ES2325931T3 - Utilizacion del analisis por citometria de flujo para optimizar las estrategias de almacenamiento en bancos de celulas para celulas cho. - Google Patents
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Abstract
La utilización de anexina V en un proceso de caracterización de un banco de células criopreservadas de células CHO tras la descongelación.
Description
Utilización del análisis por citometría de flujo
para optimizar las estrategias de almacenamiento en bancos de
células para células CHO.
La presente invención está relacionada con la
producción de biofármacos en células CHO. Particularmente, está
relacionada con la generación de bancos de células de reserva, de
trabajo y de postproducción de alta calidad mediante la
criopreservación. Más particularmente, está relacionada con la
propagación y caracterización de células criopreservadas en bancos
de células de reserva, de trabajo y de postproducción. Además, la
presente invención se refiere a nuevas estrategias que utilizan el
análisis de citometría de flujo (CF) en células teñidas con anexina
V para la caracterización de bancos de células criopreservadas con
un alto rendimiento.
El mercado de los biofármacos que se utilizan
para la terapia humana ha continuado creciendo a un ritmo muy
elevado en la última década. Las líneas celulares CHO son uno de los
sistemas de expresión en mamíferos más atractivos debido a aspectos
de su producción, seguridad y regulatorios. Para asegurar productos
terapéuticos de calidad uniforme, el sistema de almacenamiento en
bancos de células de estas líneas celulares es crucial. La creación
de bancos de células de reserva (BCR), bancos de células de trabajo
(BCT) y bancos de células de postproducción (BCPP) de células CHO
son pasos esenciales en el desarrollo de los procesos de producción
de biofármacos en estas líneas celulares. La calidad de estos bancos
es crítica, ya que su generación no sólo es necesaria para el
desarrollo clínico del producto sino que también, en último lugar,
durante la fase de abastecimiento del mercado.
El parámetro principal que caracteriza la
calidad de un banco de células es la supervivencia a largo plazo de
las células cultivadas tras la descongelación. Además, aparte de la
supervivencia a largo plazo, también son propiedades esenciales la
robustez y estabilidad de un banco de células adecuado. El tiempo
necesario desde la descongelación de un vial hasta que se
establecen cultivos de inóculo de crecimiento robusto, estabilidad
genética y elevada viabilidad del cultivo es crítico para valorar la
calidad de un banco de células. Finalmente, un banco de células de
elevada calidad debe garantizar que todos estos parámetros
permanecen estables a lo largo de un periodo de almacenamiento
prolongado del banco. Todas estas características dependen en gran
parte del método de criopreservación para la producción de una
línea celular determinada.
Actualmente un número creciente de biofármacos
se produce a partir de células CHO debido a su capacidad de
procesar y modificar correctamente las proteínas humanas. La primera
generación de procesos de producción basados en células CHO
requerían casi de forma exclusiva la presencia de suero en el medio
de cultivo. Las mejoras de la seguridad y regulatorias dieron paso
al desarrollo de nuevas líneas celulares y regímenes de cultivo que
ahora permiten el cultivo de células libre de suero a lo largo del
proceso (Merten, 1999). Sin embargo, la eliminación del suero de la
totalidad del proceso de producción también requiere que las células
se almacenen en bancos de células de reserva y de trabajo con medio
de congelación libre de suero. Se han descrito una gran variedad de
estrategias para el almacenamiento de células en un banco de células
mediante el uso de agentes crioprotectores que son capaces, al
menos parcialmente, de reemplazar los efectos protectores del suero
(Groth et al., 1991). Sin embargo, el éxito de cualquiera de
estas estrategia depende en gran medida de la línea celular, el
medio y el protocolo de congelación y descongelación. Por lo tanto,
la evaluación de diferentes estrategias de criopreservación es
esencial para el éxito de un proceso de desarrollo.
Actualmente, la primera valoración de un banco
de células de nueva generación se realiza mediante la descongelación
de un número de viales definidos y el cultivo de las células
durante 5-10 pases. El contaje celular y la
viabilidad determinada mediante la exclusión de azul de tripano son
los parámetros utilizados de forma rutinaria para describir la
recuperación de células tras la criopreservación.
La muerte celular programada o apoptosis es un
proceso crucial para un adecuado desarrollo embrionario y para la
homeostasis de los tejidos en los adultos. La muerte celular
programada se controla mediante un subgrupo específico de moléculas
conservadas en todos los organismos multicelulares, que convierten
una señal de inducción de muerte en procesos bioquímicos
intracelulares, que en último término conducen a una destrucción
completa de la célula (Vaux y Korsmeyer 1999). Una vez se dispara,
la apoptosis procede con una cinética diferente dependiendo del
tipo celular y se culmina con la disgregación celular y la formación
de cuerpos apoptóticos. Una etapa crítica de la apoptosis involucra
la adquisición de cambios en la superficie de las células moribundas
que finalmente resulta en el reconocimiento y la ingestión de estas
células por los fagocitos. Previamente, se han descrito diferentes
cambios en la superficie de las células apoptóticas, como la
expresión de lugares de unión a trombospondina, la pérdida de
residuos de ácido siálico y la exposición de fosfolípidos como la
fosfatidilserina (FS). Los fosfolípidos se distribuyen de forma
asimétrica entre las caras interna y externa de la membrana
plasmática, con fosfatidilcolina y esfingomielina expuestas en la
cara externa de la bicapa lipídica y fosfatidilserina
predominantemente observada en la superficie interna hacia el
citosol. En las células sometidas a apoptosis se destruye la
asimetría de los fosfolípidos de su membrana plasmática y exponen
la FS, que se transloca a la capa externa de la membrana. Esto
ocurre en las fases tempranas de la muerte celular apoptótica
durante la cual la membrana celular permanece intacta. La exposición
de FS es, por lo tanto, la principal característica temprana y
extendida de las células moribundas. La anexina V, pertenece a una
familia de proteínas descubiertas recientemente, las anexinas, con
propiedades anticoagulantes y que se ha demostrado que son una
herramienta útil para la detección de células apoptóticas, ya que se
unen de forma preferente a los fosfolípidos cargados negativamente
como la FS en presencia de Ca^{2+} y muestra una unión mínima a
la fosfatidilcolina y la esfingomielina. Los cambios en la asimetría
de la FS analizados midiendo la unión de anexina V a la membrana
celular se detectan antes de que aparezcan los cambios morfológicos
asociados con la apoptosis y antes de que se pierda la integridad
de la membrana.
