CN104833625B - 表达重组抗体cho细胞系稳定性的早期鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，所述方法包括如下步骤：1)通过细胞诱导凋亡剂处理表达重组抗体的CHO细胞系，得到诱导凋亡后的CHO细胞系；2)然后通过胞内流式细胞术分析所述诱导凋亡后的CHO细胞系；3)根据胞内流式细胞术分析的结果，计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图，通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性，及所述峰型图确定CHO细胞系的稳定性。本发明的方法，相比传统的细胞系稳定性鉴定方法，流式法则能在早期判定细胞系的稳定性，无需再进行产量评估，可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外，该方法还具有高通量的特点。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种细胞系的鉴定方法，尤其涉及一种表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析数万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。自70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域(参见：杜立颖，冯仁青.《流式细胞术》北京大学出版社.2008)。
细胞凋亡最早由Kerr在1972年根据细胞的形态学特征提出(Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basis biological phenomenon with wide-rangingimplications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239-257)。细胞凋亡是细胞对内外信息刺激的应答反应，且为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是一种生理性死亡(Physiogical cell death，PCD)(参见：张晓军,姚天明,王文亮.细胞凋亡的最新研究进展.第四军医大学学报,2002,23:42-44)。
基因重组工程细胞系已充分应用于重组蛋白体外表达领域。如重组人促红素蛋白(EPO)，重组人胰岛素(insulin)，以及各类单克隆抗体药物的生产等。重组EPO和重组人胰岛素均为原核表达，主要宿主细胞为大肠杆菌，该表达系统具有快速，高产的特点，但因为是原核细胞，生产的蛋白可能形成包涵体，需要复性，并且没有糖基化修饰，同时内毒素也是主要污染源。目前，已知的各类抗体药物，包括治疗乳腺癌的赫赛汀(Herceptin)，治疗淋巴瘤的美罗华(Rituxan)和治疗结肠癌的爱必妥(Erbitux)等，都是在CHO细胞体系中表达CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞，属于哺乳动物细胞，其中表达的蛋白具有正确的折叠和糖基化修饰，同时也避免了内毒素污染。
但是，使用CHO细胞体系表达重组抗体，首先需要建立稳定细胞系。稳定细胞系可在长期连续传代过程中，稳定地表达重组蛋白，在传代60-80次之后，重组蛋白的表达水平不低于原代表达水平的70％。为鉴定建立的细胞系稳定性，传统的方法是将细胞系进行60-80次连续传代，并在传代过程进行不同代次细胞的产量评估，然后将不同代次细胞的产量与原代细胞的产量进行比较。CHO细胞的传代一般2-3天为一代，经过60次传代则需要至少120天。可以看到，传统的细胞系稳定性鉴定方法非常耗时耗力，导致做稳定性鉴定的细胞系不会太多，并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差。
因此，发明设计一种能够快速鉴定CHO细胞系早期稳定性的方法成为必要。
发明内容
本发明的目的是针对目前传统的细胞稳定性评价时间长，导致做稳定性鉴定的细胞系不会太多，并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差的不足，提供一种表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，从而能在早期(15代以前)判定CHO细胞系的稳定性，无需再进行产量评估，可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外，该方法还具有高通量的特点，可以同时对几十甚至上百个克隆进行鉴定，确定表达量和稳定性的高低。
除非特别指明，本文中的“早期”是指“细胞系从原始细胞库复苏后，每三天传代一次，每次以一比六传代，连续传代不超过15代的时间段”。
除非特别指明，本文的一些术语和缩略语的含义如下：
CHO：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)
FCM：流式细胞术(Flow Cytometry)
FITC：异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate)
APC：别藻青蛋白(Allophycocyanin)
PE：藻红蛋白(P-phycoerythrin)
MFI：平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity)
VCD：活细胞密度(Viable Cell Density)
ROS：活性氧簇(Reactive Oxygen Species)
RA：全反式维甲酸(Retinoic Acid)
PBS：磷酸盐缓冲液
FBS：胎牛血清(Fetal Calf Serum)
MTX：甲氨蝶呤(Methotrexate)
ATP：腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate)
