は、ウイルス不活性化工程を含む単位操作の前に行われる。一実施形態では、ウイルス不活性化工程を含む単位操作は、深層濾過を含む単位操作の前に行われる。一実施形態では、上記の方法に従って、単離され、精製された目的の組換えタンパク質が提供される。一実施形態では、上記の方法に従って、単離された目的のタンパク質を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、界面活性剤の濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも１０分である。

本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って、単離され、精製された目的の組換えタンパク質を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って、単離された目的のタンパク質を含む医薬組成物を提供する。

ウイルス不活化特性を有することが確認された構造的に異なる界面活性剤クラス。 質量分析溶出ピークは次のとおりである：Ａ：ＰｒｏＡ精製後のｍＡｂ溶出。Ｂ：検出器からの界面活性剤のクリアランスを確認するために、界面活性剤注入後にブランクランを行った。Ｃ：Ｃ１２Ｅ９界面活性剤（０．０３％）を水中にスパイクした。 同上。 室温（２５℃）及び５℃における界面活性剤とＨＣＣＦの混合物に関する濁度データ。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、三角形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２８）、ダイヤ形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２９）、四角形；界面活性剤を含まない対照、丸形。 同上。 同上。 親和性クロマトグラフィーの前後の界面活性剤スパイクサンプルの％ＨＭＷ及び％ＬＭＷ。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、三角形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２８）、ダイヤ形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２９）、四角形；界面活性剤を含まない対照、丸形；ＴＤＡ－９ 破線及び星形；第２の界面活性剤を含まない対照、破線、白丸。 同上。 同上。 親和性クロマトグラフィーの前後の界面活性剤スパイクＢｉＴＥ（登録商標）＃１サンプルの％ＨＭＷ及び％ＬＭＷ。 ２～８℃で７日間インキュベートした後、界面活性剤をスパイクしたＨＣＣＦサンプルの％ＨＭＷ及び％ＬＭＷ。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、三角形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２８）、ダイヤ形；Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２９）、四角形；界面活性剤を含まない対照、丸形；ＴＤＡ－９ 破線及び星形；第２の界面活性剤を含まない対照、破線、白丸。 同上。 同上。

細胞培養プロセスを使用して治療用生物学的薬剤を製造することは、ウイルス汚染物質を伝播する固有のリスクを伴う。このような汚染物質は、出発原料、製造中の動物由来の試薬の使用、ＧＭＰプロセスの失敗による製造システムの汚染を含む、多くの原因から発生する可能性がある。そのようなものであるから、規制当局は、バイオマニュファクチャリングプロセスに専用のウイルス不活化及びウイルス除去工程を設けることを推奨し、製造業者に全ての生物学的製品からのウイルスの除去及び不活化を検証するよう要求している。

本明細書では、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体中のエンベロープウイルスを不活化する方法であって、少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体を得ることと；液体を表１の界面活性剤に、ウイルス不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することと、を含む、方法が提供される。

本明細書では、少なくとも１つのウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる目的の組換えタンパク質を含む液体を得ることと；液体を少なくとも１つの界面活性剤に、液体中のエンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することであって、界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有することと；ウイルス不活性化液体を少なくとも濾過工程又はクロマトグラフィー工程を含む少なくとも１つの単位操作に曝露することと、を含む、目的の組換えタンパク質の精製中にエンベロープウイルスを不活性化するための方法が提供される。

ウイルスは、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに分類される。エンベロープウイルスは、リポタンパク質膜又は「エンベロープ」で囲まれたカプシドを有する。このエンベロープは、宿主細胞タンパク質及びリン脂質、並びにウイルスが宿主細胞から発芽するときにウイルスを覆うウイルス糖タンパク質で構成される。このエンベロープにより、ウイルスは標的宿主細胞を識別、結合、侵入、及び感染させることができる。しかしながら、この膜のために、エンベロープウイルスは不活化法の影響を受けやすく、一方で、非エンベロープウイルスは、製造されるタンパク質のリスクなしに不活化するのがより困難であるが、これらは濾過法によって除去することができる。

エンベロープウイルスとしては、ヘルペスウイルス科ウイルス、ポックスウイルス科ウイルス、ヘパドナウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、コロナウイルス科ウイルス、オルトミクソウイルス科ウイルス、デルタウイルス属ウイルス、パラミクソウイルス科ウイルス、ラブドウイルス科ウイルス、ブニヤウイルス科ウイルス、フィロウイルス科ウイルス、レトロウイルス科ウイルスなどのウイルスファミリー；並びにヒト免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、コロナウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、及びワクシニアウイルスなどのウイルスが挙げられる。

患者の安全を確保するために、ウイルス不活化は、タンパク質治療薬を製造する際の精製プロセスに必要な要素である。ウイルスの不活化には様々な方法を採用することができ、熱不活化／低温殺菌、ｐＨ不活化、ＵＶ及びガンマ線照射、高強度の広域スペクトル白色光の使用、化学不活化剤、界面活性物質（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の添加、溶媒／界面活性剤処理などが挙げられる。界面活性剤などの界面活性物質（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）は、膜を可溶化するため、エンベロープウイルスを特異的に不活化するのに非常に効果的であり得る。

界面活性剤は、界面活性剤ミセルでタンパク質層を破壊することにより、エンベロープウイルスの外膜を可溶化する（Ｋｒａｇｈ－Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９８，７５（６），２９３２－２９４６）。異種栄養性マウス白血病ウイルス（ｘＭｕＬＶ）及び仮性狂犬病ヘルペスウイルス（ＰＲＶ）を含むエンベロープウイルスの外層は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える特定の界面活性剤によって破壊することができる脂質膜で構成されている。ＣＭＣの上で、界面活性剤はミセルを形成し、膜脂質を可溶化することによってエンベロープ層を破壊する（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ａｌｍｇｒｅｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，１４７（１），１－２１）。

界面活性剤は電荷によって３つのグループ：イオン性、非イオン性、及び双性イオン性に分類できる。非イオン性及び双性イオン性界面活性剤はいずれも、穏やかで、通常、製造されている治療用タンパク質を変性させることはないが、より激しいイオン性界面活性剤はそれらを分解する可能性がある。歴史的に、一般的に使用されているＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などの非イオン性界面活性剤は、目的の治療用タンパク質に影響を与えないため、ウイルスを不活化するために使用されてきた。しかしながら、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などの特定の界面活性剤の使用に関する生態学的懸念により、バイオマニュファクチャリングプロセスでエンベロープウイルスを不活化するために使用できるより「環境に優しい」界面活性剤を特定するための検索が推進されている。

本明細書で使用する場合、「ウイルス不活性化（ｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、「ウイルス不活性化（ｖｉｒａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、「不活性化ウイルス」又はこのような語句と同様のものは、エンベロープウイルスが、細胞に感染、複製、及び／又は増殖することができなくなるように改変されるプロセスを指す。界面活性剤などの界面活性物質が、１つ以上のウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体中のエンベロープウイルスを不活性化する際に非常に有効である。液体は、流出液流、溶出液、プール、保持、又は保存容器から得ることができる。一実施形態では、液体は、プールから得られる。一実施形態では、プールは、精密濾過を含む回収単位操作から得られる。一実施形態では、液体は、流出液流から得られる。

界面活性剤は、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値の０．０１％～１０％、又は０．０１倍～１０倍の濃度（ｗ／ｖ）で液体に添加され得る。特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、界面活性剤のＣＭＣ値の少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも７．５倍、又は少なくとも１０倍である。

液体は、界面活性剤に少なくとも２℃～２２℃又はそれ以上の温度で曝露され得る。特定の実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも２℃若しくはそれ以上、少なくとも５℃若しくはそれ以上、少なくとも７℃若しくはそれ以上、少なくとも１０℃若しくはそれ以上、少なくとも１５℃若しくはそれ以上、少なくとも２０℃若しくはそれ以上、又は少なくとも２２℃若しくはそれ以上の温度で曝露される。特定の実施形態では、温度は、２℃～２２℃、２℃～２０℃、２℃～１５℃、２℃～１０℃、２℃～７℃、又は２℃～５℃である。別の実施形態では、温度は、５℃～２２℃、５℃～２０℃、５℃～１５℃、５℃～１０℃、又は５℃～７℃である。別の実施形態では、温度は、７℃～２２℃、７℃～２０℃、７℃～１５℃、又は７℃～１０℃である。別の実施形態では、温度は、１０℃～２２℃、１０℃～２０℃、又は１０℃～１５℃である。別の実施形態では、温度は、１０℃～２２℃、１０℃～２０℃、又は１０℃～１５℃である。別の実施形態では、温度は、１５℃～２２℃、又は１５℃～２０℃である。一実施形態では、温度は、２０℃～２２℃である。特定の実施形態では、温度は、２℃、５℃、７℃、１０℃、１５℃、２０℃、又は２２℃である。液体は、界面活性剤に最短３０秒～４８時間又はそれ以上曝露され得る。特定の実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又は９０分間曝露される。特定の実施形態では、液体は、界面活性剤に２、３、４、５、６、９、１０、１２、１６、２０、２４、３０、３６、４２、又は４８時間曝露される。特定の実施形態では、液体は、界面活性剤に少なくとも３０秒、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、又は少なくとも９０分間曝露される。特定の実施形態では、濃度はそのＣＭＣの２．５倍であり、時間は少なくとも１０分である。特定の実施形態では、濃度はそのＣＭＣの２．５倍であり、時間は少なくとも３０分である。特定の実施形態では、濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも１０分である。特定の実施形態では、濃度はそのＣＭＣの５倍であり、時間は少なくとも３０分である。