Al conjugar FITC a la anexina V es posible
identificar y cuantificar las células apoptóticas en base a una
citometría de flujo de una sola célula (Steensma et al.,
2003). La tinción simultánea de las células con
FITC-anexina V (fluorescencia verde) y el colorante
no vital yoduro de propidio (fluorescencia roja) permite (análisis
bivariable) la discriminación de las células intactas (FITC -, YP
-), en apoptosis temprana (FITC +, YP -) y en apoptosis tardía o
células necróticas (FITC +, YP +).
Como se menciona en la sección de antecedentes,
la calidad de un banco de células criopreservadas es crítico en la
utilización de un banco de células para la producción de
biofármacos. En términos de esta invención, calidad significa,
vitalidad tras la descongelación, robustez, estabilidad
fenotípica/genética y conservación a largo plazo de la calidad de
las células, propagadas y expandidas a partir de un banco de células
criopreservadas. La presente invención se basa en la sorprendente
observación, de que la muerte celular programada, particularmente
la apoptosis, es la principal causa de muerte celular tras la
descongelación de células CHO criopreservadas de un banco de
células CHO congeladas. También se ha demostrado sorprendentemente
que la evidencia de apoptosis temprana en las células de un cultivo
propagado y expandido a partir de un banco de células
criopreservadas de células CHO se correlaciona con la calidad del
banco de células CHO, es decir con la vitalidad tras la
descongelación, robustez, estabilidad fenotípica/ genética y
conservación a largo plazo de la calidad de las células, observada
cuando las células se propagan y expanden a partir de este banco de
células. Además, se ha demostrado que la anexina V es un marcador
adecuado para detectar la apoptosis temprana en células CHO que se
han descongelado tras la criopreservación.
La presente invención por lo tanto está
relacionada con la utilización de anexina V en la caracterización
de un banco de células criopreservadas de células CHO.
Particularmente, la presente invención está relacionada con la
utilización de anexina V en un proceso de caracterización de un
banco de células criopreservadas de células CHO, realizado
preferiblemente poco después tras la descongelación de una porción
de células de tal banco de células. De acuerdo con otra realización
de la presente invención, dicho proceso incluye los pasos de: a)
descongelar una porción de células de un banco de células
criopreservadas; b) cultivar dichas células en un medio de cultivo;
c) incubar dichas células con anexina V; d) detectar las células y
cuantificar el número de células que se unen a anexina V; e)
detectar las células y cuantificar el número de células que no se
unen a anexina V; f) calcular la proporción de células que se unen a
anexina V frente a las células que no se unen a anexina V.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención también está relacionada con la utilización de anexina V
en un proceso para la determinación de la calidad de un banco de
células CHO, en el que dicho proceso incluye los pasos de: a)
criopreservar las células en alícuotas en un medio líquido como
banco de células; b) descongelar una porción de las células
criopreservadas de dicho banco de células; c) cultivar dichas
células en un medio de cultivo; d) establecer la tasa de vitalidad
de dichas células descongeladas mediante la tinción de dichas
células con anexina V. "Criopreservar las células en alícuotas"
en un medio líquido significa, que alrededor de entre 0,25 y 3
x10^{7} células se congelan en entre uno y dos mL de un medio
líquido en un contenedor. Por cada banco de células, se congelan
alrededor de 200 contenedores o viales.
La presente invención también está relacionada
con la utilización de un equipo que comprende anexina V para la
caracterización de un banco de células criopreservadas de células
CHO tras la descongelación, en el que la anexina V se utiliza para
determinar la tasa de vitalidad de las células criopreservadas tras
la descongelación. De acuerdo con una realización preferible de la
presente invención, la tasa de vitalidad de las células
criopreservadas tras la descongelación se determina mediante un
proceso que incluye los pasos de a) descongelar una porción de
células de un banco de células criopreservadas; b) cultivar dichas
células en un medio de cultivo; c) incubar dichas células con
anexina V; d) detectar las células y cuantificar el número de
células que se unen a anexina V; e) detectar las células y
cuantificar el número de células que no se unen a anexina V; f)
calcular la proporción de células que se unen a anexina V frente a
las células que no se unen a anexina V. Además, la presente
invención también proporciona un equipo que comprende anexina V y
un prospecto que incluye la información para el uso de la anexina V
en la caracterización de un banco de células de células CHO mediante
el proceso de la invención aquí descrito.
La presente invención proporciona además un
proceso para la caracterización de un banco de células CHO que
incluye los pasos de a) descongelar una porción de células de un
banco de células criopreservadas; b) cultivar dichas células en un
medio de cultivo apropiado; c) incubar dichas células con anexina V;
d) detectar las células y cuantificar el número de células que se
unen a anexina V; e) detectar las células y cuantificar el número
de células que no se unen a anexina V; f) calcular la proporción de
células que se unen a anexina V frente a las células que no se unen
a anexina V.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención también proporciona un proceso de medición de la tasa de
vitalidad de un banco de células CHO tras la descongelación, lo que
incluye los pasos de a) descongelar una porción de células de un
banco de células criopreservadas; b) cultivar dichas células en un
medio de cultivo apropiado; c) incubar dichas células con anexina
V; d) detectar las células y cuantificar el número de células que
se unen a anexina V; e) detectar las células y cuantificar el número
de células que no se unen a anexina V; f) calcular la proporción de
células que se unen a anexina V frente a las células que no se unen
a anexina V.
