MXPA06008839A - Anticuerpos contra toxinas de clostridium difficile y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos contra toxinas de clostridium difficile y usos de los mismos.

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Abstract

Anticuerpos que se ligan especificamente a toxinas de C. difficile, porciones de enlace de antigeno de los mismo, y metodos para hacer y usar los anticuerpos y porciones de enlace de antigeno de los mismos se proporcionan en la presente.

Description

ANTICUERPOS CONTRA TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE Y USOS DE LOS MISMOS Información Relacionada La solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. número 0/542.357, presentada el 6 de febrero de 2004, y la solicitud de patente provisional de E.U.A.. número 60/613,854, presentada el 28 de septiembre de 2004, los contenidos completos de ambas de las cuales se incorporan por la presente por referencia. Los contenidos de cualesquiera patentes, solicitudes de patente, y referencias citadas a través de esta especificación se incorporan por la presente por referencia en sus totalidades. Antecedentes de la Invención Clostridium difficile (C difficile) es una bacteria gram-positiva que ocasiona enfermedad gastrointestinal en seres humanos. C. difficile es la causa más común de diarrea infecciosa en pacientes de hospital, y es una de las infecciones nosocomiales más comunes en total (Kelly y col., New Eng. J. Med., 330:257-62, 1994). De hecho la enfermedad asociada con este patógeno puede afligir a tantos como tres millones de pacientes hospitalizados por año en los Estados Unidos (McFarland y col., New Eng. J. Med. 320:204-10, 1989; Johnson y col., Lancet, 336:97-100, 1990). El tratamiento con anticuerpos tales como ampicilina amoxicilina, cefalosporinas, y clindamicina que interrumpen la flora intestinal normal puede permitir la colonización de intestino con C. difficile y conducir a enfermedad de C. difficile (Kelly y La ont, Annu. Rev. Med.. 49:375-90, 1998). El principio de enfermedad C. difficile ocurre típicamente cuatro o nueve días después de que empiece del tratamiento de antibiótico, pero también puede ocurrir después de la descontinuación de terapia antibiótica. C. difficile puede producir síntomas que varían de diarrea y colitis suave a severa, incluyendo colitis pseudomernbranosa (PMC), una forma severa de colitis caracterizada por dolor abdominal, diarrea acuosa, y enfermedad sistémica (v.gr., fiebre, náusea). La recaída de enfermedad puede ocurrir en hasta 20% de pacientes tratados durante un primer episodio de enfermedad, y aquellos que recaen son a un riesgo mayor para recaídas adicionales (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998). La enfermedad de C. difficile se cree que es ocasionada por las acciones de dos exotoxinas, toxina A y toxina B, en epitelio de intestino. Ambas toxinas son proteínas de alto peso molecular (280-300 kDa) que catalizan modificación covalente de proteínas Rho, proteínas de enlace de GTP pequeñas involucradas en polimerización de actina, en células huésped. La modificación de proteínas Rho por . las toxinas las inactiva, conduciendo a despolimerización de filamentos de actina y muerte de célula. Ambas toxinas son letales a ratones cuando se inyectan parenteralmente (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med. 49:375-90, 1998). La enfermedad de C. difficile se puede diagnosticar en ensayos que detectan la presencia o actividad de toxina A. o toxina B en muestras de materias fecales, v.gr., inmunoensayos de enzima. Los ensayos de citotoxina se pueden utilizar para detectar actividad de toxina. Para realizar de ensayo de citotoxina, la materia fecal se filtra para remover la bacteria, y los efectos citopáticos de toxinas en células cultivadas se determinan (Merz y col., J. Clin. Microbiol., 32:1142-47, 1994). El tratamiento de C. difficile es complicado por el hecho de que los' antibióticos disparan la enfermedad asociada con C„ difficile. Sin embargo, los antibióticos son la opción de tratamiento primaria en la actualidad. Los anticuerpos menos probables de ocasionar enfermedad asociada con C^ difficile tal como vanco iciya y metronidazol se usan frecuentemente. La resistencia a la vancomicina que se desprende en otros microorganismos es una causa de interés al utilizar este antibiótico para tratamiento/ ya que es el único tratamiento efectivo para infección con otros microorganismos (Gerding, curr. Top. Microbiol. Immunol., 250:127-39, 2000). Los acercamientos de probiótico, en los que un sujeto se administra con microorganismos no patógenos que compiten probablemente de nichos con las bacterias patógenas, también se usan. Por ejemplo, el tratamiento con una combinación de vancomicina y Sacharomyces boulardii se ha reportado (McFarland y col., JAMA., 271824) :1913-8, 1994. Erratum en: JAMA, 272(7):518, 1994). Se han desarrollado vacunas que protegen animales de reto letal en modelos infecciosos de enfermedad (Torres y col., Infect. Immun. 63 (12) :4619-27, 1995). Además, se ha mostrado que los anticuerpos policlonales protegenen másters de enfermedad cuando se administran mediante inyección o alimentación (Giannasca y col., Infect. Immun. 67(2) :527-38, 1999; Kink y Williams, Infect. Immun. 66 (5) :2018-25, 1998). Los anticuerpos monoclonales de murina se han aislado que se ligan a toxinas de C. difficile y neutralizan sus actividades in vivo e in vitro (Orthier y col., Infect. Immun., 59 (3) : 1192-5, 1991).
Estos son algunos reportes de que los anticuerpos policlonales humanos que contienen anticuerpos que neutralizan toxina pueden impedir recaída de C. difficile (Salcedo y col., Gut., 41 (3) :36ß-70. 1997)= La respuesta de anticuerpo contra la toxina A se- ha correlacionando con principio de enfermedad, indicando la eficacia de respuestas humorales al controlar la infección. Los individuos con respuesta de ELISA de toxina A robusta tuvieron enfermedad menos severa comparada con los individuos con niveles de anticuerpo de toxina A bajos (Kyne y col., Lancet, 357 (9251) : 189-93, 2001). El papel individual de la toxina A y toxina B en patogénesis de enfermedad, y el papel de anticuerpos contra toxina en protección de enfermedad de C * difficile son controversiales y pueden depender del huésped. En humanos, la respuesta de anticuerpo de contra toxina A se ha correlacionado con resultado de enfermedad, sugiriendo un requerimiento de respuesta contra toxina A para protección. Esta observación está en contraste con reportes de organismos de C. difficile que ocasionan enfermedad - que expresan solamente toxina B, implicando que la toxina B • puede contribuir a la enfermedad en humanos . Estas cepas de toxina A-negativas también pueden ocasionar enfermedad en hámsters (Sambol y col., J. Inmfect. Dis., 183(12) :1760-6, 2001) . Compendio de la Invención Esta invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que la administración de anticuerpos contra toxina A de C. difficile a un sujeto puede proteger al sujeto de recaída de enfermedad mediada por C. difficile in vivo. La administración de anticuerpos a una o ambas de toxina A y toxina B puede prevenir la enfermedad primaria mediada por C. difficile. Los anticuerpos de alta afinidad contra toxinas de C. difficile se pueden proteger contra toxinas de C. difficile se puede producir, v.gr., en ratones, tales como ratones transgénicos que expresan segmentos de gene de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos pueden neutralizar la citotoxidad de toxina in vitro, y neutralizar la enterotoxicidad de toxina in vivo. Los anticuerpos que reconocen la toxina A y/o toxina B pueden inhibir y proteger de enfermedad in vivo. En un aspecto, la invención modaliza anticuerpos monoclonados humanos aislados o porciones de enlace de antígeno de los mismos que se ligan específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) . En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a toxina A de C. difficile (toxina A) . En otras modalidades, el anticuerpo o porciones de enlace de antígeno del mismo se enlazan específicamente a toxina B de C. difficile (Toxina B) . En otras modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se enlazan específicamente a ambas toxina A y toxina B. En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos neutralizan la toxina A in vitro, inhiben el enlace de toxina A a células de mamífero, y/o inhiben enfermedad mediada por C. difficile in vivo. En diversas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos tienen una o más de las siguientes características: cuando se administran a un ratón, protegen al ratón contra administración de una toxina de C. difficile en una cantidad que sería fatal a un ratón de control no administrado con el anticuerpo; protegen de o inhiben la colitis mediada por C. difficile, colitis asociada con antibiótico, o colitis pseodomembranosa (PMC) en un sujeto; protegen de o inhiben diarrea en un sujeto; y/o inhiben la recaída de enfermedad mediada por C. difficile. Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden ligarse específicamente a un epítope dentro de la mitad N-terminal de toxina A, v.gr., un epítope entre aminoácidos 1-1256 de toxina A. En otras modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a un epítope dentro del dominio de enlace receptor C-terminal de toxina A, v.gr., un epítope entre aminoácidos 1852-2710 de toxina A, o un epítope entre aminoácidos 659-1852, v.gr., un epítope dentro de residuos de aminoácido 900-1852, 900,1200, o 920,1033 de toxina A. En otras modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígenos de los mismos se ligan específicamente a un epítope dentro de aminoácidos 1-600, 400-600, o 415-540 de toxina A. Otros anticuerpos particulares o porciones de enlace de antígeno de los mismos se pueden ligar específicamente a un epítope dentro de residuos de aminoácido 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-2000, 2100-2200, o 2200-2300 2300-2400, 2400-2500, 2500-2600, 2600-2710 de toxina A, o cualquier porción o escala de intervalo de los mismos. En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a toxina A con un KD de menos de alrededor de 200 x 10"6 M. En una modalidad particular, el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, se liga específicamente a toxina A con un KD de menos de alrededor de 10 x 10-7 M, menos de alrededor de 10 x 10-8 M, menos de alrededor de 10 x 10-9 M, o menos de alrededor de 10 x 10"10 M. En otras modalidades particulares, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo, se liga específicamente a toxina A con un KD de menos de alrededor de 50 x 10"10 M, menos de 20 x 10"10 M, menos de alrededor de 15 x 10~10 M, menos de alrededor de 8 x 10"10 M, o menos de alrededor de 5 x 10"10 M. En diversas otras modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluyen una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácido cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NO. 1), 1B11 (SEQ ID NO:2), o 3H2 (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluyen una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, 98%. 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácido de región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el Clon D28 (SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), o 3H2 (SEQ ID NO: 6) . En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos cada uno incluye ambas, una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácido cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NO: 1), 1B11 (SEQ ID NO: 2), o 3H2 (SEQ ID NO: 3), y una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácido cuando menos 80%, 855, 90%, 95% 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable de clon 3D8 (SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), o 3H2 (SEQ ID NO: 6). En varias modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a un epítope que se traslapa con un epítope enlazado por un anticuerpo producido por clon 3D8, 1B11, o 3H2 y/o compiten para enlace a toxina A con un anticuerpo producido por el clon 3D8, 1B11, o 3H2. Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones que enlazan antígeno de los mismos puede incluir una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 80%, 85%, 90%. 95%, o 99%, o más idénticos a un CDR del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID Nos.7-9), 1B11 (SEQ ID Nos: 10-12), o 3H2 (SEQ ID Nos. 13-15) (también mostrados en el Cuadro 1) . Una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una o más CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ. ID NOs: 19-21), o 3H2 (SEQ ID N0s:22-24) (también mostrados en el Cuadro 2). Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones que enlazan antígeno de los mismos pueden incluir una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR del anticuerpo producido por el clon 3Ds (SEQ ID NOs:7-9), 1B11 (SEQ ID Nos: 10-12) o 3H2 (SEQ ID Nos: 13-15), y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos de porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir una o más CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticas a una CDR o una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), o 3H2 (SEQ ID NOs:22-24). Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir tres CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticos a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID N0s:7-9), 1B11 (SEQ ID Nos: 10-12), o 3h2 (SEQ ID NOs:13-15) . En algunas modalidades, una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID Nos: 19-21, O 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24). En algunas modalidades, una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos una o más CDRs de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18, 1B11 (SEQ ID Nos: 19-21), o 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24), y una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), o 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15). La región de cadena ligera variable puede incluir tres CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOS: 16-18), lbll (SEQ ID NOS:19-21) 0 3H2 (SEQ ID Nos: 22-24) . En ciertas modalidades, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son idénticos a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOS: 7-9), 1B11 (SEQ ID Nos:10-12), o 3H2 (SEQ ID NOs:13-15), y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son idénticas a una CDER de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID N0s:19-21), o 3H2 (SEQ ID Nos: 22-24), v.gr., una región de cadena ligera variable y región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo son idénticos a una región de cadena ligera variable y región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5), o 3h2 (SEA ID NO:3, SEQ ID NO: 6). En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos neutralizan la toxina B in vitro, inhiben el enlace de toxina B en células de mamífero y/o neutralizan la toxina B in vivo. En algunas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a un epítope en una porción C-terminal de toxina B (v.gr., entre aminoácidos 1777-2366 de toxina B) . Otros anticuerpos particulares o porciones de enlace de antígeno de los mismos, se pueden ligar específicamente a un epítope dentro de residuos de aminoácido 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400-, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-20000, 2100, 2200 o 2200-2366 de toxina B, o cualquier intervalo, porción o escala de los mismos . En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos se ligan específicamente a toxina B con un KD de menos de alrededor de 20 x 10"6 M. En una modalidad particular, el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, se liga específicamente a la toxina B con un KD de menos de alrededor de 10 x 10"7 M, menos de alrededor de 10 x 10"8 M, menos de alrededor de 10 x 10~9 M, o menos de alrededor de 10 x 10"10 M. En otras modalidades particulares, el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, se liga específicamente a la toxina B con un KD de menos de alrededor de 50 x 10~10 M, menos de alrededor de 20 x 10-10 M, menos de alrededor de 15 x 10"10 M, menos de alrededor de 8 x 10"10 M, o menos de alrededor de 5 x 10~10 M. En varias otras modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluyen una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácido que es cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una región de cadena pesada variable de secuencia de aminoácido del anticuerpo producido por el clon 124-152 (es decir la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 54), 2A11, o 1G10. En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluyen una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácido que es cuando menos 80%, 85%, 90% , 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (es decir, la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:58), 2A11, o 1G10. En ciertas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos cada uno incluye tanto una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácido cuando menos 805, 855, 905, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (es decir, la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:54), 2 ll, o 1G10, y una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácido que es cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (es decir, la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO:58), 2A11, o 1G10. En diversas modalidades, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de las mismas se ligan específicamente a un epítope que se traslapa con un epítope ligado a un anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11, o 1G10 y/o compiten para enlazarse a la toxina B con un anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11, o 1G10. Una región de .cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%,- o 99%, o más idénticas a una CDR del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 64 o 66), 2A11, o 1G10 (Cuadro 3) . Una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, o 99g%, o más idénticas a una CDR del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 68, 70 o 72), 2A11, o 1G10 (Cuadro 4). Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 62, o 66) ,- 2A11, o 1G10, y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una o más CDRs que son cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, 99% o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 68, 70, o 72) 2A11, o 1G10. Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir tres CDRs que son cuando menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 64, o 66), 2A11, o 1G10. En ciertas modalidades, la región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son cuando menos 805, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 68, 70, o 72), 2A11, o 1G10. En otras modalidades, la región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye una o más CDRs que son cuando menos 805, 85%, 905, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos. 68, 70, o 72), 2A11, o 1G10, y una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son cuando menos 805, 85%, 905, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 64, o 66), 2A11, o 1G10. La región de cadena ligera variable puede incluir tres CDRs que son cuando menos 805, 855, 90%, 95%, o 99%, o más idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 68, 70, o 72), 2A11, o 1G10. En todavía otras modalidades, la región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye tres CDRs que son idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 64, o 66) , 2A11, o 1G10, y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno' de los mismos incluye tres CDRs que son idénticas a una CDR de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 68, 70, o 72), 2A11, o 1G10, v.gr., una región de cadena ligera variable y región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo son idénticas a una región de cadena ligera variable y región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (SEQ ID Nos: 62, 64, o 66), 2A11, o 1G10. Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden ser anticuerpos de longitud completa, pueden incluir un dominio efector, v.gr.. un dominio Fc, pueden ser anticuerpos de ísotipo de gamma inmunoglobulina, anticuerpos de cadena sencilla, o fragmentos Fab. Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir además un portador farmacéuticamente aceptable y/o una etiqueta. En diversas modalidades, las composiciones que incluyen los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos están libres de otros polipéptidos humanos (v.gr., contienen menos de 5% de polipéptidos humanos distintos a los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos) . En todavía otro aspecto, la invención modaliza composiciones que incluyen: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de C. difficile; y (b) un anticuerpo policlonal o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de C. difficile. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina A de C. difficile, y el anticuerpo policlonal o porción de enlace de antígeno del mismo se liga a la toxina B de C. difficile. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a la toxina B de C. difficile, y el anticuerpo policlonal o porción de enlace del mismo se liga específicamente a la toxina A de C difficile-. Los anticuerpos pueden incluir otras particularidades descritas en la presente. En otro aspecto, la invención modaliza anticuerpos monoclonales humanos aislados o porciones de enlace de antígeno de los mismos que se ligan específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C, difficile), en donde los anticuerpos: (a) incluyen una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivada de un gene humano VH 3-33; y/o (b) incluyen una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gene humano V? seleccionado del grupo que consiste en V? L19, V L6 y V? L15. Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir otras particularidades descritas en la presente. En otro aspecto, la invención modaliza anticuerpos monoclonales humanos aislados o porciones de enlace de antígeno de los mismos que se ligan específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), en donde los anticuerpos: (a) incluyen una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gene humano VH 5-51; y/o (b) incluyen una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gene humano V? A27. Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos también pueden incluir otras particularidades descritas en la presente. En otros aspectos, la invención modaliza polipeptidos aislados que incluyen una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo producido por clon de hibridoma 3D8, 1B11, o 3H2 (también denominado en la presente como "3D8", "1B11", y "3H2") . En otro aspecto, la invención modaliza polipéptidos aislados que incluyen una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo producido por clon de hibridoma 124-152, 2A11, o 1G10 (también denominados en la presente como 124-152", 2A11", y 1G10") . En otro aspecto, las particularidades de la invención modaliza anticuerpos monoclonales aislados o porciones de enlace de antígeno de los mismos que se ligan específicamente a una exotoxina de C. difficile, neutralizan la toxina, inhiben y/o protegen de enfermedad mediada por C. difficile. En una modalidad, los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de las mismas son anticuerpos o porciones de enlace de antígeno • de los mismos de mamíferos (v.gr., humano). Los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos pueden incluir otras particularidades descritos en la presente. En otro aspecto, la invención modaliza composiciones que incluyen: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo que se enlaza específicamente a toxina A de C. difficile; y (b) un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a toxina B de C. difficile. En otro aspecto, la invención modaliza ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica polipéptidos cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más idénticos a SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4, 5, o 6; v.gr., en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 805, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticos a SEQ ID Nos, 28, 29, 40, 35, 36, o 37. La invención también modaliza vectores de expresión que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido cuando menos 755, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntico a SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, o 6; v.gr., en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEQ ID Nos. 38, 39, 40, 35, 36, o 37, así como células huésped, v.gr., células bacteriales, v.gr., células de E. coli. incluyendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntico a SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, - 5, o 6; v.gr., en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEQ ID Nos: 38, 39, 40, 35, 36, o 37. En otro aspecto, la invención modaliza ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido que es cuando menos 755, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntico a SEQ ID Nos: 54, 56, 58 o 60, por ejemplo, en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEQ ID Nos: 55, 57, 59, o 61. La invención también modaliza vectores de expresión que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido cuando menos 75g%, 805, 85%, 905, 95%, 99%, o más idéntico a SEQ ID Nos: 54, 56, 58, o 60, por ejemplo, en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEQ ID Nos: 55, 57, 59 o 61. La invención también proporciona células huésped, v.gr., células bacterianas, v.gr., células de E. coli, que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido que es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntico a SEQ ID Nos: 54, 56, 58, o 60, por ejemplo, en donde la secuencia de ácido nucleico es cuando menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntico a SEQ ID Nos: 55, 57, 59, o 61. Las células huésped también pueden ser células eucarióticas, v.gr., células de levadura, células de mamífero, v.gr., células de ovario de hámster chino (CHO), células de NSO, o células de mieloma. En otro aspecto, la invención modaliza equipos que incluyen un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) , v.gr., un anticuerpo o antígeno que liga una porción del mismo descrito en la presente. El equipo puede incluir instrucción para uso al prevenir o tratar enfermedad mediada por C. difficile. El equipo puede incluir además un anticuerpo policlonal o porción de enlace de antígeno del mismo que liga específicamente una exotoxina de C. dífficile. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina A de C. difficile. En una modalidad, el anticuerpo policlonal o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina B de C. difficile. En otro aspecto, la invención modaliza equipos que incluyen: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se liga específicamente a toxina A de C. difficile; y (b) un anticuerpo monoclonal humano que se liga específicamente a la toxina B de C. difficile. La invención también modaliza métodos para tratar enfermedad de C. diffícile en un sujeto administrando al sujeto un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) en una cantidad efectiva para inhibir enfermedad de C. difficile, v.gr., colitis mediada por C. difficile, colitis asociada con antibiótico, colitis pseudomembranosa mediada por C. difficile (PMC), o diarrea, o recaída de enfermedad mediada por C. difficile. El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se puede administrar, v.gr., intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente, al sujeto. El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se puede administrar solo o en combinación con otro agente terapéutico, v.gr., un segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina A de C. difficile y el segundo anticuerpo monoclonal o porción de enlace de antígeno se liga específicamente a toxina B de C. difficile. En otro ejemplo, el segundo agente es un antibiótico, v.gr., vancomicina o metronidazol. El segundo agente puede ser gamma-globulina policlonal (v.gr., gamma-globulina humana) . En una modalidad particular, un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se administra el cual incluye una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable idéntica a la región de cadena ligera variable y la región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (es decir, incluyendo una secuencia de región de cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO: 4 y una secuencia de región de cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO:l. En otra modalidad, este anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se administra en combinación con un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo que incluye una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable idéntica a la región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-1°52 (es decir, que incluye una secuencia de región de cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO: 58 y una secuencia de región de cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO: 54) . En todavía otra modalidad, un anticuerpo o porción de enlace de antígeno producido por el clon 3D8 (es decir, incluyendo una secuencia de región de cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO: 4 y una secuencia de región de cadena pesada variable idéntica a SEQ ID N0:1), se administra en combinación con un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo producida por el clon 124-152 (es decir, que incluye una secuencia de región de cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO: 58 y una secuencia de región de cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO: 54) . En otro aspecto, la invención modaliza métodos para hacer un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de C. difficile, inmunizando un animal no humano transgénico hacia un genoma que comprende un transgene de cadena pesada humano y un transgene de cadena ligera humano con una composición que incluye una exotoxina inactivada, y aislar un anticuerpo del animal. La exotoxina se puede inactivar, por ejemplo, mediante tratamiento con UDP-dihaldehído o mediante mutación (es decir, usando métodos recombinantes) . El método puede incluir además evaluar el enlace del anticuerpo a la exotoxina. La invención también modaliza métodos para hacer un anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo, proporcionando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de C. difficile, y expresando el ácido nucleico en una célula huésped. En todavía otro aspecto, la invención modaliza un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de enlace de antígeno (v.gr., CDRs, o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 3D8, 1B11, o 3H2. En todavía otro aspecto, la invención modaliza un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de enlace de antígeno (v.gr., CDRs, o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11, o 1G10. Ademas, la invención modaliza un método para hacer un hibridoma que expresa un anticuerpo que se liga específicamente a una exotoxina de C. difficile inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que incluye un transgene de cadena pesada humana y un transgene de cadena ligera humana, con una composición que incluye la exotoxina, en donde la toxina está inactivada; aislar esplenocitos del animal; generar hibridomas de los esplenocitos; y seleccionar un hibridoma que produce un anticuerpo que se liga específicamente a la exotoxina. El tratamiento de humanos con anticuerpos monoclonales humanos ofrece varias ventajas. Por ejemplo, los anticuerpos probablemente son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos no humanos. La terapia es rápida: la inactivación de toxina puede ocurrir tan pronto como el anticuerpo alcanza sitios de infección y neutraliza directamente las toxinas que ocasionan la enfermedad. Los anticuerpos humanos localizan sitios apropiados en humanos más efectivamente que los anticuerpos no humanos. Además el tratamiento es específico para C. difficile, y es improbable interrumpir la flora de intestino normal, a diferencia de las terapias de antibiótico tradicionales. Otras particularidades y ventajas de la invención se harán evidentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un cuadro que enumera las secuencias de aminoácido de las cadenas VH y VL codificadas por secuencias de mRNA de cada clon. Las letras de casilla inferior representan aminoácidos en el péptido principal . Las CDRs están subrayadas. El clon 3D8, que expresa 6 regiones de cadena V ligera única, solamente expreso la secuencia de aminoácido de grupo 1. La Figura 2A es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VL expresada por el clon 3D8. Los genes de segmento V y segmento J están enumerados arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerayadas . La Figura 2B es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VH expresada por el clon 3D8. Los genes de segmento V, segmento D y segmento J están enumerados arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerrayadas . La Figura 3A es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VL expresada por el clon 1B11. Los genes de segmento V y segmento J están enumerados arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerrayadas. La Figura 3B es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VH expresada por el clon 1B11 , Los genes de segmento V, segmento D y segmento J están enumerados arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerayadas . La Figura 4A es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VL expresada por el clon 33.3H2 (mencionado en la presente como 3H2; 33.3H2 y 3H2 se usan intercambiablemente en la presente) . Los genes de segmento V y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerrayadas. La Figura 4B es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VH expresada por el clon 33.3H2. Los genes de segmento V y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerayadas. La Figura 5 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos ELISA, que midieron en enlace de anticuerpos monoclonales de anti-toxina A a la toxina A. Las Figuras 6A-B son un juego de gráficas que ilustran resultados de ensayos de neutralización in vitro en presencia y ausencia de anticuerpos monoclonales anti-toxina A. La Figura 6A ilustra los resultados de ensayos realizados con células IMR-90. La Figura b& ilustra los resultados para ensayos realizados con células T-81. La Figura 7 es una representación esquemática del polipéptido de toxina A, indicando fragmentos que se analizaron para estudios de mapeo de epítope. Las Figuras 8A-B son representaciones esquemáticas de fragmentos de toxina A analizados para estudios de mapeo de epítope. La Figura 9 es un cuadro que ilustra los resultados de ensayos in vivo para determinar protección de ratón de reto letal con toxina A por anticuerpos monoclonales de anti-toxina A. La Figura 10 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de acumulación de fluido de circuito ileal de ratón para medir la eficiencia de neutralización de anticuerpo de anti-toxina in vivo.
La Figura HA es un diagrama esquemático de la línea de tiempo de administración de varios agentes a hámsters en un modelo de recaída de hámster. La Figura 11B es una gráfica que ilustra los resultados de los ensayos como el porcentaje de hámsters sobrevivientes a tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. La Figura 12 es una gráfica que ilustra resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsters que sobreviven al tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. La Figura 13 es una gráfica que ilustra los ensayos en los que le neutralización in vitro de toxina A y toxina B se midieron en presencia y ausencia de antisuero policlonal para cabras inmunizadas con toxoide B. - "G330" se refiere a muestras en las que los sueros de cabra #330 se probaron. G331" se refiere a muestras en las que los sueros de cabra #331 se probaron. La Figura 14 es un diagrama esquemático de la línea de tiempo de administración de diversos agentes a hámsters en un modelo de recaída de hámster. La Figura 15 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsters que sobreviven a tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. Los hámsters se trataron con vancomicina, vancomicina y 3D8, vancomicina y antisuero de cabra #331, o vancomicina, 3D8, y antisuero de cabra #331. La Figura 16 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales saludables después de tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. "Cabra 331" se refiere a antisuero de cabra #331. La Figura 17 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsters que sobreviven al tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. Los hámsters se inmunizaron con un fragmento de toxina B antes del tratamiento de clindamicina. Los hámsters se trataron con vancomicina, vancomicina y 3D8, o no recibieron tratamiento. La Figura 18 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales sanos después de tratamiento de clindamicina seguido por reto de C. difficile. Los hámsters se inmunizaron con un fragmento de toxina B antes del tratamiento de clindamicina. La Figura 19 es un diagrama esquemático de la línea de tiempo de administración de varios agentes a hámsters en un modelo de reto directo de C. difficile. "331" se refiere a antisueros de cabra #331. "Cunda" se refiere a tratamiento con clindamicina. La Figura 20 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de reto directo como el porcentaje de hámsters que sobreviven a reto de C. difficile directo. La Figura 21 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayo de reto directo como el porcentaje de animales sanos después de reto directo con C. difficile. La Figura 22 es una representación de la secuencia de aminoácido de toxina A de C. difficile. La Figura 23 es una representación de la secuencia de aminoácido de toxina B de C. difficile. La Figura 24 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de reto primario como el porcentaje de hámsters que sobreviven a reto de C. difficile directo. La Figura 25 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de reto primario como el porcentaje de hámsters que sobreviven a reto de C. difficile directo. La Figura 26 es una gráfica que ilustra los resultados de ensayos de reto primario como el porcentaje de hámsters que sobreviven reto de C. difficile directo. La Figura 27 es una gráfica que ilustra los ensayos en los que la neutralización in vitro de toxina A y toxina B se midieron en presencia de anticuerpos monoclonales a toxina B o suero policlonal de cabra contra la toxina B.
La Figura 28 es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VH expresada por el clon 124-152. Los genes de segmento V, segmento V y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerrayadas . La Figura 29 es una representación de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de la cadena VL expresada por el clon 124-152. Los genes de segmento V y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Las CDRs están sobrerrayadas. La Figura 30 es una representación de la secuencia de aminoácido y línea de germen relacionada de la cadena VH expresada por el clon 124-152. Los genes de segmento V, segmento D y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido. Las CDRs están sobrerrayadas . La Figura 31 es una representación de las secuencias de aminoácido y línea de germen relacionada de la cadena VL expresada por el clon 124-152. Los genes de segmento V y segmento J se enumeran arriba de las secuencias de aminoácido. Las CDRs están sobrerrayadas. La Figura 32 es una representación esquemática del polipéptido de toxina B, que indica fragmentos que se analizaron para estudios de mapeo de epítope.
Los símbolos de referencia semejantes en los diversos dibujos indican elementos iguales. Descripción Detallada de la Invención A fin de proporcionar un entendimiento claro de la especificación y reivindicaciones, las siguientes definiciones se proporcionan convenientemente abajo. Definiciones El término "toxina A" se refiere a la proteína de toxina A codificada por C. difficile. La secuencia de aminoácido de toxina A de C. difficile (SEQ ID NO: 41) se proporciona en GenBankÍR) bajo el número de acceso A37052, versión Gl 98593 (ver también la Figura 22) . "Toxina B" se refiere a la proteína de toxina B codificada por C. difficile. La secuencia de aminoácido de toxina B de C. difficile (SEQ ID NO: 42) se proporciona en GenBank(R) bajo el número de acceso S70172, versión Gl 7476000 (ver también la Figura 23) . "Proteína" se usa intercambiablemente con "polipéptido" . Un "anticuerpo contra-C. difficile) es un anticuerpo que ínteractúa con (v.gr., enlaza solamente) una proteína u otro componente producido por bacteria de C. difficile. Un "anticuerpo de anti-toxina) es un anticuerpo que interactúa con una toxina producida por C. difficile (v.gr., toxina A o toxina B) . Un anticuerpo de proteína de antl-toxina se puede ligar a un epítope, v.gr., un epítope de conformación o lineal, o a un fragmento de la proteína de toxina de longitud completa. Un "anticuerpo humano", es un anticuerpo que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea de germen humano. Los anticuerpos humanos descritos en la presente pueden incluir residuos de aminoácido no se codifican por secuencias de inmunoglobulina de línea de germen humano •(v.gr., mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o específicas en sitio in vitro por alguna mutación somática in vivo) . Un anticuerpo de anti-toxina, o porción de enlace de antígeno del mismo, se puede administrar solo o en combinación con un segundo agente. El sujeto puede ser un paciente infectado por C. difficile, o que tiene un síntoma de enfermedad asociada con C. difficile ("CDAD"; v.gr., diarrea, colitis, dolor abdominal) o una predisposición a enfermedad asociada con C. difficile (v.gr., sometiéndose a tratamiento con anticuerpos, o habiendo experimento enfermedad asociada con C. difficile y un riesgo de recaída de la enfermedad) . El tratamiento puede ser curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, mejorar, mitigar, mejorar, o afectar la infección y la enfermedad asociada con la infección, los síntomas de la enfermedad, o la predisposición a la enfermedad.
Una cantidad de un anticuerpo de anti-toxina efectiva para tratar una CDAD, o una "cantidad terapéuticamente efectiva", es una cantidad del anticuerpo que es efectiva, durante una sola o múltiples administraciones de dosis a un sujeto, al inhibir CDAD en un sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede variar de conformidad con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo de elucidar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o porción de anticuerpo se sobrepesan por los efectos terapéuticamente benéficos. La capacidad de un anticuerpo de inhibir un parámetro medible se puede evaluar en un sistema de modelo animal que predice la eficiencia en humanos. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo de anti-toxina para proteger ratones de reto letal con C. difficile puede predecir la eficacia en humanos. Otros modelos de animal que predicen la eficacia se describen en la presente, tales como el modelo de ligado intestinal descrito en los Ejemplos. Alternativamente, esta propiedad de un anticuerpo o composición de anticuerpo se puede evaluar examinando la capacidad, del compuesto de modular. dicha modulación in vitro por ensayos conocidos por el practicante experto. Los ensayos in vitro incluyen ensayos de enlace, tales como ELISA, y ensayos de neutralización. Una cantidad de un anticuerpo de anti-toxina efectiva para prevenir un desorden, o "una cantidad profilácticamente efectiva" del anticuerpo es una cantidad que es efectiva, después de administración de dosis sencilla o múltiple al sujeto, al prevenir o retrasar la ocurrencia del principio o recurrencia de CDAD, o inhibir un síntoma del mismo. Sin embargo, si se desean intervalos de tiempo más prolongados de protección, se pueden administrar dosis aumentadas. Los términos "agonizar", "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar," "aumentar", "disminuir", o lo semejante, v.gr., que denotan diferencias cuantitativas entre dos estados, se refieren a una diferencia, v.gr., una diferencia estadística o clínicamente significativa, entre los dos estados. Como se utiliza en la presente, "enlace especifico" o "liga específicamente a" se refiere a la capacidad de un anticuerpo a: (1) ligarse a una toxina de C. difficile con una afinidad de cuando menos 1 x 107 M"1, y (2) ligarse a una toxina de C. difficile con una afinidad que es cuando menos dos veces mayor que su afinidad para un antígeno no específico.
