CN102866140A - 一种畜肉腐败菌原位荧光染色的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种畜肉腐败菌原位荧光染色的快速检测方法。利用荧光染料对腐败菌活体进行原位荧光染色，结合激光共聚焦扫描显微镜断层扫描拍摄图像，并计算平均荧光强度代表猪肉组织该切片部位单位面积相对的细胞数量。本发明操作简单、检测速度快、无危害性，在不破坏生理状态的前提下，实现畜肉腐败菌的快速检测，能实时地观察和跟踪腐败菌在猪肉组织的分布、侵染情况及其动态变化。为进一步深入研究畜肉的腐败变质机理，以更有针对性地对腐败菌加以控制，延长肉品货架期，保障肉品品质安全，维护消费者健康有着直接的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对畜肉所含腐败菌原位荧光染色的快速检测方法，特指一种基于双乙酸荧光素（FDA）原位荧光染色的猪肉腐败菌快速检测方法。
背景技术
中国是世界上最大的猪肉生产国和消费国，2011年其产量和消费量均超过5000万吨，均占全世界50%以上。随着人民生活水平的提高，人们对肉品的需求发生了由量到质的变化。人们不仅关心肉类食品的营养价值，而且更关心其卫生和安全。特别是近年来，禽流感等动物疫病的发生，瘦肉精等药物残留引发的一系列人体食物中毒事件等，更加重了人民对肉品品质安全的担心。目前，食品安全已成为我国各级政府和社会关注的焦点，也是影响我国畜肉产品出口的关键问题。
新鲜度（即腐败变质程度）是反映肉品质量与安全的重要指标。腐败菌的生长繁殖是导致肉品腐败变质，造成肉品营养价值下降甚至危及食用者健康的主要原因。目前，许多学者对腐败菌的种类、组成比例及致腐能力等方面做了大量研究，但对腐败菌侵染肉品的原位实时检测及其腐败机理研究未见报道。若能对肉品中的腐败菌进行原位检测，就能实时跟踪检测腐败菌在肉样组织中的动态变化及其相应造成肉样腐败变质的程度，即可更细致微观地掌握其腐败机理，并更有针对性地对腐败菌加以控制，对保障肉品品质安全和延长肉品货架期具有重要的现实意义。
目前，对猪肉腐败菌检测的方法有压片显微计数法、平板菌落计数法、三磷酸腺苷（ATP）生物发光法、聚合酶链反应（PCR）法等，这些方法都是将细菌从肉品中分离后的体外检测，耗时、费力、操作繁锁，无法实现猪肉腐败菌原位实时的快速检测。
随着荧光标记技术和光学成像技术的发展，荧光标记结合激光共聚焦扫描显微镜（Laserconfocal scanning microscope，LCSM）成像技术，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞进行实时动态观察和检测，并提供定量荧光测定和图像分析等实用研究手段，该技术已在观察细菌活性及活体动物体内肿瘤细胞的定位、生长、转移及治疗等方面得到广泛应用。双乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）是Rotman和Papermaser于1966年发现的一种荧光染料，该染料本身不发荧光，但它渗入活细胞内并被酯酶分解后生成荧光素，在蓝色光激发下显示强的黄绿色荧光，经LCSM或荧光显微镜即可检测。死细胞由于没有酯酶活性而不显示荧光。此方法具有快速、简便、灵敏等优点，近年来在细胞活力及肿瘤细胞实时检测方面有诸多的应用。
目前尚未有将FDA荧光染色法应用于畜肉腐败菌原位实时检测的相关报道。
发明内容
鉴于上述现有技术发展情况，本发明的目的就是要提供一种畜肉腐败菌原位荧光染色实时快速检测的方法。将猪肉冷冻后在同一位置连续切成薄片置于载玻片上，采用荧光染料对畜肉中的腐败菌进行原位荧光标记，通过荧光强度定量计算猪肉组织单位面积中腐败菌相对数量，便于观察和跟踪腐败菌在畜肉腐败过程的动态变化，为进一步深入研究畜肉的腐败变质机理及其腐败菌的相应控制提供一种简便可行的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明所述的一种畜肉腐败菌原位荧光染色的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待测肉样切片：从待检畜肉中切取一小块肉样，用冷冻切片机在同一位置连续切成一定厚度的多个薄片置于干净载玻片上；
（2）FDA的配制和染色：用丙酮配制0.5mg/mL的FDA溶液，并滴加到猪肉切片（覆盖整个猪肉切片）中在室温暗处染色15分钟后，滴加甘油与PBS混合液（9：1）并用盖玻片对猪肉切片进行封片；
（3）LSCM检测：将染色封片后的猪肉切片倒置于LSCM中进行断层扫描检测，激发光波长为488nm，发射光波长为530nm，选取同样的放大倍数、激光功率、光电倍增管的增益（PMT）、扫描强度等条件，调焦获取清晰图像，可观察到侵染有腐败菌的猪肉组织部位呈现黄绿色荧光。每个切片测量5个视野，拍摄保存图像，并计算平均荧光强度代表猪肉组织该切片部位单位面积相对的细胞数量。可实时地观察和跟踪腐败菌在猪肉组织的分布、侵染情况及其动态变化。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种畜肉腐败菌原位荧光染色的快速检测方法。在不破坏畜肉样本的前提下，实现畜肉腐败菌的快速检测。本发明操作简单、检测速度快、无危害性，在不破坏生理状态下利用荧光染料对腐败菌活体进行原位荧光染色，利用LSCM扫描拍摄图像，并计算平均荧光强度代表猪肉组织该切片部位单位面积相对的细胞数量。本发明能实时地观察和跟踪腐败菌在猪肉组织的分布、侵染情况及其动态变化。为进一步深入研究畜肉的腐败变质机理，以更有针对性地对腐败菌加以控制，为延长肉品货架期，保障肉品品质安全，维护消费者健康有着直接的现实意义。
