JP2017083426A - 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 - Google Patents
細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017083426A JP2017083426A JP2016145835A JP2016145835A JP2017083426A JP 2017083426 A JP2017083426 A JP 2017083426A JP 2016145835 A JP2016145835 A JP 2016145835A JP 2016145835 A JP2016145835 A JP 2016145835A JP 2017083426 A JP2017083426 A JP 2017083426A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- cell
- light
- fluorescent
- information acquisition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 65
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 339
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 185
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 86
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 75
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 67
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 31
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 claims description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 114
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 114
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 24
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 22
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 20
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 19
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 14
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 13
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 5
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000005747 Transcription Factor RelA Human genes 0.000 description 2
- 108010031154 Transcription Factor RelA Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
実施形態1は、細胞に含まれる被検物質に互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、蛍光物質から生じる複数の蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する細胞情報取得方法に、本発明を適用したものである。実施形態1では、被検物質はNF−κBである。転写因子であるNF−κBは、IκBと複合体を形成した状態で細胞質内に存在し、種々の刺激によるIκBの分解により核の内部に移行すると考えられている。実施形態1では、NF−κBを被検物質として蛍光物質で特異的に標識し、蛍光物質からの蛍光に基づいて、NF−κBが細胞質と核のいずれに存在するかを判定する解析が行われる。なお、被検物質は、NF−κB以外のタンパク質や分子であっても良い。たとえば、被検物質は、NF−κB以外の転写因子であっても良く、たとえば、STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription)、NFAT(nuclear factor of activated T cells)、HIF(hypoxia-inducible factor)であっても良い。また、被検物質は、mRNAやmicroRNAであっても良い。また、「被検物質に複数の蛍光物質を結合させる」とは、必ずしも細胞に含まれる同種の被検物質の各分子の全てが複数の蛍光物質と結合していなくてもよく、少なくとも一部の同種の被検物質の分子に複数の蛍光物質が特異的に結合していればよい。また、局在状況の判別は、被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているかの判別に限らない。たとえば、神経細胞のように突起形状を有している場合に、被検物質が突起の先端に局在しているのか否かを判別してもよい。
細胞質局在率={N2/(N1+N2)}×100
次に、発明者が行った実施形態1の検証について説明する。
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4))を用意した。一次抗体として、NF−κB p65 (D14E12) XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technologies #8242S)を用意した。二次抗体として、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate(Life technologies A-21245)、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate(Life technologies A-11008)を用意した。二次抗体には、蛍光色素として、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488が結合している。核染色色素として、Cellstain Hoechst 33342 solution(DOjinDO H342)を用意した。この他、EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(Lonza Cat No. CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No. 7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(ナカライテスク CatNo.35501-15)を用意した。
500mLのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots KitのFBS以外の試薬を添加し、100mLを滅菌ボトルへ移し、無血清培地を作製した。無血清培地作製の残量(400mL)に、SingleQuots KitのFBSを20mL添加して、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度8% w/vとなるようにpH12のPBSにて溶解した後に、pH7.4に調整した。PBSに1.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、3% BSA/PBSを調製した。PBSに0.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、1% BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度0.1% w/vとなるようにPBSにて調製した。
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数6回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を3週間とした。TNF-α刺激培養は、約70%コンフルエントのHMVEC-C細胞の培養上清を除き、終濃度25ng/mLとなるようRecombinant Human TNF-alphaを添加したEGM-2MV培地を加え、37℃ CO2インキュベーター内で1時間静置した。3mL程度残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した懸濁液と等量の8% PFA/PBSを加え、室温で15分反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。細胞ペレットを1mLのPBSで2回洗浄した。上清を除去し、0.1% Triton X-100/PBSを1mL加えて、室温15分反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。1mLの1% BSA/PBSで2回洗浄した。上清を除去し、3% BSA/PBSを1mL加えて、室温で30分静置した。3% BSA/PBSで1/1600とした400μLの一次抗体を添加した。室温で1時間反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。1mLの1% BSA/PBSで洗浄した。3% BSA/PBSで1/1000とした400μLの二次抗体を添加した。室温で30分反応させた。1mLの1% BSA/PBSで2回洗浄した。上清を除去し、1% BSA/PBSを50μL添加した。
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記3に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長488nm、647nm、405nmのレーザ光を照射した。波長488nm、647nm、405nmのレーザ光は、上記波長λ1、λ2、λ3のレーザ光に対応する。波長488nm、647nm、405nmのレーザ光の出射パワーは、それぞれ、55mW、10mW、120mWとした。波長488nm、647nmのレーザ光がNF−κBを標識する2種類の蛍光色素に照射されることにより、それぞれ、高強度の蛍光と低強度の蛍光が生じた。波長405nmのレーザ光が核染色色素に照射されることにより蛍光が生じた。
取得された画像を目視することにより、細胞ごとにNF−κBの局在を判別した。この判別は、上記ステップS4と同様に行われた。すなわち、核からの蛍光画像に基づいて核の領域を設定し、核の領域以外の領域を細胞質の領域とした。そして、核の蛍光強度が細胞質の蛍光強度の約2倍以上と考えられる場合、この細胞においてNF−κBが核に局在していると判別し、核の蛍光強度が細胞質の蛍光強度の約2倍未満と考えられる場合、この細胞においてNF−κBが細胞質に局在していると判別した。
実施形態1の細胞情報取得方法に基づいて、細胞画像を撮像し、細胞における被検物質の局在を判別するための細胞情報取得装置の構成について説明する。
実施形態2では、2つの光を用いるのではなく、波長λ1の光のみを用いて互いに異なる強度の蛍光を取得する。実施形態2では、実施形態1と比較して、図1に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップS1、S2における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態1とは異なる手順について説明する。
実施形態3では、2つの光と2つの蛍光物質を用いるのではなく、1つの波長λ1の光と1つの蛍光物質11を用いて、互いに異なる強度の蛍光を取得する。実施形態3では、実施形態1と比較して、図1に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップS1、S2における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態1とは異なる手順について説明する。
次に、発明者が行った実施形態3の検証について説明する。
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4))を用意した。一次抗体として、NF−κB p65 (D14E12) XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technologies #8242S)を用意した。二次抗体として、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate(Life technologies A-21245)を用意した。二次抗体には、蛍光色素として、Alexa Fluor 647が結合している。この他、EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(Lonza Cat No. CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No. 7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(ナカライテスク CatNo.35501-15)を用意した。
500mLのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots Kitを添加し、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度8% w/vとなるようにpH12のPBSにて溶解した後に、pH7.4に調整した。PBSに1.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、3% BSA/PBSを調製した。PBSに0.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、1% BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度0.1% w/vとなるようにPBSにて調製した。