Un "anticuerpo" es una proteína que incluye cuando menos una o dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviada en la presente VHC) , y cuando menos una o dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en la presente como VLC) . Las regiones VHC y VLC se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones de determinación de complementariedad" ("CDR") , interdispersas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones de armazón" (FR) . La extensión de la región de armazón y CDRs se ha definido de manera precisa (ver, Kagbat, E.A,, y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departmento of Health and Human Services, NIH Publication No. 9-3242, 1991, y Chothia, C, y col., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, que se incorporan en la presente por referencia) . De preferencia, cada VHC y VLC está compuesta de tres CDRs y cuatro Frs, dispuestas de término de amino a término carboxi en el siguiente orden: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La cadena de VHC o VLC del anticuerpo puede incluir además toda o parte de una región constante de cadena pesada o ligera. En una modalidad, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesada y dos cadenas de inmunoglobulina ligera, en donde las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera están interconectadas por, v.gr., enlaces de disulfuro. La región constante de cadena pesada incluye tres dominios CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. La región variable de las cadenas pesadas y ligeras que contiene un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente el enlace del anticuerpo a tejidos huésped o factores, incluyendo diversas células del sistema inmune (v.gr., células de efector) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas de tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de los mismos), en donde las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. "Inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos substancialmente codificados mediante genes de inmunoglobulina. Los genes de ínmunoglobulina humanos reconocidos incluyen genes kappa, lambda, alfa (IgAl e IgA2), gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , delta, épsilon, y mu de región constante, así como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 25 KD y 214 aminoácidos) se codifican por un gene de región variable en el término NH2 (alrededor de 110 aminoácidos) y una gene de región • constante kappa o lambda en el término COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 50 DK y 446 aminoácidos), se codifican de manera similar mediante un gene de región variable (alrededor de 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante antes mencionados, v.gr., gamma (que codifica alrededor de 330 aminoácidos) . El término "inmunoglobulina" incluye una inmunoglobulina que tiene: CDRs de una fuente humana o no humana. El armazón de la inmunoglobulina puede ser humana, humanizada, o no humana, v.gr., un armazón de murina modificado para disminuir la antigenicidad en humanos, o un armazón sintético, v.gr., una secuencia de consenso. Como se utiliza en la presente "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (v.gr., IgM o IgGi) que se codifica mediante genes de región constante de cadena pesada. El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo", o "porción"), como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de un anticuerpo que se liga específicamente a una toxina de C. difficile (v.gr., toxina A), v.gr., una molécula en la que una o más cadenas de inmunoglobulina no es de longitud completa, pero que se liga específicamente a una toxina. Los ejemplos de porciones de enlace abarcadas dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VLD, VHC, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VHC y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VLC y VHC de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341:544-546, 1989, que consiste de un dominio VHC; y (vi) una región de complementariedad aislada (CDR) que tiene suficiente armazón para ligar específicamente, v.gr., una porción de enlace de antígeno de una región variable. Una porción de enlace de antígeno de una región variable de cadena ligera y una porción de enlace de antígeno de una región variable de cadena pesada, v.gr., los dos dominios del fragmento Fv. VLC y VHC, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en la que las regiones VLC y VHC se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocida como la cadena sencilla Fv (seFv); ver, v.gr., Bird y col. (1988) Science 242:423-236; y Huston y col. (1988) Proc. Nati Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos anticuerpos de cadena sencilla también están abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estas porciones de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el ramo, y las porciones se tamizan para utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que presenta una sola especificidad de enlace y afinidad para una meta particular, v.gr., epítope.
Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", que como se usa en la presente se refiere a una preparación de anticuerpos o porciones de los mismos con una sola composición molecular. El término anticuerpo "recombinante", como se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un sector de expresión recombinante transfectado hacia una célula huésped, anticuerpos aislados de un recombinante, librería de anticuerpo de combinación, anticuerpos aislados de un animal (v.gr., un ratón) que es transgénico de genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos preparados, expresados, creados, o aislados por cualesquiera otros medios que involucra división de secuencias de gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos humanizados, de CDR injertados, quiméricos, generados in vitro (v.gr.. mediante presentación de facto), y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea de germen humana. Como se utiliza en la presente, el término "substancialmente idéntico" (o "substancialmente homólogo") se refiere a un primer aminoácido o secuencia de nucleótido que contiene un numero suficiente de residuos de aminoácido idénticos o equivalentes (v.gr., con cadena lateral similar, v.gr., substituciones de aminoácido conservados) o nucleótidos a una segunda secuencia de aminoácido o nucleótido que la primera y segunda secuencias de aminoácido o nucleótido tienen actividades similares. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene cuando menos 50% de la afinidad del primer anticuerpo. Los cálculos de "homología" entre dos secuencias se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (v.gr., se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico para alineamiento óptimo y secuencias no homologas se pueden olvidar para propósitos de comparación) . La longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es cuando menos 50% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido correspondientes o posiciones de nucleótido luego se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico) . El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en consideración el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesitan introducirse para alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de homología de por ciento entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. E por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácido se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando una matriz de marcado Blossum 62 con una pena de espacio de 12, una pena de extensión de espacio de 4, y una pena de espacio de desplazamiento de cuadro de 5. Como se utiliza en la presente, el término "hibridiza bajo rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad elevada, o condiciones de rigurosidad muy elevada" describe condiciones para hibridización y lavado. La guía para realizar las reacciones de hibridización se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989, que se incorpora en la presente por referencia. Los métodos acuosos y no acuosos se describe en esa referencia y cualquier se pueda usar. Las condiciones de hibridización específicas mencionadas en la presente son como sigue: 1) condiciones de hibridización de baja rigurosidad: 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguido por dos lavados en 0.2X de SSC, 0.1% de SDS cuando menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55°C para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridización de rigurosidad media: 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X de SSC, 0.1% de SDS a 60°C; 3) condiciones de hibridización de rigurosidad elevada: 6X de SSC a alrededor de 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X de SSC, 0.1% de SDS a 65°C; y 4) condiciones de hibridización de rigurosidad muy elevada: 0.5 M de fosfato de sodio, 7% de SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0.2X de SSC, 1% de SDS a 65°C. Se entiende que los anticuerpos y porciones de enlace de antígeno de los mismos descritos en la presente pueden tener substituciones de aminoácido conservadoras o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto substancial sobre las funciones de polipéptido. Ya sea o no se tolere una substitución particular, es decir, no afectará adversamente las propiedades biológicas deseadas, tales como actividad de enlace, se pueden determinar como se describe en Bowie y col., Science, 247:1306-1310, 1990. Una "substitución de aminoácido conservador" es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, Las familias incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en el ramo. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (v.gr., aspargina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (v.gr., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofán) , cadenas laterales beta-ramificadas (v.gr., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.gr,, tirosina. fenilalanina, triptofán, histidina) . Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre de un polipéptido, tal como un agente de enlace, v.gr., un anticuerpo, sin alterar substancialmente una actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" resulta en dicho cambio. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por uno de experiencia ordinaria en el ramo al que pertenece esta invención. Aún cuando métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen abajo métodos y materiales apropiados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlarán, Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitativos. Resumen C. difficile es una bacteria que produce toxina, gram positiva que ocasiona diarrea asociada con antibiótico y colitis en humanos. En la presente se proporcionan métodos y composiciones para tratamiento y prevención de enfermedad asociada con C. difficile (CDAD) . Las composiciones incluyen anticuerpos que reconocen proteínas y otros componentes moleculares (v.gr., lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos) de bacteria de C. difficile, incluyendo anticuerpos que reconocen toxinas producidas por C. difficile (v.gr., toxina A y toxina B) . En particular, se proporcionan , anticuerpos monoclonales humanos. En ciertas modalidades, estos anticuerpos monoclonales humanos se producen en ratones que expresan segmentos de gene de inmunoglobulina humana (abajo descritos) - También se proporcionan combinaciones de anticuerpos de anti-toxina. Los nuevos métodos incluyen administrar anticuerpos (y porciones de enlace de antígeno de los mismos) que se liga a la toxina de C. difficile a un sujeto para inhibir CDAD en el sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos de anti-toxina A monoclonales humanos descritos en la presente pueden neutralizar la toxina A e inhibir la recaída de enfermedad mediada por C. difficile. En otros ejemplos, combinaciones anticuerpos de anti-toxina A (v.gr., anticuerpos monoclonales de anti-toxina A) y anticuerpos de anti-toxina B se pueden administrar para inhibir la enfermedad primaria y reducir la incidencia de recaída de enfermedad. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden localizarse en sitios de enfermedad (v.gr., el intestino) in vivo. 1 , Generación de Anticuerpos Inmunógenos En general, los animales se inmunizan con antígenos expresados por C. difficile para producir anticuerpos. Para producir anticuerpos de anti-toxina, los animales se inmunizan con toxinas inactivadas, o toxoides. Las toxinas se pueden inactivar, v.gr., mediante tratamiento con formaldehído, glutaraldehído, peróxido o tratamiento con oxígeno (ver, v.gr., Relyveld y col., Methos in Enzymology, 93:24, 1983; Woodrow y Levine, eds., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990) . Las toxinas de C. difficile mutantes con toxicidad reducida se pueden producir usando métodos recombinantes (ver, v.gr.. Patentes de E.U.A. 5,085,862; 5,221,618; 5,244,657; 5,332,583; 5,358,868; y 5,433,945). Por ejemplo, los mutantes que contienen omisiones o mutaciones de punto en el sitio activo de toxina se pueden hacer. Los fragmentos recombinantes de las toxinas se pueden usar como inmunógenos . Otro acercamiento es inactivar la toxina mediante tratamiento con UDP-dialdehído (Benth y col., Inf. and Immun., 68 (3) -.1094-1101, 2000). Este método conserva la estructura nativa de la toxina más fácilmente que otros tratamientos, y de esta manera puede atraer anticuerpos más reactivos a la toxina nativa. Este método también se describe en el Ejemplo 1 abajo. Los anticuerpos de anti-toxina que se ligan y neutralizan toxina A pueden interactuar con epítopes específicos de toxina A. Por ejemplo, un anticuerpo de anti-toxina A puede ligar un epítope en una región NJ-terminal de toxina A (v.gr., entre aminoácidos 1-1033 o de toxina A), o una región terminal N (v.gr., entre aminoácidos 1853-2710 de Toxina A) . En un ejemplo, un anticuerpo que se liga y neutraliza toxina A se enlaza a un epítope dentro de aminoácidos 1853-2710 de toxina A. De manera similar, los anticuerpos de anti-toxina B pueden reconocer un epítope específico de toxina B, v.gr., un epítope N-terminal, o un epítope C-terminal. En un ejemplo, un anticuerpo que liga y neutraliza la toxina B se enlaza a un epítope dentro de aminoácidos 1777-2366 de la toxina B. Generación de Anticuerpos Monolonales Humanos en Ratones HuMAb Los anticuerpos monoclonales se pueden producir de una manera no posible con anticuerpos policlonales. Los antisueros policlonales varían de animal a animal, mientras que las preparaciones monoclonales exhiben una especificidad antigénica uniforme. Los sistemas de animal de murina son útiles para generar anticuerpos monoclonales, y protocolos de inmunización, técnicas para aislar y fundir esplenocitos, y métodos y reactivos para producir hibridomas son bien conocidos . Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional, v.gr., la técnica de hibridización de célula somática convencional de Kohler y Milstein, Nature, 256:495, 1975. Ver generalmente, Harlow, E y Lañe D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Aún cuando estas técnicas convencionales son conocidas, es deseable usar anticuerpos humanizados o humanos en lugar de anticuerpos de murina para tratar sujetos humanos, debido a que los humanos montan una respuesta inmune a anticuerpos de ratones y otras especies. La respuesta inmune a anticuerpos de murina se llama un anticuerpo anti-ratón humano o respuesta HAMA (Schroff, R y col., Cáncer Res. 45, 879-885, 1985) y es una condición que ocasiona enfermedad de suero en humanos y resulta en limpieza rápida de los anticuerpos de murina de la circulación de un individuo. La respuesta inmune en humanos se ha mostrado que es contra la variable y las regiones constantes de inmunoglobulinas de murina. Los anticuerpos monoclonales humanos son más seguros para administración a humanos que los anticuerpos derivados de otros animales y anticuerpos policlonales humanos. Un tipo útil de animal en el cual generar anticuerpos monoclonales humanos es un ratón transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana en lugar de sus propios genes de inmunoglobulina de ratón. Estos ratones transgénicos, v.gr., ratones "HuMAbÍMR), contienen miniubicaciones de gene de inmunoglobulina humana que codifican secuencias pesadas humanas no redispuestas (µ y ? ) y secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera ?, junto con mutaciones dirigidas que inactivan las ubicaciones de cadena u y ? endógenas (ver, v.gr., Lonberg, N y col., Nature 368 (6474) : 856-859, 1994, y Patente de E.U.A. 5,770,429), Consecuentemente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o ? de ratón a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos se someten a conmutación de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales (Lonberg, N y col., supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994; Lonberg, N y Huszar D., Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995, y Harding, F., y Lonberg, N., Ann N.Y. Acad. Sci., 764:536-546, 1995). Lá preparación de estos ratones transgénicos se describe con mayor detalle en Taylor, L., y col., Nucleic Acids Research, 20:6287-6295, 1992; che, J., y col., International Im unology 5:647-656, 1993; Tuaillon y col, Proc. Nati. Acad. Ssi. USA 90:3720-3724, 1993; Choi y col, Nature Genetics, 4:117-123, 1993; Chen, J., y col., EMBO J. , 12:821-830, 1993; Tuaillon y col., J. Immunol. 152:292-2920 1994; Taylor, L., y col., International Immunology, 6: 579-591, 1994; y Fishwild, D., y col., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996. Ver además, Patente de E.U.A, 5,545,806; Patente de E.U.A. 5,569,825, Patente de E.U.A. 5,625,126, Patente de E.U.A. 5,633,425, Patente de E.U.A. 5,661,016, Patente de E.U.A. 5,770,429, Patente de E.U.A. 5,789,650, Patente de E.U.A. 5,814,318, Patente de E.U.A. 5,874,299 y Patente de E.U.A. 5,877,397, todas por Lonberg y Kay, y Publicaciones de PCT Nos . WO 01/14424, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, y WO 92/03918. Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos a un antígeno, ratones HuMA se pueden inmunizar con un inmunógeno, como se describe por Lonberg, N., y col., Nature, 368(6474): 856-859, 1994; Fishwild, D., y col., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996 y WO 98/24884. De preferencia, los ratones serán de 6-16 semanas de edad durante la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada de toxina A inactivada se puede usar para inmunizar los ratones HuMAb intraperitonealmente. Para generar anticuerpos contra proteínas de C. difficile, lípídos y/o moléculas de carbohidrato, los ratones se pueden inmunizar con organismos de C. difficile exterminados o no viables.