PKC：蛋白激酶C(Protein kinase C)
PKA：蛋白激酶A(Protein kinase A)
AD：防线菌素D(Actinomycin D)
GFX：Bisindolylmaleimide I(GF-109203X)
ROT：咖马林(Rottlerin)
OA：冈田酸(Okadaic acid)
CAF：咖啡因(Caffeine)
PCD：生理性死亡(Physiogical cell death)
IGF-1：胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor I)
MAPK：丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases)
MNP：细胞线粒体的膜电位(Mitochondrial membrane potential)。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过细胞诱导凋亡剂处理表达重组抗体的CHO细胞系，得到诱导凋亡后的CHO细胞系；
2)然后通过胞内流式细胞术分析所述诱导凋亡后的CHO细胞系；
3)根据胞内流式细胞术分析的结果，计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图，通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性及所述峰型图，确定CHO细胞系的稳定性；其中，荧光强度分布峰型图以荧光强度为横坐标，以细胞计数为纵坐标制图。
优选地，在步骤3)中，所述平均荧光强度通过对荧光强度分布峰型图积分得到，所述产量与平均荧光强度呈正相关。
优选地，所述确定CHO细胞系的稳定性包括以下步骤：
A)分析同一克隆不同代次之间胞内平均荧光强度和克隆产量的相关性；和/或分析不同的克隆的胞内平均荧光强度和克隆的相对产量的高与低，来确定CHO细胞系的稳定性峰型图；
B)通过步骤A)中分析同一克隆或不同克隆的荧光强度分布峰型图为单峰、双峰来确定CHO细胞系的稳定性，稳定CHO细胞系在峰型图中以单峰形式出现，不稳定CHO细胞系在峰型图中以双峰或多峰形式出现。
优选地，所述步骤2)通过包括以下步骤的方法进行：
(1)通过固定剂处理所述诱导凋亡后的CHO细胞系，得到固定后的CHO细胞系；
(2)然后通过破膜剂处理所述固定后的CHO细胞系，得到破膜后的CHO细胞系；
(3)再将破膜后的CHO细胞系进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术分析。
优选地，所述步骤2)通过包括以下步骤的方法进行：
(1)通过固定剂和破膜剂同时处理所述诱导凋亡后的CHO细胞系，得到固定破膜后的CHO细胞系；
(2)再将固定破膜后的CHO细胞系进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术分析。
优选地，在步骤(1)或(2)中，所述固定剂选自甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛中的一种或多种，优选地，所述破膜剂选自TritonX-100、NP-40、Tween 20、Saponin、Digitonin和Leucoperm中的一种或多种。
优选地，所述固定剂和破膜剂均溶于PBS溶液中，所述固定剂为多聚甲醛，所述破膜剂为tritonX-100。
优选地，所述固定剂的体积百分比浓度为2～4％，所述破膜剂的体积百分比浓度为0.1～0.2％；多聚甲醛通过自由氨基酸基团分子间形成侨连，从而形成一种抗原相互连接的网状结构。多聚甲醛更利于保持细胞的结构，在使细胞因子固定在细胞内的同时也避免了细胞表面抗原的丢失，并通过PBS的通透作用，并选用合适地固定剂浓度使得抗体进入细胞内，从而使抗体和抗原结合，从而达到良好地固定作用；Triton，NP-40为较强的去垢剂，可以将细胞膜部分溶解，适合核抗原的检测，Triton X-100是最常用的破膜剂，通过将Triton X-100以合适的浓度溶于PBS溶液中，利于荧光标记的细胞因子抗体或抗抗体进入细胞内与相应的细胞因子或抗体结合。
优选地，在步骤1)中，所述细胞诱导凋亡剂选自放线菌素D、GF-109203X(Bisindolylmaleimide I)、咖马林、冈田酸(Okadaic acid)、咖啡因中的一种或多种，Bisindolylmaleimide I是一种可逆的蛋白酶C(PKC)抑制剂，其结构和十字孢碱相似，和PKC竞争与ATP的结合位点，从而导致细胞凋亡，在高浓度下也可抑制蛋白酶A；冈田酸在细胞和组织中的急性和慢性毒性效应往往表现为细胞凋亡及肿瘤促进；咖啡因(Caffeine)是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，但高剂量的Caffeine会对中枢神经系统产生一定程度的损害，可诱导CHO细胞凋亡；咖马林(Rottlerin)是一种蛋白酶C(PKC-δ)阻断剂抑制剂，咖马林抑制细胞增生，通过线粒体酶的去极化诱导细胞凋亡，同时也会引起细胞的自我吞噬；GF-109203X亦可拮抗DADLE的这种抑制细胞凋亡的作用，表现为细胞存活率降低，凋亡率增加。
优选地，所述重组抗体为人源化抗体或全人抗体。
优选地，所述细胞免疫荧光染色所使用的荧光标记抗体为抗重组抗体；进一步优选地，所述抗重组抗体选自羊或鼠或兔抗人IgG Fc段的单克隆抗体、多克隆抗体，以及羊或鼠或兔抗人轻链的单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或多种。
更为优选地，所述抗重组抗体为荧光二抗FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体。
