KR20070090187A

KR20070090187A - Ｃｈｏ 세포에 대한 세포 뱅킹 전략을 최적화하기 위한유동 세포계산 분석의 용도

Info

Publication number: KR20070090187A
Application number: KR1020077013000A
Authority: KR
Inventors: 히토 카우프만; 위르겐 피더; 랄프 오토
Original assignee: 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
Priority date: 2004-11-10
Filing date: 2005-11-07
Publication date: 2007-09-05
Also published as: EP1820022B1; JP4620739B2; JP2008518611A; PT1820022E; WO2006051065A3; US20100086947A1; US20060121444A1; TWI364459B; DK1820022T3; TW200634161A; CA2578400C; PL1820022T3; WO2006051065A2; EP1820022A2; SI1820022T1; ES2325931T3; KR101235658B1; DE602005014805D1; CA2578400A1; CY1110345T1

Abstract

CHO 세포로부터 생물약제를 제조하기 위하여는, 어느 정도는 GMP 조건하에 고 품질의 마스터 세포 뱅크, 제조용 세포 뱅크 및 제조후 세포 뱅크의 생성이 필요하다. 최적 냉동보존 전략은, 특히 혈청 또는 어떠한 동물 성분도 완전히 배제되고 신뢰할 수 있는 생산을 위한 확실한 해동 성능을 보장하는 제조 공정을 확립하기 위한 요망의 관점에서, 각각의 새로운 생산 세포주가 필요하다. 본원에서, 본원의 발명자들은 CHO 세포 뱅크의 고 효율 특성규명을 위한 안넥신 V-염색된 세포의 유동 세포계산 (FC) 분석을 이용하는 신규 전략을 기술한다. 본원 발명자들의 데이터는 상기 방법이 해동 후 바로 6시간에 냉동보존 절차의 평가를 가능케 한다.

유동 세포계산, CHO 세포, 세포 뱅크, 안넥신 V, 냉동보존

Description

ＣＨＯ 세포에 대한 세포 뱅킹 전략을 최적화하기 위한 유동 세포계산 분석의 용도{Use of flow-cytometric analysis to optimize cell banking strategies for CHO cells}

본 발명은 CHO 세포에서 생물약제의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 냉동보존을 통한 고품질의 마스터 세포 뱅크(master cell bank), 제조용 세포 뱅크(working cell bank) 및 제조후 세포 뱅크(post-production cell bank)의 생성에 관한 것이다. 보다, 상세히, 본 발명은 마스터, 제조용 및 제조후 세포 뱅크에 냉동보존된 세포의 증식 및 특성규명에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 냉동보존된 세포 뱅크의 고효율 특성규명을 위하여 안넥신 V (Annexin V)-염색된 세포의 유동 세포계산 (FC) 분석을 이용하는 신규 전략에 관한 것이다.

인간 치료용 생물약제 시장이 지난 10년간 매우 빠른 속도로 계속하여 성장하고 있다. CHO 세포주는 제조성, 안전성 및 조절성 측면에서 가장 매력적인 포유동물 발현 시스템 중의 하나이다. 일정한 품질의 치료 제품을 확보하기 위하여, 이들 세포주의 세포 뱅킹 시스템이 중요하다. CHO 세포의 마스터 세포 뱅크 (MCB), 제조용 세포 뱅크 (WCB) 및 제조후 세포 뱅크 (PPCB)의 창제가 CHO 세포주에서 생물약제를 개발하기 위한 제조 공정의 필수 단계이다. 이들 뱅크의 품질이 중요한 이유는, 이들의 생성이 제품의 임상 개발뿐만 아니라, 궁극적으로 시장 공급 측면을 뒷받침하기 때문이다.

세포 뱅크 품질의 특성을 규정짓는 주요 매개변수는 해동 후 배양된 세포의 장기간의 생존이다. 또한, 장기간의 생존 외에, 건강함 및 안정성도 또한 적합한 세포 뱅크의 필수 특성이다. 바이알을 해동시킨 때로부터 건강한 성장, 유전적 안정성 및 높은 배양 생존력을 갖춘 접종 배양물을 확립하는데 소요되는 시간이 세포 뱅크의 품질을 평가하는데 중요하다. 최종적으로, 고품질의 세포 뱅크는 이들 모든 매개변수가 장기간의 뱅크 보관 기간 동안 안정하게 유지되도록 보장해야한다. 이들 특징은 모두 소정의 생산 세포주에 대한 냉동보존 방법에 매우 의존적이다.

오늘날, CHO 세포가 사람 단백질을 정확하게 프로세싱하고 변형시킬 수 있기 때문에, 이들 CHO 세포로부터 제조되는 생물약제의 수가 증가하고 있다. CHO 세포를 이용하는 1 세대 제조 공정은 거의 필수적으로 배양 배지 중에 혈청이 존재할 것을 요구하였다. 안전성 및 조절성의 이점을 고려하여, 전 공정 동안 세포의 무혈청 배양을 가능케 하는 새로운 세포주 및 배양 방법을 개발하였다 (Merten, 1999). 그러나, 전체 제조 공정으로부터 혈청을 제거하는 것은 세포를 무혈청 냉동 배지를 갖는 마스터 세포 뱅크 및 제조용 세포 뱅크에서 보관할 것을 요구한다. 혈청의 보호 효과를 적어도 부분적으로 대체할 수 있는 동결보호제를 사용함으로써 세포의 세포 뱅킹을 위한 다양한 전략이 기술되었다 (Groth et al., 1991). 그러 나, 이러한 전략의 성공은 세포주, 배지 및 동결 및 해동의 프로토콜에 매우 의존적이다. 따라서, 상이한 냉동보존 전략의 평가는 성공적인 공정 개발에 필수적이다.

