ES2643760T3

ES2643760T3 - Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2643760T3
Application number: ES14194551.9T
Authority: ES
Inventors: Donna Ambrosino; Gregory Babcock; Theresa Broering; Robert Graziano; Hector Javier Hernandez; Israel Lowy; Robert Mandell; Deborah Molrine; William Thomas; Hui-Fen Zhang
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC; University of Massachusetts Amherst
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC; University of Massachusetts Amherst
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2025-02-04
Also published as: BE2017C023I2; HRP20110599T1; JP2011019516A; CA2553946C; LUC00025I1; US20140120614A1; FR17C1025I1; PL1766093T3; JP5319622B2; EP2857418A1; US20050287150A1; LT2857418T; BRPI0507433B8; AU2005320349A1; CY1119416T1; DK2857418T3; EP2270045B1; US7625559B2; CN101014620A; US20120288508A1

Description

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específicamente a la toxina A de C. difficile. Los anticuerpos pueden incluir otras características descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvelan anticuerpos monoclonales humanos aislados o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), en los que los anticuerpos: (a) incluyen una región variable de cadena pesada que es el producto o se obtiene de un gen VH 3-33 humano; y/o (b) incluyen una región variable de cadena ligera que es el producto o se obtiene de un gen de V humano seleccionado del grupo que consiste en V L19, V L6 y V L15. Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden incluir otras características descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvelan anticuerpos monoclonales humanos aislados o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), en los que los anticuerpos: (a) incluyen una región variable de cadena pesada que es el producto o se obtiene de un gen VH 551 humano; y/o (b) incluyen una región variable de cadena ligera que es el producto o se obtiene de un gen V A27 humano. Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden incluir también otras características descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvelan polipéptidos aislados que incluyen una porción de unión a antígeno de un anticuerpo producido por el clon de hibridoma 3D8, 1B11 o 3H2 (también denominados en el presente documento como “3D8”, “1B11” y “3H2”).

En el presente documento se desvelan polipéptidos aislados que incluyen un porción de unión a antígeno de un anticuerpo producido por los clones de hibridoma 124-152, 2A11 o 1G10 (también denominados en el presente documento “124-152”, “2A11” y “1G10”).

En el presente documento se desvelan anticuerpos monoclonales aislados o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a una exotoxina de C. difficile, neutralizan la toxina, inhiben y/o protegen de una enfermedad mediada por C. difficile. Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos de mamífero (por ejemplo, humanos) o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden incluir otras características descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvelan composiciones que incluyen: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina A de C. difficile; y (b) un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina B de

C. difficile.

En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica polipéptidos al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6; por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 38, 39, 40, 35, 36 o 37. La invención también presenta vectores de expresión que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntico a las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6; por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 38, 39, 40, 35, 36 o 37, así como células huésped, por ejemplo, células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli, que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntico a las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6; por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 38, 39, 40, 35, 36 o 37.

En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido que es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 54, 56, 58 o 60, por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 55, 57, 59 o 61. La invención también presenta vectores de expresión que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntico a las SEQ ID NO: 54, 56, 58 o 60, por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 55, 57, 59 o 61. La invención también proporciona células huésped, por ejemplo, células bacterianas, por ejemplo células de E. coli, que incluyen un ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 54, 56, 58 o 60, por ejemplo, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más idéntica a las SEQ ID NO: 55, 57, 59 o 61.

Las células huésped también pueden ser células eucariotas, por ejemplo, células de levadura, células de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0 o células de mieloma.

En otro aspecto, la invención presenta kits que incluyen un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la invención. El kit puede incluir instrucciones para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad mediada por C. difficile.

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El kit puede incluir adicionalmente un anticuerpo policlonal o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile. El anticuerpo policlonal o porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a la toxina B de C. difficile.

En el presente documento se desvelan kits que incluyen: (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a la toxina A de C. difficile; y (b) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a la toxina B de C. difficile.