本发明采用流式细胞术检测细胞内重组抗体的方法检测细胞的稳定性，具体则是结合平均荧光强度和荧光强度分布峰型图(简称峰型图)判断细胞系的稳定性。相比传统的细胞系稳定性鉴定方法，本发明的流式法则能在早期(15代)以前判定CHO细胞系的稳定性，无需再进行产量评估，可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外，该方法还具有高通量的特点，可以同时对几十甚至上百个克隆进行鉴定，确定表达量和稳定性的高低。
本发明的优点在于，1)同一个克隆不同代次之间胞内平均荧光强度和产量之间有很好的相关性，因此可以早期判断克隆产量的降低趋势，从而判断克隆的稳定性；2)不同的克隆的胞内平均荧光强度和产量之间有很好的相关性，因此其在一定程度上可以判断克隆的相对产量的高与低；3)在峰型图中，若为不稳定的克隆，则会出现双峰的情况，且第二个峰的情况会随着代数的增加而变大。因此可以在早期出现双峰时就可以进行克隆的淘汰；在峰型图中，若为非单克隆，且克隆间表达差异比较大时，会出现双峰，所以可以根据流式的结果早期判断克隆是否为单克隆。
在本发明的具体实施方式中，本发明的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法包括如下步骤：
1.细胞预处理：取细胞进行计数，将一定细胞重悬于PBS，放12孔板中；
2.凋亡诱导：向步骤1的细胞培养孔中加入细胞凋亡诱导剂，充分混匀后，放入37℃，8％CO2摇床中，过夜孵育；
3.细胞固定：取出步骤2的12孔板，转入96孔深孔板，离心弃上清；用含1体积％胎牛血清(FBS)的PBS(1体积％FBS-PBS)洗细胞；孔中加入细胞固定剂固定细胞，室温避光孵育；
4.细胞破膜：用1体积％FBS-PBS洗步骤3的细胞；加入破膜剂，通透细胞膜，室温孵育；
5.免疫荧光染色：用1体积％FBS-PBS洗步骤4的细胞；加入荧光二抗或者抗原，室温避光孵育；
6.上机：用1体积％FBS-PBS洗步骤5中细胞；加入1体积％FBS-PBS重悬细胞即可上流式细胞仪检测。
7.使用FLOW JO 7.6软件分析结果，得到荧光强度分布峰型图，再通过峰型图进行稳定性分析。
在本发明的另一个具体实施方式中，本发明的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法包括如下步骤：
1.细胞预处理：取细胞进行计数，将细胞重悬于2mL PBS，细胞总数为2×106个，放12孔板中；
2.凋亡诱导：向步骤1的细胞培养孔中加入细胞凋亡诱导剂，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min.，过夜孵育(12-18h)；
3.细胞固定：取出步骤2的12孔板，转入96孔深孔板，离心弃上清；用1％FBS-PBS洗细胞两次，每次200μL；孔中加入200μL 2-4体积百分比％多聚甲醛固定细胞，室温避光孵育10～20min；
4.细胞破膜：用1体积％FBS-PBS洗步骤3的细胞两次，每次200μL；加入200μL 0.1-0.2体积％Triton X-100，通透细胞膜，室温孵育5～10min；
5.免疫荧光染色：用1体积％FBS-PBS洗步骤4的细胞两次，每次200μL；加入荧光二抗或者抗原，室温避光孵育30min；
6.上机：用1体积％FBS-PBS洗步骤5中细胞两次；加入1体积％FBS-PBS重悬细胞即可上流式细胞仪检测；
7.得到荧光强度分布峰型图，再通过峰型图进行稳定性分析。
优选地，步骤2中过夜孵育时间为16h，凋亡诱导剂为放线菌素D，浓度为5μM；
优选地，步骤3中使用2体积％多聚甲醛固定细胞，时间为10min；
优选地，步骤4中使用0.1积％Triton X-100通透细胞膜，时间为10min；
优选地，步骤5中使用的荧光二抗为FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体(SIGMA，货号：F3761，#SLBB3698)，浓度为50倍稀释使用。
在本发明的又一个具体实施方式中，本发明的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法包括如下步骤：
1.细胞预处理：取细胞进行计数，将细胞重悬于2mL PBS，细胞总数为2×106个，放12孔板中；
2.凋亡诱导：向步骤1的细胞培养孔中加入细胞凋亡诱导剂，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min，过夜孵育(12-18h)；
3.取出步骤2的12孔板，转入96孔深孔板，离心弃上清；用1体积％FBS-PBS洗细胞两次，每次200μL；孔中加入200μL 2％多聚甲醛和0.1体积％Triton X-100混合液，固定细胞并破膜，室温避光孵育20min；
4.免疫荧光染色：用1体积％FBS-PBS洗步骤4的细胞两次，每次200μL；加入荧光二抗或者抗原，室温避光孵育30min；
5.上机：用1体积％FBS-PBS洗步骤5中细胞两次；加入1体积％FBS-PBS重悬细胞即可上流式细胞仪检测；
6.得到荧光强度分布峰型图，再通过峰型图进行稳定性分析。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的表达重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法的流程图；
图2-1为本发明的实施例1中2μM十字孢碱(Staurosporine，简写为STS)处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图2-2为本发明的实施例1中5μM放线菌素D(Actinomycin D，简写为AD)处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图2-3为本发明的实施例1中2μM Bisindolylmaleimide I(GF109203X，简写为GFX)处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图2-4为本发明的实施例1中20nM冈田酸(Okadaic acid，简写为OA)处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图2-5为本发明的实施例1中5mM咖啡因(Caffeine，简写为CAF)处理CHO细胞系后计算的峰型图；
