TW202421771A - 從灌注培養物收穫產物的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供了使用結合了收穫回收操作的純化方案從宿主細胞諸如哺乳動物細胞純化靶蛋白例如抗體的方法，該等收穫回收操作包括連續固體排放圓盤堆疊式離心步驟，隨後是絮凝和深度過濾步驟。本揭露之蛋白質收穫方法使用非常規但有效的過程從紅血球容積大於或等於16%的灌注培養物中回收高產率的純化的靶蛋白。

Description

從灌注培養物收穫產物的方法

本揭露總體上關於生物分子處理領域，並且更特別地關於從灌注培養物收穫生物分子的領域。

現代醫學在努力解決各種困擾人類和其他動物物種的疾病和病症方面面臨著許多挑戰。對新的且更好的治療的開發超出了開發新的且更好的藥物的努力，該等藥物包括大分子生物化合物或生物製劑，諸如單株抗體（mAb）、抗體片段、抗體樣形式、多特異性抗體、工程化蛋白、生物仿製藥等。近年來，該等努力穩步取得了成果，越來越多的治療活性生物製劑被批准用於人類並滿足了醫學界未滿足的需求。努力開發新治療劑的自然輔助手段係努力改進製造製程，以提高完整的功能性治療性生物製劑的產率，同時保持產品品質，降低生產成本，提高效率和可持續性，並簡化實驗性規模和商業規模生產水平上的生產。

治療性生物製劑的製造係一種涉及生產、回收和純化/精製操作的多步驟製程。生物製劑通常藉由細胞培養物中的宿主細胞表現來生產，該細胞培養物通常為用於從宿主細胞表現所需重組蛋白的哺乳動物細胞培養物。細胞培養後進行收穫或回收操作，其中從生物反應器中取出含有重組蛋白的培養基，並進行初始澄清，以便為從細胞培養液的其他組分中分離和純化靶治療性蛋白做好準備。此類組分包括完整細胞、細胞碎片、過程和產物相關雜質，包括核酸諸如DNA、蛋白質諸如非靶宿主細胞蛋白質和所需治療性蛋白質的高分子量及低分子量變體、脂質、碳水化合物、病毒顆粒等。

隨著細胞培養實踐的改進和紅血球容積、細胞密度、滴定量、過程和產物相關雜質的增加，下游過程面臨著有效分離和純化靶蛋白的壓力。對於灌注培養物（包括連續灌注培養物）的收穫操作尤其如此，其可能會因紅血球容積的增加、雜質水平的增加和滴定量的增加而不堪重負。

出於上述原因，本領域持續需要涉及收穫回收步驟的生物分子（例如，生物製品）純化製程，該收穫回收步驟高效且成本有效地導致生物製劑與由在收穫時紅血球容積（PCV）為至少16%的渾濁灌注培養物產生的其他細胞培養組分的高產率分離。

本揭露提供了一種用於將灌注培養物中產生的重組蛋白與至少一種其他灌注培養物組分分離的方法，該方法包括：(a) 從包含該重組蛋白和至少一種其他灌注培養物組分的灌注培養物中收穫池或洗脫液流，該灌注培養物在收穫時具有至少約16%的紅血球容積（PCV）；(b) 將收穫池或洗脫液流引入到至少一個連續固體排放圓盤堆疊式離心機中；(c) 操作該連續固體排放圓盤堆疊式離心機，從而將流體組分分離成離心分離液和高密度組成物；(d) 收集該離心分離液；(e) 在8°C至12°C的溫度下將絮凝劑添加到該離心分離液中；以及 (f) 對該離心分離液進行過濾步驟。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物從單次使用生物反應器收穫，諸如單次使用500 L生物反應器或2,000 L或更大的單次使用生物反應器。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少180 NTU的濁度。在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少2 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度，或在收穫時具有至少3 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度，或在收穫時具有至少5 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物在收穫時具有至少約20%、或在收穫時具有至少約24%、或在收穫時具有至少約26%、或在收穫時具有至少約30%的PCV。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物在收穫時的溫度為約8°C至約12°C。例如，所揭露的方法中之任一種的灌注培養物在收穫時的溫度為約10°C。

在一些實施方式中，將來自所揭露的方法中之任一種的灌注培養物的連續收穫洗脫液流引入到連續固體排放圓盤堆疊式離心機中。

在其他實施方式中，將所揭露的方法中之任一種的不連續批次的灌注收穫池引入到連續固體排放圓盤堆疊式離心機中。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種的離心分離液的濁度大於約160 NTU，諸如濁度大於約180 NTU、或大於約200 NTU、或大於約250 NTU、或大於約300 NTU、或大於約500 NTU、或大於約600 NTU、或大於約750 NTU。

在一些實施方式中，在約10°C的溫度下將絮凝劑添加到所揭露的方法中之任一種的離心分離液中。在示例性實施方式中，絮凝劑係聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）或其單體二烯丙基二甲基氯化銨（DADMAC），並且添加pDADMAC或DADMAC至至少0.04%（w/w），或添加至0.04%-0.15%（w/w），或添加至0.05%（w/w）。

所揭露的方法中之任一種中，重組蛋白係真核蛋白，諸如哺乳動物蛋白。在一些實施方式中，哺乳動物蛋白係抗原結合蛋白。

在所揭露的方法中之任一種中，重組蛋白係哺乳動物抗原結合蛋白，並且該抗原結合蛋白係單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、雙特異性T細胞接合物分子（BiTE ^®）。

在其他實施方式中，所揭露的方法中之任一種的蛋白係顆粒球群落刺激因子、紅血球生成刺激劑、HER受體、細胞黏附分子、生長因子、骨誘導因子、胰島素、凝血蛋白、群落刺激因子、血型抗原；生長激素、生長激素受體、T細胞受體；神經滋養因子、神經滋養蛋白、鬆弛素、干擾素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整聯蛋白、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、運輸蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白或免疫黏附素。

在一些實施方式中，所揭露的方法中之任一種中的過濾步驟包括深度過濾。可用於所揭露的方法中之任一種的示例性深度過濾器包括MILLISTAK+ ^®C0HC過濾器、MILLISTAK+ ^®C0SP過濾器、SARTOCLEAR ^®DL60過濾器或SARTOCLEAR ^®DL75過濾器。在一個實施方式中，該深度過濾器係MILLISTAK+ ^®C0HC過濾器或MILLISTAK+ ^®C0SP過濾器，並且其中離心分離液以150 LMH或更小的通量率和10 psi或更小的壓力通過該深度過濾器。在一些實施方式中，該壓力為2 psi或更小。在一些實施方式中，該通量率為90至150 LMH。

本揭露還提供了所揭露的方法中之任一種，其進一步包括至少一個另外的層析法步驟。示例性的另外的層析法步驟包括離子交換層析法、疏水相互作用層析法或多模式層析法。

此外，本揭露提供了所揭露的方法中之任一種，其進一步包括至少一或多個病毒過濾步驟、病毒滅活步驟和/或UFDF步驟。

本揭露提供了藉由本文揭露的方法中之任一種製備的靶蛋白。

在另一個實施方式中，本揭露提供了一種用於在源自灌注培養物的負載進料的深度過濾期間維持低壓差的方法，該方法包括以下步驟：獲得源自在收穫時具有至少16%的紅血球容積（PCV）的灌注培養物的絮凝的離心分離液；使該離心分離液以150 LMH或更小的通量率和10 psi或更小的過濾壓差通過該深度過濾器；以及回收洗脫液。

本揭露還提供了用於從灌注培養物生產分離的、純化的重組蛋白的方法，該等方法包括以下步驟：(a) 在單次使用生物反應器中引發灌注培養；(b.) 用經工程化的細胞接種該生物反應器以重組表現目的蛋白；(c.) 培養該等細胞直到該灌注培養物具有至少16%的紅血球容積；(d.) 將該培養物的溫度降低至8°C與12°C之間，並從該生物反應器收集該灌注培養物作為收穫池或洗脫液流；(e.) 將該收穫池或洗脫液流引入到至少一個連續固體排放圓盤堆疊式離心機中，其中該收穫池或洗脫液流在4°C與12°C之間；(f.) 從該離心機收集離心分離液；(g.) 在8°C和12°C之間的溫度下將絮凝劑添加到該離心分離液中；(h.) 使絮凝的離心分離液以90至150 LMH的通量率和10 psi或更小的壓力通過深度過濾器，其中該絮凝的離心分離液在4°C與12°C之間；(i.) 對經過濾的離心分離液進行一或多種層析法、過濾和/或UFDF單元操作；以及 (j.) 獲得分離的、純化的重組蛋白。

在另一個實施方式中，本揭露提供了包含用本文揭露的方法中之任一種生產的分離的、純化的重組蛋白的藥物組成物。

「細胞密度」係指給定體積的培養基中的細胞數目。「活細胞密度」（VCD）係指給定體積的培養基中的活細胞數目，如藉由標準活力測定（諸如台盼藍染料排除法）所測定的。

如本文所用，「紅血球容積」（PCV）也稱為「紅血球容積百分比」（%PCV），係細胞所占體積與細胞培養物總體積的比率，以百分比表示（參見Stettler等人, (2006) Biotechnol Bioeng. [生物技術與生物工程] 12月20日:95(6): 1228-33）。紅血球容積的變化可能由細胞直徑的變化引起。紅血球容積係細胞培養物中固體含量的量度。在收穫期間除去固體。更多的固體意味著在收穫過程中需要花費更多的努力將固體材料與所需產物分離。此外，所需產物可被捕集在固體中並在收穫過程中損失，導致產物產率降低。由於宿主細胞大小不同並且細胞培養物還含有死細胞和垂死細胞以及其他細胞碎片，與細胞密度或活細胞密度相比，紅血球容積係描述細胞培養物內固體含量的更準確的方式。此外，一些細胞在處於生長停滯狀態時尺寸會增加，因此，由於細胞尺寸增加導致生物量增加，生長停滯之前和生長停滯之後的紅血球容積將可能不同。

如本文所用，「離心分離液」係在使細胞培養液經歷連續固體排放圓盤堆疊式離心（諸如單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心）時形成的或正在形成的低密度組成物。在操作中，離心機將細胞培養液分級成低密度組成物和高密度組成物，該高密度組成物含有至少一些最初在細胞培養液中發現的固體。

「靶蛋白」係根據本揭露之方法收穫的天然存在的、合成產生的或重組表現的任何蛋白質、肽或其片段。

「低密度組成物」或「輕相」係「離心分離液」的同義詞，其係指在從輸入流體中除去至少一些固體之後離開圓盤堆疊式離心機的流體。

「高密度組成物」或「重相」係富含顆粒物質的材料，諸如由連續固體排放圓盤堆疊式離心產生的細胞和細胞碎片。

「生物反應器」係適於培養能夠表現靶蛋白的細胞的任何容器。生物反應器的尺寸範圍可以從實驗室規模到商業規模，並且可以具有各種改進，包括泵控制的入口和/或出口、溫度計、CO ₂和/或O ₂計、用於攪拌培養物的裝置等。單次使用生物反應器係具有一次性袋而不是培養容器的生物反應器。

「深度過濾」係包含顆粒的流體通過足夠深度的介質的過濾，以實現各種尺寸的顆粒與流體的分離。

「切向流過濾」係包含顆粒的流體的過濾，其中利用例如由重力引起的跨膜壓力將流體切向地引導穿過過濾介質的表面，導致一些流體進入過濾介質從而被過濾。

「Q/∑」係離心機進料流速與用沈降盤實現等效固-液分離程度所需的理論等效沈降面積的比率。對於圓盤堆疊式離心機計算為： ，其中 係角速度； 係圓盤的數目； 係圓盤的最大半徑； 係圓盤的最小半徑；並且 係圓盤的半錐角。

「負載係數」係離心機進料流速與基於經驗結果的分離面積KQ的比率。KQ計算為： ，其中 係以RPM計的轉筒轉速； 係圓盤的數目； 係圓盤的最大半徑； 係圓盤的最小半徑； 係圓盤的半錐角。

「濁度」具有普通和習慣的含義，即流體缺乏透明度的程度。如本文所用，除非另有說明，否則濁度以常規比濁法濁度單位（NTU）測量。

發現在收穫時PCV為至少16%的灌注培養物的樣本具有較高的濁度水平。在收穫過程中濁度降低，然而，收穫時濁度越大，從所需產物中分離渾濁物質所需的努力就越多。灌注培養物的濁度增加會增加收穫設備故障和/或性能降低的風險，從而導致產品產量降低。PCV為至少16%的渾濁灌注培養物係對傳統收穫操作的一個挑戰。藉由離心並未完全降低濁度，在收穫時從PCV為至少16%的灌注培養物的單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心收集的輕相離心分離液樣本中檢測到高達1500 NTU的濁度值。

「單元操作」係指作為純化目的重組蛋白的過程的一部分而執行的功能步驟。例如，單元操作可以包括操作中的步驟，例如但不限於收穫、捕獲、純化、精製、病毒滅活、病毒過濾、濃縮和/或配製目的重組蛋白。可以將單元操作設計為實現單個目標或多個目標，例如捕獲和病毒滅活步驟的組合。單元操作還可以包括處理步驟之間的貯存或儲存步驟。

「灌注培養」係指一種細胞培養方法，其中在細胞培養過程中將新鮮培養基進料到生物反應器中，並且使培養液通過細胞保留裝置，該細胞保留裝置選擇性地將某些細胞培養組分（例如，細胞和視需要的重組蛋白）保留在生物反應器中，同時去除滲透物中的廢培養基、副產物、雜質和視需要的重組蛋白。

饋料批式培養係生產治療性蛋白質的重要手段。饋料批式策略用途廣泛且靈活，並且可用於所有生物反應器體積。在饋料批式製程中，培養以低細胞密度、生物反應器總工作體積的一部分（通常50%-75%體積）開始，並在培養過程中補充新鮮營養培養基，直到生物反應器總工作體積的100%。饋料培養基在細胞培養期間補充營養，以延長細胞壽命並提高生產率。用過的培養基和廢產物不從生物反應器中除去。細胞、蛋白質、用過的培養基、廢物等全部保留在生物反應器中並隨時間累積。因此，饋料批式培養受到生物反應器體積的限制，因此在數萬升下操作的較大生物反應器諸如生產生物反應器有利於增加產量。隨著時間的推移，饋料批式培養將由於用過的培養基、廢物等的累積而下降，這會不利地影響細胞質量、生產率和滴定量。收穫通常在生產率降低時開始。通常，在收穫時紅血球容積（PCV）小於或等於10%。

近年來，灌注的使用在哺乳動物細胞培養製程中越來越普遍。與饋料批式培養不同，灌注培養以等於或接近生物反應器總工作體積的高細胞密度開始 。與饋料批式培養一樣，灌注培養系統在細胞培養過程中將新鮮培養基饋料到生物反應器中。與饋料批式培養不同，灌注培養系統利用泵來引導生物反應器的內容物通過保留裝置（過濾器，諸如超濾器、微過濾器、中空纖維過濾器），該等保留裝置選擇性地保留某些細胞培養組分（細胞和視需要的重組蛋白）或使其返回生物反應器。因此，灌注培養可以比饋料批式培養維持更長的時間，例如15天或更長。在灌注培養的過程中，與饋料批式培養相比，積累了更多的細胞質量，這導致收穫時細胞數量更大、細胞尺寸更大、細胞碎片、副產物和雜質增加。用過的培養基（或營養耗盡的培養基）、廢物、副產物、產物和過程相關雜質、重組蛋白等在過濾器滲透物中作為廢物除去或收集以供收穫。灌注培養物藉由保留裝置收穫並從滲透物中收集，或者直接從反應器中大量收穫。由於該等保留裝置的限制，灌注過程在小體積生物反應器（通常為500L至2,000L）中進行。此類生物反應器包括單次使用生物反應器。

來自灌注培養物的細胞培養液在收穫時PCV為至少16%，其含有高濃度的細胞碎片、產物和過程相關雜質、副產物等，這會影響蛋白質通過過濾器並對泵送系統的能力進行分類，從而降低收穫產量並增加收穫池中雜質和副產物的水平。達到30%和更高的PCV水平對於灌注培養而言並不罕見，相比之下，饋料批式培養通常觀察到10%的PCV值。這種高固體含量增加了下游收穫、純化和精製操作的負擔。當高固體含量的灌注培養材料通過時，過濾器更容易堵塞和阻塞，導致在收穫期間需要更換過濾器，這花費時間、降低效率、降低產量並增加收穫成本。泵容量也可能受到溶液黏度和高PCV的限制，這進一步影響收穫的成本/效率。灌注系統和保留裝置的連接（管道長度、直徑等）可以使問題變得複雜並增加進入過濾器的培養液的密度，導致交叉流動故障，降低生物反應器中的生產率並負面影響細胞培養液的收穫。PCV在收穫時大於16%的灌注培養物的收穫能力通常僅達到約70%，留下大量產物。

連續灌注培養物中增加的固體含量和用於灌注培養的當前保留系統的缺點突出了對改進的灌注培養收穫製程的需要。

用於饋料批式培養的收穫回收製程傳統上依賴於離心、過濾或該等技術的組合，以從培養物顆粒中分離靶蛋白，該等培養物顆粒包括細胞、細胞碎片，以及在較小程度上分離與過程和產物相關的雜質，諸如宿主細胞蛋白（HCP）和核酸諸如DNA。間歇固體排放圓盤堆疊式離心非常適於澄清該等低固體含量的饋料批式培養物，並且廣泛用於饋料批式培養物收穫。然而，雖然間歇圓盤堆疊式離心適於澄清低固體含量的細胞培養液，但其固體輸送能力有限。此外，隨著細胞培養物固體含量增加，間歇固體排放圓盤堆疊式離心的限制變得明顯，因為離心機轉筒更快地充滿細胞和碎片，因此需要更頻繁的固體排放。頻繁的固體排放降低了產物回收率並增加了離心分離液的濁度，使得下游過濾更加困難。由於固體輸送能力有限，間歇固體排放圓盤堆疊式離心對於高PCV灌注培養物不是現實可行的選擇。因此，間歇固體排放圓盤堆疊式離心通常與另一種分離技術結合，諸如過濾，或改變雜質顆粒的尺寸以適應圓盤堆疊式離心的限制，例如藉由在離心之前使細胞培養液絮凝或沈澱而產生較大的顆粒。