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数6回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を3週間とした。TNF-α刺激培養は、約70%コンフルエントのHMVEC-C細胞の培養上清を除き、終濃度25ng/mLとなるようRecombinant Human TNF-alphaを添加したEGM-2MV培地を加え、37℃ CO2インキュベーター内で1時間静置した。3mL程度残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した懸濁液と等量の8% PFA/PBSを加え、室温で15分反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。細胞ペレットを1mLのPBSで2回洗浄した。上清を除去し、0.1% Triton X-100/PBSを1mL加えて、室温15分反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。1mLの1% BSA/PBSで2回洗浄した。上清を除去し、3% BSA/PBSを1mL加えて、室温で30分静置した。3% BSA/PBSで1/1600とした400μLの一次抗体を添加した。室温で1時間反応させた。室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。1mLの1% BSA/PBSで洗浄した。3% BSA/PBSで1/1000とした400μLの二次抗体を添加した。室温で30分反応させた。1mLの1% BSA/PBSで2回洗浄した。上清を除去し、1% BSA/PBSを50μL添加した。
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記3に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長647nmのレーザ光を照射した。波長647nmのレーザ光は、図12に示す波長λ1のレーザ光に対応する。波長647nmのレーザ光の出射パワーは、10mWとした。波長647nmのレーザ光がNF−κBを標識する蛍光色素に照射されることにより蛍光が生じた。
図15に示すように、実施形態3の装置構成では、実施形態1と比較して、図6に示す光学検出部130のうち、光源302と、集光レンズ312と、ダイクロイックミラー321が省略され、フィルタ部材412、422に代えて、それぞれフィルタ部材414、425が追加される。フィルタ部材414は、フィルタ部材411を透過した光のうち、波長帯域B4の光を反射し、波長帯域B4以外の光を透過する。フィルタ部材425は、フィルタ部材414によって反射された光のうち、波長帯域B4の光のみを透過し、波長帯域B4以外の光を遮断する。このように、フィルタ部材414、425は、フローセル200から生じた光のうち、波長帯域B4の蛍光のみを分離可能に構成される。受光部502は、波長帯域B4の低強度の蛍光を撮像する。
実施形態4では、実施形態1と比較して、図1に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップS1、S2における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態1とは異なる手順について説明する。
実施形態5では、実施形態1と比較して、図1に示す細胞情報取得方法のステップのうち、ステップS2における一部の手順のみが異なる。以下、実施形態1とは異なる手順について説明する。
実施形態6では、細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせ、生じた蛍光物質に光を照射し、光の照射により蛍光物質から生じた蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する。実施形態6では、被検物質は細胞質である。基質は、被検物質に触れると切断される切断部位を含み、切断部位が切断されると蛍光物質を生じる。より具体的には、基質は被検物質である細胞質に触れることで、細胞質中に存在する酵素により切断される。実施形態6では、細胞質を標識する蛍光物質からの蛍光に基づいて、細胞質の局在を判定する。なお、被検物質は、たとえば、細胞質中のタンパク質、細胞小器官、細胞膜等、細胞に含まれる細胞質以外の物質であってもよい。
次に、発明者が行った実施形態6の検証について説明する。
細胞として、ヒト心臓微小血管内皮細胞(HMVEC-C)(Lonza CatNo.CC-7030, Lot No.0000296500 (P4))を用意した。細胞質標識試薬として、Cell Explorer Fixable Live Cell Tracking Kit *Green Fluorescence*(コスモバイオ 22621)を用意した。細胞質標識試薬は、図20に示す基質16aに対応する物質を含む。細胞質標識試薬は、疎水性を有している。細胞質標識試薬は、細胞膜を通過し、細胞内エステラーゼで加水分解されることで蛍光物質を生じる。ここで生じる蛍光物質は、図20に示す蛍光物質16bに対応する。核染色色素として、Cellstain Hoechst 33342 solution(DOjinDO H342)を用意した。この他、EGM-2MV Medium(Lonza Cat No.CC-3202)、EGM-2MV SingleQuots Kit(Lonza Cat No. CC-3202)、PBS pH7.4(GIBCO Cat No.10010-023)、BSA(LAMPIRE Cat No. 7500805)、PFA(WAKO Cat No.160-16061)、TritonX100(ナカライテスク CatNo.35501-15)を用意した。
500mLのEGM-2MV MediumにEGM-2MV SingleQuots Kitを添加し、培養培地を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度8% w/vとなるようにpH12のPBSにて溶解した後に、pH7.4に調整した。PBSに1.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、3% BSA/PBSを調製した。PBSに0.5gのBSAを加えて溶解させ50mLにメスアップし、1% BSA/PBSを調製した。TritonX100を終濃度0.1% w/vとなるようにPBSにて調製した。Track kit Greenのバイアルに100μLのDMSOを添加し、1000× Track kit Green stock solutionを作製し、Kit付属のAssay bufferに1/1000量添加することで、Track kit working solutionを調整した。