En el presente documento se desvelan procedimientos para el tratamiento de una enfermedad por C. difficile en un sujeto, mediante la administración al sujeto de un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) en una cantidad eficaz para inhibir una enfermedad por C. difficile, por ejemplo, colitis mediada por C. difficile, colitis asociada a antibióticos, colitis pseudomembranosa (CPM) mediada por C. difficile o diarrea, o recaída de enfermedad mediada por C. difficile. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede administrarse, por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente al sujeto.

El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede administrarse solo o en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, un segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a toxina A de C. difficile y el segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a la toxina B de C. difficile. En otro ejemplo, el segundo agente es un antibiótico, por ejemplo, vancomicina o metronidazol. El segundo agente puede ser gamma-globulina policlonal (por ejemplo, gamma-globulina humana).

Se administra un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que incluye una región de la cadena ligera variable y una región de la cadena pesada variable idéntica a la región de la cadena ligera variable y la región de la cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 3D8 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO:4 y una secuencia de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO:1).

Este anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se administra en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que incluye una región de la cadena ligera variable y una región de la cadena pesada variable idéntica a la región de la cadena ligera variable y la región de la cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 124-152 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO:58 y una secuencia de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO:54).

Se administra un anticuerpo o porción de unión a antígeno producido por el clon 3D8 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO:4 y una secuencia de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO:1) en combinación con un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo producido por el clon 124-152 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEQ ID NO:58 y una secuencia de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEQ ID NO:54).

En el presente documento se desvelan procedimientos para preparar un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile, inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera humana con una composición que incluye una exotoxina inactivada, y aislar un anticuerpo del animal. La exotoxina puede inactivarse, por ejemplo, mediante tratamiento con UDP-dialdehído o por mutación (por ejemplo, usando procedimientos recombinantes). El procedimiento puede incluir adicionalmente evaluar la unión del anticuerpo a la exotoxina.

En el presente documento se desvelan procedimientos para preparar un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo proporcionando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile, y que expresa el ácido nucleico en una célula huésped.

En el presente documento se desvela un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de unión a antígeno (por ejemplo, CDR o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 3D8, 1B11 o 3H2.

En el presente documento se desvela un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de unión a antígeno (por ejemplo, CDR o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11 o 1G10.

En el presente documento se desvela un procedimiento para preparar un hibridoma que expresa un anticuerpo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana con una composición que incluye la exotoxina, en el que la toxina se inactiva; aislando esplenocitos del animal; generando hibridomas de los esplenocitos; y seleccionando un hibridoma que produce un anticuerpo que se une

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3D8 y antisueros de la cabra nº 331. La Figura 16 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales sanos después del tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. “Goa 331” se refiere a antisueros de la cabra nº 331. La Figura 17 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsteres que sobreviven al tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. Los hámsteres se inmunizaron con un fragmento de la toxina B antes del tratamiento con clindamicina. Los hámsteres se trataron con vancomicina, vancomicina y 3D8, o no recibieron tratamiento. La Figura 18 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales sanos después de tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. Los hámsteres se inmunizaron con un fragmento de toxina B antes del tratamiento con clindamicina. La Figura 19 es un diagrama esquemático del periodo de administración de diversos agentes a hámsteres en un modelo de exposición directa a C. difficile. “331” se refiere a antisueros de la cabra nº 331. “Clinda” se refiere a tratamiento con clindamicina. La Figura 20 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición directa como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a exposición directa a C. difficile. La Figura 21 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición directa como el porcentaje de animales sanos después de exposición directa a C. difficile. La Figura 22 es una representación de la secuencia de aminoácidos de toxina A de C. difficile. La Figura 23 es una representación de la secuencia de aminoácidos de toxina B de C. difficile. La Figura 24 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición primaria como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a exposición directa a C. difficile. La Figura 25 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición primaria como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a exposición directa a C. difficile. La Figura 26 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición primaria como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a exposición directa a C. difficile. La Figura 27 es una gráfica que representa los resultados de ensayos en los que se midió la neutralización in vitro de toxina A y toxina B en presencia de anticuerpos monoclonales para toxina B o sueros policlonales de cabra contra toxina B. La Figura 28 es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VH expresada por el clon 124-152. Los genes del segmento V, del segmento D y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 29 es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VL expresada por el clon 124-152. Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 30 es una representación de la secuencia de aminoácidos y de la línea germinal relacionada de la cadena de VH expresada por el clon 124-152. Los genes del segmento V, del segmento D y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 31 es una representación de la secuencia de aminoácidos y de la línea germinal relacionada de la cadena de VL expresada por el clon 124-152. Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 32 es una representación esquemática del polipéptido de la toxina B que indica fragmentos que se analizaron para estudios de mapeo de epítopes.

Símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de proporcionar un claro entendimiento de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las siguientes definiciones se proporcionan convenientemente a continuación.

Definiciones

El término “toxina A” se refiere a la proteína de la toxina A codificada por C. difficile. La secuencia de aminoácidos de la toxina A de C. difficile (SEQ ID NO:41) se proporciona en GenBank® bajo el número de referencia A37052, versión GI 98593 (véase también la Figura 22). “Toxina B” se refiere a la proteína de la toxina B codificada por C. difficile. La secuencia de aminoácidos de la toxina B de C. difficile (SEQ ID NO: 42) se proporciona en GenBank® bajo el número de referencia S70172, versión GI 7476000 (véase también la Figura 23). “Proteína” se usa indistintamente con “polipéptido”.

Un “anticuerpo anti-C. difficile” es un anticuerpo que interactúa con (por ejemplo, se une a) una proteína u otro componente producido por bacterias C. difficile. Un “anticuerpo anti-toxina” es un anticuerpo que interactúa con una toxina producida por C. difficile (por ejemplo, toxina A o toxina B). Un anticuerpo anti-proteína de toxina puede unirse a un epítope, por ejemplo, un epítope conformacional o lineal, o a un fragmento de la proteína de toxina de longitud completa.

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“Inmunoglobulina” se refiere a una proteína constituida por uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humanos reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 y IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, además de los genes de la región variable de inmunoglobulina de miríadas. Las “cadenas ligeras” de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KD y 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las “cadenas pesadas” de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KD y 446 aminoácidos) están similarmente codificadas por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los genes de la región constante anteriormente mencionados, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). El término “inmunoglobulina” incluye una inmunoglobulina que tiene: CDR de una fuente humana o no humana. La región estructural de la inmunoglobulina puede ser humana, humanizada o no humana, por ejemplo, una región estructural murina modificada para disminuir la antigenicidad en seres humanos, o una región estructural sintética, por ejemplo, una secuencia consenso.

Como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgG1) que es codificada por genes de la región constante de las cadenas pesadas.

El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo” o “porción”) como se usa en el presente documento se refiere a una parte de un anticuerpo que se une específicamente a una toxina de C. difficile (por ejemplo, la toxina A), por ejemplo, una molécula en la que una o más cadenas de inmunoglobulina no es de longitud completa, pero que se une específicamente a una toxina. Ejemplos de porciones de unión englobadas dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VLC, VHC, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VHC y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VLC y VHC de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341:544-546,1989) que consiste en un dominio VHC; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada que tiene suficiente región estructural para unirse específicamente, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de una región variable. Un porción de unión a antígeno de una región variable de las cadenas ligeras y un porción de unión a antígeno de una región variable de las cadenas pesadas, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, pueden unirse usando procedimientos recombinantes por un ligador sintético que les permite prepararse como una única cadena de proteínas en la que el par de regiones VLC y VHC para formar moléculas monovalentes (conocidas como una única cadena Fv (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también están englobados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estas porciones de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia, y las porciones se criban para la utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

El término “anticuerpo monoespecífico” se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo, epítope. Este término incluye un “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” que como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de anticuerpos o porciones de los mismos con una única composición molecular.

El término anticuerpo “recombinante” como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica cortar y empalmar secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos humanizados, injertados en CDR, quiméricos, generados in vitro (por ejemplo, por expresión en fago), y opcionalmente pueden incluir regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana.