絮凝材料具有比天然材料更大的平均粒度，導致在隨後的圓盤堆疊式離心運行中更高效地澄清饋料批式培養液。這導致饋料批式培養液的圓盤堆疊式離心分離的性能提高，並且還有助於在這種離心之後藉由深度過濾進行更高效的澄清，這係由於降低了小顆粒的水平，否則該等小顆粒將導致過濾器孔堵塞。

過濾，特別是深度過濾，既用作主要收穫分離技術，又用作離心的搭檔，諸如間歇固體排放圓盤堆疊式離心，以從饋料批式培養液中分離靶生物製劑。深度過濾器已成為饋料批式培養收穫回收製程中常規採用的主要技術之一。深度過濾器利用各種多孔過濾介質，例如矽藻土、纖維素和/或合成纖維，從而形成孔的三維網路，該等孔共同形成材料通過過濾器必須經過的曲折路徑。來自細胞培養液的較大顆粒物質（例如細胞和細胞碎片）可藉由堵塞過濾器的孔或表面而迅速污染過濾器。

對於灌注培養，採用切向流微濾係主要的收穫手段，其中細胞培養液流的方向與通過過濾器的遷移方向相切。在灌注培養過程中，當細胞培養液通過過濾器時，較大的顆粒（諸如細胞和視需要的重組蛋白）移動通過過濾器的表面並返回生物反應器，而不是沈降並堵塞過濾器的孔。藉由使用替代切向流微濾實現了進一步的改進，其中細胞培養液通過膜表面的方向週期性地反轉，從而提供沖洗作用並提高過濾器性能。開發交替切向流微濾的動機突出了這樣的事實：灌注培養液中的顆粒物質很容易堵塞過濾器；然而，對於收穫時PCV為至少16%的灌注培養物使用交替切向流微濾已成為過濾器堵塞問題的無效解決方案，特別是當用於此類灌注培養物時。灌注培養物的固體含量增加導致人們尋找更有效的收穫方法。重點係改進過濾技術，增加過濾器的表面積以適應增加的固體負載。這項努力的結果還沒有提出這種培養物的解決方案，並且可能無法在不增加材料和勞動成本以及影響效率和生產率的情況下解決問題。

使用灌注培養作為商業規模蛋白質生產的組成部分，可以縮小設備尺寸和設施占地面積，減少材料和環境影響，採用單次使用組分，在所有規模和多種治療形式下實現高效和靈活的生產。這為開發能夠處理該等較高固體含量的灌注培養物的更有效的收穫過程提供了強有力的動力。本文的揭露內容關於使用先前認為不適用於灌注培養或對於灌注培養可行的方法，即離心，特別是使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機，收穫藉由PCV為至少16%的灌注培養產生的重組蛋白。如本文所述，PCV為至少16%的灌注培養物的離心導致細胞材料的可接受的清除，然而，離心分離液濁度可以與收穫材料一樣高或更高，並且在離心分離液可用於深度過濾之前需要降低。

與在細胞培養體積中低於10% PCV的饋料批式培養相比，連續灌注培養在低培養體積（2000L或更小）中可以實現16%至45%或更高的PCV，係灌注培養的10倍。這使得該等高固體含量灌注培養物較不適合於通常用於大多數灌注培養收穫物的過濾收穫方法。該等連續灌注培養的PCV也無法與饋料批式培養相比，饋料批式培養的PCV低於10%，具有更高的培養體積和更高的產量，這使得它們更適合於更大規模的間歇或連續固體排放圓盤堆疊式離心和其他離心收穫方法。對於商業規模的灌注培養，收穫方法諸如間歇固體排放離心不是一種選擇，因為在較高的PCV下，離心機轉筒將不斷地打開以排出固體，導致離心分離液與碎片的相對無效的分離。另外，傳統的不銹鋼間歇或連續排放離心機不適合在現代單次使用製造設施（例如，具有最小效用的開放平面佈置設計）中使用，因為該設備不具有封閉的處理設計並且需要就地清洗和就地蒸汽進行產物轉換。

將連續固體排放圓盤堆疊式離心機技術引入該過程係創新的，因為先前技術認為連續固體排放圓盤堆疊式離心無法區分細胞培養液中的靶蛋白和該流體中的生物顆粒（諸如細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白（HCP）或核酸（例如，DNA））的密度。示例性的連續固體排放圓盤堆疊式離心機系統係單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機，並且預計單次使用設備對於長期使用來說成本太高。間歇固體排放圓盤堆疊式離心係這樣的圓盤堆疊式離心，其連續地產生細胞糊料，將細胞糊料積聚在離心機轉筒內，但週期性地或間歇地從離心機排出細胞糊料。固體排出間隔基於細胞培養物PCV、細胞培養物收穫流速和離心機轉筒固體保留空間。這種類型的離心機通常用於較低密度、較低PCV的細胞培養物澄清。連續固體排放圓盤堆疊式離心在離心機轉筒內連續地產生細胞糊料，並以預定的細胞糊料濃度連續地將糊料輸送出離心機。與基於間歇固體排放離心的收穫方法相比，這種類型的離心機可用於更廣泛的細胞培養PCV。圓盤堆疊式離心的發展提供了一種基於密度差異來分離物質的技術，該技術涉及相對較低的或不存在的剪切力，適於結合到涉及較高PCV灌注培養的收穫過程中。本文揭露了令人驚訝的發現，連續固體排放圓盤堆疊式離心有效地從PCV為至少16%的實際灌注培養液中發現的生物顆粒中分離出靶蛋白（諸如抗體），特別是具有高收穫濁度的那些，與使用用於灌注培養的標準收穫技術（例如，微濾）的靶蛋白的約70%分步產率相比，靶蛋白的分步產率為約85%至90%。示例性系統係單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機。分步產率為約85%至90%的增加的PCV的益處，結合減少的停機時間和疏通離心機所需的勞動力所節省的成本，多於抵消單次使用離心機的成本，從而實現了經濟上有吸引力的靶蛋白收穫方法。結合連續固體排放圓盤堆疊式離心，隨後使用絮凝或沈澱澄清離心分離液，提供了一種可擴展的方法，藉由該方法可以隨時間在連續流中收穫蛋白質，同時仍保持暢通的流動路徑並最大限度地減少任何後續過濾過程步驟的污染問題，即使使用較高固體含量的灌注培養物。

選擇圓盤堆疊連續固體排放離心，因為它可以有效地除去完整的細胞和較大的細胞碎片而無需如典型的微濾收穫那樣擴大收穫體積，並且由於其封閉的設備設計，可以使用開放式平面製造設備進行操作。當與灌注培養製程結合使用時，離心分離液不含完整細胞，但仍含有高濃度的顆粒，該等顆粒太小而無法藉由離心分離。從該等較高PCV灌注培養物的離心收穫物觀察到1500 NTU的濁度水平。該等小顆粒以低負載量堵塞深度過濾器和無菌過濾器，使得需要大的膜面積來進行過濾。採用絮凝將小顆粒聚集成大顆粒。這增加了溶液中的平均顆粒尺寸並降低了總顆粒濃度。當與有效去除絮凝顆粒（例如C0HC）的深度過濾器孔徑配合使用時，深度過濾器和無菌過濾器的負載量得到提高，從而減少了大規模過濾離心分離液所需的總膜面積。

除了提高的分步產率外，還觀察到從一個批次到另一個批次的池體積減少和更一致的收穫性能。較小的池體積和一致的產品量改善了純化設備的裝配並有助於優化製造工廠的生產計畫、原材料使用和勞動力分配。此外，圓盤堆疊式連續排放離心步驟的結合將隨後的深度過濾負載水平降低到深度過濾介質具有足夠的固體保留空間以有效地進一步純化靶蛋白而不會立即和非生產性堵塞的程度。

藉由使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機技術，將細胞培養液分離成重相（固體）和輕相（離心分離液）流。本文所述之本揭露之方法適用於多種離心機操作模式，具體地：(1) 在較高固體含量灌注培養製造過程的收穫流中從細胞材料連續分離蛋白質；(2) 從細胞材料中連續分離蛋白質和雜質，隨後將細胞材料重新引入回到生物反應器中；以及 (3) 從生物反應器中有效地批式收穫產物，諸如較高固體含量灌注培養物的連續固體排放圓盤堆疊式離心，其中來自生物反應器的輸出物保持在緩衝罐或保持罐中，用於週期性地輸送到離心機。

此外，連續固體排放圓盤堆疊式離心機提供了一種封閉系統，該封閉系統係可擴展的並且可用於生產治療靶蛋白而無需隔離室和其他要求來避免污染並確保產品品質。該方法與有利於灌注培養的生物反應器和許多在生物反應器中使用連續灌注培養的人所採用的開放式球室設置相容。例如，單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機與單次使用的生物反應器相容。商業規模的不銹鋼間歇固體排放或連續固體排放圓盤堆疊式離心機即使可用，也與商業規模的單次使用生物反應器和灌注系統不相容。

來自細胞培養生物反應器的合適的收穫流流速取決於幾個製程設計決策。為了調整連續固體排放圓盤堆疊式離心機設備的尺寸以適應所需的收穫流速，該單元的操作可為連續的，或者以週期性（批式）方式操作，如上所述。通常，調整流速以維持接近恒定的負載或Q/∑值。

在本文所述之方法中，收穫操作開始於直接從生物反應器或從緩衝罐或保持罐收集細胞培養液，並使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機對其進行離心。在絮凝並裝載到一或多個深度過濾器上之前，還可以將離心分離液收集到收穫保持容器中或串聯連接到緩衝容器。

連續固體排放圓盤堆疊式離心機設備本身可以由不銹鋼、塑膠或其他材料構成。當該設備係單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機時，它與包括離心機轉筒和其他產品接觸表面或流動路徑的單次使用的插入件組合。單次使用的插入件可以用單次使用的無菌連接器功能性地封閉，並在使用前藉由輻射進行滅菌。單次使用的插入式無菌連接器能夠連接到生物反應器或緩衝罐以及離心分離液收集罐，以功能性地封閉離心操作。

本文所述之方法在收穫操作的第一步中對培養液進行連續固體排放圓盤堆疊式離心，以從PCV為至少16%的灌注培養物中回收目的重組蛋白。更詳細地，可以理解靶蛋白（例如，重組蛋白）的收穫操作具有兩個部分：(1) 除去細胞、細胞碎片等，以及 (2) 澄清含有目的蛋白的離心分離液。為了實現該結果，所揭露的方法採用連續固體排放圓盤堆疊式離心步驟。本領域已知的任何連續固體排放圓盤堆疊式離心機均預期用於本揭露之方法中。由於該系統可為單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機，因此接觸培養物的部件係單次使用的部件，其不需要包括設計成承受重複使用的材料和構造方法。然而，考慮用於所揭露的方法的單次使用的離心機可用於不同持續時間的連續收穫方法中，並且因此，離心機可以被構造成在延長的使用週期內保持可操作。

連續固體排放圓盤堆疊式離心機可用於在到達深度過濾步驟之前執行將培養液初步分離成重相（固體，包括細胞）和離心分離液（包括分泌的靶蛋白（例如，重組蛋白和未進入重相的固體））相。在深度過濾步驟之前使用絮凝進一步澄清離心分離液。連續固體排放圓盤堆疊式離心機，包括單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機，可以基於來自例如瑞典隆德的阿法拉伐集團AB（Alfa Laval Corporate AB, Lund, Sweden）、德國厄爾德的GEA韋斯伐裡亞公司（GEA Westfalia, Oelde, Germany）的市售單元。所有形式的連續固體排放圓盤堆疊式離心機都適合根據本揭露之方法以單次使用形式使用。

連續固體排放圓盤堆疊式離心機技術可應用於從單次使用或不銹鋼生物反應器收穫培養液。較佳的是，用於此類方法的單次使用生物反應器具有不大於5,000L的體積。

在一些實施方式中，本文揭露的用於回收靶蛋白的離心機理論設定區域（∑值）歸一化流速Q/∑範圍為4.6E-9至2.2E-8 m/s。來自生物反應器的收穫流取決於幾個製程設計決策。因此，當與哺乳動物細胞培養製程相比時，收穫流的流速範圍很寬。對於單批次收穫，較佳的是較高的流速。對於連續收穫策略，諸如細胞滲出產物分離，較佳的是較低的流速。連續固體排放圓盤堆疊式離心機通常以連續方式操作，同時將細胞培養物批次進料到其中。

成功的連續固體排放離心的特徵在於高分步產率以及細胞和細胞碎片的清除（表1）。對於PCV為至少16%的灌注培養製程，觀察到懸浮顆粒水平的變化。因此，藉由將輕相濁度與建立的基線濁度值進行比較來定量連續固體排放離心機去除細胞和細胞碎片的能力。基線濁度值係藉由以約2094相對離心力（rcf）離心50 mL細胞培養物樣本17分鐘後產生的細胞培養物上清液測量的。如本文所揭露的，當從輕相中去除約100%的細胞時，靶蛋白的產率高，實現了成功的純化。如表1所示，觀察到有效的細胞和細胞碎片分離；輕相濁度係基線濁度值的不到2倍，然而，這種程度的濁度足以阻止隨後藉由深度過濾進行的純化。離心分離液通常保持在10°C，但離心機可能會將輕相升溫至16°C-25°C。在絮凝之前和絮凝過程中，將離心分離液保持在10°C。在本文揭露的實驗中，未噴射離心分離液，但預期離心分離液可噴射，特別是如果離心分離液儲存一段時間。

發現由本文所述之離心分離液中收集的高固體含量灌注培養物產生的亞微米細胞碎片、與產物和過程相關的雜質和其他培養副產物的水平顯著高於任何規模的饋料批式製程中觀察到的。離心分離液中的高濃度雜質更容易且更快速地污染深度過濾器和無菌過濾器，從而需要另外的過濾面積來製備用於進一步處理的離心分離液。因此，在深度過濾之前需要進一步澄清高濁度離心分離液。在離心後進行絮凝或沈澱操作，以快速、高效且成本有效的過程澄清離心分離液。在深度過濾之前澄清離心分離液，而不是像饋料批式培養中常見的那樣在離心之前 (a) 避免可能有害地影響產物品質的絮凝相關的細胞裂解，(b) 潛在地避免或最小化影響離心的絮凝相關的細胞培養物或細胞沈澱物流變學行為變化，以及 (c) 減少產生可裝載到層析柱上的澄清離心分離液所需的任何深度過濾膜面積。與饋料批式培養物收穫方法不同，在饋料批式培養物收穫方法中，絮凝通常作為第一步進行，然後離心以除去絮凝的材料，在離心之前將絮凝劑直接添加到PCV為至少16%的灌注培養液中不會導致可行的商業規模的收穫操作。絮凝的材料阻礙了連續的固體排放離心。

絮凝劑可以批式模式或串聯連續模式添加到離心分離液中。將預定量的絮凝劑溶液添加到離心分離液池中以達到靶絮凝劑濃度。替代性地，可以以預定的絮凝劑流速與離心分離液流速之比添加絮凝劑溶液以實現靶絮凝劑濃度。

適用於本文方法的示例性絮凝劑係陽離子絮凝劑。由於細胞培養基中許多與過程和產物相關的雜質帶負電荷，因此使用陽離子絮凝劑將它們從離心分離液中減少/除去。示例性陽離子絮凝劑包括二烯丙基二甲基氯化銨的聚合物，例如聚二烯丙基二甲基氯化銨（pDADMAC）及其單體二烯丙基二甲基氯化銨（DADMAC），以及聚乙烯亞胺（PEI）、聚丙烯醯胺（PAA）和殼聚糖（US 9,371,554和McNerney等人, mAbs [單株抗體] 7:2 413-427 (2015)，藉由援引併入本文）。另外的示例性絮凝劑包括簡單的酸，包括有機酸諸如辛酸（WO 2010/151632，藉由援引併入本文）、二價陽離子、聚陽離子聚合物諸如聚乙烯亞胺（PEI）、非離子聚合物諸如聚乙二醇（PEG）（US 9,371,554和McNerney等人, mAbs [單株抗體] 7:2 413-427 (2015)，藉由援引併入本文）和聚伸烷基二醇（和過渡金屬，諸如鋅，美國專利公開案號2009/0292109，藉由援引併入本文）、非離子界面活性劑以及刺激響應性聚合物（Kang等人, Biotechnol. Bioeng. [生物技術與生物工程] 110:2928-2937 (2013)，藉由援引併入本文）諸如苄基化聚(烯丙胺)。「刺激響應性聚合物」或「智慧聚合物」係包含多個化學亞單元（單體）的化合物，該等化學亞單元對來自外部環境（包括溫度、光、電場或磁場）和化學物質的至少一種觸發物敏感，該觸發物導致聚合物性質（諸如溶解度和誘導聚集的能力）發生可檢測的變化。此類試劑可用於根據本揭露之方法中作為絮凝化合物或附著於不溶性基質諸如二氧化矽珠或極限密度（XD）細胞培養過程（Schirmer等人, Bioproc. Intl. [生物製藥國際期刊] 8:32-39 (2010)，藉由援引併入本文），以幫助離心分離液澄清。