La Figura 1 muestra el patrón característico de
muerte celular de un cultivo de células CHO tras la
criopreservación. Las células CHO DG44 se congelaron utilizando un
congelador a una concentración de células de 2 x10^{7} células/mL
en medio de cultivo al 90% y DMSO al 10%. Las células se analizaron
mediante FACS en los puntos temporales indicados. El primer carril
muestra la difracción frontal en el eje Y y la difracción lateral en
el eje X. Se fijaron ventanas para distinguir las células que
representan células muertas o vivas según se deriva de su
morfología. El carril 2 muestra los mismos gráficos y las células
CHO positivas para anexina V se muestran en gris. El carril 3
muestra la tinción con yoduro de propidio (YP) representada frente a
la tinción con anexina V. Los puntos de acuerdo con la ventana de
difracción frontal y lateral son grises.
La Figura 2 muestra que la tinción con anexina V
a las 6 h tras la descongelación predice la calidad del banco de
células. Las células CHO DG44 se congelaron utilizando un congelador
a una concentración de células de 2 x10^{7} células/mL en medio
de cultivo del 90% y DMSO al 10%. El tamaño del banco de células fue
de 220 viales. A). Análisis de FACS de las células teñidas con
anexina V a las 6 h tras la descongelación. Los datos se
representan como un gráfico de difracción frontal lateral (las
ventanas son las descritas en la Figura 1) y como un gráfico de
intensidad de la anexina V. B). Crecimiento y viabilidad de los
cultivos tras la descongelación. Las células se contaron en cada
pase. Simultáneamente, se determinó la viabilidad mediante la
exclusión de azul de tripano.
La Figura 3 muestra diferentes bancos de células
que muestran diferentes apoptosis tras la descongelación. Las CHO
DG44 se congelaron utilizando un congelador con una concentración de
células de 1 x10^{7} o 2 x10^{7} células/mL en diferentes
medios de congelación. El tamaño de los bancos de células fue de
>200 viales. Las células se criopreservaron utilizando un
congelador o una caja de espuma de poliestireno en dos medios de
congelación diferentes. Los cultivos se analizaron mediante una
tinción con anexina V a las 6 h tras la descongelación.
La Figura 4 muestra la utilización de las
mediciones de la apoptosis temprana para comprobar la calidad del
medio. Las células CHO DG44 se congelaron utilizando un congelador a
una concentración de células de 2 x10^{7} células/mL en un medio
de cultivo al 90% y DMSO al 10%. El tamaño del banco de células fue
de 220 viales. Se utilizaron diferentes preparaciones de medios
para la generación de tres bancos de células. Los cultivos se
analizaron mediante FACS a las 6 h tras la descongelación, mediante
distribución del ciclo celular, mediante difracción
frontal-lateral y mediante tinción con anexina
V.
El término "el(los) cultivo(s)
celular(es) se inició (iniciaron)" se refiere al punto
temporal, en el que las células criopreservadas se descongelan y
transfieren a las condiciones de cultivo adecuadas para la
propagación y crecimiento de dichas células en un cultivo
celular.
El término "cultivo celular" significa
múltiples células cultivadas en un recipiente bajo condiciones
adecuadas para el crecimiento de las células.
El término "vitalidad tras la
descongelación" significa el comportamiento a lo largo del tiempo
de la recuperación tras la descongelación de las células propagadas
a partir de un banco de células dado, medido como el porcentaje de
células viables respecto a células no viables en el momento del
subcultivo. Este parámetro es esencial para el tiempo necesario
para establecer cultivos de inóculo robustos y para el posterior
escalaje para el cultivo a gran escala. Por lo tanto es un
parámetro crítico del proceso.
El término "robustez" describe la
reproducibilidad con la que dichos cultivos celulares se recuperan
tras la criopreservación de acuerdo con un patrón establecido de
vitalidad post descongelación. Un banco de células robusto
resultará en menores diferencias entre los comportamientos post
descongelación de sus diferentes viales. El término
"vial/viales" se refiere al número de células congeladas en un
contenedor. Normalmente, un vial contiene entre 0,25 y 3x10^{7}
células en uno o dos ml de un medio líquido.
El término "estabilidad
fenotípica/genética" de células se define por los cambios en los
niveles de RNA y de expresión de proteína observados cuando las
células de un determinado banco de células se cultivan durante un
periodo de tiempo relevante al formato del proceso determinado, por
ejemplo, para alrededor de 100 a 300 subpases. Un banco de células
de mala calidad, lo que quiere decir unas vitalidades tras la
descongelación bajas, dará lugar a una estabilidad
fenotípica/genética baja debida a una alta presión de selección
cuando se inician los cultivos. Una vitalidad tras la
descongelación baja en el sentido dado por la presente invención
indica que no más del 50%, preferiblemente no más del 30%, más
preferiblemente no más del 20%, aún más preferiblemente no más del
15% de las células son anexina V positivas en las 6 h después de la
descongelación. En otras palabras, un banco de células de alta
calidad se caracteriza en que la tasa de vitalidad tras la
descongelación es superior al 50%, preferiblemente más del 70%, más
preferiblemente más del 80%, aún más preferiblemente más del 85% de
las células viables, lo que indica que son anexina V negativas en
las 6 h después de la descongelación.
El término "calidad de preservación a largo
plazo" se define por el cambio de los tres parámetros
anteriormente descritos durante un prolongado periodo de
criopreservación, por ejemplo alrededor de 20 años, de un banco de
células determinado.
La necesidad de eliminar el suero de los
procesos de cultivo de células de mamífero, particularmente del
cultivo de células CHO, ha resultado en una mayor sensibilidad de
los cultivos hacia la muerte celular en diferentes estadíos de un
proceso de producción. Se proporciona un análisis detallado de la
muerte celular durante la descongelación de células CHO después de
la criopreservación. Un hallazgo sorprendente de la presente
invención fue que la muerte celular programada o apoptosis es la
forma predominante de muerte celular provocada por la
criopreservación de células CHO. Se observó sorprendentemente, tan
pronto como a las 3 h tras la descongelación, un aumento de nivel
de fosfatidilserina en la superficie celular de las células CHO. La
presentación de fosfatidilserina en la superficie celular de las
células CHO como resultado de la pérdida de asimetría de
fosfolípidos es una característica temprana de la muerte celular
programada. En este punto, la integridad de la membrana celular está
todavía intacta.