Los ratones HuMAb transgénicos responden mejor cuando se inmunizan intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunización de IP cada tercera semana (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. La respuesta inmune se puede supervisar durante el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma gue se obtienen mediante sangrados retroorbitales . El plasma se puede tamizar, por ejemplo mediante ELISA o citometría de flujo, y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana de anti-toxina se pueden usar para fusiones. Los ratones se pueden aumentar intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y remoción del bazo. Se espera que 2-3 fusiones para cada antígeno pueden ser necesarias de realizar. Varios ratones se inmunizan típicamente para cada antígeno. Los esplenocitos de ratón se pueden aislar y fundir con PEG a una línea de célula de mieloma de ratón basado en protocolos convencionales. Las hibridomas resultantes luego se tamizan para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones de célula sencilla de linfocitos esplénícos de ratones inmunizados se funden a una sexta parte del número de P3X63-Ag8.653 de células de mieloma de ratón que no secreta (ATCC, CRL 1580) con 505 de PEG. Las células se cubren a aproximadamente 2x1O5 en una placa de microtítulo de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de Suero de Clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5mM de HEPES, 0.055 M de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y Ix HAT (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión) . Después de dos semanas, las células se cultivan en medio en el que el HAT se reemplaza con HT. Los sobrenadantes de los pozos individuales luego se tamizan mediante ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales de célula de anti-toxina humana. Las hibridomas que secretan anticuerpo se colocan en placas nuevamente, se tamizan de nuevo, y si todavía son positivas para anticuerpos monoclonales de anti-toxina de IgG humano, se pueden subclonar cuando menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables luego se cultivan in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización. En una modalidad, el animal transgénica utilizado para generar anticuerpos humanos para toxina contiene cuando menos una, típicamente 2-10, y en ocasiones 25-50 o más copias del transgene descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884 (v.gr., pHCl o pHC2) criados con un animal que contiene una sola copia de un transgene de cadena ligera descrito en los ejemplos 5, 6, 8 o 14 de WO 98/24884, y la cría de vastago con el animal suprimido JH descrito en el ejemplo 10 de WO 98/24884, los contenidos de la cual se incorporan expresamente por la presente como referencia. Los animales de crían a homozigosidad para cada uno de estos tres rasgos. Estos animales tienen el siguiente genotipo: una sola copia (por juego de haploide de cromosomas) de mini-ubicación no redispuesta de cadena pesada humana (descrita en el Ejemplo 12 de WO 98/24884), una sola copia (por juego de haploide de cromosomas) para una construcción de cadena ligera K humana redispuesta (descrita en el ejemplo 14 de WO 98/24884), y una supresión en cada ubicación de cadena pesada de ratón endógeno que remueve todos los segmentos JH funcionales (descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884). Estos animales de crían con ratones que son homozigosos para la supresión de los segmentos JH y hemizigosos para las construcciones de cadena pesada y ligera humana. Los animales resultantes se inyectan con antígenos y se usan para producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos. Las células B aisladas de dicho animal son monoespecíficas con respecto a las cadenas pesada y ligera humana debido a que contienen solamente una copia única de cada gene. Además, serán monoespecíficas con respecto a cadenas pesadas humanas o de ratón debido a que ambas copias de gene de cadena pesada de ratón endógeno son no funcionales en vista de la supresión de expansión de la región JH introducida como se describe en los Ejemplos 9 y 12 de WO 98/24884» Además, una fracción substancial de las células B será no específica con respecto a cadenas ligeras humanas o de ratón, debido a la expresión de la copia única del gene de cadena ligera kappa humano redispuesto excluirá alélicamente e isotípicamente la redisposición de los genes de cadena kappa y lambda de ratón endógeno en una fracción significativa de células B. En una modalidad, el ratón transgénico exhibirá producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, de manera ideal substancialmente similar a aquel de un ratón nativo. De esta manera, por ejemplo, en modalidades en donde los genes Ig endógenos se han inactivado, los niveles totales de inmunoglobulina variarán de alrededor de 0.1 a 10 mg/ml de suero, v.gr., 0.5 a 5 mg/ml, o cuando menos alrededor de 1.0 mg/ml. Cuando un transgene capaz de efectuar un cambio a IgG de IgM se ha introducido hacia el ratón transgénico, la relación de ratón adulto de suero IgG a IgM es de preferencia alrededor de 10:1. La relación de igG a IgM será muy inferior en el ratón inmaduro. En general, más de alrededor de 10%, v.gr., alrededor de 40 a 80% de las células B de bazo y nodo linfático expresaran exclusivamente proteína igG humana. El repertorio en el ratón transgénico idealmente se aproximara a aquel mostrado en un ratón no transgénico, usualmente cuando menos alrededor de 10% tan elevado, de preferencia 25 a 50% o más de elevado. Generalmente, cuando menos alrededor de mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG) , de preferencia 104 a 106 o más, se producirán, dependiendo principalmente del número de regiones V, J y D diferentes introducidas en el genoma de ratón. Típicamente, las inmunoglobulinas exhibirán una afinidad para antígenos preseleccionados de cuando menos alrededor de 107M_1, IO'MG1; lO^M"1, ÍO^M"1, lO^M"1, o mayor, v.gr., hasta 1013M_1 o mayor. Los ratones HuMAb pueden producir células B que se someten a cambio de clase a través de recombinación de cambio de intratransgene (cambio cis-) y expresar inmunoglobulinas reactivas con la toxina. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencia humana, en donde los polípéptidos de cadena pesada y ligera se codifican mediante secuencias de transgene humano, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación -somática y juntas de combinación de región V, así como secuencias codificadas de línea de germen. Estas inmunoglobulinas de secuencia humana se pueden denominar como siendo substancialmente idénticas a una secuencia de polipéptido codificado por un segmento de gene VL o VH humano y JL o segmento de JL humano, aun cuando ningunas otras secuencias de línea de germen pueden estar presentes como resultado de mutación somática y juntas de recombinación V-J y V-D-J diferenciales. Con respecto a dichos anticuerpos de secuencia humana, las regiones variables de cada cadena son típicamente cuando menos 80 por ciento codificadas por V, FR, de línea de germen humano y, en el caso de cadenas pesadas, D, segmento de gene. Frecuentemente cuando menos 85 por ciento de las regiones variables se codifican por secuencias de línea de germen humano presentes en el transgene. Frecuentemente 90 o 95 por ciento o más de las secuencias de región variable se codifican por secuencias de línea de germen humano presentes en el transgene. Sin embargo, puesto que se introducen secuencias de no línea de germen mediante mutación somática y junta de VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia humana frecuentemente tendrán algunas secuencias de región variable (y menos frecuentemente secuencias de región constante) que no se codifican por segmentos de gene V, D, o J humano como se encuentra en los transgenes humanos en la línea de germen de los ratones. Típicamente, estas secuencia de no línea de germen (o posiciones de nucleótido individuales) se agruparán en o cerca de CDRs, o en regiones en donde las mutaciones somáticas se sabe que se agrupan.
Los anticuerpos de secuencia humanos que se ligan a la toxina pueden resultar de cambio de isotipo, de modo gue los anticuerpos humanos gue comprenden una cadena gamma de secuencia humana (tal como gamma 1, gamma 2, o gamma 3) o una cadena ligera de secuencia humana (tal como K) se producen. Dichos anticuerpos de secuencia humana cambiados en isotipo frecuentemente contienen una o más mutaciones somáticas, típicamente en la región variable y con frecuencia en o dentro de alrededor de 10 residuos de una CDR) como resultado de la maduración de afinidad y selección de células B por antígeno, particularmente subsecuente a reto de antígeno secundario (o subsecuente) . Estos anticuerpos de secuencia humana de afinidad elevada tienen afinidades de enlace de cuando menos alrededor de lxlO9 M"1, típicamente por lo menos 5xl09 M"1, frecuentemente más de 1x1010 M_1, y en ocasiones 5x1010 M~a a 1x1011 M~a o mayor, Los anticuerpos anti-toxina se pueden elevar a otros mamíferos, incluyendo ratones no transgénicos, humanos, conejos y cabras. Anticuerpos de Anti-toxina A Los anticuerpos monoclonales humanos que se ligan específicamente a toxina A incluyen anticuerpos producidos por los clones 3D8, 1B11, y 3H2 descritos en la presente. Los anticuerpos con regiones de cadena pesada variable y cadena ligera variable son cuando menos 80%, o más, idénticos a las regiones de cadena pesada y ligera variables de 3D8, 1B11, y 3H2 también se pueden ligar a la toxina A. En modalidades relacionadas, los anticuerpos de anti-toxina A incluyen, por ejemplo, las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de cadenas pesadas variables y/o cadenas ligeras variables de 3D8, 1B11, o 3H2. Las CDRs de las regiones de cadena pesada variable de estos clones se muestran en el Cuadro 1 abajo. Cuadro 1. Secuencias de Aminoácido de CDR de Cadena Pesada Variable Clon Cadena CDR Secuencia de Aminoácido SEQ ID NO: 3D8 H CDRl ' NYGMH 7 1B11 H CDRl SYGMH 10 3 3HH22 H H CDRl KYGMH 13 3D8 H CDR2 LIWYDGSNEDYTDSVGK 8 1B11 H CDR2 VIWASGNKKYYIESVEG 11 3h2 H CDR2 VIWYDGTNKYYADSMKG 14 3D8 H CDR3 WGMVRGVIDVFDI 9 1 1BB1111 H H CDR3 ANFDY 12 3H2 H CDR3 DPPTANY 15 Las CDRs de las regiones de cadena ligera variable de estos clones se muestra en el Cuadro 2, a continuación. Cuadro 2: Secuencias de Aminoácido de CDR de Cadena Ligera Variable. Clon Cade:na CDR Secuencia de Aminoácido SEQ ID NO: 3D8 L CDRl RASQGISSWLA 16 1B11 L CDRl RASQSVSSYLA 19 3H2 L CDRl RASQGISSWLA 22 3D8 L CDR2 AASSLQS 17 1B11 L CDR2 DASNRAT 20 3H2 L CDR2 AASSLQS 23 3D8 L CDR3 QQANSFPWT 18 11BB1111 LL CCDDRR33 QQRSNWSQFT 21 3H2 L CDR3 OOYKSYPVT 24 Las CDRs son las porciones de inmunoglobulinas que determinan la especificidad para un antígeno particular. En ciertas modalidades, las CDRs correspondientes a las CDRs en los cuadros 1 y 2 que tienen variaciones de secuencia (v.gr., substituciones conservadoras) se pueden ligar a toxina A. Por ejemplo, las CDRs, en las que 1, 2, 3, 4 o 5 residuos, o menos del 20% de los residuos totales en la CDR, se substituyen o suprimen pueden estar presentes en un anticuerpo (o porción de enlace de antígeno del mismo) que se enlaza a la toxina A. De manera similar, los anticuerpos anti-toxina pueden tener CDRs que contienen una secuencia de consenso, como motivos de secuencia conservados entre múltiples anticuerpos pueden ser importantes para actividad de enlace. Por ejemplo, CDRl de una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir una secuencia de aminoácido R-A-S-Q-X-X-S-S-X-K-L-A (SEQ ID NO: 25), CDR2 de una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir la secuencia de aminoácido A-S-X-X-X-S/T (SEQ ID NO: 26), y/o CDR3 de una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos puede incluir la secuencia de aminoácido Q-Q-X-X-S/N-S-P/S (SEQ ID NO: 27), en donde X es cualquier aminoácido. En algunas modalidades, CDRl de una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye la secuencia de aminoácido Y-G-M-H (SEQ ID NO: 28), y/o CDR2 de una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de enlace de antígeno de los mismos incluye la secuencia de aminoácido 1—X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G (SEQ ID NO: 29), en donde X es cualquier aminoácido. Los anticuerpos de anti-toxina humana pueden incluir regiones variables que son el producto de, o derivados de, genes de inmunoglobulina humana especifica.
Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluir una región de cadena pesada variable que es el producto de, o derivada de un gene VH3-33 humano. Numerosas secuencias de anticuerpos derivadas de este gene están disponibles en GenBank(R) (ver, v.gr., Acc. No: AJ555951, Gl No:29836865; Acc. No:AJ556080, Gl No.:29837087; Acc. No.: AJ556038, Gl (No..-29837012, y otros segmentos de gene redispuestos VH3-33 humanos proporcionados en GenBank(R) ) . Los anticuerpos también pueden, o alternativamente, incluir una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gene V? L19 humano (ver, v.gr., GenBank(R) Acc. No. AJ556049, Gl No:29837033 para una secuencia parcial de un segmento de gene V? L19 redispuesto humano) . Como se conoce en el ramo y se describe en esta sección, arriba, regiones de inmunoglobulina variables de anticuerpos recombinados se derivan mediante un proceso de recombinación in vivo en el que la variabilidad se introduce a segmentos genómicos que codifican las regiones. Consecuentemente, las regiones variables derivadas de un gene humano VH-33 o V? L19 pueden incluir nucleótidos que son diferentes a aquellos en el gene encontrado en tejidos no linfoides. Estas diferencias de nucleótido se concentran típicamente en las CDRs. Anticuerpos Anti-toxina B Los anticuerpos monoclonales humanos que se ligan específicamente a la toxina B incluyen anticuerpos producidos por los clones 124-152, 2A11 y 1G10 descritos en la presente . Los anticuerpos con regiones de cadena pesada variable y cadena ligera variable que son cuando menos 805, o más, idénticos a las regiones de cadena pesada y ligera variable de -152, 2 ll y 1G10 también se pueden ligar a la toxina B. En modalidades relacionadas, los anticuerpos anti-toxina B incluyen, por ejemplo, las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de cadenas pesadas variables y/o cadenas ligeras variables de -152, 2A.ll- o 1G10. Las CDRs de las regiones de cadena pesada variable de estos clones se muestran en el Cuadro 3, abajo.-Cuadro 3: Secuencias de Aminoácido de CDR de Cadena Pesada Variable Clon Cadena CDR Secuencia de Aminoácido SEO ID NO: SEQ ID (a.a) NO: (n.t.) 124-152 H CDRl SYWIG 62 63 124-152 H CDR2 IFYPGDSSTRYSPSFQG 64 65 124-152 H CDR3 RRNWGNAFDI 66 67 Las CDRs de las regiones de cadena ligera variable de estos clones se muestra en el Cuadro 4, abajo. Cuadro 4 : Secuencias de aminoácido de CDR de Cadena Ligera Variable Clon Cadena CDR Secuencia de Aminoácido SEQ ID NO. SEQ ID (a.a.) NO: (n.t.) 124-152 L CDRl RASQSVSSSYLAW 68 69 124-152 L CDR2 GASSRAT 70 71 124-152 L CDR3 QQYGSSTWT 72 73 Las CDRs son las porciones de inmunoglobulinas que determinan la especificidad para un antígeno particular. En ciertas modalidades, las CDRs correspondientes a las CDRs en los Cuadros 3 y 4 que tienen variaciones de secuencia (v.gr., substituciones conservativas) se pueden ligar a toxina B. Por ejemplo, CDRs, en las que 1, 2, 3, 4, o 5 residuos, o menos de 20% de los residuos totales en la CDR, se substituyen o suprimen pueden estar presentes en un anticuerpo (o porción de enlace de antígeno del mismo) se que liga a la toxina B. Los anticuerpos de anti-toxina B humanos pueden incluir regiones variables que son el producto de, o derivados de genes de inmunoglobulina humana específica (ver las Figuras 28-31). Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluir una región de cadena pesada variable que es el producto de, o derivado de un gene VH 5-51 humano. Los anticuerpos también pueden, o alternativamente, incluir una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gene V A27 humano y/o gene JK1. Como se conoce en el ramo y se describe en esta sección, arriba, regiones de inmunoglobulina variables de anticuerpos recombinados se derivan mediante un proceso de recombinación in vivo en el que se introduce variabilidad a segmentos genómicos gue codifican las regiones. Consecuentemente, las regiones variables derivadas de un gene humano VH-5-51 o V A27/JK1 pueden incluir nucleótidos gue son diferentes a aquellos en el gene encontrado en tejidos no linfoides. Estas diferencias de nucleótido se concentran típicamente en las CDRs . 2. Producción y Modificación de Anticuerpos Muchas formas diferentes de anticuerpos anti-toxina pueden ser útiles en la inhibición de CDAD. Los anticuerpos pueden ser de varios isotipos, incluyendo: IgG (v.-gr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD, o IgE. De preferencia, el anticuerpo es un isotipo IgG, v.gr., IgGl. Las moléculas de anticuerpo pueden ser de longitud completa (v.gr., un anticuerpo IgGl o IgG4) o pueden incluir solamente un fragmento que se enlaza a antígeno (v.gr., un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla) . Estos incluyen anticuerpos monoclonales (v.gr., anticuerpos monoclonales humanos), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados, así como porciones de enlace de antígeno de los anteriores. Los anticuerpos de anti-toxina o porciones de los mismos útiles en la presente invención también pueden ser anticuerpos recombinantes producidos por células huésped transformadas con ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina de un anticuerpo deseado. Los anticuerpos recombinantes se pueden producir por técnicas de ingeniería genética conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes se pueden producir clonando una secuencia de nucleótido, v.gr., un cADN o ADN genómico, que codifica las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo deseado. La secuencia de nucleótido que codifica estos polipeptidos se inserta luego en un vector de expresión de modo gue ambos genes estén enlazados operativamente a sus propias secuencias de expresión de transcripción y traslación. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. Típicamente, ambos genes se inserta en el mismo vector de expresión. Se pueden usar células huésped procarióticas o eucarióticas. La expresión en células huésped aucarióticas se prefiere debido a gue dichas células son más probables gue las células procarióticas de ensamblarse y secretar un anticuerpo apropiadamente doblado e inmunológicamente activo. Sin embargo, cualquier anticuerpo producido gue es inactivo debido a doblez inapropiado se puede ranurar de conformidad con métodos bien conocidos (Kim y Baldwin, Ann. Rev. Biochem., 51:459-89, 1982). Es posible gue las células huésped produzcan porciones de anticuerpos intactos, tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada, que también son homólogos de anticuerpo de conformidad con la presente invención. Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden producir en un Jrasfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinantes y métodos de transfección de gene como es bien sabido en el ramo (Morrison, S., Science, 299:1202, 1985) . Por ejemplo, en una modalidad, los genes de interés, v.gr,, genes de anticuerpo humanos, se pueden ligar hacia un vector de expresión tales como un plásmido de expresión eucariótica tal como se usa en un sistema de expresión de gene GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841, o en otros sistemas de expresión bien conocidos en el ramo. El plásmido purificado con los genes de anticuerpo clonados se pueden introducir en células huéspedes eucarióticas tales como células CHO, o células NSO o alternativamente otras células eucarióticas como un células derivadas de planta, células de hongos o levadura. El método utilizado para introducir estos genes puede ser cualquier método descrito en el ramo, tal como electroporación, lipofectina, lipofectamina o transfección balística, en donde las células se bombardean con micropartículas que llevan el ADN de interés (Rodin, y col. Immunol. Lett., 74 (3) :197-200, 2000), Después de introducir estos genes de anticuerpo en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo se pueden identificar y seleccionar. Estas células representan los transfectomas que luego se pueden amplificar para su nivel de expresión y elevar a escala para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes se pueden aislar y purificar de estos sobrenadantes de cultivo y/o células gue usan- técnicas convencionales. Se entenderá gue las variaciones en los I procedimientos anteriores son útiles en la presente invención. Por ejemplo, se puede desear transforman una célula huésped con ADN gue codifica ya sea cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo. La tecnología de ADN recombinante también se puede usar para remover parte o todo el ADN gue codifica cualguiera o ambas de las cadenas ligeras y pesadas gue no es necesaria para enlace, v.gr., la región constante se puede modificar, por ejemplo, suprimiendo aminoácidos específicos. Las moléculas expresadas de dichas moléculas de ADN truncadas son útiles en los métodos descritos en la presente. Además, los anticuerpos bifuncionales se pueden producir en los gue una cadena pesada y una ligera se ligan a una toxina, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto a la toxina, u otro epítope de la toxina.