在一些實施方式中，絮凝劑係聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）或其單體二烯丙基二甲基氯化銨（DADMAC）。在一些實施方式中，將pDADMAC以0.04%-0.15%（w/w）添加到離心分離液中。在一些實施方式中，將pDADMAC或DADMAC以0.05%（w/w）添加到離心分離液中。絮凝在8-12°C下進行，其中絮凝通常在10°C下進行。在一些實施方式中，絮凝在約8°C、8.5°C、9°C、9.5°C、10°C、10.5°C、11°C、11.5°C或12°C下進行。在一些實施方式中，絮凝在約10°C下進行。添加絮凝劑後，將混合物混合30分鐘，然後開始深度過濾。在一些實施方式中，在混合下將絮凝的混合物在8-12°C，例如10°C下儲存至多4小時。在一些實施方式中，從生物反應器內容物的冷卻到離心分離液的深度過濾的整個收穫過程在10°C下進行或用10°C的流體進行。在一些實施方式中，離心、絮凝和深度過濾用10°C流體進行。

深度過濾器利用各種多孔過濾介質，例如矽藻土、纖維素和/或合成纖維，從而形成孔的三維網路，該等孔共同形成材料通過過濾器必須經過的曲折路徑。來自細胞培養液的顆粒物質，例如細胞、細胞碎片、副產物以及與產物和過程相關的雜質可藉由堵塞過濾器的孔或表面而迅速污染過濾器。如本領域已知的，過濾器結垢或堵塞的速率和程度受細胞碎片顆粒數量和尺寸分佈以及深度過濾介質化學性質和孔徑的影響。本文揭露的數據表明，當未處理的離心分離液與X0HC或甚至更大的孔徑諸如C0HC配對時，幾乎立即發生堵塞（參見圖8）。絮凝確保形成較大的分子聚集體，這減少了細胞碎片顆粒數量並增加了顆粒尺寸，從而降低結垢或堵塞的發生率，特別是當與合適的過濾器類型（例如，C0HC、C0SP、DL75、DL60）配對時。合適的深度過濾器類型的選擇基於絮凝、深度過濾介質化學性質和深度過濾介質孔徑範圍的經驗優化。具體地，孔徑與溶液中細胞碎片的大小相匹配。在沒有絮凝的情況下，發現顆粒的尺寸範圍小於1-2 μm。在有絮凝的情況下，發現顆粒在50-100 μm範圍內。總體而言，絮凝後的顆粒也較少。小顆粒和大顆粒都會堵塞過濾器。當深度過濾器劑量的所選孔徑與溶液中的顆粒尺寸不匹配時，觀察到最差的性能，這係使用未處理的離心分離液的C0HC過濾器的性能比X0HC過濾器類型更差的原因。如圖1所示，多種深度過濾器類型顯示，相對於X0HC對照，深度過濾負載有所增加。選擇未處理的離心分離液的X0HC對照，因為之前已證明它可以為未處理的離心分離液提供最佳的深度過濾能力。增加的深度過濾能力減少了需要過濾固定的離心分離液體積的深度過濾器的數量，從而減少了製造設備中的過濾面積。

合適的深度過濾器由合成纖維或纖維素纖維的多孔基質組成，視需要地連接到用於吸引和保留帶相反電荷助濾劑的帶電荷樹脂上，如本領域已知的。一些示例性深度過濾器結合了矽藻土作為無機助濾劑。深度過濾器也可包含黏合劑。對於所有深度過濾器，包括纖維素深度過濾器，材料（例如，纖維素纖維墊或材料）越厚，通過過濾材料的路徑越彎曲和複雜，這導致各種尺寸的顆粒被捕獲並從被澄清的流體中去除。纖維素深度過濾器通常具有淨正電荷，這也為吸附去除帶負電荷的雜質提供了基礎。

本揭露之方法包括在如本文所揭露的絮凝步驟之後，將來自連續固體排放圓盤堆疊式離心分離液的澄清離心分離液暴露於深度過濾以去除雜質。深度過濾操作可以包括一或多個相同或不同類型的深度過濾器。適用於本揭露之方法的深度過濾器包括但不限於纖維素、合成纖維網或兩者的組合，以及用如Singh等人, Biotechnol. Bioeng. [生物技術與生物工程] 110:1964-1972 (2013)中描述的預處理的過濾基質製成的深度過濾器，該文獻藉由援引併入本文。基於本文揭露的當前小規模深度過濾數據，適合用於本揭露之收穫方法中的絮凝的離心分離液的示例性深度過濾類型包括C0HC（0.2-2 μm標稱孔徑分佈）、C0SP（0.2-2 μm標稱孔徑分佈）、DL75（1-14 μm標稱孔徑分佈）和DL60（0.6-10 μm孔徑分佈）。熟悉該項技術者僅使用常規技術即可識別出適合在所揭露的方法中使用的其他過濾介質。擴展前述觀察結果，示例性深度過濾器包括纖維素深度過濾器、MILLISTAK+ ^®D0HC過濾器、MILLISTAK+ ^®C0HC過濾器、MILLISTAK+ ^®C0SP過濾器、SARTOCLEAR ^®DL60過濾器、SARTOCLEAR ^®DL75過濾器、Clarisolve 20MS過濾器、Clarisolve 40MS過濾器、Clarisolve 60HX過濾器、3M™ Zeta Plus™過濾器、矽藻土和3M™ Emphaze™ AEX混合純化器。所有該等過濾介質將提供有用的純化而不會造成不可接受的產率損失，但如本文所指出的，如果過濾介質孔徑未基於被過濾的離心分離液中的粒度適當選擇，則過濾介質負載將降低。基於本文揭露的數據，預期多層過濾器將有利於純化以高產率獲得的靶蛋白，但多層過濾器不是根據本揭露之方法的要求。設計與純化方法的深度過濾組分相關的實驗以產生可用於實現高負載水平的數據，以便最大限度地減少澄清足夠通過任何後續下游過濾器（諸如蛋白A保護過濾器（通常0.2 μm孔徑））的離心分離液所需的過濾器數量，同時保持高分步產率。

此外，深度過濾後可為孔徑不大於0.2 μm的多於一個無菌或生物負載減少過濾器（例如，Millipore SHC過濾器、Sartopore 2過濾器（Sartorius）和Pall過濾器），以確保生物負載減少。在深度過濾完成後，將純化的離心分離液保持在2-8°C，通常不超過72小時。根據分子穩定性，保持力可能會降低。

本揭露進一步考慮了將收穫過程與本領域已知的收穫後回收步驟組合的方法，諸如靶生物分子回收，例如基於親和力的回收，對於免疫球蛋白和免疫球蛋白樣靶標，其可以基於利用葡萄球菌（ Staphylococcus）蛋白諸如蛋白A的靶親和層析材料的結合，以及層析段分和精製步驟，其中層析介質可為任何形式，包括柱形式的珠，並且段分和精製步驟可以依賴於靶標的任何區分性質，諸如尺寸（例如，粒徑篩析層析法）、親和力、電荷（例如，陰離子或陽離子交換層析法、疏水性（例如，疏水相互作用層析法）、多模式或混合模式（不同模式的組合）或已知可用於使用層析介質區分分子的任何性質。簡單地說，本揭露提供了用於純化已使用本文揭露的方法收穫的靶生物分子（例如生物製品，諸如抗體）的任何方法。

本揭露提供了從來自細胞培養生物反應器的批式收穫流中的細胞培養液中分離重組蛋白。當滿足預定參數（例如，培養持續時間、滴定量、活細胞密度或紅血球容積）時，從生物反應器收穫培養物。將生物反應器冷卻至12°C或更低的溫度。然後直接從生物反應器收穫細胞培養液或將其收集到儲存罐中並保持在10-12°C。使用本領域已知的常規技術測定培養物的收穫細胞活力、活細胞密度（VCD）、紅血球容積和/或基線濁度。

本揭露提供了從來自灌注培養製程的週期性收穫流中的細胞培養液中分離重組蛋白，其中細胞培養液在連續固體排放圓盤堆疊式離心機之前或之後通過緩衝罐/容器，從而將固體材料（重相）與液體上清液（輕相或離心分離液）分離。然後將離心分離液進行絮凝/沈澱步驟，然後裝載到一或多個深度過濾器上，並且視需要地還裝載到一或多個無菌過濾器上。然後將洗脫液收集到儲存罐中並儲存在4°C或直接進行純化層析操作。

本揭露提供了從連續細胞培養物中連續分離重組蛋白，其中使多批細胞培養液通過連續固體排放圓盤堆疊式離心機，從細胞培養上清液（離心分離液）中分離固體材料。在一些實施方式中，可以將固體再循環或再引入生物反應器中。將離心分離液收集在收穫池中並進行本文所述收穫方法的剩餘步驟。在一些實施方式中，該等方法涉及直接從工作生物反應器連續收穫，並且一些實施方式提供串聯冷卻。

本文所述之收穫操作可以與另外的收穫策略組合，包括另外的離心，諸如圓盤堆疊式離心；過濾，包括切向流過濾、微濾、超濾和深度過濾；沈降方法和基於層析介質的分離，通常使用包括陰離子和/或陽離子交換、基於親和力的交換（例如，免疫親和力交換）、分子篩和/或精製層析的柱。本文揭露的方法包括本領域已知的適用於細胞培養材料（包括細胞培養上清液和含有細胞材料的流體）的任何純化或澄清方案。在典型的操作中，藉由連續固體排放圓盤堆疊式離心的分離係從生物反應器（或在批式模式分離中有用的緩衝罐或儲存罐）中去除細胞培養物之後的第一步驟。在本文所述之離心、絮凝和過濾收穫步驟之後，純化或澄清方案可以包括下游過濾器和/或柱和/或可用於分離生物分子諸如蛋白質的其他離心形式的任何組合。

除了上述技術之外，本揭露之方法考慮了涉及分離或澄清目的生物分子（例如，蛋白質）的多種層析步驟，包括粒徑篩析層析法、離子交換層析法、疏水相互作用層析法、多模式或混合模式層析法和親和層析法，諸如免疫親和層析法。各種介質可以以設計成有助於生物分子（例如蛋白質）以批式和連續純化模式分離的各種組態使用。

本揭露之方法考慮了在三個或更多個不同階段中培養細胞的生產方法。每個階段可以在其自身的生物反應器容器或其他適於細胞培養的容器中進行。替代性地，可以在共用容器中進行多於一個階段。對於使用哺乳動物細胞生產蛋白質的商業方法，通常存在多個，例如至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10個生長期/階段，該等生長期/階段發生在最終N生產階段之前在不同培養容器中。例如，細胞可以在N-1種子階段之前的一或多個生長階段中培養，並在一或多個N-1生物反應器中培養。N-1階段的持續時間可以在例如7至14天的範圍內，並且可以被設計成在接種生產（N）生物反應器之前維持細胞呈指數生長。在一些實施方式中，將來自N-1個生物反應器的細胞轉移至（N）生產生物反應器中並在使蛋白質生產最大化的條件下生長。在其他實施方式中，沒有轉移，即N-1和N生產階段發生在同一生物反應器中。

「一或多種細胞」包括任何原核或真核細胞。細胞可為離體細胞、體外細胞或體內細胞，可為分離的或作為高級結構（諸如組織或器官）的一部分。細胞包括「宿主細胞」，它們可以被基因工程化以表現具有商業或科學意義的蛋白質。宿主細胞典型地源自來自原代培養物的譜系，其可在培養中維持無限時間。宿主細胞可為原核細胞（例如，大腸桿菌）或真核細胞（例如，酵母、昆蟲或動物細胞（例如，CHO））。在適當條件下培養的宿主細胞表現目的蛋白，該目的蛋白可隨後從培養基收集（如果宿主細胞將其分泌到培養基中），直接從產生它的宿主細胞收集（如果蛋白質不分泌），或從兩種來源收集。合適的宿主細胞的選擇將取決於各種因素，例如所需的表現水平、活性所需或必需的蛋白質修飾（例如糖基化或磷酸化）以及易於折疊成生物活性分子。

基因工程化宿主細胞涉及用重組多核苷酸分子轉染、轉化或轉導細胞，和/或以其他方式改變（例如，藉由同源重組和基因活化或重組細胞與非重組細胞的融合）以引起宿主細胞表現所需的重組蛋白。用於遺傳工程細胞和/或細胞系以表現目的生物分子（例如，蛋白質）的方法和載體係熟悉該項技術者熟知的。提供了表現載體形式的表現系統和構建體，諸如質體或轉錄或表現盒，其包含編碼目的生物分子（例如，蛋白質）的一或多種多核苷酸，諸如本文鑒定的那些，以及包含此類表現系統或構建體的宿主細胞。如本文所用，「載體」意指適用於將編碼蛋白質的資訊轉移和/或轉運到宿主細胞中和/或宿主細胞內的特定位置和/或區室的任何分子或實體（例如，核酸、質體、噬菌體、轉位子、黏質體、染色體、病毒、病毒衣殼、病毒體、裸DNA、複合DNA等）。載體可以包括病毒和非病毒載體，以及非附加型哺乳動物載體。載體可為表現載體，例如重組表現載體或選殖載體。可以將載體引入宿主細胞以允許載體自身的複製，並從而擴增其中含有的多核苷酸的拷貝。選殖載體可以含有序列組分，該等序列組分通常包括但不限於複製起點、啟動子序列、轉錄起始序列、強化子序列、轉位子/轉位酶和選擇標誌物。熟悉該項技術者可以適當地選擇該等元件，並且選殖載體內可以包含每個選擇的組分中之一或多個。

較佳的是，宿主細胞係真核細胞，諸如哺乳動物細胞。適於重組蛋白表現的任何哺乳動物細胞都適合在本揭露之上下文中使用。合適的哺乳動物細胞包括但不限於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞、鼠骨髓瘤（NS0、Sp2/0）細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、人胚腎（293）細胞、纖維肉瘤（HT-1080）細胞、人胚胎視網膜（PER.C6）細胞、雜交腎和B細胞（HKB-11）、CEVEC羊水細胞生成（CAP）細胞、人肝（HuH-7）細胞以及用於或適合用於臨床和/或商業製造的任何其他細胞。最常用的細胞系來自CHO細胞。CHO細胞廣泛用於生產複合重組蛋白。二氫葉酸還原酶（DHFR）缺陷突變細胞系（Urlaub等人 (1980), Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 77: 4216-4220）DXB11和DG-44係理想的CHO宿主細胞系，因為高效的DHFR可選擇和可擴增基因表現系統允許在該等細胞中高水平的重組蛋白表現（Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol [酶方法學] 185:537-566）。也廣泛使用麩醯胺合成酶（GS）-敲除的CHOK1SV細胞系，其利用基於麩醯胺合成酶（GS）的甲硫胺酸亞碸亞胺（MSX）選擇。還包括CHOK1細胞（ATCC CCL61）。

可以測量關鍵屬性和性能參數，以更好地指導有關製造期間每個步驟性能的決策。該等關鍵屬性和參數可以即時監測、近即時監測和/或事後監測。在細胞培養期間可以測量主要的關鍵參數，諸如消耗的培養基組分（諸如葡萄糖）、可能在培養物中累積的代謝副產物（諸如乳酸和氨）的水平，以及與細胞維持和存活相關的參數，諸如溶氧量。關鍵屬性諸如比生產率、活細胞密度、pH、滲透壓、外觀、顏色、聚集、細胞計數、紅血球容積、產率百分比和滴定量可在製造過程的適當階段監測。還可以在整個製造過程中監測過程和產品雜質。

「培養」（「culture」或「culturing」）係指細胞在多細胞生物體或組織外部的生長和繁殖。對於哺乳動物細胞的合適培養條件係本領域已知的。細胞培養基和組織培養基可互換地用於指在體外細胞培養期間適合宿主細胞生長的培養基。典型地，細胞培養基含有緩衝液、鹽、能源、胺基酸、維生素和痕量必需元素。可以使用能夠支持適當宿主細胞在培養中生長的任何培養基。可以進一步補充其他組分以使特定培養的宿主細胞中的細胞生長、細胞活力和/或重組蛋白生產最大化的細胞培養基（包括有效控制重組蛋白生產時間的組分）係可商購的，並且包括RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、杜爾貝科改良伊格爾培養基（DMEM）、伊格爾最低必需培養基、F-12K培養基、哈姆F12培養基、伊思考夫改良的杜爾貝科培養基、麥考伊（McCoy's）5A培養基、Leibovitz L-15培養基和無血清培養基如EX-CELL™300系列等，該培養基可以從美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）或SAFC生物科學公司（SAFC Biosciences）和其他供應商處獲得。細胞培養物還可以補充有特定營養物的獨立濃縮饋料，該等營養物可能難以配製在細胞培養物中或在細胞培養物中快速耗盡。此類營養物可為胺基酸諸如酪胺酸、半胱胺酸和/或胱胺酸（參見例如WIPO公開案號2012/145682）。細胞培養基可為無血清、無蛋白質、無生長因子和/或無蛋白腖的培養基。細胞培養物也可以藉由添加高於其通常推薦濃度的營養物來增濃。在較佳的實施方式中，調整細胞培養基以使宿主細胞生長至大於10 ⁶個細胞/ml的細胞密度，即接近、達到或超過10 ⁸個細胞/ml的細胞密度。

可以配製或補充灌注饋料培養基，以在使細胞培養物通過中空纖維過濾器時實現至少5 g/L的非離子嵌段共聚物的濃度，該中空纖維過濾器具有不將重組蛋白保留在生物反應器中的孔徑或截留分子量（MWCO）（WO 2015/188009）。

在培養物過程中可以使用多種培養基配製物，例如，以引發培養、促進從一個階段（例如，生長階段或生長期）過渡到另一階段（例如，生產階段或生產期）和/或優化細胞培養期間的條件（例如，在灌注培養過程中提供的濃縮培養基）。含有基本培養基組分的基礎培養基配製物通常用於引發細胞培養。生長培養基配製物可用於促進細胞生長並使蛋白質表現最小化。生產培養基配製物可用於促進目的生物分子（例如，蛋白質）的生產和細胞的維持，同時使新細胞的生長減至最少。饋料培養基，通常是含有更濃縮的組分諸如營養物和胺基酸的培養基，其在細胞培養物的生產階段過程中被消耗，可用於補充和維持活性培養物，特別是以灌注模式操作的培養物。這種濃縮的進料培養基可以含有細胞培養基的大部分組分，例如它們的正常量或濃度的約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至約1000倍。