현재, 새로이 제조된 세포 뱅크의 제1 평가는 한정된 수의 바이알을 해동시키고 세포를 5 내지 10 계대 동안 배양하는 방법으로 수행하였다. 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 측정된 세포 수 및 생존력은 냉동보존 후 세포의 회복을 기술하는데 통상적으로 사용되는 매개변수이다.

프로그램된 세포 사멸 또는 아폽토시스(apoptosis)는 성인에게서 적당한 배아 발생 및 조직 항상성에 중요한 과정이다. 프로그램된 세포 사멸은, 사멸 유도 시그널을 세포내 생화학적 과정으로 전환시켜, 궁극적으로 세포의 완전한 파괴를 유도하는 모든 다세포 생물체 내에 보존된 특정 소집단의 분자에 의해 조절된다 (Vaux and Korsmeyer 1999). 일단 촉발되면, 아폽토시스는 세포 유형에 따라 상이한 반응속도론(kinetics)으로 진행하여, 마침내 세포를 파괴하고 아폽토시스 소체(apoptotic body)를 형성한다. 아폽토시스의 결정적 단계는 사멸하는 세포가 표면 변화를 획득하고, 결국 식세포에 의한 이들 세포의 인식 및 섭취를 초래하는 것이다. 아폽토시스 세포의 표면 상에서의 상이한 변화, 예를 들어 트롬보스폰딘 결합 부위의 발현, 시알산 잔기의 상실, 및 포스파티딜세린 (PS)과 같은 인지질의 노출은 이전에 기술되었다. 인지질은 원형질막의 내부 및 외부 소편 사이에 비대칭적으로 분포하는데, 이때 포스파티딜콜린 및 스핀고미엘린은 지질 이중층의 외부 소편 상에 노출되고 포스파티딜세린은 시토졸과 접하는 내면 상에서 주로 관찰된 다. 아폽토시스를 겪는 세포들은 이들의 원형질막의 인지질 비대칭을 깨뜨리고 막의 외층으로 전위된 PS를 노출한다. 이는 아폽토시스 세포 사멸의 초기 단계에 일어나며, 이 동안에 세포막은 온전하게 유지된다. 따라서, PS 노출은 사멸 세포의 초기의 광범위한 특질이다. 최근에 발견된 항응고제 특성을 갖는 단백질 계열인 안넥신에 속하는 안넥신 V는 아폽토시스 세포를 검출하는데 유용한 도구인 것으로 입증되었는데, 이는 안넥신 V가 Ca² ⁺의 존재하에서 PS와 같은 음 전하의 인지질에 우선적으로 결합하고 포스파티딜콜린 및 스핀고미엘린에 대해 최소한으로 결합하기 때문이다. 세포막에 결합하는 안넥신 V를 측정하여 분석된 PS 비대칭의 변화는, 아폽토시스와 관련된 형태학적 변화가 일어나고 막 완전성이 상실되기 전에 검출되었다.

FITC를 안넥신 V에 접합시킴으로써, 유동 세포계산에 의해 단일-세포 기준으로 아폽토시스 세포를 확인하고 정량하는 것이 가능하다 (Steensma et al., 2003). FITC-안넥신 V (녹색 형광) 및 실활(non-vital) 염료인 프로피듐 요오다이드 (적색 형광)로 세포를 동시에 염색함으로써, 온전한 세포 (FITC-PI-), 초기 아폽토시스 세포 (FITC+PI-) 및 후기 아폽토시스 또는 괴사 세포 (FITC+PI+)를 구별할 수 있다 (2가 분석).

발명의 개시

배경 부문에서 언급한 바와 같이, 냉동보존된 세포 뱅크의 품질은 생물약제의 제조를 위해 세포 뱅크를 사용하는데 중요하다. 본 발명의 취지에서, 품질은, 냉동보존된 세포 뱅크로부터 출발하여 증식 및 증대된, 세포의 해동후 활력(vitality), 건강함, 표현형/유전형 안정성 및 장기간의 보존 속성을 의미한다. 본 발명은, 프로그램된 세포 사멸, 특히 아폽토시스가 동결된 CHO 세포 뱅크의 냉동보존된 CHO 세포의 해동 후 세포 사멸의 주원인이라는 놀라운 관찰을 토대로 한다. CHO 세포의 냉동보존된 세포 뱅크로부터 증식 및 증대된 배양물 중의 세포들 중의 초기 아폽토시스의 증거가, 세포가 CHO 세포 뱅크로부터 출발하여 증식하고 증대된 때 관찰되는 해동후 활력, 건강함, 표현형/유전형 안정성 및 장기간의 보존 속성을 갖는 것을 의미하는 CHO 세포 뱅크의 품질과 상관관계가 있다는 것이 놀랍게도 증명되었다. 또한, 안넥신 V가 냉동보존 후 해동된 CHO 세포에서 초기 아폽토시스를 검출하는데 적합한 마커라는 것이 증명되었다.

따라서, 본 발명은 CHO 세포의 냉동보존된 세포 뱅크의 특성을 규명하는데 있어서의 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CHO 세포의 냉동보존된 세포 뱅크, 바람직하게는 이러한 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동한 직후에 특성을 규명하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 방법은 a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 세포들을 세포 뱅크로서 액체 배지 중에 부분으로 나누어 냉동보관하는 단계; b) 상기 세포 뱅크의 냉동보존된 세포들의 일부를 해동시키는 단계; c) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; d) 상기 세포를 안넥신 V로 염색하여 상기 해동된 세포의 활력 비를 확립하는 단계를 포함하는 CHO 세포 뱅크의 품질을 결정하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 액체 배지 중에 "부분으로 나누어 세포들을 냉동보존함"은 각 0.25 내지 3E7 세포들을 용기 내의 1 내지 2 ml의 액체 배지 중에 동결시키는 것을 의미한다. 세포 뱅크 당, 약 200개 용기 또는 바이알을 동결시킨다.