En tiempos tempranos tras la descongelación, por
ejemplo, de 3 a 24 h tras la descongelación, las células CHO
anexina V positivas, mostraron todavía estar morfológicamente
intactas (como se puede observar en las representaciones de
difracción frontal-lateral). En tiempos más tardíos
(alrededor de 24-48 h tras la descongelación), la
mayoría de células CHO anexina V positivas parecieron mostrar
signos de reducción/desestructuración de membrana como se puede
observar en los análisis de difracción
frontal-lateral. De acuerdo con estos hallazgos
sorprendentes, el porcentaje de células CHO que pueden ser teñidas
con yoduro de propidio (YP) sólo aumenta significativamente 24 h
tras la descongelación. Estos datos describen por primera vez la
naturaleza y evolución de la muerte celular de las células CHO tras
la criopreservación. Ciertas células CHO muestran signos de haber
iniciado un programa de destrucción en las primeras horas después
de haber sido desplazadas a un medio de cultivo caliente y
posteriormente estas células se desestructuran durante un periodo
de 48 h.
La anexina V se describió inicialmente como una
proteína vascular con fuertes propiedades anticoagulantes
(Reutelsberger et al., 1885). Parece que pertenece a una
familia de multigenes de proteínas definidas por un motivo
repetido, originalmente denominado como el lazo endonexina. En este
tiempo, han sido identificadas y clonadas las secuencias génicas
que codifican la proteína anexina V de varias especies. Por ejemplo
véase el Nº de acceso NP 001145 de la base de datos de proteínas
del NCBI.
La presente invención por lo tanto se refiere a
la utilización de anexina V en la caracterización de un banco de
células CHO criopreservadas. Particularmente, la presente invención
se refiere a la utilización de anexina V en un proceso de
caracterización de un banco de células criopreservadas de células
CHO. De acuerdo con otra realización de la presente invención,
dicho proceso incluye los pasos: a) descongelación de una porción de
células de un banco de células criopreservadas; b) cultivar dichas
células en un medio de cultivo; c) incubar dichas células con
anexina V; d) detectar las células y cuantificar el número de
células que se unen a anexina V; e) detectar las células y
cuantificar el número de células que no se unen a anexina V; f)
calcular la proporción de células que se unen a anexina V vs
células que no se unen a anexina V.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención también está relacionada con la utilización de anexina V
in un proceso para determinar la calidad de un banco de células CHO,
en el que dicho proceso incluye los pasos: a) criopreservar las
células en partes en un medio líquido como un banco de células; b)
descongelar una porción de las células criopreservadas de dicho
banco de células; c) cultivar dichas células en un medio de
cultivo; d) establecer la tasa de vitalidad de dichas células
descongeladas mediante la tinción de dichas células con anexina V.
Los criterios de calidad de un banco de células CHO son la vitalidad
post-descongelación, robustez, estabilidad
fenotípica/genética y calidad de preservación a largo plazo, que se
observa cuando las células se propagan y se expanden a partir de
este banco de células. Estos criterios se ven afectados
principalmente por el número de células CHO que sobreviven al
proceso de congelación/descongelación, en otras palabra, el número
de "células intactas". Un gran número de células CHO intactas
garantiza un rápido crecimiento del cultivo celular inicial, reduce
el número de paso de subcultivo necesarios para expandir el cultivo
celular hasta el nivel de fermentación a gran escala y por lo tanto
para minimizar el riesgo de que las variantes genéticas puedan
establecerse y/o dominar el cultivo. La tasa de vitalidad se estima
preferiblemente mediante la tinción con anexina V, que indica la
detección y cuantificación de células que se unen a anexina V. Por
lo tanto, de acuerdo con una realización más preferible de la
presente invención, el proceso de tinción con anexina V para poder
estimar la tasa de vitalidad de células CHO propagadas y expandidas
tras la descongelación incluye los pasos. a) incubar las células
descongeladas con anexina V; b) detectar las células y cuantificar
el número de células que se unen a anexina V; c) detectar las
células y cuantificar el número de células que no se unen a anexina
V; d) calcular la proporción de células que se unen a anexina V vs
células que no se unen a anexina V. Se proporcionan ejemplos de
células CHO en la Tabla 1.
Se ha descrito una serie de ensayos para la
detección de cultivos de células apoptóticas, lo que incluye ensayos
de encadenamiento de DNA (DNA-laddering) y TUNEL
(Gavrieli et al., et al., 1992; Wijsman et al.,
1993). Sin embargo, los métodos de citometría de flujo para la
detección de la apoptosis ofrecen varias ventajas sobre las
técnicas anteriores ya que permiten una rápida cuantificación de
propiedades de miles de células. La utilización de las mediciones
de citometría de flujo permite una evaluación rápida de alto
procesamiento de diferentes estrategias para generar un banco de
células con éxito para una línea celular determinada. Por esta razón
y de acuerdo con otra realización de la presente invención, la
anexina V está marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Esto permite la utilización de un ensayo de afinidad de anexina V
para citometría de flujo para estimar la tasa de vitalidad de
células tras la descongelación. Por lo tanto, la presente invención
también está relacionada con un proceso de tinción de células
criopreservadas de un banco de células CHO tras la descongelación
de una porción de células de ese banco de células con anexina V
marcada con FITC en un ensayo de citometría de flujo. Un ejemplo de
dicho ensayo se proporciona aquí más en detalle en la sección de
Ejemplos.