在細胞培養過程中，特別是在生產階段過程中，細胞生長可能受到限制或停滯。此類方法包括單獨或組合的溫度變化、pH變化、使用蛋白質產生的化學誘導劑和細胞週期抑制劑、營養限制或飢餓。例如，溫度變化可用於從生長階段過渡到生產階段。例如，生長階段可以在約35°C至約38°C的第一溫度下進行，並且生產階段可以在約29°C至約35°C，視需要地約30°C至約35°C或約30°C至約34°C，視需要地約32°C至約33°C的第二溫度下進行。此外，生長階段可以在比生產更高的pH下進行。pH變化可單獨使用或與溫度變化和/或添加化學誘導劑組合使用。

將細胞維持在所需生理狀態的另一種方法係藉由將細胞培養物暴露於低L-天冬醯胺條件和/或天冬醯胺飢餓來誘導細胞生長停滯（參見例如WIPO公開案號WO 2013/006479）。細胞生長停滯可以藉由含有限制濃度的L-天冬醯胺並在細胞培養物中維持低濃度的L-天冬醯胺的培養基來實現和維持。將L-天冬醯胺的濃度維持在5 mM或更低可用於誘導和維持細胞處於生長停滯狀態，由此提高生產率。

此外，可以在溫度變化之前、同時和/或之後添加蛋白質產生的化學誘導劑，諸如咖啡因、丁酸鹽和六亞甲基雙乙醯胺（HMBA）。如果在溫度變化後添加誘導劑，則可以在溫度變化後一小時至五天，視需要地在溫度變化後一至兩天添加誘導劑。細胞週期抑制劑、已知或懷疑調節細胞週期進程以及與此相關的轉錄、DNA修復、分化、衰老和細胞凋亡的相關過程的化合物也可用於誘導細胞生長停滯。與週期機制相互作用的細胞週期抑制劑諸如細胞週期蛋白依賴性激酶（CDK）係有用的，與來自其他途徑諸如AKT、mTOR和直接或間接影響細胞週期的其他途徑的蛋白質相互作用的那些分子亦為有用的。

本揭露之方法可用作較大生產過程的一部分，由此細胞在三個或更多個不同階段中培養。每個階段可以在其自身的生物反應器容器或其他適於細胞培養的容器中進行。替代性地，可以在共用容器中進行多於一個階段。合適的容器包括具有或不具有微載體的流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌罐生物反應器。在如本文所用的一般術語中，生物反應器係用於細胞培養的任何容器。

為了用於本文所述之方法，細胞培養物以灌注模式操作。哺乳動物細胞（諸如CHO細胞）可以在生物反應器中以小於100 ml至小於1000 ml的較小規模培養。替代性地，可以使用1000 ml至超過2,000升的更大規模的生物反應器。在一個實施方式中，使用1升至2000升。在一個實施方式中，生物反應器為10升至2000升。在一個實施方式中，生物反應器為10升至100升。在一個實施方式中，生物反應器為30升至50升。在一個實施方式中，生物反應器為30升至2000升。在一個實施方式中，生物反應器為100升至2000升。在一個實施方式中，生物反應器為500升至2000升。在一個實施方式中，生物反應器係1000升至2000升。更大規模細胞培養，諸如用於蛋白治療劑的臨床和/或商業規模的生物製造，可以維持數週或數月，在此期間細胞產生所需的一或多種蛋白質。

在一些實施方式中，使用單次使用生物反應器（也稱為一次性生物反應器）進行本揭露之方法，該等單次使用生物反應器使用一次性袋代替傳統的不銹鋼培養容器。單次使用技術的使用使得與傳統細胞培養相關的基礎設施需求最小化，諸如鋼/玻璃商業規模的容器和相關機器。單次使用生物反應器為製造過程提供了靈活性，並且現場組裝、重新配置、滅菌和驗證比傳統的內置不銹鋼細胞培養設備更快、更容易且成本更低。單次使用生物反應器包括由非一次性支撐結構支撐的一次性塑膠無菌袋。藉由袋內的攪拌器或藉由搖動來攪拌培養物，還提供空氣和氧氣噴霧器以及感測器來測量和調節培養物的各種參數，諸如pH、溫度、氧氣、細胞密度等。單次使用生物反應器可商購獲得，例如德國哥廷根賽多利斯公司（Satorius, Göttingen Germany）的Bio STR ^®；麻塞諸塞州柏林頓的密理博公司（Millipore, Burlington, MA）的MOBIUS ^®；麻塞諸塞州馬爾波羅賽提瓦公司（Cytiva, Marlborough, MA）的XCELLEREX®。在一些實施方式中，預期3 kL或更多的培養物將在合適尺寸的生物反應器中生長。

生物反應器系統維持生物反應器內的條件以支持細胞培養。對於哺乳動物細胞的合適培養條件係本領域已知的。 參見例如Animal cell culture: A Practical Approach [動物細胞培養：一種實用方法], D. Rickwood編輯, Oxford University Press [牛津大學出版社], 紐約 (1992)。「運行」生物反應器系統係指維持生物反應器系統中的條件以支持細胞培養。生物反應器「運行」通常包括以下步驟：用種子培養物接種準備好的生物反應器，使細胞經歷一或多個生長期和/或生產階段直至滿足預定參數（時間、活細胞密度、紅血球容積），然後收穫生物反應器的內容物。

「培養」係指在適合於除多細胞生物體或組織之外的細胞的存活和/或增殖以及適合於產生蛋白質產物的條件下，將細胞維持在培養基中。細胞培養通常以批式、饋料批式或灌注模式操作。在批式模式中，在運行開始時向生物反應器中添加固定量的培養基和細胞。在培養過程中，反應器中的培養基體積保持恒定，而培養基的營養物含量降低，廢物和副產物含量增加。細胞濃度在運行過程中不斷增加，並且隨著營養物含量耗盡和廢物增加而趨於穩定和下降。饋料批式培養從接種細胞和固定量的培養基開始。與批式培養不同，生物反應器中培養基的體積隨著在培養過程中添加濃縮的營養物而增加。與批式培養類似，廢物和副產物含量在運行過程中增加，並且將隨著營養物含量耗盡和廢物產物增加而趨於穩定和下降。

灌注培養，如批式培養和饋料批式培養，從細胞和培養基的固定接種開始。與饋料批式培養不同的是，培養在反應器的最終工作體積或接近最終工作體積時開始。還與饋料批式培養不同的是，當將新鮮饋料培養基添加到生物反應器中時，藉由保留裝置灌注或從生物反應器中取出等量的用過的培養基。在本文所述方法的情況下，灌注係連續灌注。保留裝置，諸如切向流過濾（TFF）系統或交替切向流（ATF）系統可用於從生物反應器中除去用過的培養基和不需要的產物。替代性地，可以使用聲波技術或細胞沈降技術來除去用過的介質和不需要的產物。

ATF依賴於使用再循環裝置（最典型的是隔膜泵）來使細胞培養物來回移動通過模組（例如，通過中空纖維過濾器模組），以允許去除用過的培養基，同時將細胞保留在生物反應器中。參見例如美國專利案號6,544,424；Furey (2002) Gen. Eng. News. [基因工程和新聞] 22 (7), 62-63。ATF的好處係由交替流動引起的對過濾器的清潔效果。本揭露之示例性方法包括使用ATF灌注系統運行（N）個生產生物反應器。

通常，在ATF系統中使用中空纖維過濾器（儘管這不是必需的）。當將細胞培養物（包括細胞培養基、細胞（完整的和裂解的）、可溶性表現的重組蛋白、宿主細胞蛋白、廢物等）引入過濾器時，取決於孔徑或截留分子量（MWCO），中空纖維材料可以在內腔側（內部）保留某些細胞培養物組分（除了細胞本身之外），並基於中空纖維材料的孔徑或截留分子量允許某些組分通過過濾器（滲透物）。將保留的材料（滯留物）返回到生物反應器。將新鮮的灌注培養基添加到生物反應器中，並以預定的時間間隔或連續地從過濾器中取出滲透物，以維持所需的或恒定的生物反應器體積。滲透物可以被丟棄，儲存在儲存罐、袋或搬運箱中或直接轉移到另一單元操作，諸如收穫操作。

示例性過濾器（例如，超濾器和微濾器）包括但不限於Millipore prostrack、多種孔徑範圍的Cytiva中空纖維過濾器、多種孔徑的Repligen過濾器、多種孔徑的Spectrum中空纖維過濾器和Ashai Kasei中空纖維過濾器。

通常，中空纖維過濾器用於灌注培養保留系統。在各個方面，中空纖維具有約0.5 mm至約1 mm的內徑，並且可以具有任何合適的長度（例如，約30 cm至約110 cm）。用於微濾的中空纖維通常具有0.1 μm至10 μm的孔徑或500至750 kDa或更大的截留分子量，並且可用於允許蛋白質（例如，單株抗體或工程化抗體樣蛋白質）進入滲透物。超濾中空纖維通常具有0.01 μm至0.1 μm的孔徑範圍或300 kDa或更小的截留分子量，並且可用於將所需蛋白質保留在滯留物中以返回生物反應器。這可用於例如濃縮重組蛋白產物以供收穫。此類過濾器可商購獲得，諸如Xampler（麻塞諸塞州馬爾波羅賽提瓦公司（Cytiva, Marborough, MA））、Midikros（加利福尼亞州多明格茲的仕必純公司（Spectrum Laboratories, Inc, Dominguez, CA.））、XCell ATF ^®（麻塞諸塞州沃爾珊的雷普雷根公司（Repligen, Waltham, MA））。控制離開生物反應器的培養液的溫度，溫度通常維持在10-12°C。使用泵將培養液從生物反應器移出至連續固體排放圓盤堆疊式離心機或緩衝罐。應當理解，離心機本身也具有泵。

可以藉由泵送系統將細胞培養液從生物反應器中抽出並進入過濾器模組，該泵送系統使細胞培養物通過或沿著過濾器（例如，通過中空纖維的內腔側）。細胞泵送系統的實例包括蠕動泵、雙隔膜泵、低剪切泵（瑞士蘇黎世（Zurich, Switzerland）的Levitronix™泵）和交替切向流系統（麻塞諸塞州沃爾珊雷普雷根公司（Repligen, Waltham, MA）的ATF™）。可以藉由使用蠕動泵從過濾器中抽出滲透物。在本文提供的實例中，灌注藉由使用交替切向流系統實現。

生物反應器中的培養基交換表示為每天的容器體積（VVD）或每天的生物反應器體積（BV/d）。可以使交換率最小化，諸如藉由將其設定為約0.25 BV/d，但更頻繁地將其設定為至少1 BV/d的值；通常，該交換率被設置為至少2 BV/d至3 BV/d的值。

在灌注培養物中表現後，然後根據本揭露之方法收穫目的靶蛋白。收穫過程澄清或純化、或部分澄清或純化靶蛋白，使其遠離培養液中發現的至少一種雜質，諸如剩餘的細胞培養基、細胞提取物、細胞、細胞碎片、不需要的細胞或培養基組分、產物和/或過程相關雜質。收穫的目的重組蛋白可以儲存在緩衝罐、儲存罐、袋或其他可適於向層析柱橇（skid）提供進料的容器中。收穫的目的重組蛋白也可以作為洗脫液流直接提供給層析柱橇。在收穫時，灌注培養物的PCV為至少16%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為至少18%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約20%-約30%。在一個實施方式中，灌注培養物為約16%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約18%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約19%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約20%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約21%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約22%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約23%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約24%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約25%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約26%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約27%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約28%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約29%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約30%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約30%-約35%。在一個實施方式中，灌注培養物的PCV為約16%-45%。目的靶蛋白的回收和進一步純化可藉由下游單元操作完成。

下游操作純化和精製靶蛋白。下游操作利用包括樹脂和/或膜的捕獲層析法，該等樹脂和/或膜含有將與至少一種所需蛋白質、雜質或污染物結合和/或相互作用的試劑。捕獲層析法的實例包括親和層析法、粒徑篩析層析法、離子交換層析法（IEX）諸如陽離子交換（CEX）和陰離子交換（AEX）層析法、疏水相互作用層析法（HIC）、多模式或混合模式（MMC）、固定化金屬親和層析法（IMAC）等。此類材料係本領域已知的並且可為商購的。

親和層析法通常在生物製造過程中用作初始捕獲步驟，以從粗製或澄清材料中分離和濃縮目的靶蛋白，諸如重組蛋白。這種親和層析材料的示例包括利用以下的那些：葡萄球菌蛋白諸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和蛋白L；底物結合性捕獲機構；抗體或抗體片段結合性捕獲機構；適體結合性捕獲機構；輔因子結合性捕獲機構；等等。固定化金屬親和層析可用於捕獲對金屬離子具有親和性或已經被工程改造為對金屬離子具有親和性的蛋白。蛋白A對多種抗體和抗體樣蛋白具有高度選擇性，並且作為第一線的大量純化方法依賴於過程相關雜質的強去除和高產率。蛋白A材料可從許多供應商處購買到。例如，MABSELECT ^TMSURE蛋白A、蛋白A Sepharose FAST FLOW™（麻塞諸塞州馬爾波羅的賽提瓦公司（Cytiva, Marborough, MA））、PROSEP-A™（英國的默克密理博公司（Merck Millipore, U.K））和TOYOPEARL™ 650M蛋白A（賓夕凡尼亞州費城的托索哈斯公司（TosoHass Co., Philadelphia, PA））。

中間和/或精製單元操作利用各種層析方法來連續純化目的蛋白並清除污染物和雜質，諸如DNA、宿主細胞蛋白、產物相關雜質、變體產物和聚集體、病毒（諸如藉由病毒吸附）等。該等層析單元操作利用含有試劑的樹脂和/或膜，它們可以多種配置操作，諸如流通模式，其中目的蛋白包含在洗脫液中並且污染物和雜質與層析介質結合；前沿或超載層析模式，其中將含有目的蛋白的溶液裝載到柱上，直到吸附位點被佔據並且對固定相具有最小親和力的物質（目的蛋白）開始洗脫；以及結合和洗脫模式，其中目的蛋白與層析介質結合並在污染物和雜質流過層析介質或從層析介質上洗掉之後洗脫，或用於藉由層析法實現一定程度的靶蛋白純化的任何其他方法。如上所述，此類層析方法的實例包括離子交換層析法（IEX），諸如陰離子交換層析法（AEX）和陽離子交換層析法（CEX）；疏水相互作用層析法（HIC）；混合模式或多模式層析法（MM）、羥磷灰石層析（HA）；逆相層析法和凝膠過濾等。

多個層析單元操作，通常是一個、兩個或三個，每個通常執行不同的功能或以不同的模式操作，根據製造過程的要求進行組合。基於帶電表面之間的靜電相互作用的離子交換層析法，基於反映蛋白質（或雜質）對層析介質的靜電吸引水平的吸附和解吸的不同速率將目的蛋白與雜質分離。陽離子交換層析法係指在帶負電荷的固相介質上進行的層析法，其具有可用於與通過或穿過固相的水溶液中的陽離子交換的陽離子。電荷可以藉由將一或多種帶電荷的配體連接到固相來提供，例如藉由共價連接。替代性地或另外地，電荷可為固相的固有性質（例如，如具有總體負電荷的二氧化矽的情況）。陽離子交換層析法通常以結合和洗脫模式運行，並且許多目的蛋白的高pI能夠與層析材料結合。陽離子交換層析法也可以流通模式運行。CEX層析法通常用於去除高分子量（HMW）污染物、過程相關雜質和/或病毒清除。可商購獲得的陽離子交換介質包括但不限於固定在瓊脂糖上的磺丙基（SP）官能基（例如SP-SEPHAROSE FAST FLOW™、SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL™或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™、CAPTO S™、CAPTO SP ImpRes™、CAPTO S ImpAct™（賽提瓦公司（Cytiva））、FRACTOGEL-SO3™、FRACTOGEL-SE HICAP™和FRACTOPREP™（德國達姆施塔特的EMD默克公司（EMD Merck, Darmstadt, Germany））、TOYOPEARL ^®XS、TOYOPEARL ^®HS（賓夕凡尼亞州普魯士國王區的托什生物科學公司（Tosh Bioscience, King of Prussia, PA））、UNOsphere™（加利福尼亞州海格立司的伯樂公司（BioRad, Hercules, CA））和S Ceramic Hyper D™F（紐約州華盛頓港的頗爾公司（Pall, Port Washington, NY））、POROS™（馬薩諸賽州沃爾珊的賽默飛世爾公司（ThermoFisher, Waltham, MA）））。

陰離子交換層析係指在帶正電並且具有可用於與通過或穿過固相的水溶液中的陰離子交換的陰離子的固相介質上進行的層析法。陰離子交換層析法通常以流通模式運行。由於許多治療性蛋白質的高pI，它們不容易與AEX層析材料結合。例如，AEX層析用於病毒清除和雜質去除。市售陰離子交換介質係可用的並且包括但不限於固定在瓊脂糖上的四級胺（Q）（例如，Source 15 Q、Capto™ Q、Q-SEPHAROSE FAST FLOW™（賽提瓦公司（Cytiva））、FRACTOGEL EDM TMAE™、FRACTOGEL EDM DEAE™（EMD默克公司（EMD Merck））、TOYOPEARL Super Q ^®（托什生物科學公司（Tosh Bioscience））、POROS HQ™、POROS XQ™、（賽默飛世爾公司（ThermoFisher））。

混合模式或多模式層析（MMC）係指在固相介質上進行的層析，它利用了相互作用機制的組合，例如離子交換（CEX或AEX）和疏水相互作用等。市售的多模式層析介質係可用的並且包括Capto ^TMAdhere（賽提瓦公司（Cytiva））。