또한, 본 발명은, 해동 후 CHO 세포의 냉동보존 세포 뱅크의 특성 규명을 위한 안넥신 V를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이며, 이때 안넥신 V는 해동 후 냉동보존 세포의 활력 비를 결정하는데 사용된다. 본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 해동 후 냉동보존 세포의 활력 비는, a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 본 발명은 안넥신 V, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법에 의해 CHO 세포의 세포 뱅크의 특성 규명에서 안넥신 V를 사용하기 위한 정보를 포함하는 포장 광고지를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, CHO 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법을 제공한다.

추가 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, 해동 후 CHO 세포의 활력 비를 측정하는 방법을 제공한다.

도 1은 냉동보존 후 CHO 세포 배양물의 세포 사멸의 핑거프린트를 도시한다. CHO DG44 세포를 냉동기를 사용하여 90% 배양 배지 및 10% DMSO 중에서 2E7 세포/mL의 세포 농도로 냉동시켰다. 세포를 지정 시점에서 FACS로 분석하였다. 제1 레인은 Y 축 상의 전면 산란(forward scatter) 및 X 축 상의 측면 산란(side scatter)을 도시한다. 형태에 의해 판단하건대 죽은 세포 또는 살아있는 세포를 나타내는 세포들을 구별하도록 게이트를 설정한다. 레인 2는 동일한 그래프를 보여주며, 안넥신 V 양성 CHO 세포는 백색으로 표시된다. 레인 3은 안넥신 V 염색에 대해 플로팅된 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색을 도시한다. 돗트는 전면 대 측면 게이팅에 따르면 회색이다.

도 2는 해동 후 6시간의 안넥신 V 염색이 세포 뱅크 품질을 예견한다는 것을 보여준다. A. CHO DG44 세포를 냉동기를 사용하여 90% 배양 배지 및 10% DMSO 중에서 2E7 세포/mL의 세포 농도로 냉동시켰다. 세포 뱅크의 크기는 220개 바이알이었다. A). 해동 후 6시간의 안넥신 V 염색한 세포의 FACS 분석. 데이터를 전면 측면 산란 그래프 (도 1에 대해 기재된 바와 같은 게이트) 및 안넥신 V 강도 플롯으로서 플로팅한다. B). 해동 후 배양물의 성장 및 생존력. 세포를 모든 계대에 대하여 계수하였다. 동시에, 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 측정하였다.

도 3은 해동 후 상이한 아폽토시스를 나타내는 상이한 세포 뱅크를 보여준다. CHO DG44를 냉동기를 사용하여 상이한 냉동 배지 중에서 1E7 또는 2E7 세포/mL의 세포 밀도로 냉동시켰다. 세포 뱅크의 크기는 >200개 바이알이였다. 세포를 냉동기 또는 스티로폼 박스를 사용하여 2개의 상이한 냉동 배지 중에서 냉동보존하였다. 배양물을 해동 후 6 시간의 안넥신 V 염색에 의해 분석하였다.

도 4는 배지 품질을 시험하기 위한 초기 아폽토시스 측정의 용도를 보여준다. CHO DG44 세포를 냉동기를 사용하여 90% 배양 배지 및 10% DMSO 중에서 2E7 세포/mL의 세포 농도로 냉동시켰다. 세포 뱅크의 크기는 220개 바이알이였다. 상이한 배지 제제를 3개의 세포 뱅크의 제조에 사용하였다. 배양물을 세포 사이클 분포, 전면-측면 산란 및 안넥신 V 염색을 위하여 해동 후 6시간의 FACS에 의해 분석하였다.

정의

"세포 배양(들)을 개시하였다"란 표현은, 냉동보존된 세포를 해동하고 상기 세포를 세포 배양물로 증식시키고 성장시키기에 적합한 배양 상태로 이전한 때의 시점을 의미한다.

"세포 배양물"이란 용어는 세포의 성장을 위해 적합한 상태 하에서 하나의 용기 내에서 배양된 다중 세포들을 의미한다.

"해동 후 활력"이란 표현은, 2차 배양(sub-cultivation) 시점에 생존 세포 대 비-생존 세포의 %로서 측정된, 소정 세포 뱅크로부터 증식된 세포의 해동 후 회복의 시간경과를 의미한다. 이 매개변수는 건강한 접종 배양물을 확립하고 이어서 대규모 배양을 위해 규모를 증가시키는데 소요되는 시간에 필수적이다.

"건강함(robustness)"이란 용어는 확립된 해동 후 활력 패턴에 따라 냉동보존 후 세포 배양물이 회복한 증식력을 의미한다. 건강한 세포 뱅크는 이의 상이한 바이알의 해동 후 성능에서 미미한 차이를 초래할 것이다. "바이알/바이알들"이란 용어는 하나의 용기 내에 냉동된 수많은 세포들을 의미한다. 통상적으로, 바이알은 1 내지 2 ml의 액체 배지 중에 약 0.25 내지 3E7 세포들을 함유한다.

세포의 "표현형/유전형 안정성"이란 표현은, 소정의 세포 뱅크로부터의 세포를 소정의 공정 형식에 관한 기간, 예를 들어 100 내지 300회의 2차-계대에 걸쳐 배양했을 때 관찰되는 RNA 및 단백질 발현 수준의 변화로 정의된다. 해동 후 낮은 활력을 의미하는 불량 품질의 세포 뱅크는, 배양이 개시될 때 높은 선택압으로 인해 불량한 표현형/유전형 안정성을 일으킬 수 있다. 본 발명의 취지에서 해동 후 낮은 활력은 세포의 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하, 보다 더욱 바람직하게는 15% 이하가 해동 후 6시간 이내에 안넥신 V 양성인 경우를 의미한다. 환언하면, 고품질의 세포 뱅크는 생존 세포의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 85% 이상의 해동 후 활력비를 특징으로 하며, 이는 해동 후 6시간 이내의 안넥신 V 음성을 의미한다.