本明細書に開示される方法を使用する任意の程度のウイルス不活化が望ましい。しかしながら、関連する規制当局によって確立されたバイオ医薬品の安全ガイドライン又は規制を満たすために必要な程度のウイルス不活化を達成することが好ましい。

ウイルスを不活化するための、本明細書に記載の界面活性剤などの薬剤の程度又は有効性を決定するために、１つの方法は、細胞変性効果（ＣＰＥ）への影響を監視することである。細胞変性効果には、宿主細胞の溶解などのウイルス感染による宿主細胞の構造変化、又は宿主細胞分裂に影響を与えるウイルスの変化による溶解を伴わない細胞死が含まれる。薬剤への曝露後、宿主細胞におけるそのような影響が検出できない場合、ウイルスは不活性であると見なされる。これは、培養中の細胞が生存して残存している間、細胞培養で細胞変性効果を妥当な期間、例えば５～２０日間引き起こす可能性のあるウイルスの感染力価を決定するために使用される、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定してもよい。活性ウイルスが存在する場合、細胞に対する細胞病原性の影響を顕微鏡を使用して観察することができる。感染した細胞は変形しており、感染していない細胞とは異なっているように見える。結果は、各サンプルのウイルス力価を提供するスピアマン－カーバー方程式で分析され、次いでこれを使用して、ウイルスの総対数減少を計算することができる。使用されている検出方法の限度（通常は約４ｌｏｇ１０）で検出されない場合、不活性化は完了したと見なされる。

本明細書で記載されるとおり、広範囲の構造的変動性、疎水性、及び電荷を有する界面活性剤を、エンベロープウイルスを不活化するためのそれらの有効性について評価した。強力なウイルス不活性化能力を有する界面活性剤を特定した。これらには、ＡＮＡＰＯＥ－Ｃ１２Ｅ９；ＡＮＡＰＯＥ－Ｃ１２Ｅ８；Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート（ＴＤＡ－６）；Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（ＴＤＡ－９）；Ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド；ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオマルトピラノシド；スクロースモノラウレート；ｎ－デカノイルスクロース；ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－３；ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトシド；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－６；ヘキサエチレングリコールモノオクチルエーテル；Ｃ－ＨＥＧＡ（登録商標）－１０；ｎ－ウンデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－チオマルトシド；ＨＥＧＡ（登録商標）－９；ＡＮＡＰＯＥ－Ｘ－４０５；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５；Ｃ－ＨＥＧＡ（登録商標）－１１；Ｔｈｅｓｉｔ；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－マルトシド；ＭＥＧＡ－８；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－グルコシド；ＨＥＣＡＭＥＧ（登録商標）；ＨＥＧＡ（登録商標）－１０；ｎ－オクチル－ｂ－Ｄ－グルコシド；ＨＥＧＡ（登録商標）－８；ＭＥＧＡ－１０；ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド；Ｃ８Ｅ５；ＭＥＧＡ－９；ｎ－ヘキシル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－７；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－４；２，６－ジメチル－４－ヘプチル－ｂ－Ｄ－マルト－ピラノシド；ｎ－デシル－ｂ－Ｄ－マルトシド；及びＣ８Ｅ４などの非イオン性界面活性剤が含まれる。双性イオン界面活性剤には、ＮＤＳＢ－１９５；ＦＯＳ－ＭＥＡ（登録商標）－１０；ＮＤＳＢ－２０１；ＣＨＡＰＳ；ＮＤＳＢ－２１１；ＣＨＡＰＳＯ；ＮＤＳＢ－２２１；Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０；ＮＤＳＢ－２５６；ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３－０８；Ｔｒｉｐａｏ、及びＤＤＭＡＢが含まれる。合成脂質界面活性剤には、ＬｙｓｏＦｏｓ（商標）Ｃｈｏｌｉｎｅ１２、ＬｙｓｏＦｏｓ（商標）Ｃｈｏｌｉｎｅ１４、Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート（Ｎｏｖｅｌ－ＴＤＡ６、ＩｓｏＣ１３Ｅ６）、及びＡｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（Ｎｏｖｅｌ－ＴＤＡ９、Ｉｓｏ－Ｃ１３Ｅ９）が含まれる。

いくつかのエンベロープウイルスに対するウイルス不活化に陽性であった界面活性剤の中には、化学物質の安全性に関する欧州連合指令６７／５４８ ／ＥＣに従って現在危険ではないと見なされているものがいくつかある：ＡＮＡＰＯＥ－Ｃ１２Ｅ９ ＣＡＳ番号：３０５５－９９－０；ＡＮＡＰＯＥ－Ｃ１２Ｅ８ ＣＡＳ番号：３０５５－９８－９；Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート（ＴＤＡ－６） ＣＡＳ番号９０４３－３０－５；Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（ＴＤＡ－９）、ＣＡＳ番号９０４３－３０－５；Ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド ＣＡＳ番号：８５６１８－２０－８；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－３ ＣＡＳ番号：１８１１３５－５８－０；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－４ ＣＡＳ番号：１８１１３５－５７－９；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５ ＣＡＳ番号：２５０６９２－６５－０；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－６ ＣＡＳ番号：２２８５７９－２７－９；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－７ ＣＡＳ番号：３４９４７７－４９－２；Ｆｏｓ Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０ ＣＡＳ番号：７０５０４－２８－８；ｎ－ヘキシル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド ＣＡＳ番号：５９０８０－４５－４；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－グルコシド ＣＡＳ番号：６９９８４－７３－２；ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオマルトピラノシド ＣＡＳ番号：１４８６１６－９１－５；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－チオマルトシド ＣＡＳ番号：１４８５６５－５５－３；ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド ＣＡＳ番号：６９２２７－９３－６；ｎ－デシル－ｂ－Ｄ－マルトシド ＣＡＳ番号：８２４９４－０９－５；ｎ－ウンデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド ＣＡＳ番号：２５３６７８－６７－０；ｎ－ノニル－ｂ－Ｄ－チオマルトシド ＣＡＳ番号：１０６４０２－０５－５；ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトシド ＣＡＳ番号：９３９１１－１２－７；及びｎ－オクチル－ｂ－Ｄ－グルコシド ＣＡＳ番号：２９８３６－２６－８。

これらの「環境に優しい」界面活性剤の４つのグループは、同様の分子構造に基づいて選択され、「ＣＹＭＡＬ」、「Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ」、「Ａｎａｐｏｅ」、及び「チオグルコシド」とラベル付けされた（図１）。これらの各グループの界面活性剤は、温度、時間、濃度、製品モダリティ、ウイルスの種類、並びに毒性及び界面活性剤の強力なクリアランスなどのパラメーターに基づいて、ウイルスの不活化について更に分析した。

界面活性剤ウイルス不活性化データの大規模なセットに基づいて、アルキル及びエトキシレート鎖長を含む不活化に影響を与える傾向が特定された。驚くべきことに、アルキル鎖長は、ウイルス不活性化活性に影響を与えた。１個又は２個の炭素のアルキル鎖を有するＣＹＭＡＬ（登録商標）は、ウイルス不活性化に影響を及ぼさないが、３～７個の炭素のアルキル鎖を有するＣＹＭＡＬ（登録商標）は、ウイルスを不活性化させた。Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅｓ（登録商標）についても同様の観察結果であった。８個又は９個の炭素リンカー鎖を有するＦｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅｓ（登録商標）は、ウイルス不活性化に影響を及ぼさないことが分かったが、１０個の炭素リンカー鎖を有するＦｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）は、ウイルスを不活性化させた。Ａｎａｐｏｅ界面活性剤は、アルキル鎖及びエトキシレート鎖で構成されており、名前の中にアルキル炭素（Ｃ）とエトキシレート基（Ｅ）の数が表されており、例えば、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９は、１２個のアルキル炭素及び９エトキシレート基を有する。Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９及びＡｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート（ＴＤＡ－６）、並びにＡｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（ＴＤＡ－９）には、ウイルスの強力な不活性化が見られたが、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１０Ｅ９、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１０Ｅ６、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ１０、及びＣ１３Ｅ８には、見られなかった。

Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９、Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート（ＴＤＡ－６）、及びＡｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（ＴＤＡ－９）、並びにＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドは、いくつかの重要な治療モダリティ：モノクローナル抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、及び融合タンパク質の存在下でのウイルス不活化において特に強力であった。これらの界面活性剤は、５℃～１５℃の低温で３０秒から３０分の間に完全なウイルス不活化を示した。

界面活性剤のウイルス不活性化は、バイオマニュファクチャリングの下流プロセスの１つ以上の工程で行われ得る。界面活性剤のウイルス不活性化は、回収物の清澄化の後、及び親和性クロマトグラフィー工程の前；親和性クロマトグラフィー工程の後、及び深層濾過及び／ポリッシュクロマトグラフィー工程の前；ポリッシュクロマトグラフィー工程の間；ウイルス濾過工程及び／又はＵＦ／ＤＦ工程の前に行われ得る。