HMVEC-Cは、メーカー推奨プロトコルに準じてEGM-2MV培地にて培養した。購入後から継代回数6回以内の細胞を本検証に用いた。培養培地は開封後の使用期限を3週間とした。細胞が70%コンフルエントに培養された後に、3mL程度の培地を残して電動ピペッターで培地を除去し、スクレーパーにて細胞を剥離した。回収した3mLの懸濁液に3μLのTrack kit working solutionを加え、37℃ CO2インキュベーター内で30分静置した。30分静置後、室温下、1000rpmで3分間遠心分離した。細胞ペレットを5mLのPBSで3回洗浄した。上清を除去し、1% BSA/PBSを50μL添加した。
蛍光画像を取得可能なフローサイトメータとして、ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Merck Millipore)を用いた。このフローサイトメータのフローセルに上記3に沿って調製した試料を流し、フローセルを流れる試料に、波長488nm、405nmのレーザ光を照射した。波長488nm、405nmのレーザ光は、図20に示す波長λ1、λ3のレーザ光に対応する。波長488nm、405nmのレーザ光の出射パワーは、それぞれ、50mW、20mWとした。波長488nmのレーザ光が細胞質を標識する蛍光色素に照射されることにより蛍光が生じた。波長405nmのレーザ光が核染色色素に照射されることにより蛍光が生じた。
実施形態7では、細胞に含まれる被検物質に2種類の基質を接触させて2種類の蛍光物質を生じさせ、生じた2種類の蛍光物質に光を照射し、光の照射により2種類の蛍光物質から生じた蛍光に基づいて被検物質の局在状況を判別する。すなわち、実施形態7では、実施形態6のように1つの光を用いるのではなく、互いに異なる波長の光を用いて互いに異なる強度の蛍光を取得する。なお、被検物質に1種類の基質を接触させて2種類の蛍光物質を生じさせてもよい。
16a、17a、18a 基質
16b、17b、18b 蛍光物質
21、22、24 フィルタ部材
100 細胞情報取得装置
111 取得部
112 解析部
200 フローセル
300 光照射部
301、302 光源
411、412、414、421、422、425、451、452、481 フィルタ部材
501、502、505 受光部
Claims (28)
- 細胞に含まれる被検物質に、互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を結合させ、
前記細胞に光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が異なる蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する、細胞情報取得方法。 - 細胞に含まれる被検物質に、基質を接触させて互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質を生じさせ、
前記細胞に光を照射して前記複数の蛍光物質から波長および強度が異なる蛍光を生じさせ、
生じた前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する、細胞情報取得方法。 - 前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、請求項1または2に記載の細胞情報取得方法。
- 前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の局在状況を判別する、請求項1ないし3の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記複数の蛍光情報に基づいて、前記被検物質が核に局在しているか細胞質に局在しているか判別する、請求項1ないし4の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記複数の蛍光物質は、励起用の光の波長が互いに異なっている、請求項1ないし5の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記細胞に、第1の光および前記第1の光より強度の弱い第2の光を照射する、請求項1ないし6の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記複数の蛍光物質は、同一波長の光が照射されることにより生じる蛍光の波長および強度が互いに異なっている、請求項1ないし5の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記複数の蛍光物質から生じた各蛍光を、第1の蛍光と、前記第1の蛍光より強度の弱い第2の蛍光と、に分離する、請求項1ないし8の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 細胞に含まれる被検物質に蛍光物質を結合させ、
前記細胞に光を照射して前記蛍光物質から蛍光を生じさせ、
生じた前記蛍光から波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、
取得した前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、細胞情報取得方法。 - 細胞に含まれる被検物質に基質を接触させて蛍光物質を生じさせ、
前記細胞に光を照射して前記蛍光物質から蛍光を生じさせ、
生じた前記蛍光から波長および強度の異なる複数の蛍光を取得し、
取得した前記各蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得し、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する、細胞情報取得方法。 - 前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の局在状況を判別する、請求項10または11に記載の細胞情報取得方法。
- 前記蛍光物質から生じた前記蛍光を、第1の蛍光と、前記第1の蛍光より強度の弱い第2の蛍光と、に分離する、請求項10ないし12の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 第1の光が照射された前記細胞から生じた第1の蛍光波長の第1の蛍光画像を取得し、
前記第1の光より強度の弱い第2の光が照射された前記細胞から生じた第2の蛍光波長の第2の蛍光画像を取得する、請求項1ないし13の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。 - 前記細胞を含む試料をフローセルに流し、
前記フローセルを流れる前記細胞に光を照射して、前記蛍光を生じさせる、請求項1ないし14何れか一項に記載の細胞情報取得方法。 - 前記被検物質の前記局在状況の判別は、前記細胞の解析対象部位における前記被検物質の局在量の、前記細胞全体における前記被検物質の局在量に対する割合の算出を含む、請求項4または12に記載の細胞情報取得方法。
- 前記被検物質の前記局在状況の判別は、強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記強度が所定の範囲に含まれる前記蛍光から得られた前記蛍光情報に基づいて行われる、請求項4、12、または16に記載の細胞情報取得方法。