图2-6为本发明的实施例1中6μM咖马林(Rottlerin，简写为ROT)处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-1为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-1处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-2为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-2处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-3为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-3处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-4为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-4处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-5为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-5处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-6为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-6处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-7为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-7处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-8为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-8处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图3-9为本发明的实施例2中固定通透方式为方法-9处理CHO细胞系后得到的峰型图；
图4-1为本发明的实施例3中二抗使用Fab-FITC(0.25～50μl)进行免疫荧光染色后得到的峰型图；
图4-2为本发明的实施例3中二抗使用FC-PE(0.25～50μl)进行免疫荧光染色后得到的峰型图；
图4-3为本发明的实施例3中二抗使用FC-APC(1～50μl)进行免疫荧光染色后得到的峰型图；
图4-4为本发明的实施例3中二抗使用LIGHT-FITC(1～50μl)进行免疫荧光染色后得到的峰型图；
图4-5为本发明的实施例3中二抗使用CD3-FITC(1～50μl)进行免疫荧光染色后得到的峰型图；
图5为实施例4中不同的克隆的胞内平均荧光强度和产量的相关性结果；
图6为实施例5中1克隆-1不同代次之间胞内平均荧光强度和产量的相关性结果；
图7为实施例5中克隆-2不同代次之间胞内平均荧光强度和产量的相关性结果；
图8-1为实施例6中克隆-1、克隆-3不同代次同时通过流式细胞术计算平均荧光强度的峰型图结果；
图8-2为实施例6中克隆-1、克隆-3不同代次分别通过流式细胞术计算平均荧光强度的峰型图结果；
图8-3为实施例6中不同克隆-15、克隆-7不同代次分别通过流式细胞术计算平均荧光强度的峰型图结果。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂和设备均可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中的放线菌素D(Actinomycin D)(Abcam，货号：ab141058)；Bisindolylmaleimide I(Abcam，货号：ab144264)；咖马林(Rottlerin)(ENZO，货号：ALX-350-075-M010)；冈田酸(Okadaic acid)(ENZO，货号：ALX-350-003-C100)；咖啡因(Caffeine)(Abcam，货号：ab120240)。对比例选用的是十字孢碱(Staurosporine)(上海前尘，货号：ICA1041)。
本发明中荧光二抗选用的是鼠抗人(Mouse Anti-Human)IgG FC-PE(0.5μl～50μl)(Biolegend，货号：409304)，鼠抗人(Mouse Anti-Human)IgG FC-APC(0.5μl～50μl)(Biolegend，货号：409305)；鼠抗人(Mouse Anti-Human)IgG FC-FITC(0.5μl～50μl)(Biolegend，货号：409309)，FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体(Goat Anti-Human KappaLight Chain-FITC))(0.25μl～50μl)(SIGMA，货号：F3761，#SLBB3698)，FITC标记的CD3抗原(0.5μl～50μl)(简写为CD3-FITC，CD3抗原为本公司自有的专利产品CD3E/CD3D-LZ，已申请专利，专利申请号：CN201310440453)，因为该专利实施例中的抗体为一种抗CD3的抗体，所以可将能与抗体结合的抗原作为检测的二抗。以上的荧光标记的二抗其均能用于实验，即只要是抗人的FC的流式二抗，或能与抗体结合的带荧光标记的抗原均能用于本发明。对比例选用的是FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体(Goat Anti-Human AffiniPure F(ab’)2Fragment-FITC)(JacksonIR，货号：109-096-098).