用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、全体を通して互換的に用いられ、一本鎖及び二本鎖核酸の両方を含み、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源、又は自然界に通常見られる配列とは関連しないそれらのいくつかの組み合わせを含む。用語「単離されたポリヌクレオチド」、又は「単離された核酸分子」は、具体的には、合成起源の配列又は通常は自然界に見られない配列を指す。特定の配列を含む単離された核酸分子は、目的のタンパク質を発現する配列に加えて、最大で１０若しくは更に最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含み得、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する調節配列を作動可能に連結して含み得、及び／又はベクター配列を含み得る。核酸分子を含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース改変、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合の改変が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、（ｉ）通常、それと共に見出される少なくともいくつかの他のタンパク質若しくはポリヌクレオチドを含まないか、（ｉｉ）例えば同一種等の同一源に由来する他のタンパク質若しくはポリヌクレオチドを実質的に含まないか、（ｉｉｉ）天然ではそれに結合しているポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖質若しくは他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されているか、（ｉｖ）天然ではそれに結合していないポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと（共有結合的若しくは非共有結合的な相互作用によって）操作可能に結合しているか、又は（ｖ）天然には生じないことを意味する。

用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、全体を通して互換的に用いられ、ペプチド結合によって互いに連結される２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ポリペプチド及びタンパク質はまた、天然配列のアミノ酸残基からの１つ以上の欠失、挿入、及び／又は置換を有する高分子も含み、即ち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されるポリペプチド又はタンパク質、或いは、遺伝子操作された細胞又は組換え細胞によって産生され、天然タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基からの１つ以上の欠失、挿入、及び／又は置換を有する分子を含む。ポリペプチド及びタンパク質はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸及びポリマーの化学的アナログであるアミノ酸ポリマーも含む。ポリペプチド及びタンパク質はまた、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ－リボシル化を含むが、これらに限定されない修飾も含む。用語「単離されたタンパク質」、「単離された組換えタンパク質」、又は「精製された組換えタンパク質」は、同じ意味で用いられてもよく、その治療的、診断的、予防的、研究又は他の使用を妨げるタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質から精製される、目的のポリペプチド又はタンパク質を指してもよい。特に、本明細書に記載の本発明を使用して処理された目的の組換えタンパク質から作製された原薬及び医薬品は、「組換えタンパク質製剤」、「組換え生物学的治療薬」と呼ばれ得る。

ポリペプチド及びタンパク質は、タンパク質治療薬を含む科学的又は商業的関心の対象であってもよい。目的のタンパク質は、とりわけ、分泌タンパク質、非分泌タンパク質、細胞内タンパク質、又は膜結合型タンパク質を含む。目的のタンパク質は、本明細書に記載の方法を使用する細胞株で生成することができ、「組換えタンパク質」、「目的の組換えタンパク質」、又は「組換えタンパク質治療薬」と互換的に呼ばれることもある。発現したタンパク質は、細胞内で産生されてもよいか、又はそれを回収及び／又は収集することができる培養媒体中に分泌されてもよい。目的のタンパク質は、例えば、標的、特に以下に列挙し、それらから誘導される標的、それらに関連する標的、及びそれらの改変を含む標的に結合することによって治療効果を発揮するタンパク質を含んでもよい。

目的のタンパク質は、「抗原結合タンパク質」を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、それが結合する別の分子（抗原）に対して強い親和性を有する抗原結合領域又は抗原結合部分を含むタンパク質又はポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質としては、抗体、ペプチボディー、抗体断片、抗体誘導体、抗体類似物、融合タンパク質（単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）及び二重鎖（二価）ｓｃＦｖを含む）、変異体、ｘＭＡｂｓ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ｓｃＦｖは、一体に連結された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する単鎖抗体断片である。米国特許第７，７４１，４６５号明細書及び同第６，３１９，４９４号明細書並びにＥｓｈｈａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９７）４５：１３１－１３６を参照されたい。ｓｃＦｖは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持する。

用語「抗体」は、任意のアイソタイプ又はサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方、又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合領域への言及を含む。特に指定のない限り、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、多特異性、モノクローナル、ポリクローナル、ヘテロＩｇＧ、二重特異性、及びそれらのオリゴマー又は抗原結合断片を含む。抗体は、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、又はｌｇＧ４型を含む。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、一本鎖抗体分子、単一ドメインＶ_ＨＨ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどの抗原結合断片又は領域を有するタンパク質、及び標的ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドも含まれる。

また、ヒトに投与した場合に著しく有害な免疫応答を生じない、ヒト、ヒト化、並びにヒト及びヒト化抗体等の、他の抗原結合タンパク質も含まれる。

また、非共有結合、共有結合、又は共有結合と非共有結合の両方によって化学的に修飾されるタンパク質等の修飾タンパク質も含まれる。また、細胞改変システムによってなされてもよい１つ以上の翻訳後修飾か、又は酵素及び／若しくは化学的方法によって生体外に導入されるか又は他の方法で導入される修飾を更に含むタンパク質も含まれる。

目的のタンパク質はまた、例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分等のような多量体化ドメインを含む組換え融合タンパク質を含んでもよい。また、分化抗原のアミノ酸配列の全て又は一部を含むタンパク質（ＣＤタンパク質と呼ばれる）又はそれらのリガンド或いはこれらのいずれかに略類似するタンパク質も含まれる。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子を含んでもよい。このようなＧ－ＣＳＦ剤としては、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）及びＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）、Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）、Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）、Ｈｅｍａｔｉｄｅ（登録商標）、ＭＲＫ－２５７８、ＩＮＳ－２２、Ｒｅｔａｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンゼータ）、Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）、Ｓｉｌａｐｏ（登録商標）（エポエチンゼータ）、Ｂｉｎｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）、エポエチンアルファＨｅｘａｌ、Ａｂｓｅａｍｅｄ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ｒａｔｉｏｅｐｏ（登録商標）（エポエチンシータ）、Ｅｐｏｒａｔｉｏ（登録商標）（エポエチンシータ）、Ｂｉｏｐｏｉｎ（登録商標）（エポエチンシータ）、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンゼータ、エポエチンシータ、及びエポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＧＬＰ－１受容体アゴニストなどの赤血球形成促進剤（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ （ＥＳＡ））、並びに、それらの分子若しくはバリアント又はそれらの類似体及び前記のいずれかのバイオシミラーも挙げられる。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、１つ以上のＣＤタンパク質、ＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、細胞接着分子、成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーム成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子、骨誘導性因子、インスリン及びインスリン関連タンパク質、凝固及び凝固関連タンパク質、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、他の血液及び血清タンパク質血液型抗原；受容体、受容体関連タンパク質、成長ホルモン、成長ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体；神経栄養因子、ニューロトロフィン、リラキシン、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、インテグリン、リウマチ因子、免疫毒素、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、及びイムノアドヘシンに特異的に結合するタンパク質を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、単独で又は任意の組み合わせで、以下のうちの１つ以上に結合し得る：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７４を含むがこれらに限定されないＣＤタンパク質、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、ＥＧＦ受容体であるＥＧＦＲｖＩＩＩ、細胞接着分子、例えばＬＦＡ－１、Ｍｏｌ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、例えば、血管内皮成長因子（「ＶＥＧＦ」）を含むがこれらに限定されない成長因子、ＶＥＧＦＲ２、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー抑制物質、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ－β等の神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦを含む線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、クリプト、数ある中でも、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、又はＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βを含むトランスフォーム成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳内ＩＧＦ－Ｉ）、及び骨形成促進因子、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様成長因子結合タンパク質を含むがこれらに限定されないインスリン及びインスリン関連タンパク質、数ある中でも、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子等の凝固及び凝固関連タンパク質、プロテインＣ、α－１－アンチトリプシン、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（「ｔ－ＰＡ」）等のプラスミノーゲンアクチベーター、ボンバジン、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン受容体、数ある中でも、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦを含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アルブミン、ＩｇＥ、及び血液型抗原を含むがこれらに限定されない他の血液及び血清タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、成長ホルモン受容体、及びＴ細胞受容体を含む受容体及び受容体関連タンパク質；（ｘ）骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン－３、－４、－５、又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）を含むがこれらに限定されない神経栄養因子；（ｘｉ）リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロレラキシン、例えば、インターフェロン－α、－β、及び－γを含むインターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ１－Ｒ１、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－４受容体及び／又はＩＬ－１３から受容体であるＩＬ－１３ＲＡ２、又はＩＬ－１７受容体であるＩＬ－１ＲＡＰ；（ｘｉｖ）エイズエンベロープウイルス抗原、リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子－α及び－βを含むがこれらに限定されないウイルス抗原、エンケファリナーゼ、ＢＣＭＡ、ＩｇＫａｐｐａ、ＲＯＲ－１、ＥＲＢＢ２、メソセリン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、Ｄｎａｓｅ、ＦＲ－α、インヒビン、及びアクチビン、インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドディスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、ＭＩＣ（ＭＩＣ－ａ、ＭＩＣ－Ｂ）、ＵＬＢＰ １－６、ＥＰＣＡＭ、アドレシン、制御タンパク質、イムノアドヘシン、抗原結合タンパク質、ソマトロピン、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ４、エオタキシン－１、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ｃ－ＭＥＴ、クローディン－１８、ＧＰＣ－３、ＥＰＨＡ２、ＦＰＡ、ＬＭＰ１、ＭＧ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣＡ、ガングリオシドＧＤ２、グラングリオシドＧＭ２、ＢＡＦＦ、ＯＰＧＬ（ＲＡＮＫＬ）、ミオスタチン、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１）、Ａｎｇ２、ＮＧＦ、ＩＧＦ－１受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｃ－Ｋｉｔ、Ｂ７ＲＰ－１、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ－１、プログラムされた細胞死タンパク質１及びリガンド、ＰＤ１及びＰＤＬ１、マンノース受容体／ｈＣＧβ、Ｃ型肝炎ウイルス、メソセリンｄｓＦｖ［ＰＥ３８コンジュゲート、レジオネラニューモフィラ（ｌｌｙ）、ＩＦＮガンマ、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＩＦＮＡＲ、ＴＡＬＬ－１、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、幹細胞因子、Ｆｌｔ－３、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ＯＸ４０Ｌ、α４β７、血小板特異的（血小板糖タンパクＩｉｂ／ＩＩＩｂ（ＰＡＣ－１）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＦＧβ）、透明帯精子結合タンパク質３（ＺＰ－３）、ＴＷＥＡＫ、血小板由来成長因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）、スクレロスチン、及び前記のいずれかの生物活性断片又はバリアント。