Los anticuerpos quiméricos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinantes conocidas en el ramo. Por ejemplo, un gene gue codifica la región constante Fc de una murina (u otra especie>) molécula de anticuerpo monoclonal se digiere con enzimas de restricción para remover la región gue codifica la murina Fre, y la porción equivalente de un gene gue codifica una región humana de Fc constante se substituye (ver Robison y col., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., Solicitud de Patente europea 184, 187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente europea 171,496; Morrison y col., Solicitud de Patente europea 173,494; Neuberger y col., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y col. Patente de E.U.A, 4,816,567; Cabilly y col., Solicitud de Patente europea 125,023; Better y col. (1988 Science, 249:1041-1043); Liu y col. (1987) PNAS, 84:3439-3443; Liu y col., 1987, . Immunol., 139:3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res., 47:999-1005; Wood y col. (1985) Nature, 314:446-449; y Shaw y col., 1988, J. Nati. Cáncer Inst., 80:1553-1559). Los anticuerpos quiméricos también se pueden crear mediante técnicas de ADN recombinantes en donde el ADN que codifica regiones de murina V se puede ligar a ADN que codifica las regiones constantes humanas . Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina se puede humanizar mediante métodos conocidos en el ramo. Por ejemplo, una vez que se obtienen anticuerpos de. murina, las regiones variables se pueden formar en secuencia. La ubicación de las CDRs y residuos de armazón se pueden determinar (ver, Kabat, E.A. , y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Departmento of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242, y Chothia, C, y col. (1987) J, Mol. Biol., 196:901-917). Las regiones variables de cadena ligera y pesada, opcionalmente se pueden ligar a regiones constantes correspondientes . En realidad, se entiende gue cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, incluyendo anticuerpos completamente humanos, se pueden alterar (v.gr., mediante mutación, substitución) para contener una región constante substituta, v.gr., región Fc, o porciones de la misma para lograr, por ejemplo, una estructura de anticuerpo deseada, función (v.gr., función de efector), subtipo, alotipo, subclase, o lo semejante. Los anticuerpos de anti-toxina se pueden formar en secuencia usando técnicas reconocidas en el ramo. Las moléculas de anticuerpo injertadas con CDR o inmunoglobulinas se pueden producir injertando CDR o substitución de CDR, en donde una, dos o todas las CDRs de una cadena de inmunoglobulina se pueden reemplazar. Ver, v.gr., Patente de E.U.A. 5,225,539; Jones y col., 1986, Nature, 321:552-525; Verhoeyan y col., 1988, Science, 239:1534; Beidler y col, 1988, J. Immunol., 141:4053-4060; y Winter, Patente de E.U.A. 5,225,539. Winter describe un método de injerto de CDR que se puede usar para preparar los anticuerpos de la presente invención (Solicitud de Patente de RU GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter Patente de E.U.A. 5,225,539), los contenidos de la cual se incorporan expresamente por referencia. Por ejemplo, todas las CDRs de un anticuerpo particular se pueden reemplazar con cuando menos una porción de una CDR humana (v.gr., una CDR del clon 3D8, como se muestra en los Cuadros 1 y 2, y/o clon 124-152, como se muestra en los Cuadros 3 y 4, arriba) o solamente algunas de las CDRs se pueden reemplazar. Solamente es necesario reemplazar el número de CDRs requerido para enlace del anticuerpo a un antígeno predeterminado (v.gr., una exotoxina de C. difficile). Los anticuerpos humanizados se pueden generar reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente involucrados en antígeno que se enlaza con secuencias equivalentes de regiones variables de Fv humano. Los métodos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L,, 1985, Science, 229:1202-1207, por Oi y col., 1986, BioTechniques, 4:214, y por Queen y col. Patente de E.U,A. 5,585,089, Patente de EUA 5,693,761 y Patente de E.U.A. 5,693,762. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de regiones variables Fv de inmunoglobulina de cuando menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de dicho ácido nucleico son bien conocidas por los expertos en el ramo y, por ejemplo, se pueden obtener de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una meta predeterminada, como se describe arriba. El ADN recombinante gue codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, luego se puede clonar hacia un vector de expresión apropiado. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan y col. EP 519596 Al, publicada el 23 de diciembre de 1992. También dentro del alcance de la invención se encuentran anticuerpos en los gue aminoácidos específicos se han substituido, suprimido, o añadido. En particular, los anticuerpos preferidos tienen substituciones de aminoácido en la región de armazón, tal como para mejorar el enlace al antígeno. Por ejemplo, un número pegueño, seleccionado de residuos de armazón aceptor de la cadena de inmunoglobulina se puede reemplazar por los aminoácidos donadores correspondientes. Las ubicaciones preferidas de las substituciones incluyen residuos de aminoácido adyacentes a la CDR, o gue son capaces de interactuar con una CDR (ver, v.gr., Patente de E.U.A.. 5,585,089), Los criterios para seleccionar aminoácidos del donador se describen en la Patente de E.U.A. 5,585,089 (v.gr., columnas 12-16), los contenidos de la cual se incorporan en la presente por referencia. El armazón aceptador puede ser una secuencia de armazón de anticuerpo humano maduro o una secuencia de consenso. Una "secuencia de consenso" es una secuencia formada de los aminoácidos (o nucleótidos) gue ocurren más frecuentemente en una familia de secuencias relacionadas (ver, v.gr., Winnaker, de Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987), En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido gue ocurre más frecuentemente en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos ocurren de manera igualmente frecuencia, cualguiera se puede incluir en la secuencia de consenso. Un "armazón de consenso" de una imunoglobulina se refiere a una región de armazón en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. Un anticuerpo de anti-toxina, o porción de enlace de antígeno del mismo, se puede derivar o enlazar a otra molécula funcional (v.gr., otro péptido o proteína). Por ejemplo, un anticuerpo se puede enlazar funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más distintas entidades moleculares, tal como otro anticuerpo, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido gue puede mediar la asociación con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etigueta de polihistidina) . Un tipo de proteína derivada se produce reticulando dos o más proteínas (del mismo tipo o de tipos diferentes) . Los reticuladores 'apropiados incluyen aguellos gue son heterobifuncionales, gue tienen dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador apropiado (v.gr., éster de m-maleindobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobufuncional (v.gr., suberato de disuccinimidilo) .
Estos reticuladores están disponibles de Pierce chemical Company, Rockford, IL. Los agentes detectables útiles con los gue una proteína se puede derivar (o etiguetar) incluyen compuestos fluorescente, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los agentes detectables fluorescentes de ejemplo incluyen fluoresceína, isotiacianato de fluoresceína, rodamina, y ficoeritrina. Una proteína o anticuerpo también se puede derivar con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, /?-galactosidasa, acetilcolinesterasa, oxidasa de glucosa y lo semejante. Cuando una proteína se deriva con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales gue la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable de peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, gue es detectable. Una proteína también se puede derivar con un grupo prostético (v.gr., estreptavidina/biotina y avidina/biotina) . Por ejemplo, un anticuerpo se puede derivar con biotina, y detectar a través de edición indirecta de enlace de avidina o estreptavidina. Las proteínas y anticuerpos etiguetados se pueden usar, por ejemplo, diagnósticamente y/o experimentalmente en un número de contextos, incluyendo (i) aislar un antígeno predeterminado mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación; y (ii) detectar un antígeno predeterminado (v.gr., una toxina, v.gr., en un lisado celular o una muestra de paciente) a fin de supervisar los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, v.gr., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. Un anticuerpo anti-toxina o fragmento de enlace de antígeno del mismo se puede conjugar a otra entidad molecular, tal como una etigueta. 3. Métodos de Tamizado Los anticuerpos anti-toxina se pueden caracterizar por enlazarse a la toxina por una variedad de técnicas conocidas. Los anticuerpos se caracterizan típicamente mediante ELISA primero. Brevemente, las placas de microtítulo se pueden revestir con la toxina o antígenotoxoide en PBS, y luego bloquearse con proteínas irrelevantes tales como albúmina de suero bovino (BSA) diluida en PBS. Las diluciones de plasma de ratones inmunizados con toxina se añaden a cada pozo y se encuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween 20 y luego se incuban con un reactivo policlonal Fc-específico de IgG anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, las placas se desarrollan con substrato de ABTS, y analizan a OD de 405. De preferencia, los ratones que desarrollan los títulos más elevados se usarán para fusiones . Un ensayo de ELISA como se describe arriba se puede usar para tamizar los anticuerpos y, de esta manera, las hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con la toxina. Las hibridomas que producen anticuerpos que se ligan, de preferencia con afinidad elevada, a la toxina se pueden luego subclonar y caracterizar adicionalmente-. Un don de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células originales (mediante ELISA) , se puede seleccionar luego para hacer un banco de células, y para purificación de anticuerpo. Para purificar los anticuerpos anti-tsxina, las hibridomas seleccionadas se pueden desarrollar en botellas de rodillo, frascos de giro de dos litros u otros sistemas de cultivo. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de cromatografía afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) Para purificar la proteína. Después de intercambio de tampón a BPS, la concentración se puede determinar mediante métodos espectrofotométricos . Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionables se ligan a epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, 111) . Enlace de Mab biotinilado se puede detectar con una sonda etiquetada de estreptavidina. Los anticuerpos de anti-toxina se pueden probar adicionalmente para reactividad con la toxina por manchado Western. Otros ensayos para medir la actividad de los anticuerpos de anti-toxina incluyen ensayos de neutralización. Los ensayos de neutralización in vitro puede medir la capacidad de un anticuerpo para inhibir un efecto citopátíco en células en cultivo (ver Ejemplo 3, abajo) . Los ensayos in vivo para medir neutralización de toxina se describen en los Ejemplos 5, 6 y 7, abajo. 4. Composiciones Farmacéuticas y Equipos En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones, v.gr., composiciones farmacéuticamente aceptables, que incluyen una molécula de anticuerpo descrita en la presente o porción de enlace de antígeno del mismo, formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y lo semejante que son fisiológicamente compatibles. Los portadores pueden ser apropiados para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, rectal, espinal o epidérmica (v.gr., mediante inyección o infusión) . Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y solidas, tales como soluciones líquidas (v.gr., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones útiles están en la forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo útil de administración es parenteral (v.gr., intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular) . Por ejemplo, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se pueden administrar mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se usan en la presente significan' modos de administración distintos a administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal subcutánea, subcutilcular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intrasternal. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada apropiada para concentración elevada de anticuerpo. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes arriba enumerados, como se requiera seguido por esterilización filtrada. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos arriba enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos útiles de preparación son secado al vacío y secado por congelación que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional desde una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se pueden ocasionar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos y porciones de anticuerpo descritos en la presente se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en el ramo, y para muchas aplicaciones terapéuticas. Como se apreciará por el artesano experto, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, un anticuerpo, o porción de anticuerpo del mismo se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se puede encerrar en una cápsula de gelatina de coraza dura o suave, comprimirse en tabletas, o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y usar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trozos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y lo semejante. Para administrar un compuesto de la invención mediante otra distinta a la administración parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o coadministra el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en el ramo. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (v.gr., una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo se puede administrar, varias dosis divididas se pueden administrar durante el tiempo, o la dosis se puede reducir proporcionalmente o aumentar como se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas situadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención se dictan por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activos y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en el ramo de composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Una escala no limitativa, de ejemplo, para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0.1-60 mg/kg, v.gr., 0.5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg, o 0=75-10 mg/kg. Se debe entender además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar durante el tiempo de conformidad con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosificación expuestas en la presente son ejemplos solamente y no se pretende que limiten el alcance o práctica de la composición reivindicada. También dentro del alcance de la invención se encuentran eguipos gue incluyen un anticuerpo anti-toxina o porción de enlace de antígeno del mismo. Los equipos pueden incluir uno o más distintos elementos incluyendo: instrucciones de uso; otros reactivos, v.gr,, una etiqueta, un agente terapéutico, o un agente útiles para quelar, o acoplar de otra manera, un anticuerpo a una etiqueta o agente terapéutico, u otros materiales para preparar el anticuerpo ' para administración; portadores farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para administración a un sujeto. Diversas combinaciones de anticuerpos se pueden empacar juntas. Por ejemplo, un equipo puede • incluir anticuerpos que se ligan a la toxina A (v.gr., anticuerpos que incluyen las regiones de cadena pesada y ligera variables dd 3D8) y anticuerpos gue se ligan a la toxina B (v.gr., anticuerpos anti-toxina B monoclonales humanos, -v.gr., 124-152, 2A 11, y/o 1G10, o reactivo antisuero policlonal con toxina B) . Los anticuerpos se pueden mezclar juntos, o empacar separadamente dentro del equipo. Las instrucciones para uso pueden incluir instrucciones para aplicación terapéutica incluyendo dosificaciones sugeridas y/o modos de administración, v.gr., en un paciente con un síntoma de CDAD. Otras instrucciones pueden incluir instruccional sobre el acoplamiento del anticuerpo a un quelador, una etiqueta o un agente terapéutico, o para purificación de un anticuerpo conjugado, v.gr., de componentes de conjugación no reaccionados . El eguipo puede incluir una etigueta detectable, -un agente terapéutico, y/o un reactivo útil para guelar o acoplar de otra manera una etiqueta o agente terapéutico al anticuerpo. Los agentes de copulación incluyen agentes tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) . En tales casos el equipo puede incluir uno o más de un recipiente de reacción para llevar a cabo la reacción o un dispositivo de separación, v.gr., una columna cromatográfica, para uso al separar el producto terminado de los materiales de partida o intermediarios de reacción. • El eguipo puede contener además cuando menos un reactivo adicional, tal como un agente de diagnóstico o terapéutico, v.gr., un agente de diagnóstico o terapéutico como se describe en la presente, y/o uno o más anticuerpos anti-toxina o anti-C. difficile adicionales (o porciones de Los mismos), formulados como sea apropiado, en una o más preparaciones farmacéuticas separadas . Otros eguipos pueden incluir ácidos nucleicos optimizados gue codifican anticuerpos de anti-toxina, e instrucciones para expresión de los ácidos nucleicos. 5. Métodos y Composiciones Terapéuticos Las nuevas proteínas y anticuerpos tienen utilidades terapéuticas, profilácticas y de diagnóstico in vitro e in vivo. Por ejemplo, estos anticuerpos se pueden administrar las células en cultivo, v.gr., in vitro o ex vivo, o a un sujeto, v.gr,, in vivo, para tratar, inhibir, prevenir recaída, y/o diagnosticar C. difficile y enfermedad asociada con C. difficile. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se pretende gue incluya animales humanos y no humanos. El término "animales no humanos" incluye todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, pollos, ratones, perros, gatos, cerdos, vacas y caballos. Las proteínas y anticuerpos se pueden usar en células en cultivo, v.gr., in vitro o ex vivo. Por ejemplo, las células se pueden cultivar in vitro en medio de cultivo y el paso de contacto se puede efectuar añadiendo el anticuerpo anti-toxina o fragmento del mismo, al medio de cultivo. Los métodos se pueden realizar en viriones o células presentes en un sujeto, como parte de un protocolo in vivo (v.gr., terapéutico o profiláctico). Para modalidades in vivo, el paso de contacto se efectúa en un sujeto e incluye administrar un anticuerpo anti-toxina o porción del mismo al sujeto bajo condiciones efectivas para permitir el enlace del anticuerpo, o porción, a cualguier toxina expresada por bacteria en el sujeto, v.gr., en el intestino. Los métodos para administrar moléculas de anticuerpo se describen en la presente. Las dosificaciones apropiadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la droga particular usada. Las moléculas de anticuerpo se pueden usar como agentes competitivos para enlazar ligando para inhibir o reducir una interacción no deseable, v.gr., para inhibir en enlace de toxinas al epitelio gastrointestinal. Los anticuerpos de anti-toxina (o porción de enlace de antígeno de los mismos) se puede administrar en combinación con otros anticuerpos anti-C. difficile (v.gr., otros anticuerpos monoclonales,. gamma-globulina policlonal) . Las combinaciones de anticuerpos gue se pueden usar incluyen un anticuerpo anti-toxina A o porción de enlace de antígeno del mismo y un anticuerpo anti-toxina B o porción de enlace de antígeno del mismo. El anticuerpo anti-toxina A puede ser 3D8, un anticuerpo gue incluye las regiones variables de 3D8, o un anticuerpo con regiones variables cuando menos 90% idénticos a las regiones variables de 3D8. El anticuerpo anti-toxina B puede ser 124-152, 2A11, 1G11, o un anticuerpo con regiones variables cuando menos 90% idénticas a las regiones variables de las interiores, v.gr., 124-152. Las combinaciones de anti-toxina A (v.gr., 3D8) y anticuerpos de anti-toxina B (v.gr., 124-152) pueden proporcionar inhibición potente de CDAD. Se entiende gue cualguiera de los agentes de la invención, por ejemplo, anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B, o fragmentos de los mismos, se pueden combinar, por ejemplo en diferentes relaciones o cantidades, para efecto terapéutico mejorado. En realidad, los agentes de la invención se pueden formular como una mezcla, o guímica o genéticamente enlazado usando técnicas reconocidas en el ramo resultando de esta manera en anticuerpos covalentemente enlazados (o fragmentos de anticuerpo covalentemente enlazados), gue tienen ambas propiedades de enlace de anti-toxina A y anti-toxina B. La formulación combinada se puede guiar mediante una determinación de uno o más parámetros tales como la afinidad, avidez, o eficacia biológica del agente solo o en combinación con otro agente. Los agentes de la invención también se pueden administrar en combinación con otros agentes gue mejoran el acceso, vida media, o estabilidad del agente terapéutico o dirigir, limpiar y/o secuestrar C. difficile o un antígeno del mismo. Estas terapias de combinación son de preferencia aditivas y aún sinergísticas en su actividad terapéutica, v.gr., en la inhibición, prevención (v.gr., de recaída), y/o tratamiento de enfermedades o desordenes relacionados con C, difficile (ver, v.gr., Ejemplo 16 gue muestra la eficacia de terapias de anticuerpo solo o combinado) . Administrando dichas terapias de combinación se puede disminuir la dosificación del agente terapéutico (v.gr., anticuerpo o mezcla de fragmento de anticuerpo , o anticuerpo reticulado o genéticamente fundido, biespecífico o fragmento de anticuerpo) necesarios para lograr el efecto deseado. Las composiciones inmunogénicas gue contienen una cantidad inmunogénicamente efectiva de una toxina, o fragmentos de la misma, se describen en la presente, y se pueden usar al generar anticuerpos anti-toxina. Los apítopes inmunogénicos en una secuencia de toxina se pueden identificar de conformidad con métodos conocidos en el ramo, y proteínas, o fragmentos gue contienen esos epítopes se pueden entregar por diversos medios, en una composición de vacuna. Las composiciones apropiadas pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (v.g., Vitiello y col., J. Clin. Invest. 93:341 81995)), composiciones de péptido encapsuladas en microesferas de poli (DL-lactido-co-glicolido) ("PLG") (ver, v.gr., Eldrige y col., Molec. Immunol. 28:287-94 (1991); Alonso y col., Vaccine 12:299-306 (1994); Jones y col., Vaccine 13:675-82 (1995)), composiciones de péptido contenidas en complejos de estimulación inmunes (ISCOMS) (ver, v.gr., Takahashi y col., Nature 344:873-75 (1990); Hu y col.. Clin. Exp. Immunol. 113:235-43 (1998)), y múltiples sistemas de péptido de antígeno (MA_Ps) (ver, v.gr., Tam, Proc, Nati. Acad, Sci, E.U.A. 85:5409-13 (1988); Tam, J. Immunol, Methods 196:17-32 (1996)). Los portadores útiles gue se pueden usar con composiciones inmunogénicas de la invención son bien conocidos, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide de tétano, ácidos poliamino tales como poli L-lisina, ácido poli L-glutámico, influenza, proteína de núcleo de virus de hepatitis B y lo semejante. Las composiciones pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o salina, salina tamponada típicamente con fosfato. Las composiciones y vacunas también incluyen típicamente un adyuvante. Los adyuvantes tales como adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en el ramo. Adicionalmente, las respuestas de CTL se pueden preparar conjugando toxinas (o fragmentos), derivados inactivos o análogos de los mismos) a lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil- seril-serina (P3CSS) . Los anticuerpos anti-toxina se pueden administrar en combinación con otros agentes, tales como composiciones para tratar CDAD. Por ejemplos, la terapéutica gue se puede administrar en combinación con anticuerpos de anti-toxina incluyen antibióticos usados para tratar CDAD, tal como vancomicina metronidazol, o bacitracina. Los anticuerpos se pueden usar en combinación con agentes probióticos tales como Saccharomyces boulardii. Los anticuerpos también se pueden administrar en combinaciones con una vacuna de C. difficile, v.gr., una vacuna toxoide. 6. Otros Métodos Un anticuerpo anti-toxina (v.gr., anticuerpo monoclonal) se puede usar para aislar toxinas mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitacíón. Además, un anticuerpo anti-toxina se puede usar para detectar la toxina (v.gr., en una muestra de vastago), v.gr., para tamizar muestras para la presencia de C. difficile. Los anticuerpos anti-toxina se pueden usar diagnósticamente para supervisar niveles de la toxina en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, v.gr., para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado. Ejemplificación A través de los ejemplos, los siguientes materiales y métodos se usaron, a menos que se manifieste de otra manera. Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, v.gr., tecnología de anticuerpo) , y técnicas convencionales en preparación de polipéptido. Ver, v.gr., Sambrook Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press 81989; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr 81996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr 81996); Antibodies: A Laboratory Manual, Halow y col., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons (1992). EJEMPLOS La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, gue no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. Ejemplo 1. Generación de Anticuerpos Monoclonales de Anti-Toxina A. Se obtuvo toxina A de C. difficile ya sea de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va), o mediante producción recombinante. La toxina se purificó e inactivo antes de inmunización. La inactivación se realizó mediante tratamiento con UDP-dialdehído reactivo, gue resulta en alguilación de residuos catalíticos mientras gue conserva la estructura de toxina nativa. Para el protocolo detallado, ver Genth y col., Inf and Im un, 68(3) :1094-1101, 2000. Brevemente, la toxina A purificada se incubó con UDP-2',3'- dihaldehído (0.1-10 mM) en tampón durante 18 horas a 37°C, filtrado a través de un filtro 100 kDa-corte para remover el UDP-2' , 3' -dihaldehído no reaccionado, y se lavo con tampón. La toxina A inactivada (toxoide A) se usó para inmunización. Ratones transgénicos HCo7, generados como se describe arriba en la sección titulada "Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos en Ratones HuMAb" y suministrados por Medarex, Milpitas, CA, se inmunizaron intraperitonealmente 6-12 veces cada uno con 10 ug de toxoide en adyuvante RIBI. En los ratones transgénicos HCo7, el gene de cadena ligera kappa de ratón endógeno se ha interrumpido homozigosamenté como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gene de cadena pesada de ratón endógeno se ha interrumpido homozigosamente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación de PCT WO 01/09187. Los ratones transgénicos HCo7 llevan un transgene de cadena ligera kappa humano, KCo5, como se describe en Fishwild y col., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, y el transgene de cadena pesada humana HCo7 como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. El suero se recogió de cada ratón y se probó para reactividad a toxina A por ELISA y neutralización de citotoxicidad sobre células IMR-90, Los ratones que probaron positivo para reactivo de toxina A y antisuero de neutralización se inyectaron con 5-10 ug de toxoide A a través de la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron y los bazos se aislaron para fusión a hibridomas aproximadamente 3 días después de que se realizó la inyección en la vena de la cola. Las hibridomas clónales se generaron y sacrificaron por ELISA. Los porcentajes de clones positivos de cadena ligera kappa/gamma, específicos de antígeno, y de neutralización identificados tamizando clones generados de cuatro fusiones de hibridoma separadas se enumeran en el Cuadro 5.
Cuadro 5 Fusión % kappa/gamma % de antígeno de neutralizapositivo específico ción 1 55,,77 ((9944//11663322)) 3.4 (56/1632) 0.7(12/1632) 2 00,,22 ((11//338844)) 0 (0/384) 0 (0/384) 3 1.8 (14/768) 0.39 (3/768) 4 4.4 (43/960) 1,7 (17/960) Tres clones de hibridoma se seleccionaron para análisis adicional: 3D8, 1B11, y 33.3H2. CDAs para cada clon se amplificaron mediante RT-PCR de mRNA.,- se clonaron y colocaron en secuencia. Una secuencia de consenso de región de cadena V pesada se encontró para cada clon. Todos los tres dones utilizaron una región VH derivada del mismo gene de región V de línea de germen (VH 3-33),k pero utilizaron diferentes secuencias J. Las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de cada clon se muestran en la Figura 1 (SEQ ID Nos: 1-6) . Las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) están sobrerrayadas en la Figura. El análisis de secuencia de los genes kappa V (cadena ligera V?) reveló gue HuMAb, 1B11 y 33.3H2 cada uno expresa una secuencia de consenso kappa cadena V. El hibridoma 1B11 expresó una cadena ligera V? derivada del gene de línea de germen V L6, mientras gue el hibridoma 33.3H2 expresa una cadena ligera V? derivado del gene de línea de germen V? 1.15. Después del análisis de los clones V? de HuMAb 3D8, 6 cadenas ligeras (I-VI) se expresaron en el nivel mRNA (Figura 1) . Para determinar cual de las cadenas ligeras se expresaron en el nivel de proteína, espectroscopia de masa y formación de secuencia N-terminal del anticuerpo 3D8 purificado se realizaron. Cuando las cadenas ligeras se aislaron de proteína celular y se analizaron mediante espectroscopia de masa, una cadena ligera sencilla se vio con una masa de 23,569 Daltons. Esto correspondió a la cadena de luz con la secuencia de aminoácido de grupo I ilustrada en la Figura 1, que se derivó del gene de línea de germen V? L19. La formación de secuencia N-terminal de la cadena ligera confirmó este resultado. Las Figuras 2A, 3A, y 4A ilustran el nucleótido y las secuencias de aminoácido del V? de cada 3D8 (grupo I; SEQ ID Nos: 4, y 30-34), 1B11 (SEQ ID NO: 5), y 33.3H2 (SEQ ID NO: 6), respectivamente. Las CDRs están sobrerrayadas y la línea de germen V? y J? se muestran. De esta manera, el anticuerpo 3D8 comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gene VH3-33 humano y una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gene humano V? L19. El anticuerpo 1B11 comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivada de un gene humano VH 3-33 y una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gene humano V? L6. El anticuerpo 33.3H2 comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gene humano VH3-33 y una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gene humano V? L15. Los anticuerpos 3D8 y 1B11 expresan regiones constantes humanas IgGl y, el anticuerpo 33.3H2 expresa regiones constantes humanas IgG3. Los anticuerpos descritos en los Ejemplos 2-7 se aislaron de estos hibridomas, y de esta manera expresan las secuencias variables mostradas en la Figura 1 junto con regiones constantes humanas. El ADN que codifica la porción de enlace de antígeno de cada clon se clonó hacia un vector para expresarse como un anticuerpo humano para administración a humanos. Ejemplo 2. Actividad de Enlace de Anticuerpos Anti-Toxina A El enlace de cada anticuerpo a la toxina A se determinó mediante ELISA usando técnicas convencionales.
Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 5. Los anticuerpos producidos por 3D8, 1B11, y 33.3H2 se compararon a un cuarto anticuerpo monoclonal humano con actividad de enlace a toxina A, 8E6. La Figura 5 muestra que los anticuerpos se ligan a toxina A con afinidades comparables . La afinidad de los anticuerpos de 3D8 y 1B11 para la toxina A también se midió con instrumento Biacore(R), que detecta interacciones de enlace biomoleculares con tecnología de resonancia de plasmón superficial. Cada anticuerpo se añadió a las pastillas de sensor revestidas con proteína A, y la toxina A se dejó fluir sobre la pastilla para medir el enlace. 3D8 tuvo un KD de 14.6 x 10_10M. 1B11 tuvo un Kd de 7.38 x 10"10 M. De esta manera, los anticuerpos se ligan con alta afinidad a la toxina A, Estas constantes de enlace indican .gue los anticuerpos tienen afinidades apropiadas para uso en la terapia humana. Ejemplo 3. Neutralización de Toxina por Anticuerpos Anti-Toxina A Los anticuerpos expresados por hibridomas 1B11, 3D8 y 33.3H2 se probaron para actividad de neutralización de toxina A in vitro. Las células se incubaron en presencia de concentraciones variables de toxina A, que ocasiona gue las células se redondeen y pierdan adherencia a platos de cultivo de célula. El efecto citopático (CPE) se determinó mediante inspección visual de células Una marca SPE de 0-4 se determinó, basado en los resultados de la inspección visual (4=199% de citotoxicidad, 0=0% de toxicidad) . Los resultados de estos ensayos se ilustraron en las Figuras 6A y 6B. La neutralización de toxicidad contra una línea de célula de fibroblasto de pulmón humano, IMR-90, y una línea de célula epitelial de intestino humano, T-84 se determinó. La Figura 6A muestra gue todos los anticuerpos tuvieron capacidad de neutralización hacia las células IMR-90. La actividad de neutralización relativa de citotoxicidad de toxina A en células IMR-90 fue 1B11 > 3H2 > 3D8. De manera interesante, la actividad de neutralización relativa fue 3D8 > 1B11 > 3H2 contra células T-84, gue son células epiteliales colónicas humanas (Figura 6A) . Las células T-84 se cree gue son más sensibles a la toxina A gue otros tipos de célula. Las células T-84 pueden proporcionar una célula de blanco más relevante para determinar la citotoxicidad de toxina A. Ejemplo 4. Mapeo de Epítope de Anticuerpos Anti-Toxina A El epítope de toxina A ligado por cada anticuerpo monoclonal se determinó mediante manchado western. Clones de E. coli recombinantes se construyeron con cuatro fragmentos expresos de toxina A que representan el dominio enzimático (es decir, aminoácidos 1-659 de toxina A) , el dominio de enlace receptor (es decir, aminoácidos 1853-2710 de toxina A) , y las dos regiones intermedias (es decir, aminoácidos 660-1255 y 1256-1852 de toxina A) . Los segmentos apropiados del gene de toxina A se amplificaron PCR de ADN genómico preparado de C. difficile cepa ATCC 43255. Los fragmentos se clonaron usando un vector pET y se transformaron en células BL21 DE3 para expresión. El vector proporciona expresión inducible y dominios de afinidad para purificación (es decir, su etiqueta His-) y detección (es decir, una etiqueta de epítope V5) . La expresión se indujo con IPTG y fragmentos se purificaron mediante cromatografía de afinidad. El enlace a cuatro fragmentos diferentes de toxina A se midió: el fragmento 1 correspondió a aminoácidos 1-659; el fragmento 2 correspondió a aminoácidos 660-1255; el fragmento 3 correspondió a aminoácidos 1256-1852; y el fragmento 4 correspondió a aminoácidos 1853-2710 (Figura 7) . 1B11 reaccionó con los fragmentos 1 y 2 , 33.3H2 reaccionó con el fragmento 2, 3D8 y otro anticuerpo monoclonal humano, 6B4, reaccionaron con el fragmento 4 (el dominio de enlace de receptor) . Un antisuero policlonal de conejos inmunizado con toxoide A reaccionó con todos los cuatro fragmentos . Los apítopes 1B11 y 22.2H2 se mapearon con mayor detalle. Para hacer mapa del epítope 1B11, subfragmentos del fragmento 1 (aminoácidos 1-659) correspondientes a los aminoácidos 1-540, 1-415, 1-290, y 1-165, se generaron (Figura 8A) . 1B11 se ligó al fragmento 1 y al fragmento que contiene aminoácidos 1-540. 1B11 no se enlazó a los otros subfragmentos. Por lo tanto, el epítope ligado por 1B11 forma mapa entre los aminoácidos 415-540 de toxina A. Para hacer mapa del epítope 33.3H2, los subfragmentos del fragmento 2 (aminoácidos 660-1255) correspondientes a los aminoácidos 6y60-1146, 660-1033, 660-920, y 660-807, se generaron (Figura 8B) . 33.3H2 se ligó a los fragmentos correspondientes a los aminoácidos 660-1255, 660-1146, y 660-1033. 33.3H2 no se ligó a los otros subfragmentos. Por lo tanto, el epítope ligado por 33.3H2 hace mapa entre los aminoácidos 920-1033 de toxina A. Ejemplo 5. Protección de Ratones de Reto de Toxina A Letal mediante Administración de Anticuerpos Antí-Toxína A Cada anticuerpo se probó para la capacidad de proteger ratones del reto con una dosis letal de toxina A. Ratones hembra Swiss Webster, cada uno pesando 10-20 gramos, se inyectaron intraperitonealmente con hasta 250 ug de 3D8, 1B11, o 33.3H2, o un anticuerpo de control (anticuerpo de virus sincitial anti-respiratorio, Medlmmune) antes del reto con toxina A. Aproximadamente 24 horas después de la inyección, los ratones se retaron con una dosis de toxina A mayor a 10 veces la dosis letal (LD50) , típicamente 100 ng. Los animales se observaron para signos de toxicidad durante los siguientes 7 días. Los resultados de estos experimentos se resumen en la figura 9. El dato se expresa como porcentaje de sobrevivencia. Los números entre paréntesis se refieren a dosis de anticuerpo, si una dosis distinta a 250 ug se proporcionó. La Figura 9 muestra que cada uno de los anticuerpos fue capaz de proteger ratones de reto de toxina A letal hasta cierto grado. El porcentaje de ratones sobrevivientes cuando se trataron con 3D8 varió de 10-100 por ciento. El porcentaje de ratones sobrevivientes cuando se trataron con 33.3H2 variaron de 20-100 por ciento. El porcentaje de ratones sobrevivientes cuando se trataron con 1B11 variaron de 0-60 por ciento. La capacidad relativa de estos monoclonales para proteger ratones fue 3H2 >.3D8 > 1B11. Ejemplo 6. Neutralización de Enterotoxicidad de Toxina A en Circuitos Intestinales de Ratón Ligados con Anticuerpos Anti-Toxina A Los anticuerpos 3D8 y 33.3H2 se probaron para neutralización con enterotoxicidad de toxina A en un modelo de circuito ileal de ratón. Este modelo mide acumulación de fluido inducido de toxina A en el intestino del ratón. Para realizar estos experimentos, cada ratón se puso a dieta durante 16 horas, se anestesió, y el íleo junto al ciego se expuso. Un circuito de 3 a 5 centímetros de ligó doblemente en cada extremo y se inyectó con 10 ug de toxina A. El circuito de íleo se regresó a la cavidad abdominal, la herida se cerró, y el animal se dejó recuperar. Cuatro horas después de la cirugía, el animal se sacrificó y el circuito se removió del animal. La longitud de cada segmento se midió nuevamente, y se extrajo el fluido intraluminal . El volumen del fluido y la relación de volumen a longitud (V:L) en milímetros por centímetro se calculó para cada circuito. Los ratones de prueba se inyectaron con anticuerpo parenteralmente 1-2 días antes de la cirugía. Los resultados de estos experimentos se ilustran en la Figura 10. La inyección con toxina A aumentó la relación de peso a longitud de fluido intestinal en 50%. Ambos 3D8 y 33.3H2 impidieron este aumento en acumulación de fluido. Los ratones administrados con cualquier anticuerpo tuvieron una relación de peso a longitud comparable con los ratones que no recibieron ninguna inyección de toxina A, Por lo tanto, 3D8 y 33,3H2 para proteger de acumulación de fluido intestinal in vivo. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales de anti-toxina A protegen de enterotoxicidad mediada por toxina A in vivo. El dato de circuito ligado de ratón muestra que estos anticuerpos monoclonales pueden proteger de daño mucosal cuando se administran sistémicamente . Ejemplo 7. Protección de Hámsters de Recaída de C. difficile con Anticuerpos de Anti-Toxina A Se probó 3D8 en un modelo de recaída de hámster.
