JP2006325549A

JP2006325549A - 細菌検査方法

Info

Publication number: JP2006325549A
Application number: JP2005157494A
Authority: JP
Inventors: Chikanobu Hoshino; 京延星野; Masanori Mito; 雅徳三戸; Tetsuo Kasuya; 哲夫糟谷
Original assignee: THK Co Ltd; Beldex Corp
Current assignee: THK Co Ltd; Beldex Corp
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2006-12-07

Abstract

【課題】培養時間を大幅に短縮できる新たな細菌検査方法を提供する。
【解決手段】本発明の細菌検査方法は、細菌を採取する工程（Ｓ１）と、目視できるまでの所定の時間細菌を培養すると、肉眼でコロニーの数をカウントできない程度にコロニーの密度が高くなるように、細菌を低い希釈倍率で希釈する希釈工程（Ｓ２）と、得られた試料液を培地に加えて、目視できるまでの所定の培養時間未満細菌を培養して培養段階の早期のコロニーを得る培養工程（Ｓ３）と、高倍率のレンズを有するコロニーカウンタを用いて、培地の一部の測定エリア内のコロニーの数をカウントし、カウントしたコロニーの数に（培地の全エリアの面積Ａ／測定エリアの面積Ａ１）を乗ずるカウント工程（Ｓ４）と、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、食品業界において、生菌の数をカウントすることを目的として行なわれる細菌検査方法に関する。

食品業界では、食品衛生法により生菌数を把握することが義務付けられていて、食品衛生法で定められる検査を実施しなければいけない。寒天培地で細菌を所定の時間培養し、細菌が生きている証拠として出現してくるコロニーを目視で検査することは、生菌検出を目的とした最も確実な細菌検査方法の一つである。

食品業界で行なわれているこの種の細菌検査方法には、食品に含まれる細菌を検査する場合、食品製造環境（包丁、まな板）の細菌を検査する場合等がある。食品に含まれる細菌検査を行なう場合は、滅菌済袋に食品と滅菌生理食塩水または滅菌水を加えて均質化し、得られた懸濁液を適宜希釈して試料液として用いる。そして、寒天培地等の培地に試料液を加え、一定時間保温して菌を培養（すなわち目視できるまで菌群を増殖）させる。得られたコロニー（菌群の培地上の肉眼で見える集まり）の数を、目視又は画像処理設備によって数える。食品製造環境の細菌検査を行なう場合は、食品製造環境を滅菌ガーゼや滅菌綿棒等により拭き取り、拭き取ったガーゼ等を滅菌生理食塩水または滅菌水等に懸濁し、得られた懸濁液を適宜希釈して試料液として用いる。以上に記載のような細菌検査方法は、例えば特許文献１に記載されている。

国際公開ＷＯ０１／４４４３７号公報（２３頁）

スーパーマーケットや百貨店等の食品メーカは、食品衛生法に定められた衛生上の基準をクリアしているかどうかを、検査受託会社に検査依頼している。しかし、食品メーカが検査受託会社に検査依頼すると、検査結果を得るまでに時間がかかるという問題があった。食品衛生検査指針には、菌群が目視できるまでに増殖するだけの培養時間が定められ、例えば一般生菌を培養するときは２４時間、抗生物質を用いて特定の細菌を培養するときは４８時間、あるいはそれ以上の培養時間が定められている。食品衛生検査指針に基づいて検査する場合にはこの培養時間を待たなければならない。このため、特に鮮度が必要な食品等については、食品メーカでも実施できる簡易且つ迅速な細菌検査方法が望まれている。

培養時間を短くするために、培地に振動を加えたり、加熱したりする技術が知られているが、設備が高価なので、食品メーカで導入することは難しい。また、コロニーを発色させて菌を迅速に特定する培地も、上述の特許文献１などに開示されているが、この培地を使用しても数時間しか培養時間を短縮できない。

そこで本発明は、培養時間を大幅に短縮できる新たな細菌検査方法を提供することを目的とする。

コロニーは時間に比例して大きくなる。本発明者は、培養段階早期の小さいコロニーの数を測定しても、目視できるまで大きく成長させたコロニーを測定する場合とほぼ同じ結果が得られることを知見した。そして、培養段階早期の小さいコロニーの数を測定するための細菌検査方法を考案した。