疏水相互作用層析法係指在固相介質上進行的層析，該層析利用疏水配體和目的蛋白表面上的疏水殘基之間的相互作用。市售疏水相互作用層析介質包括但不限於苯基Sepharose ^TM（賽提瓦公司（Cytiva））、Tosoh己基（托什生物科學公司（Tosoh Bioscience））和Capto ^TM苯基（賽提瓦公司（Cytiva））。

羥磷灰石層析法係指在使用帶正電的鈣和帶負電的磷酸鹽的固相介質上進行的層析法。根據蛋白質的pI和緩衝液的pH，羥磷灰石介質可用作陽離子或陰離子交換劑。

參與滅活、減少和/或消除病毒污染物的單元操作可包括操縱環境和/或依賴於過濾的過程。病毒緩解措施對於確保蛋白質治療劑的安全性至關重要，並且可以在收穫操作的下游純化階段執行一次或多次。病毒污染物可來自多種來源，包括使用動物來源的試劑、宿主細胞系中的外來病毒污染物或GMP生產場所的系統故障。病毒分為包膜病毒和非包膜病毒。對於包膜病毒，包膜允許病毒識別、結合、進入和感染靶宿主細胞。因此，包膜病毒容易受到滅活方法的影響。可以使用各種方法來滅活病毒並且該等方法包括熱滅活/巴氏消毒法，UV和γ射線照射，使用高強度廣譜白光，添加化學滅活劑、界面活性劑、和溶劑/洗滌劑處理。界面活性劑（諸如洗滌劑）能溶解多種膜，並且因此在特異性滅活有包膜病毒方面可能非常有效。實現病毒滅活的一種方法係在低pH（例如，pH小於4）下孵育。在低pH病毒滅活之後，可以進行中和單元操作，該中和單元操作將重新調節經過病毒滅活的溶液至更符合後續單元操作要求的pH值。低pH病毒滅活通常在用親和層析法純化收穫液後進行，特別是用利用來自金黃色葡萄球菌的底物結合配體的親和層析法，諸如蛋白A層析法，因為從這種層析材料的洗脫通常在低pH下進行。示例性低pH病毒滅活方法在美國專利申請案號63/168,608和美國專利申請案號63/159,217中進行了描述。示例性洗滌劑失活在世界國際專利組織公開案號WO 2020/190985中進行了描述。低pH病毒滅活後也可以進行過濾，諸如深度過濾，以除去任何產生的渾濁或沈澱。

無包膜病毒更難滅活而不會對正在生產的蛋白質造成風險，並且可以藉由過濾方法去除。示例性過程在世界國際專利組織公開案號WO 2020/159838中進行了描述。病毒過濾可以使用微米或奈米過濾器（如從PLAVONA ^®（伊利諾州芝加哥的旭化成株式會社（Asahi Kasei，Chicago，IL））、VIROSART ^®（德國戈廷根的賽多利斯公司（Sartorius，Goettingen，Germany））、VIRESOLVE ^® Pro（麻塞諸塞州柏林頓的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma，Burlington，MA））、Pegasus ^TMPrime（紐約華盛頓港的頗爾生物技術（Pall Biotech，Port Washington，NY））和CUNO Zeta Plus VR，（明尼蘇達州聖保羅（St. Paul，Mn）的3M公司）獲得的那些）進行。病毒過濾可能發生在生物製造過程的下游操作中之一或多個步驟。通常，病毒過濾在任何超濾或滲濾（即，UF/DF）操作之前進行，但也可在UF/DF之後進行。

單元操作還可以包括產物濃縮和將目的蛋白緩衝液交換成所需的製劑緩衝液用於藥物的大量儲存。緩衝液交換和產物濃縮可以使用已知的超濾和滲濾方法來完成。可以遵循實現藥物產品填充/完成的單元操作。根據本揭露之方法進一步視需要地包括使用超濾和滲濾（UF/DF）濃縮蛋白質產物。對純化的蛋白質進行超濾和滲濾操作，包括藉由超濾來濃縮或稀釋純化的蛋白質；藉由滲濾將純化的濃縮/稀釋的蛋白質進行緩衝液交換成所需的配製物；以及藉由第二輪超濾進一步稀釋或濃縮配製的純化蛋白，直至達到靶蛋白濃度。可視需要地將一或多種穩定性增強的賦形劑直接添加到含有配製的純化蛋白質的UF/DF滯留物進料罐中，從而產生配製的藥物物質，或者添加到UF/DF洗脫液池中。用於UF/DF操作的過濾器係本領域眾所周知且常見的，並且可從多種來源商購獲得。有許多可獲得的材料類型，包括再生纖維素Pellicon（麻塞諸塞州丹弗士的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma, Danvers, MA））、穩定纖維素、Sartocon ^®Slice、Sartocon ^®ECO Hydrosart ^®（德國戈廷根的賽多利斯公司（Sartorius, Goettingen, Germany））、聚醚碸（PES）膜和Omega（紐約華盛頓港的頗爾公司（Pall Corporation, Port Washington, NY））。多個過濾器可根據支架、橇或UF/DF系統的實際設置所允許的容量或實現生產製程預期目標所需的容量來使用。

如本領域已知的，可以測量純化的目的蛋白的關鍵屬性和性能參數，以更好地為有關生產過程中每個步驟的性能的決策提供資訊。該等關鍵屬性和參數可以即時監測、近即時監測和/或事後監測。在細胞培養期間可以測量主要的關鍵參數，如消耗的培養基組分（如葡萄糖）、累積的代謝副產物（如乳酸和氨）的水平、和與細胞維持和存活相關的參數，如溶氧量。關鍵屬性諸如比生產率、活細胞密度、pH、滲透壓、外觀、顏色、聚集、百分比產率和滴定量可以在生產過程的適當階段監測。可以使用已知技術和可商購的設備進行監測和測量。

藥物組成物（例如，溶液、懸浮液等）可以包括以下中之一或多種：緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝液等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、聚葡萄醣或甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（例如，氫氧化鋁）；和防腐劑；無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽溶液，較佳的是生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉，固定油，諸如可用作溶劑或懸浮介質的合成的單甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇，或其他溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。胃腸外製劑可以被封裝在由玻璃或塑膠製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。 靶蛋白（例如，目的生物分子）

術語「多肽」或「蛋白質」在本揭露全文中可互換使用，並且係指包含藉由肽鍵連接的兩個或更多個胺基酸殘基的分子。多肽和蛋白質還包括具有天然序列的胺基酸殘基的一或多個缺失、插入和/或取代的大分子，即包括由天然存在細胞和非重組細胞產生的多肽或蛋白質；或藉由基因工程化細胞或重組細胞產生，並且包括具有天然蛋白質的胺基酸序列的胺基酸殘基的一或多個缺失、插入和/或取代的分子。多肽和蛋白質還包括如下胺基酸聚合物，其中一或多種胺基酸為對應天然存在的胺基酸和聚合物的化學類似物。多肽和蛋白質也包括修飾，包括但不限於衍生化，諸如糖基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化。

術語「多核苷酸」、「核酸分子」或「工程化核酸分子」在本揭露全文中可互換使用，並且包括單股和雙股核酸，包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA、合成來源的核酸，或與自然界中通常存在的序列無關的一些組合。術語「分離的多核苷酸」、「分離的核酸分子」或「分離的工程化核酸分子」具體係指在自然界中通常不存在的序列，諸如合成來源的序列。包含規定序列的分離的核酸分子除該等規定序列以外還可以包括針對多達十種或甚至多達二十種其他蛋白質或其部分的編碼序列，或可以包括控制所敘述核酸序列的編碼區的表現的可操作地連接的調節序列，及/或可以包括載體序列。包含核酸分子的核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或者任一類型核苷酸的經修飾形式。修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；以及核苷酸間鍵修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯及胺基磷酸酯。

目的生物分子（例如，多肽和蛋白質）可能具有科學意義或商業意義，包括基於蛋白質的治療劑。目的生物分子（例如，蛋白質）尤其包括分泌型蛋白、非分泌型蛋白、胞內蛋白或膜結合蛋白。目的生物分子可以使用細胞培養方法藉由重組動物細胞系產生，並且可以被稱為「重組蛋白」以表示蛋白質生物分子的來源而不是結構。本揭露之蛋白質可以具有與天然存在的蛋白質相同的結構，可為其片段，諸如特異性結合至結合配偶體的片段或酶活性片段，並且蛋白質還可為兩種或更多種蛋白質的至少部分的嵌合體或融合體。表現的一或多種蛋白質可以在細胞內產生或分泌到培養基中，可以根據本揭露之方法從培養基中回收和/或收集。術語「分離的蛋白質」或「分離的重組蛋白質」係指目的多肽或蛋白，該目的多肽或蛋白從會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白質或多肽或其他污染物中純化出來。目的生物分子包括藉由結合靶、特別是下面列出的那些中的靶而發揮治療作用的蛋白質，包括從其衍生的靶、與其相關的靶及其修飾。

「純化」意味著藉由從組成物中去除（部分或完全）至少一種雜質來提高組成物中蛋白的純度。藉由本揭露之方法實現蛋白質的回收和純化，從而產生滿足產率和產物品質基準（諸如減少的產物相關雜質和增加的產物品質）的更「均質」的蛋白質組成物。

如本文所用，術語「分離的」意指 (i) 不含至少一些通常與其一起被發現的蛋白或多核苷酸，(ii) 基本上不含來自相同來源的其他蛋白或多核苷酸，例如來自相同物種或來自相同細胞，(iii) 與至少約50%的在自然界與其相關的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(iv) 可操作地與在自然界與其不相關的多肽相關（藉由共價或非共價相互作用），或 (v) 在自然界中不存在。

目的生物分子（例如蛋白質）包括「抗原結合蛋白」。「抗原結合蛋白」係指包括抗原結合區或抗原結合部分的蛋白質、多肽或其片段，該抗原結合區或抗原結合部分對與其結合的另一分子（抗原）具有親和力。抗原結合蛋白涵蓋抗體、肽體、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物、融合蛋白（包括單鏈可變片段（scFv）和雙鏈（雙價）scFv、突變蛋白、多特異性蛋白和雙特異性蛋白）。

scFv係單鏈抗體片段，它具有連接在一起的抗體重鏈和輕鏈的可變區。參見美國專利案號7,741,465和6,319,494以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy [癌症免疫學與免疫治療] (1997) 45: 131-136，所有該等在相關部分中藉由援引併入本文。scFv保留了親本抗體與靶抗原特異性相互作用的能力。

術語「抗體」包括任何同種型或亞類的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白，或者其與完整抗體競爭特異性結合的抗原結合區。除非另外說明，否則抗體包括人的、人源化的、嵌合的、多特異性的、單株的、多株的、雜IgG（heteroIgG）、雙特異性的抗體、及其寡聚物或抗原結合片段。抗體包括IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。還包括具有抗原結合片段或抗原結合區的蛋白，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、雙抗體、Fd、dAb、最大抗體（maxibody）、單鏈抗體分子、單結構域V _HH、互補決定區（CDR）片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體和至少包含足以使特異性抗原與靶多肽結合的免疫球蛋白的一部分的多肽。

還包括人的、人源化的和其他抗原結合蛋白，如人抗體和人源化抗體，該抗原結合蛋白當投與於人時不會產生明顯有害的免疫響應。

還包括經修飾的蛋白，如經非共價鍵、共價鍵或者共價鍵和非共價鍵兩者化學修飾的蛋白。還包括進一步包含一或多種譯後修飾的蛋白，其可以藉由細胞修飾系統或由酶和/或化學方法離體引入或以本領域已知的任何其他方式引入的修飾製得。

「多特異性構建體」、「多特異性蛋白」和「多特異性抗體」在本文用於指重組工程化以同時結合和中和同一抗原上的至少兩個不同抗原或至少兩個不同表位的蛋白。例如，多特異性蛋白可以被工程化以靶向與針對腫瘤的靶向細胞毒性劑或感染劑組合的免疫效應子。雙特異性蛋白包括三特異性抗體、四價雙特異性抗體、不含抗體組分多特異性蛋白（如雙抗體、三抗體或四抗體、微型體）、以及能夠結合多個靶標的單股蛋白。Coloma, M.J. 等人, Nature Biotech. [自然-生物技術] 15:159-163 (1997)，在相關部分中藉由援引併入本文。

最常見和最多樣化的多特異性蛋白係結合兩種抗原的蛋白，在本文中稱為「雙特異性」、「雙特異性構建體」、「雙特異性蛋白質」和「雙特異性抗體」。雙特異性蛋白可分為兩大類：免疫球蛋白G（IgG）樣分子和非IgG樣分子。IgG樣分子保留了Fc介導的效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞毒性（CDC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）。Fc區有助於提高溶解度和穩定性並有助於一些純化操作。非IgG樣分子較小，可增強組織穿透力（參見Sedykh等人, Drug Design, Development and Therapy [藥物設計、開發與療法] 18(12), 195-208, 2018；Fan等人, J Hematol & Oncology [血液與腫瘤學雜誌] 8:130-143, 2015；Spiess等人, Mol Immunol [分子免疫學] 67, 95-106, 2015；Williams等人, 第41章 Process Design for Bispecific Antibodies in Biopharmaceutical Processing Development [生物製藥處理開發中雙特異性抗體的過程設計], Design and Implementation of Manufacturing Processes [製造過程的設計與實現], Jagschies等人編輯, 2018, 第837-855頁，全部在相關部分中藉由援引併入本文）。雙特異性蛋白有時被用作具有對不同抗原或表位數目的結合特異性的另外組分的框架，增加了分子的結合特異性。

包括雙特異性抗體的雙特異性蛋白的形式正在不斷發展，並且包括但不限於單鏈抗體、四源融合瘤、杵臼結構、交叉單株抗體、雙可變結構域IgG（DVD-IgG）、IgG單鏈Fv（scFv）、scFv-CH3 KIH、雙功能Fab（DAF）、半-分子交換、κλ-體、串聯scFv、scFv-Fc、雙抗體、單鏈雙抗體（sc雙抗體）、sc雙抗體-CH3、三抗體、微型抗體、微型體、TriBi微型體、串聯雙抗體、sc雙抗體-HAS、串聯scFv-毒素、雙親和重定向分子（DART）、奈米抗體、奈米抗體-HSA、對接和鎖定（DNL）、鏈交換工程化結構域SEED體（SEEDbody）、三功能抗體（Triomab）、白胺酸拉鍊（LUZ-Y）、XmAb ^®；Fab-臂交換、DutaMab、DT-IgG、帶電荷的對（charged pair）、Fcab、正交Fab、IgG(H)-scFv、scFV-(H)IgG、IgG(L)-scFV、IgG(L1H1)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFV-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy體（Zybody）、DVI-Ig4（四合一）、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFV、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙抗體-Fc、雙抗體-Fc、胞內抗體、ImmTAC、HSA體（HSABody）、IgG-IgG、Cov-X-體、scFv1-PEG-scFv2、雙特異性T細胞接合物（包括BiTE ^®分子（Fan，同上；Spiess, 同上；Sedykh, 同上；Seimetz等人, Cancer Treat Rev[癌症治療評論] 36(6) 458-67, 2010；Shulka和Norman, 第26章 Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates [Fc融合蛋白、雙特異性抗體和抗體藥物綴合物的下游處理], 在第二版Process Scale Purification of Antibodies [抗體的生產規模純化] 中, Uwe Gottschalk編輯, 第559-594頁, John Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 2017；Moore等人, MAbs [單株抗體] 3:6, 546-557, 2011，它們各自在相關部分中藉由援引併入本文））。目的生物分子（例如，蛋白質）還可以包括重組融合蛋白，該重組融合蛋白包括例如多聚化結構域，如白胺酸拉鍊、纏繞線圈、免疫球蛋白的Fc部分等。還包括包含分化抗原的全部或部分胺基酸序列的蛋白（稱為CD蛋白）或其配體或與該等中之任一個基本上相似的蛋白。

目的生物分子（例如，蛋白質）還可以包括基因工程化受體，諸如嵌合抗原受體（CAR或CAR-T）和T細胞受體（TCR），以及包含與該靶向抗原相互作用的抗原結合分子的其他蛋白質。藉由包含與靶抗原相互作用的抗原結合分子，CAR可以被工程化以結合抗原（諸如細胞表面抗原）。CAR通常將抗原結合結構域（如scFv）與一或多個共刺激（「傳訊」）結構域和一或多個胞內活化結構域串聯在一起。

在一些實施方式中，目的生物分子（例如，蛋白質）可包括群落刺激因子，例如顆粒球群落刺激因子（G-CSF）。此類G-CSF試劑包括但不限於Neupogen®（非格司亭）和Neulasta®（培非格司亭）。還包括紅血球生成刺激劑（ESA），諸如Epogen®（依泊汀α）、Aranesp®（達貝泊汀α）、Dynepo®（依泊汀δ）、Mircera®（甲氧基聚乙二醇-依泊汀β）、Hematide®、MRK-2578、INS-22、Retacrit®（依泊汀ζ）、Neorecormon®（依泊汀β）、Silapo®（依泊汀ζ）、Binocrit®（依泊汀α）、epoetin alfa Hexal、Abseamed®（依泊汀α）、Ratioepo®（依泊汀θ）、Eporatio®（依泊汀θ）、Biopoin®（依泊汀θ）、依泊汀α、依泊汀β、依泊汀ζ、依泊汀θ、依泊汀δ、依泊汀ω、依泊汀ι、組織性血漿蛋白原活化劑、GLP-1受體促效劑，以及前述任何內容的分子或其變體或類似物和生物仿製藥。

在一些實施方式中，目的生物分子（例如，蛋白質）可以包括特異性結合一或多種CD蛋白、HER受體家族蛋白、細胞黏附分子、生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）、似胰島素生長因子、骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白、凝血和凝血相關蛋白、群落刺激因子（CSF）、其他血液和血清蛋白、血型抗原、受體、受體相關蛋白、生長激素、生長激素受體、T細胞受體、神經滋養因子、神經滋養蛋白、鬆弛素、干擾素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整聯蛋白、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、運輸蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白和免疫黏附素的蛋白質。