"장기간의 보존 품질"이란 용어는 소정 세포 뱅크의 장기간, 예를 들어 약 20년 이하의 냉동보존 동안 상기 3가지 매개변수의 변화로 정의된다.

발명의 설명

포유동물 세포 배양 과정으로부터, 특히 CHO 세포 배양으로부터 혈청을 제거할 필요성은 생산 과정의 상이한 단계에서 세포 사멸에 대하여 고도의 배양 민감성을 초래하였다. 냉동보존에 이어, CHO 세포를 해동하는 동안의 세포 사멸에 관한 상세한 분석이 제공되었다. 본 발명의 놀라운 발견은, 프로그램된 세포 사멸 또는 아폽토시스가 CHO 세포의 냉동보존에 의해 야기된 세포 사멸의 주요 형이라는 것이다. 이르면 3시간 후, 포스파티틸세린의 수준 증가가 CHO 세포의 세포 표면 상에서 놀랍게도 관찰되었다. 인지질 비대칭의 상실의 결과로서 나타나는 CHO 세포의 표면 상의 포스파티딜세린은 프로그램된 세포 사멸의 초기 특징이다. 이 시점에서, 세포막 완전성은 여전히 온전하다.

해동 후 초기에, 예를 들어 해동 후 3 내지 24 시간은, 여전히 형태학적으로 온전한 안넥신 V 양성 염색된 CHO 세포를 보여주었다 (전면-측면 산란 플롯으로 제시됨). 후기 (해동 후 약 24 내지 48 시간)에, 안넥신 V 양성 염색된 CHO 세포의 대부분이 전면-측면-산란 분석에 의해 제시된 바와 같이 수축/막 분해의 징조를 보이는 것으로 여겨졌다. 이들 놀라운 발견에 따르면, 프로피듐 요오다이드 (PI)만으로 염색될 수 있는 CHO 세포의 %가 해동 후 24 시간에 현저히 증가하였다. 이들 데이터 값은 냉동보존 후 CHO 세포의 세포 사멸의 초기 특성 및 시간경과를 기술한다. 특정 CHO 세포는, 따뜻한 배양 배지에 두고 이어서 48 시간에 걸쳐 이들 세포를 분해한 후, 몇 시간 내에 파괴 프로그램이 개시되는 징조를 보여준다.

안넥신 V는 처음에는 강한 항응고제 특성을 갖는 혈관 단백질로서 기술되었다 (Reutelsberger et al., 1985). 이는 원래 엔도넥신 루프(endonexin loop)로 명명된, 반복 모티프로 한정된 다중유전자 계열의 단백질에 속하는 것으로 여겨진다. 한편, 여러 종의 안넥신 V 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 확인되고 클로닝되었다. 예를 들면, NCBI 단백질 데이터 베이스 등록번호 NP 001145를 참조하라.

따라서, 본 발명은 냉동보존된 CHO 세포 뱅크의 특성을 규명하는데 있어서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CHO 세포의 냉동보존된 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가 태양에 따르면, 상기 방법은 a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 세포들을 세포 뱅크로서 액체 배지 중에 부분으로 나누어 냉동보관하는 단계; b) 상기 세포 뱅크의 냉동보존된 세포들의 일부를 해동시키는 단계; c) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; d) 상기 세포를 안넥신 V로 염색하여 해동된 세포의 활력 비를 확립하는 단계를 포함하여, CHO 세포 뱅크의 품질을 결정하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. CHO 세포 뱅크의 품질에 대한 기준은, CHO 세포 뱅크로부터 출발하여 세포를 증식하고 증대시켰을 때 관찰되는, 해동 후 활력, 건강함, 표현형/유전형 안정성 및 장기간의 보존 속성이다. 이들 기준은 주로 냉동/해동 과정에서 생존하는 CHO 세포의 수, 환언하면, "온전한 세포"의 수에 의해 영향받는다. 매우 많은 수의 온전한 CHO 세포가 초기 세포 배양의 신속한 성장을 보장하고, 대규모 발효로 세포 배양을 증대시키는데 필요한 2차 배양 단계의 수를 감소시키고, 따라서 유전적 변이체가 확립된 및/또는 지배적인 배양물일 수 있는 위험을 최소화시킨다. 활력 비는 바람직하게는, 안넥신 V-결합 세포의 검출 및 정량화를 의미하는 안넥신 V 염색에 의해 평가된다. 따라서, 본 발명의 보다 바람직한 태양에 따르면, 해동 후 증식 및 증대된 CHO 세포의 활력 비를 평가하기 위한 안넥신 V 염색 방법은, a) 해동 후 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; b) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; c) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 d) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함한다. CHO 세포의 예는 표 1에 제시된다.

DNA-래더링(laddering) 및 TUNEL 검정을 포함하여, 아폽토시스 세포 배양물의 검출을 위한 각종 검정이 기재되었다 (Gavrieli et al., et al., 1992; Wijsman et al., 1993). 그러나, 아폽토시스 검출의 유동 세포계산 방법은 수천 개 세포의 특성을 신속히 정량화할 수 있기 때문에, 상기 기법에 비해 여러 이점을 제공한다. 유동 세포계산 측정을 사용하면, 상이한 전략의 신속한 고 효율의 평가가 가능하므로 소정의 세포주에 대한 성공적인 세포 뱅크를 수득할 수 있다. 이러한 이유로, 본 발명의 추가 태양에 따라, 안넥신 V을 플루오레스세인 이소티오시아네이드(fluorescein isothiocyanate) (FITC)로 표지화시킨다. 이는 유동 세포계산 안넥신 V 친화성 검정을 사용하여, 해동 후 세포의 활력 비를 평가할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명은 또한, 유동 세포계산 검정에서 FITC-표지화된 안넥신 V를 사용하여, CHO 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시킨 후 CHO 세포 뱅크의 냉동보존된 세포를 염색하는 방법에 관한 것이다. 이러한 검정의 예는 본원의 실시예 부문에서 보다 상세히 제공된다.