- 前記被検物質の前記局在状況の判別は、強度が異なる複数の前記蛍光から得られた前記蛍光情報のうち、前記細胞の解析対象部位における蛍光強度と、前記解析対象部位以外の前記細胞部分における蛍光強度との差が、所定の閾値より大きい前記蛍光情報に基づいて行われる、請求項4、12、16、または17の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 前記被検物質は、タンパク質、mRNA、microRNA、細胞質、細胞小器官、または細胞膜である、請求項1ないし18の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 試料に含まれる前記細胞のうち前記被検物質が特定の部位に局在する細胞の割合または数を、前記複数の蛍光情報に基づいて算出する、請求項1ないし19の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
- 互いに蛍光波長が異なる複数の蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に光を照射して、前記複数の蛍光物質から波長および強度が異なる蛍光を生じさせる光照射部と、
前記複数の蛍光物質から生じた前記各蛍光を受光する受光部と、
強度が異なる前記蛍光に基づいて複数の蛍光情報を取得する取得部と、を備える、細胞情報取得装置。 - 前記光照射部は、第1の光を照射する第1の光源と、前記第1の光とは波長が異なり前記第1の光より強度の弱い第2の光を照射する第2の光源と、を備える、請求項21に記載の細胞情報取得装置。
- 前記複数の蛍光物質から生じた各蛍光を分離するためのフィルタ部材を備える、請求項21または22に記載の細胞情報取得装置。
- 第1の蛍光を受光する第1の受光部と、前記第1の蛍光より強度の弱い第2の蛍光を受光する第2の蛍光を受光する第2の受光部と、を備える、請求項21ないし23の何れか一項に記載の細胞情報取得装置。
- 前記取得部は、第1の光が照射された前記細胞から生じた第1の蛍光波長の第1の蛍光画像と、前記第1の光より強度の弱い第2の光が照射された前記細胞から生じた第2の蛍光波長の第2の蛍光画像を取得する、請求項21ないし24の何れか一項に記載の細胞情報取得装置。
- 蛍光物質が結合した被検物質を含む細胞に光を照射して前記蛍光物質から蛍光を生じさせる光照射部と、
前記蛍光物質から生じた波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、
受光した前記複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える、細胞情報取得装置。 - 基質に接触することにより蛍光物質を生じさせた被検物質を含む細胞に光を照射して前記蛍光物質から蛍光を生じさせる光照射部と、
前記蛍光物質から生じた波長および強度の異なる複数の蛍光を受光する受光部と、
受光した前記複数の蛍光に基づいて、複数の蛍光情報を取得する取得部と、
前記複数の蛍光情報に基づいて、前記細胞における前記被検物質の分布状況を判別する解析部と、を備える、細胞情報取得装置。 - 前記蛍光物質から生じた前記蛍光を、第1の蛍光と、強度の弱い第2の蛍光と、に分離するためのフィルタ部材を備える、請求項26または27に記載の細胞情報取得装置。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16195497.9A EP3163287B1 (en) | 2015-10-30 | 2016-10-25 | Cell information obtaining method and cell information obtaining apparatus |
US15/335,719 US10145794B2 (en) | 2015-10-30 | 2016-10-27 | Cell information obtaining method and cell information obtaining apparatus |
CN201610958244.XA CN106645713B (zh) | 2015-10-30 | 2016-10-28 | 细胞信息获取方法以及细胞信息获取装置 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015215201 | 2015-10-30 | ||
JP2015215201 | 2015-10-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017083426A true JP2017083426A (ja) | 2017-05-18 |
JP6824654B2 JP6824654B2 (ja) | 2021-02-03 |
Family
ID=58714098
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016145835A Active JP6824654B2 (ja) | 2015-10-30 | 2016-07-25 | 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6824654B2 (ja) |
CN (1) | CN106645713B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109387512A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 希森美康株式会社 | 试样处理装置、试样处理系统及测定时间的计算方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6834907B2 (ja) * | 2017-10-25 | 2021-02-24 | トヨタ自動車株式会社 | 撮像方法 |
JP7054619B2 (ja) * | 2017-11-30 | 2022-04-14 | シスメックス株式会社 | 画像分析装置および画像分析方法 |
JP2020094925A (ja) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | 住友電気工業株式会社 | 品質評価方法 |
US20200200671A1 (en) * | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Sony Corporation | Information processing apparatus, information processing method, and program |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509827A (ja) * | 1997-02-27 | 2000-08-02 | セロミックス インコーポレイテッド | 細胞に基づくスクリーニングシステム |
JP2004301561A (ja) * | 2003-03-28 | 2004-10-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 分光学的識別定量システム |