Como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de forma que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos tengan actividades similares. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos el 50 % de la afinidad del primer anticuerpo.

Los cálculos de “homología” entre dos secuencias se realizan del siguiente modo. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden ignorarse para los fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia alineada para los fines de comparación es al menos el 50 % de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos

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correspondientes. Si una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, “identidad” de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a “homología” de aminoácidos o de ácidos nucleicos). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que necesita introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación de la homología en porcentaje entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. La homología en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización extendida por hueco de 4 y un hueco de desplazamiento de marco de 5.

Como se usa en el presente documento, el término “se hibrida bajo condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. La orientación para realizar las reacciones de hibridación puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989. Los procedimientos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y puede usarse cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas citadas en el presente documento son del siguiente modo: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad: 6X cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de dos lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS al menos a 50 ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55 ºC para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de media rigurosidad: 6X SSC a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 60 ºC; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad: 6X SSC a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 65 ºC; y 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad: fosfato de sodio 0,5 M, 7 % de SDS a 65 ºC, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, 1 % de SDS a 65 ºC.

Se entiende que los anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales que no tienen un efecto sustancial sobre las funciones del polipéptido. Tanto si se tolera como si no una sustitución particular, es decir, no se afectarán adversamente las propiedades biológicas deseadas tales como la actividad de unión, puede determinarse como se describe en Bowie y col., Science, 247:1306-1310, 1990. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que un resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia. Estos familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que puede alterarse de la secuencia natural de un polipéptido tal como un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido “esencial” produce un cambio tal.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los procedimientos y los materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, dominará. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos sólo son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Visión general

C. difficile es una bacteria gram-positiva productora de toxina que produce diarrea y colitis asociada a antibióticos en seres humanos. En el presente documento se proporcionan anticuerpos y composiciones para el tratamiento y la prevención de enfermedad asociada a C. difficile (CDAD). Las composiciones incluyen anticuerpos que reconocen proteínas y otros componentes moleculares (por ejemplo, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos) de bacterias C. difficile incluyendo anticuerpos que reconocen toxinas producidas por C. difficile (por ejemplo, toxina A y toxina B). En particular se proporcionan anticuerpos monoclonales humanos. En ciertas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales humanos se producen en ratones que expresan segmentos de genes de inmunoglobulina humana (descritos más adelante). También se proporcionan combinaciones de anticuerpos anti-toxina.

Los anticuerpos (y porciones de unión a antígeno de los mismos) que se unen a una toxina de C. difficile descritos en el presente documento pueden inhibir CDAD en un sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos anti-toxina A monoclonales humanos descritos en el presente documento pueden neutralizar la toxina A e inhibir la recaída de la

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2. Producción y modificación de anticuerpos

Muchas formas diferentes de anticuerpos anti-toxina pueden ser útiles en la inhibición de CDAD. Los anticuerpos pueden ser de los diversos isotipos, que incluyen: IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE). Preferentemente, el anticuerpo es un isotipo IgG, por ejemplo, IgG1. Las moléculas de anticuerpo pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden incluir sólo un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de una sola cadena). Éstos incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, además de porciones de unión a antígeno de los anteriores.

Los anticuerpos anti-toxina o porciones de los mismos útiles en la presente invención también pueden ser anticuerpos recombinantes producidos por células huésped transformadas con ADN que codifica cadenas de inmunoglobulina ligeras y pesadas de un anticuerpo deseado. Los anticuerpos recombinantes pueden producirse por técnicas de ingeniería genética conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden producirse clonando una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, un ADNc o ADN genómico que codifica las cadenas de inmunoglobulina ligeras y pesadas del anticuerpo deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica aquellos polipéptidos se inserta luego en un vector de expresión de manera que ambos genes estén operativamente ligados a sus propias secuencias de control de la expresión transcripcional y transduccional. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para ser compatibles con la expresión de la célula huésped usada. Normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Pueden usarse células huésped procariotas o eucariotas.