別の実施形態では、目的のタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフリベルセプト、アレムツズマブ、アリロクマブ、アナキンラ、アタシセプト、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビオスズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カンツズマブメルタンシン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、コナツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エタネルセプト、エボロクマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、イキセキズマブ、レルデリムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、モテサニブ二リン酸、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシリチド、ニモツズマブ、ニボルマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オプレルベキン、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペニツムマブ、パキセリズマブ、ラニビズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロミプロスチム、ロモソズマブ、サルグラモスチム、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ザノリムマブ、ザルツムマブ、及び前述のいずれかのバイオシミラーを含む。

本発明による目的のタンパク質は、前述の全てを包含し、上記抗体のいずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５、又は６を含む抗体を更に含む。また、目的のタンパク質の基準アミノ酸配列に対して７０％以上、特に８０％以上、より特に９０％以上、更により特に９５％以上、特に９７％以上、より特に９８％以上、更により特に９９％以上のアミノ酸配列が同一である領域を備えるバリアントも含まれる。この点に関する同一性は、種々の周知であり且つ容易に利用可能なアミノ酸配列分析ソフトウェアを用いて特定することができる。好ましいソフトウェアには、スミス－ウォーターマンアルゴリズムを実装するものが含まれ、配列の検索及び整列の問題に対する満足な解決策と考えられる。特に速度が重要な考慮事項である場合には、他のアルゴリズムも採用してもよい。この点に関して用いることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチドの整列及びホモロジーマッチングのために一般に用いられるプログラムには、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＰＲＯＳＲＣＨ、ＢＬＡＺＥ、及びＭＰＳＲＣＨが含まれ、後者は、ＭａｓＰａｒによって作製された超並列プロセッサ上で実行するためのスミス－ウォーターマンアルゴリズムの実装である。

上記の核酸分子を少なくとも１つ含む、プラスミド、発現ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態の発現系及びコンストラクト、並びにそのような発現系又はコンストラクトを含む宿主細胞も本明細書で提供される。本明細書で使用する場合、「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に、並びに／又は宿主細胞内の特定の場所及び／若しくは区画に、伝達並びに／又は輸送するために使用するのに好適な任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ウイルスカプシド、ビリオン、ネイキッドＤＮＡ、複合体化ＤＮＡなど）を意味する。ベクターには、ウイルス及び非ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターが含まれ得る。ベクターは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター及びクローニングベクターと呼ばれることが多い。ベクターを宿主細胞に導入してベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅させることができる。クローニングベクターは、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列及び選択可能なマーカーが一般的に挙げられるが、これらに限定されない配列成分を含有し得る。これらのエレメントは、当業者により必要に応じて選択され得る。

「細胞（Ｃｅｌｌ）」又は「細胞（Ｃｅｌｌｓ）」には、任意の原核細胞又は真核細胞が含まれる。細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、分離しているか、又は組織若しくは臓器などの高次構造の一部として存在し得る。細胞には、「宿主細胞」が含まれ、「細胞株」とも称され、これらは、商業的又は科学的に目的のポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている。宿主細胞は、一般的には時間が制限されずに培養で維持され得る初代培養から生じる系統に由来する。宿主細胞の遺伝子操作には、宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、細胞を組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、トランスフォーム、若しくはトランスダクトすること、及び／又は別の方法で改変すること（例えば、相同組換え及び遺伝子活性化、又は組換え細胞と非組換え細胞との融合によって）を含む。目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／又は細胞株を遺伝子操作するための方法及びベクターは当業者によく知られており、例えば、種々の技術が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０、及び四半期ごとにアップデート）中のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５－６９に説明されている。

宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、従来のトランスフォーメーション手法又はトランスフェクション手法によって原核細胞又は真核細胞に導入することができる。

一実施形態では、細胞は、宿主細胞である。宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、目的のタンパク質を発現し、これは、続いて、培養培地（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）から、又はそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）のために所望されるか又は必要であるポリペプチドの改変及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子によるであろう。

「培養する」又は「培養」は、多細胞生物又は組織の外部での細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当該技術分野において知られている。細胞培養培地及び組織培養培地は、互換的に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養中の宿主細胞の増殖に好適な培地を指す。典型的には、細胞培養培地は、バッファー、塩、エネルギー供給源、アミノ酸、ビタミン、及び微量主要成分を含有する。培養中の適切な宿主細胞の増殖をサポートすることができる任意の培地を使用することができる。特定の培養宿主細胞における細胞増殖、細胞生存率、及び／又は組換えタンパク質産生を最大化するために他の成分を更に補充することができる細胞培養培地は、市販されており、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及び無血清培地、例えばＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズなどが挙げられ、とりわけ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、並びに他の販売業者から入手できる。細胞培養培地は、無血清、無タンパク質、無成長因子、及び／又は無ペプトンの培地であり得る。細胞培養はまた、栄養素の添加によって強化され、通常の推奨濃度よりも高く使用される場合がある。

例えば、ある段階（例えば、増殖段階又は増殖期）から別の段階（例えば、産生段階又は産生期）への移行を容易にするため、及び／又は細胞培養中の条件を最適化するために（例えば、灌流培養中に提供される濃縮培地）、培養の期間中に様々な培地配合物を使用することができる。増殖培地配合物を使用して、細胞増殖を促進し、タンパク質発現を最小限に抑えることができる。産生培地配合物を使用して、目的のタンパク質の産生及び細胞の維持を促進し、新しい細胞の増殖を最小限に抑えることができる。細胞培養の産生段階の過程で消費される、典型的には栄養素及びアミノ酸などのより濃縮された成分を含む培地であるフィード培地を使用して、活性培養、特にフェドバッチ、半灌流、又は灌流モードで操作される培養を補充及び維持することができる。このような濃縮フィード培地は、細胞培養培地の成分の大部分を、例えば、その通常の量の約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、又は更には約１０００倍で含有し得る。

増殖段階は、産生段階よりも高い温度で起こり得る。例えば、増殖段階は、約３５℃～約３８℃の第１温度で起こり得、産生段階は、約２９℃～約３７℃、任意選択的には約３０℃～約３６℃、又は約３０℃～約３４℃の第２温度で起こり得る。加えて、例えば、カフェイン、ブチレート、及びヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学的誘導物質を、温度シフトと同時に、温度シフトの前及び／又は後に添加することができる。誘導物質を温度シフト後に添加する場合は、温度シフト後１時間～５日まで、任意選択的には温度シフト後１日～２日まで添加することができる。

宿主細胞は、懸濁液中で又は付着した形態で、固体基材に付着して、培養され得る。細胞培養は、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクターで、マイクロキャリアの有無にかかわらず確立することができる。

細胞培養は、バッチ、フェドバッチ、連続、半連続、又は灌流モードで操作することができる。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、バイオリアクター内で１００ｍｌ未満から１０００ｍｌ未満の小規模で培養することができる。或いは、１０００ｍｌから２０，０００リットル超の培地を含有する大規模なバイオリアクターを使用することができる。タンパク質治療薬の臨床及び／又は商業規模のバイオマニュファクチャリングなどの大規模の細胞培養は、細胞が所望のタンパク質を産生する間、数週間及び更には数ヶ月間維持することができる。

本明細書では、単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、目的の組換えタンパク質を発現するように細胞を培養することと；目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；目的の組換えタンパク質を含有する回収された液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤に、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で曝露することと；少なくとも２つの更なる単位操作により、目的の組換えタンパク質を含有するウイルス不活化液体を処理することと；単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、を含む、方法が提供される。

本明細書では、単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、目的の組換えタンパク質を発現するように細胞を培養することと；目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；少なくとも２つの単位操作により、目的の組換えタンパク質を含有する液体を処理することであって、少なくとも１つの単位操作中に、目的の組換えタンパク質を含有する液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤と、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で組み合わせる工程が存在することと；単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、を含む、方法が提供される。

次いで、発現された組換えタンパク質を含有する細胞培養液を、バイオリアクター内の細胞培養物から回収することができる。浮遊細胞から発現されるタンパク質を収集するための方法は、当該技術分野で既知であり、酸沈殿、凝集などの加速沈降、重力を使用した分離、遠心分離、音波分離、限外濾過膜、精密濾過膜、タンジェント流濾過膜、深層濾過膜、及び砂濾過膜（ａｌｌｕｖｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）を使用した膜濾過を含む濾過が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物によって発現される組換えタンパク質は、当該技術分野で既知のレドックスフォールディングプロセスによって、細胞質内の封入体から回収してもよい。