在一些實施方式中，目的生物分子（例如，蛋白質）單獨或以任何組合與以下中之一或多種結合：CD蛋白（包括但不限於CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174）、HER受體家族蛋白（包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受體）、EGFRvIII、細胞黏附分子（例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整聯蛋白）、生長因子（包括但不限於血管內皮生長因子（「VEGF」））；VEGFR2、生長激素、甲狀腺刺激素、促濾泡素、黃體生成激素、生長激素釋放因子、甲狀旁腺激素、米勒管抑制物質、人類巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1-α）、促紅血球生成素（EPO）、神經生長因子（比如，NGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、纖維母細胞生長因子（包括例如aFGF和bFGF）、上皮生長因子（EGF）、Cripto、轉化生長因子（TGF）（尤其包括TGF-α和TGF-β（包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5））、似胰島素生長因子-I和似胰島素生長因子-II（IGF-I和IGF-II）、des(1-3)-IGF-I（腦IGF-I）和骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白（包括但不限於胰島素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素原和類胰島素生長因子結合蛋白）；（凝血和凝血相關蛋白諸如因子VIII、組織因子、von Willebrand因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、血漿蛋白原活化劑諸如尿激酶和組織性血漿蛋白原活化劑（「t-PA」）、bombazine、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受體、群落刺激因子（CSF），包括以下各項：M-CSF、GM-CSF和G-CSF、其他血液和血清蛋白，包括但不限於白蛋白、IgE和血型抗原、受體和受體相關蛋白，包括例如flk2/flt3受體、肥胖（OB）受體、生長激素受體、T細胞受體、神經滋養因子，包括但不限於骨源性神經滋養因子（BDNF）和神經滋養蛋白-3、-4、-5或-6（NT-3、NT-4、NT-5或NT-6）、鬆弛素A-鏈、鬆弛素B-鏈和鬆弛素原、干擾素，包括例如干擾素-α、-β和-γ、白介素（IL）和它們的受體、例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受體、IL-4受體和/或IL-13受體、IL-13RA2或IL-17受體、IL-1RAP、IL1-α、IL-1β、病毒抗原，包括但不限於AIDS包膜病毒抗原、脂蛋白、降鈣素、升糖素、心房利鈉因子、肺界面活性劑、腫瘤壞死因子-α和-β、腦啡肽酶、BCMA、Igκ、ROR-1、ERBB2、間皮素、RANTES（調節正常T細胞表現和分泌的活化）、小鼠促性腺激素相關肽、DNA酶、FR-α、抑制素和活化素、整聯蛋白、蛋白A或D、類風濕因子、免疫毒素、骨成形性蛋白質（BMP）、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰變加速因子（DAF）、AIDS包膜、運輸蛋白、歸巢受體、MIC（MIC-a、MIC-B）、ULBP 1-6、EPCAM、PSA、位址素、調節蛋白、免疫黏附素、抗原結合蛋白、生長激素、CTGF、CTLA4、嗜酸細胞活化趨化介素-1、MUC1、CEA、c-MET、緊密連接蛋白（Claudin）-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GM2、BAFF、OPGL（RANKL）、肌生長抑制素、Dickkopf-1（DKK-1）、Ang2、NGF、IGF-1受體、肝細胞生長因子（HGF）、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、P-鈣黏蛋白、NKG2D-1、程式化細胞死亡蛋白1和配體PD1和PDL1、甘露糖受體/hCGβ、C型肝炎病毒、間皮素、SS1(dsFv)PE38綴合物、退伍軍人症嗜肺桿菌（ Legionella pneumophila）（lly） 、gpA33、B7H3、干擾素（IFN）γ、干擾素γ誘導蛋白10（IP10）、IFNAR、TALL-1、胸腺基質淋巴球生成素（TSLP）、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型（PCSK9）、幹細胞因子、Flt-3、降鈣素基因相關肽（CGRP）、OX40L、α4β7整聯蛋白、血小板特異性（血小板糖蛋白Iib/IIIb（PAC-1）、轉化生長因子β（TFGβ）、透明帶精子結合蛋白3（ZP-3）、TWEAK、血小板衍生的生長因子受體α（PDGFRα）、硬化素，以及任何前述物質的生物活性片段或變體。

在一些實施方式中，目的生物分子（例如，蛋白質）包括阿昔單抗、阿達木單抗、阿德木單抗、阿柏西普、阿侖單抗、阿利庫單抗、阿那白滯素、阿塞西普、巴厘昔單抗、貝利木單抗、貝伐單抗、生物素單抗（biosozumab）、本妥昔單抗、布羅達單抗、莫坎妥珠單抗、康納單抗、西妥昔單抗、塞妥珠單抗、可那木單抗、達利珠單抗、迪諾舒單抗（denosumab）、依庫麗單抗、依決洛單抗、依法利珠單抗、依帕珠單抗、依那西普、依伏庫單抗、加利昔單抗、蓋尼塔單抗、吉妥珠單抗、戈利木單抗、替伊莫單抗、英夫利昔單抗、易普利姆瑪、樂地單抗、魯昔單抗、左旋單抗（lxdkizumab）、馬帕木單抗、磷酸莫特沙尼（motesanib diphosphate）、莫羅單抗-CD3、那他珠單抗、奈西立肽、尼妥珠單抗、納武單抗、奧瑞珠單抗、奧法木單抗、奧馬珠單抗、奧普瑞白介素、帕利珠單抗、帕尼單抗、派姆單抗、帕妥珠單抗、培克珠單抗、蘭尼單抗、利妥木單抗、利妥昔單抗、羅米司亭、洛莫索珠單抗、沙格司亭、托珠單抗、托西莫單抗、曲妥單抗、優特克單抗、維多珠單抗、維西珠單抗、伏洛昔單抗、紮木單抗、紮魯木單抗、以及前述任何內容的生物仿製藥。

在一些實施方式中，目的生物分子（例如，蛋白質）可以包括博納吐單抗、卡妥索單抗、厄妥索單抗、索利托單抗、targomiRs、魯吉珠單抗（ABT981）、伐努賽珠單抗（RG7221）、壬托魯單抗（ABT122）、奧利組單抗（ozoralixumab）（ATN103）、弗洛特單抗（floteuzmab）（MGD006）、帕妥昔珠單抗（AMG112、MT112）、lymphomun（FBTA05）、（ATN-103）、AMG211（MT111、Medi-1565）、AMG330、AMG420（B1836909）、AMG-110（MT110）、MDX-447、TF2、rM28、HER2Bi-aATC、GD2Bi-aATC、MGD006、MGD007、MGD009、MGD010、MGD011（JNJ64052781）、IMCgp100、銦標記的IMP-205、xm734、LY3164530、OMP-305BB3、REGN1979、COV322、ABT112、ABT165、RG-6013（ACE910）、RG7597（MEDH7945A）、RG7802、RG7813（RO6895882）、RG7386、BITS7201A（RG7990）、RG7716、BFKF8488A（RG7992）、MCLA-128、MM-111、MM141、MOR209/ES414、MSB0010841、ALX-0061、ALX0761、ALX0141；BII034020、AFM13、AFM11、SAR156597、FBTA05、PF06671008、GSK2434735、MEDI3902、MEDI0700、MEDI7352，以及其修飾的分子或變體或類似物和上述任何一種的生物仿製藥。

根據本揭露之目的生物分子（例如，蛋白質）涵蓋所有前述內容，並且進一步包括包含上述任何抗體的1、2、3、4、5或6個互補決定區（CDR）的抗體。還包括這樣的變體，其包括與蛋白質形式的目的生物分子的參考胺基酸序列具有70%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高同一性的胺基酸序列的區。在這方面的同一性可以使用多種熟知的且容易獲得的形式的胺基酸序列分析軟體來確定。較佳的軟體包括實施史密斯-沃特曼（Smith-Waterman）演算法的那些軟體，該軟體被認為是搜索和比對序列問題的令人滿意的解決方案。還可以採用其他演算法，特別是在速度係重要考慮因素的情況下。可以用於此方面的用於DNA、RNA和多肽的比對和同源性匹配的常用程式包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE和MPSRCH，後者係用於在MasPar製造的大規模並行處理器上執行的史密斯-沃特曼演算法的實施方式。

嵌合抗原受體（CAR）包含本領域已知的一或多個共刺激（傳訊）結構域以增加CAR-T細胞響應的效力。參見美國專利案號7,741,465和6,319,494，以及Krause等人和Finney等人（同上），Song等人, Blood [血液] 119:696-706 (2012)；Kalos 等人, Sci Transl. Med. [科學轉化醫學] 3:95 (2011)；Porter等人, N. Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 365:725-33 (2011)以及Gross等人, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. [藥理學和毒理學年度評論] 56:59-83 (2016)，它們各自在相關部分中藉由援引併入本文。用於結合到CAR中的示例性共刺激結構域可以源自（除其他來源外）CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3（α、β、δ、ε、γ、ξ）、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD 33、CD37、CD40、CD 45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1（LFA-1（CDl la/CD18）、CD247、CD276（B7-H3）、LIGHT（腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14）、NKG2C、Ig α（CD79a）、DAP-10、Fc γ受體、MHC I類分子、TNF、TNFr、整聯蛋白、傳訊淋巴球活化分子、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM（LIGHTR）、KIRDS2、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2R β、IL-2R γ、IL-7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl-ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl-la、LFA-1、ITGAM、CDl-lb、ITGAX、CDl-lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRT AM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Lyl08）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、41-BB、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配體、或其片段或組合。共刺激結構域可以包含共刺激結構域所來源的蛋白質的胞外部分、跨膜部分和胞內部分中之一或多種。

提供以下實例（實際的和預測的二者）係為了說明本發明的實施方式或特徵，而不是為了限制其範圍。 實例 實例 1 高密度細胞培養物的單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心、絮凝和深度過濾。

該實例提供了一種用於使用純化方案從高密度連續灌注哺乳動物細胞培養物中純化靶蛋白的收穫方法，該純化方案利用單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心步驟，隨後進行絮凝和深度過濾。該收穫方法使用非常規但有效的方法從高密度培養物中生產高產率、純化的蛋白質。

以500 L規模進行九種不同的灌注培養。培養物包含四種單株抗體（mAb）即mAb 1（運行1、2和3）、mAb 2、mAb 3或mAb 4、xmAb（運行1和2）中之一種，或者培養物包含兩種雙特異性抗體（Bsp）即Bsp 1和Bsp 2中之一種。

在第0天，將表現單株或雙特異性抗體的CHO細胞以450-500 L無血清、化學成分確定的批式培養基的工作體積接種到500 L單次使用生物反應器中。以批式模式在36°C下在攪拌下開始培養。然後使用X-CELL ATF-6 ^®交替切向流（ATF）過濾系統（麻塞諸塞州沃爾珊的雷普雷根公司（Repligen, Waltham, MA））用標稱表面積為2.1 m ²的ATF-6過濾器和無血清、化學成分確定的灌注培養基連續灌注培養物直至收穫。對培養物進行低溫轉變（32-33°C）以增加產量並維持在較低溫度直至收穫。

在第15天或第18天，生物反應器的內容物大量收穫。最初，將培養物冷卻至10°C。然後在10°C下直接收穫細胞培養液或將其收集到儲存罐中並保持在4°C。使用常規技術測定培養物的收穫細胞活力、活細胞密度（VCD）、紅血球容積百分比（%PCV）和基線濁度，結果示於表1中。

使用500 L單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機（加利福尼亞州弗雷斯諾（Fresno, CA）的Alfa Laval Primo ^™）對未稀釋的細胞培養物進行連續離心。藉由串聯機構以特定流速將細胞培養物連續裝載到離心機中（表1）。離心機以5.25 E-9 m/s至1.5×E-8 m/s的等效沈降速率（Q/∑）或0.6至1.8（L/h/KQ）操作，%PCV值為16%-30%。

調節進料流速和重相泵流速以維持所需的重相%PCV。控制轉筒速度和進料流速以維持所需的輕相濁度值。報告的離心機進料流速、離心分離液流速、重相流速和收穫產率的值係給定樣本在離心過程中不同樣本時間點的平均值（參見表1）。

如表1所示，使用Alfa Laval Primo ^™轉筒，平均轉筒速度根據所收穫的分子而變化，並且為4713-5200 rpm。平均離心機進料流速在0.7-2.0 L/min（LPM）之間。將離心分離液連續收集到收穫罐中並在混合下保持在10°C。將濃縮物（重相）排放到廢物中。平均離心分離液流速在0.79-1.51 L/min之間。平均濃縮物（重相）流速在0.29-0.61 L/min之間。平均濃縮物（重相）% PCV為77%-96%。定期進行線上離心分離液測量，平均離心分離液濁度在165-940比濁法濁度單位（NTU）之間。平均理論離心產率在88%-99%之間。在根據本揭露之方法進行單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心時，注意進料流速、轉筒速度和重相%PCV目標，其受進料的細胞密度和重相泵的流速影響。如本文所述，使用Q/∑值總結該等參數，並且Q/∑值與濁度正相關，因為對於給定的等效沈降面積（∑），進料流速（Q）的增加將增加濁度。重要的離心操作參數包括離心機轉筒速度、進料流速、細胞培養物固體含量（PCV）和重相（細胞糊）固體含量（PCV）。在整個申請中揭露了該等參數的示例性值。調節該等參數以控制歸一化沈降速率（Q/∑）和理論分步產率。如本領域已知的，Q/∑提供了標準化沈降速率的量度，其中Q係進料流速，並且∑係旋轉轉筒的標準化沈降面積。為了獲得相對較低的Q/∑，離心機以較低的進料流速操作，以允許更多的停留時間來捕獲細胞和更大的碎片，從而在離心分離液中產生較少的碎片。

離心分離液濁度通常與顆粒（尤其是細顆粒）的濃度成正比。如本文的數據所示，收穫物和離心分離液濁度由於細胞培養物、細胞密度、紅血球容積和根據本揭露收穫的各種培養物的活力百分比的差異而在一定程度上變化。值得注意的是，使用間歇固體排放離心的先前技術僅適用於細胞培養物收穫時PCV值為3%-12%的較低細胞密度培養物。使用饋料批式細胞培養從細胞培養物中獲得目的蛋白的其他方法導致較低的濁度，但這係由於較低的細胞密度和較低的%PCV，與降低的顆粒負荷一致。在一些方法中，設計了收穫操作，其中將具有相對低%PCV的細胞培養物與細胞糊混合。結果係一種混合的含細胞流體，其中%PCV在具有人為高細胞活力和相應低細胞碎片的環境中人為增加，從而允許不適合於現實世界細胞培養物收穫操作的高細胞培養物進料或流速。

如本文所揭露的實驗所證實的，單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心可有效地以高產率從細胞培養液中去除全細胞。然而，觀察到的平均離心分離液濁度為165至941 NTU，表明溶液中保留有大量細胞碎片。造成離心分離液濁度的一個主要原因係累積的細胞碎片，這主要是由生物反應器或細胞培養容器中的細胞死亡機制引起的，但也可能受離心機操作方式的影響。例如，較低的進料流速和較高的轉筒速度將降低濁度。濁度的變化使深度過濾器的尺寸確定變得複雜。藉由增加離心後絮凝步驟克服了該難題。增加絮凝步驟提高了過程的穩健性，以應對實際靶蛋白收穫物中濁度變化的影響。藉由比較研究揭示了添加絮凝步驟的益處，其中將藉由絮凝隨後深度過濾的離心分離液澄清與僅藉由深度過濾的澄清進行比較（參見實例2）。首先藉由將不同濃度的pDADMAC添加到離心分離液中，然後進行實驗室規模的離心和上清液濁度測量來研究絮凝濃度對濁度的影響。在0.04%至0.10%（w/w）pDADMAC的濃度下觀察到低濁度（圖5）。使用不同的深度過濾器測試濃度為0.05%（w/v）的pDADMAC，隨後進行深度過濾，並將結果與單獨使用深度過濾獲得的結果進行比較。更特別地，該等實驗的結果表明，與單獨的深度過濾相比，pDADMAC處理後的深度過濾負載量增加了0.85-16.2倍（圖1）。除了增加深度過濾器負載水平之外，與單獨深度過濾相比，絮凝和深度過濾觀察到相似或改善的DNA清除和宿主細胞蛋白（HCP）清除（圖3和4）。當與單獨的深度過濾相比時，改進的過濾器負載和雜質清除不會不利地影響分步產率（圖2）。通常，當與單獨的深度過濾相比時，對於絮凝和深度過濾觀察到相似或改善的分步產率。考慮到離心分離液的澄清度增加，產物損失的水平係可接受的，其適用於直接應用於層析段分，例如抗體生物製劑與蛋白質A柱的親和結合。 [ 表 1] . 用於各種大規模（ 500 L ）運行的單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心機參數

樣本名稱	培養持續時間（天）	收穫日 %PCV	收穫樣本濁度（ NTU ）	收穫 VCD （ ×10 5 個細胞 /ml ）	收穫活力（ % ）	平均轉筒角速度（ RPM ）	平均離心機進料流速（ LPM ）	Q/ ∑ （ m/s ）	平均離心分離液流速（ LPM ）	平均重相流速（ LPM ）	平均重相 % PCV	平均離心分離液濁度（ NTU ）	平均離心機產率（ % ）
mAb 1（運行1）	18	24	250	218	88	5200	2.0	1.50E-08	1.51	0.61	84	272	94
mAb 1（運行2）	18	24	250	218	79	5200	1.5	1.12E-08	1.5	0.45	82	182	93
mAb 2	15	16	184	327	81	5200	1.5	1.12E-08	1.19	0.3	94	322	97
mAb 3	15	27	524	316	n/a	5147	1.5	1.12E-08	0.94	0.54	83	669	91
xmAb 1（運行1）	15	26	404	542	88	5140	1.3	9.74E-09	0.86	0.45	93	299	93
xmAb 1（運行2）	15	25	300	641	89	5138	1.2	8.99E-09	0.79	0.41	84	235	90
雙特異性1	15	30	N/A	602	88	5200	0.7	5.25E-09	1.09	0.5	77	165	88
mAb 4	15	23	N/A	526	88	4713	1.7	1.27E-08	1.28	0.45	96	941	99
雙特異性2	15	18	195	208	44	5133	1.3	9.74E-09	1.02	0.29	82	n/a	95