본원에 제공된 결과는, 냉동/해동 단계가 세포 생존력의 트립판 블루 배제 분석 (세포 뱅크의 특성규명에서 당업계의 상황을 반영하는 표준 방법)에 의해 모니터될 때, 통상적으로 관찰되는 결과에 대한 설명을 제공한다. 이들 전형적인 해동-조절 실험은 일반적으로 해동 직후 매우 많은 수의 생존 세포를 보여주며, 해동 후 24시간 내지 48시간 사이에 단지 생존력이 감소한다. CHO 세포에 대해 수득된 데이터의 광범위한 분석은 놀랍게도 유동 세포계산 안넥신 V 친화성 검정의 예측 값을 나타냈다. 해동 후 6 시간 정도의 이른 시기에 측정된 아폽토시스 CHO 세포의 %는, 2 내지 10일의 기간에 걸친 전형적인 해동 조절 실험에서만 통상적으로 수득되는, 냉동보존 전략의 성공에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한, 안넥신 V와의 항온배양 단계가 해동 후 냉동보존 세포의 배양 개시 24시간, 바람직하게는 18시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 더욱 바람직하게는 9시간, 보다 더욱 바람직하게는 6시간 이내에 수행되는, CHO 세포 뱅크의 특성규명에서 또는 CHO 세포 뱅크의 품질을 결정하는 방법에서 안넥신 V의 용도를 제공한다. 이와 관련하여, FITC 표지화된 안넥신 V를 이용하는 유동 세포계산 검정을 사용하는 것이 가장 바람직한 방법이다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은, 해동 후 냉동보존 CHO 세포 뱅크의 특성규명을 위한, 해동 후 냉동보존 CHO 세포의 활력 비를 측정하는데 사용되는 안넥신 V를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 세포 배양물의 활력 비는 a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 결정된다. 또한, 본 발명은 안넥신 V, 및 CHO 세포 뱅크의 특성규명에서 안넥신 V의 사용 정보를 포함하는 포장 광고지를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하는 CHO 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법을 제공한다. 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, 해동 후 CHO 세포의 활력 비를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 밝혀진 바와 같이, 해동 후 24시간 내지 6시간 정도의 이른 시기에 측정된 아폽토시스 CHO 세포의 %는, 2 내지 10일의 기간에 걸친 전형적인 해동 조절 실험에서만 통상적으로 수득되는, CHO 세포의 냉동보존 전략의 성공에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한, 안넥신 V와의 항온배양 단계가 해동 후 냉동보존 세포의 배양 개시 24시간, 바람직하게는 18시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 더욱 바람직하게는 9시간, 보다 더욱 바람직하게는 6시간 내에 수행되는, CHO 세포 뱅크의 특성을 규명하거나 또는 세포 뱅크의 활력 비를 측정하는 방법을 제공한다.

CHO 세포는 장기간 동안 약 -196℃의 액체 질소에서 성공적으로 보관될 수 있다. 그러나, 세포는 통상적으로 DMSO와 같은 동결보호제의 첨가 없이는 냉동 및 해동될 수 없다. 이러한 경우에도, 냉동-해동 과정은 세포의 손실을 초래할 것이다. 이러한 손실량에 대한 중요한 매개변수는 냉동 및 해동 과정에 사용되는 프로토콜이다. 일반적으로, 온도가 분당 약 1도의 속도로 저하되도록 냉동 중에 온도 감소를 조절하는 것이 유익하다. CHO 세포를 성공적으로 해동시키기 위하여, 냉동바이알(cryovial) (해동된 세포)을 거의 모든 CHO 세포주의 최적 배양 온도인 37℃로 가능한 신속히 가온하는 것이 요구된다. 해동 후 배양물의 높은 회수율을 보장하는 한가지 방법은 다량의 혈청을 함유하는 배지에 세포를 냉동시키는 것이다.

최근에, 많은 연구가 냉동 배지에서 혈청을 사용하지 않으면서 CHO 세포를 냉동보존하는 전략을 개발하는데 집중되었다. 각종 동결보호제가 혈청의 부재하에 세포의 성공적인 장기간의 보관을 용이하게 할 수 있다. 추가로, 기본 배지 그 자체의 조성이 모든 냉동보존의 성공에 상당한 영향을 미친다. 이러한 모든 전략의 기재된 신속처리(fast-track) 품질 평가는, 새로운 CHO 생산 세포주에 대한 마스터 또는 제조용 세포 뱅크의 제조를 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 만드는데 필요한 개발 시간을 과감히 줄일 수 있을 것이다. 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 또한, CHO 세포의 냉동보존용 배양 배지의 용도와 관련하여, a) CHO 세포를 배양하는데 적합한 배양 배지에서, 바람직하게는 -100℃에서, 예를 들어 액체 질소 중에서 CHO 세포를 냉동보존하는 단계, b) 냉동보존된 세포의 일부 또는 전부를 해동시키는 단계, c) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; d) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; f) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 g) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, CHO 세포에 대한 배양 배지를 분석하는 방법을 제공한다. 적합한 배양 배지는 시판 배지, 예를 들어 Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베고 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium) (MEM; Sigma), 이스코브 변형 둘베고 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S (Invtirogen), 무혈청 CHO 배지 (Sigma), 및 단백질 부재 CHO 배지 (Sigma)를 이용하는 것들이다. 바람직한 방법에 따르면, 상기 배지는 특정한 동결보호제, 예를 들어 DMSO, BSA, 메틸셀룰로스 또는 글리신을 포함한다. 이러한 방법의 보다 바람직한 태양에 따르면, 안넥신 V와의 항온배양 단계는 해동 후 냉동보존 세포의 배양 개시 24시간, 바람직하게는 18시간, 보다 바람직하게는 12시간, 보다 더 바람직하게는 9시간, 보다 더 바람직하게는 6시간 이내에 수행된다. 유동 세포계산 검정에 FITC-표지화된 안넥신 V를 사용하는 것이 본 발명의 더욱더 바람직한 태양이다.