WO2005036143A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Hamamatsu Photonics K.K. | 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム |
JP2006068002A (ja) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 生細胞の検出方法 |
JP2007225381A (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Osaka Prefecture Univ | 蛍光測定方法及び蛍光顕微鏡 |
JP2010512508A (ja) * | 2006-12-20 | 2010-04-22 | ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド | 量子ドットで染色された組織試料の定量的マルチ・スペクトル画像の分析 |
US20110278471A1 (en) * | 2009-01-23 | 2011-11-17 | Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd | Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method |
JP2012032183A (ja) * | 2010-07-28 | 2012-02-16 | Olympus Corp | 試料観測装置および試料観測方法 |
US20150132766A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-05-14 | On-Chip Cellomics Consortium | Imaging cell sorter |
JP2015096846A (ja) * | 2013-10-10 | 2015-05-21 | シスメックス株式会社 | 被検物質検出方法、蛍光検出方法、並びにそれらの検出方法に用いる被検物質検出装置、蛍光検出装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003224692A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-29 | Q3Dm, Llc | System and method for measurement of a response of localized cellular compartments |
FI112504B (fi) * | 2002-08-07 | 2003-12-15 | Cyflo Oy | Menetelmä bakteerien tunnistamiseksi |
CN100480382C (zh) * | 2002-08-16 | 2009-04-22 | 抗癌公司 | 实时测量细胞反应 |
ES2955829T3 (es) * | 2008-10-21 | 2023-12-07 | Chemometec As | Aparato y procedimiento de imagenología por fluorescencia |
CN102439416B (zh) * | 2009-03-20 | 2015-11-25 | 伯乐实验室有限公司 | 串行线扫描编码多色荧光显微术及成像流式细胞仪 |
-
2016
- 2016-07-25 JP JP2016145835A patent/JP6824654B2/ja active Active
- 2016-10-28 CN CN201610958244.XA patent/CN106645713B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509827A (ja) * | 1997-02-27 | 2000-08-02 | セロミックス インコーポレイテッド | 細胞に基づくスクリーニングシステム |
JP2004301561A (ja) * | 2003-03-28 | 2004-10-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 分光学的識別定量システム |
WO2005036143A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Hamamatsu Photonics K.K. | 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム |
JP2006068002A (ja) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 生細胞の検出方法 |
JP2007225381A (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Osaka Prefecture Univ | 蛍光測定方法及び蛍光顕微鏡 |
JP2010512508A (ja) * | 2006-12-20 | 2010-04-22 | ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド | 量子ドットで染色された組織試料の定量的マルチ・スペクトル画像の分析 |
US20110278471A1 (en) * | 2009-01-23 | 2011-11-17 | Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd | Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method |
JP2012032183A (ja) * | 2010-07-28 | 2012-02-16 | Olympus Corp | 試料観測装置および試料観測方法 |
US20150132766A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-05-14 | On-Chip Cellomics Consortium | Imaging cell sorter |
JP2015096846A (ja) * | 2013-10-10 | 2015-05-21 | シスメックス株式会社 | 被検物質検出方法、蛍光検出方法、並びにそれらの検出方法に用いる被検物質検出装置、蛍光検出装置 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LUBECK ERIC, CAI LONG: "Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling", NATURE METHODS, vol. 9, no. 7, JPN6020000572, July 2012 (2012-07-01), pages 743 - 748, XP055353689, ISSN: 0004190753, DOI: 10.1038/nmeth.2069 * |