Avg—平均值 NTU—比濁法濁度單位 VCD—活細胞密度 LPM—升/分鐘 實例 2 絮凝的離心分離液的深度過濾

在本揭露之收穫方法中，在單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心和絮凝/沈澱之後，使用深度過濾進一步純化離心分離液材料。因此，將從實例1中描述的大規模收穫獲得的絮凝後的離心分離液材料的流體級分用於絮凝和小規模深度過濾實驗，以比較未處理的與pDADMAC絮凝的離心分離液之間的深度過濾性能，如上面實例1中簡述的。向1L離心分離液樣本中添加pDADMAC（聚二烯丙基二甲基氯化銨，密蘇里州聖路易斯的西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich, St. Louis, MO））儲備溶液至最終濃度為0.025%-0.01%（w/w）pDADMAC。來自各離心分離液的1L樣本未經處理以充當處理對照。將pDADMAC溶液連續添加到離心分離液中約一分鐘，並在10°C下攪拌至少30分鐘。使用攪拌板和攪拌棒實現攪拌；改變攪拌速率以保持離心分離液與絮凝材料的恒定混合。以不同形式和不同深度過濾器總共測試了56種條件。結果表明，0.035%-0.10%（w/w）pDADMAC限定了含有靶蛋白的多種離心分離液的絮凝的最佳濃度範圍（參見圖5和圖6）。數據表明，最優和次優但仍有效的絮凝劑濃度，並且與該數據一致，本揭露考慮了用於本揭露之收穫方法中的0.025%-0.15%絮凝劑的範圍。

具有較大孔徑分佈（諸如C0HC和C0SP）的過濾器可能不適用於未處理的材料，因為使用動態光散射（DLS）測量各種分子的未處理的離心分離液中的顆粒尺寸分佈在1 μm-60 μm範圍內，其中大多數顆粒在1-40 μm範圍內。該粒度範圍與該等過濾器的標稱孔徑分佈一致。此外，未處理的材料中較細顆粒的數量增加，這可能導致內部過濾器堵塞並進一步加劇深度過濾通過量。相比之下，pDADMAC絮凝藉由將更細的分子聚集在一起形成更大的顆粒而起作用。DLS數據表明，在pDADMAC處理後，顆粒數量減少，平均粒度增加。這可以解釋在pDADMAC絮凝之後使用的深度過濾器的通過量增加的原因；與含有大量較細顆粒（在過濾總顆粒中所占比例較高）的未處理材料相比，較大顆粒被過濾器保留並防止內部堵塞。選擇正確的處理類型、處理濃度和深度過濾器標稱孔徑等級與優化深度過濾器負載、分步產率和雜質去除有關。

測試了六種小型微莢深度過濾器，MILLISTAK+ ^®X0HC、MILLISTAK+ ^®X0SP、MILLISTAK+ ^®C0HC、MILLISTAK+ ^®C0SP（麻塞諸塞州柏林頓的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma, Burlington, Mass））、SARTOCLEAR ^®DL60和SARTOCLEAR ^®DL75 （紐約州波希米亞的賽多利斯公司（Sartorius, Bohemia, NY））。Millipore和Sartorius深度過濾器分別為23 cm ²和25 cm ²。

用於小規模實驗的深度過濾器的孔徑分佈和材料組成不同。Millipore X0HC和C0HC深度過濾器由纖維素和無機助濾劑組成。X0HC孔徑範圍為0.1-0.5 μm，C0HC深度過濾器孔徑範圍為0.3-1.0 μm。Millipore X0SP和C0SP深度過濾器係合成的，具有與X0HC和C0HC深度過濾器相同的孔徑分佈。與Millipore深度過濾器相比，Sartorius DL60和DL75的孔徑分佈範圍更廣，標稱孔徑分佈分別為0.6-10 μm和2-14 μm。DL60深度過濾器具有一個純纖維素預過濾器和一個粗二級過濾器的組合。DL75深度過濾器包含一個粗初級過濾器和一個二級精過濾級過濾器。用於開發的深度過濾器中的各種孔徑分佈和材料特性確保了大的深度過濾數據集可用於支持所揭露的收穫方法選擇適當的深度過濾器。

在裝載經處理和未處理的樣本之前，在約10°C的溫度下以小於400升/平方米/小時（LMH）通量的流速用純化水或緩衝溶液沖洗深濾器以實現至少100 L/m ²的目標通過量。沖洗初級深度過濾器後，將二級0.2 μm Optiscale Capsule SHC過濾器連接至初級過濾器（麻塞諸塞州柏林頓的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma, Burlington, Mass）），並以相同的通量率沖洗二級過濾器，目標通過量為至少50 L/m ²。二級過濾器的表面積為3.6 cm ²，對於Millipore和Sartorius深度過濾器，1級與2級的深度過濾表面比分別為6.38和7.14。

在水沖洗之後，將初級深度過濾器的入口排水，以除去多餘的水。然後用它們各自的裝載物（未處理的離心分離液或絮凝的離心分離液）對深度過濾器進行灌注，以確保去除氣泡。然後向過濾器中裝入1 L未處理的離心分離液或1 L絮凝的離心分離液。實驗期間的入口通量保持在90 LMH與150 LMH之間。最終深度過濾通過量根據深度過濾的性能而變化。在實驗結束時測量深度濾液池的濁度。

當過濾器中的1級入口壓力達到至少20 psig時或達到所需的通過量時，深度過濾實驗結束。在一些情況下，由於時間限制，深度過濾實驗在達到所需通過量之前結束。基於得自深度過濾和絮凝研究兩者的數據，0.02%-0.1%（w/w）的pDADMAC範圍被證明係在本揭露之收穫方法中誘導有益絮凝的最佳濃度範圍。

包括以下參數以評估小規模深度過濾的性能：深度過濾最終通過量、深度過濾產率、深度濾液池宿主細胞蛋白（HCP）水平（也稱為CHOP水平）、深度濾液池DNA水平、歸一化深度過濾通過量、HCP對數減少值（LRV）和DNA LRV。使用未處理的X0HC深度過濾器作為對照條件並將各種參數的最終值除以對照條件（X0HC+未處理）來計算歸一化值。歸一化值顯示了所測試的各種參數的增減幅度，因此有助於更好地評估新收穫技術的改進程度。LRV藉由對測得的負載值除以測得的池值應用以十為底的對數變換來計算。

深度過濾中改進的性能的特徵在於增加的深度過濾通過量值或歸一化的深度過濾通過量值、增加的或相當的百分比產率以及增加的或相當的HCP LRV和/或DNA LRV。

圖1示出了各種分子、處理類型和深度過濾器的深度過濾歸一化通過量值。與未處理的離心分離液的量值相比，絮凝的離心分離液條件的歸一化深度過濾量值在0.85-16.2倍的範圍內。測試了三種主要處理類型：對照（X0HC+未處理）、pDADMAC處理（各種深度過濾器 + 0.05%（w/w）pDADMAC絮凝）和未處理（除X0HC +未處理之外的各種深度過濾器）。所有條件均在小於或等於150 LMH通量下運行。通常，數據表明，使用0.05%（w/w）pDADMAC絮凝的深度過濾通過量比使用X0HC深度過濾器和未處理的離心分離液的對照條件高得多，與材料和測試樣本的最終%PCV無關。具體地，除了mAb1和X0HC之外，所有深度過濾器在0.05%（w/w）pDADMAC絮凝時表現更好。對照和未處理的條件在短時間內達到不超過20 psig的最大壓力，而pDADMAC處理的條件保持壓差小於10 psig並且可以操作更長的時間。這係有利的，因為這表明在達到峰值壓力之前可以過濾更多體積的材料。20 psig的峰值壓力被認為是一種危險和安全風險，因此限制了深度過濾操作。

圖2示出了0.05%（w/w）pDADMAC處理條件的百分比產率與對照條件和未處理條件相當或更高。作為例外的深度過濾器係與pDADMAC處理配對的X0SP和X0HC。因此，由於產率較低，不較佳的是使用X0SP或X0HC過濾與pDADMAC處理的離心分離液。對照和未處理的條件顯示產率較低，這係由於深度過濾器堵塞導致達到最大壓力所致。在該等實驗中，不進行回收緩衝液沖洗。

評估圖1中所示的小規模絮凝和深度過濾池的雜質水平。測量深度濾液池雜質水平並使用對數減少值（LRV）計算與離心分離液池比較。當觀察到高LRV值時，觀察到高雜質清除率。圖3和圖4示出了pDADMAC處理（深灰色）、未處理（淺灰色）和對照條件（黑色）的HCP和DNA值。在離心分離液批次之間觀察到雜質LRV的變化，但一般而言，pDADMAC處理的離心分離液的雜質LRV與未處理的離心分離液和對照條件相似或更好。

本揭露提供了一種收穫方法，該方法利用單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心結合離心分離液的絮凝，例如使用pDADMAC處理進行絮凝，以及深度過濾，該深度過濾導致比使用微濾的傳統灌注培養收穫方法更高的收穫產率。在連續灌注培養中產生的分子，諸如實例1中揭露的那些，具有16%至30%範圍內的高PCV。高PCV細胞培養對現有的微濾收穫技術提出了挑戰，由於增加的過濾器使用導致收穫產率變化和高成本。另外，一些分子的收穫產率較低（約70%），這係由可歸因於細胞培養可變性、過濾器可變性和設備變化的產物損失導致的，該等變化共同導致在收穫操作過程中不同量的產物損失。由於離心機堵塞，目前的間歇固體排放離心機技術無法處理如此高的PCV細胞培養收穫物。人們認識到，連續固體排放圓盤堆疊式離心可能無法提供高固體含量細胞培養收穫物的充分澄清，並且可能無法提供其自身或甚至與深度過濾組合的穩健收穫方法選項，如在未處理的離心分離液實例中的低通過量和在一些情況下低百分比產率、HCP清除率和DNA清除率中所見。連續固體排放圓盤堆疊式離心和隨後的絮凝的組合導致了用於從高固體含量灌注細胞培養物中收穫多種靶蛋白的穩健過程，並且該過程還使得結合深度過濾步驟以進一步純化靶蛋白成為可能，同時在與進一步常規下游純化操作相容的一系列成本有效的步驟中保持高產率。

用0.05%（w/w）pDADMAC處理離心分離液導致較小顆粒的聚集，減少顆粒的總量，同時有效地增加粒度分佈，使得當與合適的深度過濾器（例如，Millistak+ ^®C0HC、Millistak+ ^®C0SP、Sartoclear ^®DL75或Sartoclear ^®DL60）配對時，離心和凝聚步驟導致深度過濾通過量增加，同時當收穫大多數靶蛋白時提供相似或改善的收穫產率、HCP清除率和DNA清除率。另外，pDADMAC絮凝能夠在整個運行中保持較低的壓差，這在安全性和過濾所需量的材料同時滿足目標深度過濾通過量目標的能力而言係一個重要方面（參見圖8）。 實例 3 pDADMAC 濃度對濁度和小規模深度過濾性能的影響

進行pDADMAC劑量研究以瞭解pDADMAC濃度對絮凝樣本濁度的影響。使用具有不同濁度的離心分離液重複劑量研究。藉由改變模式和單次使用連續固體排放離心機操作條件產生離心分離液濁度的變化，如表2所述。藉由將來自儲備溶液的pDADMAC添加到40 mL離心分離液中至表2中所示的最終pDADMAC濃度來進行劑量研究 。將對照（0% w/w pDADMAC）和pDADMAC處理的離心分離液混合至少15分鐘。使用JS4.2離心機（印地安納州印第安納波利斯的貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter, Indianapolis, IN））以3000 rpm離心樣本17分鐘。離心後，將上清液置於新的錐形管中，並使用Hach 2100P可擕式濁度計（科羅拉多州洛弗蘭的哈希公司（Hach Company, Loveland, CO））測量上清液的濁度。 [ 表 2]. mAb 1和xmAb 1的pDADMAC劑量研究

單次使用連續離心機參數	pDADMAC 劑量研究
模式 （運行）	條件	初始離心分離液濁度（NTU）	泵速（RPM）	入口流速（LPM）	pDADMAC濃度範圍（%w/w）
mAb 1 （運行2）	1	547	5400	1.5	0	0.025	0.04	0.06	0.08	0.1
2	740	6400	1.5	0	0.025	0.04	0.06	0.08	0.1
3	663	6720	1.7	0	0.025	0.04	0.06	0.08	0.1
4	740	5760	1.3	0	0.025	0.04	0.06	0.08	0.1
xmAb 1 （運行1）	1	1500	6204	1.5	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1
2	250	6294	1.3	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1

圖5顯示了如表2所述之pDADMAC劑量研究的結果。圖5A顯示了使用表1的mAb 1（運行2）和表2所述之條件的pDADMAC劑量研究的結果。該研究評價了pDADMAC濃度對經受不同離心機流速和轉筒速度的各種離心分離液源的濁度水平的影響。注意，表1僅顯示了進料流速和轉筒速度的平均值。研究結果揭示了在0.04至0.10%（w/w）的pDADMAC濃度範圍內低的上清液濁度值。低於0.04%的pDADMAC濃度水平係不期望的，因為這導致高濁度水平。

圖5B描述了來自xmAb1（運行1）的pDADMAC劑量研究的結果。本研究評價了pDADMAC濃度對具有不同初始濁度水平的離心分離液源的影響。藉由改變單次使用離心機的入口流速產生了離心分離液中不同的初始濁度。高濁度和低濁度離心分離液分別產生了1500 NTU和290 NTU的初始濁度值。研究結果顯示了在0.02至0.10%（w/w）的pDADMAC濃度範圍內低的上清液濁度值，與初始離心分離液濁度水平無關。低於0.02%的pDADMAC濃度水平係不期望的，因為這不降低pDADMAC處理後的濁度水平。

在確定導致最低濁度值的最佳pDADMAC濃度後，使用濃度為0.02%（w/w）、0.05%（w/w）和0.1%（w/w）的pDADMAC進行小規模深度過濾研究以確定導致最高深度過濾通過量的濃度範圍。如實例2所述執行小規模深度過濾操作。

單株抗體mAb 1（運行1）和mAb 2使用單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機從細胞培養液中收穫，如實例1表1中所述。使用2% pDADMAC儲備溶液以小規模進行pDADMAC絮凝。對於mAb 1（運行1），測試的pDADMAC濃度範圍為0.01%、0.02%和0.05%。對於mAb 2，測試的pDADMAC濃度範圍為0.035%、0.05%、0.1%和0.15%。本實驗中使用的所有pDADMAC濃度均為（w/w）。C0HC深度過濾器用於pDADMAC處理的樣本。對於每個實驗，用X0HC深度過濾器過濾未處理的離心分離液作為對照。

來自該等實驗的歸一化深度過濾器通過量值在圖6中示出。藉由將pDADMAC處理的條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）除以對照未處理條件的最終深度過濾通過量來計算歸一化深度過濾器通過量。大於一的歸一化通過量顯示相對於對照改善的深度過濾性能。當與對照相比時，在0.035%和0.1%（w/w）pDADMAC之間的pDADMAC濃度顯示出改善的深度性能。 實例 4 pDADMAC 和 PEG 對小規模深度過濾性能的影響

收集mAb 1運行3的離心分離液。該大規模運行不包括在實例1中，因為它不是使用單次使用的連續固體排放離心機設備產生的，而是使用不銹鋼連續固體排放離心機進行的。平均離心分離液濁度為182 NTU，其類似於mAb 1運行1和運行3的平均離心分離液濁度，因此其被認為是pDADMAC處理的深度過濾研究的代表性材料。如實例2所述，用0.05%（w/w）pDADMAC單獨地或與3% PEG 3000組合對從大規模獲得的離心分離液進行絮凝，隨後進行深度過濾。將pDADMAC和PEG 3000溶液同時添加到離心分離液中。將絮凝的離心分離液混合至少30分鐘，然後裝載到C0HC或C0SP深度過濾器上。將未處理的離心分離液裝載到X0HC深度過濾器上作為對照，因為先前已經確定這為未處理的離心分離液提供最高的深度過濾器負載量。X0HC過濾器用於未處理的對照離心分離液，因為對於未處理的條件，它係溶液中顆粒尺寸的最佳過濾器類型（參見圖1）。我們將其用作對照以理解每個分子如何彼此相似/不同。

圖7顯示與單獨的0.05% w/w pDADMAC相比，pDADMAC + PEG3000條件實現了增加的深度過濾通過量。因此，本揭露提供了高效且有效的靶蛋白收穫方法，其中連續固體排放圓盤堆疊式離心在絮凝步驟之前，絮凝步驟較佳的是使用0.02%-0.15% pDADMAC，含或不含約3% PEG，諸如3% PEG3000。 實例 5 大規模和小規模深度過濾性能的比較

如表1所示，對mAb 1運行1、xmAb運行1、xmAb 1運行2和Bsp 2進行大規模和小規模深度過濾。在大規模時，如表1中對於mAb 1運行1、xmAb1運行1、xmAb1運行2和Bsp 2所述，從單次使用的連續固體排放離心中收集離心分離液。對離心分離液進行絮凝和大規模深度過濾。使用C0HC深度過濾器進行大規模深度過濾。用於大規模運行的C0HC的過濾器尺寸大於或等於1.1 m ²。使用未處理的離心分離液和X0HC深度過濾器作為對照，對每個離心分離液批次平行進行小規模深度過濾研究。如實例2所述，用DI水沖洗小規模和大規模深度過濾器中的深度過濾器。使用2%（w/w）pDADMAC儲備溶液進行絮凝以在離心分離液中實現0.05%（w/w）的最終pDADMAC濃度。使用至少1 L經絮凝的材料進行每種小規模深度過濾條件。對於三個代表性運行中之每一個，使用150 LMH的絮凝的離心分離液深度過濾流速評估小規模深度過濾性能。mAb 1運行1、xmAb1運行1、xmAb1運行2和Bsp 2的大規模深度過濾性能分別使用65、95、155 LHM和120 LMH的絮凝的離心分離液流速來評估。

