KR100476790B1

KR100476790B1 - 세포 저장 용액과 이를 이용한 동물 세포의 동결 및 저장방법

Info

Publication number: KR100476790B1
Application number: KR10-2002-0055700A
Authority: KR
Inventors: 고재필; 고연자
Original assignee: 주식회사 제넨메드
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2005-03-16
Also published as: KR20040024170A

Abstract

본 발명은 세포 저장 용액과 본 세포 저장 용액을 이용한 동물 세포의 동결 및 저장 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 세포 저장 용액은 분자식과 분자량이 알려져 있는 화합물만을 구성 성분으로 포함하여 세포의 저장 및 보관에서 안정성과 경제성 및 편의성을 확보할 수 있도록 한다.

Description

세포 저장 용액과 이를 이용한 동물 세포의 동결 및 저장 방법 {A CELL PRESERVATION SOLUTION AND THE FREEZING AND PRESERVATION PROCEDURES OF ANIMAL CELLS USING THE SAID SOLUTION}

세포 저장은 동물 세포를 이용한 검사, 실험 및 산업적 응용에서 매우 중요하고도 필수적인 과정이다. 정상세포 및 확립된 세포주를 적절히 저장하는 것은 장기간에 걸쳐 반복적으로 그 정상세포와 세포주를 사용할 수 있도록 할 뿐 아니라, 특히 유용물질 생산 및 의약용으로서 동물 세포를 사용할 경우에는 안전성 및 재현성 확보에 매우 중요하다. 최근 생물의약 산업의 급속한 발전과 줄기세포(stem cell) 및 조직세포 등 정상세포를 이용한 세포이식(cell transplantation) 및 세포치료(cell therapy) 기술의 임상적 적용과 그 가능성은 세포 저장 기술의 중요성을 더욱 증대시키고 있다.

정상세포 및 세포주의 시험관내 유지 또는 증식은 적절히 선택된 완전한 세포배양액(complete culture medium) 또는 무혈청 세포배양액(serum-free culture medium)에 의해 이루어진다. 완전한 세포배양액은 MEM(minimum essential medium), DMEM(Dulbecco's modified eagle medium), F-12K 배지, RPMI 1640 배지, McCoy's 5A 배지 (GIBCO, Invitrogen Cell Culture Products, 2002 Catalog, Invitrogen, NY, 및 BioWhittaker Cell Biology Products, 2002-2003 Catalog, Cambrex, MD) 등과 같은 무혈청의 세포배양액에 전체 부피비 약 10%의 혈청(serum)을 혼합한 것을 말한다. 주로 사용되는 혈청은 소로부터 분리된 소혈청(bovine serum)이다. 혈청은 세포 증식에 매우 중요하게 관여한다고 여겨지는 알려지거나 알려지지 않은 여러 가지 성분을 함유하고 있어서 세포배양에 있어 거의 필수적으로 사용된다. 따라서, 비록 시험관내에서 강제적 적응과정을 통해 세포를 무혈청 세포배양액에서 유지 또는 증식시킬 수 있다 하더라도 (Berg et al. High-level expression of secreted proteins from cells adapted to serum-free suspension culture. Biotechniques 14, 972-978 (1993), Haldankar et al. Stable production of a human growth hormone antagonist from CHO cells adapted to serum-free suspension culture. Biotechnol. Prog. 15, 336-346 (1999), 및 Sinacore et al. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Mol. Biotechnol. 15, 249-257 (2000)), 세포배양의 보다 일반적인 방식은 완전한 세포배양액을 이용하는 것이다.

정상세포 및 세포주는 유래된 조직이나 시험관내 배양과정에서 생긴 적응 정도에 따라 사용되는 세포배양액이 달라질 수 있다. 보통의 경우 최적화된 것을 사용하고 최적화가 이루어지지 않은 것은 다양한 세포배양액을 사용하여 가장 적절한 세포배양액을 확인한 다음 그 세포배양액을 사용하게 된다.

현재 정상세포 및 세포주 등 동물 세포를 저장하는 데 있어 가장 널리 사용되는 기준 방법은 저장하고자 하는 정상세포 또는 세포주를 각각의 세포에 최적화된 완전한 세포배양액(complete medium)으로 세포를 재현탁(resuspend)시킨 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 부피비 10-20% 넣고 -80℃에서 천천히 동결시킨 다음 액체 질소에서 보관하는 것이다.