Los hámsters son sensibles a los efectos tóxicos de toxinas de C. difficile, y típicamente mueren dentro de 2-3 días después de recibir una sola dosis de clindamicina en presencia de C. difficile-, Para probar la eficacia de 3D8 en hámsters, se usó un modelo de recaída. En este modelo, los hémsters recibieron una dosis de clindamicina y una dosis de esporas de C. difficile Bl un día después. Un juego de hámsters de control se trataron con 10 mg/kg/día de vancomicina. La vancomicina es un antibiótico usado en el tratamiento de enfermedad de C. difficile. Como se muestra en la Figura HA, un juego de prueba de hámsters recibió 10 mg/kg/día de cancomicina y 2 mg/kg/día de un antisuero policlonal de conejo desarrollado contra toxina A cada día durante siete días después de exposición a C. difficile, como se indica por las flechas en la figura. Un segundo juego de prueba de hámsters recibió 10 mg/kg/día de vancomícina y 50 mg/kg/día de 3D8 en los mismos intervalos de tiempo. La sobrevivencia de hámster se trazó contra tiempo y se muestra en la Figura 11B. La Figura 11B muestra que todos los hámsters que recibieron solamente clindamicina y C. dífficile (diamantes) murieron dentro de dos días de reto con la bacteria. Doce por ciento. (2/17) de hámsters tratados con vancomicina (cuadrados) sobrevivieron el reto con bacteria; ochenta y ocho por ciento (15/17) murieron dentro de ocho días. Cuarenta y uno por ciento (7/17) de hámsters tratados con vancomicina y 3D8 (cruces) sobrevivieron el reto; cincuenta y nueva (10/17) por ciento murieron dentro de siete días, Sesenta y cuatro por ciento (7/11) de los hámsters tratados con vancomicina y suero de conejo policlonal (triángulos) sobrevivieron el reto con bacteria; treinta y seis por ciento (4/11) murieron dentro de nueve días. Estos datos también se ilustran en la Figura 12 como el porcentaje de sobrevivientes totales en cada grupo de tratamiento. Como se muestra en la figura, el porcentaje de sobrevivientes fue mas elevado (sesenta y cuatro por ciento) en el grupo que recibe vancomicina y suero de conejo policlonal. El grupo que recibe 3D8 y vancomicina tuvo el segundo régimen más elevado de sobrevivencia (cuarenta y uno por ciento) , Solamente doce por ciento de hámsters tratados con vancomicina sobrevivieron. Aquellos sin tratamiento murieron todos. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-toxina policlonales y monoclonales protegen de recaída de enfermedad C. difficile in vivo cuando se administran después de la infección. Ejemplo 8. Producción de Anticuerpos de Anti-Toxina para Administración a Humanos Secuencias de ácido nucleico que codifican una cadena pesada variable y cadenas ligeras del anticuerpo 3D8 se clonaron con un vector pIE-UgammalF utilizando metodología de ADN recombinante convencional. El vector se amplificó en E. coli, se purificó y se transfectó en células CHO-dg44. Las células transfectadas se cubrieron a 4 x 105 células por pozo en un plato de 96 pozos y se seleccionó para transfección de vector con G418. Un clon, designado 1D3, se seleccionó originalmente por resistencia G418, luego se ensayó junto con otros transfectomas para producción de IgG. 1D3 tuvo un nivel superior de producción de IgG con relación a los otros transfectantes durante varias vueltas de expansión. La expresión del anticuerpo 3D8 se amplificó mediante crecimiento en presencia de concentraciones incrementantes de metotrexato. Un cultivo capaz de crecimiento de 175 nM de metotrexato se seleccionó para clonar células sencillas para desarrollo adicional . La colocación en placas del cultivo en placas de 96 pozos a baja densidad permitió la generación de cultivos que se suscitan de una sola célula o clones. Los cultivos se tamizaron para producción de IgG humano, y la célula gue produjo el nivel más elevado de IgG se seleccionó para uso adicional. El clon amplificado con metotrexato se expandió para producir un banco de células incluyendo múltiples viales de células congelados. Para preparar anticuerpos de células transfectadas, las células de un clon aisladas en los pasos anteriores se cultivaron y expandieron como inoculo para un bioreactor. El bioreactor típicamente retiene un volumen de 500 litros de medio de cultivo. Las células se cultivan en el bioreactor hasta gue cae la viabilidad de célula, gue indica gue una concentración máxima de anticuerpo se ha producido en el cultivo. Las células se separan mediante filtración. El filtrado se aplica a una columna de proteína A. Los anticuerpos se ligan a la columna, y se eluyen con un lavado de pH bajo. A continuación, los anticuerpos se aplican a una columna de Q-Sepharose para remover los contaminantes residuales, tales como proteínas de célula CHO, ADN, y otros contaminantes (v.gr., contaminantes virales, si están presentes) . Los anticuerpos se eluyen de la columna de Q-Sepharose, se nanofiltran, concentran y lavan en un tampón tal como PBS . La preparación luego se pone en alícuotas asépticamente hacia viales para administración. Ejemplo 9. Preparación y Caracterización de Anticuerpos de Anti-Toxina B Policlonales. Dos cabras nubias (#339t #331) se inyectaron intramuscularmente con 50 ug de toxina B inactivada con dialdehído UDP (Techlab) y adyuvante de Freund completo. Se aumentan las dosis de 25 ug de toxoide B con adyuvante incompleto de Freund se proporcionaron intramuscularmente a intervalos de dos semanas . Los sangrados de prueba se obtuvieron después de 4 inmunizaciones. La reactividad ELISA y neutralización de citotoxicidad contra tanto toxina A como toxina B se ensayaron para medir la especificidad y reactividad cruzada de los sueros. Ambos animales respondieron bien a la toxina B y hasta un grado menor a la toxina A como se mide por ELISA.
Los sueros de la cabra #331 tuvieron menos reactividad cruzada de toxina A y se seleccionó para la mayoría de los experimentos subsecuentes. La neutralización de citotoxicidad a células IMR-90 se determino como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de neutralización de citotoxicidad se ilustran en la Figura 13, gue muestra gue los sueros de ambos animales exhibieron buenos títulos de anticuerpos de neutralización de toxina B y títulos de anticuerpo de neutralización de toxina A muy bajos, pero detectables . La capacidad de los sueros de cabra de proteger ratones de un reto intraperitoneal letal con toxina B (100 ng) también se confirmó (dato no mostrado) .
Ejemplo 10. Protección de Hámsters de Recaída de C. difficile con Anticuerpos Anti-Toxina A y Anti-Toxina B. Grupos de hámsters (n = 20= se retaron con clindamicina y C. difficile, y luego se trataron con vancomicina como se describe en el modelo hámster de recaída en el Ejemplo 7. Los anticuerpos (ya sea 3D8, suero de cabra #331, o 3D8 y suero de cabra #331) se dieron dos veces diarias después del tratamiento de vancomicina (Figura 14). Los animales se supervisaron para supervivencia (Figura 15) o enfermedad (Figura 16) . Las dosis de anticuerpo fueron 1 ml dos veces diarias para suero de cabra #331 y 3 mg para 3D8 dados dos veces diariamente. Los animales que reciben vancomicina solamente (es decir ningún tratamiento de anticuerpo) sirvieron como los controles negativos . Como se observó previamente, 3D8 y el tratamiento de vancomicina solo demostraron un efecto protector parcial, en el que 10 de 20 animales se protegieron de letalidad (Figura 15) . Cincuenta por ciento de animales en este grupo permanecieron sanos (Figura 16) . Seis de 20 anímales que reciben tratamiento de vancomicina solo se protegieron (Figura 15) . Treinta por ciento permaneció sano (Figura 16) . La protección parcial (9/20 animales protegidos) también se observó cuando el suero de cabra se usó solo (Figura 15) . Cuarenta por ciento permaneció sano. La protección se aumentó a casi 100% cuando tanto suero de cabra como 3D8 se proporcionaron juntos (18/20) y el principio de enfermedad se retrasó (Figura 15) . Noventa por ciento de estos animales permaneció sano (Figura 16) .
Claramente, la protección de la enfermedad siguió un patrón similar a la protección de mortandad. Estos datos demuestran que 3D8 puede ser completamente protector en el modelo de enfermedad de hámster cuando la toxina B también se neutraliza. Ejemplo 11. Protección de Hámster de Recaída de C. difficile en Hámsters Inmunizados con Toxina B Los hámsters se inmunizaron intraperitonealmente con 10 ug del fragmento COOH-terminal de toxina B (correspondiente a aminoácidos 1777-2366 de toxina B) expresada en E. coli y usando RIBI como adyuvante. Los animales recibieron 7 dosis de antígeno de toxina B. Respuestas de anticuerpo de neutralización se observaron en los animales que se probaron. Los grupos de hámsters inmunizados se retaron con clindamicina y C. difficile luego se trataron con vancomicina como se describe en el modelo de hámster de recaída en el Ejemplo 7. El anticuerpo (3D8, 3 mg/dosis) se proporcionó dos veces diarias después de tratamiento de vancomicina a 19 animales y se comparó con un grupo de control negativo (n=20) que no recibió tratamiento (Figuras 17 y 18). Seis animales se retaron sin tratamiento de vancomicina para asegurar que los hámsters inmunizados con antígeno de toxina B eran susceptibles a infección de C. difficile. Los animales se supervisaron para supervivencia (figura 17) o enfermedad (Figura 18). La Figura 17 muestra que los animales inmunizados que no recibieron 3D8 recayeron a un régimen similar al observado previamente (65% de recaída). Los animales inmunizados con toxina B que reciben 3D8 fueron más completamente protegidos de recaída que la observada previamente (10% de recaída, en comparación con aproximadamente 50% de recaída en animales no previamente inmunizados con toxina B en otros experimentos) .
La Figura 18 muestra gue algunos de los animales inmunizados gue reciben 3D8 se enfermaron, pero se recuperaron de su diarrea. Treinta y cinco por ciento de animales inmunizados gue reciben vancomicina sola permanecieron sanos. En experimentos en los gue el suero reactivo de toxina B no estuvo presente en animales, virtualmente todos los animales gue tuvieron diarrea murieron posteriormente. Estos datos proporcionan evidencia completa de que 3D8 puede ser completamente protector en el modelo de enfermedad de hámster cuando la toxina B también se neutraliza, La neutralización de toxina B además de toxina A se requirió para protección óptima de enfermedad de C. difficile en este modelo. Ejemplo 12. Protección de Hámsters de Reto de C. difficile Primaria Usando 3D8 en Hámsters Tratados con Sueros Anti-Toxina B de Cabra La prevención de recaída de enfermedad de C. difficile en los hámsters fue más fácil de demostrar gue la protección de reto directo (es decir, reto sin administración de vancomicina) . Los experimentos con suero de conejo demostraron solamente protección débil del reto directo y 3D8 no tuvo efecto detectable en reto directo. Puesto que 3D8 fue más protector en un fondo de anticuerpos de neutralización de toxina B, se determinó si la administración combinada de 3D8 y antisueros anti-toxina B podría prevenir la enfermedad debida a reto directo. Los grupos de 5 hámsters se retaron después de recibir una vez diariamente dosis de 3D8 (3 mg) , 3D8 combinada (3 mg) y suero de cabra #331 (1 ml), o ningunos anticuerpos durante los 3 días antes del reto como se ilustra en la figura 19. El dato en la Figura 20 muestra gue los animales gue no reciben anticuerpos o ya sea 3D8 o suero de cabra solo todos murieron con 48 horas de reto de C. difficile. La mayoría de los animales (80%) gue reciben ambos 3D8 y suero de cabra sobrevivieron y los animales afectados sobrevivieron durante 10 días después del reto. La Figura 21 muestra gue los animales tratados con 3D8 y suero de cabra se enfermaron, pero se recuperaron. Estos datos proporcionan evidencia adicional de gue 3D8 puede ser completamente protector en el modelo de enfermedad de hámster cuando la toxina B también se neutraliza. La neutralización de toxina B además de toxina A se reguirió para protección óptima de enfermedad de C. difficile en este modelo. La protección satisfactoria de hámsters directamente retados con C. difficile ofrece varias ventajas al tamizado de nuevos candidatos de toxina B. Números menores de animales se pueden usar puesto gue el 100% de animales no tratados mueren. Los anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales (v.gr,, anticuerpos monoclonales humanos) se pueden tamizar directamente en hámsters debido a gue el procedimiento reguiere 100 mg o menos del anticuerpo de prueba. Otros modos de prueba, tales como el modelo de recaída, reguieren el esfuerzo de producir cantidades en gramo debido al bajo régimen de atague en el modelo de recaída, gue necesita probar números mayores de animales. Los experimentos de reto directo también son más cortos en duración y una lectura definitiva dentro de 3-4 días de reto de C. difficile comparado con 7-10 en el modelo de recaída. Además, la eliminación de tratamiento de vancomicina del método de tamizado reduce el número de veces gue los animales se manejan. Ejemplo 13. Generación de anticuerpos Monoclonales de Anti-Toxina B Toxina B de C. difficile se obtuvo ya sea de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va), o mediante producción recombinante. La toxina se purificó e inactivo antes de la inmunización. La inactivación se realizó mediante tratamiento con UDP-dialdehído reactivo, gue resulta en alquilación de residuos catalíticos mientras que conservan la estructura de toxina nativa. Brevemente, la toxina B purificada se incubó con UDP-2/ ,3' -dialdehído (0.1-l.OmM) en tampón durante 18 horas a 37°C, se filtró a través de un filtro de 100 dKa-corte para eliminar el UDP-2',3'-dihaldehído no reaccionado, y se lavó con tampón. La toxina B inactivada (toxoide B) o fragmentos de toxina B recombinante se usaron como inmunógenos . Un dominio de enlace de receptor de toxina B (residuos de aminoácido 1777-2366) se expresó en E. coli como una t proteína de fusión gue contiene una etigueta inmuno (hexahistadina) para purificación de afinidad usando cromatografía de afinidad de guelato de níguel (designado fragmento 4; ver Ejemplo 11) . Ratones Hcol2 transgénicos, generados como se describe arriba en la sección titulada "Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos en Ratones HuMAb" y suministrados por Medarex, Milpitas, CA, se inmunizaron intraperitonealmente 6-12 veces cada uno con 10 ug de toxoide en adyuvante RIBI. En los ratones Hcol2 transgénicos, el gene kappa de cadena ligera de ratón endógeno se ha homozigilosamente interrumpido como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gene de cadena pesada de ratón endógeno se había interrumpido homozigosamente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación de PCT WO 01/09187. Los ratones Hcol2 transgénicos llevan un transgene de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, y el transgene de cadena pesada humana Hcol2 como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806; 5,615,825; y 5,545,807. Él suero se recogió de cada ratón y se probó para reactividad a toxina B mediante ELISA y neutralización de citotoxicidad en células IMR-90. Los ratones gue probaron positivo para toxina-reactivo y neutralizando antisuero se inyectaron con 5-10 ug de toxoide B o fragmento 4 a través de la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron y los bazos se aislaron para fusión a hibridomas aproximadamente 3 días después de gue se realizó la inyección de vena de cola. Los hibridomas clónales se generaron y tamizaron mediante ELISA. Tres clones de hibridoma se seleccionaron para análisis adicional: 124-152; 2A11; y 1G10. En particular, cDNAs del clon 124-152 se amplificaron mediante RT-PCR de RNA, se clonaron y formaron en secuencia. La región de cadena pesada V se determino gue se deriva de la secuencia de línea de germen VH 5-51, la región D derivada de la secuencia de línea de germen 7-27, y la secuencia J de la región de línea de germen JH3b. Las regiones de cadena ligera (kappa) se determinaron gue se derivan de A27 y la región J de JKl. El isotipo del clon 124-152 se determinó gue es igGl. Las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL del clon 124-152 se muestran en las Figuras 27-28. Las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se indican en las Figuras. Las secuencias de línea de germen relacionadas de las regiones VH y VL se muestran en las Figuras 30-31.
Los anticuerpos 124-152; 2A11; y 1G10 se aislaron de hibrídomas correspondientes y se probaron para sus características de enlace (infra) . El ADN gue codifica el don 124-152 se clonó hacia un vector para expresarse como un anticuerpo humano para administración a humanos . Ejemplo 14. Actividad de Enlace de Anticuerpos de Anti-Toxina B El enlace de cada anticuerpo a toxina B se determinó mediante Biacore usando técnicas convencionales. Los resultados de este ensayo se ilustran en el Cuadro 6. Los anticuerpos producidos por 124-152; 2A11; y 1G10 se compararon con controles apropiados . En particular, la afinidad de los anticuerpos 124-152; 2A11; y 1G10 para toxina B se midió con instrumento Biacore(R), gue detecta interacciones de enlace biomolecular con tecnología de resonancia de plasmón superficial. Cada anticuerpo se añadió a chips de sensor revestidas con proteína A, y toxina B se dejo fluir sobre el chip para medir en enlace. 124-152 tuvo un KD de 1.64 x 10-10M; 2A11 tuvo un KD de 0.24 x 10"10M; y 1G10 tuvo un KD de 2.98 x 10-10M. De esta manera, los anticuerpos se enlazan con afinidad elevada a toxina B. Estas constantes de enlace indican gue los anticuerpos tienen afinidades apropiadas para uso en aplicación in vivo, por ejemplo, terapia humana.
Cuadro 6 Muestra ID KDxl0-10 (M) kaxl05 (1/Ms) kdxl0"5 (1/s) 2A11 0.24 21 5.07 124.152 1.64 34.5 56.4 51.1G10 2.98 1.31 3.89 Ejemplo 15. Neutralización de Toxina por anticuerpos de Anti-Toxina B Los anticuerpos expresados por hibridomas 124-152; 2A11; y 1G10 se probaron para actividad de neutralización de toxina B in vitro. Las células se incubaron en presencia de concentraciones variables de un anticuerpos monoclonal específico a toxina B gue impediría gue las células se redondearan después de exposición a toxina B. El efecto citopático (CPE) se determinó mediante inspección visual de las células. Una marca de CPE de 0-4 se determinó, basado en los resultados de la inspección visual (4=199% de citotoxicidad, 0=0% de toxicidad) . Los resultados de estos ensayos se ilustran en la Figura 27. La neutralización de toxicidad contra una línea de célula de fibroblasto de pulmón humano, IMR-90. La Figura 27 muestra gue todos los anticuerpos tuvieron capacidad de neutralización hacia células IMR-90. La actividad de neutralización relativa de citotoxicidad de toxina A en células IMR-90 fue 124-152 > 1G10 > 2A11. Ejemplo 16. Protección de Hámsters de Reto de C. difficile Primario Usando Anticuerpos de Anti-Toxina B La protección de reto directo de un inoculo de C. difficile (clindamicina en esporas de día 1 y C. difficile en día 0 (1/100,000 dilución) se realizó durante un período de 4 a 10 días en presencia o ausencia de anticuerpos de anti-toxina B. Los grupos de 5 hámsters se retaron después de recibir una vez diaria dosis de 3D8 (20 mg total durante 4 días), combinado con 3D8 (Id.) Y suero de cabra #331 (3 ml), 3D8 en combinación con anticuerpos de anti-toxina B 124-152 (18 mg total durante 4 días), 2A11 (20 mg total durante 4 días) , o 1G10 (20 mg total durante 4 días) o ningunos anticuerpos durante 3 días antes del reto como se ilustra en la Figura 24. El dato en la Figura 24 muestra que los animales que no reciben anticuerpos o ya sea 3D8 o suero de cabra sola todos murieron dentro de 72 horas de reto de C. difficile, mientras que los animales que reciben 3D8 y un anticuerpo anti-toxina B, y de preferencia en combinación con 124-152, tuvieron un régimen de supervivencia de 40% (Figura 24). Un estudio de 10 días similar al anterior (pero usando un inoculo de C. difficile más diluido) se realizó con cantidades incrementantes del anticuerpo de anti-toxina B 124-152 (0156 mg, 1.7 mg, o 5.0 mg proporcionados en los días -3, -2, -1, y 0) . Los animales que reciben ambos 3D8 y suero de cabra sobrevivieron y la mayoría de los animales (60%-70%) sobrevivieron durante 10 días después del reto si se les proporciona 3D8 en combinación con 124-152. Aún la dosificación más baja del anticuerpo de anti-toxina B 124-152 (0.56 mg en combinación con 3D8) fue altamente efectivo (70% de supervivencia; ver la Figura 25) . Los resultados muestran gue 124-152 y 3D8, solos, son menos efectivos entonces cuando se usan en combinación en donde más de un aditivo, en realidad, se logra resultado terapéutico sinergístico (Figuras 24-26) . Estos datos proporcionan evidencia adicional de gue el anticuerpo de anti-toxina B es altamente efectivo, especialmente en combinación con el anticuerpo de antitoxina A 3D8. La neutralización de toxina B además de toxina A se determinó gue proporciona para protección de enfermedad de C. difficile en este modelo. Ejemplo 17. Mapeo de Epítope de Anticuerpos de Anti-Toxina B El epítope de toxina B enlazado por cada anticuerpo monodonal se determinó mediante manchado western. Clones de E. coli recombinante se construyeron con fragmentos expreso de toxina B gue representa diferentes dominios de toxina B. Los segmentos apropiados del gene de toxina B se amplificaron con PCR de ADN preparado de una cepa de C. difficile apropiada. Los fragmentos se clonaron hacia un vector de expresión y expresaron en E. coli. El anticuerpo monoclonal humano 152 se usó para probar fragmento de toxina B en manchas western a fin de mapear el epítope de enlace. Los fragmentos de proteína de toxina B se aislaron de E. coli gue contiene una porción de los genes de toxina B y se separaron usando SDS-PAGE. Después de •electroforesis, los fragmentos de toxina B se transfirieron a nitrocelulosa y se probaron con anticuerpo 152 monoclonal seguido por fosfatasa alcalina conjugada con cabra antihumana para detectar enlace de Mab 152. HuMab 152 se determino que se enlaza a la porción de fragmento -COOH de toxina B entre los aminoácidos 1777 y 2366 (ver, por ejemplo, Figura 32) . Otras Modalidades Un número de modalidades de la invención se ha descrito. Sin embargo, se entenderá gue se pueden hacer varias modificaciones sin abandonar el espíritu y alcance de la invención. Consecuentemente, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo monóclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo gue se liga especificamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficíle) . 2.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina A de C. difficile (toxina A) . 3.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina B de C. difficile (toxina B) . 4.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo neutraliza la toxina A in vitro. 5.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo neutraliza la toxina A in vivo. 6.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo neutraliza toxina A in vivo. 7.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 6, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo tiene una o más de las siguientes características: protege de o inhibid colitis mediada por C. difficíle en un sujeto; protege de o inhibe la colitis asociada con anticuerpo en un sujeto; protege de o inhibe colitis psedomembranosa mediada por C. difficile (PMC) en un sujeto; protege de o inhibe diarrea mediada por C. difficíle en un sujeto; e inhibe recaída de enfermedad mediada por C. difficile. 8.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope dentro de la mitad N-terminal de toxina A. 9.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza a un epítope entre aminoácidos 1-1256 de toxina A. 10.- El método o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope seleccionado del grupo gue consiste de la mitad C-terminal de toxina B y el dominio receptor de toxina B. 11.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga a un epítope entre aminoácidos 1777-2366 del dominio receptor de toxina B. 12.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en. donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope dentro del dominio de enlace receptor C-terminal de toxina A. 13.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza a un epítope entre aminoácidos 1852-2710 de toxina A. 14.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza a un epítope dentro de aminoácidos 659-1852 de toxina A. 15.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope dentro de aminoácidos 1-600, 400-600, o 415-540 de toxina A. 16.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a un epítope dentro de aminoácidos 900-1852, 900-1200, o 920-1033 de toxina A. 17.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a toxina A con un KD de menos de 20 x 10-6 M. 18.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a toxina B con un KD de menos de 20 x 10~s M. 19.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una región de cadena pesada variable gue comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. 20.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una región de cadena ligera variable gue comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, o SEO ID NO: 6. 21.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una región de cadena pesada variable gue comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 54; O SEQ ID NO: 56. 22.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una región de cadena ligera variable gue comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 60. 23.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 19, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende además una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. 24.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope que se traslapa con un epítope ligado por un anticuerpo producido por el clon 2D8, 1B11, o 3H2. 25.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se enlaza específicamente a un epítope que se traslapa con un epítope ligado por un anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11, o 1G10. 26.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 24, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo compite para enlaza a toxina A con un anticuerpo producido por el clon 3D8, 1B11, o 3H2. 27.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde una región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 80% idénticas a una o más se SEQ ID Nos: 7-15. 28.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde una región de cadena ligera variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende uno o más CDRs que son cuando menos 80% idénticas a una o más de SEQ ID NOs: 16-24. 29.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde una región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que son cuando menos 80% idénticas a una o más de SEQ ID Nos: 62, 64 y 66. 30.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde una región de cadena ligera variable el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una o más CDRs que son cuando menos 80% idénticas a una o más de SEQ ID Nos: 68, 70, y 72. 31.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 21, en donde una región de cadena ligera variable del anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende una o más CDRs que son cuando menos 80% idénticas a una o más de SEQ ID Nos: 16-24. 32.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 21, en donde una región de cadena pesada variable comprende tres CDRs que son cuando menos 80% idénticas a una CDR de una región de cadena pesada variable de una o más de SEQ ID Nos: 10-15. 33.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 22, en donde una región de cadena ligera variable comprende tres CDRs que son cuando menos 80% idénticas a SEQ ID NOs: 16-18, ?EQ ID Nos: 19-21, o SEQ ID NOs: 22-24. 34.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 23, en donde una región de cadena pesada variable comprende tres CDRs que son cuando menos 80% idénticas a SEQ ID Nos:7-9, SEQ ID NOs:10-12, o SEQ ID NOs: 13-15. 35.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 26, en donde una región de cadena ligera variable comprende tres CDRs que son cuando menos 80% idénticas a SEQ ID Nos:16-18, SEQ ID Nos:19-21, o SEQ ID NOs:22-24. 36.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde la región 1 de determinación de complementariedad (CDRl) de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A- (SEQ ID NO.25), en donde la región 2 de determinación de complementariedad (CDR2) de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido A-S-X-X-X-S/T (SEQ ID NO: 26), y en donde la región 3 de determinación de complementariedad (CDR3) de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido Q-Q-X-X-S/N-X-P/S (SEQ ID NO:27), en donde X es cualquier aminoácido. 37.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 2, en donde CDRl de una región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácido Y-G-M-H (SEQ ID NO: 28), y en donde CDR2 de una región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminácido I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G (SEQ ID NO: 29), en donde X es cualquier aminoácido. 38.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 29, en donde CDRl de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A- (SEQ ID NO: 25), en donde CDR2 de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido A-S-X-X-X-S/T (SEQ ID NO: 26), y en donde CDR3 de una región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácido Q-Q-X-X-S/N-X-P/S (SEQ ID NO: 27). 39,- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo inhibe el enlace de toxina A a células de mamífero, 40.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa. 41.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo inhibe el enlace de toxina B a células de mamífero. 42.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo es un anticuerpo de longitud completa. 43.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo que se liga específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) , en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo: (a) comprende una región variable de cadena pesada gue es el producto de o se deriva de un gene humano VH 3-33; y (b) comprende una región variable de cadena ligera gue es el producto de o se deriva de un gene humano V? seleccionado del grupo gue consiste en V? L19, V? L6 y V? L15, 44.- Un polipéptido aislado gue comprende la porción de enlace de antígeno de un anticuerpo producido por clon de hibridoma 3D8, 1B11, o 3H2. 45.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo gue se enlaza específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) , en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o se deriva de un gene humano VH 5-51; y (b) comprende una región variable de cadena ligera gue es el producto de o se deriva de un gene humano V? A27. 46.- Un polipéptido aislado gue comprende la porción de enlace de antígeno de un anticuerpo producido por clon de hibridoma 124-152, 2A11, o 1G10. 47.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, 'en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende un dominio efector. 48.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo comprende un dominio Fc. 49,- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo es un anticuerpo de cadena sencilla. 50.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo es un fragmento Fab. 51.- Una composición farmacéutica gue comprende el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 en un portador farmacéuticamente aceptable. 52.- El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, gue comprende además una etigueta. 53.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido cuando menos 90% idéntico a SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 O SEQ ID NO: 60. 54.- Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 53. 55. - Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 53. 56.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 55, en donde -la célula huésped es una célula bacteriana . 57.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 55, en donde la célula huésped es una célula eucariótica. 58.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 55, en donde la célula huésped es una célula de mamífero'. 59.- Un equipo que comprende un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la -reivindicación 1, e instrucciones para uso al tratar enfermedad mediada por C. difficile . 60.- Un método para tratar enfermedad de C. difficile en un sujeto, el método comprendiendo.- administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , en una cantidad efectiva para inhibir un síntoma de enfermedad de C. difficile. 61.- El método de conformidad con la. reivindicación 60, en donde el sujeto es humano. 62. - El método - de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se administra intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente al sujeto. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 60, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se administra en combinación con un segundo agente . 64. - El método de conformidad con la reivindicación 63, en donde el segundo agente es un segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo. 65. - El método de conformidad con la reivindicación 64, en donde el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina A de C. difficile y el segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de enlace de antígeno del mismo se liga específicamente a toxina B de C. difficile. 66 . - El método de conformidad con la reivindicación 64, en donde el segundo agente es un antibiótico. 67. - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde el segundo agente es vancomicina o metronidazol . 68.- El método de conformidad con la reivindicación 65, en donde los dos agentes se administran en combinación con un antibiótico. 69. - El método de conformidad con la reivindicación 64, en donde el segundo agente es una vacuna de C. difficile. 70.- El método de conformidad con la reivindicación 61, en donde C. difficile ocasiona diarrea asociada con antibiótico, colitis pseudomembranosa mediada por C. difficile (P C) , diarrea, o recaída de enfermedad mediada por C. difficile. 71.- Una composición que comprende: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se liga específicamente a toxina A de C. difficile, y (b) un anticuerpo aislado que se liga específicamente a toxina B de C. difficíle. 72.- La composición de conformidad con la reivindicación 71, en donde el anticuerpo aislado que se liga específicamente a toxina A de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 3D8, 1B11, y 3H2. 73. - La composición de conformidad con la reivindicación 71, en donde el anticuerpo aislado que se liga específicamente a toxina B de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 124-152, 2 ll, y 1G10. 1 74. - La composición de conformidad con la reivindicación 71, en donde el anticuerpo aislado que se liga específicamente a toxina A de C. difficile es el anticuerpo monoclonal humano 3D8 y el anticuerpo aislado que se liga específicamente a toxina B de C. difficile es el anticuerpo monoclonal humano 124-152. 75. - Una composición apropiada para tratar una enfermedad o desorden asociado con C. difficile en un mamífero, que comprende, un anticuerpo de enlace de toxina A, o fragmento del mismo, y un anticuerpo de enlace de toxina B, o fragmento del mismo, en donde los anticuerpos , o fragmentos de los mismos, están presentes en cantidades sinergísticamente efectivas . 76.- La composición de conformidad con la reivindicación 75, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo que se liga a toxina A de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 3D8, 1B11, y 3H2. 77.- La composición de conformidad con la reivindicación 75, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo que se liga a toxina B de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 124-152, 2 ll, y 1G10. 78.- Un método para tratar una enfermedad o desorden asociado con C. difficile en una mamífero que comprende, administrar al mamífero cantidades sinergísticamente efectivas de un anticuerpo que enlaza toxina A, o fragmento del mismo, y un anticuerpo que enlaza toxina B, o fragmento del mismo, de modo que dicha terapia se logre. 79. - El método de conformidad con la reivindicación 78, en donde el anticuerpo, o fragmento del mismo, que se liga a toxina A de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 3D8, 1B11, y 3H2. 80.- El método de conformidad con la reivindicación 78, en donde el anticuerpo, o fragmento del mismo, que se liga a toxina B de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en 124-152, 2All, y 1G10.
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