本发明中的破膜剂和固定试剂选用2-4体积％的多聚甲醛PBS溶液和0.1-0.2体积％Triton X-100的PBS溶液；对比例选用的是BD细胞固定通透试剂盒(CytofixCytopermTM Fixation Permeabilization Kit)(购自BD，货号：554714)。
实施例1:不同细胞凋亡诱导试剂处理CHO细胞峰型图的比较
1.取8个第5代的表达重组抗体的CHO细胞系的克隆样本，Vi-cell(Beckman公司)计数，将细胞重悬于2ml，细胞总数为2×106个，放入12孔板中；
2.分别加入如下细胞凋亡诱导剂，混入CHO细胞系，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min，16h；
表1：不同细胞凋亡诱导试剂处理浓度
3.取出12孔板，转入96孔深孔板，300g室温离心4min，弃上清；
4.将细胞用200μl 1％FBS-PBS重悬于PCR 96孔板，300g室温离心4min，弃上清；
5.将细胞重悬于200μl BD固定通透试剂(Fixation/Permeabilizationsolution)中，4℃孵育20min；
6.取出孔板，300g室温离心4min，弃上清；
7.再用200μl 1％FBS-PBS重悬洗涤1次，300g室温离心4min，弃上清；
8.将细胞重悬于50μl标记的抗体FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体(Goat Anti-Human AffiniPure F(ab’)2Fragment-FITC)(1:250溶于1％FBS-PBS)，4℃避光孵育30min；
9.取出孔板，补200μL 1％FBS-PBS重悬洗涤1次，300g室温离心4min，弃上清；
10.再用200μL 1％FBS-PBS重悬洗涤1次，300g室温离心4min，弃上清；
11.再用200μL 1％FBS-PBS重悬于1.5mL EP管或者流式管中，准备流式上流式细胞仪(BD公司Accuri C6)；
12.同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。应用FLOW JO 7.6软件进行数据分析，实验分析结果图2-1.2-2,2-3,2-4,2-5,2-6所示，分析结果统计如表2所示。
表2：不同细胞凋亡诱导试剂处理CHO细胞后峰型图比较
说明：对比例中用十字孢碱进行了细胞系的稳定性评估，且能在早期判断细胞系的稳定性，与选择的其他诱导试剂进行对比，表中带下划线的地方，表明用其他细胞凋亡诱导试剂处理细胞后获得的峰型与用十字孢碱获得的峰型不同的地方。
以上结果说明冈田酸(Okadaic acid)，作用效果和十字孢碱(Staurosporine)一样，诱导细胞凋亡且结果相符，即这些细胞凋亡诱导剂均可用于诱导凋亡CHO细胞。其中，放线菌素D(Actinomycin D)，Bisindolylmaleimide I(GF 109203X)，咖啡因(Caffeine)，咖马林(Rottlerin)作用效果与十字孢碱的结果有部分差别，但与表7的产量评估检测细胞系稳定性结果相对照，证明放线菌素D的处理组的结果准确，单峰表示稳定，双峰表示不稳定，与表7结果一致，说明其准确性优于十字孢碱。
实施例2：不同固定通透方式处理CHO细胞后峰型图的比较
1.取8个表达重组抗体的CHO细胞系的克隆(传代次数均为5代)进行Vi-cell计数，将细胞重悬于2mL，细胞总数为2×106个，放12孔板中，一式9份；
2.加入放线菌素D(Actinomycin D)-5μM，混入细胞，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min，过夜孵育16h；
3.取出12孔板，转入96孔深孔板，300g室温离心4min，弃上清；
4.将细胞用200μL 1％FBS-PBS重悬于PCR 96孔板，300g室温离心4min，弃上清；
5-10.处理方式见下表
表3：不同的固定通透方式
11.每孔分别加入50μL二抗：FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体(Goat Anti-HumanAffiniPure F(ab’)2Fragment-FITC)(1:250溶于1％FBS-PBS)，4℃避光孵育30min.；
12.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min.，弃上清；
13.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min.，弃上清；
14.加入200μL 1％FBS-PBS重悬即可上机检测；
15.同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。数据分析：FLOW JO7.6；
16.实验分析结果图3-1,3-2,3-3,3-4,3-5,3-6,3-7,3-8,3-9所示，分析结果统计见表4。
表4：不同固定通透方式的峰型图的比较
说明：对比例(方法-9)中用BD固定通透试剂盒进行了细胞系的固定通透处理，与选择的其他固定通透方法进行对比，表中的带下划线的地方表示其他处理方式处理细胞获得的峰型与对比例处理细胞获得的峰型的区别。
以上结果说明方法3、7和BD固定通透试剂盒处理方式(方法-9)结果得到的结果一样，且与表7的稳定性评估结果一致，均能用于该细胞系稳定性评估的细胞固定通透步骤中，且效果相当。
实施例3：不同荧光二抗获得的峰型图的比较
1.取8个第五代的表达重组抗体的CHO细胞系的克隆进行Vi-cell计数，将细胞重悬于2mL，细胞总数为2×106个，放12孔板中，一式6份；