Los resultados proporcionados aquí dan una
explicación para los resultados que se observan normalmente cuando
se monitoriza la viabilidad de las células en un paso de
congelación/descongelación con un análisis de exclusión con azul de
tripano (el método estándar que refleja el estado de la técnica en
la caracterización del banco de células). Estos experimentos
clásicos de control de la descongelación generalmente muestra un
gran número de células viables justo después de la descongelación y
la viabilidad sólo disminuye entre las 24 h y las 48 h tras la
descongelación. Un amplio análisis de datos obtenidos para los
bancos de células CHO reveló de forma sorprendente el valor
predictivo de los ensayos de afinidad para anexina V en la
citometría de flujo. El porcentaje de células CHO apoptóticas
medidas como tempranas en las 6 h tras la descongelación proporciona
información en el éxito de una estrategia de criopreservación que
se obtiene sólo normalmente en los experimentos clásicos de control
de la descongelación en un periodo de 2-10 días. La
presente invención por lo tanto también proporciona la utilización
de anexina V en la caracterización de un banco de células CHO o en
un proceso para determinar la calidad de un banco de células CHO,
en el que el paso de incubación con anexina V se realiza en las 24
h, preferiblemente, 18 h, más preferiblemente 12 h, aún más
preferiblemente 9 h, lo más preferible 6 h tras la descongelación y
el inicio del cultivo de las células criopreservadas. En esta línea,
el método de uso más preferible del ensayo de citometría de es
flujo utilizando anexina V marcada con FITC.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención también pertenece al uso de un equipo que comprende la
anexina V para la caracterización de un banco de células CHO
criopreservadas tras la descongelación, en el que la anexina V se
utiliza para determinar la tasa de vitalidad de las células CHO
criopreservadas tras la descongelación. De acuerdo con una
realización preferible de la presente invención, la tasa de
vitalidad de un cultivo celular se determina mediante un proceso
que incluye los pasos a) descongelación de una porción de células
de un banco de células criopreservadas; b) cultivar dichas células
en un medio de cultivo; c) incubar dichas células con anexina V; d)
detectar las células y cuantificar el número de células que se unen
a anexina V; e) detectar las células y cuantificar el número de
células que no se unen a anexina V; f) calcular la proporción de
células que se unen a anexina V vs células que no se unen a anexina
V. Además, la presente invención también proporciona un equipo que
comprende anexina V y un prospecto que incluye la información para
utilizar la anexina V en la caracterización de un banco de células
CHO.
La presente invención proporciona además un
proceso para caracterizar un banco de células CHO que incluye los
pasos a) descongelación de una porción de células de un banco de
células criopreservadas; b) cultivar dichas células en un medio de
cultivo apropiado; c) incubar dichas células con anexina V; d)
detectar las células y cuantificar el número de células que se unen
a anexina V; e) detectar las células y cuantificar el número de
células que no se unen a anexina V; f) calcular la proporción de
células que se unen a anexina V vs células que no se unen a anexina
V. De acuerdo con otra realización, la presente invención también
proporciona un proceso para medir la tasa de vitalidad de un banco
de células CHO tras la descongelación, que incluye los pasos a)
descongelación de una porción de células de un banco de células
criopreservadas b) cultivar dichas células en un medio de cultivo
apropiado c) incubar dichas células con anexina V; d) detectar las
células y cuantificar el número de células que se unen a anexina V;
e) detectar las células y cuantificar el número de células que no
se unen a anexina V; f) calcular la proporción de células que se
unen a anexina V vs células que no se unen a anexina V. Como se
muestra en la presente invención, el porcentaje de células CHO
apoptóticas medidas tan pronto como de 24 a 6 horas después de la
descongelación, proporciona información sobre el éxito de la
estrategia de criopreservación para las células CHO que normalmente
sólo se gana en los experimentos de control de la descongelación
clásicos en un periodo de 2-10 días. La presente
invención también proporciona por lo tanto los procesos de
caracterización de un banco de células CHO o medir la tasa de
vitalidad de un banco de células tras la descongelación, en el que
el paso de incubación con anexina V se realiza en un plazo de 24 h,
preferiblemente, 18 h, más preferiblemente 12 h, aún más
preferiblemente 9 h, aún más preferiblemente 6 h tras la
descongelación e iniciar el cultivo de las células
criopreservadas.
Las células CHO pueden almacenarse con éxito en
nitrógeno líquido a alrededor de -196ºC durante periodos de tiempo
prolongados. Sin embargo, las células pueden normalmente no
congelarse y descongelarse sin la adición de crioprotectores como
DMSO. Incluso así, el proceso de
congelación-descongelación resultará en la pérdida
de células. Un parámetro crítico para la cantidad de estas pérdidas
es el protocolo utilizado para el proceso de congelación y
descongelación. Generalmente es beneficioso controlar el descenso de
la temperatura durante la congelación para asegurar que la
temperatura disminuye a una tasa de alrededor de un grado por
minuto. Para descongelar con éxito las células CHO, es necesario
calentar el criovial (células descongeladas) tan rápido como sea
posible hasta 37ºC, la temperatura óptima de cultivo de casi todas
las líneas celulares CHO. Una ruta para asegurar unas tasas altas
de recuperación de cultivos tras la descongelación es congelar las
células en un medio que contenga altas cantidades de suero.
Recientemente, se ha centrado mucho trabajo en
el desarrollo de estrategias de criopreservación para las células
CHO sin el uso de suero en el medio de congelación. Una serie de
crioprotectores pueden facilitar un almacenamiento a largo término
con éxito de células sin la presencia de suero. Además, la
composición del medio basal como tal, posee un impacto
significativo en el éxito de cualquier criopreservación. La
evaluación de la calidad por vía rápida descrita de cualquiera de
estas estrategias permitirá reducir drásticamente los tiempos de
desarrollo que son necesarios para generar protocolos fiables para
la generación de un banco de células de reserva o de trabajo para
la producción de nuevas líneas celulares CHO. De acuerdo con otra
realización, la presente invención también proporciona un proceso
para analizar un medio de cultivo para células CHO sin tener en
cuenta el uso de dicho medio para la criopreservación de células CHO
que incluye los pasos: a) criopreservar células CHO en un medio de
cultivo adecuado para cultivar esas células, preferiblemente a
temperaturas por debajo de los -100ºC, por ejemplo, en nitrógeno
líquido, b) descongelación de una porción o todas las células
criopreservadas; c) cultivar dichas células en un medio de cultivo
apropiado; d) incubar dichas células con anexina V; e) detectar
las células y cuantificar el número de células que se unen a anexina
V; f) detectar las células y cuantificar el número de células que
no se unen a anexina V; g) calcular la proporción de células que se
unen a anexina V vs células que no se unen a anexina V. Los medios
de cultivo adecuados son aquellos que están basados en los medios
comercialmente disponibles como el medio de Ham F12 (Sigma,
Deisenhofen, Alemania), RPMI-1640 (Sigma), Medio
Modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM;
Sigma), Medio Modificado de Dulbecco Iscove (IMDM; Sigma),
CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA),
CHO-S-Invtirogen), medio CHO libre
de suero (Sigma), y medio CHO libre proteínas (Sigma). De acuerdo
con un proceso preferible, dicho medio incluye crioprotectores
específicos como DMSO, BSA, metilcelulosa o glicina. De acuerdo con
una realización más preferible de este proceso, el paso de
incubación con anexina V se realiza en un plazo de 24 h,
preferiblemente 18 h, más preferiblemente 12 h, aún más
preferiblemente 9 h, lo más preferible 6 h tras la descongelación e
iniciar el cultivo de las células criopreservadas. El uso de
anexina V marcada con FITC en un ensayo de citometría de flujo es
además una realización preferible del proceso inventivo.
La invención descrita antes generalmente se
entenderá más fácilmente mediante la referencia de los siguientes
ejemplos, que se incluyen aquí con el único propósito de ilustrar
ciertas realizaciones de la presente invención y no pretenden
limitar la invención de ninguna manera.
BSA: albúmina sérica bovina
CHO: ovario de hámster chino
DMSO: dimetil sulfóxido
ELISA: ensayo inmunosorbente unido a enzimas
FACS: separador de células activado por
fluorescencia
FITC: isotiocianato de fluoresceína
BCR: banco de células de reserva
PBS: tampón fosfato salino
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
YP: yoduro de propidio
BCPP: banco de células post producción
FS: Fosfatidilserina
BCT: banco de células de trabajo
Se investigaron bancos de células de varias
líneas celulares CHO en suspensión utilizadas para la producción y
desarrollo de biofármacos. Todas las líneas celulares utilizadas
están patentadas y su producto proteico no será revelado. Todas las
líneas celulares utilizadas en escala de producción y desarrollo se
mantuvieron en cultivos de reserva de siembra seriados en frascos T
aireados en superficie (Nunc, Dinamarca) en incubadores (Thermo,
Alemania) o frascos de agitación con burbujeo (Wheaton, USA) en
cámaras de incubación especialmente diseñadas a una temperatura de
37ºC y una mezcla adecuada de aire y CO_{2} al 5%. Los cultivos de
reserva de siembra se dividieron cada 2-3 días en
una proporción de división adecuada y se sembraron en densidad. La
concentración de células se determinó en todos los cultivos
utilizando un hemocitómetro. Se evaluó la viabilidad mediante el
método de exclusión de azul tripano. Los cultivos se originaron de
los bancos de células de reserva, de trabajo o de seguridad y se
analizaron exhaustivamente para la esterilidad, micoplasma y la
presencia de agentes extraños. Todas las operaciones tuvieron lugar
en laboratorios con filtros de aire y bajo estrictos procedimientos
que cumplen con las ``Buenas Prácticas de Fabricación actuales
(cGMP). Todos los medios de cultivo utilizados están patentados y
su composición no será revelada.
La congelación y descongelación se realizaron de
acuerdo con los protocolos estándar y la ley fundamental
"congelación lenta-descongelación rápida". Los
cultivos se cogieron en fase exponencial a partir de cultivos en
suspensión y se congelaron en viales de plástico de 1,8 mL (Nunc,
Dinamarca) tanto mediante una máquina de congelación controlada por
un ordenador (Consarctic, Alemania) con un programa de congelación
especialmente diseñado o mediante una caja de espuma de
poliestireno en un congelador a -70ºC. Tras congelar a -100ºC
(máquina de congelación) o -70ºC (caja de espuma de poliestireno)
las células se transfirieron a contenedores de nitrógeno líquido.
Los viales se almacenaron en la fase gaseosa del nitrógeno líquido
(<- 150ºC). La concentración de células en los viales de
congelación fue de 1-3 E^{7} células. Se utilizó
DMSO (Merck, Alemania) como crioprotector a una concentración del
10%. Los medios de congelación detallados están también patentados
y su composición no será revelada. Las células CHO se descongelaron
en un baño de agua a 37ºC, se diluyeron con medio apropiado y se
centrifugaron (Thermo, Francia) a 180Xg. Posteriormente las células
se sembraron en medio de cultivo a una concentración de células
definida.
Se midieron la fluorescencia de la
anexina-V-FITC verde y del YP roja
con un contador de citometría de flujo Epics XL (Coulter, Alemania)
utilizando el programa Expo32. La excitación se obtuvo a 488nm con
un láser de Argón y se midió utilizando los filtros de paso de
banda estándar (53020nm) y de paso alto (>570nm). En cada
muestra, se midieron 10000 eventos para la apoptosis y 3000 eventos
para el análisis de ciclo celular. Los datos se analizaron con la
herramienta de análisis Expo32. Para discriminar entre las células
muertas y apoptóticas, se añadió a la suspensión celular la tinción
de DNA impermeable a la membrana, yoduro de propidio (YP) en
paralelo a la anexina V. Con esta doble tinción es posible
discriminar entre células vivas, en apoptosis temprana, en
apoptosis tardía y necróticas. El ensayo de anexina V se realizó de
acuerdo con el protocolo del vendedor
(Becton-Dickinson, Alemania). Se analizaron las
células y se cuantificó la apoptosis mediante citometría de flujo.
La tinción con yoduro de propidio se utilizó además para determinar
la distribución de ciclo celular. Las muestras se tomaron de las
suspensiones celulares sin fijación. Los cultivos se centrifugaron
y se lavaron con PBS (Gibco, Alemania). Después, se añadió la
solución de tinción con YP (BioSure, USA) y se procedió a la
incubación durante 30 min. Posteriormente, se analizaron las células
mediante citometría de flujo. La proporción de células en cada fase
del ciclo celular se obtuvo a través del programa Multicycle
(Phoenix Flow, USA).