RAJ ARJUN ET AL.: "Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes", NATURE METHODS, vol. 5, no. 10, JPN6020000571, October 2008 (2008-10-01), pages 877 - 879, XP055556353, ISSN: 0004190752, DOI: 10.1038/nmeth.1253 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109387512A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 希森美康株式会社 | 试样处理装置、试样处理系统及测定时间的计算方法 |
JP2019032283A (ja) * | 2017-08-09 | 2019-02-28 | シスメックス株式会社 | 試料処理装置、試料処理システム、および測定時間の算出方法 |
US11054359B2 (en) | 2017-08-09 | 2021-07-06 | Sysmex Corporation | Sample processing apparatus, sample processing system, and measurement time calculation method |
JP7029903B2 (ja) | 2017-08-09 | 2022-03-04 | シスメックス株式会社 | 試料処理装置、試料処理システム、および測定時間の算出方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106645713A (zh) | 2017-05-10 |
CN106645713B (zh) | 2018-09-18 |
JP6824654B2 (ja) | 2021-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6824654B2 (ja) | 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 | |
EP3163287B1 (en) | Cell information obtaining method and cell information obtaining apparatus | |
JP6013328B2 (ja) | 標的粒子の定量方法 | |
CN102257379B (zh) | 分析荧光颗粒的方法及装置 | |
US8885165B2 (en) | Fluorescence detecting device and fluorescence detecting method | |
JP2015528911A5 (ja) | ||
EP2251672A1 (en) | Fluorescence detecting method and fluorescence detecting device | |
Baird et al. | Evaluation and optimization of multiple fluorophore analysis of a Pseudomonas aeruginosa biofilm | |
WO2005093392A1 (ja) | 蛍光分光分析装置 | |
JP2016185075A (ja) | 検体分析方法および検体分析装置 | |
WO2009098624A1 (en) | Analysis system and method | |
EP2725356A2 (en) | Microscope apparatus for detecting or imaging protein using ifret probe, and method for detecting or imaging protein using same | |
JP4918178B2 (ja) | 蛍光検出方法 | |
JP6948778B2 (ja) | 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 | |
JP2010043865A (ja) | 異常型プリオンの検出方法 | |
JP2005207823A (ja) | 蛍光分光分析の方法 | |
WO2013031141A1 (ja) | 分子検出装置、分子検出方法及び分子検出用カートリッジ | |
JP2009219455A (ja) | 核酸解析方法 | |
JP2005337805A (ja) | 抗体または抗原の測定方法 | |
Aurousseau et al. | A Step-by-Step Guide to Single-Subunit Counting of Membrane-Bound Proteins in Mammalian Cells | |
JP2003275000A (ja) | 一分子蛍光分析により核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法 | |
Horvath et al. | Toll-like receptor interactions measured by microscopic and flow cytometric FRET | |
JPWO2007032266A1 (ja) | 蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法を用いた抗原の迅速検出法 | |
JP6956402B2 (ja) | 解析方法 | |
Horvath et al. | Toll-like receptor interactions imaged by FRET microscopy and GFP fragment reconstitution |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190328 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20191226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200114 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200313 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201014 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201208 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201222 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210113 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6824654 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |