CN101687926A - 中和抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与GM－CSF或其片段或部分结合、相互作用或者缔合并拮抗或中和GM－CSF活性的抗体。按照本发明的实施方式，产生以高亲和力结合人GM－CSF并抑制GM－CSF活性的人源化单克隆抗体。

Description

中和抗体
发明领域
本发明总体上涉及结合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗体。更具体地说，本发明涉及GM-CSF的特异性高亲和力、中和性人源化单克隆抗体。本发明还涉及这种抗体在治疗或预防GM-CSF介导和GM-CSF相关性疾病或病症中的应用。本发明还涉及通过给予本发明抗体来调节GM-CSF介导和GM-CSF相关性疾病或病症的方法。
发明背景
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是调节粒细胞和单核细胞，例如巨噬细胞分化、增殖和功能的造血生长因子。
GM-CSF还是强效的炎性细胞因子，其活性或过表达具有显著的有害作用。GM-CSF参与各种自身免疫和炎性疾病，包括类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症和特发性血小板减少性紫癜。在哮喘和类风湿性关节炎中，检测到GM-CSF水平升高，其与炎性过程有关，而在实验性自身免疫脑脊髓炎中(多发性硬化症的动物模型)，GM-CSF敲除小鼠受保护而免于疾病发作。
因此，明显需要开发有效的方法以靶向GM-CSF并阻断或中和GM-CSF活性。作为具有明确治疗应用的GM-CSF拮抗剂，抗GM-CSF的抗体提供了一种特别适合的备选方案，例如用于治疗或预防自身免疫或炎性疾病。
虽然抗GM-CSF的抗体是本领域已知的，但依然需要开发改进的抗体，例如具有增强的结合亲和力。
发明概述
除非文中另有要求，在本说明书和随附的权利要求书中，词语“包含”和变形，例如“包括”或“包含着”应理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
本发明总体上涉及与GM-CSF或其片段或部分结合、相互作用或者缔合并拮抗或中和GM-CSF活性的抗体。这些抗体优选单克隆抗体或其抗原结合片段。这些抗体通常是分离的、均质或完全或部分纯化的形式。最典型的抗体是适合给予人的人源化或人抗体。这些抗体包括从，例如鼠单克隆抗体制备的人源化抗体以及，例如采用转基因小鼠或通过噬菌体展示制备的人单克隆抗体。
按照本发明的具体实施方式，制备以高亲和力结合人GM-CSF并抑制GM-CSF活性的人源化单克隆抗体。
本发明一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体包含含有SEQ ID NO：1所示序列或其片段或变体的轻链可变区。
本发明另一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体包含SEQ ID NO：2所示的重链可变序列或其片段或变体。
本发明另一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体包含含有SEQ ID NO：1所示序列或其片段或变体的轻链可变区，以及如SEQ ID NO：2所示的重链可变序列或其片段或变体。
在一个实施方式中，该抗体是抑制GM-CSF活性的鼠抗体或其人源化衍生物。该抗体可以是2007年5月17日保藏在英国索尔兹伯里普当应用微生物与研究中心的欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)(European Collection of CellCultures(ECACC)，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，United Kingdom)的鼠单克隆抗体4K21，登录号为07051601。
鼠单克隆抗体4K21的人源化衍生物的轻链可变区可包含SEQ ID NO：9-11中任一所示的序列或其片段或变体。鼠单克隆抗体4K21的人源化衍生物的重链可变区可包含SEQ ID NO：13-15、17或18-27中任一所示的序列或其片段或变体。
本发明另一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体在轻链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：3-5中任一所示序列的互补决定区(CDR)，其中该抗体或其抗原结合片段抑制GM-CSF的活性。
在一个实施方式中，该抗体是人源化抗体。
本发明另一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体在重链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：6-8中任一所示序列的互补决定区(CDR)，其中该抗体或其抗原结合片段抑制GM-CSF的活性。
在一个实施方式中，该抗体是人源化抗体。
本发明另一方面提供结合人GM-CSF或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体在轻链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：3-5中任一所示序列的互补决定区(CDR)，在重链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：6-8中任一所示序列的互补决定区(CDR)。
在一个实施方式中，该抗体是人源化抗体。该人源化抗体可包含含有SEQID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示序列或其片段或变体的轻链可变区。该人源化抗体可包含含有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示序列或其片段或变体的重链可变区。
在一个实施方式中，该人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO：13所示序列或其片段或变体。
变体重链可变区可包含用相应鼠重链可变区中相应位置的氨基酸残基替代SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示序列的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方式中，在包含SEQ IDNO：13所示序列的重链可变区中作出所述一个或多个上述氨基酸取代。在一个实施方式中，变体重链可变区包含SEQ ID NO：18-27中任一所示的序列。在一个实施方式中，变体重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的序列。
在一个实施方式中，所述人源化抗体选自包含下表所示轻链可变序列和重链可变序列的组：
表1
  人源化抗体   重链包含   轻链包含
  hGM4/1   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：9
  hGM4/2   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：9
  hGM4/3   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：9
  hGM4/5   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：9
  hGM4/6   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：10
  hGM4/7   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：10
  hGM4/8   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：10
  hGM4/10   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：10
  hGM4/11   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：11
  hGM4/12   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：11
  hGM4/13   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：11
  hGM4/15   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：11
  hGM4/17   SEQ ID NO：18   SEQ ID NO：11
  hGM4/18   SEQ ID NO：19   SEQ ID NO：11
  hGM4/19   SEQ ID NO：20   SEQ ID NO：11
  hGM4/20   SEQ ID NO：21   SEQ ID NO：11
