JP2006068002A - 生細胞の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 (1)試料に蛍光染料を添加・接触させて細胞を蛍光染色し、(2)前記蛍光染料で染色した試料に、(a)生細胞の細胞膜を透過でき、(b)生細胞内のpHでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、(c)生細胞内のpHと異なるpHにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のpHと異なるpH条件下で添加し、若しくは接触させ、(3)前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のpHと異なるpH条件下で、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出することにより生細胞の検出を行う。
【選択図】 なし
Description
素基、R8〜R12は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
本発明においては、試料に直接蛍光染料溶液を添加することにより細胞を染色することもできるが、以下の(i)〜(iii)に示すように、試料中の細胞をフィルタや粘着シート等に固定した後、蛍光染料で染色することもできる。
上記(i)で得られたフィルタ上にトラップされた細胞をそのまま蛍光染色することもできるが、上記フィルタの濾過面全体に粘着シートを貼り付け、粘着シートの粘着層にフィルタ上にトラップされた細胞を転写してから蛍光染色してもよい。
上記(i)で得られたフィルタ上にトラップされた細胞あるいは上記(ii)で得られた粘着シートに転写された細胞を蛍光染料で染色する。
消光染料は、用いる染料に応じて適当なpH(生細胞内のpHより弱酸性(約pH5〜6.8)もしくは弱アルカリ性(約pH7.4〜9)であって、且つ生細胞内のpHと異なるpH)の緩衝液に溶解して用いられる。消光染料溶液のpHが極端に酸性やアルカリ性であると、蛍光染料の蛍光を十分に吸収・消光できなかったり、生細胞が死ぬおそれがあるため好ましくない。
(3)前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程
上記のようにして、蛍光染料と消光染料で染色したフィルタあるいは粘着シートに、蛍光染料の励起光(例えば、CFDAの場合は波長400〜495nm)を照射し、フィルタの濾過面あるいは粘着シートの粘着層表面上の蛍光の画像をCCDカメラ、カラーカメラ、白黒カメラ等によって取り込む。
・エッジの検出(ソーベル、プレヴィット等の画像処理フィルタで処理)
・2値化処理
・各輝点のナンバリングと面積計算
を行った後、使用者が設定した所定のサイズに合致する輝点を検出する。
C=A×Sm/(Sp×V)
図3には、本発明の生細胞の検出方法において好適に用いられる検出装置の一実施形態が示されている。
・タンパク質分解酵素溶液:2%トリプシン溶液(溶媒は生理食塩水)を無菌濾過したもの
・蛍光染料溶液:CFDAを300μg/mLとなるようにリン酸緩衝液(pH8.6)に溶解した後、0.2μmのフィルタで濾過したもの
・消光染料溶液:フェノールレッドを1mg/mLとなるようにリン酸緩衝液(pH8.6)に溶解した後、0.2μmのフィルタで濾過したもの
・洗浄液:リン酸緩衝液(pH8.6)
試料である生乳1mLと、上記界面活性剤溶液20μLと、上記タンパク質分解酵素溶液250μLとを、マイクロチューブ(トレフ社製1.5mL微量遠心チューブ、型番No.96.7246.9.01をオートクレーブ滅菌して使用)に入れて、試験管ミキサーで10秒混合した。そして、42℃の恒温水槽に上記マイクロチューブを浮かべ、10分間保温した後、室温(約25℃)で3分間遠心分離(7300×g)した。
2.固定台
3.鏡筒
4.レンズ
5、8.バンドパスフィルタ
6.画像取り込み手段
7.励起光源
9.ダイクロイックミラー
10.生細胞の検出装置
Claims (12)
- (1)試料に蛍光染料を添加し、若しくは接触させて細胞を蛍光染色する工程と、(2)前記蛍光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を添加し、若しくは接触させる工程と、(3)前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料に、前記蛍光染料の励起光を照射して、前記試料が発する蛍光を捕集、検出する工程とを有する生細胞の検出方法であって、
前記工程(2)において、(a)生細胞の細胞膜を透過でき、(b)生細胞内のpHでは前記蛍光染料の蛍光を吸収し難く、(c)生細胞内のpHと異なるpHにおいて前記蛍光染料の蛍光を吸収する、性質を有する消光染料を、生細胞内のpHと異なるpH条件下で添加し、若しくは接触させ、
前記工程(3)において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を、生細胞内のpHと異なるpH条件下に保つことを特徴とする生細胞の検出方法。 - 前記蛍光染料として、生細胞のみを染色できる蛍光染料を使用する請求項1に記載の生細胞の検出方法。
- 前記蛍光染料として、核酸を蛍光標識する物質、又は酵素分解されると蛍光性を有するようになる酵素基質を用いる、請求項1又は2に記載の生細胞の検出方法。
- 前記消光染料は、前記蛍光染料の蛍光波長を吸収する共役二重結合を有する化合物である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の生細胞の検出方法。
- 前記消光染料は、少なくとも2つの芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項4に記載の生細胞の検出方法。
- 前記消光染料は、少なくとも1つの縮合芳香族環を有する芳香族化合物である、請求項4に記載の生細胞の検出方法。
- 前記消光染料は、不飽和炭化水素構造を有する化合物である、請求項4に記載の生細胞の検出方法。
- 前記消光染料は、下記構造式(I)〜(IX)に示されるいずれかの化合物又はアントシアン類である、請求項1〜4のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
上記構造式(I)〜(III)及び(V)中のR1〜R11は、水素原子、メチル基、炭素原子が少なくとも2個以上からなる脂肪鎖又は脂肪酸エステル、ヨウ素、臭素を示し、同一若しくは異なっていてもよい。
上記構造式(VII)中のMeは、鉄、銅又はマグネシウムを示し、R1〜R7は炭化水素基、R8〜R12は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
上記構造式(VIII)中のR1〜R8は炭化水素基、R9〜R12は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示す。
上記構造式(IX)中のR1〜R4は炭化水素基、水素原子又は炭素原子を示し、nは1〜11の整数である。 - 前記工程(2)において、アルカリ性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程(3)において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料をアルカリ性条件下に保つ、請求項1〜8のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
- 前記工程(2)において、酸性条件下において前記蛍光染料の蛍光を吸収する性質を有する消光染料を用い、前記工程(3)において、前記蛍光染料及び前記消光染料で染色した試料を酸性条件下に保つ、請求項1〜8のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
- 前記工程(3)において、前記試料が発する蛍光のうち、前記蛍光染料の蛍光波長の光のみを捕集し、その蛍光像を取り込む、請求項1〜10のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
- 前記工程(3)において、前記試料が発する蛍光を捕集し、捕集した蛍光をカラー画像として取り込み、前記蛍光染料に由来する蛍光と、それ以外の蛍光とを区別する、請求項1〜10のいずれか一つに記載の生細胞の検出方法。
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