附图说明
图1是激光共聚焦扫描显微镜下观察染色后的P.koreensis PS1效果图。
图2是激光共聚焦扫描显微镜下观察接种有P.koreensis PS猪肉切片荧光染色及区域放大效果图。
图3是激光共聚焦扫描显微镜下观察接种有P.koreensis PS1猪肉切片不同深度肌纤维荧光染色效果图。
图4是激光共聚焦扫描显微镜下观察接种有P.koreensis PS1猪肉切片不同深度脂肪细胞荧光染色效果图。
具体实施方式
本发明对畜肉腐败菌原位实时检测具有通用性，但由于畜肉及腐败菌种类较多，因此本发明只以里脊猪肉和优势腐败菌Pseudomonas koreensis PS1的检测为实施实例，其它畜肉腐败菌检测可参照该实施实例的方法，具体针对所测畜肉腐败菌污染情况，选取适当的待测样本，对其冷冻切片FDA荧光染色后LSCM扫描检测。
实例实施步骤结合附图进行详细描述。
实施例一
将从变质猪肉中分离鉴定保存的优势腐败菌P.koreensis PS1（该菌种已被Soon Wo Kwon，M.Hultberg和龚凤娟等人报道；Pseudomonas koreensis sp.nov.,Pseudomonas umsongensis sp.nov.and Pseudomonas jinjuensis sp.nov.,novel species from farm soils in Korea；Internationa lJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2003)，53，21-27)。先将该菌种在大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA培养基）试管斜面中培养活化，并用无菌水制成104~105CFU/mL的细胞悬液；同时割取大小约3cm×3cm×2cm的里脊猪肉样本，于菌液中浸泡10s进行接种，沥干后取出放入无菌塑料袋中密封于4℃冰箱保存。
用冷冻切片机从接种有优势腐败菌P.koreensis PS1的肉样表面切取厚度60μm的薄片，置于干净载玻片上，同时将优势腐败菌P.koreensis PS1细胞悬液涂在载玻片上，分别滴加0.5mg/mL FDA染料将其覆盖，在室温暗处染色15分钟后，滴加甘油与PBS混合液（9：1）并用盖玻片对猪肉切片进行封片。然后将染色切片倒置于LSCM中进行断层扫描检测，激发光波长为488nm，发射光波长为530nm，选取合适放大倍数、激光功率、光电倍增管的增益（PMT）、扫描频率等，调焦获取清晰图像拍摄保存。可得到优势腐败菌P.koreensis PS1经FDA染色后呈现明显黄绿色荧光（图1）。以及可看出接种有P.koreensis PS1的肉样经FDA染色后，猪肉组织含菌部位也同样出现黄绿色荧光（图2），从图2局部区域放大可看出，优势腐败菌P.koreensis PS1较多分布在猪肉组织的细胞间隙处，且其数量越多发出的黄绿色荧光越强。
将4℃冰箱保存3天接种有优势腐败菌P.koreensis PS1的猪肉里脊和五花肉样本，分别用冷冻切片机在肉样中同一位置连续切成厚度60μm的薄片，置于干净载玻片上，滴加0.5mg/mLFDA染料覆盖整个猪肉切片，在室温暗处染色15分钟后，滴加甘油与PBS混合液（9：1）并用盖玻片对猪肉切片进行封片。然后将染色切片倒置于LSCM中进行断层扫描检测，激发光波长为488nm，发射光波长为530nm，选取合适放大倍数、激光功率、光电倍增管的增益（PMT）、扫描频率等，调焦进行断层扫描拍摄保存图像,图像以1024×1024像素JPG和LIF两种格式保存。经分析得到不同深度猪肉肌纤维和脂肪细胞所含优势腐败菌P.koreensis PS1染色的荧光效果图（图3和图4）。可见，利用本发明方法可以实时地观察和跟踪腐败菌在猪肉组织的分布、侵染情况及其动态变化。
Claims (3)
1.一种针对畜肉所含腐败菌原位荧光染色的快速检测方法，按照以下步骤进行：
待测肉样切片：从待检畜肉中切取一小块肉样，用冷冻切片机在同一位置连续切成一定厚度的多个薄片置于干净载玻片上；
荧光染料配制和染色：用丙酮配制浓度为0.5mg/mL的荧光染料溶液，并滴加到猪肉切片中，使溶液覆盖整个猪肉切片，在室温暗处染色15分钟后，再滴加甘油与PBS体积比为9：1的混合液并用盖玻片对猪肉切片进行封片；
激光共聚焦扫描显微镜检测：将染色猪肉切片倒置于激光共聚焦扫描显微镜中，用激发光激发，并选取同样检测条件，调焦进行断层扫描拍摄保存图像，可观察到侵染有腐败菌的猪肉组织部位呈现黄绿色荧光；即达到实时观察和跟踪腐败菌在猪肉组织的分布、侵染情况及其动态变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光染料是双乙酸荧光素。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件是使用激光共聚焦扫描显微镜的激发光波长为488nm，发射光波长为530nm，放大倍数选10×10，激光功率选最大功率的60%，光电倍增管的增益选750V, 以xyz为扫描模式，设定分辨率1024×像素，扫描速度为200Hz，针孔大小、线平均、面平均参数均为默认值。
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