  hGM4/21   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：11
  hGM4/22   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：11
  hGM4/23   SEQ ID NO：24   SEQ ID NO：11
  hGM4/24   SEQ ID NO：25   SEQ ID NO：11
  hGM4/25   SEQ ID NO：26   SEQ ID NO：11
  hGM4/34   SEQ ID NO：27   SEQ ID NO：11
本发明还提供包含与SEQ ID NO：1-27中任一所示氨基酸序列具有至少约70％序列相同性的氨基酸序列的单克隆抗体。
本发明还提供产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。
在另一方面，本发明提供治疗或预防GM-CSF介导疾病或病症或与GM-CSF表达和/或活性升高或异常相关的疾病或病症的方法，该方法包括给予有此需要的对象有效量的至少一种本发明抗体或其抗原结合片段。
所述疾病或病症通常是自身免疫或炎性疾病或病症。所述疾病或病症可以选自，例如哮喘、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、特发性血小板减少性紫癜、急性呼吸窘迫综合征、多发性硬化症、阿尔茨海默病、克罗恩病、肠易激综合征、结肠炎、银屑病、黄斑变性、葡萄膜炎、华勒变性、抗磷脂综合征、视网膜变性(restinosis)、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、复发性多软骨炎、肝炎、肾小球肾炎、狼疮和其它代谢性疾病。
在另一方面，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防GM-CSF-介导疾病或病症或与GM-CSF表达和/或活性升高或异常有关疾病或病症的药物中的应用。
本发明还提供包含一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其任选含有合适的药学上可接受的运载体和/或稀释剂。
附图简述
现在将参考附图描述本发明，只是作为非限制性的实施例。
图1.与商品化购得的抗-GM-CSF抗体(BD)相比，13种鼠抗-GM-CSF单克隆抗体中和人GM-CSF的细胞生长促进活性的能力。
图2.与商品化购得的抗-GM-CSF抗体(BD)相比，有鼠抗-GM-CSF单克隆抗体存在下，鼠FDC-P1细胞的增殖。
图3.4K21单克隆抗体和4种人源化变体的轻链可变区序列的比对。标出了CDR L1、L2和L3。还示出了框架4、G105Q和V109L中的突变。
图4.4K21单克隆抗体和5种人源化变体的重链可变序列的比对。标出了CDR H1、H2和H3。
图5.与鼠4K21单克隆抗体和商品化购得的抗-GM-CSF抗体(BD)相比，通过BIAcore分析测定15种人源化4K21单克隆抗体对人GM-CSF的结合亲和力(RU)。为简明起见，每隔一种人源化单克隆抗体进行编号(4K21-1、4K21-3等)。
图6.人源化4K21抗体的BIACore结合分析。注射浓度从66.7nM到4.17nM的两倍连续稀释抗体。显示了GM-CSF人源化抗体的结合亲和力(A)、结合速率(B)和解离速率(C)。
图7.4K21单克隆抗体和5种人源化变体的重链可变区序列的比对，显示了4K21鼠框架和人源化h4Vh/10框架区之间8个不同氨基酸残基的位置和种类(框)。带框残基上的编号(19-25)表明用回复突变构建的人源化抗体的身份。还标出了CDR H1、H2和H3。
图8.人源化抗体中和人GM-CSF的细胞生长促进活性。制备浓度从400nM到28fM的三倍连续稀释抗体，并与GM-CSF混合1小时再加入细胞。细胞生长72小时，然后通过3H-胸苷的掺入定量测定细胞生长。各点以一式三份计算。
图9.4K21和人源化4K21抗体hGM4/11、hGM4/21、hGM4/22和hGM4/34的BIACore结合分析。将抗体通过抗鼠IgG或抗人IgG抗体偶联于CM5芯片。注射浓度从1000nM到15.63nM的两倍连续稀释GM-CSF。显示了GM-CSF抗体的结合亲和力(A)、结合速率(B)和解离速率(C)。
以序列标识符(SEQ ID NO：)指定核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)，等等。在说明书末尾提供了序列表。具体地说，本发明抗体的轻链可变区和重链可变区和CDR的氨基酸序列见SEQ ID No：1-27。
发明详述
本文所用的冠词“一”和“一个”指一个或一个以上(即，至少一个)的该冠词在语法上的对象。例如，“一个元素”表示一个元素或一个以上的元素。
术语“多肽”表示由通过肽键连接在一起的氨基酸构成的多聚物。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，虽然出于本发明的目的，“多肽”可以构成全长蛋白质的一部分。
在本说明书的范围内，述及“抗体”包括述及抗体的各种形式，包括但不限于：完整抗体、抗体片段，包括，例如Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段，通过遗传工程改造技术产生的人源化抗体、人抗体和免疫球蛋白-衍生多肽。
在本说明书的范围内，述及某抗体的“结合”表示与靶抗原，例如GM-CSF的结合、相互作用或缔合。述及“GM-CSF”包括其含有抗体结合表位的片段或部分。述及“GM-CSF与抗体结合”在其范围内包括抗体或其抗原结合片段与GM-CSF的部分、片段或含表位区域的结合、相互作用或缔合。“结合”、“相互作用”或“缔合”通常表示或包括抗体与GM-CSF或其部分的特异性结合、相互作用或缔合。
本文所用的术语“抑制”与GM-CSF活性有关，不一定表示完全抑制活性。而是指可以将活性抑制到足以产生所需效果的一定程度和/或一段时间。因此，抑制GM-CSF活性可以是部分或完全减弱GM-CSF的一种或多种生物学效应，这种抑制可以在时间和/或空间上受限制。时间和/或空间上受限制表示抑制可以局限于身体的特定生理条件或环境和/或特定的区域。
在本说明书的范围内，术语“活性”与GM-CSF有关时，其表示GM-CSF通过本身的蛋白质或多肽形式或其任何片段或部分施加的任何细胞功能、作用、效应或影响。
本文所用的术语“治疗”和“预防”指以任何方式治疗疾病或症状，预防病症或疾病的产生，或预防、阻止、延迟或逆转病症或疾病或其它不良症状的进程的任何或所有应用。因此，术语“治疗”和“预防”等应在其最宽的范围内考虑。例如，治疗不一定暗示治疗患者直至完全康复。
本文所用的术语“有效量”的含义包括某药物提供所需作用的无毒但有效的用量。所需的确切用量或剂量取决于以下因素而在对象之间有所不同：所治疗的物种、对象的年龄和总体状况、所治疗疾病的严重性、所给予的具体药物和给药方式等等。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域技术人员只采用常规实验即可确定合适的“有效量”。
本文所用的术语“对象”通常指哺乳动物，包括人、灵长类、牲畜(例如，绵羊、猪、牛、马、驴)、实验室检验动物(例如，小鼠、家兔、豚鼠)、陪伴动物(例如，狗、猫)和捕获的野生动物(例如，狐、袋鼠、鹿)。哺乳动物优选人或实验室检验动物。所述哺乳动物甚至更优选人。
本发明提供可用作GM-CSF拮抗剂并可用于治疗GM-CSF水平和/或活性升高所诱导或与之有关的某些疾病的抗体。本发明还提供治疗这些疾病的方法，包括给予患有这种疾病的患者本发明抗-GM-CSF抗体。还提供了用于这些方法的组合物，该组合物包含一种或多种抗-GM-CSF抗体。
本发明抗体与GM-CSF或其部分结合、相互作用或缔合。这些抗体通常对特定物种的GM-CSF，例如人GM-CSF具有特异性，或者就不同物种的GM-CSF之间的序列相似性水平而言，这些抗体可以与两种或更多种物种的GM-CSF显示一定的交叉反应性。在抗体针对人GM-CSF的情况中，与GM-CSF的其它哺乳动物形式具有一定交叉反应性水平在某些情况下可能是理想的，例如为在特定疾病的动物模型中检验抗体和进行毒理学、安全性和剂量研究。
本发明抗体通常是单克隆抗体或其抗原结合片段。这些抗体最优选适合给予人的人源化或人抗体。这些抗体包括从，例如鼠单克隆抗体制备的人源化抗体和可利用，例如转基因小鼠或通过噬菌体展示制备的人单克隆抗体。
可通过本领域技术人员熟知的各种方法制备本发明抗体。例如，可参考：《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新空间》(Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)，Kennet等(编)，普莱纳姆出版社(Plenum Press)，纽约(1980)；《抗体：实验室手册》(Antibodies：ALaboratory Manual)，Harlow和Land(编)，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，(1988)；和《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，Goding，第三版，学术出版社(Academic Press)(1996)。它们的内容通过引用全文纳入本文。类似地，可通过常规技术纯化杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。