次いで、１つ以上の単位操作を使用して、残りの細胞培養培地、細胞抽出物、望ましくない成分、宿主細胞タンパク質、不適切に発現されたタンパク質、汚染物質、細菌及びウイルスのような微生物、凝集体などの任意の不純物を取り除いて、清澄化されて回収された細胞培養液中の目的の組換えタンパク質を精製、又は部分的に精製することができる。用語「単位操作」は、液体培養培地などから組換えタンパク質を精製するためのプロセスで実施される機能工程を指す。例えば、操作の単位は、濾過（例えば、組換えタンパク質を含む液体からの汚染細菌、酵母、ウイルス、マイコバクテリア、不純物、及び／又は粒子状物質の除去）、捕捉、エピトープタグの除去、精製、収集、保持、保存、ポリッシング、回収、ウイルス不活性化を伴うことが可能であり、界面活性剤のウイルス不活性化、ウイルス濾過、組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度及び／又はｐＨ調整、及び不要な塩の除去を含む。本明細書に記載の本発明は、原薬の回収から製剤化までの下流プロセスの１つ以上の工程で使用することができる。

例えば、単位操作としては、目的の組換えタンパク質の回収、捕捉、精製、ポリッシング、ウイルス不活化、ウイルス濾過、濃縮、並びに／又は目的の組換えタンパク質を含有する濃度及び配合物の調節などの工程が挙げられ得るが、これらに限定されない。単位操作はまた、回収、クロマトグラフィー若しくは濾過後の捕捉プールなどの、液体をプール、保持、及び／又は保存する工程、並びに回収後などの保持又は保存容器内の液体を含み得る。単一の単位操作は、回収及びウイルスの不活化、又は捕捉及びウイルスの不活化など、同じ操作で複数の目的を達成するように設計することができる。

捕捉単位操作としては、目的の組換えタンパク質に結合する薬剤を含有する樹脂及び／又は膜を利用する捕捉クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）などが挙げられる。このような物質は、当該技術分野で既知であり、及び市販されている。例えば、親和性クロマトグラフィーとしては、例えば、基質結合捕捉メカニズム、抗体又は抗体断片結合捕捉メカニズム、アプタマー結合捕捉メカニズム、及び補助因子結合捕捉メカニズムが挙げられ得る。例示的な親和性クロマトグラフィーとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬが挙げられる。目的の組換えタンパク質は、ポリヒスチジンタグでタグ付けされ、その後、イミダゾール又はエピトープ（ＦＬＡＧ（登録商標）など）を使用してＩＭＡＣから精製され、その後、そのようなエピトープに向けられた特異抗体を使用して精製することができる。

１つ以上の捕捉単位操作は、ウイルス不活性化及びウイルス濾過を含み得る。本明細書で提供される本発明のウイルス不活性化法に加えて、熱不活化／低温殺菌、ｐＨ不活化、ＵＶ及びガンマ線照射、高強度の広域スペクトル白色光の使用、Ｂ－プロピオラクトンなどの化学的不活化剤の添加などが加えられた、ウイルス不活性化のための他の方法がまた、更に使用されてもよい。

液体に含有されていることが知られている、又は含有されていることが疑われるウイルスの不活化は、いつでも行うことができる。生物学的原薬の製造の際、目的の組換えタンパク質を含む液体中のウイルスの不活性化は、１つ以上の独立したウイルス不活性化単位操作で；回収単位操作の一部として；１つ以上の捕捉クロマトグラフィー単位操作の前に、その一部として、若しくはその後に；１つ以上の親和性クロマトグラフィー単位操作の前に、その一部として、若しくはその後に；１つ以上のポリッシュクロマトグラフィー単位操作の前に、その一部として、若しくはその後に；１つ以上のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前に、その一部として、若しくはその後に；混合モーダル若しくはマルチモーダルクロマトグラフィー、及び／若しくはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー単位操作；１つ以上のウイルス濾過単位操作の前に、その一部として、若しくはその後に；並びに／又は限外濾過／ダイアフィルトレーション単位操作の前に、若しくはその後に、行うことができる。一実施形態では、ウイルスの不活化は、回収後に行われる。一実施形態では、ウイルス不活性化は、精密濾過を含む回収単位操作に続いて行われる。一実施形態では、ウイルス不活性化は、捕捉クロマトグラフィー単位操作の前に行われる。一実施形態では、ウイルス不活性化は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程の前に行われる。ウイルスの不活化に続いて、濾過（深層濾過など）又はクロマトグラフィー（プロテインＡクロマトグラフィーなど）を行って、不活化ウイルス、界面活性剤及び界面活性剤などの不活化剤、濁り及び／又は沈殿物を除去する。

ウイルス濾過は、旭化成（Ｐｌａｖｏｎａ（登録商標））及びＥＤＭミリポア（ＶＰｒｏ（登録商標））などの入手可能な市販の精密濾過膜又はナノ濾過膜を使用して実施することができる。

用語「ポリッシング」は、本明細書では、残っている汚染物質、及びＤＮＡ、宿主細胞タンパク質などの不純物；製品固有の不純物、変形製品及び凝集体、並びに最終的な望ましい純度に近い組換えタンパク質を含む液体からのウイルス吸着物を除去するために実施される１つ以上のクロマトグラフ処理工程を指すのに使用される。例えば、ポリッシングは、組換えタンパク質を含む液体を、標的組換えタンパク質又は組換えタンパク質を含む液体中に存在する汚染物質若しくは不純物のいずれかに選択的に結合するクロマトグラフィーカラム又は膜吸収剤に通すことにより、結合及び溶出モードで実施することができる。このような例では、クロマトグラフィーカラム又は膜吸収剤の溶出液／濾液に、組換えタンパク質が含まれる。

ポリッシュクロマトグラフィー単位操作では、フロースルーモード（ここで、目的のタンパク質はクロマトグラフィー媒体を通過する溶離液に含まれ、汚染物質及び不純物はクロマトグラフィー媒体に結合している）又は「結合及び溶出モード」（ここで、目的のタンパク質はクロマトグラフィー媒体に結合し、汚染物質及び不純物がクロマトグラフィー媒体を通過した後、又はクロマトグラフィー媒体から洗い流された後にクロマトグラフィー媒体から溶出する）のいずれかで使用できる薬剤を含有するクロマトグラフィー樹脂及び／又は膜を使用する。このようなクロマトグラフィー法の例としては、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；混合モーダル又はマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）；逆相クロマトグラフィー及びゲル濾過が挙げられる。

本出願で使用される用語は当該技術分野では標準的であるが、特定の用語の定義は、特許請求の範囲の意味の明確さ及び明確さを保証するために本明細書で提供される。単位、接頭辞、及び記号は、ＳＩで受け入れられる形式で示される場合がある。本明細書に記載の数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含み、それを支持する。別段の記載がない限り、本明細書に記載の方法及び手法は、一般に、当技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。特許、特許出願、論文、書籍及び学術論文が挙げられるが、これらに限定されない、本出願で引用される全ての文献又は文献の一部は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の一実施形態に記載されているものは、本発明の他の実施形態と組み合わせることができる。

本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示として意図される本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等の方法及び構成要素が本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示されているもの及び記載されているものに加え、本発明の様々な変更が、前出の説明並びに添付図面から当業者には明らかとなろう。このような変更は添付する特許請求の範囲内にあることを意図している。

実施例１
ウイルスストック
ｘＭｕＬＶ、ＰＲＶ、及びＭＭＶのウイルス株を、Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ ２００８，６（２），４４－５２で先に記載したように生成した。細胞変性効果（ＣＰＥ）を特定するために、ウイルスと互換性のあるインジケーター細胞株を使用した。ｘＭｕＬＶの場合、細胞株ＰＧ４（ネコの星状細胞株）を使用した。ＣＰＥは接種の７日後に測定した。細胞株３２４Ｋを使用して接種１０日後のＭＭＶのＣＰＥを測定し、ＰＲＶの場合はＶｅｒｏ細胞株を３日間のアッセイで使用した。

界面活性剤スクリーニング
９６種類の界面活性剤の初期スクリーニングは、ウイルスクリアランス研究で一般的に使用されるマウスレトロウイルスであるｘＭｕＬＶを使用して実施した。Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＨＲ２－４０６），Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡからの９６ディープウェルプレート上でスクリーニングを実施した。試験された界面活性剤は、非イオン性、双性イオン性、及びイオン性の特性を含む、様々な両性特性を有した。スクリーニングで評価された全ての界面活性剤は、それらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値の１０倍であるか、又はハンプトンキットで示されるように１０％ｗ／ｖであった。１５℃で５％ウイルススパイクを３０分間行った後、各界面活性剤の重複分析を評価した。界面活性剤の不活性化を停止するのに希釈が効果的であることを示すために、５％ｖ／ｖの水スパイクを用いた対照も同時に実行した。複製実行及び対照実行の各々は、細胞毒性及び干渉を減らすために培地で１：３００に希釈し、２５％コンフルエントなＰＧ４付着細胞とインキュベートした。インキュベーション期間後、接種したＰＧ４細胞の任意のＣＰＥについてウェルを分析した。