동결 저장된 세포가 높은 세포 활성도(cell viability)를 유지하기 위해서는 초기 동결과정 중에 발생하는 얼음 결정의 생성을 적절히 억제하는 것이 중요하다고 알려져 있다 (Carpenter JF and Hansen TN. Antifreeze protein modulates cell survival during cryopreservation: mediation through influence on ice crystal growth. Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 89, 8953-8957 (1992), Karlsson et al. Intracellular ice formation: causes and consequences. Cryo. Lett. 14,323-336 (1993), Toner et al. Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation during freezing of biological cells. J. Appl. Phys. 67, 1582-1592 (1990) (erratum, 70, 4653 (1991)), 및 Fujikawa S. Freeze-fracture and etching studies on membrane damage on human erythrocytes caused by formation of intracellular ice. Cryobiology 17, 351-362 (1980)6-9). 얼음 결정의 생성과 크기는 여러 요소에 의해 영향을 받는데 DMSO와 같은 동결방지제(cryoprotectant)의 종류와 농도 (Anchordoguy et al. Insights into the cryoprotective mechanism of dimethyl sulfoxide for phospholipid bilayers. Cryobiology 28, 467-473 (1991), 및 McGann LE. Differing actions of penetrating and nonpenetrating cryoprotective agents. Cryobiology 15, 382-390 (1978)), 그리고 저장용액에 포함된 염분, 당류, 단백질 등의 농도 및 그것에 따른 삼투압 (Harris et al. Cryopreservation of isolated hepatocytes: intracellular ice formation under various chemical and physical conditions. Cryobiology 28, 436-444 (1991), 및 Armitage et al. Response of epithelial (MDCK) cell junctions to calcium removal and osmotic stress is influenced by temperature. Cryobiology 31, 453-460 (1994)) 등이 관여한다.

기준방법에서 사용하는 완전한 세포배양액은 적절한 농도의 염분과 소혈청에서 유래하는 세포 저장에 유효한 여러 성분들을 적당히 함유하고 있다. 즉, 소혈청내에 존재하는 알부민 등과 같은 단백질은 물의 어는점을 적절히 변화시켜 얼음 결정의 생성을 억제하고 삼투압을 적절히 조절하여 초기 동결과정에서 세포의 성상 유지 및 안정화 작용을 한다 (Harrison et al. The optimum concentration of albumin as an embryo cryoprotectant. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 4, 288-291 (1987), 및 Luo et al. Effect of dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated human marrow cells. Cryobiology 31, 349-354 (1994)). 따라서 소혈청은 세포의 증식에 필요한 여러 중요한 인자들의 공급 요소로서 뿐 아니라 초기 동결과정에서도 중요한 역할을 한다. 그러므로 기준 방법에서 소혈청을 사용하지 않고 세포를 동결 저장할 경우에는 충분한 정도로 세포활성도를 기대할 수 없다. 물론 저장되는 세포의 종류와 이후 사용 목적에 따라서는 소혈청 대신 사람의 자가 혈청이나 다른 동물의 혈청이 사용될 수도 있다. 혈청이 세포 저장 용액에 사용되지 않을 경우, 즉 무혈청 세포 저장 용액이 사용될 경우에는, 따라서 혈청의 역할을 할 수 있는 물질이 세포 저장 용액에 적절히 첨가되어야만 한다.

세포는 적절히 선택된 세포 저장 용액을 이용하여 -80℃에서 동결된 후 적절한 온도에서 저장 및 보관된다. 동결된 세포를 곧 다시 사용할 경우에는 -80℃에서 보관하기도 하지만 1년 이상과 같은 장기간에 걸쳐 세포를 보관할 경우에는 반드시 동결된 세포를 액체 질소내에서 보관한다. 그것은 -80℃에서 세포를 보관할 경우 충분한 정도로 세포 활성도를 확보할 수 없기 때문이다. 따라서 동결된 세포를 1년 이상과 같이 장기간 보관할 때에는 액체 질소를 사용하는 것이 현재 가장 널리 사용하는 기준 방법이다.