例如，产生本发明抗体的一种方法包括用GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段免疫非人动物，例如小鼠或转基因小鼠，从而在所述动物产生抗GM-CSF多肽的抗体。可用于免疫动物的GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段可以来自任何哺乳动物来源。所述GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段通常是GM-CSF。
可通过常规技术产生本发明抗体的抗原结合片段。这种片段的例子包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，包括单链Fv片段(称为sFv或scFv)。也考虑使用通过遗传工程改造技术产生的抗体片段和衍生物，例如二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、单链可变区结构域(Abs)分子和小抗体。除非另有规定，本文所用的术语“抗体”和“单克隆抗体”包括完全抗体及其抗原结合片段。
可通过已知技术制备这种抗GM-CSF的单克隆抗体的衍生物，并筛选其所需特性。这些技术可以包括，例如分离编码感兴趣单克隆抗体的多肽链(或其一部分)的DNA，和通过重组DNA技术操作DNA。该DNA可用于产生感兴趣的另一DNA，或经改变(例如，通过诱变或其它常规技术)而，例如添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。可从用GM-CSF免疫的小鼠的B细胞分离编码抗体多肽(或重链或轻链，只有可变区或全长)的DNA。可通过包括聚合酶链式反应(PCR)在内的常规方法分离DNA。
噬菌体展示是可制备本发明抗体的衍生物的另一合适技术。在一个方法中，可以在任何合适的重组表达系统中表达作为感兴趣抗体的诸部分的多肽，可装配表达的多肽以形成抗体分子。
可通过氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变区(Fv区)片段以形成单链抗体，从而得到一根多肽链。可通过在编码两个可变区多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备这种单链Fv(scFv)。根据两个可变区之间弹性接头的长度，得到的抗体片段可形成二聚体或三聚体(参见Kortt等，Protein Engineering 10：423，1997)。为产生单链抗体而开发的技术包括以下文献所述的技术：美国专利号4,946,778；Bird(Science 242：423，1988)、Huston等，(Proc.Natl.Acad Sci USA 85：5879，1988)和Ward等(Nature 334：544，1989)。它们的内容通过引用全文纳入本文。本发明包括衍生自本文所提供抗体的单链抗体。
本发明考虑的单克隆抗体的例子是鼠单克隆抗体4K21，其产生方法如本文所述。鼠单克隆抗体4K21包含SEQ ID NO：1所示的轻链可变序列和SEQ IDNO：2所示的重链可变序列。4K21的轻链CDR序列如SEQ ID NO：3-5所示。4K21的重链CDR序列如SEQ ID NO：6-8所示。
产生鼠单克隆抗体4K21的杂交瘤于2007年5月17日保藏在英国索尔兹伯里普当应用微生物与研究中心的欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，登录号为07051601。
应该知道，本发明单克隆抗体的氨基酸序列可包括一个或多个氨基酸取代，这种取代使得虽然多肽的基本序列改变了，但该抗体结合GM-CSF的能力以及该抗体的活性依然保留。所述取代可以是保守性取代。本文所用的术语“保守性氨基酸取代”指在多肽链(蛋白质的一级序列)中用一种氨基酸取代或替代特性相似的另一氨基酸。例如，荷电氨基酸谷氨酸(Glu)取代类似荷电的氨基酸天冬氨酸(Asp)是保守性氨基酸取代。
本发明考虑本文公开的轻链和重链序列的变体，这种变体属于本发明的范围。本文所用的术语“变体”指基本上相似的序列。多肽序列变体通常具有共同的定性生物学活性。变体多肽序列可以是本文公开序列的衍生物，该衍生物包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。变体可在轻链或重链序列的框架区或CDR内与公开的序列不同。例如，考虑了包含与SEQ ID NO：1-27所示氨基酸序列有至少约70％序列相同性的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述单克隆抗体或其抗原结合片段可包含与SEQ ID NO：1-27所示氨基酸序列有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。术语“变体”包括通过任何合适的方式从本文公开的那些序列修饰的抗体序列。例如，当用于鼠序列时，术语“变体”的范围包括这种序列的人源化形式。当用于本文公开的人源化序列时，该术语“变体”的范围包括包含一个或多个鼠回复突变的修饰序列。
源自非人动物，例如小鼠的抗体通常不适合给予人，因为它们可能导致免疫反应，并产生抗-小鼠抗体(所谓的HAMA反应)。HAMA反应可通过快速清除血液中的小鼠抗体而中和它们，因而阻止了小鼠抗体与其靶标结合。
为避免产生HAMA反应。一种策略是通过用人序列替代非表位结合区中许多“外来”残基而“人源化”小鼠抗体。抗体与抗原之间相互作用的特异性涉及可变区中的超变区或互补决定区(CDR)。人源化过程中通常不改变这些残基。通常用人序列替代重链和轻链上可变区中的其余残基，其称为抗体的框架区(FW)和恒定区。为避免破坏抗体-结合袋的结构和抗体的特异性或亲和力，可能需要保留框架区中某些鼠残基。合适的人源化方法，例如CDR嫁接(CDRgrafting)是本领域技术人员熟知的。本文示例了特别合适的方法。以下文献也描述了用于产生嵌合型和人源化单克隆抗体的方法，例如：Riechmann等，Nature 332：323，1988；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439，1987；Larrick等，Bio/Technology 7：934，1989；Winter和Harris，TIPS 14：139，1993。可采用Kabat等在《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第五版，美国健康与人类服务部(US Dept.ofHealth andHuman Services)，PHS，NIH，NIH出版号91-3242，1991)中所述的系统鉴定给定抗体的互补决定区(CDR)。
例如，本文所述的鼠单克隆抗体4K21经人源化以降低该抗体的免疫原性。鉴定了保留对人GM-CSF的高结合亲和力(皮摩尔范围)以及合适GM-CSF抑制活性的22种人源化抗体，如本文所示例的。
在具体的实施方式中，本发明的人源化抗体在其轻链可变区中包含至少一个在鼠抗体4K21的轻链中发现的CDR，如SEQ ID NO：3-5所示。因此，本发明所考虑的抗体是包含鼠抗体4K21轻链可变区的1个到所有3个CDR序列的那些抗体。
此外，本发明所考虑的抗体是在其重链可变区中包含至少一个在鼠抗体4K21的重链中发现的CDR(如SEQ ID NO：6-8所示)的那些抗体。因此，本发明所考虑的抗体是包含鼠抗体4K21重链可变区的1个到所有3个CDR序列的那些抗体。
在优选的实施方式中，本发明抗体包含鼠抗体4K21的重链和轻链可变区的1个到所有6个CDR序列。
本发明特定实施方式的人源化抗体如下表2所述。
表2-衍生自鼠单克隆抗体4K21的人源化抗体
  人源化抗体   重链包含   轻链包含
  hGM4/1   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：9
  hGM4/2   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：9
  hGM4/3   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：9
  hGM4/4   SEQ ID NO：16   SEQ ID NO：9
  hGM4/5   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：9
  hGM4/6   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：10
  hGM4/7   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：10
  hGM4/8   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：10
  hGM4/9   SEQ ID NO：16   SEQ ID NO：10
  hGM4/10   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：10
  hGM4/11   SEQ ID NO：13   SEQ ID NO：11
  hGM4/12   SEQ ID NO：14   SEQ ID NO：11