ＴＣＩＤ５０アッセイは、１０^０－１０^－７からの８つの複製で１：１０の段階希釈で実行した。タンパク質にスパイクされた１０％ｘＭｕＬＶの保持対照溶液は、界面活性剤なしでの分析中に保持され、シード培地の陰性対照も同様であった。全てのサンプルを２５％コンフルエントなＰＧ４細胞で滴定し、３７℃で７日間インキュベートした。プレートを７日目にＣＰＥについて読み取り、前述のように（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，前述）、総ウイルス力価及び対数減少値（ＬＲＶ）についてスピアマン－カーバー方程式で評価した。

拡張したウイルス研究
ｘＭｕＬＶを不活化した界面活性剤のうちの１９種類は、化学物質の安全性に関する欧州連合指令６７／５４８／ＥＣに従って、現在危険ではないと見なされている。これらの界面活性剤は、更に２つのウイルス、別のエンベロープウイルスＰＲＶ、及び非エンベロープウイルスＭＭＶに対して、ＣＭＣ値の５倍で更に試験された。両方のウイルスを５％ｖ／ｖで試験し、それ以外の場合は、上記の最初の界面活性剤スクリーニングで説明したのと同じ条件及びアッセイを使用した。

濃度の研究
Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＣＡＳ番号３０５５－９８－９）、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９（ＣＡＳ番号３０５５－９９－９０）、ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５（ＣＡＳ番号２５０６９２－６５－０）、Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０（ＣＡＳ番号７０５０４－２８－８）、（Ａｎａｔｒａｃｅ，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨにより供給される）、及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド（ＣＡＳ番号８５６１８－２０－８）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、なおもウイルスを不活化するための最低濃度について評価した。臨界ミセル濃度の２．５倍、５倍、及び７．５倍の濃度を、１５℃でｘＭｕＬＶに対して評価し、上記のように界面活性剤とウイルスを３０分間インキュベートした。

温度依存性の研究
Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９、ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５、Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０、及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドを、５℃～２２℃の温度で、ｘＭｕＬＶに対して、並びに３つの異なるタンパク質モダリティである、モノクローナル抗体（ｍＡｂ＃１）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）＃１）、及びＸｍＡｂ融合タンパク質（融合タンパク質＃１）を含有する基質（宿主細胞培養液）で評価した。３０秒、１０分、及び３０分の時点を取り、１：３００に希釈した。これは、前述のように（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，前述）、スピアマン－カーバー法を使用してバッファーマトリックスが毒性及び干渉を引き起こさない希釈であった。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００対照（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｔｅｍａｃｕｌａ，ＣＡ）を１８℃で２回実行した。

界面活性剤の速度論的研究
Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９、ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５、Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０、及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドを３つの時点：３０秒、１０分、及び３０分で、ｘＭｕＬＶに対して、並びに３つの異なるタンパク質モダリティである、モノクローナル抗体（ｍＡｂ＃１）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）＃１）、及びＸｍＡｂ融合タンパク質（融合タンパク質＃１）を含有する基質（宿主細胞培養液）で評価した。３０秒、１０分、及び３０分の時点を取り、１：３００に希釈した。これは、スピアマン－カーバー法を使用してバッファーマトリックスが毒性及び干渉を引き起こさない希釈であった。

界面活性剤のクリアランス
界面活性剤であるＡｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９のクリアランスを、モノクローナル抗体を含有するサンプルに対するプロテインＡクロマトグラフィーの際に評価した。タンパク質サンプル（モノクローナル抗体を含有する宿主細胞培養液）に、０．０３％の界面活性剤をスパイクし、プロテインＡカラムに通した。Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ（商標）ポリフェノール（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）４５０Å、２．１×５０ｍｍカラムで、溶出ピークと界面活性剤をスパイクしたバッファーのクリアランスについて評価した。流量は６５℃で０．５ｍＬ／分であった。０．１％ＴＦＡ／０．１％ギ酸を含む水の固定相Ａ、及び移動相Ｂとして９０％ｎ－プロパノールを用いた５分間のグラジエントを使用して、サンプルを分析した。

拡張した範囲の研究
研究の範囲を拡張して、更に２つのアルキルエトキシレート誘導体を評価した。アルキルエトキシレート界面活性剤であるＩｓｏＣ１３Ｅ６（ＣＭＣ：２９．９１ｍｇ／Ｌ）及びＩｓｏ－Ｃ１３Ｅ９（ＣＭＣ：５７．９７ｍｇ／Ｌ）（Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－６エトキシレート、Ｎｏｖｅｌ－ＴＤＡ６及びＡｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート、Ｎｏｖｅｌ－ＴＤＡ９、（Ａｖａｎｔｏｒ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ；Ｓａｓｏｌ，Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ），ＣＡＳ９０４３－３０－５）としても入手可能）を、３つの濃度：それらのＣＭＣ値の２．５倍、５倍、及び７．５倍で試験した。サンプルは、ｍＡｂ＃１又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）＃１）のいずれかを含有する宿主細胞培養液とともに、５％ＸＭｕＬＶスパイクを用いて５℃でインキュベートした。３つの時点：３０秒、１０分、及び３０分での細胞毒性及び干渉を減少させるために、サンプルを１：３００に希釈した。

ＴＣＩＤ５０アッセイは、１０^０－１０^－７からの８つの複製で１：１０の段階希釈で実行した。タンパク質にスパイクされた５％ＸＭｕＬＶの保持対照溶液は、界面活性剤なしでの分析中に保持され、シード培地の陰性対照も同様であった。全てのサンプルを２５％コンフルエントなＰＧ４細胞で滴定し、３７℃で７日間インキュベートした。プレートを７日目にＣＰＥについて読み取り、前述のように（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，前述）、総ウイルス力価及び対数減少値（ＬＲＶ）についてスピアマン－カーバー方程式で評価した。

結果及び考察
界面活性剤スクリーニング
様々なイオン性、疎水性、及び構造的特性を備えた市販の９６種類の界面活性剤を選択利用して、エンベロープモデルウイルスｘＭｕＬＶに対して初期スクリーニングを実施した。表１に示すように、これらの界面活性剤のうちの５１種類は、複製及び界面活性剤対照のいずれにおいてもＣＰＥは特定されなかった。このグループには、非イオン性、双性イオン性、及び合成脂質界面活性剤が含まれていたが、試験されたイオン性界面活性剤はいずれもウイルスの不活化を示さなかった。

ウイルス不活化について陽性であることが分かった５１種類の界面活性剤のうち、いくつかは構造が類似しており、アルキル鎖リンカーの長さだけが異なる。界面活性剤の構造に基づいて結果を評価することにより、構造クラス内の傾向が観察された。特定された界面活性剤のうちの１９種類は、化学物質の安全性に関する欧州連合指令６７／５４８／ＥＣに従って、現在危険ではないと見なされている（表２）。
これらの「環境に優しい」界面活性剤は、分子構造に基づいて４つのクラスに分けられ、「ＣＹＭＡＬ」、「Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ」、「Ａｎａｐｏｅ」、及び「チオグルコシド」とラベル付けされた（図１）。

ＣＹＭＡＬ（登録商標）界面活性剤は、様々な長さのアルキル鎖によってシクロヘキサンに結合したマルトシド糖を含有する。ＣＹＭＡＬ（登録商標）１～７は、最初のスクリーニングの９６種類の界面活性剤の中にあった。驚くべきことに、１個又は２個の炭素のアルキル鎖を有するＣＹＭＡＬ（登録商標）は、ｘＭｕＬＶウイルスの不活性化に影響を及ぼさなかったが、３～７個の炭素のアルキル鎖を有するＣＹＭＡＬ（登録商標）は、ウイルスを不活性化させた。Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅｓ及びＡｎａｐｏｅ誘導体に影響を与えるアルキル鎖長に関連する同様の驚くべき結果も同様に思われた。８個又は９個の炭素リンカー鎖を有するＦｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅｓは、ウイルス不活性化に影響を及ぼさないことが分かったが、１０個の炭素リンカー鎖を有するＦｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅは、ウイルスを不活性化させた。Ａｎａｐｏｅ界面活性剤は、アルキル鎖及びエトキシレート鎖で構成されており、名前の中にアルキル炭素（Ｃ）とエトキシレート基（Ｅ）の数が表されており、例えば、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９は、１２個のアルキル炭素及び９エトキシレート基を有する。Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９及びＡｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８は、ウイルスを強力に不活性化させることが見出されたが、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１０Ｅ９、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１０Ｅ６、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ１０、及びＣ１３Ｅ８は、見出されなかった（表３）。アルキル鎖長は、分子の全体的な疎水性に起因し、最終的にウイルスエンベロープの分配に影響を与えることがある。脂質エンベロープ層の破壊を誘発するには、特定の範囲の親油性が必要な場合がある。

ウイルス不活化の拡張されたウイルス研究範囲
１９種類の「環境に優しい」界面活性剤を、異なるエンベロープウイルスであるＰＲＶ、及び非エンベロープウイルスであるマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）で更に試験した。１９種類の界面活性剤は全てｘＭｕＬＶと同様にＰＲＶを不活化したが、ＭＭＶには影響を与えなかった。これは、界面活性剤がエンベロープウイルスには影響を与えるが、非エンベロープウイルスには影響を与えないことを示す。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００もエンベロープウイルスにのみ影響を及ぼし、これらの界面活性剤が同様の方法で脂質エンベロープを破壊する可能性があることを示す。

