CN104237180A - 一种快速验证灭菌效果的生物阅读器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，主要由激发光源、荧光滤片系统、光学信号采集系统、荧光生物指示剂、温控系统、图像处理系统、输出结果组成。其主要原理和工作过程是：将经过灭菌处理的生物指示剂插入本发明，在合适的温度和培养液中芽孢萌发剂的作用下，芽孢开始萌发，并产生一种活性酶与培养基中添加的荧光物质发生反应，激发光源发出特定波长的激发光并照射荧光生物指示剂，荧光生物指示剂中的荧光物质经激发后，发出特定波长的荧光被数字化高灵敏度CCD所捕获并成像，图像处理系统对采集的图像信息进行处理并对比分析，短时间内判断出灭菌是否有效的结果。

Description

一种快速验证灭菌效果的生物阅读器

一、所属技术领域

本发明涉及一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，特别涉及一种用光学显微技术和图像处理技术来检测灭菌是否合格的方法。

二、背景技术

自1880年查尔斯·张伯伦生产了第一台压力蒸汽灭菌器以来，研究人员就一直致力于发现能够监测灭菌效果的方法。为了能够方便和快速地检测到灭菌操作过程中所出现的灭菌问题，生物指示物获得了极大的发展。目前生物指示剂被广泛应用于测试灭菌方法的有效性，通常情况下，将含有微生物孢子的生物指示剂暴露于某种灭菌剂，然后将暴露处理过的孢子置于能够维持孢子发芽和微生物生长的环境中，从而确定暴露处理过的孢子的存活率，一般情况下，孢子比绝大多数的微生物更耐灭菌过程，因此认为，能够杀死微生物孢子的灭菌方法同样可以杀死其它任何污染的微生物。

医院感染控制传统采用对生物指示剂进行培养并检测PH值是否改变的方式，其原理为：生物指示剂由载有细菌芽孢的菌片及内含培养液的安瓿瓶组成，灭菌结束后，挤碎安瓿瓶，使菌片与培养液充分接触。根据灭菌是否成功，会出现以下两种情况：若灭菌失败，芽孢并未全部死亡，则芽孢与培养液接触后会有细菌生长，细菌生长时会排泄出酸性或碱性的物质，这些物质会改变培养液的ph值，使培养液中所含的酸碱指示物变色。若灭菌成功，细菌芽孢已全部死亡，则细菌芽孢与培养液接触后不会有细菌生长，培养液本身的ph值不会改变，因此培养液的颜色不会发生变化，依然保持原来的颜色，以此来判定灭菌成功。

上述的这种常规方法需要24～48小时的培养，才能评估灭菌效果的有效性，这种方法传统而有效，但存在的问题是所需时间过长，这显然不能满足医院迫切需要知道灭菌结果的需求，所以，对能够准确、快速判断灭菌是否合格是医疗机构普遍存在的需求，如何在较短时间内判定灭菌的有效性一直是感控领域的难题。

三、发明内容

本发明针对以上技术问题提供了一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，主要由激发光源、荧光滤片系统(包括激发滤片、阻断滤片)、光学信号采集系统(高灵敏度CCD)、荧光生物指示剂、温控系统、图像处理系统、输出结果组成：

1)荧光生物指示剂的荧光信号强度的质量与激发光源的强度、波长有很大关系，本发明所选择的激发光源为高压汞灯，高压汞灯能以最小的表面积释放出最大数量的短光波，而且亮度大、性能稳定。

2)荧光滤片系统的激发滤片装在激发光源和荧光生物指示剂之间的滤片滑板中，其作用是吸收光源中波长较长的可见光，允许短于一定波长的光波通过，作为快速验证灭菌效果的生物阅读器的激发光。

3)荧光滤片系统的阻断滤片装在荧光生物指示剂和光学信号采集系统之间的光路滑板中，其作用是过滤背景干扰光强信号，只允许生物指示剂被激发后所产生的荧光通过，以获得高清晰的荧光图像。

4)光学信号采集系统由数字化高灵敏度CCD组成，位于阻断滤片之后，其作用是对所激发的荧光信号进行捕捉并成像。

5)图像处理系统的工作过程包括以下步骤：图像存储、信号放大、图像预处理(包括图像的平滑、锐化和直方图化)、图像的对比分析和判断。

6)荧光生物指示剂由透明容器、含有芽孢的菌片和培养基组成，菌片上的芽孢可以是嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或是以上菌体的组合，且在培养基中含有细菌芽孢萌发促进剂、营养物及荧光物质。