  hGM4/13   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：11
  hGM4/14   SEQ ID NO：16   SEQ ID NO：11
  hGM4/15   SEQ ID NO：17   SEQ ID NO：11
  hGM4/17   SEQ ID NO：18   SEQ ID NO：11
  hGM4/18   SEQ ID NO：19   SEQ ID NO：11
  hGM4/19   SEQ ID NO：20   SEQ ID NO：11
  hGM4/20   SEQ ID NO：21   SEQ ID NO：11
  hGM4/21   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：11
  hGM4/22   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：11
  hGM4/23   SEQ ID NO：24   SEQ ID NO：11
  hGM4/24   SEQ ID NO：25   SEQ ID NO：11
  hGM4/25   SEQ ID NO：26   SEQ ID NO：11
  hGM4/34   SEQ ID NO：27   SEQ ID NO：11
本领域技术人员开发并熟知在非人动物中产生人抗体的方法。抗体可以是部分人的，或完全人的抗体。例如，可用已引入编码一个或多个人免疫球蛋白链的遗传材料的转基因小鼠来产生抗体。所述转基因小鼠可以这样的，即免疫后该动物产生的至少一些抗体中存在替换内源性免疫球蛋白链的人免疫球蛋白多肽链。
产生人抗体的另一种方法是噬菌体展示。本领域技术人员熟知产生人抗体的噬菌体展示技术，包括剑桥抗体技术公司(Cambridge Antibody Technology)和MS公司(MorphoSys)所用的方法，这些方法描述于国际专利公布号WO92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213和WO 93/11236(其内容通过引用纳入本文)。
可筛选并操作本发明的抗体或包含这种抗体的杂交瘤以进一步鉴定具有特别理想特性，例如结合亲和力增加、免疫原性降低和/或对GM-CSF的抑制活性增加的单克隆抗体。
本发明提供治疗或预防GM-CSF-介导疾病或病症、与GM-CSF的水平和/或活性升高有关的疾病或病症以及可能从通过给予本发明抗体抑制或中和GM-CSF活性的治疗中受益的其它疾病或病症的方法。可根据本发明治疗的疾病和病症包括自身免疫和炎性疾病。这种疾病包括但不限于：哮喘、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、特发性血小板减少性紫癜、急性呼吸窘迫综合征、多发性硬化症、阿尔茨海默病、克罗恩病、肠易激综合征、结肠炎、银屑病、黄斑变性、葡萄膜炎、华勒变性、抗磷脂综合征、视网膜变性、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、复发性多软骨炎、肝炎、肾小球肾炎、狼疮和其它代谢性疾病。可根据本发明治疗的其它自身免疫疾病包括：全身性硬化症、硬皮病、斯耶格仑综合征、脊椎关节炎、SAPHO综合征、青少年特发性关节液(juvenile iodipathic arthritis)、莱姆病、多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroditis)、格雷夫斯病、1型糖尿病、肾上腺炎(adrenaltis)、自身免疫性阿狄森病、多内分泌腺综合征(polyendocrine syndromes)、胃炎、恶性贫血、垂体炎、溶血性贫血、嗜中性白血球减少症、再生障碍性贫血、凝血病(clotting disorder)，包括获得性冯维勒布兰德综合征、格-巴二氏综合征、慢性炎性脱髓鞘多发性神经根性神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyradiculoneuropathy)、重症肌无力、伊顿-兰伯特肌无力综合征、获得性神经性肌强直、强直人综合征、小脑性共济失调、拉斯姆森脑炎(RasmussenEncephalitis)、莫凡综合征(Morvan Syndrome)、边缘系脑炎、眼病、内耳病、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬变(primary billary cirrhosis)、原发性硬化性胆管炎、胰腺炎、天疱疮(pemphigus pemphigoid)、斑秃、白癜风、慢性荨麻疹、古德帕斯彻病、ANCA-相关肾小球肾炎、睾丸炎、卵巢炎、风湿性心脏病、心肌炎、扩张性心肌病、结节性多发性关节液(polyartheritis nodosa)、川畸病、韦格纳肉芽肿病、显微多脉管炎、丘-施二氏综合征、冷球蛋白血症脉管炎(cryoglobulenemic vasculitis)、亨-舍二氏紫癜、贝切特(氏)病、巨细胞动脉炎、高安动脉炎、特发性梗阻性细支气管炎(idiopathic bronchiolitis obliterans)、特发性肺纤维变性、肺的自身免疫疾病和眼阵挛-肌阵挛综合征(Opsoclonus-Myoclonus syndrome)。
本文公开的抗体还可应用于治疗失败或排异的植入物和假体及失败或排异的器官移植，例如肺、肾、心和肝。
还考虑了本发明抗体在体内和体外的其它应用。例如，设计用于检测GM-CSF的存在和/或纯化GM-CSF的试验可利用本发明抗体。还可在特定疾病的动物模型中检验抗体，以进行毒理学、安全性和剂量研究。
对于治疗性和预防性应用，将能获得所需治疗或预防作用的有效量的本发明抗体给予有此需要的对象。应该知道，任何特定对象的具体有效量或剂量取决于各种因素，包括，例如所用具体抗体的活性、年龄、体重、待治疗个体的总体健康状况和饮食、给药时间、排出速率和与任何其它治疗或疗法联用。可以根据治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次给药。
如果需要，治疗或预防自身免疫和炎性疾病时，本发明考虑给予多种抗体。本领域技术人员可根据具体的病例决定给予一种或多种抗体是否是合适或理想的。
本发明还考虑联合治疗，其中本文所述抗体与可能有助于所需治疗或预防后果的其它合适药物共同给予。例如，就哮喘而言，可寻求维持现有的抗炎治疗以控制炎症的发生率同时利用本发明实施方式的药物。“共同给予”表示通过相同或不同途径在同一制剂或两种不同制剂中同时给予，或通过相同或不同途径而顺次给予。“顺次”给予表示两种药物的给药时间相差数秒、数分钟、数小时、数日、数周、数月或数年。可采用任何顺序给予这些药物。
根据本发明的实施方式，可采用任何合适的形式给予抗体。根据本发明，通常给予药物组合物形式的抗体，所述组合物可包含一种或多种药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。这种组合物可以通过任何合适的途径，例如通过胃肠外(包括静脉内、动脉内或肌肉内)、口服、经鼻、局部和皮下途径而全身性、区域或局部给予。
药学上可接受的运载体或稀释剂的例子是去除矿物质的水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉聚糖；黄蓍胶或阿拉伯胶和石油凝胶。以组合物的重量计，运载体通常占10％-99.9％。
适用于口服的运载体、稀释剂、赋形剂和辅助剂的一些例子包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可含有合适的调味剂和着色剂。当用于胶囊形式时，可用延迟崩解的化合物，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包衣所述胶囊。辅助剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
对于采用可注射溶液或悬液给药，胃肠外可接受的无毒稀释剂或运载体可包括林格液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。本领域技术人员已知制备可胃肠外给予的组合物的方法，更多细节见，例如通过引用全文纳入本文的《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalScience)，第15版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州。
本说明书引用任何在先出版物(或从中获得的信息)或任何已知的物质不是，并且不应理解为承认或认可或是以任何形式暗示该在先出版物(或从中获得的信息)或已知物质在任何国家中构成本说明书有关领域的公知常识。
现在参考以下具体实施例描述本发明，这些实施例不应理解成以任何形式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-产生鼠单克隆抗体4K21
将CFA(完全弗氏佐剂)配制的50μg重组人GM-CSF(PT公司(Peprotech))腹膜内注射入BALB/c小鼠来产生抗人GM-CSF抗体。2周和4周后，再注射IFA(不完全弗氏佐剂)配制的25μg重组人GM-CSF两次。
首次注射后6个月，腹膜内给予IFA配制的25μg重组人GM-CSF加强免疫。最后，加强免疫后2周静脉内给予磷酸缓冲盐水配制的50μg重组人GM-CSF。5天后，收集小鼠脾脏，并与SP2/0细胞融合。
通过ELISA(酶联免疫吸附测定)筛选表达抗体的杂交瘤上清液与重组人GM-CSF的特异性结合情况。采用TF-1和FDC-P1生物学试验(参见实施例2)进一步筛选抗-人GM-CSF抗体的中和活性。
如此产生的一种鼠抗-人GM-CSF单克隆抗体指定为4K21-O11-E14(下文称为4K21)。
mAb 4K21的可变区氨基酸序列如下所示：
轻链
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVNSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)
重链
EVQLVESGGGLVKSGGSLKLSCAASGFAFSAYDMSWVRQTPEKRLELVAYISSGGSSFYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRHLGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：2)
含有4K21的杂交瘤于2007年5月17日保藏在英国索尔兹伯里普当应用微生物与研究中心的欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，登录号为07051601。
实施例2-鼠单克隆抗体4K21的生物学特性
在TF-1细胞生长生物学试验中，证明鼠抗-人GM-CSF单克隆抗体4K21能中和人GM-CSF的生长促进功能(图1)。TF-1细胞的生长依赖GM-CSF的存在，用2ng/ml重组GM-CSF(PT公司)维持该细胞。为进行中和试验，用含0.25ng/ml GM-CSF的TF-1生长培养基制备10ng/ml-10,000ng/ml浓度的抗体。混合各浓度的抗体与GM-CSF，在96孔板中37℃温育1小时。然后将经清洗的TF-1细胞(1×105)加入各孔，37℃温育72小时。通过用0.5uCi的3H-胸苷脉冲处理各孔4小时以定量测定细胞生长。
相反，4K21显示抗-人GM-CSF特异性，但该抗体不能中和鼠GM-CSF介导的FDC-P1细胞生长(图2)。为进行该中和试验，用含5ng/ml鼠GM-CSF的FDC-P1生长培养基制备10ng/ml-10,000ng/ml浓度的抗体。混合各浓度的抗体与GM-CSF，在96孔板中37℃温育1小时。然后将经清洗的FDC-P1细胞(1×105)加入各孔，37℃温育72小时。通过用0.5uCi的3H-胸苷脉冲处理各孔4小时以定量测定细胞生长。
采用Biacore测定4K21单克隆抗体的结合动力学，并与购自BD生物科学公司(BD Biosciences，BD；目录号554501)的大鼠抗-人GM-CSF抗体的结合动力学作比较(参见下表1)。将重组人GM-CSF包被到CM5芯片上以测定4K21抗体的结合动力学。未包被的流动小室(cell)用作参照。在2分钟内注射用HBS-EP制备成66.7nM到4.17nM浓度的两倍连续稀释抗体，稳定时间为10分钟，解离时间为15分钟。运行BIACore动力学分析向导(BIACorekinetic analysis wizard)来确定各抗体与GM-CSF的缔合(ka[1/Ms])、解离(kd[1/s])和亲和力(KD[nM])。如表3所示，4K21显示对人GM-CSF的结合亲和力极高，在低皮摩尔浓度即可结合。
表3-4K21单克隆抗体的结合动力学
用重组人GM-CSF包被CM5芯片以测定4K21抗体的结合动力学.
  抗体   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KA(1/M)   KD(M)   KD(nm)
  BD   5.20E+04   ＜1e-5   ＞5.2e9   ＜1.9e-10   ＜0.19
  4K21-O11-E14(小鼠) 5.90E+04 ＜1e-5 ＞5.9e9 ＜1.7e-10 ＜0.17
实施例3-4K21的人源化
测定CDR和框架区残基
通常按照各种编号方案，例如Kabat、Chothia或IMGT(ImMunoGeneTicsinformation
Figure A20088002339700201
http://imgt.cines.fr)来确定某抗体的CDR和框架区。Kabat定义是基于序列变异性，是最常用的。然而，Kabat确定的给定抗体的CDR不一定与其它编号系统确定的CDR相同。两种编号系统确定的CDR可能重叠，或者一种可在另一种的某侧延伸几个残基。
联用Kabat和IMGT编号系统以确定可变(V)区中的CDR和框架区。其目标是尽可能提高嫁接入人框架区的小鼠CDR序列的范围，从而保持抗原结合袋的结构。因此，GM-CSF抗体CDR包括由Kabat和IMGT编号系统分类为CDR的所有残基。其余序列包含V区框架。
选择合适的人抗体框架序列
为选择嫁接小鼠CDR的合适人抗体框架序列，采用多种方案：
·采用BlastP检索序列数据库，鉴定与GM-CSF抗体的小鼠可变区同源性最高的人Ig V区轻链和重链序列。
·根据以下三条标准对人Ig V区重链和轻链序列排序：
a)与完整鼠可变区序列的总体相似性和相同性
b)经典的结构比较
c)框架相似性评分。
·选择与小鼠GM-CSF抗体的同源性最高的已知人抗体，利用那些人可变区框架嫁接小鼠GM-CSF抗体CDR。
从序列数据库选择同源性抗体
小鼠4K21可变区氨基酸序列(重链和轻链)分别用作对NCBI非冗余数据库作Blasp检索的查询序列。然后选择源自人来源的序列。检查参照物，在不清楚克隆是否确实分离自人来源的情况中，忽略这些序列。根据Tomlinson等，EMBO J 14：4628-4638，1995的定义确定轻链经典结构。相似地，根据Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817，1992的定义确定重链经典结构。
从各检索获得与查询序列的同源性最高的序列清单，见下表4和5。
选择人轻链框架
表4-与小鼠GM-CSF mAb轻链可变区同源的人序列
  hIgLVGMCSF 序列ID ％相同性 ％相似性 经典结构   框架相似性评分 参照
1   1X9Q_AGI：62738392 93 3 4-1-1 可能是鼠
2 BAC01734.1GI：21669419 83 8 4-1-1 -11   无参照：人治疗性文库克隆
3   1WT5_DGI：67464418 79 11
4   ABC66847.1GI：84797796 82 8 4-1-1 可能是鼠
5   BAC01730.1GI：21669411 83 7 4-1-1 -11   无参照：人治疗性文库
  克隆
6   AAZ09071.1GI：70798723 83 6 4-1-3 -11   参照-人抗体
7   ABC66863.1GI：84797828 82 8 4-1-1 可能是鼠
8   ABC66914.1GI：84797930 78 11 4-1-1 可能是鼠
9 BAC01562.1GI：21669075 78 11 4-1-1 -10   无参照：人治疗性文库克隆
10   AAK94811.1GI：18025604 77 12
11   CAA51134.1GI：441401 76 12
12   CAA61441.1GI：929641 76 12
13   CAB51297.1GI：5578794 77 12
14   CAB51293.1GI：5578786 78 12
15   ABC66930.1GI：84797962 78 9 4-1-1 可能是鼠
16   ABC66929.1GI：84797960 78 9
17   ABA26215.1GI：75707503 77 11
18   ABA71374.1GI：77379434 74 11
19   AAY33347.1GI：63102883 78 10 4-1-1 -10   参照-人抗体
20   ABA70842.1GI：77378240 75 12
21   ABA26227.1GI：75707527 76 11
22   BAC01733.1GI：21669417 78 10
23   ABC66952.1GI：84798006 76 10
24   ABA26042.1GI：75707157 75 12
25   AAY33405.1GI：63102999 78 11
26   ABC66931.1GI：84797964 76 11
27   AAB61659.1GI：2072982 76 11
28   AAM46359.1GI：21310712 72 6
29   1S3K_LGI：51247325 66 15
与4K21轻链可变区同源性最高的框架是hIgVL GMCSF01、02、04、05、06、07、19、15、09和08。除了hIgVL GMCSF06(4-1-3)，所有这些抗体具有与4K21轻链(4-1-1)相同的经典结构。这些抗体中许多的来源不明，因此忽略它们。
选择用于比较的抗体是hIgVL GMCSF02、05、06、19和09。抗体02和05具有相同的框架，因此，总共确定了4种不同的框架。确定的框架非常相似，事实上，除了在框架4中有两个突变以外，两对框架是相同的。两对中突变是相同的-G105Q和V109L-参见图3。根据该数据，决定只合成h4a、h4b和h4c，因为该轻链组合可以覆盖框架4中的突变，如果它们重要的话。
选择人重链框架
表5-与小鼠GM-CSF mAb重链可变区同源的人序列.