濃度研究
ｘＭｕＬＶの不活性化の必要な最低濃度を決定するために；ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９、ＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０、及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドを、ｘＭｕＬＶ、ＰＲＶ、及びＭＭＶに対して、それらのＣＭＣ値の２．５倍、５倍、及び７．５倍で重複して試験した。試験された全てのウイルスについて、２．５倍のＣＭＣが細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した；したがって、その後の研究は、界面活性剤のＣＭＣ値の５倍で評価した。

温度依存性の研究
Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９、Ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５、及びＦｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０を、３つのタンパク質治療モダリティである、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、及び融合タンパク質（ＸｍＡｂ）の存在下、様々な温度で分析した（表２）。Ａｎａｐｏｅ界面活性剤及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドはいずれも、５℃及び１５℃の両方で３０分で完全な不活性化を示し、これは、製造環境の「最悪な場合のシナリオ」の温度を表す。これらの３つの界面活性剤は、ＢｉＴＥ（登録商標）及びｍＡｂモダリティの両方については、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に匹敵するＬＲＶ値を有し、融合タンパク質のクリアランスについては更に優れている。

ＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ－１０及びＣＹＭＡＬ（登録商標）－５の界面活性剤は、試験したどの温度でも、ｘＭｕＬＶに対して有意な不活化は生じなかった。これらの界面活性剤によるウイルスの不活化は、初期の界面活性剤スクリーニング及びその他の実験中に観察されたため、製品が存在しない場合、サンプルマトリックスとの負の相互作用がある可能性がある。１５℃のプロセス温度で、Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０及びＣＹＭＡＬ（登録商標）－５は、それぞれ、３．８及び０．３９の平均ＬＲＶを有した。温度が界面活性剤に及ぼす影響を解析するために、ＣＹＭＡＬ（登録商標）－５をより高い温度（２２℃）で試験し、これにより、ＬＲＶで約１ｌｏｇの増加がもたらされた。この温度上昇があっても、ＬＲＶはまだ低かった。

界面活性剤の速度論的研究
ウイルス不活性化が起こる速度を評価をするために、３つの時点：３０秒、１０分、及び３０分で試験した。３０秒以内に、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８及びＮ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドについて、試験した３つの治療モダリティ全てに対してｘＭｕＬＶの完全な不活化が観察された。Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９は、ｍＡｂ＃１に対して３０秒で完全な不活化を示し、融合タンパク質＃１及びＢｉＴＥ（登録商標）＃１に対して１０分以内に完全な不活化を示した（表５を参照）。Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９は、試験した３つの治療モダリティ全てで１０分以内に完全なクリアランスを示した。Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９のＣＭＣ値はＡｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８の半分、つまり、同じＬＲＶを実現するために必要な界面活性剤は大幅に少なくなることを意味する。商業用生産量へのスケールアップの場合、この特性は非常に有益である。

Ｆｏｓ－Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）－１０及びＣＹＭＡＬ（登録商標）－５のいずれも、３０分以内で強力なクリアランスはもたらさなかった。

Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８のクリアランス
ウイルス不活化プロセス後に界面活性剤を完全に除去できるようにするために、ｍＡｂを含有する宿主細胞培養液に０．０３％のＡｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８界面活性剤をスパイクし、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して親和性精製した。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、クロマトグラフィー実行後に残された界面活性剤の量を分析した。結果は、プロテインＡクロマトグラフィー工程中に界面活性剤が除去されたことを示す（図２）。

アルキルエトキシレート界面活性剤の拡張された範囲
強力なウイルスクリアランスに必要な界面活性剤の特異性を更に理解するために、分枝したイソプロピル基を組み込んだ更に２つのアルキルエトキシレートを評価した。いずれの界面活性剤もまた、ＣＭＣ値の５倍又はそれを超える濃度でｘＭｕＬＶの強力なクリアランスを有した。高ＬＲＶは、２つの治療モダリティである、ｍＡｂ＃１及びＢｉＴＥ（登録商標）＃１で観察された（表６）。これらの結果は、広範囲のＡｎａｐｏｅ誘導体の強力なウイルス不活性化能力を示す。

実施例２ 濁度
濁度、溶解度、及び高分子量化学腫（ＨＭＷ）で測定した場合、４つの異なるタンパク質モダリティの安定性に悪影響を与えるかどうかを判断するために、３種類の界面活性剤を更に試験した。加えて、ＨＭＷのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）及び低分子量化学種（ＬＭＷ）の還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）で製品品質を測定した。

Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２８）、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９（ＡＰＯ１２９）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を、１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ＃２）、２つの融合タンパク質（融合＃２及び融合＃３）、１つの二重特異性（二重特異性＃１）、及び２つの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）＃１及びＢｉＴＥ（登録商標）＃２）を使用して試験した。

濁度の測定は、界面活性剤スパイクサンプルの安定性を測定するために使用された。サンプルの濁度の増加は、タンパク質分子の沈殿を反映する。

各分子の培養物から収集した、回収された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）１００ｍＬを、４つの条件：界面活性剤を含有しないＨＣＣＦ（対照）、ＡＰＯ１２８を含有するＨＣＣＦ、ＡＰＯ１２９を含有するＨＣＣＦ、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＨＣＣＦにさらした。界面活性剤を、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値の５倍でスパイクした。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ：Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ：１．１ｍＭ、ＡＰＯ１２８：０．５５ｍＭ、ＡＰＯ１２９：０．２５ｍＭ、ＴＤＡ－９：０．４８ｍＭ。

各分子に対して２つのサンプルセットを生成した；１セットを室温で５日間保持した。もう一方のセットを、２～８℃で７日間保持した。各サンプルの濁度を、０、１、２、５、及び７日目に、濁度計（Ｈａｃｈ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ ２１００Ｐ ４６５００－００，Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ＣＯ）を使用して測定した。

図３は、室温及び２～８℃での界面活性剤とＨＣＣＦの混合物の各時点での濁度データを示す。５日目の室温のデータポイントは、サンプルの細菌汚染が原因であり得る最大の変動を示す。ＡＰＯ１２８及びＡＰＯ１２９をスパイクしたサンプルのデータポイントは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００をスパイクしたサンプルのデータポイントと非常に近い傾向にあるか、又は対照よりも濁りが少なかった。これは、試験された界面活性剤のいずれも、異なるタンパク質モダリティの沈殿を引き起こさなかったことを示す。

実験４ 製品品質
パーセント高分子量（％ＨＭＷ）及びパーセント低分子量（％ＬＭＷ）を使用して、界面活性剤をスパイクしたサンプルの安定性を測定した。％ＨＭＷはサンプル中のタンパク質の凝集を測定し、％ＬＭＷはタンパク質のクリッピングを測定した。これらの製品品質属性は、界面活性剤の存在が親和性精製プロセス又は親和性精製された材料の製品品質に影響を与えるかどうかを判断するために、親和性カラム精製の前後に測定された。

１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ＃２）、２つの融合タンパク質（融合＃２及び融合＃３）、１つの二重特異性（二重特異性＃１）、及び２つの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）＃１及びＢｉＴＥ（登録商標）＃２）から回収された細胞培養液及び親和性クロマトグラフィー後のサンプルを試験した。

ＨＣＣＦ親和性クロマトグラフィー前のロード材料及び親和性クロマトグラフィー後のプール材料の１００ｍＬサンプルに、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ８（ＡＰＯ１２８）（０．１１ｍＭ）、Ａｎａｐｏｅ Ｃ１２Ｅ９（ＡＰＯ１２９）（０．０５ｍＭ）、Ａｌｆｏｎｉｃ ＴＤＡ－９エトキシレート（ＴＤＡ－９）（０．１ｍＭ）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．２２ｍＭ）を用いて臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の５倍をスパイクした。界面活性剤を含まないサンプルを対照として使用した。サンプルを、室温で、界面活性剤と、約１時間撹拌した。次いで、それらを製品品質分析に提出する前に２～８℃で７日間保持するか、又は親和性カラムで精製するかのいずれか行ってから製品品質分析に提出した。

回収した細胞培養液を、ＢｉＴＥ＃２用のＧＥ ＣａｐｔｏＣｈｅｌａｔｉｎｇ樹脂（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）及び他の全てのタンパク質モダリティ用のＧＥ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ樹脂（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにかけることによって、親和性カラム後のサンプルを生成した。

各タンパク質モダリティからのＨＣＣＦ親和性クロマトグラフィー前のロード材料の追加の１００ｍＬサンプルに界面活性剤をスパイクし、２～８℃で７日間保持した。

ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して％ＨＭＷを決定し、ｒＣＥ－ＳＤＳを使用して％ＬＭＷを決定することで、製品品質を評価した。

材料の有用性のタイミングにより、２セットの実験を実施した。第１の実験は、４つの条件：界面活性剤を含まない対照、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＡＰＯ１２８、及びＡＰＯ１２９で構成された。第２の実験は、２つの条件：界面活性剤を含まない対照及びＴＤＡ－９で構成された。