1년 이상과 같이 장기간 동안 세포를 보관할 경우 동결된 세포를 액체 질소내에서 보관하는 것이 현재 가장 널리 사용되는 기준 방법이지만 이 방법이 가지고 있는 여러 가지 문제점이 있다.

무엇보다도 중요한 문제점은, 이 방법이 저장된 세포의 세포 활성도를 충분히 유지시키지 못한다는 것이다. 보관 기간이 2년 정도로 길어질 경우 세포 활성도가 심각한 정도로 상실되는 것은 흔한 일일 뿐 아니라, 세포에 따라서는 세포 활성도의 완전한 상실도 경험하게 된다. 본 발명의 세포 저장 용액이 보여주는 결과에 따르면, 이 문제는 저장 온도, 즉 액체 질소를 사용하느냐의 여부보다는 세포 저장 용액에서 비롯되는 것이 명확하다.

다음으로는 사용되는 액체 질소가 가진 문제점이다. 액체 질소는 연속적으로 기화하기 때문에 알려진 세포 저장 용액을 이용하여 기존의 기준 방법을 따라 세포를 동결 보관할 경우에는 보관된 세포의 세포 활성도 유지를 위해 항상 적절한 정도로 액체 질소를 유지시켜주어야만 한다. 따라서 만일 사용자의 부주의로 액체 질소가 모두 기화하게 되면 보관된 모든 세포를 일시에 소실하게 되는 위험이 있다. 뿐만 아니라 액체 질소는 심각한 상해를 유발할 수 있는 물질이므로 사용자의 매우 특별한 사용상의 주의가 요구되는 위험 물질이기도 하다.

끝으로 세포를 동결시킬 때 무혈청 용액이 아닌 완전한 세포배양액을 사용할 경우에는 혈청에서 유래하는 혈액내 병원균의 존재 가능성 때문에 저장된 세포를 세포치료 등의 의약품 재료나 생물의약품 생산용으로의 사용에 제한을 받을 수 있는 문제점이 있다. 특히 소혈청이 사용될 경우에는 소에서 유래하는 병원균이 사람으로 전이할 수 있는 가능성이 있다.

세포 동결 및 저장을 위한 기존의 기준 방법이 안고 있는 이러한 문제점들은 많은 연구자들에 의해 폭넓게 인지된 것이지만 지금까지 개선에 있어 이렇다 할 진전을 이루지는 못했다. 상기에서 언급된 문제들을 한꺼번에 해결할 수 있는 방법은, 무엇보다도 동결된 세포를 액체 질소가 아닌 -80℃ 내외에서 장기간 보관할 수 있는 무혈청 세포 저장 용액을 개발하는 것이었지만 지금까지 이것에 대한 만족할 만한 성과를 이뤄내지는 못했다. 따라서 동결된 세포의 세포 활성도를 극대화하면서도 -80℃내외에서 동결된 세포를 장기간 보관할 수 있는 무혈청 세포 저장 용액의 개발은 기존의 세포 저장 방법이 갖고 있는 문제점들을 근본적으로 해결할 뿐만 아니라 세포저장에 있어 새로운 기준을 확립할 만한 일이다.

본 발명은 동물 세포의 동결 및 저장을 보다 간편하게 하고 장기간에 걸쳐 안정적으로 하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로 본 발명은 동물 세포의 저장을 위한 기존의 기준 방법이 -80℃에서 천천히 세포를 동결시킨 후 액체 질소에 저장 보관하던 것과는 달리, 세포를 -80℃에서 동결시킨 후 장기간 그 온도에서 보관할 수 있도록 한다. 이렇게 하여도 세포 활성도가 충분히 유지되도록 함으로써 본 발명은 세포의 저장 및 보관에서 안정성과 경제성 그리고 편의성을 확보할 수 있도록 한다.

또한, 기존의 동물 세포 동결 및 저장에 있어 널리 사용되는 기준 방법은 혈청과 같은 동물성 추출물을 사용함으로써 저장된 세포가 생물의약품 생산이나 치료용으로 사용될 경우 혈청내에 존재할 수 있는 병원균에의 노출 위험성이 상존하였다. 이에 본 발명은 분자식과 분자량이 정확히 알려져 있는 화합물만을 구성성분으로 포함하는 동물 세포 저장 용액을 제공함으로써 이 같은 위험을 근본적으로 제거하고자 한다.