7)温控系统可以根据荧光生物指示剂的种类进行温度调节，维持荧光生物指示剂中所含芽孢的正常萌发、生长所需的温度。

8)输出结果：对经过图像处理系统所得出的灭菌是否有效的判断结果进行输出，输出装置可以为蜂鸣器、打印设备、显示器等，也可以是以上几种装置的组合形式。

光学信号采集系统、图像处理系统的主要工作步骤和作用过程，具体描述如下：

1)信号的采集与输入

信号采集与输入的具体过程为荧光生物指示剂经激发光源激发后发出荧光，该荧光通过阻断滤片，阻断滤片对其背景干扰信号进行过滤，最终光学信号采集系统(高灵敏度CCD)捕捉到荧光信号并形成荧光图像传输到图像处理系统的存贮器中。该光学信号采集系统的信号采集每间隔一段时间进行一次，以备对图像信号的变化与时间的关系进行分析。

2)荧光图像的预处理

输入到图像处理系统中的荧光图像，通常是模糊的荧光团，如同蒙上了一层薄雾，此时的图像往往包含了各类噪声甚至伴随着失真、模糊等现象，图像质量并不符合图像分析的要求，需要进行预处理，图像预处理的主要任务是去除噪声、图像增强和图像复原，并使图像变换成标准形式，使特征提取、识别、测量变得简单易行，图像增强将感兴趣信息突出，抑制或去除不需要的信息，以提高图像使用价值，主要包括图像的平滑，锐化等过程。

a)图像的平滑，实际获得的图像在形成、传输、接收和处理过程中，不可避免地存在内部和外部的干扰，图像平滑的目的是去除噪声改善图像质量，图像受到的噪声干扰来自成像系统的各个环节，应根据图像噪声的性质，针对特定的噪声模型，选择相应的图像平滑算法，图像的平滑可以在空间域进行，也可以在频率域进行，在空间域，可采用多幅图像平均、领域平均法和中值滤波法等实现去噪声，在频率域，噪声主要对应于频谱中的高频分量，适当衰减高频分量和保留低频分量，即可达到去除噪声的效果。

b)图像的锐化处理主要用于增强图像中的轮廓边缘、细节以及灰度跳变部分，形成完整的物体边界，达到将目标从图像背景中分离出来或将表示同一目标表面的区域检测出来的目的，从空间域的处理角度出发，采用微分法，如梯度法、Roberts算子、Sobel算子以及Laplacian算子等，将空间域的图像通过傅里叶变换成频率域，由于图像中的边缘对应于频谱中的高频分量，因此采用高通滤波器让高频分量通过，而抑制低频分量，可使图像的边缘变得更清楚，从而实现图像的锐化。

3)对图像的对比分析和判断

图像处理系统对经过预处理的荧光图像信息做更进一步处理，实现数字化，最终荧光图像根据光强度被转化为0～255之间的灰度值，图像处理系统中数字图像的像素颜色的深浅程度是用灰度来表示的，一般将灰度值0对应于黑点，将灰度值255对应白点，按照这样的约定，灰度值越小则目标越暗淡，或者采用相反的约定，灰度值越小则目标越明亮。对一幅图像所包含的全体像素的灰度值做统计，用横坐标表示灰度值，纵坐标表示图像中具有该灰度值的像素数目，或表示具有某一灰度值的像素数目在总的像素数目中所占的比例，这样绘制的曲线称为图像的灰度分布直方图(可简称灰度直方图)，灰度直方图反映了一幅图像中灰度值和出现这种灰度值的概率关系，反映图像明暗程度、细节清晰度和动态范围等图像的整体性质。将每一时间点采集的荧光图像信息进行直方图化，并对其进行比对分析，在一定的时间范围内(2h或3h)，如有芽孢萌发或微生物生长，在激发光的激发下，荧光生物指示剂会产生荧光，而且荧光强度会随微生物数量的增长而不断增大，其荧光图像的灰度直方图也会发生相应的变化，经图像处理系统对其进行对比、分析、判断，可得到阳性结果；反之，如果在灭菌过程中芽孢全部被杀灭，荧光生物指示剂则无荧光产生或只有背景荧光，其光强度不发生变化，荧光图像的灰度直方图也会在一定的范围内保持不变，因此就可判断得出阴性结果。