具体的には、請求項１に記載の発明は、細菌を培地で培養して得られるコロニーの数をカウントする細菌検査方法において、コロニーとして目視できるまで所定の培養時間細菌を培養すると、肉眼でコロニーの数をカウントできない程度にコロニーの密度が高くなるように、細菌を低い希釈倍率で希釈する希釈工程と、得られた試料液を培地に加えて、前記所定の培養時間未満細菌を培養して、培養段階の早期のコロニーを得る培養工程と、高倍率のレンズを有するコロニーカウンタを用いて、前記培地の一部の測定エリア内のコロニーの数をカウントし、カウントした前記コロニーの数に（培地の全エリアの面積／測定エリアの面積）を乗ずるカウント工程と、を備えることを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の細菌検査方法において、前記培地は寒天培地であり、前記カウント工程では、前記コロニーカウンタを用いて、前記培地に光を透過させて前記コロニーの数をカウントすることを特徴とする。

請求項１に記載の発明によれば、培養時間を大幅に短縮することができる。また、レンズと培地との間のワークディスタンスが短くなるので、コロニーカウンタが小型になる。

請求項２に記載の発明によれば、早期の培養段階の小さいコロニーの数を測定し易くなる。

以下本発明の一実施形態における細菌検査方法の一実施形態を説明する。図１は、細菌検査方法の工程図を示す。この検査方法では、食品製造環境（例えば包丁、まな板）に付着した一般生菌や大腸菌等の細菌の数が食品衛生法に定められた基準置以下であるかどうかを検査する。

本実施形態の細菌検査方法は、拭き取りによる細菌の採取工程（Ｓ１）と、採取した細菌の密度を調整する希釈工程（Ｓ２）と、細菌を寒天培地に加えて培養する培養工程（Ｓ３）と、培養したコロニーの数をカウントするカウント工程（Ｓ４）を備える。以下に各工程を順次説明する。

細菌の採取工程（Ｓ１）
まず、包丁、まな板等の食品製造環境を滅菌綿棒１や滅菌ガーゼにより万遍なく拭き取る。拭き取る目安は例えば１００ｃｍ^２であり、最終的には例えば１００ｃｍ^２あたりのコロニー数がカウントされる。次に、滅菌綿棒１や滅菌ガーゼを滅菌生理食塩水または滅菌水等に懸濁して細菌を均質化させる。これにより細菌の原液が得られる。ここで、滅菌生理食塩水が溜められた容器に滅菌綿棒が組み込まれた拭き取りキットを用いてもよい。

細菌の希釈工程（Ｓ２）
得られた原液を希釈する。ここでは、得られた原液にバッファと呼ばれる希釈液を注入して原液を薄める。具体的には、ウェル２に希釈液としての生理食塩水３を溜め、スポイト４からウェル２に原液を注入する。ウェル２内で原液と生理食塩水が混ざり、原液が薄められる。生理食塩水３で薄められた原液をスポイト４で再び吸い上げ、別のウェル２に注入すると、さらに原液が薄められる。ウェル２に溜められた生理食塩水３の量と注入した原液の量から、希釈倍率が算定される。

従来の検査方法では、コロニー密度があまりにも高いと肉眼でカウントすることができないから、肉眼でコロニーの数をカウントできる程度のコロニー密度になるように希釈倍率のほどよいところを見つけていた。すなわち、肉眼でコロニーをカウントできることが希釈倍率を決める上での要因になり、肉眼でコロニーの数をカウントできる程度に希釈倍率を決めていた。これに対して、本実施形態では、肉眼でコロニーの数をカウントできない程度に希釈倍率を下げて、コロニーの密度を高くしているのを特徴にしている。これは、培養段階の早期の小さなコロニーをカウントするからできることである。