본 발명은 동결된 세포를 -80℃내외에서 장기간 보관할 수 있는 무혈청 세포 저장 용액과 이를 이용한 동물 세포의 동결 및 저장 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 저장 용액은 기존의 세포 저장 용액이 가지고 있던 여러 가지 문제점들을 근본적으로 해결하기 위해 개발된 새로운 형태의 세포 저장 용액으로서, 분자식과 분자량이 알려진 화합물만으로 이루어져 있으며 소혈청과 같은 동물성 추출물은 전혀 사용하지 않으며 장기간의 보관에도 충분한 세포 활성도를 보장하면서 액체 질소가 아닌 -80℃내외에서 동결된 세포를 보관할 수 있도록 한다. 본 발명에서 사용될 때, '동물 세포'란 사람 세포를 포함한 포유류 동물 세포를 말한다.

본 발명의 한 가지 양태로서, 본 발명은 수용액 상태로서 KH₂PO₄, KOH, NaCl, MgCl₂, 락트산(Lactic acid), 덱스트로스(Dextrose), 솔비톨(Sorbitol)을 주성분으로 하는 세포 저장 용액에 관한 것이다.

본 발명의 세포 저장 용액은 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 및 솔비톨 150-500mM를 포함하는 것이 바람직하며, pH는 6.3-7.5가 바람직하다.

본 발명의 다른 한 가지 양태로서, 본 발명은 수용액 상태로서 KH₂PO₄, KOH, NaCl, MgCl₂, 락트산, 덱스트로스, 솔비톨을 주성분으로 하며 이에 더하여 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 0-20 부피%, 바람직하게는 10 부피%, 보다 바람직하게는 20 부피%의 DMSO를 추가로 포함하는 세포 저장 용액에 관한 것이다. 이때 상기 각 성분의 농도는 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 및 솔비톨 150-500mM가 바람직하며, pH는 6.3-7.5가 바람직하다.

본 발명의 세포 저장 용액을 구성하기 위해 사용되는 상기 화합물들은 모두 시약 등급이 바람직하다.

본 발명의 다른 한 가지 양태로서, 본 발명은 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 솔비톨 150-500mM을 주성분으로 하는 세포 저장 용액을 포함하는 세포 저장용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 솔비톨 150-500mM을 주성분으로 하며, 이에 더하여 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 0-20 부피%의 DMSO를 추가로 포함하는 세포 저장 용액을 포함하는 세포 저장용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 한 가지 양태로서, 본 발명은 상기한 본 발명의 세포 저장 용액을 이용하여 동물 세포를 기존의 기준 방법에 비해 보다 간편하게 동결하고, -80℃ 내외에서 장기간 저장할 수 있는 세포 동결 및 저장 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 동결 및 저장 방법은 하기의 단계를 포함한다:

1) 동결 보관할 세포의 배양접시로부터 세포배양액을 제거하는 단계;

2) Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 한차례 세척한 다음 동일 용액으로 처리하여 세포를 배양접시로부터 분리시키는 단계;

3) 사용한 Trypsin-EDTA 용액의 5-10배에 상당하는 세포배양액을 사용하여 분리된 세포를 재현탁한 다음 적절한 용량의 용기로 옮겨 원심분리 하는 단계;

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 1천만-1억 세포가 되도록, 분리된 세포를 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 및 솔비톨 150-500mM를 포함하는 세포 저장 용액으로 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;

7) DMSO를 최종 세포 재현탁액의 전체 부피를 기준으로 0 부피% 초과에서 20 부피% 되도록, 바람직하게는 10 부피% 되도록 상기 세포 재현탁액에 첨가하고 잘 혼합하는 단계;

8) 1ml씩 동결 저장용 용기에 나누어 담은 다음 -80℃에서 동결시키는 단계;

9) 24시간 경과 후 동결된 세포를 -80℃에서 그대로 보관하거나 액체질소내로 옮겨 보관하는 단계.