図４は、％ＨＭＷ及び％ＬＭＷで測定した親和性捕捉プロセス全体での分子の安定性を示す。データは、界面活性剤を含まない対照の値を差し引くことによって正規化した。ほとんどの分子について、％ＨＭＷ及び％ＬＭＷは、親和性捕捉工程の前後で一定のままであった。ＢｉＴＥ＃２は、親和性クロマトグラフィー後のプール段階で不安定であることが知られていたため、％ＨＭＷの変動が大きくなった。

図５は、親和性後のＢｉＴＥ＃１についての製品品質データを示す。ＢｉＴＥ＃１ＨＣＣＦ（ロード材料）は、親和性クロマトグラフィーの前に製品品質については提出されなかった。

図６は、％ＨＭＷ及び％ＬＭＷで測定した場合、２～８℃で７日間のインキュベーション後も分子の安定性が比較的一定に保たれていることを示す。データは、界面活性剤を含まない対照の値を差し引くことによって正規化した。

界面活性剤は、親和性クロマトグラフィーの際の製品品質に有意な影響を与えなかった。

Claims (55)

1. 少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体中のエンベロープウイルスを不活化する方法であって、
   少なくとも１つのエンベロープウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる液体を得ることと；
   前記液体を表１の界面活性剤に、ウイルス不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することと、
   を含む、方法。
2. 前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、又はＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記液体が、前記界面活性剤に少なくとも３０秒～少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される、請求項１に記載の方法。
5. 前記液体が、前記界面活性剤に少なくとも１０分間曝露される、請求項４に記載の方法。
6. 前記液体が、前記界面活性剤に少なくとも３０分間曝露される、請求項４に記載の方法。
7. 前記液体が、前記界面活性剤に少なくとも６０分間又はそれ以上曝露される、請求項４に記載の方法。
8. 前記界面活性剤の前記濃度が、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の少なくとも２．５倍～少なくとも１０倍又はそれ以上である、請求項１に記載の方法。
9. 前記界面活性剤の前記濃度が、そのＣＭＣの少なくとも５倍である、請求項８に記載の方法。
10. 前記界面活性剤の前記濃度が、そのＣＭＣの少なくとも７．５倍である、請求項８に記載の方法。
11. 前記界面活性剤の前記濃度が、そのＣＭＣの少なくとも１０倍である、請求項８に記載の方法。
12. 前記液体の前記界面活性剤への曝露が、少なくとも５℃～２２℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
13. 前記液体の前記界面活性剤への曝露が、少なくとも５℃の温度で行われる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記液体の前記界面活性剤への曝露が、少なくとも１５℃の温度で行われる、請求項１２に記載の方法。
15. 前記液体の前記界面活性剤への曝露が、少なくとも２０℃の温度で行われる、請求項１２に記載の方法。
16. 前記濃度がそのＣＭＣの５倍であり、前記時間が少なくとも１０分である、請求項１に記載の方法。
17. 不活性化が、ＴＣＩＤ_５０アッセイを使用して測定される、請求項１に記載の方法。
18. 前記液体が、目的の組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記液体が、回収された宿主細胞培養液である、請求項１に記載の方法。
20. 前記液体が、回収工程、濾過工程、又はクロマトグラフィー工程を含む単位操作からの流出液流、溶出液、プール、保存物、又は保持物由来である、請求項１に記載の方法。
21. 前記液体が、深層濾過、精密濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから回収される溶出液である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記液体が、回収された細胞培養液、深層濾過からの溶出液、精密濾過からの溶出液、親和性クロマトグラフィーからの溶出液、イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液、マルチモーダルクロマトグラフィーからの溶出液、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出液、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの溶出液を含有するプールである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬクロマトグラフィーである、請求項２２に記載の方法。
24. 目的の組換えタンパク質の精製中にエンベロープウイルスを不活性化するための方法であって、
    少なくとも１つのウイルスを含有することが知られているか又は含有することが疑われる前記目的の組換えタンパク質を含む液体を得ることと；
    前記液体を少なくとも１つの界面活性剤に、前記液体中のエンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な濃度及び時間で曝露することであって、前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有することと；
    前記ウイルス不活性化液体を少なくとも濾過工程又はクロマトグラフィー工程を含む少なくとも１つの単位操作に曝露することと、を含む、方法。
25. 前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記濃度がそのＣＭＣの５倍であり、前記時間が少なくとも１０分である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記液体が、目的の組換えタンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
28. 前記液体が、回収された宿主細胞培養液である、請求項２４に記載の方法。
29. 前記液体が、回収工程、濾過工程、又はクロマトグラフィー工程を含む単位操作からの流出液流、溶出液、プール、保存物、又は保持物由来である、請求項２４に記載の方法。
30. 前記液体が、深層濾過、精密濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから回収される溶出液である、請求項２４に記載の方法。
31. 前記液体が、回収された細胞培養液、深層濾過からの溶出液、精密濾過からの溶出液、親和性クロマトグラフィーからの溶出液、イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液、マルチモーダルクロマトグラフィーからの溶出液、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出液、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの溶出液を含有するプールである、請求項２４に記載の方法。
32. 前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又はプロテインＬクロマトグラフィーである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；混合モーダル若しくはマルチモーダルクロマトグラフィー、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される、請求項２４に記載の方法。
34. 前記液体が、回収された宿主細胞培養液であり、前記単位操作が、深層濾過を含む、請求項２４に記載の方法。
35. 前記液体が、回収された宿主細胞培養液であり、前記単位操作が、精密濾過を含む、請求項２４に記載の方法。
36. 前記液体が、回収された宿主細胞培養液であり、前記単位操作が、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを含む、請求項２４に記載の方法。
37. 前記液体が、プロテインＡ溶出液であり、前記単位操作が、深層濾過を含む、請求項２４に記載の方法。
38. 前記単位操作が、深層濾過を含む、請求項２４に記載の方法。
39. 前記単位操作が、精密濾過を含む、請求項２４に記載の方法。
40. 単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、
    組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、前記目的の組換えタンパク質を発現するように前記細胞を培養することと；
    前記目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；
    前記目的の組換えタンパク質を含有する前記回収された液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤に、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で曝露することと；
    少なくとも２つの更なる単位操作により、前記目的の組換えタンパク質を含有する前記ウイルス不活化液体を処理することと；
    単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、
    を含む、方法。
41. 前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記濃度がそのＣＭＣの５倍であり、前記時間が少なくとも１０分である、請求項４０に記載の方法。
43. 請求項４０に記載の、単離され、精製された目的の組換えタンパク質。
44. 請求項４０に記載の、単離された目的のタンパク質を含む医薬組成物。
45. 単離され、精製された目的の組換えタンパク質を製造するための方法であって、
    組換えタンパク質を発現する宿主細胞を用いてバイオリアクター内で細胞培養を確立し、前記目的の組換えタンパク質を発現するように前記細胞を培養することと；
    前記目的の組換えタンパク質を含有する細胞培養液を回収することと；
    少なくとも２つの単位操作により、前記目的の組換えタンパク質を含有する前記液体を処理することであって、少なくとも１つの単位操作中に、前記目的の組換えタンパク質を含有する前記液体を、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、ＣＡＳ８５６１８－２０－８、ＣＡＳ１８１１３５－５８－０、ＣＡＳ１８１１３５－５７－９、ＣＡＳ２５０６９２－６５－０、ＣＡＳ２２８５７９－２７－９、ＣＡＳ３４９４７７－４９－２、ＣＡＳ７０５０４－２８－８、ＣＡＳ５９０８０－４５－４、ＣＡＳ６９９８４－７３－２、ＣＡＳ１４８６１６－９１－５、ＣＡＳ１４８５６５－５５－３、ＣＡＳ６９２２７－９３－６、ＣＡＳ８２４９４－０９－５、ＣＡＳ２５３６７８－６７－０、ＣＡＳ１０６４０２－０５－５、又はＣＡＳ９３９１１－１２－７のＣＡＳ登録番号を有する界面活性剤と、エンベロープウイルスの不活性化を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度及び時間で組み合わせる工程が存在することと、
    単離され、精製された目的の組換えタンパク質を得ることと、
    を含む、方法。
46. 前記界面活性剤が、ＣＡＳ３０５５－９９－０、ＣＡＳ３０５５－９８－９、ＣＡＳ９０４３－３０－５、及びＣＡＳ８５６１８－２０－８から選択される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記濃度がそのＣＭＣの５倍であり、前記時間が少なくとも１０分である、請求項４５に記載の方法。
48. 少なくとも１つの単位操作が、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される捕捉クロマトグラフィー工程を含む、請求項４５に記載の方法。
49. 少なくとも１つの単位操作が、イオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択されるポリッシュクロマトグラフィー工程を含む、請求項４５に記載の方法。
50. 少なくとも１つの単位操作が、ウイルス濾過、深層濾過、及びＵＦ／ＤＦから選択される工程を含む、請求項４５に記載の方法。
51. 前記ウイルス不活性化工程を含む前記単位操作が、親和性クロマトグラフィーを含む単位操作の前に行われる、請求項４５に記載の方法。
52. 親和性クロマトグラフィーを含む単位操作が、前記ウイルス不活性化工程を含む前記単位操作の前に行われる、請求項４５に記載の方法。
53. 前記ウイルス不活性化工程を含む前記単位操作が、深層濾過を含む単位操作の前に行われる、請求項４５に記載の方法。
54. 請求項４５に記載の、単離され、精製された目的の組換えタンパク質。
55. 請求項４５に記載の、単離された目的のタンパク質を含む医薬組成物。
    
    

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