앞서 전반적으로 기재된 발명은, 본 발명의 특정 태양을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 어떤 식으로든 제한하고자 포함된 것이 아닌 아래의 실시예를 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 것이다.

약어

BSA: 소 혈청 알부민

CHO: 중국 햄스터 난소

DMSO: 디메틸 설폭시드

ELISA: 효소-연결된 면역흡착 검정

FACS: 형광성 활성화된 세포 분류기

FITC: 플루오레스세인 이소티아시네이트

MCB: 마스터 세포 뱅크

PBS: 포스페이트 완충된 염수

PCR: 중합효소 연쇄 반응

PI: 프로피듐 요오다이드

PPCB: 제조후 세포 뱅크

PS: 포스파티딜세린

WCB: 제조용 세포 뱅크

방법

세포 배양

생물약제의 제조 및 개발을 위해 사용된 여러 CHO 현탁 세포주의 세포 뱅크를 연구하였다. 사용된 모든 세포주는 소유권이 있으며, 이들의 단백질 제품은 밝힐 수 없다. 제조 및 개발 규모로 사용된 모든 세포주는, 항온배양기 (Thermo, Germany) 내의 표면-통기된 T-플라스크 (Nunc, Denmark)에서 또는 공기와 5% CO₂의 적당한 혼합물을 함유하는, 37℃의 특별히 설계된 항온배양기 실내의 살포 스피너 (sparged spinner) 플라스크 (Wheaton, USA)에서 일련의 시드스톡(seedstock) 배양으로 유지시켰다. 시드스톡 배양물을 적당한 분할비 및 시드 밀도에 따라 2 내지 3일 마다 분할하였다. 세포 농도를 혈구계수기를 사용하여 모든 배양물에서 측정하였다. 생존력을 트립판 블루 배제법으로 평가하였다. 마스터, 제조용 또는 안전성 세포 뱅크로부터 기원하는 배양물을 멸균성, 미코플라스마 및 외래 제제의 존재에 대하여 철저히 시험하였다. 모든 작업은 공기-여과된 실험실에서 현재의 우수 의약품 제조기준 (Good Manufacturing Practices (cGMP))을 따르는 엄격한 절차하에 이루어졌다. 사용된 모든 배양 배지는 소유권이 있으며 이들의 조성은 밝힐 수 없다.

냉동보존

냉동 및 해동을 표준 프로토콜 및 기본 원칙 "냉동 약하게 해동 신속히"에 따라 수행하였다. 현탁 배양물의 지수 상으로부터 배양물을 채취하여, 특별히 설계된 냉동 프로그램이 구비된 컴퓨터-제어 냉동기 (Consarctic, Germany)를 사용하거나 또는 -70 ℃ 냉동고 내의 스티로폼 박스를 사용하여 1.8ml 플라스틱 바이알 (Nunc, Demark)내에서 냉동시켰다. -100 ℃ (냉동기) 또는 -70 ℃ (스티로폼 박스)로 냉동시킨 후, 세포를 액체 질소 용기로 옮겼다. 바이알을 액체 질소의 가스(<-150 ℃)상에서 보관하였다. 냉동 바이알 중의 세포 농도는 1-3E7 세포였다. DMSO (Merck, Germany)를 10% 농도에서 동결보호제로서 사용하였다. 사용된 세부적인 냉동 배지는 소유권이 있으므로 이의 조성은 밝힐 수 없다. CHO 세포를 37 ℃의 수조에서 해동시키고, 적당한 배지로 희석시키고, 180xg로 원심분리(Thermo, France)하였다. 이어서, 세포를 규정된 세포 농도를 가진 배양 배지 중에 시딩하였다.

유동 세포계산

녹색 안넥신-V-FITC 및 적색 PI 형광을, Expo32 소프트웨어를 사용하는 Coulter Epics XL 유동 세포계산기 (Coulter, Germany)로 측정하였다. 여기는 아르곤 레이저를 사용한 488nm에서 유도되었으며 표준 대역 투과 (530 ±20nm) 필터 및 장파 투과 (>570nm) 필터를 사용하여 측정하였다. 각 샘플에서, 아폽토시스에 대한 10.000 이벤트 및 세포 사이클 분석에 대한 3.000 이벤트가 측정되었다. 데이터를 Expo32 분석 도구로 분석하였다. 사멸 세포와 아폽토시스 세포 간의 구별을 위하여, 막-불투과성 DNA 염료 프로피듐 요오다이드 (PI)를 세포 현탁액에 안넥신 V와 병행하여 첨가하였다. 이러한 이중 염색을 사용하는 경우에, 살아있는 세포, 초기-아폽토시스 세포, 후기-아폽토시스 세포 및 괴사 세포 간을 구별할 수 있다. 안넥신 V 검정을 판매인의 프로토콜 (Becton-Dickinson, Germany)에 따라 수행하였다. 세포를 분석하고 아폽토시스를 유동 세포계산기로 정량하였다. 프로피듐 요오다이드 염색을 사용하여 세포 사이클 분포를 추가로 측정하였다. 고정하지 않은 채로 세포 현탁액으로부터 샘플을 채취하였다. 배양물을 원심분리하고 PBS (Gibco, Germany)로 세척하였다. 이어서, PI 염색 용액 (BioSure, USA)을 첨가하고 항온배양을 30분간 진행하였다. 후속적으로, 세포를 유동 세포계산으로 분석하였다. 세포 사이클의 각 상의 세포의 비율은 Multicycle 프로그램 (Phoenix Flow, USA)을 통하여 수득하였다.