Análisis cuantitativo de la muerte celular
durante la descongelación de las células CHO
criopreservadas:
Aunque se sabe que las células CHO mueren cuando
los cultivos de células se reinician tras la criopreservación, la
cinética y naturaleza de esta célula muerta no se ha descrito en
gran detalle. Para cuantificar el alcance de la muerte celular
programada en los cultivos celulares de células CHO durante las
primeras horas tras la descongelación, se determinó la cantidad de
fosfatidilserina mostrada en la membrana externa de las células
CHO. Las células CHO DG44 y los derivados de esta línea celular se
utilizan ampliamente para la producción de biofármacos. Se analizó
primero un banco de células de 220 viales generados para una línea
celular de producción derivada de CHO. El banco de células se
generó con un medio de congelación libre de componentes animales,
como suero, y se conoce por ser particularmente sensible respecto a
la viabilidad del cultivo tras la descongelación. Se analizaron las
células mediante tinción doble con anexina V y yoduro de propidio en
los tiempos 0 h, 3 h, 6 h, 24 h y 48 h. Se detectó un alto
porcentaje de aproximadamente un 30% de células positivas para
anexina V justo después de que las células se colocaran en medio de
cultivo (0 h), aumentando hasta casi un 50% durante las primeras 3
h y permaneciendo alrededor del 40% para las primeras 48 h tras la
descongelación. Para todos los bancos de células CHO DG44
analizados, el pico de nivel de células positivas para anexina V se
alcanzó entre las 3 h y 24 h tras la descongelación. En contraste
con esto, la cantidad de células positivas para YP permaneció
relativamente bajo inmediatamente después de la descongelación antes
de que aumentara de forma notable a las 24 h tras la
descongelación. En la fase inicial de la apoptosis, se muestra FS en
la superficie celular y la anexina V se une a su diana. En esta
fase inicial, la membrana plasmática todavía es capaz de excluir el
YP y, así, las células son anexina V+/YP-(Figura 1, cuadrante
inferior derecho). Posteriormente, las células perdieron la
integridad de su membrana plasmática y su capacidad de excluir el
YP. Estas células apoptóticas tardías son anexina V+/YP+ (Figura 1,
cuadrante superior derecho). Por lo tanto, estos experimentos
demuestran que la transición desde el estadio de apoptosis temprana
a tardía sólo ocurre tras las primeras 6 horas tras la
descongelación. Esto también se ve en el diagrama de difracción
frontal-lateral (Figura 1), mostrando un aumento en
las células muy pequeñas, que representan los cuerpos celulares
destruidos (Figura 1) en el punto de transición alrededor de 24
horas tras la descongelación.
El análisis tras la descongelación mediante
tinción con anexina V sirve como marcador predictivo temprano para
la calidad del banco de células CHO:
Como puede realizarse una cuantificación de la
apoptosis mediante tinción rápida de anexina V para un gran número
de muestras, ofrece un método atractivo para el análisis de alto
rendimiento de diferentes métodos de criopreservación. Se
analizaron dos bancos de células CHO de dos células CHO de
producción diferentes mediante tinción con anexina V y se
compararon estos datos con la tinción de exclusión con azul de
tripano medido para seis pases de cultivo (control de
descongelación estándar). Como se puede ver en la Figura 2A, la
cantidad de células mostrando fosfatidilserina varía
significativamente entre cultivos descongelados de los dos bancos
de células diferentes (35% en la descongelación 1 versus 67% en la
descongelación 2). El control clásico de descongelación (Figura 2B)
mostró la misma diferencia significativa entre las viabilidades del
cultivo de los diferentes bancos. La descongelación 1 demostró una
caída al 83% antes de la recuperación del cultivo a una viabilidad
de más del 90% cuatro días después de la descongelación. En
contraste a esto, sólo el 60% de células eran viables 24 h después
de la descongelación 2. Este cultivo tardó once días en alcanzar el
90% de viabilidad como se determinó mediante exclusión con azul de
tripano. Un banco de células de esta calidad claramente no será
adecuado para un proceso de producción comercial. Estos datos
demuestran de forma sorprendente que el porcentaje de células que
muestran FS en su superficie predice el resultado de controles
clásicos de la descongelación tan pronto como 6 h tras la
descongelación.
La calidad del banco de células puede variar
de forma dramática entre las diferentes líneas celulares, protocolos
de criopreservación y calidad del medio de cultivo:
Para probar el método recién descrito para la
evaluación de la calidad del banco de células analizamos una serie
de bancos de células. Se generaron dos bancos de células CHO DG44,
uno contenía BSA al 0,8% en el medio de congelación, el otro no
contenía BSA pero sí una mezcla 50:50 de medio condicionado y medio
fresco. Tal como se describe en la Figura 3, las células mostraron
tasas significativamente inferiores de apoptosis temprana para
ambos medios de congelación. Además, fue sólo evidente un efecto
beneficioso al añadir BSA al 0,8% en comparación con las células
almacenadas en medio condicionado cuando se utilizaron las cajas de
espuma de poliestireno.
Uso de mediciones de apoptosis tras la
descongelación para el desarrollo de estrategias de vía
rápida:
Como el tiempo de suministro clínico y de
mercado es un parámetro crucial para el desarrollo exitoso de nuevos
biofármacos, existe un interés creciente en los métodos de cribado
de vía rápida para el proceso de optimización y el proceso de
mejoras. Se determinó por lo tanto la viabilidad de utilizar
mediciones de anexina V justo 6 h después de la descongelación para
evaluar las estrategias para establecer una criopreservación exitosa
en las nuevas líneas celulares de producción de CHO.