細菌の培養工程（Ｓ３）
希釈された試料液をスポイト４で吸い上げ、寒天培地５に所定量滴下する。滴下後、試料液を培地全体に万遍なく塗りつける。培養時間は、目視できるまでコロニーが成長する所定の培養時間未満に設定される。食品衛生検査指針には、菌群が目視できるまでに増殖するだけの培養時間が定められ、例えば一般生菌を培養するときは２４時間、抗生物質を用いて特定の細菌を培養するときは４８時間、あるいはそれ以上の培養時間が定められている。これに対して、本実施形態では、培養の早期の段階でコロニーの数をカウントするので、食品衛生検査指針で定められる培養時間の半分以下の培養時間を設定する。例えば、一般生菌を培養するときは１０時間以下の培養時間になる。

コロニーのカウント工程（Ｓ４）
高倍率のレンズを有するコロニーカウンタ（図４参照）を用いて、培地の一部の測定エリア内のコロニーの数をカウントする。コロニーカウンタの詳細については後述するが、ＣＣＤカメラ等で培地の一部の測定エリアのデジタル画像を取得し、該デジタル画像を画像処理してコロニー数をカウントする。培地内の一部の測定エリアをカウントするので、測定したコロニーの数に（培地の全エリアの面積Ａ／測定エリアの面積Ａ１）を乗じて、培地全体のコロニー数とする。例えば、培地の全エリアの１／２０の面積を測定したのならば、コロニー数に２０を乗じて培地全体のコロニー数とする。最終的に、この培地全体のコロニー数に希釈倍率を乗ずると、食品製造環境１００ｃｍ^２あたりのトータルのコロニー数が得られる。なお、目視できなくても拡大鏡を使用すればコロニー数をカウントできる場合には、コロニーカウンタを使用することなく、人手でコロニー数をカウントしてもよい。

図２及び図３は、食品衛生検査指針に簡易・迅速検査法として収載される乾式培地を示す。寒天培地の替わりに、このような乾式培地を使用してもよい。この乾式培地の培養器は、水溶性高分子化合物層６上に多孔質マトリックス層７が積層された形態である。培養器は、粘着シート８の中心部に多孔質マトリックス層７が上になるように接着剤により接着される。培養器の上には、培養器よりも大きな透明フィルム９が多孔質マトリックス層７に接するように被せられる。透明フィルム９の培養器からはみ出している部分は、粘着シートに接着される。

図３に示されるように、多孔質マトリックス層７上に試料液を添加すると、試料液が一旦多孔質マトリックス層７に保持される。この保持された水により、多孔質マトリックス層７に接した高分子化合物層６が溶解し、生じた水溶性高分子化合物水溶液と、高分子化合物層に含まれる生育栄養成分によって細菌の生育しうる環境となり、細菌の生育分裂が開始される。試料液中に存在する細菌は、試料液と共に多孔質マトリックス層７全体に均一に分散する。水溶性化合物層は徐々に溶解し、高粘度水溶液を形成する。この高粘度水溶液により高分子化合物層６と多孔質マトリックス層７とが一体化する。このため、図２に示されるように、細菌は高分子化合物層６内部までは侵入せず、多孔質マトリックス層７の表面まで押し上げられ、多孔質マトリックス層７の表面又は表面近傍にコロニーが形成される。一般生菌の替わりに大腸菌等の特定の細菌を検査する場合には、高分子化合物層６に発色剤、選択剤が添加される。以上に記載のような乾式培地としては、「サニ太くん」（登録商標）を用いることができ、その構成は例えば国際公開番号ＷＯ０１／４４４３７号公報に詳細に記載されている。

図４は、コロニーのカウント工程（Ｓ４）で使用されるコロニーカウンタを示す。コロニーカウンタは、培地１１が載せられる台座１２と、台座１２に立設される支柱１３に支持され、培地を撮影するＣＣＤカメラ等のカメラ１４と、カメラ１４に取り付けられる高倍率のレンズ１５とを備える。このカメラ１４は、パソコン等の画像処理コンピュータに接続される。外乱光が問題になる場合には、必要に応じて培地１１の上に図５に示されるフード１６を配置する。レンズ１５としては複数の倍率のものが用意される。高倍率のレンズ１５を使用すると、レンズ１５と培地１１との間のワーキングディスタンスを短くすることができ、コロニーカウンタが小型化する。