  hIgHVGMCSF 序列ID ％相同性 ％相似性 经典结构   框架相似性评分 参照
1   AAX82494.1GI：62421461 80 6 1-3 -8   参照-人抗体
2   1FH5_HGI：10835839 80 6 1-3 -9 可能是鼠
3   AAC51009.1GI：1791031 72 12 -17
4   CAC28887.1GI：12733968 72 13 -18
5 BAC01301.1GI：21668548 74 12 1-3 -16   无参照-人治疗性文库克隆
6   S22657GI：7438758 71 13 -17
7   CAA41851.1GI：32778 71 13 -19
8   CAD60378.1GI：27753335 69 12 -16
9   BAC01458.1GI：21668862 71 12 -17
10   CAD60354.1GI：27753287 67 13 -18
11   AAC18279.1GI：3170953 72 13 -15   参照-人抗体
12   CAD60400.1GI：27753465 69 11 -18
13   CAD60389.1GI：27753357 70 11 -18
14   CAD60364.1GI：27753307 69 13 -17
15   CAD60352.1GI：27753283 69 11 -18
16   CAD60349.1GI：27753277 71 13 -18
17   CAD60347.1GI：27753273 69 12 -18
18   CAD60300.1GI：27753179 66 14 -18
19   AAS85871.1GI：46253798 69 14 -16
20   CAF31294.1GI：49523898 72 8 -14   未公布-可能是人
21   CAC28931.1GI：12734096 72 12 -18
22   CAA78572.1GI：30966 71 12 -18
23   CAA78561.1GI：31019 70 12 -18
24   ABA26208.1GI：75707489 70 10 -16
25   AAL96550.1GI：19744554 64 13 -22
26 AAZ94745.1GI：74039339 74 8 1-3 -15   无参照-人治疗性文库克隆
27   AAB62913.1GI：2253346 71 9 -19
28   AAZ08900.1GI：70798376 70 14 -20
29   AAZ08886.1GI：70798348 70 12 -26
30   AAD53846.1GI：5834160 71 12 -19
31   CAC28912.1GI：12734026 72 13 -19
32   AAX19318.1GI：60392056 70 12 -20
33   CAC88717.1GI：15886920 73 13 -22
34   ABC67109.1GI：84798320 71 10 -17
35   ABC67046.1GI：84798194 71 11 -18
36   CAA75158.1GI：4379079 71 11 -22
37   BAC01328.1GI：21668602 62 11 -20
38   AAY57129.1GI：66821321 68 11 -23
39   AAY57128.1GI：66821293 68 11 -21
40   AAY57125.1GI：66821255 63 11 -23
41   AAV39619.1GI：54778900 68 11 -16
与4K21重链可变区同源性最高的框架是hIgVH GMCSF01、02、05和26。所有这些抗体具有与4K21重链(1-3)相同的经典结构。下一大组抗体的相同性和相似性评分非常类似，但根据它们的框架相似性评分选择两种抗体。通过分析框架区中的各残基来计算框架相似性，评分是非相同残基数。这两种抗体是hIgVH GMCSF11和20。检查所有抗体的来源，除了被忽略hIgVH GMCSF02外，所有抗体都是人来源的。因此，选择的与4K21重链可变区同源性最高的抗体是hIgVH GMCSF01、05、11、20和26。
将CDR嫁接入框架序列并产生人源化轻链和重链序列
人源化4K21轻链
产生4种形式的人源化4K21轻链可变区。图3显示这些人源化形式的4K21轻链抗体的比对。这些抗体中的3种，h4a、h4b和h4c用于本文所述的人源化抗体中。
人源化抗GM-CSF轻链h4a(SEQ ID NO：9)是基于hIgVL GMCSF02和05框架-这两种抗体轻链具有相同的框架。两种抗体均分离自治疗性人抗体的文库。从人扁桃体、脐带、外周血和骨髓的混合物产生该文库。
人源化抗GM-CSF轻链h4b(SEQ ID NO：10)是基于hIgVL GMCSF06框架。该抗体分离自慢性淋巴细胞性白血病患者的外周血(Stamatopoulos等，Blood 106(10)：3575-3583，2005)。
人源化抗GM-CSF轻链h4c(SEQ ID NO：11)是基于hIgVL GMCSF09框架。该抗体分离自治疗性人抗体的文库。从人扁桃体、脐带、外周血和骨髓的混合物产生该文库。
人源化4K21重链
产生5种形式的人源化4K21重链可变区。图4显示这5种人源化形式的4K21重链抗体的比对。
人源化抗GM-CSF重链h4/10(SEQ ID NO：13)是基于hIgVHGMCSF01。该抗体分离自耐受疟疾感染的患者(Lundquist等，Infect.Immun.74(6)：3222-3231，2006)。
人源化抗GM-CSF重链h4/20(SEQ ID NO：14)是基于hIgVHGMCSF05。该抗体分离自治疗性人抗体的文库。从人扁桃体、脐带、外周血和骨髓的混合物产生该文库。
人源化抗GM-CSF重链h4/30(SEQ ID NO：15)是基于hIgVHGMCSF11。该抗体分离自两位健康的成年人(Wang和Stollar，Clin.Immuno1.93(2)：132-142，1999)。
人源化抗GM-CSF重链h4/40(SEQ ID NO：16)是基于hIgVHGMCSF20。该抗体分离自CD5+B细胞群。
人源化抗GM-CSF重链h4/50(SEQ ID NO：17)是基于hIgVHGMCSF26。该人抗体分离自毛细胞性白血病的患者。注意数据库中的条目不具有框架1的完整序列(前16个氨基酸缺失)。为完成框架区1，插入小鼠重链的等效残基。鼠抗体的所有这些残基均出现在人数据库中，除了氨基酸14处是丝氨酸。氨基酸14处的丝氨酸看来是鼠独有的。因此，对于4K21重链的这种人源化形式，在氨基酸14处包含丝氨酸可视作框架回复突变成鼠残基。
实施例4-表达人源化抗体
将抗体可变区基因克隆入含恒定区基因的载体中
如上所述设计重链和轻链可变区氨基酸序列。为产生含有这些结构域的抗体，优化编码各可变区的DNA序列并由德国格纳特股份有限公司(GeneartGmbH，Germany)合成。轻链可变基因在各端具有独特的BsmB1限制性位点。重链基因在5′端具有BsmB1位点，在3’端具有Nhe1位点。此外，为便于亚克隆入其它载体，在5’或3’端加入EcoRI和HindIII位点。
为构建全长抗体基因，将可变区基因亚克隆入编码分泌信号和恒定区的载体。对于轻链，该载体含有通过两个独特BsmB1位点隔开的分泌信号序列和人恒定区κ(Cκ)基因。重链载体含有通过BsmB 1和Nhe1位点隔开的分泌信号和人恒定区γ(Cγ1)基因。
克隆方法包括通过标准方法制备质粒DNA，根据生产商(NEB)的推荐用BsmB1(轻链载体和Vk区基因)或BsmB1和Nhe1(重链载体和Vh区基因)消化质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，利用凝胶提取试剂盒(JetQuick，基诺迈得公司(Genomed))从凝胶回收DNA片段，将可变区基因片段连接于载体片段(T4DNA连接酶，NEB)，将DNA转化入感受态大肠杆菌细胞(TOP10，英杰公司(Invitrogen))。通过限制性消化分析转化细胞的质粒DNA，测序质粒中的抗体基因以证实可变区亚克隆入正确的读框。
将抗体基因亚克隆入表达载体
证实全长抗体基因具有正确序列后，将其亚克隆入表达载体。可用的表达载体的例子包括以下任一种：pcDNA-、pLENTI-、pT-REX-、pAd-、pREP-或pCEP-哺乳动物表达载体(英杰公司)，pTriEx1或pBac载体(诺瓦金(Novagen))，ZAP和pCMV表达载体(斯特拉塔基因公司(Stratagene))，GS表达系统载体(隆扎公司(Lonza))，pCMV5cumate表达系统载体(QBG公司(Qbiogene))，UCOE表达系统质粒(ML实验室公司(ML Laboratories))或MARtech表达质粒(赛勒克斯公司(Selexis))。在该情况中，将重链基因(在5’端含有HindIII位点，在3’端含有EcoRI位点)亚克隆入pEE6.4载体(隆扎生物公司(Lonza Biologics)，英国)中CMV启动子下游的HindIII-EcoRI位点。将轻链基因(在5’端含有HindIII位点，在3’端含有EcoRI位点)亚克隆入pEE12.4载体(隆扎生物公司，英国)中的HindIII-EcoRI位点。将重链表达盒(含启动子、重链编码序列和多聚腺苷酸化信号并且在5’端含有NotI位点，在3’端含有BamHI位点)亚克隆入轻链表达盒下游的NotI-BamHI位点，从而产生同时表达重链和轻链的单一载体。
在哺乳动物细胞中表达人源化抗体
为表达人源化抗体，在一些情况中，利用脂质转染试剂(英杰公司)将重链和轻链载体共转染入CHO细胞。或者，可通过电穿孔、磷酸钙沉淀、直接注射、基因枪或本领域技术人员已知的其它方法转染载体DNA。在大多数情况中，通过电穿孔将同时编码重链和轻链的单一载体转染入CHO细胞。
瞬时抗体转染和表达
转染之日，用脂质转染试剂将150μg DNA转染入1.5×107CHO细胞中(至少90％为活细胞，隆扎生物公司，英国)。3-4天后通过ELISA监测抗体表达。
纯化人源化抗体