결과

냉동보존된 CHO 세포의 해동 도중의 세포 사멸의 정량 분석:

비록 세포 배양이 냉동보존 후 재개시되는 때에 CHO 세포가 사멸한다는 것이 공지되었지만, 이러한 세포 사멸의 반응속도론 및 특성은 상세히 기술되지 않았다. 해동 후 초기 시간 동안 CHO 세포의 세포 배양물에서 프로그램된 세포 사멸의 정도를 정량화하기 위하여, 본원 발명자들은 CHO 세포의 외막 상에 나타난 포스파티딜세린의 양을 측정하였다. CHO DG44 세포 및 이 세포주의 유도체가 생물약제의 제조에 널리 사용된다. 본원 발명자들은 CHO-유래 생산 세포주에 대해 생성된 220개 바이알의 세포 뱅크를 분석하였다. 세포 뱅크는, 동물 성분, 예를 들어 혈청이 부재하는 냉동 배지를 제조하였으며, 해동 후 배양 생존력에 있어서 특히 민감한 것으로 알려졌다. 세포를 0h, 3h, 6h, 24h 및 48h의 시점에 안넥신 V 및 프로피듐 요오다이드를 사용한 이중 염색으로 분석하였다. 약 30% 안넥신 V 양성 세포의 높은 %가 세포를 배양 배지 (Oh) 속에 넣은 직후 검출되었으며, 해동 후 처음 3시간 이내에 거의 50%로 증가하고, 해동 후 처음 48시간 동안 40% 이상을 유지했다. 지금까지 분석된 모든 CHO DG44 세포 뱅크의 경우에, 안넥신 V 양성 세포의 피크 수준은 해동 후 3시간 내지 24시간 사이에 도달하였다. 이와 반대로, PI 양성 세포의 양은 해동 직후에 비교적 낮게 유지된 후, 해동 후 24시간에 현저하게 증가되었다. 아폽토시스의 초기 단계에서, PS는 세포 표면 상에 나타나며, 안넥신 V는 이를 표적에 결합시킨다. 이러한 초기 단계에, 원형질막은 여전히 PI를 배제할 수 있으므로, 세포는 안넥신 V +/PI- 이다 (도 1, 하부 우측 사분면). 후속적으로, 세포들은 이들의 원형질막 완전성 및 이들의 PI 배제 능력을 상실한다. 이들 후기 아폽토시스 세포는 안넥신 V +/PI+ 이다 (도 1, 상부 우측 사분면). 따라서, 이들 실험은 초기로부터 후기 단계 아폽토시스로의 전이가 해동 후 처음 6시간 후에만 일어난다는 것을 입증한다. 이는 또한, 해동 후 약 24시간의 전이 시점에서 파괴된 세포 소체 (도 1)를 나타내는 매우 작은 세포에서의 증가를 보여주는 전면-측면 산란 도표 (도 1)에 제시되어있다.

안넥신 V 염색에 의한 해동 후 분석은 CHO 세포 뱅크 품질에 대한 조기 예견 마커로서 작용한다:

안넥신 V 염색에 의한 아폽토시스의 정량화가 매우 많은 수의 샘플에 대해 쉽게 수행될 수 있기 때문에, 이는 상이한 냉동보존 방법의 고 효율 분석을 위한 매력적인 방법을 제공한다. 본원의 발명자들은 안넥신 V 염색에 의해 2종의 상이한 CHO 생산 세포의 2종의 CHO 세포 뱅크를 분석하고, 이들 데이터를 배양 (표준 해동 조절) 중에 6회 계대 동안 측정된 트립판 블루 배제 염색과 비교하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 포스파티딜세린를 나타내는 세포의 양은 2종의 상이한 세포 뱅크로부터 해동된 배양물 간에 현저하게 달랐다 (해동 1에서 35 % 대 해동 2에서 67%). 전형적인 해동 조절 (도 2B)은 상이한 뱅크로부터의 배양물 생존력 간에 동일한 현저한 차이를 보여주었다. 해동 1은, 배양물이 해동 후 4일에 90% 이상의 생존력을 회복하기 전에, 83%로 저하됨을 입증했다. 이와 반대로, 해동 2 후 24시간에 세포의 60%만이 생존하였다. 이 배양물은, 트립판 블루 배제법에 의해 측정한 바에 따르면, 90% 생존력에 도달하는데 11일이 소요되었다. 이러한 품질의 세포 뱅크는 상업용 제조 공정에는 분명히 적합하지 않을 것이다. 이들 데이터는 놀 랍게도, 세포 표면에 PS를 나타내는 세포의 %가 전형적인 해동 조절의 해동 후 6시간 정도의 조기의 결과를 예견한다는 것을 입증한다.

세포 뱅크 품질은 상이한 세포주, 냉동보존 프로토콜 및 배양 배지의 품질 사이에서 급격하게 달라질 수 있다:

세포 뱅크 품질 평가를 위한 새로이 기재된 방법을 시험하기 위하여, 본원의 발명자들은 수많은 세포 뱅크를 분석하였다. 2종의 CHO DG44 세포 뱅크를 제조하였는데, 하나는 냉동 배지 중에 0.8% BSA를 함유하고, 다른 하나는 BSA를 함유하는 대신, 조절 배지 및 신선 배지의 50:50 혼합물을 함유한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 세포들은 두 냉동 배지 모두에 대해 초기 아폽토시스의 현저히 낮은 비를 보여주었다. 게다가, 조절 배지에 세포를 보관하는 것에 비해, 0.8% BSA를 첨가한 경우의 유익한 효과는, 스티로폼 박스를 사용하였을 때만 명백하였다.