Se prefiere la expresión en células huésped eucariotas debido a que es más probable que tales células se ensamblen y secreten un anticuerpo activo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo que las células procariotas. Sin embargo, cualquier anticuerpo producido que es inactivo debido a un plegamiento inapropiado puede renaturalizarse según procedimientos muy conocidos (Kim y Baldwin, Ann. Rev. Biochem., 51:459-89, 1982). Es posible que las células huésped produzcan porciones de anticuerpos intactos tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada que también son homólogos de anticuerpos según la presente invención.

Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden producirse en un transfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y procedimientos de transfección de genes como es muy conocido en la técnica (Morrison, S., Science, 229:1202,1985). Por ejemplo, en una realización, el (los) gen(es) de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos humanos, puede(n) ligarse en un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariota tal como se usa en un sistema de expresión de genes de GS desvelado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841, o en otros sistemas de expresión muy conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede introducirse en células huésped eucariotas tales como células CHO o células NSO o alternativamente otras células eucariotas como células derivadas de plantas, hongos o células de levadura. El procedimiento usado para introducir estos genes puede ser cualquier procedimiento descrito en la materia tal como electroporación, lipofectina, lipofectamina o transfección balística en el que las células son bombardeadas con micropartículas que llevan el ADN de interés (Rodin, y col. Immunol. Lett., 74(3):197-200, 2000). Después de introducir estos genes de anticuerpo en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que entonces pueden amplificarse para su nivel de expresión y escalado para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse de estos sobrenadantes de cultivo y/o células usando técnicas convencionales.

Se entenderá que variaciones en los procedimientos anteriores son útiles en la presente invención. Por ejemplo, puede desearse transformar una célula huésped con ADN que codifica tanto la cadena ligera como la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo. La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para eliminar algo o todo el ADN que codifica tanto una como ambas de las cadenas ligera y pesada que no son necesarias para la unión, por ejemplo, la región constante puede modificarse, por ejemplo, delecionando aminoácidos específicos. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas son útiles en los procedimientos descritos en el presente documento. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera se unen a una toxina, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de la toxina, u otro epítope de la toxina.

Los anticuerpos quiméricos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (u otra especie) se digiere con enzimas de restricción para eliminar la región que codifica la Fc murina, y se sustituye la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana (véanse Robinson y col., solicitud de patente internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., solicitud de patente europea 184, 187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171,496; Morrison y col., solicitud de patente europea 173,494; Neuberger y col., solicitud internacional WO 86/01533; Cabilly y col., patente de EE.UU. 4,816,567; Cabilly y col., solicitud de patente europea 125,023; Better y col. (1988 Science, 240:1041-1043); Liu y col. (1987) PNAS, 84:3439-3443; Liu y col., 1987, J. Immunol., 139:3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res., 47:999-1005; Wood y col. (1985) Nature, 314:446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559). Los anticuerpos quiméricos también puede crearse por técnicas de ADN recombinante en las que el ADN que codifica regiones V murinas puede ligarse a ADN que codifica las regiones constantes humanas.

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dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración previsto y la aplicación terapéutica. Composiciones útiles están en forma de disoluciones inyectables o infusibles. Un modo útil de administración es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). Por ejemplo, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser para administración por infusión o inyección intravenosa. En otra realización, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es para administración por inyección intramuscular o subcutánea.

Los términos “administración parenteral” y “administrado parenteralmente” como se usan en el presente documento significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada para alta concentración de anticuerpos. Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, el anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación útiles son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo. La fluidez apropiada de una disolución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo descritas en el presente documento pueden administrarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, y para muchas aplicaciones terapéuticas. Como será apreciado por el experto, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Un anticuerpo o porción de anticuerpo del mismo puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros componentes, si se desea) también pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de vaina dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto por administración distinta de parenteral puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica.