다르게는, 본 발명의 세포 동결 및 저장 방법은 하기의 단계를 포함한다:

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 2천만-2억 세포가 되도록, 분리된 세포를 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 및 솔비톨 150-500mM를 포함하는 세포 저장 용액으로 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;7) 0-4℃의 KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 솔비톨 150-500mM 및 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 0 부피% 초과에서 20 부피%의 DMSO, 바람직하게는 20 부피%의 DMSO를 포함하는 세포 저장 용액을 단계 5)에서 사용된 세포 저장 용액의 부피만큼 상기 세포 재현탁액에 넣고 잘 섞는 단계;

삭제

9) 24시간 경과 후 동결된 세포를 -80℃에서 그대로 보관하거나 액체 질소내로 옮겨 보관하는 단계.

본 발명의 세포 저장 용액을 이용하여 세포를 동결 및 저장할 경우, DMSO는 상기한 본 발명 방법들의 단계 5)에서 이용되는 세포 저장 용액에 포함되어서는 안되며, 동결전 재현탁 단계인 단계 7)에서 단독으로 또는 세포 저장 용액의 일부로서 첨가되어야 한다.

본 발명의 세포 저장 용액 및 저장 방법을 사용하여 세포를 동결 저장할 경우, -80℃에서 2년의 보관 기간 동안 동결된 세포는 최소 90% 이상의 세포 활성도를 보인다. 동결된 세포는 -80℃에서 보관되어도 액체 질소에서 보관된 것과 비교하여 세포 활성도에 거의 차이가 없다. 따라서 본 발명의 세포 저장 용액을 사용하여 2년 정도의 기간에 걸쳐 세포를 동결 보관할 경우에는 액체 질소를 사용할 필요가 전혀 없다. 따라서 액체 질소 사용을 위한 설비가 필요하지 않다. 단, 사용자가 -80℃보다 액체 질소를 동결세포의 보관에서 더 선호할 때는 관련 설비가 필요할 것이다.

또한, 기존의 세포 동결 및 저장에 관한 기준 방법을 사용하여 세포를 동결 보관할 경우 최대의 세포 활성도를 얻기 위해서는 -80℃에서 세포의 초기 동결을 천천히 하여야 했으나(보통 분당 0.3-1℃ 감소), 본 발명의 세포 저장 용액 및 저장 방법을 이용하여 세포를 동결 저장할 경우에는 -80℃에서 초기 동결을 급속히 시켜도 세포활성도에 미치는 영향이 전혀 없으므로 초기 동결을 천천히 할 필요가 없다. 따라서 초기 동결을 천천히 시키기 위한 기구나 설비가 필요하지 않게 된다.

상기와 같은 본 발명의 세포 저장 용액 및 저장 방법은 세포의 종류에 구애받지 않고 모든 포유류 동물 세포의 저장에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 저장 용액 및 저장 방법은 사람 세포의 저장에 이용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 세포 저장 용액 A의 제조

KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 솔비톨 150-500mM의 농도가 되도록 각 성분을 증류수에 녹여 pH가 6.3-7.5인 수용액으로 세포 저장 용액 A를 제조하였다.

실시예 2. 세포 저장 용액 B의 제조

실시예 1에서 제조한 세포 저장 용액 A에 전체 용액 부피를 기준으로 20 부피%가 되도록 DMSO를 첨가하여 세포 저장 용액 B를 제조하였다.

실시예 3. 세포 저장 용액 A를 사용한 세포의 동결 및 저장

하기의 단계를 포함하는 방법에 따라 실시예 1에서 제조한 세포 저장 용액 A를 이용하여 세포를 동결 및 저장하였다:

3) 사용한 Trypsin-EDTA 용액의 5-10배에 상당하는 세포배양액을 사용하여 분리된 세포를 재현탁한 다음 적절한 용량의 용기로 옮겨 원심분리하는 단계;

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 1천만-1억 세포가 되도록 분리된 세포를 세포 저장 용액 A로 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;7) DMSO를 최종 세포 재현탁액 전체 부피를 기준으로 10 부피% 되도록 상기 세포 재현탁액에 넣고 잘 혼합하는 단계;