转染的细胞将抗体分泌入生长培养基。通过G蛋白亲和层析纯化抗体。合并通过SDS-PAGE或人IgG特异性ELISA鉴定的含抗体组分。采用人IgG特异性ELISA测定回收的抗体量及其浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳估计抗体纯度。
产生和测定的人源化抗体的清单
下表6列出了产生的不同抗体，显示抗体中存在的重链和轻链序列。
表6
  人源化单克隆抗体   重链序列   轻链序列
  hGM4/1(h4K21-1)   h4/10，hG1   h4a，hKa
  hGM4/2(h4K21-2)   h4/20，hG1   h4a，hKa
  hGM4/3(h4K21-3)   h4/30，hG1   h4a，hKa
  hGM4/4(h4K21-4)   h4/40，hG1   h4a，hKa
  hGM4/5(h4K21-5)   h4/50，hG1   h4a，hKa
  hGM4/6(h4K21-6)   h4/10，hG1   h4b，hKa
  hGM4/7(h4K21-7)   h4/20，hG1   h4b，hKa
  hGM4/8(h4K21-8)   h4/30，hG1   h4b，hKa
  hGM4/9(h4K21-9)   h4/40，hG1   h4b，hKa
  hGM4/10(h4K21-10)   h4/50，hG1   h4b，hKa
  hGM4/11(h4K21-11)   h4/10，hG1   h4c，hKa
  hGM4/12(h4K21-12)   h4/20，hG1   h4c，hKa
  hGM4/13(h4K21-13)   h4/30，hG1   h4c，hKa
  hGM4/14(h4K21-14)   h4/40，hG1   h4c，hKa
  hGM4/15(h4K21-15)   h4/50，hG1   h4c，hKa
实施例5-人源化抗体的生物学特性
人源化抗GM-CSF抗体的结合亲和力分析
通过BIACore分析测定人源化抗体的结合亲和力。用乙酸钠，pH 5制备100μg/ml的重组GM-CSF(PT公司)，通过胺偶联固定于CM5传感器芯片。约1200RU结合于芯片。第一个实验是测定15种人源化抗体的结合活性。用HBS-EP制备1μg/ml的这些抗体，在3分钟内注射，与鼠4K21和商品化购得的抗GM-CSF抗体(BD)比较。图5显示15种抗体中有12种显示等效，在一些情况中，与GM-CSF结合最多是鼠4K21的3.5倍。
进行第二实验以测定这些抗体结合人GM-CSF的动力学。用HBS-EP制备浓度为66.7nM到4.17nM的两倍连续稀释抗体。利用偶联于CM5芯片的重组GM-CSF再次定量测定直接结合，未包被的流动小室用作参照。在2分钟内注射各浓度的抗体，稳定时间为10分钟，解离时间为15分钟。运行BIACore动力学分析向导来确定各抗体与GM-CSF的缔合(ka[1/Ms])、解离(kd[1/s])和亲和力(KD[nM])。表7和图6显示hGM4/1的缔合速率最高，hGM4/6的亲和力最高。
表7-GM-CSF人源化抗体的缔合速率、解离速率和结合亲和力
  抗体   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KA(1/M)   KD(M)   KD(nm)
  BD   5.20E+04   ＜1e-5   ＞5.2e9   ＜1.9e-10   ＜0.19
  4K21-O11-E14(小鼠) 5.90E+04 ＜1e-5 ＞5.9e9 ＜1.7e-10 ＜0.17
  hGM4/1   2.90E+05   3.80E-05   7.70E+09   1.30E-10   0.13   缔合最高
  hGM4/2   1.60E+05   4.70E-05   3.50E+09   2.90E-10   0.29
  hGM4/3   2.10E+05   3.00E-05   7.10E+09   1.40E-10   0.14
  hGM4/5   1.40E+05   1.90E-05   7.60E+09   1.30E-10   0.13
  hGM4/6   2.00E+05   1.60E-05   1.20E+10   8.10E-11   0.081   亲和力最高
人源化抗体阻断GM-CSF介导的细胞生长
用TF-1细胞生长生物试验测定各抗体的GM-CSF中和活性。TF-1细胞的生长依赖于GM-CSF的存在，用2ng/ml重组GM-CSF(PT公司)维持该细胞。为进行中和试验，用含0.25ng/ml GM-CSF的TF-1生长培养基制备各种浓度的抗体。混合各浓度的抗体与GM-CSF，在96孔板中37℃温育1小时。然后将经清洗的TF-1细胞(1×105)加入各孔，37℃温育72小时。通过用0.5uCi的3H-胸苷脉冲处理各孔4小时以定量测定细胞生长并计算EC50。测试浓度为400nM到28fM的3倍连续稀释抗体。如表8所示，抗体hGM4/1、hGM4/6和hGM4/11显示中和活性良好。
表8.与非-GF-CSF特异性hIgG1抗体相比，4K21和人源化抗体的EC50值
Figure A20088002339700291
Figure A20088002339700301
实施例6-人源化抗体重链序列中的回复突变以及所产生抗体的特性
在以上实施例5中所述TF-1生物试验中显示具有最佳中和活性的抗体(hGM4/1、hGM4/6和hGM4/11)均具有相同的重链序列(h4/10；SEQ IDNO：13)。不想局限于理论，但估计这些抗体的至少相当一部分的结合活性源自该重链。从图7可以看出，与鼠框架相比，h4/10重链框架的氨基酸序列在8个位置不同(图7中框出的)。将一系列点回复突变和两个双回复突变(double back mutation)(回复突变成相应的鼠序列)引入h4/10序列的这些位点以增加人源化抗GM-CSF抗体的结合亲和力。采用定点诱变(斯特拉塔基因公司；按照生产商的使用说明书)产生含“回复”突变的重链序列。将这些改变的重链克隆入抗体表达载体，转染入CHO细胞，表达，通过G蛋白亲和层析纯化并如上所述定量测定。表9显示含改变的框架和产生的“回复”突变的抗体清单。
表9.所含人框架“回复”突变成鼠残基的人源化抗体
  人源化单克隆抗体   重链序列   轻链序列
  hGM4/17   h4/10Q1E，hG1   h4c，hKa
  hGM4/18   h4/10Q5V，hG1   h4c，hKa
  hGM4/19   h4/10P14S，hG1   h4c，hKa
  hGM4/20   h4/10D42E，hG1   h4c，hKa
  hGM4/21   h4/10W47L，hG1   h4c，hKa
  hGM4/22   h4/10A97T，hG1   h4c，hKa
  hGM4/23   h4/10M110T，hG1   h4c，hKa
  hGM4/24   h4/10V111L，hG1   h4c，hKa
  hGM4/25   h4/10M110T，V111L，hG1   h4c，hKa
  hGM4/34   h4/10W47L，A97T，hG1   h4c，hKa
采用以上实施例5所述的TF-1生物试验测定表9所列各抗体的中和活性。与hGM4/11相比，3种抗体，即hGM4/19、hGM4/21和hGM4/22显示结合活性改善。由于hGM4/21和hGM4/22中的回复突变分别位于CDR 2和CDR3附近，所以产生双回复突变(W47L，A97T)(hGM4/34)。与原始4K21抗体相比，该抗体也显示中和活性改善(参见图8)。
通过BIAcore分析以测定表9所列抗体的结合动力学。采用从以上实施例5所述方案改进而来的方案进行这些动力学试验。对于本动力学分析，通过固定抗小鼠IgG或抗人IgG来制备CM5芯片。然后分别通过抗小鼠IgG或抗人IgG将4K21或人源化变体固定于芯片。用HBS-EP制备浓度为1000nM到15.63nM的2倍连续稀释GM-CSF。在2分钟内注射各浓度的GM-CSF，在接下来的10分钟内检测解离情况(流速30微升/分钟)。运行BIACore动力学分析向导来确定各抗体的缔合(ka[1/Ms])、解离(kd[1/s])和亲和力(KD[nM])。图9显示hGM4/21和hGM4/34的亲和力与4K21相同。
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>2
<211>115
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>3
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>4
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>5
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1               5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>6
Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr Asp Met Ser
1               5                   10
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>7
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>8
His Leu Gly Phe Asp Tyr
1               5
<210>9
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)/智人(Homo sapiens)
<400>9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>10
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>11
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>11