Encontramos de forma sorprendente que las
mediciones tempranas de apoptosis tras la descongelación son una
herramienta sensible para la evaluación de la calidad de materiales
básicos. Un factor esencial para la criopreservación exitosa de
células CHO es la calidad del medio utilizado. Generalmente, la GMP
incluye fechas de caducidad claramente definidas para el uso de los
medios para cultivar células CHO. Se investigó si las condiciones
agresivas de un proceso de congelación descongelación puede resultar
en tiempos de uso menores para el uso del medio en comparación con
los procedimientos de cultivo estándar. Se utilizó un medio con una
vida de estantería de cuatro semanas para el cultivo de células CHO
para analizar esto en profundidad. La Figura 4 muestra datos de
apoptosis temprana (6 h tras la descongelación) para células CHO que
estaban criopreservadas en medio recién preparado (4 inferior),
medio que se almacenó a 4ºC durante cuatro semanas (4 arriba) y
medio que se almacenó a 4ºC durante cuatro semanas y que se
suplementó con una preparación fresca de un compuesto esencial
inmediatamente antes de ser usado (4 medio). Estos datos muestran
un descenso en el rendimiento de descongelación para los bancos de
células generados con este medio justo antes de su fecha de
caducidad. Este efecto puede reducirse significativamente añadiendo
una preparación fresca de un componente esencial del medio
relevante. La determinación simultánea de la distribución del ciclo
celular 6 h después de la descongelación mostró que un medio de
cuatro semanas no presenta efecto inhibitorio sobre el crecimiento.
Estos resultados demuestran de forma sorprendente cómo las
mediciones de apoptosis tempranas tras la descongelación podrían
utilizarse para análisis de sensibilidad de medios y sus
componentes respecto al uso de preparaciones de medios para la
criopreservación de células CHO.
Merten OW, Dev. Biol. Stand.
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Mol. Med. 2003; 85:323-32.
Claims (15)
1. La utilización de anexina V en un proceso de
caracterización de un banco de células criopreservadas de células
CHO tras la descongelación.
2. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, que se caracteriza por que dicho proceso
incluye los pasos de:
a) la descongelación de una porción de células
de un banco de células criopreservadas;
b) el cultivo de dichas células en un medio de
cultivo;
c) incubar dichas células con anexina V;
d) detectar las células y cuantificar el número
de células que se unen a la anexina V;
e) detectar las células y cuantificar el número
de células que no se unen a la anexina V;
f) calcular la proporción de células unidas a
anexina V frente a las no unidas a anexina V.
\vskip1.000000\baselineskip
3. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la anexina V se utiliza en un proceso
para determinar la calidad de un banco de células de células CHO,
en el que dicho proceso incluye los pasos de:
a) criopreservar las células en alícuotas en un
medio líquido como un banco de células;
b) descongelar una porción de las células
criopreservadas de dicho banco de células;
c) cultivar dichas células en un medio de
cultivo;
d) establecer la tasa de vitalidad de dichas
células descongeladas tiñendo dichas células con anexina V, en las
que la tasa de vitalidad es la proporción entre células unidas a
anexina V frente a las células no unidas a anexina V.
\vskip1.000000\baselineskip
4. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 3, que se caracteriza por que la tinción con
anexina V se realiza:
a) incubando las células tras la descongelación
con anexina V;
b) detectando las células y cuantificando el
número de células que se unen a la anexina V;
c) detectando las células y cuantificando el
número de células que no se unen a la anexina V;
d) calculando la proporción de células que se
unen a anexina V frente a las células que no se unen a anexina
V.
\vskip1.000000\baselineskip
5. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que un equipo que comprende anexina V se
utiliza para la caracterización de un banco de células
criopreservadas de células CHO tras su descongelación, en el que la
anexina V se utiliza para determinar la tasa de vitalidad de las
células criopreservadas tras la descongelación, en el que la tasa
de vitalidad es la proporción entre las células que se unen a
anexina V y las células que no se unen a anexina V.
6. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que un equipo además comprende una solución
de tinción de yoduro de propidio en PBS y un tampón de unión a
anexina V.
7. La utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 5 o 6, que se caracteriza por que el proceso
de determinación de la tasa de vitalidad incluye los pasos de:
a) descongelación de una porción de células de
un banco de células criopreservadas;
b) cultivar dichas células en un medio de
cultivo;
c) incubar dichas células con anexina V;
d) detectar las células y cuantificar el número
de células que se unen a la anexina V;
e) detectar las células y cuantificar el número
de células que no se unen a la anexina V;
f) calcular la proporción de células que se unen
a la anexina V frente a las células que no se unen a la anexina
V.
8. La utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 4, y 7, que se caracteriza por
que el paso de incubación con anexina V se realiza durante las 24 h
siguientes a la descongelación y se inicia el cultivo de las
células.
9. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 8, que se caracteriza por que el paso de
incubación con anexina V se realiza en las 6 h siguientes a la
descongelación y se inicia el cultivo las células.
10. La utilización de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 9, que se caracteriza por que la
anexina V está marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
11. El proceso de caracterización de un banco de
células de las células CHO que incluye los pasos de:
a) descongelación de una porción de células de
un banco de células criopreservadas;
b) cultivar dichas células en un medio de
cultivo apropiado;
c) incubar dichas células con anexina V;
d) detectar las células y cuantificar el número
de células que se unen a la anexina V;
e) detectar las células y cuantificar el número
de células que no se unen a la anexina V;
f) calcular la proporción de células que se unen
a la anexina V frente a las células que no se unen a la anexina
V.
12. El proceso de acuerdo con la reivindicación
11 para medir la tasa de vitalidad de un banco de células de
células CHO tras su descongelación, en el que la tasa de vitalidad
es la proporción entre las células que se unen a la anexina V
frente a las células que no se unen a la anexina V.
13. El proceso de acuerdo con las
reivindicaciones 11 o 12, que se caracteriza por que el paso
de incubación con anexina V se realiza en las 24 h siguientes a la
descongelación y se inicia el cultivo de las células.
14. El proceso de acuerdo con la reivindicación
13, que se caracteriza por que el paso de incubación con
anexina V se realiza en las 6 h siguientes a la descongelación y se
inicia el cultivo de las células.
15. El proceso de acuerdo con las
reivindicaciones de 11 a 14, que se caracteriza por que la
tinción de las células se realiza con anexina V marcada con
isotiocianato de fluoresceína (FITC).
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