2.加入冈田酸(Okadaic acid)20nM，混入细胞，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min，过夜孵育(12-18h.)；
3.取出12孔板，转入96孔深孔板，300g室温离心4min，弃上清；
4.将细胞用200μL 1％FBS-PBS重悬于PCR 96孔板，300g室温离心4min，弃上清；
5.每孔加200μL 2％多聚甲醛，固定细胞，室温避光孵育10min(实施例2中的方法-3)；
6.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
7.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
8.每孔加200μL 0.1％Triton X-100，通透细胞膜，室温孵育10min；
9.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
10.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清
11.每孔分别加入50μL二抗室温避光孵育30min；
表5：不同荧光二抗的列表及使用浓度
12.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min.，弃上清；
13.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min.，弃上清；
14.加入200μL 1％FBS-PBS重悬即可上流式细胞仪检测。
15.同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。数据分析软件：FLOW JO 7.6
实验分析结果图4-1、4-2、4-3、4-4、4-5所示，实验分析结果统计见表6。
表6：不同荧光二抗染色细胞后峰型图比较
*说明：克隆-1，克隆-2，克隆-3，克隆-4，克隆-5，克隆-6，克隆-7，克隆-8，均为表达重组抗体Ab的CHO的细胞系，代数为第5代(P5)。
对比例为5-1，其中用FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体(Goat Anti-HumanAffiniPure F(ab’)2Fragment-FITC)作为二抗，与选择的其他荧光二抗进行对比。
以上结果说明采用PE标记的鼠抗人IgG-FC抗体(Mouse Anti-Human IgG FC-PE)，APC标记的鼠抗人IgG-FC抗体(Mouse Anti-Human IgG FC-APC)，FITC标记的鼠抗人IgG-FC抗体(Mouse Anti-Human IgG FC-FITC)，和FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体(Goat Anti-Human AffiniPure F(ab’)2Fragment-FITC)处理方式结果得到的结果一致，均可用于鉴定CHO细胞，但FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体(Goat Anti-Human Kappa Light Chain-FITC)和荧光标记抗原CD3-FITC与对比例的结果不完全一致。参考表7的结果，FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体的检测结果符合克隆的稳定性情况，即FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体的检测效果优于FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体。
实施例4：不同克隆之间胞内平均荧光强度和14天产量评估之间的关系
一、胞内平均荧光强度的检测
1.取同一克隆不同代次的表达重组抗体的CHO细胞系进行Vi-cell计数，共选择6个克隆(如表7)，将细胞重悬于2mL，细胞总数为2×106个，放12孔板中；
2.加入放线菌素D(5μM)，混入细胞，充分混匀后，放入8％CO2摇床，170rpm/min，过夜孵育16h；
3.取出12孔板，转入96孔深孔板，300g室温离心4min，弃上清；
4.将细胞用200μL 1％FBS-PBS重悬于PCR 96孔板，300g室温离心4min.，弃上清；
5.每孔加200μL 2％多聚甲醛，固定细胞，室温避光孵育10min；
6.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
7.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
8.每孔加200μL 0.1％Triton X-100，打孔细胞，室温孵育10min；
9.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
10.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
11.每孔加入50μL二抗(Mouse Anti-Human IgG FC-FITC)，室温避光孵育30min；
12.补入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min，弃上清；
13.加入200μL 1％FBS-PBS重悬，300g室温离心4min.，弃上清；
14.加入200μL 1％FBS-PBS重悬即可上机检测。
15.软件分析结果。通过FLOW JO 7.6软件进行数据分析。
二、14天产量评估
以上克隆同时进行14天单纯补糖的产量评估，步骤如下：