圖8顯示與使用X0HC深度過濾器的小規模深度過濾性能相比，使用C0HC深度過濾器和0.05%（w/w）pDADMAC處理的大規模絮凝的離心分離液的深度過濾性能。數據顯示，當與使用未處理的離心分離液和X0HC深度過濾（黑色）的對照條件相比時，絮凝和C0HC深度過濾性能（灰色）在壓差趨勢方面得到改善。pDADMAC處理和C0HC過濾顯示出低於10 psig的穩定壓差。在製造過程中保持低壓差係一個重要的目標，因為為了保持安全性和降低與高壓相關的風險，在製程過程中希望約20 psig的最大允許壓力。確保低壓差可以維持較長的持續時間導致更多的材料被過濾，並且這減少了對收穫操作中的下游步驟的任何影響。該等大規模運行的收穫步驟產率總結於表3中。步驟產率在86%至92%的範圍內，比大約70%的平均微濾收穫步驟產率有所提高。 [ 表 3] . 大規模單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機、絮凝和深度過濾製程性能總結。

運行ID	平均離心機產率（%）	絮凝和深度過濾步驟產率（%）	總體收穫產率（%）
mAb 1（運行1）	93	96	89
xmAb 1（運行1）	93	95	88
xmAb 1（運行2）	90	96	86
Bsp 2	94	98	92

實例 6 產品品質考慮

藉由使含有靶蛋白的深度濾液池進行製備型蛋白A純化，然後藉由層析段分或電泳進行分析測試來評估產品品質。所用的分析層析法的類型包括粒徑篩析層析法（SE）和陽離子交換層析法（CEX）。使用還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（rCE）和非還原型毛細管電泳（nrCE）進行產品品質的電泳評估。進行該等不同類型的分析以提供對產品品質的嚴格評估。

圖9顯示pDADMAC處理的C0HC濾液池（深灰色）、未處理的離心分離液C0HC池（淺灰色）和未處理的X0HC濾液池（黑色）的xmAb 1運行1產品品質比較。如實例2所述，使用0.05%（w/w）pDADMAC進行C0HC條件。如圖9中所示，分別使用SE、CEX、rCE和nrCE進行的產品品質評估顯示了在接受品質評估的三種類型的材料（即，未處理的離心分離液、pDADMAC處理的離心分離液和C0HC深度過濾池）中的可比結果。該等結果證實，用絮凝劑諸如pDADMAC處理細胞培養物離心分離液不會對產品品質特徵造成負面影響。

無

[ 圖 1] . 絮凝對小規模歸一化深度過濾器負載水平的影響。圖1示出了使用來自大規模單次使用連續固體排放圓盤堆疊式離心的未處理和絮凝材料的歸一化小規模深度過濾性能。在除所測試的一個條件之外的所有條件下，離心分離液絮凝相對於對照增加了歸一化深度過濾器通過量。藉由將pDADMAC處理（深灰色）和未處理（淺灰色）條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）除以對照條件（黑色）的深度過濾最終通過量（L/m ²）來計算歸一化通過量。對照條件（黑色）使用未處理的材料與X0HC深度過濾器配對來操作。pDADMAC條件使用0.05%（w/w；重量pDADMAC/重量離心分離液）pDADMAC處理的離心分離液與C0HC、C0SP、X0HC、X0SP、DL60或DL75深度過濾器配對來操作。未處理的條件使用未處理的離心分離液與C0SP、C0HC或X0SP深度過濾器來操作。由於時間限制，在小規模深度過濾過程中提前終止以下運行：xmAb運行1、xmAb運行2和雙特異性2。如果延長操作時間，對於該等運行將實現更高的通過量。誤差線表示與平均值 ± 1的標準差。Bsp = 雙特異性。

[ 圖 2] . 絮凝和小規模深度過濾對百分比產率的影響。圖2示出了圖1所示實驗的小規模絮凝和深度過濾分步產率。當與對照條件（黑色）或未處理條件（淺灰色）相比時，絮凝後深度過濾條件（深灰色）具有相似或改善的分步產率。藉由將深度濾液池中測得的總蛋白質質量（g）除以離心分離液池中測得的總蛋白質量（g）來計算百分比產率。pDADMAC條件使用0.05% w/w pDADMAC處理的離心分離液與C0HC、C0SP、X0HC、X0SP、DL60或DL75深度過濾器配對來操作。未處理的條件使用未處理的離心分離液與C0SP、C0HC或X0SP深度過濾器來操作。誤差線表示與平均值 ± 1的標準差。Bsp = 雙特異性。

[ 圖 3] . 小規模絮凝宿主細胞蛋白（ HCP ）水平的影響。圖3示出了圖1所示實驗的小規模絮凝和深度過濾HCP對數減少值（LRV）。在考慮HCP測定可變性後，絮凝後深度過濾條件（深灰色）顯示出與對照條件（黑色）和未處理條件（淺灰色）相似的HCP清除率。HCP LRV藉由對在離心分離液池中測得的HCP水平與在深度濾液池中測得的HCP水平的比率應用以10為底的對數變換來計算。對照條件（黑色）使用未處理材料與X0HC深度過濾器配對來操作。pDADMAC條件使用0.05%（w/w）pDADMAC處理的離心分離液與C0HC、C0SP、X0HC、X0SP、DL60或DL75深度過濾器配對來操作。未處理的條件使用未處理的離心分離液與C0SP、C0HC或X0SP深度過濾器來操作。Bsp = 雙特異性。

[ 圖 4] . 小規模絮凝和深度過濾 DNA 水平的影響。圖4示出了圖1所示實驗的小規模絮凝和深度過濾DNA LRV。相對於對照條件（黑色）和未處理條件（淺灰色），絮凝後深度過濾條件（深灰色）顯示出相似或改善的DNA清除率。DNA LRV藉由對在離心分離液池中測得的DNA水平與在深度濾液池中測得的DNA水平的比率應用以10為底的對數變換來計算。對照條件（黑色）使用未處理材料與X0HC深度過濾器配對來操作。pDADMAC條件使用0.05%（w/w）pDADMAC處理的離心分離液與C0HC、C0SP、X0HC、X0SP、DL60或DL75深度過濾器配對來操作。未處理的條件使用未處理的離心分離液與C0SP、C0HC或X0SP深度過濾器來操作。Bsp = 雙特異性。

[ 圖 5] . pDADMAC 對離心分離液濁度的影響。圖5示出了離心操作條件和pDADMAC濃度對上清液濁度的影響。在與pDADMAC孵育和實驗室規模離心後測量上清液濁度值。離心機進料流速和離心機轉筒速度的變化用於產生初始離心分離液濁度的變化。pDADMAC濃度大於0.04（%w/w）降低了所測試的兩種模型分子（即mAb 1運行2 (A) 和xmAb運行1 (B)）的離心分離液濁度。

[ 圖 6] . pDADMAC 濃度對小規模深度過濾性能的影響。圖6示出了pDADMAC濃度對使用來自 (A) mAb1（運行1）和 (B) mAb 2的大規模離心分離液的小規模歸一化深度過濾通過量的影響。與對照（黑色）相比，使用0.05%至0.1% w/w pDADMAC（針對mAb1）和0.035%至0.1% w/w pDADMAC（針對mAb 2）觀察到深度過濾通過量增加。未處理的材料與X0HC深度過濾器配對。pDADMAC條件使用0.02%、0.035%、0.05%或0.1% w/w pDADMAC處理的離心分離液與C0HC深度過濾器配對來操作。藉由將pDADMAC處理條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）除以對照未處理條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）來計算歸一化通過量。

[ 圖 7] . pDADMAC 和 PEG3000 處理對深度過濾性能的影響。圖7示出了使用來自運行mAb 1運行3的代表性大規模離心分離液的pDADMAC和pDADMAC+PEG3000處理條件之間的小規模深度過濾性能的比較。使用不銹鋼連續卸料離心機進行mAb1運行3大規模運行。初始未處理的離心分離液濁度值與使用單次使用連續固體排放離心機觀察到的濁度值相似，並且被認為是深度過濾研究的代表。當與對照相比時，對於pDADMAC和pDADMAC+PEG3000處理的離心分離液，觀察到歸一化深度過濾器通過量增加。未處理的材料與X0HC深度過濾器配對。0.05% w/w的pDADMAC與C0HC深度過濾器配對。pDADMAC（0.05% w/w）+PEG3000與C0HC和C0SP深度過濾器配對。藉由將pDADMAC和/或pDADMAC+PEG處理條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）除以對照未處理條件的深度過濾最終通過量（L/m ²）來計算歸一化通過量。對於mAb1運行3大規模運行，在過程結束後一天（第19天）進行小規模深度過濾。藉由將pDADMAC處理條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）除以對照未處理條件的小規模深度過濾最終通過量（L/m ²）來計算歸一化通過量。

[ 圖 8] . 絮凝對深度過濾連續壓力趨勢的影響。圖8示出了使用0.05% w/w pDADMAC和C0HC過濾器（深灰色）進行的大規模深度過濾系列與使用未處理的離心分離液和X0HC過濾器（黑色）進行的對照小規模深度過濾實驗相比的壓差曲線。使用的代表性大規模運行係：mAb1運行1、xmAb 1運行1、xmAb 1運行2和雙特異性2、運行1。與觀察到壓差快速增加的X0HC對照相比，使用絮凝和C0HC深度過濾產生低且穩定的壓差曲線。ΔA壓力表示1級深度過濾器的壓差。ΔB壓力表示2級生物負載減少過濾器的壓差。注意，y軸上由滲透率趨勢繪製的數據與該圖中的絕對壓力趨勢相比沒有差異。

[ 圖 9] . pDADMAC 處理的材料與未處理的材料之間的產物品質比較。圖9示出了來自xmAb1運行1的pDADMAC處理的材料與未處理的材料之間的產物品質比較。絮凝後深度過濾條件（淺灰色）顯示出與對照條件（黑色）和pDADMAC處理的離心分離液（深灰色）相似的產物品質。藉由將pDADMAC處理的離心分離液（深灰色）和pDADMAC處理的深度濾液池（淺灰色）條件的產物品質值除以未處理的對照條件（黑色）的產物品質值來計算歸一化的產物品質值。縮寫：SE = 粒徑篩析層析法，CEX = 陽離子交換層析法，rCE = 還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳，nrCE = 非還原型毛細管電泳；主要 = 中值分子量範圍；主峰 = 層析段分產生的主峰或中值峰；LMW = 低分子量；MMW = 中分子量。

無

Claims (43)

1. 一種用於將灌注培養物中產生的重組蛋白與至少一種其他灌注培養物組分分離的方法，該方法包括： (a)   從包含該重組蛋白和至少一種其他灌注培養物組分的灌注培養物中收穫池或洗脫液流，該灌注培養物在收穫時具有至少約16%的紅血球容積（PCV）； (b)   將收穫池或洗脫液流引入到至少一個連續固體排放圓盤堆疊式離心機中； (c)   操作該連續固體排放圓盤堆疊式離心機，從而將流體組分分離成離心分離液和高密度組成物； (d)   收集該離心分離液； (e)   向該離心分離液中添加絮凝劑；以及 (f)    對該離心分離液進行過濾步驟。
2. 如請求項1所述之方法，其中該連續固體排放圓盤堆疊式離心機係單次使用的連續固體排放圓盤堆疊式離心機。
3. 如請求項1或2所述之方法，其中在8°C至12°C的溫度下將該絮凝劑添加到該離心分離液中。
4. 如請求項3所述之方法，其中在約10°C的溫度下將該絮凝劑添加到該離心分離液中。
5. 如請求項1-4中任一項所述之方法，其中從單次使用生物反應器收穫該灌注培養物。
6. 如請求項5所述之方法，其中該單次使用生物反應器為至少500 L。
7. 如請求項5所述之方法，其中該單次使用生物反應器為2,000 L或更大。
8. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少180 NTU的濁度。
9. 如請求項1-8中任一項所述之方法，其中該灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少2 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度。
10. 如請求項9所述之方法，其中該灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少3 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度。
11. 如請求項9所述之方法，其中該灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少5 × 10 ⁷個活細胞/ml的活細胞密度。
12. 如請求項1-11中任一項所述之方法，其中該灌注培養物收穫池或洗脫液流在收穫時具有至少約18%的紅血球容積。
13. 如請求項12所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時具有至少約20%的紅血球容積。
14. 如請求項12所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時具有至少約24%的紅血球容積。
15. 如請求項12所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時具有至少約26%的紅血球容積。
16. 如請求項12所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時具有至少約30%的壓積。
17. 如請求項1-16中任一項所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時的溫度為約8°C至約12°C。
18. 如請求項17所述之方法，其中該灌注培養物在收穫時的溫度為約10°C。
19. 如請求項1-18中任一項所述之方法，其中將來自該灌注培養物的連續收穫洗脫液流引入到該連續固體排放圓盤堆疊式離心機中。
20. 如請求項1-19中任一項所述之方法，其中將不連續批次的灌注收穫池引入到該連續固體排放圓盤堆疊式離心機中。
21. 如請求項1-20中任一項所述之方法，其中該離心分離液的濁度大於約160 NTU。
22. 如請求項1-21中任一項所述之方法，其中該絮凝劑係聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）。
23. 如請求項22所述之方法，其中添加聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）作為絮凝劑至至少0.04%（w/w）。
24. 如請求項22所述之方法，其中添加聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）作為絮凝劑至0.04%-0.15%（w/w）。
25. 如請求項22所述之方法，其中添加聚(二烯丙基二甲基氯化銨)（pDADMAC）作為絮凝劑至0.05%（w/w）。
26. 如請求項1-25中任一項所述之方法，其中該重組蛋白係真核蛋白。
27. 如請求項26所述之方法，其中該真核蛋白係哺乳動物蛋白。
28. 如請求項27所述之方法，其中該哺乳動物蛋白係抗原結合蛋白。
29. 如請求項28所述之方法，其中該抗原結合蛋白係單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、雙特異性T細胞接合物分子（BiTE ^®）。
30. 如請求項1-29中任一項所述之方法，其中該蛋白係顆粒球群落刺激因子、紅血球生成刺激劑、HER受體、細胞黏附分子、生長因子、骨誘導因子、胰島素、凝血蛋白、群落刺激因子、血型抗原；生長激素、生長激素受體、T細胞受體；神經滋養因子、神經滋養蛋白、鬆弛素、干擾素、白介素、病毒抗原、脂蛋白、整聯蛋白、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、運輸蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白或免疫黏附素。
31. 如請求項1-30中任一項所述之方法，其中該過濾包括深度過濾器。
32. 如請求項31所述之方法，其中該深度過濾器係MILLISTAK+ ^®C0HC過濾器、MILLISTAK+ ^®C0SP過濾器、SARTOCLEAR ^®DL60過濾器或SARTOCLEAR ^®DL75過濾器。
33. 如請求項31所述之方法，其中該深度過濾器係MILLISTAK+ ^®C0HC過濾器或MILLISTAK+ ^®C0SP過濾器。
34. 如請求項31-33中任一項所述之方法，其中該離心分離液以150 LMH或更小的通量率和10 psi或更小的壓力通過該深度過濾器。
35. 如請求項34所述之方法，其中該壓力為2 psi或更小。
36. 如請求項34所述之方法，其中該通量率為90至150 LMH。
37. 如請求項1-36中任一項所述之方法，該方法進一步包括至少一個另外的層析法步驟。
38. 如請求項35所述之方法，其中該層析法步驟選自離子交換層析法、疏水相互作用層析法或多模式層析法。
39. 如請求項1-38中任一項所述之方法，該方法進一步包括至少一或多個病毒過濾步驟、病毒滅活步驟和/或UFDF步驟。
40. 一種靶蛋白，該靶蛋白藉由如請求項1-39中任一項所述之方法製備。
41. 一種用於在源自灌注培養物的負載進料的深度過濾期間維持低壓差的方法，該方法包括以下步驟： (a)   獲得源自在收穫時具有至少16%的紅血球容積（PCV）的灌注培養物的絮凝的離心分離液； (b)   使該離心分離液以150 LMH或更小的通量率和10 psi或更小的壓力通過該深度過濾器；以及 (c)   回收洗脫液。
42. 一種用於從在單次使用生物反應器中引發的灌注培養物生產分離的、純化的重組蛋白的方法，該方法包括以下步驟 a.     用經工程化的細胞接種該生物反應器以重組表現目的蛋白； b.     培養該等細胞直到該灌注培養物具有至少16%的紅血球容積； c.     將該培養物的溫度降低至8°C與12°C之間，並從該生物反應器收集該灌注培養物作為收穫池或洗脫液流； d.     將該收穫池或洗脫液流引入到至少一個連續固體排放圓盤堆疊式離心機中，其中該收穫池或洗脫液流在4°C與12°C之間； e.     從該離心機收集離心分離液； f.     在8°C和12°C之間的溫度下將絮凝劑添加到該離心分離液中； g.     使絮凝的離心分離液以90至150 LMH的通量率和10 psi或更小的壓力通過深度過濾器，其中該絮凝的離心分離液在4°C與12°C之間； h.     對經過濾的離心分離液進行一或多種層析法、過濾和/或UFDF單元操作；以及 i.      獲得分離的、純化的重組蛋白。
43. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含用如請求項42所述之方法生產的分離的、純化的重組蛋白。