本发明的原理和主要工作过程：将经过灭菌处理的生物指示剂挤碎，按操作规程要求插入快速验证灭菌效果的生物阅读器，在合适的温度和培养液中芽孢萌发剂的作用下，芽孢开始萌发并繁殖，并产生一种活性酶与培养基中添加的荧光物质发生反应，此时快速验证灭菌效果的生物阅读器中的激发光源发出特定波长的激发光并照射荧光生物指示剂，荧光生物指示剂中的荧光物质经激发后，发出特定波长的荧光并被本发明的光学信号采集系统的高灵敏度CCD所捕获并成像，该信号采集动作每隔一个时间周期进行一次，并将形成的图像传递给图像处理系统的存储器进行存储。图像处理系统对不同时间采集的图像信息进行处理和对比分析，便可得到是否有芽孢萌发或细菌生长，由此得出细菌是否被彻底杀灭的结论。

本发明的有益效果：本发明与传统验证灭菌效果的检测方法相比，所需时间由原来的24-48h缩短至2-3h，大大提高了灭菌结果检测效率，解决了传统灭菌检测方法所存在的需求与检测结果相脱节的矛盾，加快了医院医疗器械的灭菌结果检测时间，提高了医疗器械的发放速度，同时也为灭菌过程中所出现问题的及时解决和早期预防提供了便利。

四、附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是图像处理系统的工作过程示意图。

五、具体实施方式

取一定数量的生物指示剂对其进行灭菌处理，以压力蒸汽灭菌方式为例，灭菌温度设为121℃，灭菌时间分为3min和20min两组，而且每组里都选定相同数量和同种类的生物指示剂。同时，对每组都准备一个经过相同方式灭菌处理的对照组。按照美国药典、ISO11138-2、GB18281-2等标准中关于压力蒸汽生物指示剂的规定，其存活时间应大于等于3.9min，杀灭时间应小于19min，所以经121℃，3min灭菌后生物指示剂中应还有芽孢存活，以此模拟灭菌失败的情况，而灭菌20min后，芽孢应全部被杀死，以此作为灭菌成功的样品组。对以上组分别灭菌处理完毕后，打开快速验证灭菌效果的生物阅读器的电源，通过温控系统调节好适宜芽孢繁殖的温度，依次将各非对照组的生物指示剂用专用挤碎器挤碎，放入快速验证灭菌效果的生物阅读器进行培养，光学信号采集系统每隔单位时间自动对荧光生物指示剂进行扫描采集图像信息；图像处理系统对每个时间点提取的图像提取特征参数并进行比对分析，短时间(2h-3h)内得出各组别生物指示剂的阴性或阳性的结果。依次准确记录好各组别生物指示剂的阴性或阳性的结果。另外，将对照组的生物指示剂按传统检测灭菌结果的方式培养24-48h，以传统的检测PH值是否改变的方法再对其进行观察，也依次记录好各组别生物指示剂的PH值变色管显示的结果，对比非对照组和对照组两种检测结果是否一致，也就是对比本发明和传统方法两种检测结果是否一致，以确定快速验证灭菌效果的生物阅读器的检测结果是否准确、有效。实验结果表明：采用本发明所描述的灭菌指示结果与传统检测PH值改变与否的方法检测结果完全一致。因此可用本发明代替传统的灭菌检测方法，在短时间内指示灭菌效果是否合格。

Claims (8)

1.一种快速验证灭菌效果的生物阅读器主要由激发光源、荧光滤片系统(包括激发滤片、阻断滤片)、光学信号采集系统(高灵敏度CCD)、荧光生物指示剂、温控系统、图像处理系统和输出结果组成。

2.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的荧光生物指示剂由透明容器、含有芽孢的菌片和培养基组成，且在培养基中含有细菌芽孢萌发促进剂、营养物及荧光物质。

3.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的光学信号采集系统由数字化高灵敏度CCD组成，位于阻断滤片之后，其作用是对所激发的荧光信号进行捕捉并成像。

4.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的图像处理系统的工作过程包括以下步骤：图像存储、信号放大、图像预处理(包括图像的平滑、锐化和直方图化)、图像的对比分析和判断。

5.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的激发光源选择的是高压汞灯。

6.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的荧光滤片系统的激发滤片装在激发光源和荧光生物指示剂之间的滤片滑板中。

7.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征在于：所述的荧光滤片系统的阻断滤片装在荧光生物指示剂和光学信号采集系统之间的光路滑板中。

8.如权利要求1所述的一种快速验证灭菌效果的生物阅读器，其特征还在于：所述的温控系统可以根据荧光生物指示剂的种类进行温度调节，维持荧光生物指示剂中所含芽孢的正常萌发、生长所需的温度。