1.将细胞状态恢复的细胞株(活力大于90％)接种到125mL的摇瓶中,接种密度3×105/mL,培养体积30mL，培养基为CD FortiCHO培养基添加6mM L-谷氨酰胺(L-glutamine，够于GIBCO，货号：35050-061)和1％的抗聚集(Anti-Clumping Agent，够于GIBCO，货号：01-0057DG)。
2.将细胞放置于37℃，80％相对湿度，8％CO2的培养箱中，170rpm/min的摇床上培养。
3.第14天收获培养液，使用HPLC-proteinA检测抗体效价。
6个表达相同抗体的不同的细胞系，均在无MTX的常规培养基中传代培养，每3天传一次代；收取一部分细胞进行固定通透处理，然后孵育FITC标记的抗人的抗体，最后通过流式分析得到MFI；同时另一部分细胞进入常规的14天的单纯补糖的产量评估，得到抗体的产量；将MFI与14天产量做成如上散点图，结果如图5所示。
从图5可以看出，不同的克隆的胞内平均荧光强度和产量之间有很好的相关性，因此，其可以判断克隆的相对产量的高与低。
实施例5:同一个克隆不同代次之间胞内平均荧光强度与14天产量评估之间的关
系
一、胞内平均荧光强度的检测
1.取同一克隆不同代次的表达重组抗体的CHO细胞系进行Vi-cell计数，共选择2个克隆，将细胞重悬于2mL，细胞总数为2×106个，放12孔板中；
2.胞内平均荧光强度的检测同实施例4优选的方法中步骤2～15(同实施例4优选地方法)。
二、14天产量评估(同实施例3)
不同代次的克隆-1每3天传一次代，收取一部分细胞进行固定通透处理，然后孵育FITC标记的抗人的抗体(具体抗体名称)，最后通过流式分析得到MFI；同时另一部分细胞进入常规的14天的单纯补糖的产量评估，得到抗体的产量；将MFI与14天产量做成如上散点图，结果如图6所示。
不同代次的克隆-2每3天传一次代，收取一部分细胞进行固定通透处理，然后孵育FITC标记的抗人的抗体(具体抗体名称)，最后通过流式分析得到MFI；同时另一部分细胞进入常规的14天的单纯补糖的产量评估，得到抗体的产量；将MFI与14天产量做成如上散点图，结果如图7所示。
从图6和7可以看出，同一个克隆不同代次之间胞内平均荧光强度和产量之间有很好的相关性，因此，本发明的方法可以早期判断克隆产量的降低趋势，从而判断克隆的稳定性。
实施例6：细胞稳定性的判定
一、14天产量评估
1.取不同代次(第1代记为P1，第15代记为P15，第40代记为P40)的表达重组抗体的CHO细胞系进行Vi-cell计数，共选择8个克隆，将细胞重悬于30mL基本培养基中，细胞密度为0.3×106/mL，于125mL锥形瓶中悬浮摇床培养；
2.连续培养14天后，收集上清，进行ProteinA亲和层析和紫外分光光度计UV280nM检测抗体浓度并计算产量。统计结果如表7所示。
表7：8个克隆的不同代次14天产量评估结果及稳定性判断
二、胞内平均荧光强度的检测(同实施例3)
其中4个表达相同抗体的不同的细胞系克隆-1，克隆-3，克隆-5，克隆-7均在无MTX的常规培养基中传代培养，每3天传一次代；各选取第1代(P1)，第15代(P15)，第40代(P40)收取一部分细胞进行凋亡诱导剂(5μM放线菌素D)16h处理和固定通透(2％多聚甲醛和0.1％TritonX100混合液)20min处理，然后孵育50倍稀释的FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体，最后通过流式分析得到MFI；分析结果如图8-1、8-2和8-3所示。
图8-1，8-2结果显示：克隆-1，P1(点虚线)，P15(线虚线)，P40(实线)均为单峰，产量下降为6％(P15)和9％(P40)(表7)，可判定为稳定的克隆，峰型和产量两者结果相符；克隆-3P1(点虚线)，P15(线虚线)，P40(实线)均为单峰，产量下降为9.3％(P15)和16.1％(P40)(表7)，可判定为稳定的克隆；
图8-3结果显示：克隆-5，P1(上左图)，P15(上中图)，P40(上右图)均为双峰，且第二峰在P15时较为明显，产量下降为33.7％(表7)，可判定为不稳定的克隆，在P40代时，双峰更为明显，产量也下降了47.6％，峰型和产量两者结果相符；克隆-7，P1(下左图)，P15(下中图)，P40(下右图)均为双峰，且第二峰在P15时较为明显，产量下降为31.6％(表7)，可判定为不稳定的克隆，在P40代时，双峰更为明显，产量也下降了42.1％(表7)，峰型和产量两者结果相符；
实验分析结果如图8-1，8-2，8-3所示：在流式直方图中，若为不稳地的克隆，则会出现双峰的情况，且第二个峰的情况会随着代数的增加而变大，因此可以在早期(15代以前)出现双峰时就可以进行克隆的淘汰；在流式直方图中，若为非单克隆，且克隆间表达差异比较大时，会出现双峰，所以可以根据流式的结果早期判断克隆是否为单克隆。
因而，上述试验结果说明，本发明的方法，相比传统的细胞系稳定性鉴定方法，流式法则能在早期(15代以前)判定细胞系的稳定性，无需再进行产量评估，可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。本发明的方法，使用细胞凋亡诱导剂放线菌素D和荧光二抗FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体可以增加判断的准确性(达100％)。而对照文献(参见：Haimanti Dorai,Susanne Corisdeo,Dawn Ellis,Cherylann Kinney,Matt Chomo,PamHawley-Nelson,Gordon Moore,Michael J.Betenbaugh and Subinay GanguLy.Earlyprediction of instability of chinese hamster ovary cell lines expressingrecombinant antibodies and antibody-fusion proteins.Biotechnology andBioengineering Volume 109,Issue 4,pages 1016-1030,April2012，报道的十字孢碱和FITC标记的羊抗人F(ab’)2段抗体的组合，判断克隆稳定性的准确率则不到90％。此外，该方法还具有高通量的特点，可以同时对几十甚至上百个克隆进行鉴定，确定表达量和稳定性的高低。