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>12
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>13
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>14
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>15
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>16
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Phe Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Phe His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>17
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人源化序列
<400>17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>18
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>18
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>19
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>20
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>21
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>22
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>23
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>24
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>25
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Leu Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>26
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠同复突变的人源化序列
<400>26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>27
<211>115
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>包含鼠回复突变的人源化序列
<400>27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg His Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115

Claims (25)

1.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含含有SEQ ID NO：1所示序列或其片段或变体的轻链可变区。
2.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO：2所示的重链可变序列或其片段或变体。
3.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含含有SEQ ID NO：1所示序列或其片段或变体的轻链可变区，以及SEQ ID NO：2所示的重链可变序列或其片段或变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是抑制GM-CSF活性的鼠单克隆抗体或其人源化衍生物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是2007年5月17日保藏在英国索尔兹伯里普当应用微生物与研究中心的欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)的鼠单克隆抗体4K21，登录号为07051601。
6.鼠单克隆抗体4K21的人源化形式，所述抗体于2007年5月17日保藏在英国索尔兹伯里普当应用微生物与研究中心的欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)中，登录号为07051601。
7.如权利要求6所述鼠单克隆抗体4K21的人源化形式，其特征在于，轻链可变区包含SEQ ID NO：9-11中任一所示的序列或其片段或变体。
8.如权利要求6或7所述鼠单克隆抗体4K21的人源化形式，其特征在于，重链可变区包含SEQ ID NO：13-15、17或18-27中任一所示的序列或其片段或变体。
9.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，所述抗体在轻链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：3-5中任一所示序列的互补决定区(CDR)，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制GM-CSF的活性。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
11.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体在重链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：6-8中任一所示序列的互补决定区(CDR)，其中该抗体或其抗原结合片段抑制GM-CSF的活性。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
13.一种结合人GM-CSF或其片段的抗体或其抗原结合片段，所述抗体在轻链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：3-5中任一所示序列的互补决定区(CDR)，在重链可变区内包含至少一个含有SEQ ID NO：6-8中任一所示序列的互补决定区(CDR)。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
15.如权利要求14所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示序列或其片段或变体的轻链可变区。
16.如权利要求14或15所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示序列或其片段或变体的重链可变区。
17.如权利要求16所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含SEQ ID NO：13所示序列或其片段或变体。
18.如权利要求16所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体重链可变区包含用相应鼠重链可变区中相应位置的氨基酸残基替代SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示序列的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代。
19.如权利要求18所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，在包含SEQ ID NO：13所示序列的重链可变区中作出所述一个或多个氨基酸取代。
20.如权利要求19所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体重链可变区包含SEQ ID NO：18-27中任一所示的序列。
21.如权利要求20所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的序列。
22.如权利要求14-21中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化抗体包含选自下组的轻链和重链可变区序列：SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：13；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13；SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：18-27中任一项。
23.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含与SEQ ID NO：1-27中任一所示氨基酸序列具有至少约70％序列相同性的氨基酸序列。
24.一种治疗或预防GM-CSF介导疾病或病症或者与GM-CSF表达和/或活性升高或异常相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给予有此需要的对象有效量的至少一种权利要求1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
25.一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，任选含有药学上可接受的合适运载体和/或稀释剂。
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