신속처리(fast-track) 개발 전략을 위한 초기 해동 후 아폽토시스의 용도:

병원 및 시장 공급 시기는 새로운 생물약제의 성공적인 개발을 위한 중요한 매개변수이기 때문에, 공정 최적화 및 공정 개선을 위한 신속처리 스크리닝 방법에 관한 관심이 증가하고 있다. 따라서, 본원의 발명자들은, 새로운 CHO 생산 세포주의 성공적인 냉동보존을 확립하기 위한 전략을 평가하기 위하여 해동 후 바로 6시간에 안넥신 V 측정의 사용가능성을 결정하였다.

본원의 발명자들은 놀랍게도, 초기 해동 후 아폽토시스 측정이 원료 품질의 평가를 위한 민감한 수단이라는 것을 밝혀내었다. CHO 세포의 성공적인 냉동보존에 대한 필수 인자는 사용된 배지의 품질이다. 일반적으로, GMP는 CHO 세포 배양용 배지의 사용을 위한 명백히 규정된 만기일을 포함한다. 본원의 발명자들은 냉동-해동 과정의 조악한 조건이 표준 배양 과정에 비해 배지 사용의 기간을 단축시킬 수 있는지에 관하여 연구하였다. 본원의 발명자들은 이를 추가로 연구하기 위하여 CHO 세포의 배양을 위한 4주의 보관 수명을 가진 배지를 사용하였다. 도 4는, 새로이 제조된 배지 (도 4 하단), 4주 동안 4℃에서 보관된 배지 (도 4 상단), 및 4주 동안 4℃에서 보관되고 사용 직전에 필수 화합물의 신선한 제제를 보충한 배지 (도 4 중간)에서 냉동보존한 CHO 세포에 대한 초기 아폽토시스 데이터 (해동 후 4시간)를 보여준다. 이들 데이터는 만기일 직전에 상기 배지로 제조된 세포 뱅크에 대한 감소된 해동 성능을 보여준다. 이 효과는 관련 배지의 새로이 제조된 필수 성분을 첨가함으로써 현저히 감소될 수 있다. 해동 후 6시간의 세포 사이클 분포의 동시적 측정은 4주령 배지가 성장 억제 효과를 갖지 않는다는 것을 보여주었다. 이들 결과는 놀랍게도, 초기 해동 후 아폽토시스 측정이, CHO 세포의 냉동보존용 배지 제제의 용도와 관련하여, 배지 및 이의 성분의 민감한 분석에 어떻게 사용될 수 있는 지를 증명하였다.

참조문헌

Merten OW, Dev. Biol. Stand. 1999;99 167-80.

Gavrieli et al., et al., 1992. J Cell Biol. 1992 Nov;119(3):493-501.

Groth J, et al., J Immunol Methods. 1991 Jul 26;141(1):105-9.

Vaux DL, Korsmeyer SJ, Cell. 1999 Jan 22;96(2):245-54

Steensma DP, et al., Methods Mol. Med. 2003;85:323-32.

Claims

해동 후 CHO 세포의 냉동보존 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법에서 안넥신 V (Annexin V)의 용도.
제1항에 있어서, 방법이

a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계;

b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계;

d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계;

e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및

f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계

를 포함함을 특징으로 하는 용도.
a) 세포들을 세포 뱅크로서 액체 배지 중에 부분으로 나누어 냉동보존시키는 단계;

b) 상기 세포 뱅크의 냉동보존된 세포들의 일부를 해동시키는 단계;

c) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계;

d) 상기 세포를 안넥신 V로 염색시켜 상기 해동된 세포의 활력(vitality) 비를 확립하는 단계

를 포함하여, CHO 세포의 세포 뱅크의 품질을 결정하는 방법에서 안넥신 V의 용도.
제3항에 있어서, 안넥신 V 염색이

a) 해동 후 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계;

b) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계;

c) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및

d) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계

에 의해 제공됨을 특징으로 하는 용도.
해동 후 CHO 세포의 냉동보존 세포 뱅크의 특성을 규명하기 위한, 해동 후 냉동보존 세포의 활력 비를 측정하는데 사용되는 안넥신 V를 포함하는 키트의 용도.
제5항에 있어서, PBS 중에 프로피듐 요오다이드 염색 용액 및 안넥신 V 결합 완충제를 추가로 포함하는 키트의 용도.
제5항 또는 제6항에 있어서, 활력 비를 측정하는 방법이

a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계;

b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계;

d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계;

e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및

f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계

를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제4항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 안넥신 V와의 항온배양 단계를 해동 후 세포의 배양 개시 24 시간 이내에 수행함을 특징으로 하는 용도.
제8항에 있어서, 안넥신 V와의 항온배양 단계를 해동 후 세포의 배양 개시 6 시간 이내에 수행함을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 안넥신 V를 플루오레스세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지화함을 특징으로 하는 용도.
a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계;

b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계;

d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계;

e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및

f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계

를 포함하여, CHO 세포의 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법.
a) 냉동보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계;

b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계;

c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온배양하는 단계;

d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계;

e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및

f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계

를 포함하여, 해동 후 CHO 세포의 세포 뱅크의 활력 비를 측정하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 안넥신 V와의 항온배양 단계를 해동 후 세포의 배양 개시 24 시간 이내에 수행함을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 안넥신 V와의 항온배양 단계를 해동 후 세포의 배양 개시 6 시간 이내에 수행함을 특징으로 하는 방법.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 염색을 플루오레스세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지화된 안넥신 V를 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.