Claims (14)
1.一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，所述方法包括如下步骤：
1)通过细胞诱导凋亡剂处理传代次数不超过15代的表达重组抗体的CHO细胞系，得到诱导凋亡后的CHO细胞系；
2)然后对凋亡后的CHO细胞系进行胞内重组抗体的荧光染色并进行流式细胞术检测及分析；
3)根据胞内流式细胞术分析的结果，计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图，通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性，及所述峰型图确定CHO细胞系的稳定性。
2.根据权利要求 1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，在步骤1)中，所述细胞诱导凋亡剂选自放线菌素D、GF-109203X、咖马林、冈田酸、咖啡因和十字胞碱中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述细胞诱导凋亡剂为放线菌素D。
4.根据权利要求3所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述放线菌素D的使用浓度为5μM，处理时间为16h。
5.根据权利要求1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)通过包括以下步骤的方法进行：
(1)通过固定剂处理所述诱导凋亡后的CHO细胞系，得到固定后的CHO细胞系；
(2)然后通过破膜剂处理所述固定后的CHO细胞系，得到破膜后的CHO细胞系；
(3)再将破膜后的CHO细胞系进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术分析。
6.根据权利要求1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)通过包括以下步骤的方法进行：
(1)通过固定剂和破膜剂同时处理所述诱导凋亡后的CHO细胞系，得到固定破膜后的CHO细胞系；
(2)再将固定破膜后的CHO细胞系进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术分析。
7.根据权利要求 5或6所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，在步骤(1)或(2)中，所述固定剂选自甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛中的一种或多种；所述破膜剂选自Triton-100、NP-40、Tween 20、Saponin、Digitonin和Leucoperm中的一种或多种。
8.根据权利要求 7所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述固定剂为多聚甲醛，所述破膜剂为tritonX-100，并且所述固定剂和破膜剂均溶于PBS溶液中。
9.根据权利要求5或6所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述固定剂的体积百分比浓度为2～4％，所述破膜剂的体积百分比浓度为0.1～0.2％。
10.根据权利要求 1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述细胞免疫荧光染色所使用的荧光标记抗体为抗重组抗体。
11.根据权利要求 10所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述抗重组抗体选自羊或鼠或兔抗人IgG Fc段的单克隆抗体、多克隆抗体，以及羊或鼠或兔抗人轻链的单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或多种。
12.根据权利要求 11所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，所述抗重组抗体，优选地，为荧光二抗FITC标记的羊抗人Kappa轻链抗体。
13.根据权利要求1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，在步骤3)中，所述平均荧光强度通过对荧光强度分布峰型图积分得到。
14.根据权利要求1所述的表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法，其特征在于，在步骤3)中，所述确定CHO细胞系的稳定性具体包括如下步骤：
A)分析同一克隆不同代次之间胞内平均荧光强度和克隆产量的相关性；和/或分析不同的克隆的胞内平均荧光强度和克隆的相对产量的高与低，来确定CHO细胞系的稳定性；
B)通过步骤A)中分析同一克隆或不同克隆的荧光强度分布峰型图为单峰、双峰来确定CHO细胞系的稳定性。
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