삭제

실시예 4. 세포 저장 용액 A와 세포 저장 용액 B를 사용한 세포의 동결 및 저장

하기의 단계를 포함하는 방법에 따라 실시예 1 및 2에서 제조한 세포 저장 용액 A와 세포 저장 용액 B를 이용하여 세포를 동결 및 저장하였다:

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 2천만-2억 세포가 되도록 세포 저장 용액 A로 분리된 세포를 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;

7) 0-4℃의 세포 저장 용액 B를 단계 5)에서 세포 저장 용액 A가 사용된 부피만큼 상기 세포 재현탁액에 넣고 잘 섞는 단계;

실시예 5. 세포 활성도 조사

실시예 1,2,3 및 4에서 기술한 세포 저장 용액과 방법을 이용하여 1년 및 2년 동안 -80℃ 또는 액체 질소내에 저장한 다양한 세포주의 세포 활성도를 조사하였다. 보관된 세포주를 37℃의 물 또는 실내 온도의 물에서 해동한 다음, 각 세포주의 완전한 세포배양액을 이용하여 플레이트에 도말하고 24시간 내지 48시간 경과 후 광학 현미경하에서 단위 면적당 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 센 다음, 전체 세포수 대비 살아있는 세포의 비율을 표시하는 방법으로 세포 활성도를 조사했다. 그 결과하기 표 1에 나타난 바와 같이, 저장된 세포들의 세포 활성도는 모두 90% 이상이었다.

표 1. 1년 및 2년 보관 후 세포 활성도

세포활성도(%)

1년 보관 2년 보관

세포주 -80℃ 액체질소 -80℃ 액체질소

293 >90 >90 >90 >90

293T >90 >90 >90 >90

A549 >90 >90 >90 >90

CHO >90 >90 >90 >90

DU145 >90 >90 >90 >90

HCT116 >90 >90 >90 >90

HeLa >90 >90 >90 >90

Hep3B >90 >90 >90 >90

Hepa1-6 >90 >90 >90 >90

HepG2 >90 >90 >90 >90

LNCaP >90 >90 >90 >90

NIH3T3 >90 >90 >90 >90

MCF-7 >90 >90 >90 >90

MDCK >90 >90 >90 >90

MDA-MB-231 >90 >90 >90 >90

실시예 6. DMSO의 사용 및 사용 시기

본 발명의 세포 저장 용액을 이용하여 세포를 동결 및 저장함에 있어, DMSO의 사용 필요성 및 적절한 사용 시기를 확인하기 위하여 하기와 같은 세 가지 경우를 실험하였다.

I: 실시예 3 및 4의 방법으로 세포를 동결함

II: 실시예 3 및 4의 방법으로 세포를 동결하되 DMSO를 사용하지 않음

III: 실시예 3의 방법으로 세포를 동결함에 있어 세포 저장 용액 A 대신 세포 저장 용액 B를 사용함

세포 활성도는 293 및 LNCaP 세포를 이용하여 조사하였다.

그 결과, 하기 표 2에서 확인할 수 있는 바처럼, 본 발명의 세포 저장 용액 및 동결 방법에서 DMSO를 전혀 사용하지 않거나, 세포 저장 용액 A 대신 DMSO를 처음부터 포함하는 세포 저장 용액 B를 사용할 경우, 저장 세포의 세포 활성도가 실질적으로 보존되지 않음을 알 수 있다.

표 2.

세포활성도(%)

7일 보관 1년 보관

-80℃ 액체질소 -80℃ 액체질소

I

293 >90 >90 >90 >90

LNCaP >90 >90 >90 >90

II

293 0 0 0 0

LNCaP 0 0 0 0

III

293 <30 <30 <30 <30

LNCaP <30 <30 <30 <30

본 발명의 세포 저장 용액은 세포 저장에서 매우 획기적인 것이다. 이 용액의 사용은 세포 저장을 매우 간편하게 할 수 있도록 할 뿐 아니라 장기간에 걸쳐 안정적으로 세포의 저장 및 보관을 가능하게 한다. 나아가 소혈청과 같은 동물성 추출물의 사용을 완전히 배제하고 분자식이 알려진 화합물만을 사용함으로써 병원균 감염의 위험을 완전히 제거한다. 또한 2년 정도의 보관 기간에는 -80℃에서도 안정적으로 세포를 보관할 수 있으므로 액체 질소 사용 없이 세포의 저장 및 보관을 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 세포 저장 용액은 경제적이면서도 저장된 세포의 세포활성도를 장기간 동안 충분히 확보할 수 있는 완전히 새로운 개념의 세포 저장 용액이다.