Las pautas de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante el tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas de dosificación unitarias son dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la materia del mezclado por incorporación de un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo es 0,1-60 mg/kg, por ejemplo, 0,5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg o 0,75-10 mg/kg. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, pautas de dosificación específicas deberán ajustarse con el tiempo según las necesidades del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento solo son a modo de ejemplo y no pretenden limitar ni el ámbito ni la práctica de la composición reivindicada.

En el presente documento se desvelan kits que incluyen un anticuerpo anti-toxina o porción de unión a antígeno del mismo. Los kits pueden incluir uno o varios elementos que incluyen: instrucciones para su uso; otros reactivos, por ejemplo, una marca, un agente terapéutico o un agente útil para quelar, o de otro modo acoplar, un anticuerpo a una marca o agente terapéutico, u otros materiales para preparar el anticuerpo para su administración; vehículos farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto.

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Ejemplo 5. Protección de ratones de la exposición a la toxina A mortal por administración de anticuerpos anti-toxina A

Cada anticuerpo se sometió a ensayo para determinar la capacidad para proteger ratones de la exposición a una dosis mortal de la toxina A. A ratones hembra Swiss Webster, que pesan cada uno 10-20 gramos, se les inyectaron intraperitonealmente hasta 250 µg de 3D8, 1B11 o 33.3H2, o un anticuerpo de control (anticuerpo anti-virus respiratorio sincitial, MedImmune) antes de la exposición a la toxina A. Aproximadamente 24 horas después de la inyección, los ratones se expusieron a una dosis de la toxina A superior a 10 veces la dosis mortal (DM50), normalmente 100 ng. Los animales se observaron para signos de toxicidad durante los 7 días siguientes. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Figura 9. Los datos se expresan como supervivencia en porcentaje. Los números entre paréntesis se refieren a dosis de anticuerpo, si se administró una dosis distinta de 250 µg. La Figura 9 muestra que cada uno de los anticuerpos pudo proteger hasta cierto punto los ratones de la exposición a la toxina A mortal. El porcentaje de ratones que sobrevivieron cuando se trataron con 3D8 osciló del 10100 por ciento. El porcentaje de ratones que sobrevivieron cuando se trataron con 33.3H2 osciló del 20-100 por ciento. El porcentaje de ratones que sobrevivieron cuando se trataron con 1B11 osciló del 0-60 por ciento. La capacidad relativa de estos monoclonales para proteger los ratones fue 3H2 ≥ 3D8 > 1B11.

Ejemplo 6. Neutralización de enterotoxicidad de la toxina A de asas intestinales de ratón ligadas con anticuerpos anti-toxina A

Los anticuerpos 3D8 y 33.3H2 se sometieron a ensayo para determinar la neutralización de la enterotoxicidad de la toxina A en un modelo de ratón de asa ileal. Este modelo mide la acumulación de fluido inducido por la toxina A en el intestino de ratón. Para realizar estos experimentos, cada ratón se privó durante 16 horas, se anestesió y se expuso el íleo próximo al ciego. Un asa de 3 a 5 centímetros se ligó doblemente en cada extremo y se inyectó con 10 µg de la toxina A. El asa ileal se devolvió a la cavidad abdominal, la herida se cerró y se dejó que el animal se recuperara. Cuatro horas después de la cirugía, el animal se sometió a eutanasia y el asa se extirpó del animal. Se volvió a medir la longitud de cada segmento y se extrajo el fluido intraluminal. El volumen del fluido y la relación volumen con respecto a longitud (V:L) en milímetros por centímetro se calculó para cada asa. A los ratones de ensayo se les inyectó anticuerpo parenteralmente 1-2 días antes de la cirugía. Los resultados de estos experimentos se representan en la Figura 10. La inyección con toxina A aumentó el 50 % la relación de peso con respecto a longitud del fluido intestinal. Tanto 3D8 como 33.3H2 previnieron este aumento en la acumulación de fluido. Los ratones a los que se les administró cualquier anticuerpo tenían una relación de peso con respecto a longitud comparable a la de ratones que no recibieron ninguna inyección de toxina A. Por tanto, 3D8 y 33.3H2 protegen de la acumulación de fluido intestinal in vivo.

Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales anti-toxina A protegen de la enterotoxicidad mediada por toxina A in vivo. Los datos del asa ligada de ratón muestran que estos anticuerpos monoclonales pueden proteger de la lesión de la mucosa cuando se administran sistémicamente.

Ejemplo 7. Protección de hámsteres de la recaída de C. difficile con anticuerpos anti-toxina A

3D8 se probó en un modelo de recaída de hámster. Los hámsteres son sensibles a los efectos tóxicos de toxinas de

C. difficile y normalmente mueren en el transcurso de 2-3 días desde que recibieron una dosis única de clindamicina en presencia de C. difficile. Para probar la eficacia de 3D8 en hámsteres se usó un modelo de recaída. En este modelo, a los hámsteres se les administró una dosis de clindamicina y una dosis de esporas B1 de C. difficile un día después. Un conjunto de hámsteres de control no recibió antibiótico ni anticuerpo adicional. Un segundo conjunto de hámsteres de control se trató con 10 mg/kg/día de vancomicina. La vancomicina es un antibiótico usado en el tratamiento de enfermedad por C. difficile. Como se muestra en la Figura 11A, un conjunto de prueba de hámsteres recibió 10 mg/kg/día de vancomicina y 2 mg/kg/día de un antisuero policlonal de conejo producido contra la toxina A cada día durante siete días después de la exposición a C. difficile como se indica por las flechas en la figura. Un segundo conjunto de prueba de hámsteres recibió 10 mg/kg/día de vancomicina y 50 mg/kg/día de 3D8 a los mismos intervalos de tiempo. La supervivencia de los hámsteres se representó frente al tiempo y se muestra en la Figura 11B.

La Figura 11B muestra que todos los hámsteres que sólo recibieron clindamicina y C. difficile (diamantes) murieron en el transcurso de dos días desde la exposición a las bacterias. El doce por ciento (2/17) de los hámsteres tratados con vancomicina (cuadrados) sobrevivió a la exposición a bacterias; el ochenta y ocho por ciento (15/17) murió en el transcurso de ocho días. El cuarenta y uno por ciento (7/17) de los hámsteres tratados con vancomicina y 3D8 (cruces) sobrevivieron a la exposición; el cincuenta y nueve (10/17) por ciento murió en el transcurso de siete días. El sesenta y cuatro por ciento (7/11) de los hámsteres tratados con vancomicina y suero de conejo policlonal (triángulos) sobrevivieron a la exposición a bacterias; el treinta y seis por ciento (4/11) murió en el transcurso de nueve días. Estos datos también se representan en la Figura 12 como el porcentaje de supervivientes totales en cada grupo de tratamiento. Como se muestra en la figura, el porcentaje de supervivientes fue el mayor (sesenta y cuatro por ciento) en el grupo que recibió vancomicina y suero de conejo policlonal. El grupo que recibió 3D8 y vancomicina tuvo la segunda tasa de supervivencia mayor (cuarenta y uno por ciento). Sólo sobrevivió el doce por ciento de los hámsteres tratados con vancomicina. Murieron todos aquellos sin tratamiento. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-toxina policlonales y monoclonales protegen de la recaída de la enfermedad por C. difficile

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Ratones transgénicos Hco12, generados como se ha descrito anteriormente en la sección titulada “Generación de anticuerpos monoclonales humanos en ratones HuMAb” y suministrados por Medarex, Milpitas, CA, se inmunizaron intraperitonealmente 6-12 veces cada uno con 10 µg de toxoide en adyuvante RIBI. En los ratones transgénicos Hco12, el gen de la cadena ligera kappa de ratón endógena se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen de la cadena pesada de ratón endógena se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la publicación PCT WO 01/09187. Los ratones transgénicos Hco12 llevan un transgén de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild y col., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, y el transgén de la cadena pesada humana de Hco12 como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. El suero se recogió de cada ratón y se sometió a ensayo para determinar la reactividad para la toxina B por ELISA y la neutralización de citotoxicidad en células IMR-90. A los ratones que dieron positivo para el antisuero reactivo para la toxina B y neutralizante se les inyectaron 5-10 µg de toxoide B o el fragmento 4 mediante la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron y los bazos se aislaron para la fusión con hibridomas aproximadamente 3 días después de realizarse la inyección en la vena de la cola.