図６は、寒天培地５を通して光を照射し、コロニーの影を半導体素子が基盤の目のように並んだカメラ１４に投影させた例を示す。小さいコロニーの影を更にそれよりも小さい素子から構成されるカメラ１４に投影させて画像を取得する。寒天培地の場合は、透過光により投影させることで、コロニーの数を測定することができる。

図７は、画像処理システムの構成図を示す。デジタル化された画像データであるデジタル画像はカメラ１４から画像処理用コンピュータ１８（コンピュータ）に入力される。ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体１９には、画像処理用コンピュータ１８に、コロニーのデジタル画像を取得してコロニー数をカウントするためのプログラムが記録されている。このプログラムは画像処理用コンピュータ１８のメモリ１８ａにロードされる。オペレータが画像処理用コンピュータ１８を操作できるように、画像処理用コンピュータ１８にはキーボード２０、マウス２１が設けられる。またデジタル画像を表示できるように、画像処理用コンピュータ１８には液晶表示装置、ＣＲＴ等の表示装置２２や、プリンタ２３等が設けられる。

図８は画像処理用コンピュータで実行される画像処理手順のフローチャートの一例を示す。まず、画像処理用コンピュータ１８は、カメラ１４で撮影されたデジタル画像を受信する（Ｓ１）。得られた画像は光の強度分布を表す輝度値の画像データとして、フィルタリング後、画像メモリに書き込まれる。次に、オペレータは、培地内の測定エリア及び測定エリアの面積を指定する（Ｓ２）。続けてオペレータは、与えられたデジタル画像の濃淡からしきい値を設定する（Ｓ３）。画像処理用コンピュータは、設定されたしきい値に基づいて画像を二値化（白か黒かの二値）し、与えられたデジタル画像からコロニーの部分だけを抽出する（Ｓ４）。次に、抽出されたコロニーの二値画像から、コロニーの数をカウントする（Ｓ５）。カウントされたコロニーは、表示装置２２上で枠で囲まれる。コロニー数をカウントする際、コロニーが近接している場合には、コロニー数が２個なのに１個とカウントされてしまう。この問題を解決するため、オペレータが表示装置２２上を見てマウス等を操作して計測されたコロニー数を増減・修正する（Ｓ６）。以上により、培地の測定エリアのコロニー数がカウントされる。測定したコロニーの数に（培地の全エリアの面積Ａ／測定エリアの面積Ａ１）を乗じて培地全体のコロニー数とする。

なお本発明は上記実施形態に限られることなく、種々変更可能である。例えば、本発明の検査方法は、細菌を培地で培養する検査であれば、食品製造環境の細菌検査に限られることなく、食品に含まれる細菌検査にも適用することができる。

本発明の一実施形態における細菌検査方法の工程図。乾式培地を示す断面図。乾式培地に試料を注入する状態を示す斜視図。コロニーカウンタを示す斜視図。コロニーカウンタで使用されるフードを示す斜視図。寒天培地に透過光を照射してコロニーの画像を得る例を示す斜視図。画像処理システムの構成図。画像処理用コンピュータで実行される画像処理手順のフローチャート。

符号の説明

Ｓ１…細菌の採取工程
Ｓ２…細菌の希釈工程
Ｓ３…細菌の培養工程
Ｓ４…コロニーのカウント工程

Claims

細菌を培地で培養して得られるコロニーの数をカウントする細菌検査方法において、
コロニーとして目視できるまで所定の培養時間細菌を培養すると、肉眼でコロニーの数をカウントできない程度にコロニーの密度が高くなるように、細菌を低い希釈倍率で希釈する希釈工程と、
得られた試料液を培地に加えて、前記所定の培養時間未満細菌を培養して、培養段階の早期のコロニーを得る培養工程と、
高倍率のレンズを有するコロニーカウンタを用いて、前記培地の一部の測定エリア内のコロニーの数をカウントし、カウントした前記コロニーの数に（培地の全エリアの面積／測定エリアの面積）を乗ずるカウント工程と、を備えることを特徴とする細菌検査方法。
前記培地は寒天培地であり、
前記カウント工程では、前記コロニーカウンタを用いて、前記培地に光を透過させて前記コロニーの数をカウントすることを特徴とする請求項１に記載の細菌検査方法。