삭제

Claims

KH₂PO₄ 3-10mM, KOH 20-35mM, NaCl 20-150mM, MgCl₂ 0.5-4mM, 락트산 15-35mM, 덱스트로스 3-15mM, 및 솔비톨 150-500mM를 주성분으로 포함하며, pH가 6.3-7.5인 세포 저장 용액.
제 1항에 있어서, 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 0 부피% 초과에서 20 부피%까지의 DMSO를 추가로 포함하는 세포 저장 용액.
제 1항에 있어서, 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 10 부피%의 DMSO를 추가로 포함하는 세포 저장 용액.
제 1항에 있어서, 세포 저장 용액 전체 부피를 기준으로 20 부피%의 DMSO를 추가로 포함하는 세포 저장 용액.
하기의 단계를 포함하는, 제1항의 세포 저장 용액을 이용하여 세포를 동결, 저장 및 보관하는 방법:

1) 동결 보관할 세포의 배양접시로부터 세포배양액을 제거하는 단계;

2) Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 한차례 세척한 다음 동일 용액으로 처리하여 세포를 배양접시로부터 분리시키는 단계;

3) 사용한 Trypsin-EDTA 용액의 5-10배에 상당하는 세포배양액을 사용하여 분리된 세포를 재현탁한 다음 적절한 용량의 용기로 옮겨 원심분리하는 단계;

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 1천만-1억 세포가 되도록 제1항의 세포 저장 용액으로 세포를 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;

7) DMSO를 최종 세포 재현탁액의 전체 부피 기준으로 0 부피% 초과에서 20 부피% 되도록 상기 세포 재현탁액에 넣고 잘 혼합하는 단계;

8) 1ml씩 동결 저장용 용기에 나누어 담은 다음 -80℃에서 동결시키는 단계;

9) 24시간 경과 후 동결된 세포를 -80℃에서 그대로 보관하거나 액체 질소내로 옮겨 보관하는 단계.
하기의 단계를 포함하는, 제1항의 세포 저장 용액 및 제2항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 세포 저장 용액을 이용하여 세포를 동결, 저장 및 보관하는 방법:

1) 동결 보관할 세포의 배양접시로부터 세포배양액을 제거하는 단계;

2) Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 한차례 세척한 다음 동일 용액으로 처리하여 세포를 배양접시로부터 분리시키는 단계;

3) 사용한 Trypsin-EDTA 용액의 5-10배에 상당하는 세포배양액을 사용하여 분리된 세포를 재현탁한 다음 적절한 용량의 용기로 옮겨 원심분리하는 단계;

4) 분리된 세포를 제외한 상등액을 버리는 단계;

5) 1ml당 2천만-2억 세포가 되도록 제1항의 세포 저장 용액으로 세포를 재현탁하는 단계;

6) 세포 재현탁액을 얼음에 10분간 방치하는 단계;

7) 0-4℃의 제2항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 세포 저장 용액을 제1항의 세포 저장 용액이 단계 5)에서 사용된 부피만큼 상기 세포 재현탁액에 넣고 잘 섞는 단계;

8) 1ml씩 동결 저장용 용기에 나누어 담은 다음 -80℃에서 동결시키는 단계;

9) 24시간 경과 후 동결된 세포를 -80℃에서 그대로 보관하거나 액체질소내로 옮겨 보관하는 단계.
제1항의 세포 저장 용액을 포함하는 세포 저장용 키트
제7항에 있어서, 제2항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 세포 저장 용액을 더 포함하는 세포 저장용 키트.
제5항에 있어서, 단계 7)에서 DMSO를 최종 세포 재현탁액 전체 부피 기준으로 10 부피% 되도록 첨가하는, 세포를 동결, 저장 및 보관하는 방법.
제6항에 있어서, 단계 7)에서 제4항의 세포 저장 용액을 사용하는, 세포를 동결, 저장 및 보관하는 방법.