Se generaron hibridomas clónicos y se cribaron por ELISA. Se seleccionaron tres clones de hibridomas para el posterior análisis: 124-152; 2A11; y 1G10. En particular, los ADNc del clon 124-152 se amplificaron por RT-PCR a partir de ARNm, se clonaron y se secuenciaron. Se determinó que la región V de la cadena pesada se derivaba de la secuencia de la línea germinal VH 5-51, la región D se derivaba de la secuencia de la línea germinal 7-27 y la secuencia J de la región de la línea germinal JH3b. Se determinó que las regiones de la cadena ligera (kappa) se derivaban de A27 y la región J de JK1. Se determinó que el isotipo del clon 124-152 era IgG1. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del clon 124-152 se muestran en las Figuras 27-28. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se indican en las figuras. Las secuencias de la línea germinal relacionadas de las regiones VH y VL se muestran en las Figuras 30-31.

Los anticuerpos 124-152; 2A11; y 1G10 se aislaron de hibridomas correspondientes y se sometieron a ensayo para determinar sus características de unión (más adelante). El ADN que codifica el clon 124-152 se clonó en un vector que va a expresarse como un anticuerpo humano para la administración a seres humanos.

Ejemplo 14. Actividad de unión de anticuerpos anti-toxina B

La unión de cada anticuerpo a la toxina B se determinó por Biacore usando técnicas convencionales. Los resultados de este ensayo se representan en la Tabla 6. Los anticuerpos producidos por 124-152; 2A11; y 1G10 se compararon con controles apropiados.

En particular, la afinidad de los anticuerpos 124-152; 2A11; y 1G10 para la toxina B se midió con el instrumento Biacore® que detecta interacciones de unión biomolecular con tecnología de resonancia de plasmones superficiales. Cada anticuerpo se añadió a chips sensores recubiertos de proteína A y se dejó que la toxina B fluyera sobre el chip para medir la unión. 124-152 tuvo una KD de 1,64 x 10-10 M; 2A11 tuvo una KD de 0,24 x 10-10 M; y 1G10 tuvo una KD de 2,98 x 10-10 M. Por tanto, los anticuerpos se unen con alta afinidad a la toxina B. Estas constantes de unión indican que los anticuerpos tienen afinidades adecuadas para su uso en aplicación in vivo, por ejemplo, terapia humana.

Tabla 6

ID de la muestra: KD x 10-10(M) ka x 105(1/Ms) kd x 10-5(1/s)

2A11: 0,24 21 5,07

124.152: 1,64 34,5 56,4

51.1G10: 2,98 1,31 3,89

Ejemplo 15. Neutralización de toxina por anticuerpos anti-toxina B

Los anticuerpos expresados por los hibridomas 124-152; 2A11; y 1G10 se sometieron a ensayo para determinar la actividad de neutralización de la toxina B in vitro. Las células se incubaron en presencia de concentraciones variables de un anticuerpo monoclonal específico para la toxina B que prevendría que las células se redondearan después de la exposición a la toxina B. El efecto citopático (CPE) se determinó por inspección visual de células. Se determinó una puntuación CPE de 0-4 basándose en los resultados de la inspección visual (4 = 100 % de citotoxicidad, 0 = 0 % de toxicidad). Los resultados de estos ensayos se representan en la Figura 27. Se determinó la neutralización de la toxicidad contra una línea celular de fibroblasto de pulmón humano, IMR-90. La Figura 27 muestra que todos los anticuerpos tuvieron capacidad neutralizante hacia las células IMR-90. La actividad neutralizante relativa de la citotoxicidad de la toxina A en células IMR-90 fue 124-152 > 1G10 > 2A11.

Claims

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